8/14/2019 Toucan Vd. 29, No . 9, Pp.

1/13

8/14/2019 Toucan Vd. 29, No . 9, Pp.

2/13

1 1 30 B. G STI L E Se t a l.

c o b r a v e n om ( Hema c h a t u sh a ema c h a t u s ) h a d a n t i b a c t e r i a le f f e c t sa g a i n s tSt a p hy l o c oc c u sa u r e u s a nd E s c h e r i c h i ac o l a ( ALOOF- Hms c se t a l. , 1 9 6 8 ). Th i s g r o u p o f b a s i c , l o wmo l ec u l a rwe i g h t p r o t e i n s d i s r u p t sp ho sp ho l i p i dmemb r a nes a nd i s f o u nd i n ma ny e l a p i dve no ms s u c h a s t h o s eo f Na j a s p . a nd H h a ema c h a t u s( ( ~ t v e t a l . , 1 9 8 7 ).

A n t i b a c t e r i a le f f e c t so f v i p e r i dve no ms h a v e a l s o been d e s c r i b e d( GLASER, 1 9 4 8;S x wRl v F S ,1 9 7 0 ). B a c t e r i c i d a le f f e c t swe r e o b s e r v ed wi t ht wo d i f f e r e n tr a t t l e s n a k eve no mso n g r a m- p os i t i v eSa r c i na s p e c i e s ,b u t t h e r ewa s l i t t l ee f f e c ta g a i n s tB a c i l l u ss u b t i l i s ,E c o l a ,o r S a u r e u s( GLASER, 1 9 4 8 ). An o t h e r r e p o r ts h ow e d t h a tL - a m no a c i d o x i d a s e ,p u r i f i e df r o m t h e v e n om o f C r o t a l u sa t t a ma n t e u s( e a s t e r nd i a mo n db a c k r a t t l e s n a k e ) ,h a d a n t i -b a c t e r i a la c t i v i t ya g a i n s tv a r i o usg r a m- neg a t i v em c r o - o r g ani s ms( SKARNE3,1 9 7 0 ). A n t i -b a c t e r i a lc o mp o n en t s p r e s e n ti n s n a k e ve no ms ma y p r o t e c tt h e h o s ta f t e re a t i n gp r e yc o nt a m na t ed wi t hp a t h o g en s l i k eAe r omon a s ( T~I OMASe t a l. , 1 9 7 9 ).

Th e L - a m no a c i d o x i d a s e c o n v e r t sL - a m no a c i d si n t o k e t o a c i d s ,ammon i a a ndh y d r o g en p er o x i de. Ca t a l a s ee f f e c t i v e l yp r e v e n t s t h ea n t i b a c t e r i a le f f e c t so f L - a m no a c i do x i da s e f r o m C a d aman t e u s , s u g g e s t i n gt h a th y d r o g enp er o x i de i s t h e b i o a c t i v e

p r o du c to f t h e enz y ma t i c r e a c t i o n( $ KARNES,1 9 7 0 ). Th e o nl yo t h er v e n om c omp on en t known t oh a v e a n t i mi c r o b i a l p r o p e r t i e si s f r o m t h e c ommo n h o n e y b e e , Ap i sme l l i j e r a( F~ x x ELe t a l. , 1 9 6 8 ). Th i sv e n om c on t a i n sme l l i t i n ,a 2 8 0 0mo l . wt p e p t i d e ,wh i c hi s mo r e a c t i v ea g a i n s tg r a m- p o s i t i v et h an g r a m- neg a t i v eb a c t e r i a.

We d e s c r i b eh e r e t h ea n t i b a c t e r i a lp r o p e r t i e so f 3 0 d i f f e r e n ts n a k e ve no ms a nd t h ep u r i f i c a t i o na nd c h a r a c t e r i z a t i o no f t wo a n t i b a c t e r i a lp r o t e i n sp u r i f i e df r o mt h ev e n omo fPs e u de c h i sa u s t r a l i s( t h emu l g a o r k i ng b r o wn s n a k e ).

MATERI ALS AND METHODSVe no v n , ma ga i r t i n sa nd p u r i f i e di - a mf i wa c i do x i d a s eAl l l y o p h i l i z e dve no ms we r eo b t a i n e dc o mme r c i a l l y( S i g ma ,S t L o u i s ,MO, U S. A. ) e x c e p t Cr o t a l u sa l ma ,

C s c u t u l a t u rs c t r t u l a t u s. C. a d ammt t e u sa nd Ec h i sc a r i n a t u s ,wh i c h we r ee x t r a c t e df r o ml o n g - t e r mc a p t i v es p e c i me n s. Venomf r o mt h el o n g - t e r mc a p t i v es p e c i me n swa s c o l l e c t e dma n ua l l y ,i mme d i a t e l yf r o z e n , l y o ph i l i z e da n d t h e n s t o r e d a t4 Co v e rd e s i c c 8 n ti n t h ed a r k. Th e L - a mi n oa c i do x i d a s ep u r i f i e df r o mt h ev e n omo fC a t r o xa nd ma g ai n i np e p t i d e sI a n d I I we r eo b t a i n e d c o mme r c i a l l y( S i g ma ) ,r e c o n s t i t u t e dw i t hp h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e ,pH 7 . 2 ( P B S ) ,a n d s t o r e d a t- 4 0 C.

A n t i b a c t e r i a la s s a y sB a c t e r i awe r eo b t a i n e df r o mt h eAme r i c a n Ty p e C u l t u r eC o l l a t i o n( ATCC, R o c k v i l l e ,MD, U . S. A. ) a n d

g r own i n I Oml n u t r i e n tb r o t ht u b e s ,a s r ec ommended b y ATCC B a c t e r i au s e di n t h i ss t u d y i n c l u d eP s e u d o -m o r r a ra e r t t g l n o s ano . 2 7 8 5 3( b l o o di s o l a t e ); Es c h er l c h i ac o l ano . 2 5 9 2 2( c l i n i c a li s o l a t e ); S t a p hy l o c o c c u sa u r e u sn o. 2 9 2 1 3( wo u n di s o l a t e ); B a c i l l u ss u b t A i tno . 6 0 5 1( t y p es t r a i n ); A e r o n t o r t a sh y d r o p h l l as t r a i n sn o. 7 9 6 5( s o u r c eunknown ); n o. 7 9 6 6( t y p es t r a i ni s o l a t e df r o mmi l k ); no . 4 3 4 0 8( f r o g ,n a s a lu l c e r ); no . 4 3 4 0 9( f r o g ,s k i nu l c e r );no . 4 3 4 1 4( s n a k e ,s t o ma ch a f a r ); A. v e r o n l ln o. 3 5 62 2 ( h u ma n ,d i a r r h e a ls t o o l ); a nd A. s o b r l an o. 9 0 7 1( f r o g ,h e mo r r h a g i cs e p t i c e mi a ). A d i s cd i f f u s i o na s s a y( BeuOe e t a l. , 1 9 6 6 )wa s u s e dw i t ht h e f o l l o wi n g ma d i f i a r t i o n s:b a c t e r i a( 2 0 0l t lo f a 0. 1A6aoc u l t u r ec o n t a i n i n g1. 7 5x ( 0 "c o l o n y f o r mi n gu n i t s( CFU) / m w e r es p r e a do n t oISm n u t r i e n ta g a rp l a t e s( 9 0mm d i a me t e r ). S t e r i l ep a p e rd i s c s( 7mm d i a me t e r )we r et h e yp l ea d o n t ot h ea g a rs u r f a c ea n d I S p l ( 1 8 8~ f v e n om wa s a d d e dp e r d i s c. P l a t e swe r e i n c u ba t e da t e i t h e r2 5 , 3 0 o r 3 7 C ,d e p e n d i n go n t h eo p t i mu mg r o wt ht e m p e r a t u r er ec ommended b y ATCC f o re a c hb a c t e r i a ls t r a i n. A f t e r1 8h r ,t h ed i a me t e r so f i n h i b i t i o nz o n e swe r e r e c o r d e di nmm mi n u st h ed i s cd i a me t e r.A n t i b a c t e r i a le f f e c t so f r. - a mi n oa c i do x i d a s e1 ( LAOI ) o r 2 ( LA0 2 ) p u r i f i e df r o mP a u s t r a l i svenom a n d

~ - a ~ + + no a c i do x i d a s ef r o mC . a t r o xv e n omwem a l s ot e s t e di n n u t r i e n tb r o t hc u l t u r e s. S o l u t i o n sc o n t a i n i n gLA01 , LA02 o r L - a mi n oa c i do x i d a s ef r o mC. a l ma a nd p u r i f i e dAs p er g i l d t s n a ge rc 8 t a l a a e( C a l b i o c h e m,Sa nDi e g o ,CA, U S. A. ) w e r ef i l t e rs t e r i l i z e dw i t ha 0. 2 2pm membr an e ( M i l l i p o r e ,B e d f o r d ,MA, U S. A. ) ,a n d at o t a lvo l ume o f 1 0 0p l wa s added p e r n u t r i e n tb r o t ht u b e( 1 0ml ). Tube s we r ei n o c u l a t e dw i t h0. 5ml o f a0 . 0 7 5

d~ i n oc u l u m( 7. 5xl o sCFU/ m ) a n d t h e t u r b i d i t yma a a u r e dh o u r l y

.

8/14/2019 Toucan Vd. 29, No . 9, Pp.

3/13

A n t i b a c t e r i a lE f f e c t so fS n a k eVenoms 1 1 3 1

P w i f e c a t i o no fP . s u a t r a l i s a n t i b a c t e r i a lc o mp a r a n t aC r u d eP a u s t r a l i sv e n o m( 3 0mg ) wa sd i s s o l v e di n0 . 6ml o f 0. 0 5M r i s - H C lb u f f e r ,pH7 . 2 ,c o n t a i n i n g0. 7M

NaCI ( b u f f e rn . Th e s a mp l ewa sf i l t e r e dt h r o u g ha 0. 2 2r a nmemb r a n ea n d OSml o ff i l t r a t ew a si n j e c t e d i n t oaSu p er o s e - 1 2 ( m o l e c u l a rs i e v e )c o l u mn( 1c mx 3 0c m)a t t a c h e dt oa F a s tP r o t e i n L i q u i dCh r o ma t o g r a p h ySy s t e m( F P L C ,P h a r ma c i a ,P i e c a t a w ay ,NJ ,U S. A. ). Th ec o l u mnwa se q u i l i b r a t e dw i t hb u f f e r Ia t 1ml / mi n ,a n d imlf r a c t i o n sw e r ec o l l e c t e d. Co l u mne l u a n twa smo n i t o r e da t 2 8 0n ma n df r a c t i o n sw i t ha n t i b a c t e r i a le f f e c t sa g a i n s tA. h y d r o p h i l a7 9 6 5w e r ep o o l e d ,d i a l y s e d a g a i n s td ei o n i z e dw a t e r ,a n dl y o p h i l i a d. Th es a mp l ew a sd i s s o l v e di n6 5 0i ~ lo f0. 0 5M [ N- mo r p h o l i n o ]e t h a n es u l f o n i ca c i db u f f e r ,pH 5. 6( M E S ) ,a n di n j e c t e di n t oaMonoS ( c a t i o ne x c h a n g e )c o l u mn( 1c mx 1 0c m)e q u i l i b r a t e dw i t ht h es a m eb u f f e r. P r o t e i n sw e r ee l u t e dw i t ha l i n e a rNaCIg r a d i e n t ( 0. 0 - 1. 0M) i n MES a n d f r i c t i o n sa s s a y e df o ra n t i b a c t e r i a la c t i v i t y. A c t i v ef r a c t i o n sw e r ep o o l e d ,d i a l y s e da g a i n s tP B S ,l y o p h i l i z e da n df i n a l l yr e c o n a t i t u t o dw i t h1ml o fs t e r i l e ,d e i o n i z e dw at e r.

P r o t e i n d E t e r m i n a t i o n sP r o t e i nc o n t e n tw a sd e t e r mi n e db y t h eb i c i n c h o n i n i c a c i da s s a y( S ~ a r t te t a l. , 1 9 8 5 )f r o mP i e r c eCh e mi c a l s ,

R o c k f o r d ,I L ,U S. A. w i t hb o v i n es e r u ma l b u mi na s a s t a nd a r d.

P o l y a c r y l a r n i d tg e le l e c t r o p h o r c a l sSo d i u md o d e c y ls u l f a t ep o l y a c r y l a mi d eg e l e l e c t r o p h o r e s i s( SDS- PAGE)w i t ha 4 % s l a c k e ra n d 1 0%s e p a r a t i n gg e lwa sr u ni naMi n iP r o t e a nI Ie l e c t r o p h o r e s i su n i t( B i o - R a d ,R i c h m o n d ,CA, U S. A. ) ,a c c o r d i n gt ot h et e c h ni q u eo f L ~ r ~ a a l( 1 9 7 0 ). P r n a t a i n edmo l. wt s t a n d a r d s( 1 4 , 0 0 0 - 2 ( 1 0 , 0 0 0 )w e r e p u r c h a s e df r o mAme r-a h am( A m e r a h a m ,U . K. ). P r e c a s t4 - 3 0 %p o l y a c r y l a mi d eg r a d i e n tg e l s( P h a r ma c i a )w e r er u nf o r2 0h r a t1 5 0v o l t si n 8 0mM b o r i ca c i d - 9 0mM T r i ab u f f e r ,p H7. 3. P r o t e i ns t a n d a r d sw e r ef e r r i t i n( 4 4 0 , 0 0 0 ) ,c a t a l a n e( 2 3 2 , 0 0 0 ) ,a n db o v i n es e r u ma l b umi n( 6 7 , 0 0 0 )( P h a r ma c i a ). P r o t e i n sw e r es t a i n o dw i t h0 . 0 2 5 %Co o ma a n i eb l u eR - 2 5 0d i s s o l v e di nme t h a n o l: w a t e r: g l a c i a la c e t i ca c i d( 5: 4 a ).

l i Hz y me~YTh e t. - a m i n oa c i do x i d a s ea c t i v i t i e so fp u r i f i e dLAOI ,LA0 2a n dt h et: a mi n oa c i do x i d as ef r o mC a t r o xw e r e

d e t e r mi n eda t 3 0 Cw i t ha n o x y g e ns e n s o r( Y e l l o wSp r i n g sI n s t r u m e n tCo . I n c. , Ye l l o wS p r i n g s ,OH, U S. A. ) ,a c c o r d i n gt o t h ep r o c e d u r eo fC t r n r te t a l. , ( 1 9 6 8 ).

L e t h a lp o t e n c yr k t e r m i n a t l o n sL e t h a lp o t e n c yo f c r u d eP a u s t r a l l sv e n o mwa sd e t e r mi n edb y i . p. i n j e c t i o no f Sw i s s - We b s t e tmi c e( m a l e ,

1 8 - 2 0g ) i n f o u rg r o u p so f f o u rmi c ep e rg r o u p. D o s e sw e r ed e r i v e df r o ma 1mg/ mls o l u t i o no f l y o p h i l i z e dv e n omr o c o n s t i t u t e di nPBS ,p H7. 2. Th e~ wa sc a l c u l a t e db y t h eS p e a r m a n - K a r b e rme t h o d( WH . O. , 1 9 8 1 ).

P r o t e a s ea s s a yP r o t e as ea c t i v i t yi n v e n o mwa s m e a s u r e dw i t ha c o mme r c i a lc a s e i ns u b s t r a t e( B i o - R a d). Ca s e i nwa s

i n c o r p o r a t e di n t oa g a r w e ,w e l l sw e r ep u n c h e d ,a n da n a p p r o p r i a t ev e n o md i l u t i o n( 0 . 1 2 5 - 1. 0mg/ mli nP B S )w a sa p p l i e d. A t r y p s i ns o l u t i o n ,2 3 2u n i t s / m gs t o c k( M i l l i p o r eC o r p. , F r e e h o l d ,NJ ,U S. A. ) ,w a su s e da s ap o s i t i v ec o n t r o l ( S p g / a s a a y )a n dPHS a s a n e g a t i v e c o n t r o l.

RESULTS

A n t i b a c t e r i a le f f e c t so f c r u d ev enomsT ab l e1 s u mma r i z e st h ea n t i b a c t e r i a la c t i v i t yo fv e n o ms f r o m3 0d i f f e r e n ts n a k es p e c i e s.

Th ev e n o m sf r o mf i v es p e c i e so f A f r i c a na n dAs i a nc o b r a s( N a j as p. ) s h o w e ds t r o n ga n t i b a c t e r i a le f f e c t s ,e s p e c i a l l ya g a i n s tA. h y d r o p h i l a7 9 6 5. No t i c e ab l ee x c ep t i o n sw e r ev e n o m sf r o mo n eAs i a n c o b r a( N. n . o x i a n a )a n d o n eA f r i c a nc o b r a( N me l a n o l e u c a ) ,w h i c hl a c k eda n y a n t i b a c t e r i a la c t i v i t y. Ve n o mf r o mt h ed i s t i n c t i v eA f r i c a ne l a p i d ,H h a e ma c h a t u s ,h a da mo d e r a t ee f f e c ta g a i n s tA . h y d r o p h i l a7 9 6 5. Two A u s t r a l i a ne l a p i d

v e n o m s( N o t s c h i ss c u t a t u s s c u t a t u sa n dP a u s t r a l i s ) ,a l s oh a dp o t e n ta n t i b a c t e r i a la c t i v i t y.

8/14/2019 Toucan Vd. 29, No . 9, Pp.

4/13

1 1 32

TABLE I . AI VT>eACI EwALEPPECI 3 OF D~HNT 3 NAt EVENOMS ( 1 8 8 h g ~ DL 1 C)WTH A DDC DI I ' RU3 1 0 NA SSAY~

Venom

El a p i d a e

. l c a n t h o ph i s o n t a r c t i c u s( Au s t r a l i a nd ea t h a d d er )Be n g a r e st n e l t i c l n c t e s( Many b a n d e d k r a f t )i ? e n d r o a s p t ra n g e s t i c e p s( E a s t e r ng r e en mamba )De n ~o a s p i sj a r r u s o n U( J a me ao n ' smamb a )i k n d r o a s p i sp o l y l e p i s( Bl a c kmamba )1 ) c r t d r o a s p i rv b i d i s( We s t e r n g r e e nmamba )E n h y d r i n as c h i r t o s a( Be a k e d s e a s n a k e )Hema c h a t e sh a c n w c h a t e s( R i n g ha l ss p i t t i n gc o b r a )H y d r o p h i sc y a n o c i n c t l i s( Hl i u - b an de ds e a s n a k e )La t k a e d a l a t k a e d a t o( Common s e a k r a f t )l a t i c a u d as e m i j a s c i a t a( Ha n d e ds e a k r a f t )M i c r u r u rj u l v i e s( Ea s t e r n c o r a l s na k e )Na j a h a j eh a j c( Eg y pt i a nc o b r a )Na j a n a j a a f r o( Ch i n e s e c o b r a )

Na j ar m l a n o l e e c a( Bl a c kf o r e s tc o b r a )Na j amo s s mn b i c a( Mo z a mb i q u es p i t t i n gc o b r a )Na j an i g r i c o U i s( Bl a c k - n e c k e ds p i t t i n gc o b r a )Na j amues ( Y e l l o wo r c a pe c o b r a )Na j an a j ao x i a n a( Ox u s c o b r a )N o t e c h i ss c u t a t e ss c e t a t e s( Au s t r a l i a nt i g e rs n a k e )P s e t u d c c h i so e s t r o u s( K i n gb r o wn o r mu l g a s n a k e )

Vi p er i d a e. l g k i s t r o d o nc o n t o r t r i xc o n t o r t r i x( So u t h e r n

c o p p e r h e a d )B i t i ta r i c t a n s( P u f fa d d er )C r o t a h r sa t r o x( we s t e r n d i a mo n d b a c kr a t t l e s n a k e )

C r o t a h t ss c e t e l a t e s s c et e l a t e s( Mo j a v er a t t l e s n a k e )

C r o t a h t sa d a mm t t e e s( E a s t e r nd i a mo n d b a c kr a t t l e s n a k e )

C r o t a l e sd e r t r s e st e r r l J i c e s( S o u t hAme r i c a nr a t t l e s na k e o rCa s c a b el )

E c h i sc a s i n a t e s( Sa w- s e a l o do r c a r p e t v i p e r )T r L n t r e s e r u so k b t a v e n r i r ( I m e h a b u )P i p e r ar u s s e l l i( R u s s e l l ' sv i p e r )

B G STI LES e t a l.

P . a e n g i r t o s aS . a u mv E c o l iA . h y d r o p h i l aB s e b t i l i s

0 0 0 0 I1 0 0 10 0 0 0 20 0 0 0 10 0 0 0 00 0 0 0 00 0 0 0 00 2 0 4 1

0 0 0 0 00 0 0 0 00 0 0 0 10 I 0 0 10 4 0 7 30 3 0 6 1

0 0 0 0 00 3 0 5 20 5 0 6 10 2 0 6 10 0 0 0 I1 7 0 1 0 30 7 1 I 1 5

3 8 1 1 1 3

2 9 1 1 I 5

2 8 1 1 2 5

0 0 0 0 1

4 8 l 1 2 51 0 0 0 01 0 0 0 1

r I ' h ev a l u e sg i v en r e p r e s e n ta venom i n h i b i t i o nz o n e i nmm, mi n u s t he 7mm d i a me t e r o f t h e d i s c ,a l k r a nl 8 h r i n c u ba t i o n.

Th e b a c t e r i a li n o c u l u mp e r p l a t ec o n t a i n ed3 . 5x 1 0 ' c o l o n y f o r mi n gu n i t swh i c hwe r e s p r e ad o n t o t h e a g a rs u r f a c ewi Wa s t e r i l eg l a s sr o d. S t e r i l ep a p e r d i s c s( 7mm i a me t e r ) we r e p l a c edo n t o t h ea g a r s u r f a c ea nd I S l t lo fv e n om ( 1 8 8Rg ) a d d e d.

Venoms f r o ms e v e r a l s p e c i e so fs e as n a k e s( E n h y d r i n as c h i s t o s e ,H y d r o p h i sc y a n o c i n c t u sa n dL a t i c a u d as p. )a n d t h ec o r a ls na k e , Mi c r u r u sj u l v i u sf u l v i e s ,w e r eu n i f o r m l yn e g a t i v e.None o f t h ee l a p i dv e n o m st e s t e dh a d a n ys i g n i f i c a n te f f e c t sa g a i n s tP a e r u g i n o s a o rE c o l ia n do n l ym o d e r a t ee f f e c t sw e r es e e nw i t hB s u b t i l i s. Of t h eg r a m - p o s i t i v ea n dg r a m - n e g a t i v eb a c t e r i at e s t e d ,S. a u r e u sa n dA . h y d r o p h i l aw e r emo s ts u s c e p t i b l et oe l a p i dv e n o m s. A b r o a d e rs p e c t r u mo fa c t i v i t ywa ss e e nw i t hsomev i p e r i dv e n o m s ,i n c l u d i n gt h o s e o fr a t t l e s n a k e s( C r o t a l u ss p. )a n dE c h f sc a r i n a t e s. Th es u s c e p t i b i l i t yo f t h e b a c t e r i at e s t e da g a i n s t v i p e r i dv e n o m swa sa s f o l l o w s; A h y d r o p h i l a> S. a u r e u s> B ,s u b t i l i s>P a e r u g i n o s a> E . c o l i( T a b l e1 ). P s e u d e c h i s o e s t r o u sv e n omwa sc h o s e nf o ra d d i t i o n a ls t u d i e ss i n c et h i se l a p i ds p e c i e si s k n ownt o f e e dl a r g e l yu p o nf r o g s ,a p o t e n t i a ls o u r c eo f

A. h y d r o p h i l aw h i c hi s a ma j o rp a t h o g e no f a mp h i b i a n sa n d r e p t i l e s.

8/14/2019 Toucan Vd. 29, No . 9, Pp.

5/13

8/14/2019 Toucan Vd. 29, No . 9, Pp.

6/13

1 1 34 B. G ST I LESe t a l .

P t i r ~ c a t i o no f P . a u s t r a l i s a n t i b ac t e r i a lc o mp o n e n t sTwo s t e p sw e r er e q u i r e dt o p u r i f yt h ea n t i b a c t e r i a lc omp o n e n t so f P . a u s t r a l i sv e n o mt o

h o mo g e ne i t y. F i g u r e1A s h ow st h ec h r o ma t o g r a p h i cp r o f i l eo b t a i n e df r o mf r a c t i o n a t i n g3 0mg o f P . a u s t r a l i sv e n o mon a mo l e c u l a rs i e v ec o l u mn. A n t i b a c t e r i a la c t i v i t ywas f o un di n t h ef i r s te l u t e dp e a kc o n t a i n e di n f r a c t i o n s1 3 - 1 5. I n t e r e s t i n g l yt h ea n t i b a c t e r i a la c t i v i t yo fv e n om s f r o mN n. a t r a ,N n i g r i c o l l i sa n dN h a j e h a j ew e r el o c a t e di n f r a c t i o n s1 2 - 1 4.F r a c t i o n sc o n t a i n i n ga n t i b a c t e r i a la c t i v i t ya l s o e x h i b i t e da y e l l o wc o l o rwh i c h i sc ommo n l ya s s o c i a t e di n s n a k ev e nomsw i t ht h eFAD p r o s t h e t i cg r o u pf o u n di n L - a mi n oa c i do x i d a s e( KOANAL I K a n dMASTER, 1 9 6 4; Tu , 1 9 7 7; ZELLER ,1 9 4 8 ). Can o n e x c h a n g ec h r oma t og r a p h yo f P . a t r s t r a l i sv e n o mf r a c t i o n sw i t ha n t i b a c t e r i a la c t i v i t yr e s o l v e d t h r e ep e a k s( F i g. 1 B ). On l y t wo p e a k sh ad a n t i b a c t e r i a la c t i v i t ya n d w e r ed e s i g n a t e dLAO1 ,wh i c hd i dn o t b i n dt o t h ec o l u mn , a ndLA0 2 , wh i c he l u t e dw i t h1 0 0mM NaCI ( F i g. 1B).Th e LAO1 a n d LA02 r e p r e s e n t e d2. 6 % an d0 . 2 5 %o f t o t a lv e n o mp r o t e i n , r e s p e c t i v e l y.Bo t hp r o t e i n sw e r eh omog e n e o u sa n d h a d n a t i v emol . wt so f 1 4 2 , 0 0 0 ,b a s e don g r a d i e n tg e le l e c t r o p h o r e s i s ,a n d s u b u n i t so f 5 6 , 0 0 0i n SDS- PAGE. Th e ma r i n eLn ~ o fP . a u s t r a l i sc r u d ev e n o m was 0 . 5 7mg / k g. N e i t h e rLAO1 n o r LA02 w e r e l e t h a li n mi c e( u p t o2 . 7 5m g / k g ) ,n o r d i dt h e yh a v ea n y p r o t e o l y t i ca c t i v i t y.

A n t i b a c t e r i a le f f e c t sa n d e n z y ma t i ca c t i v i t yo f p u r ~d LAOI a n d LA02Th e a n t i b a c t e r i a le f f e c t so f LAO1 a n d LA02 a r e s hown i n T a b l e2 a n d F i g. 2 A - C.

V a r i a t i o nwas n o t e di n s u s c e p t i b i l i t i e sb e t w e e nd i f f e r e n t s t r a i n so f A . h y d r o p h i l a. T h e r ewas a s l i g h ta n t i b a c t e r i a le f f e c ta g a i n s tA . s o b r i a9 0 7 1 ,b u t n o tA . v e r o n 3 5 6 2 2. N e i t h e rv e n o mf r o mt h ec ommonh o n e y b e e ,Ap i sme l l i f e r a( 1 8 7f i g ) ,n o r7. 5h g o fma g a i n i nI o r I Ii s o l a t e d o r i g i n a l l yf r o ms k i ne x t r a c t so f t h eA f r i c a nc l a we df r o g ,Xe n o p u sl a e v i s ,h a d a n y

a n t i b a c t e r i a le f f e c t sa g a i n s tA . h y d r o p h i l a7 9 6 5. Mag a i n i nI o r I I h a d n o e f f e c ton o t h e rA . h y d r o p h i l as t r a i n s. Howe v e r ,1 8p g o fL - a mi n oa c i do x i d a s ef r o mC a t r o xv e n o mg a v ea

TAHt E2 . Ax n aAC r ewA it a + t + e c t so FLAO1 Ax n 2 AGA n ~ s rB . s u b t i r , S a ~e u a ANDAc r omo n a ss p. o x r n t r a m v ~ rAGAa

o . o z o / o / o o / o o / o o / o o / o o / o

' Ba c t e r i a li n oc u l u m( 3 . 3x 1 0 "c o l o n yf o r mi n gu n i t s )f o r e a c hp l a t ewa s s p r e a do n t ot h en u t r i e n ta g a rs u r f a c ew i t ha s t e r i l eg l a s sr o d. Th e i n h i b i t i o nz o n e so f LAOI a n d LA02 a r e l i s t e di n t h e f i r s ta n d s e c o n dp o s i t i o n s ,r e s p e c t i v e l y( e. g. ( 0 / 6= z o n e so f i n h i b i t i o no f 1 0mm f o rLAOI a nd 6mm f o rLA0 2 ). Va l u e sd o n o t i n c l u d et h e7mm d i a me t e ro f t h ed i s c. T e t r a c y c l i n es u s c e p t i b i l i t ywa s o n l yt e s t e dw i t hA . h y dr o ph i l aATCC n o. 7%S b e t w e e nc o n c e n t r a t i o n so f 1. 2 5p g / d i s ca n d 0. 0 2P g / d i s c. T e t r a c y c l i n ez o n e so f i n h i b i t i o na r er e c o r d e du n d e rA . h y d r op h i l aATCC n o. 7%S i n t h et h i r dp o s i t i o n( e . g. S / 3 / 1S ~ z o n e so f i n h i b i t i o no f 5mm f o rLAOI , 3mm f o rLA0 2 , a n d

1 5mm f o r t e t r a c y c l i n e. ND = No t d e t e r mi n e d.

I n h i b i t i o nZo ne s o fLAO1 a n d LA02 ( mm)"

P r o t e i n A. h y d r o ph i l a A . h y d r o ph i l a A h y dr o p h i l a A . s o ~ b r i a B s u b t i r S a u r e u s( Pg ) ATCC ~ 7%S ATCC ~ 4 3 4 0 9 ATCC ~ 4 3 4 1 4 ATCC ~ 9 0 7 1 ATCC ~ 6 0 3 1 ATCC

# 2 9 2 1 3

S. 0 8 / 6 / ND 1 0 / 6 3 / 0 2 / 1 4 / 2 4 / 32 . 3 8 / S/ ND 8 / 4 2 / 0 2 / 0 2 / 0 3 / 21. 2 3 S / 3 / 1 5 6 / 2 1 / 0 1 / 0 l / 0 2 / 10 . 6 2 4 / 2 / 1 4 S / 2 O/ 0 0 / 0 0 / 0 1 / 00 . 3 1 3 / 0 / 1 2 3 / 0 0 / 0 0 / 0 0 / 0 0 / 00 . 1 6 0 / 0 / 8 0 / 0 0 / 0 0 / 0 0 / 0 0 / 00 / O8 0 / 0 / 6 0 / 0 0 / 0 0 / 0 0 / 0 0 / 00 . 0 4 0 / 0 / 1 0 / 0 0 / 0 0 / 0 0 / 0 0 / 0

8/14/2019 Toucan Vd. 29, No . 9, Pp.

7/13

An t i b ac t e r i a lE f f e c t so f Sn ak e Ven oms

F~ a . 2 . ( A, B)

11 3 5

s i g n i f i c a n tz o n eo f i n h i b i t i o n( 6mm d i a me t e r ). Mo l a rc o mp a r i s o n s o ft e t r a c y c l i n e( 0. 1 4n mo l e s )w i t hLA0 2 ( 0. 0 0 8n mo l e s )a n dLAO1 ( 0. 0 0 2n mo l e s )s h o w e dt h a t1 7. 5 - 7 0 -f o l dm o r et e t r a c y c l i n ewa sn e c e s s a r yf o ra 3mm z o n e o fi n h i b i t i o n( T a b l e2 ). A f t e r4 8h r ,t h ei n h i b i t i o nz o n e so fLAO1 o r LA02d i dn o tc o n t a i na n yr e s i s t a n tc o l o n i e su n l i k et h o s ef o u n dwi t h i n t h et e t r a c y c l i n ei n h i b i t i o nz o n e( F i g. 2D a n dE ).

8/14/2019 Toucan Vd. 29, No . 9, Pp.

8/13

1 1 36 B G ST I L ES e t a l.

F i a. 2 , ( C , D )

A n t i b a c t e r i a la c t i v i t yc o r r e l a t e dw i t h~ - a mi n oa c i do x i d a s ea c t i v i t y. L AO1 a n dL A 0 2h a d 2 4 4a n d 1 1 3e n z y ma t i cu n i t s / mgp r o t e i n ,r e s p e c t i v e l y. L AO1 s h o w e dc o n s i s t e n t l yh i g h e ra n t i b a c t e r i a la c t i v i t yt h a nL A 0 2 ( T a b l e2 ). C r o t a l a sa t r o xv e n o m L - a mi n oa c i do x i d a s ec o n t a i n e d6 I e n z y ma t i cu n i t s / mgp r o t e i n ,w h i c hwa sl o we rt h a ne i t h e rP a u s t r a l i se n z y m e. T h e C a t r o xe n z y m ec o n c o mi t a n t l yh a d l e s sa n t i b a c t e r i a le f f e c t s( 1 8F i g= 6 mm

i n h i b i t i o nz o n e )c o m p a r e dt o e i t h e rL AO1 o r L A 0 2 ( T a b l e2 }.

8/14/2019 Toucan Vd. 29, No . 9, Pp.

9/13

A n t i b a c t e r i a lE f f e c t so f S n a k e Vcnoms l 1 3 7

FI C. 2 . ZONESo f I NI ~ I T I ONEY LAO1, LA02 ANDTETRACYCLI NEAGA I N S T. ! . h y d r o p h i l a7 9 6 5.

( A ). Di s cn o . 1 c o n t a i n s5 p g o f LAOI . P r o c e e d i n gc o u n t e r c l o c k w i s e ,e a c hd i s cc o n t a i n s2. 5p g ,1 . 2 5l + g ,0 . 6 2Rg ,0 . 3 1p g ,0 . 1 6l + g ,0 . 0 8Kg ,0 . 0 4p g a n d 0 . 0 2p g L AO 1/ d i s c. ( B ). Di s cn o. 1 c o n t a i n s5 p g o f LA 0 2 . P r o c e e d i n gc o u n t e r c l o c k w i s e ,e a c hd i s c c o n t a i n s2 . 5P g , 1. 2 5Pg , 0 . 6 2k g , 0. 3 1p g ,0 . 1 6P g , 0. 0 8h g , 0 . 0 4p g a n d 0. 0 2p g L A0 2/ d i s c. ( C ). D i s cn o. 1 c o n t a i n s1. 2 5p g o f t e t r a c y c l i n e.P r o c e e d i n gc o u n t e r c l o c k w i s e ,e a c hd i s cc o n t a i n s0. 6 2p g , 0. 3 1P g ,0 . 1 6Rg ,0 . 0 8h g , 0 . 0 4u g , 0. 0 2p g0 . 0 1! + ga n d 0 . 0 0 5Rg t e t r a c y c l i n e / d i s c. ( D). R e s i s t a n tc o l o n i e sw i t h i n t h et e t r a c y c l i n ez o n e o fi n h i b i t i o na f t e r4 8h r a t 1 . 2 5p g t e t r a c y c l i n e / d i s c ( l a b e l e da s 1 ) a n d c l o c k w i s ei s a d i s cc o n t a i n i n g0 . 6 2

p gt e t r a c y c l i n e. ( E ). L a c k o f r e s i s t a n tc o l o n i e sw i t h i nt h eLAOI z o n eo f i n h i b i t o na f t e r4 8h ra t 5 h g L AOI / d i s c( l a b e l e da s I ) a n d c l o c k w i s ei s a d i s cc o n t a i n i n g2 . 5p g LAOI .

I n h i b i t i o no f g r o w t hi n b r o t hc u l t u r e swa s a l s oo b s e r v e dw i t hLAO1, LA02 a n dC

. a t r o xL - a mi n oa c i do x i d a s e( T a b l e s3 a n d4 ). B r o t hc u l t u r e sw e r eu s e dt o a s c e r t a i ni fh y d r o g e np e r o x i d e ,o n eo f t h ep r o d u c t sf r o mL - a mi n oa c i do x i d a s er e a c t i o n s ,wa s t h ea c t u a li n h i b i t o r yc o m p o n e n t. T i t r a t i o ns t u d i e sw i t hLAO1 a n dA . h y d r o p h i l a7 9 6 5s h o w e da ne f f e c t i v eb a c t e r i c i d a lc o n c e n t r a t i o ni nb r o t hb e t we e n0 . 7 5 - 1. 5l e g / m l( T a b l e3 ). C a t a l a s ea d d e dt o c u l t u r et u b e sc o n t a i n i n g0. 5p g J m lo f LAO1 a n dA . h y d r o p h i l a7 9 6 5p r e v e n t e d

TABLE3 . ANT I ew c r ERI wLEFmc I So F LAOI AGAI NSTd . h y d r o p h i l aATCC No . 7 9 6 5u v aROTxcuLTURE

" T u r b i d i me t r i cr e a d i n g sw e r et a k e ne v e r yh o u r a t . lam. Th e i n oc u l u mp e r t u b e ( t wot u b e s p e rLAOIo o n o c n t r a t i o n )c o n s i s t e do f 3. 2x l o "c o l o n yf o r mi n gu n i t sf r o ml o g a r i t h mi cp h a s eg r o wnc e l l s.

LAOI ( p g / m l ) 0 1

Ho ur l yt u r b i d i me t r i cr e a d i n g s"

2 4 6 2 0

6 . 03 . 0Ls

0. 0 0 5 / 0 . 0 1 00. 0 1 0 J 0 . 0 1 0o. o l o / o . o l o

0 . 0 1 0 / 0. 0 1 00 . 0 1 0 J 0. 0 1 0o. o l o / o. o l o

0 . 0 0 8 / 0. 0 1 00 . 0 0 9 / 0. 0 1 0o . o l o / o. o l o

0. 0 0 8 / 0. 0 1 00 . 0 0 9 / O. O l Oo . o l o / o. o l o

0. 0 0 8 / 0 . 0 1 00. 0 0 8 / 0. 0 0 80. 0 0 8 / o. o o s

0. 0 0 5 / 0. 0 0 50. 0 0 5 / 0. 0 0 5o. o o s / o. o o s

0 . 7 5 0. 0 1 0 / 0 . 0 1 00 . 0 1 0 / 0. 0 1 0 0 . 0 t 0 / 0. 0 1 0 0. 0 1 0 / 0. 0 1 2 0. 0 0 8 / 0 . 0 1 00. 0 0 5 / 0 . 0 3 20 . 3 8 0. 0 1 0 / 0 . 0 1 00 . 0 1 0 J 0. 0 1 2 0 . 0 1 2 / 0. 0 1 2 0. 0 1 0 / 0. 0 1 0 0. 0 0 8 / 0. 0 0 8 0. 1 2 0 / 0 . 1 2 0O. 1 9 0. 0 1 0 / 0 . 0 1 00 . 0 1 2 / 0. 0 1 2 0 . 0 1 8 / 0. 0 2 5 0. 0 4 5 / 0. 0 5 0 0. 0 5 5 / 0 . 0 6 2 0. 1 4 5 / 0 . 1 5 00 . 0 9 0. 0 1 0 / 0 . 0 1 00 . 0 1 5 / 0. 0 1 5 0 . 0 2 7 / 0. 0 2 9 0. 0 5 0 / 0. 0 5 9 0. 0 6 5 / 0. 0 6 5 0. 1 4 3 / 0 . 1 4 5U n t r e a t e d 0. 0 1 0 / 0 . 0 1 00 . 0 1 8 / 0. 0 1 8 0 . 0 3 7 / 0. 0 4 0 0 . 0 5 2 / 0. 0 6 0 0. 0 6 4 / 0 . 0 7 00. 1 3 0 / 0. 1 4 5

8/14/2019 Toucan Vd. 29, No . 9, Pp.

10/13

1 1 38 H G ST I LESe t a l.

T e a r E4 . E t ~ r + e c r sa ~F c ~ r e t. ~ o x L AOI / L A0 2 / Ca t r o xL - ~ i mv oA c r ooxm~seA c r t v r r s rs a ~ s r A. h yd r o ph i l a7 9 6 sn va n m ~ r r rc t n. i v a e

' Tu r b i d i me t r i c r e a d i n g sw e r et a k e ne v e r yh o u ra t A e . Th ei n o c u l u mp e r 1 0ml n u t r i e n tb r o t ht u b eo o n n i n t e do f3. 2x 1 0 'c o l o n yf o r m i n gu n i t sf r o ml o g a r i t h m i cp h a s eg r o w nc e l l s.t U n t r e a t e d t u b e sc o n t a i n e db a c t e r i a li n o c u l u mo n l y.

$ Tu r b i d i me t r i c h e a d i n g sa r ei ng r o u p so f t h r e e( e. g.

At 2 h r , r e a d i n g sf o rLAOI ( O. s~ g / m l )= 0. 0 1 2 ,LA0 2( 1~ g / ml )= 0. 0 1 4 ,a n dA t r o x( 2P g / mp- 0. 0 1 0 ). A t r o x= C. a t r o xr. - a m i n oa c i do x i d a s e. ' I ' u r b i d i m e t r i cr e a d i n g sa r ei ng r o u p s o ft h r e e a sd e s c r i b e da b o v e. H ea i d e sc o n t a i n i n gi n a c u l u ma n dLAOI

( O. st r g / m l ) ,LA0 2 ( 1p g / m l )o rA t r o x( 2p g / ml ) ,e a c h t u b e c o n t a i n e d2 0 0 0u n i t so f c a t a l a n e.~ j T het u b ec o n t a i n e di n a c u l u ma n d2 0 0 0u n i t so fc a t a l a n e.

t h ea n t i b a c t e r i a le f f e c to fLAO1 ( T a b l e4 ). S i m i l a rr e s u l t sw e r es e e nw i t hLA 0 2a n dt h eL - a mi n oa c i do x i d a s ef r o mC a t r o x.

DI SCUSSI ON

T h i sr e p o r ts h o w st h a ts e v e r a ld i f f e r e n ts n a k ev e n o m sh a v ea n t i b a c t e r i a le f f e c t sa g a i n s tg r a m- p o s i t i v ea n dg r a m - n e g a t i v eb a c t e r i a. T he mo r ea c t i v ev e n o m sw e r ef r o mA s i a na n dA f r i c a nc o b r a s( N a j as p. ) ,A u s t r a l i a ne l a p i d s( N o t s c h i ss c e t a t u s s e e t a t e sa n dP s e ed e e h i sa e s t r a l i s ) ,a n dN o r t hAme r i c a nr a t t l e s n a k e s( C r o t a l e ss p. ). T h e r eh a sb e e na s i n g l er e p o r to fe l a p i da n t i b a c t e r i a lp r o p er t i e s a s s o c i a t e dw i t hd i r e c tl y t i cf a c t o r( ~ 7 0 0 0mo l. wt )f r o mH h a e ma c h a t e sv e n om( A L O O F - H n z s c He t a l. , 1 9 6 8 ). Ot umo l e c u l a rs i e v ec h r o m a t o g r a p h ye x p e r i me n t sr e v e a l e da n t i b a c t e r i a la c t i v i t yf r o mN n. a t r a ,N n i g r i c o l l i s ,N h . h a j ea n dP a e s t r a l i se l a p i dv e n o m so n l yi n y e l l o w ,h i g hmo l. wt f r a c t i o n s( > 1 0 0 , 0 0 0 ). Wi t ht h ep h y s i c a la n de n z y ma t i cc h a r a c t e r i s t i c so f t h ea n t i b a c t e r i a lp r o t e i n si s o l a t e d i nt h e p r e s en ts t u d y ,we c o n c l u d et h a tt h e ma j o r i t yo f a n t i b a c t e r i a le f f e c t ss e e n i n e l a p i dv e n o m se x a mi n e dwe n d u et o L - a mi n oa c i do x i d a s e( ~ 1 4 0 , 0 0 0mo l. wt )a n d n o td i r e c tl y t i c

f a c t o r.

A n t i b a c t e r i a le f f e c t so fv i p e r i dv enomsh a v ea l s ob e e ns t u d i e d( G L A S > ~ t ,1 9 4 8; S x w I t r T r s ,1 9 7 0 ). On e s t u d ys h o w e dmi n i ma le f f e c t so f v e n o m sf r o mCr o t a l e s mi t c he l l p y r r h u s( S o u t h - w e s t e r ns p e c k l e dr a t t l e s n a k e )a n dC r o b e r( r e dd i a mo n d b a c kr a t t l e s n a k e )a g a i n s tE

. c o l i ,S. a u r e u sa n dB . s e b t i l i s( GL ~t , 1 9 4 8 ). We o b s e r v e dma r k o de f f e c t sw i t ht h r e eo u to f f o u r C r o t a l e sv enomsa g a i n s tS . a e r e e sa n dB . s e b t i l i s ,b u tl i t t l ee f f e c to n E . c o l i.I n t e r e s t i n g l yv e n omf r o mt h e h i g h l yt o x i cS o u t hAme r i c a nr a t t l e s n a k e ,C d e r i s s e st e r r i f i -c w s ,wa s n e g a t i v ei n o u ra s s a y. Th ev e n o ms a mp l ewa sf r o ma g e o g r a p h i cr a c ewh i c hp r o d u c e sa w h i t ev e n o m ,s u g g e s t i n gl a c ko fL - a mi n oa c i do x i d a s e. We s u s p e c tt h a ty e l l o wv e n omf r o ma d i f f e r e n tC d . t e r r i f i t c e sp o p u l a t i o nwo u l dh a v ea n t i b a c t e r i a le f f e c t s.Th ey e l l o w c o l o ri n v e n omi sc ommon l ya s s o c i a t e dw i t ht h eFAD p r o s t h e t i cg r o u po f

L - a mi n oa c i do x i d a s e( ' I ~ r ,1 9 7 7 ).

D > b n T l t o va n dI C w N I w e x A I t( 1 9 6 8 )s h o w e dt h a tL - a mi n o

T i me( l u ) U n t r e a t e d t

H o u r l yt u r b i d i m e t r i cr e a d i n g s '

LAOI / L A0 2 / At r o x $ C a t a l a n e + LA OI / L A0 2 / A t r o x ~C a t a l a s e ~ j

0 o. a o s o. o l o / o. o l o l o . o o s o. o l s / o. o l s / o . o l o o. o l o1 o. o l s o. 0 1 2 / 0. 0 1 2 / 0 . 0 1 0 0. 0 2 0 / o. o l s / o . o l g o. o l s2 0. 0 2 6 0. 0 1 2 / 0. 0 1 4 / 0 . 0 1 0 0. 0 3 8 / 0. 0 3 s / 0 . 0 4 0 0 . 0 3 s3 0. 0 4 s 0. 0 1 0 / 0. 0 1 0 / O . O I S OO S 2 / 0 . 0 4 B J 0. 0 4 s O OS 24 OOS 2 0. 0 0 8 / 0. 0 1 0 / 0 . 0 3 s 0. 0 6 0 / O . O S S / 0. 0 6 0 0 . 0 6 0s o. o s s o. 0 1 2 / o . o l s / o . o s o 0. 0 6 0 / o . o 6 z / o. o 6 0 0 . 0 6 06 0. 0 6 0 0. 0 0 9 / o . o 3 s / o . o s o o. o 6 s /o. m o / o. o 60 0. 0 6 02 0 o. 1 4 g o. o g s / o . l l 2 / 0 . 1 2 2 o. l s o / o. l 2 0 / 0. 1 3 0 o. l a g

8/14/2019 Toucan Vd. 29, No . 9, Pp.

11/13

An ba c t c r i a lE8 ' e c t so f S n a k e Ven oms 1 1 3 9

a c i do x i d a s ewa s p r e s e n ti n g r e a t e rq u a n t i t yi n y e l l o wt h an wh i t e v e n oms o f Vi p e r sr u s s e l l i. Ye l l o wv e n o m f r o mV i p e r sa mmo d y t e s h a d2 0 0 t i me smo r e L - a mi n oa c i d o x i d a s et h a n wh i t e v e n o ms f r o m t h e s ame s p e c i e s( KORNAL I Ka n d M~ s r e t , 1 9 6 4 ). Two l i g h t l yy e l l o wv e n o ms f r o mN me l a n o l e uc aa n d N n . o x i a na we r e n e g a t i v ei n o u r a n t i b a c t e r i a la s s a ywh i l ef i v emo r e ma r k e d l yy el l o wv e n oms , f r o m Na j a s p. , we r e p o s i t i v e.

An o t h e r r e p o r td e s c r i b e d t h ea n t i b a c t e r i a le f f e c t so f L - a mi n o a c i d o x i d a s e f r o mC o d ama n t e u sv e n o m a g a i n s t v a r i o u sg r a m- n eg a t i v eb a c t e r i a( SKARNE4 ,1 9 7 0 ). E s c h e r i c h i ac o l i wa s t h e mo s t r e s i s t a n tb a c t e r i u m t e s t e d r e q u i r i n ga 5 0~g / m c o n c en t r a -t i o n o f e n z y me t o g e t a I I L DSp d o s e ( SR. A RNE 3 ,1 9 7 0 ). An e f f e c t i v eL n ~ d o s e o fC a d ama r e t e u se n z y me f o r P a e r u g i n o s awa s 3 . 5pg J ml . Th i s c o r r e l a t e swi t h o u r f i n d i n g ss h o wi n g i n c r e a s e ds u s c e p t i b i l i t yo f P . a e r u g i n o s a ,c o mp a r e d t o E c o l i , u s i n gv i p e r i dv e n o ms . L i t t l eo r n o e f f e c twa s s e e n w i t he l a p i dv e n o ms t e s t e da g a i n s tP a e r u g i n o s ao rE c o l i.

I n i t i a lf r a c t i o n a t i o no f P a u s t r a l i sv e n o m o n a mo l e c u l a r s i e v ec o l u mn y i e l d e dt h r e e

s u c c e s s i v e ,y e l l o wf r a c t i o n sc o r r e s p on d i n gt o a n t i b a c t e r i a la c t i v i t y. A s u b s e q u e n t

c a t i o ne x c h a n g e s t e p r e s o l v e dt wo p r o t e i n s ,L AO1 a n d LA02 , w i t ha n t i b a c t e r i a lp r o p e r t i e s.Bo t h h a d z - a mi n o a c i do x i d a s ea c t i v i t ya n d i d e n t i c a l n a t i v ea n d s u bu n i tmo l . wt s . Th en a t i v emo l , wt s o f L AO1 o r LA0 2 ( 1 4 2 , 0 0 0 )we r e v e r ys i m i l a rt o t h e 1 40 , 0 0 0 d e t e r mi n a-t i o n f o r C a d ama n t e u s v e n o m t - a mi n o a c i d o x i d a s e ( D~ c o x a n d RAW7 TCH, 1 9 6 9 ).P u r i f i e dp r e p a r a t i o n s o fL AO1 we r e n o t i c e a b l yy e l l o wwh i l eL A 0 2 1 a c k e da n y c o l o r. Th ep e r c e p t i b l ec o l o rma y b e a t t r i b u t e dt o t h et e n - f o l dh i g h e rp r o t e i nc o n cen t r a t i o no f L AO1 .

A n t i b a c t e r i a le f f e c t so f L AO1 a n d LA0 2 c o r r e l a t e dw e l l ,b u t n o t p e r f e c t l y ,wi t h t h ee n zy ma t i c a c t i v i t yo f e a c h p r o t e i n. Fo r i n s t a n c e ,t h e r ei s a f o u r - f o l dd i f f e r e n c eb e t we e nLAO1 a n d LA0 2 i n a n t i b a c t e r i a la c t i v i t y( d i s cd i f f u s i o n ) ,y e to n l y a t wo - f o l dd i f f e r e n c ei ne n zy ma t i ca c t i v i t y. Di s c r e p an c i e sb e t we e n t h eb i o l o g i c a la n d e n zy ma t i ca c t i v i t i e so f L AO1

a n d LA0 2 ma y b e d u e t o p r o f e s s e sp r o d u c edb y me t a b o l i c a l l ya c t i v eb a c t e r i a. Si n c eb o t hp r o t e i n sh a v e d i f f e r e n te l u t i o np r o f i l e so n c a t i o ne x c h a ng e c h r o ma t o g r a p hy ,t h e a mi n oa c i d s e q u e n c e s p r o b ab l yd i f f e ra n d r e n d er LA02 , wh i c h h a s l e s sa n t i b a c t e r i a la c t i v i t yr e l a t i v et o e n z yma t i c a c t i v i t y ,mo r e s u s c e p t i b l et o p r o f e s s e s. T h e mi n i mum e f f e c t i v eb a c t e r i c i d a ld o s e o f L AO1 f o r A h y d r o p h i l a7 9 6 5 i n b r o t h wa s b e t we e n 0 . 7 5 a n d1. 5p g / ml.T h er e h a v e b e e n n o p r e v i o usr e p o r t s c h a r a c t e r i z i n ga n L - a m n o a c i do x i d as e f r o m

P a u s t r a l i sb u t i s o e n z yme s o f L - a mi n oa c i do x i d a s e a r ec ommo n i n o t h e rs n a k e v e n o ms .As many a s 1 8i s o f o n ms o f t h ee n z y me h av e b e e n f o u n di n C a d ama n t e u s v e n o m( HwFsa n d WEL LNSR, 1 9 6 9 ). Ou r s t u dy s h ow e d t h a t C a d ama n t e e r sv e n o mc o n t a i n eds i g n i f i c a n ta n t i b a c t e r i a la c t i v i t y. As r e p o r t e d wi t hC a d ama n t e u s t , - a mi n oa c i do x i d a s e( S x ~ x r r ts ,

1 9 7 0 ) ,c a t a l a s ea l s on e u t r a l i z e dt h ea n t i b a c t e r i a le f f e c t so f L AO1 a n d LA0 2 . So me o f t h ev i p e r i dv e n o ms p r o d u c e d l a r g e ri n h i b i t i o nz o n e s r e l a t i v et o e l a p i dv e n o ms. Th i s ma y b ed u e t o d i f f e r e n c e si n z - a m n o a c i d o x i d a s e c o n c e n t r a t i o n ,e nz y ma t i c a c t i v i t yo f t her . - a m n o a c i do x i d as ea nd / o r t h e r ema y b e a n o t h er u nd es c r i b eda n t i b a c t e r i a lc omp o n e n t.Th e c o n c en t r a t i o na n d / o r a c t i v i t yo f z - a m n o a c i do x i d a s ep r e s e n ti n n on r e ac t i n gv e n o msi s p r o b a b l y l o we r t h an t h e r e a c t i v ev e n o ms .

An t i b a c t e r i a l e f f x t so f s n a k e v e n o ms a g a i n s tA h y d r o p h i l a ,a ma j o r p a t h o g en o fr e p t i l e sa n d a mp h i b i a n s ( Fs z ~ s n n i e t a l. , 1 9 7 2; Gma s e t a l. , 1 9 7 1; Hu t s e t a l. , 1 9 8 3 ) ,h a v e n o t b e e n r e p o r t e dp r e v i o u s l y. A e r omo n a s s p e c i e sa r e a l s o o p p o r t u n i s t i ch umanp a t h o gen s , c au s i n gwound i n f e c t i o n sa n d d i a r r h e a ld i s e a s e( Hi c x Mwx - BRENNERe t a l. ,1 9 8 7; PI TARANGSIe t a l. , 1 9 8 2 ). We o b s er v ed a n t i b a c t e r i a le f f e c t sa g a i n s td i f f e r e n ts t r a i n so f

A . h y d r o p h i l aa n d A s o b r i ai s o l a t e df r o mc u t a n eo u sl e s i o n so f f r o g sa n d a b o ac o n s t r i c t o r

8/14/2019 Toucan Vd. 29, No . 9, Pp.

12/13

1 1 40 B. G ST I LESe t a l.

w i t ha s e p t i cs t o ma c hu l c e r. F r o g sc a nb e a r e s e r v o i rf o rA. h y d r o p h i l a( H>Rn e t a l. , 1 9 8 3 )a n d c o mp r i s ea s i g n i f i c a n tp a r t o f t h e P a u s t r a l i s d i e t( C o c ~ e t ,1 9 8 3; SHI NE a n dCov ACEVI CH, 1 9 8 3 ). An A . v e r o n s t r a i n ,i s o l a t e df r o ma humand i a r r h e a ls t o o ls p e c i me n ,w a s n o ta f f e c t e db y e i t h e rLAO1 o r LA02. Ob v i o u s l y ,t h e r ei sv a r i a t i o ni nt h eLAO1a n dLA02 s u s c e p t i b i l i t yamong d i f f e r e n ts p e c i e sa n ds t r a i n so fA e r o r n o r e a s.A n t i b a c t e r i a le f f e c t so f LAO1 a n dLA02w e r ea l s s e e n w i t ha S. a u r e u swound i s o l a t e

a n d as p o r ef o r mi n gB s t ~ b t i l i s. I t i sn o t e w o r t h yt h a tS . a u r e u sa n dA . h y d r o p h i l a ,wh i c hw e r et h emo s ts e n s i t i v eb a c t e r i at e s t e dw i t hLAO1 a n d LA02, a l s op r o d u c ec a t a l a s ed u r i n gg r o w t h( I CRI EGe t a l. , 1 9 8 4 ) ,b u to b v i o u s l yn o ti ns u f f i c i e n tq u a n t i t i e st oc o u n t e r a c tt h eb a c t e r i c i d a lq u a n t i t i e so f H20 Z p r o d u c e db y LAO1 o r LA02.Th e f u n c t i o no f L - a mi n oa c i do x i d a s e si n s n a k evenomsi s p o o r l yu n d e r s t o o d. Some

a u t h o r ss u g g e s tt h a ti tma y s e r v ea d i g e s t i v ef u n c t i o n( MI NTON a n dMi N~ r oN, 1 9 8 0 ). Wh i l ewe a n do t h e r sh a v e d e mo n s t r a t e da na n t i b a c t e r i a lp r o p e r t ya s s oc i a t e dw i t hs n a k ev enomL - a mi n oa c i d o x i d a s e ,t h eb i o l o g i c a l s i g n i f i c a n c er e ma i n su n c l e a r.

REFERENCES

At o oF - Hr n s c x ,S . , D e v x > F S ,A . a n dH ~ e e 3 e a ,A . ( 1 9 6 8 )Th e d i r e c tl y t i cf a c t o ro f c o b r av e n om: P u r i f i c a t i o na ndc h e mi c a lc h a r a c t e r i z a t i o n. B t o c h i m. b i o p h y s. Ac t s1 3 4 ,530 .

BeueR ,A . W , Kl a a Y,W M , S ~ a x s , J . C . a nd T t r n c ,M ( 1 9 6 6 )A n t i b i o t i cs u s c e p t i b i l i t y t e s t i n gb y as t a n d a r d i z e ds i n g l ed i s kme t h o d. Mr . J . C l i p. Pa t h. 4 3 ,49396 .

Cw, Y . H . , L r o u ,R . F . ,Hu , C . T. , J u eN ,C . C . a nd Ye x a , J . T . ( 1 9 8 7 )I n t e r a c t i o no f s n a k ev e n o mc a r d i o t o x i n( ame mb r a n e - d i s r u p t i v ep o l y p e p t i d e )w i t hh uma n e r y t h r o c y t e s. A f o l. Ce l l. B i o c h e me. 7 3 , 6 9 - 7 6.

COCC e a a ,H . G ( 1 9 8 3 )R e p t i l ea nd Mc P h l b i a n so j A u s t r a l l a. Reed : New So u t hWa l e s.Cuan , B. , Ma s e r , V a n dZ. e r t mr u ,M ( 1 9 6 8 )I n a c t i v a t i o no f s n a k ev e n omt - a mi noa c i do x i d a s eb y f r e e z i n g.J . b i o l. C h e n e. 2 4 3 ,2 3 0 6 - 2 3 1 4.

De a o x , A . a nd Re wr r c x ,A . B. ( 1 9 6 9 )S t u d i e son t - a mi n oa c i do x i d a s e. I I. Di s s o c i a t i o na n d c h a r a c t e r i z a t i o no fi t ss u b u n i t s. B i c e h e m i r t r y8 , 1 4 0 1 4 1 1 .

Dr ~ o v, G D . a n d I C e n t e t e x r c e x ,R . C . ( 1 9 6 8 ) F r a c t i o n a t i o no f V i p e r sr u s s r i l ib yg e lf i l t r a t i o n. I I. Comp a r a t i v es t u d yo f y e l l o wa nd w h i t evenoms o f Y i p e r ar u s s e l l iw i t hs p x i a lr e f e r e n c et o t h el o c a ln e c r o t i z i n ga nd l e t h a la c t i o n s. T ox i c o nS , 2 8 3 - 2 9 0.

E s t e t e e e n r ,A . H . , E , F . a n dK a e t a ,M A . ( 1 9 7 2 )I s o l a t i o na n d i d e n t i f i c a t i o no f . l e r a n o n a sh y d r o p h i l af r o m a no u t b r e a ko f h a e mo r r h a g i cs e p t i c e mi a i ns n a k e s. C a r e. J . Comp . Me d 3 7 , 4 1 8 2 0 .

F e e a v e t ,J . F . , S r n r e u x ,W H . a n d Co l e ,L . J . ( 1 9 6 8 ) A n t i b a c t e r i a la c t i o no f m e l i t t i n ,a p o l y p e p t i d ef r o mb e ev e n om. P r o c. So c . Ex p . Bl o l. Me d . 1 2 7 ,7 0 7 - 7 1 0.

G~, E . L. , Ne c e , G W a n d E e r x o N S ,M B . ( 1 9 7 1 )Th e l i v ef r o gi s a l mo s td e a d. B i o s c i mc e2 1 ,1 0 2 7 - 1 0 3 4.G LA S E a ,H . S . R . ( 1 9 4 8 )B a c t e r i c i d a la c t i v i t yo f Cr o t a h vv e n o mI n v i t r o. Co p e i a4 , 2 4 2 4 7 .HeYFSM B. a n d W ~ r r n n , D . ( 1 9 6 9 )Mi c r o h e t e r o g e n e i t yo f L - a mi n oa c i do x i d a s e: Se p a r a t i o no f mu l t i p l e

c omp o ne n t s b y p o l y a c r y l a mi d eg e l e l e c t r o f o c u s i n g. J . b i o l. Ch r m. 2 4 4 ,6 6 3 E ~ 6 6 4 4.H r c e u x - B x s r r x c a ,F . W , Mec DoNe t n , K L. , Sr ~ e we t r , A . G , F e x x n ~ r a , . R . , Bn ~ xr , D . J . a n d

F e x e ~ a , J . J . ( 1 9 8 7 )A e r n r r e o r e a sv e r o n ,a n e w o r n i t h i n e d e c a r b o x y l a s o - p o s i t i v es p e c i e s t h a tma y c a u s e

d i a r r h e a.

J.

C l i p.

A f k r o b i o l.

2 3 ,9 0 0 - 9 0 6.

H r a n , D . W , D r n s c e ,S . L . , McK n vNe t t ,R . G , G o x x e e y E. , Mex r n v, F . H. , MEeooWS, C . A . a n dGe s t o a o ws t ,M ( 1 9 8 3 )En t e r o b a c t e r i a c e a ea n d Ae r omona s h y d r o p h i l ai n Mi n n es o t af r o g sa nd t a d p o l e s( Ra n gp i p i e n s ). App l. En v i r o n. Mi c r o b l o l. 4 6 , 1 4 2 3 - 1 4 2 5.

K ow v e u a F . a nd M e s s r a a ,R . W P . ( 1 9 6 4 )A c omp a r a t i v e e x a mi n a t i o no f y e l l o wa nd w h i t evenoms o f V i p e r oa n u n o d y t c s. T o x i c o n2 , 1 0 9 - 1 1 5.

Kx o , N . R . , Hot r , J . G , S r i p w r x ,P . H . A . , S r e t r a r ,J . T . a n dWI LUANS,S . T . ( 1 9 8 4 )B e r g e ys Mamml o fSy s t e ma t i cBa c t e r i o l o g y. Ba l t i mo r o: Wi l Ga ma a n dWi l k i n s.

L e t a w e a. r ,U K ( 1 9 7 0 )Cl e a v a g eo f s t r u c t u r a lp r o t e i n sd u r i n g t h ea s s e mb l yo f t h eh e a d o f b a c t e r i o p h a g eT4 .N a t u r e2 2 7 ,6 8 0 8 5 .

Mwr oN ,S . A . a n dMr r r r o r e ,M R . ( 1 9 8 0 )Venomous R e p t i l e s. New Yor k : Sc r i b n e r s.P r r e A e x c e a ,C . , F x ~ v > a e w e ,P . , Wx i l a n ne ,R . , T r n e r e r ,C . , F o x e t e t ,S. , D e e o ~ , G J . a nd T Rd ( i r A 1. e P O NO ,

M ( 1 9 8 2 )En t e r o p a t h o g e n i c i t yo f A e r o r r e o n a sh y d r a p h l l aa n d Pk s i omo r ws s h ( g e l l o i d e s: P r e v a l e n c eamongi n d i v i d u a l swi Wa nd w i t h o u td i a r r h e ai n T h a i l a n d. I n j e c t. I mme a e. 3 3 ,6 6 6 7 3 .

Sr n ~ , R . a n d Cov e c e v r cH , J . ( 1 9 8 3 )Ec o l o g y o fh i g h l yvenomous s n a k e s: Th e A u s t r a l i a ng e n u sOxy u r ame ,

( E l a p i d a e ). J . H e r p e t o l. 1 7 , 6 0 - 6 9.

8/14/2019 Toucan Vd. 29, No . 9, Pp.

13/13

A n t i b a c t e r i a lE f f e c t so fS n a k eVenoms 1 1 4 1

S t c w a r ~ s ,R C. ( 1 9 7 0 )t - a m i n oa c i do a i d a s e ,a b a c t e r i c i d a ls y s t e m. N a t u r e2 2 5 ,( 0 7 2 - 1 0 7 3.S e a ' r x ,P K , Kxo xN ,R L ,H~x s o x , G T. ,Mec. t. u ,A K . , G ~ x r x e a ,F . H . P a o v a v z u v o ,M D , F u n x o r o ,E K . , GO~CE, N M , O r s o x ,B J . a n dKi m, D C. ( 1 9 8 5 )Me a s u r e me n to fp r o t e i nu s i n gb i c i n c h o n i n i ca c i d.. l n a l. Bi o c h e m. 1 3 0 ,7 t ~ 8 5.

T x oM e s ,R G a n dP o u a x ,F . H ( 1 9 7 9 )Th e e f f e c to f r a t t l e s n a k ev e n omo n d i g e s t i o no f p r e y. Tox l c o n1 7 ,2 2 1 - 2 2 8.

T u ,A . T ( 1 9 7 7 )Ve n om s: Ch e mi s t r ya n d Mo l e c u l a rB i o l o g y. Ne wYo r k: Whey.Wont. n Hr wt r xO x a ~ r n z r ~ n o x. ( 1 9 8 1 )P r o g r e s si n t h e c h a r a c t e r i z a t i o no f v e n o m sa n d s t a n d a r d i z a t i o no fa n t i v e n o ma. WHO o f f s e tp u b. S8 , 2 3 - 2 4.

Z r a , r ~ tE . A . ( 1 9 4 8 )E n r y m e so f s n a k ev e n o m sa n dt h e i r b i o l o g i c a l s i g n i f i c a n c e. Ad v. E t r z y m o l. 8 , 4 5 9 9 5 .