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TRANSCRIPTÓMICA Y PROTEÓMICA CURSO 2013-‐2014 PRÁCTICAS DE LABORATORIO
Introduction to Cold stress response in Chlamydomonas reinhardtii (Valledor et al. 2013, Mol. Cell. Prot. 12:2032-‐2047) Chlamydomonas reinhardtii is one of the most important model organisms nowadays phylogenetically situated between higher plants and animals (Merchant et al. 2007). Stress adaptation of this unicellular model algae is in the focus because of its relevance to biomass and biofuel production. Here, we have studied cold stress adaptation of C. reinhardtii hitherto not described for this algae whereas intensively studied in higher plants. Towards this goal, high throughput mass spectrometry was employed to integrate proteome, metabolome, physiological and cell-‐morphological changes during a time-‐course from 0-‐–120 hours. These data were complemented with RT-‐qPCR for target genes involved in central metabolism, signaling and lipid biosynthesis. Using this approach dynamics in central metabolism were linked to cold-‐stress dependent sugar and autophagy pathways as well as novel genes in C. reinhardtii such as CKIN1, CKIN2 and a hitherto functionally not annotated protein named CKIN3. Cold stress affected extensively the physiology and the organization of the cell. Gluconeogenesis and starch biosynthesis pathways are activated leading to a pronounced starch and sugar accumulation. Quantitative lipid profiles indicate a sharp decrease in the lipophilic fraction and an increase in polyunsaturated fatty acids suggesting this as a mechanism of maintaining membrane fluidity. The proteome is completely remodelled during cold stress: specific candidates of the ribosome and the spliceosome indicate altered biosynthesis and degradation of proteins important for adaptation to low temperatures. Specific proteasome degradation may be mediated by the observed cold-‐specific changes in the ubiquitinylation system. Sparse Partial Least Squares (sPLS) regression analysis was applied for protein correlation network analysis using proteins as predictors and FvFm, FW, Total Lipids, and Starch as responses. We applied also Granger causality analysis and revealed correlations between proteins and metabolites otherwise not detectable. Twenty percent of the proteins responsive to cold are uncharacterized proteins. This presents a considerable resource for new discoveries in cold stress biology in alga and plants.
Variations in the maximum quantum efficiency of Photosystem II (Fv/Fm) and in the accumulation of lipids, fatty acids, and starch during the experimental time course. Different letters within series indicate significant differences (ANOVA followed by a TukeyHSD, p < 0.05).
Generación de una biblioteca de cDNA El objetivo principal de esta práctica será familiarizar al alumno con las técnicas básicas de biología molecular que nos permitan elaborar bibliotecas de cDNA. Este conocimiento proporcionará una base sólida para comprender no solo las técnicas transcriptómicas clasicas, sino tambien las basadas en secuenciación masiva. Para realizar las bibliotecas emplearemos un sistema experimental conocido, el estrés térmico por bajas temperaturas, en el alga modelo Chlamydomonas reinhardtii. La generación de una biblioteca de cDNA consta de varias etapas, tal y como se describió en las clases teóricas, que podremos resumir en 5 bloques principales:
1. Purificación de RNA 2. Elaboración de cDNA 3. Transformación de E. Coli 4. Screening. Evaluación de resultados.
1 Purificación de RNA 1. Calentar tampón a 65ºC 2. Homogeneizar la muestra en N2 liquido. 3. Añadir 1000 uL de Chang + 30 uL(3%) de B-‐Mercapto. Inmediatamente mezclar por vortex. Si no se hace muy rápido, no sale 4. Dejar en la poyata 4-‐5'. Vorteando entre medias. 5. Centrifugar a 12000xg (13000 rpm) durante 1'. Pasar sobrenadante a un nuevo tubo. 6. Extraer con Cloroformo:IAA(24:1) añadiendo 500 uL volumen. Vortear bien hasta formar una emulsión. 7. Centrifugar 10' a 12000xg a temperatura ambiente 8. Pasar el sobrenadante a un nuevo tubo, procurando no llevarse interfase 9. Repetir 8-‐9, 2 veces 10. Añadir 1/3 vol de 10M LiCl, mezclar bien por inversión. Incubar o/n a 4ºC. Esto es básico. Si se deja menos tiempo, no sale 11. Centrifugar a 14000 rpm y 4ºC durante 20' 12. Eliminar sobrenadante con pipeta, muy cuidadosamente. Lavar pellet con etanol 75º 13. Centrifugar a 14000 rpm y 4ºC durante 15' 14. Eliminar sobrenadante con pipeta, muy cuidadosamente. Dejar secar el pellet. 15. Resuspender en 50 uL de Rnase-‐Free ddH2O. Tomar 1.5 uL y correr en gel. 16. Añadir 10 uL de DNase y 1 uL de Ribolock. Incubar 1.5 h a 37C 17. Inactivar DNasa calentando 10 min a 85C 18. Tomar 1.5 uL y correr en gel. 19. Purificar RNA en columna y cuantificarlo. Buffer de Chang, Composición: Para 50 mL 2% CTAB 1 g 2% PVP 1 g 100 mM Tris-‐HCl pH 8.0 5 mL (de stock 0.5M) 25 mM EDTA 400 uL (de stock 0.5M) 2 M NaCl 5,844 g 0,5 g/L Espermidina 25 mg
2.1 Síntesis de cDNA, primera hebra 1. RNA denaturation. Mix:
Template RNA (aprox 1-‐3 µg) x µL Oligo dT (100 pmol/µL) 1.5 µL RNase Free H2O up to 12 µL Heat at 65°C for 5 min in the thermal cycler
2. Add to each tube, Ribolock (Fermentas #E00381) 0.5 µL dNTPs 10mM each 2.0 µL 5x Reaction Buffer 4.0 µL (thaw and mix until the precipitate is dissolved) M-‐MuLV RT 2.0 µL
3. Incubate with the following PCR program:
25°C 10 min 45°C 75 min 80°C 10 min 8°C hold
2.2 Síntesis de cDNA, segunda hebra 1. Add to each tube,
dNTPs 10mM each 2.0 µL random hexamers 2.0 µL 5x Reaction Buffer 4.0 µL DNA polymerase 2.0 µL First Strand cDNA 10 µL
2. Incubate with the following PCR program: 25°C 10 min 45°C 15 min 8°C hold
3. Clean up:
3 Transformación 3.1 Ligación.
1. Calcular la cantidad de inserto que es necesaria en la reacción de ligación para tener una relación de 3 a 1 con el vector de clonación. Para ello, utilizamos la siguiente fórmula:
2. Añadir a un tubo de 1.5 ml lo siguiente:
a. Buffer 2X---------------------5 microlitros. b. Blunting Enzyme------------0.5 microlitros. c. Muestra+Agua---------------3.5 microlitros.
3. Spin. 4. 10’ a 70ºC en el termociclador. Se añade un ciclo posterior de 10’ a 4ºC para bajar la T de una
forma gradual. 5. Añadir 0.5 microlitros de plásmido p-JET y, a continuación, 0.5 microlitros de T4 DNA ligasa.
No preparar previamente un mix con el plásmido y la ligasa, pues se nos cerraría el plásmido. 6. 30’ a 22ºC (Al aire libre si la T es óptima o en el termociclador con la tapa abierta).
Existe la posibilidad de parar el proceso aquí. Para ello se guardan los tubos a 4ºC. Notas: El blunting enzyme elimina la cola de poli A que arrastramos de la PCR, pues la añade por defecto la Taq polimerasa. Es necesario eliminarla porque el plásmido que usamos tiene extremos romos. Además, cuanto más grande es
el inserto, menor es la eficiencia de la ligación y, como la cola de poli A no la queremos para nada, es una forma de disminuir el tamaño de nuestro inserto.
3.2 Transformación. 1. Descongelar en hielo las células competentes (caja verde en congelador a -80ºC). Si descongelan
bruscamente, pierden la competencia y baja su viabilidad. 2. Resuspender las células mediante golpes suaves en la base del tubo. 3. Añadir en un tubo de 1.5 ml:
a. Producto de ligación-----------4.5 microlitros. b. Células competentes------------ 60 microlitros.
4. Vórtex (no muy fuerte). 5. 2’ a 42ºC. 6. 2’ en hielo. 7. Añadir 100 microlitros de medio fresco LB. Si se hace con cuidado no hace falta hacerlo en
condiciones de esterilidad, aunque es recomendable. 8. Vórtex (no muy fuerte) 9. Incubar 1 hora a 37ºC. Durante esa hora se sacan las placas en las que vamos a sembrar y se
ponen en la estufa a 37ºC. 10. Sembrar las placas. 11. Dejar sobre un día a 37ºC. 12. Guardar a 4ºC para que no sigan creciendo o lo hagan más lentamente.
3 Screening. Evaluación de resultados. ¿Cómo se podría saber rápidamente que colonias han sido transformadas y presentan un inserto en su plásmido? PCR de colonia, comprobando las inserciones. Dream Taq Buffer 2 uL
pJET Forward 0.4 uL
pJET Reverse 0,4 uL
dNTPs (2.5 mM each)
0,6 uL
Dream Taq 0,1 uL
Muestra
H2O 15,5 uL
95ºC-2' 95ºC-30''------------------------ 55ºC-30'' X50 72ºC-45''------------------------ 72ºC-10' 12ºC-Hold
Cuestiones prácticas:
-‐Interpretar los resultados obtenidos. ¿Cómo se explica la presencia de un número diferente de colonias en cada placa? ¿Es este número alto o bajo? ¿De que depende? ¿Por qué las PCRs de colonia muestran longitudes diferentes? ¿Cuales serian los siguientes pasos para caracterizar la librería?
-‐Evalúese el método empleado para generar la librería. ¿Es susceptible de mejora? Plantear alguna alternativa para la construcción de la librería.
-‐Propóngase ejemplos prácticos del uso que podría darse a la librería generada. -‐¿En que casos es preferible disponer de una librería de cDNA respecto a realizar una
alternativa basada en secuenciación masiva? Ventajas y desventajas de cada una.
Estudio de la expresión génica mediante PCR cuantitativa. El estrés por bajas temperaturas ocasiona una serie de importantes cambios morfológicos y estructurales en la célula que permiten su supervivencia. Entre ellos destaca el aumento de la cubierta del pirenoide, que es la zona del cloroplasto en la cual se produce la fijación del CO2, y un cambio en la composición de los lípidos de membrana, aumentando sus insaturaciones para mantener la fluidez incluso a muy bajas temperaturas.
Evolución de la proporción de los FAME indicados durante 120 h de exposición al frío.
El aumento del tamaño de la cubierta del pirenoide nos indica que existe un déficit de CO2. Este se engrosa para crear un ambiente más anóxico que permita una mayor eficiencia de la enzima RuBisCO. Para estudiar si realmente se activan los sistemas inducibles por bajo CO2 analizaremos los cambios de expresión de los genes CAH3 (Anhidrasa Carbónica 3) y PEPC2 (fosfo-‐enol-‐piruvato carboxilasa) El cambio de fluidez en la membrana, vital para el mantenimiento de las funciones celulares, es consecuencia tanto de la formación de nuevos FAME como de su desaturación:
Esquemas del proceso de elongación e insaturación de los ácidos grasos.
Nosotros monitorizaremos el proceso de cambio en la membrana celular mediante el estudio por PCR cuantitativa de los genes ACP (Acyl-‐Carrier-‐Protein), ACC (Acetyl-‐CoA-‐Carboxilasa) y SCD(Stearoyl-‐CoA desaturase, delta-‐9-‐desaturase) Preparar placa de PCR en tiempo real conforme al diseño realizado en prácticas de tablero. PCR en tiempo real: 1x 24x
(22 wels) 27x (for 24 wells)
48x (for 44 wells)
2X Sybr Green MasterMix 7.5 180 uL 202.5 µL 360 µL Oligo primer F+R (10pmol/µL each) 0.6 14.4 uL 16.2 µL 28.8 µL DMSO 0.15 3.6 uL 4.05 µL 7.2 µL Water 5.5 132 uL 148.5 µL 264 µL Chlamy cDNA 1.25 -‐-‐-‐ -‐-‐-‐ Final Volume 15 -‐-‐-‐ -‐-‐-‐ 95°C – 5 min 95°C – 15 s -‐-‐-‐| 63°C – 15 s |-‐ x45 79.5°C – 20 s -‐-‐-‐| <-‐ measure here the fluorescence (Melting curve step) 95°C – 15 s 60°C – 15 s to 95°C in 20min and hold 15s END Cuestiones prácticas:
-‐Procesar los resultados obtenidos y analizarlos estadísticamente. -‐Realizar una interpretación biológica en base a la bibliografía y a los resultados obtenidos.
¿Podría proponer algún nuevo experimento para validar o ampliar sus afirmaciones? -‐¿Qué ventajas y desventajas presenta un análisis de PCR en tiempo real sobre microarrays y
RNA-‐seq? ¿Cual sería el mas adecuado en este experimento? Razonar la respuesta.
