8/3/2019 Thomas Podleski et al- Compared Effects of Dithiothreitol on the Interaction of an Affinity-Labeling Reagent with Ac

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COMPARED EFFECTS OF DITHIOTHREITOL ON THE INTERACTIONOF AN AFFINITY-LABELING REAGENT WITHACETYLCHOLINESTERASE AND THE EXCITABLEMEMBRANE OF THE ELECTROPLAX*

BY THOMAS P O D L E S K I , J E A N - C L A U D E M E U N I E R , ANDJ E A N - P I E R R E CHANGEUXDAPARTEMENT DE BIOLOGlE M O L A C U L A 1 R E , INSTITUT PASTEUR, PARIS

C o m m u n i c a t e d b y J a c q u e s M o n o d , Ma y 1 5 , 1 9 6 9A b s t r a c t . - p - ( t r i m e t h y l a m m o n i u m ) b e n z e n e d i a z o n i u m d i f l u o r o b o r a t e ( T D F ) ,

a n a f f i n i t y - l a b e l i n g r e a g e n t o f t h e a c e t y l c h o l i n e r e c e p t o r s i t e ( s ) , w h i c h i n t h en o r m a l c e l l a c t s a s a n i r r e v e r s i b l e i n h i b i t o r b e c o m e s a r e v e r s i b l e a c t i v a t o r a f t e ri n v i v o e x p o s u r e o f t h e e l e c t r o p l a x t o d i t h i o t h r e i t o l ( D T T ) , a d i s u l f i d e b o n d r e -d u c i n g a g e n t . A f t e r i n v i t r o e x p o s u r e o f a c e t y l c h o l i n e s t e r a s e t o DTT, TDF b e -c o m e s a r e v e r s i b l e c o m p e t i t i v e i n h i b i t o r o f t h e e n z y m e , u s i n g i n d o p h e n y l a c e t a t ea s t h e s u b s t r a t e . B o t h a c e t y l c h o l i n e s t e r a s e a n d t h e m a c r o m o l e c u l a r r e c e p t o r o fa c e t y l c h o l i n e t h u s c o n t a i n d i s u l f i d e b o n d s . A d d i t i o n a l e x p e r i m e n t s w i t h DTTs u g g e s t t h a t t h e r e m i g h t e x i s t s e v e r a l d i f f e r e n t c l a s s e s o f r e c e p t o r s i t e s f o rc h o l i n e r g i c a g e n t s i n t h e e x c i t a b l e m e m b r a n e o f t h e e l e c t r o p l a x .

I n a p r e c e d i n g p a p e r we h a v e s h o w n t h a t p - ( t r i m e t h y l a m m o n i u m ) b e n z e n ed i a z o n i u m d i f l u o r o b o r a t e ( T D F ) may b e u s e d a s a n a f f i n i t y - l a b e l i n g r e a g e n tf o r t h e s i t e ( o r s i t e s ) w h i c h a r e i n v o l v e d i n t h e e l e c t r o g e n i c a c t i o n o f a c e t y l -c h o l i n e ( A C h ) o n t h e e l e c t r o p l a x m e m b r a n e . ' On t h e o t h e r h a n d w e h a v es t u d i e d t h e a f f i n i t y l a b e l i n g b y TDF o f a c e t y l c h o l i n e s t e r a s e ( A C h E ) , a n e s s e n t i a lc o m p o n e n t o d t h e e l e c t r o p l a x m e m b r a n e , 2 a n d h a v e s h o w n t h a t TDF c o v a l e n t l yb i n d s t o a t l e a s t t w o c l a s s e s o f s i t e s o n t h e e n z y m e . 4 O n e o f t h e m i s c o n s t i t u t e db y t h e a n i o n i c s i t e o f t h e a c t i v e c e n t e r a n d t h e o t h e r b y a g r o u p o f n o n c a t a l y t i c ,a n i o n i c , s i t e s l o c a t e d o u t s i d e t h e a c t i v e s i t e : t h e " p e r i p h e r a l a n i o n i c c e n t e r s . " 5T h e q u e s t i o n t h e n i s r a i s e d : Do a n y o f t h e s e TDF b i n d i n g s i t e s c a r r i e d b yAChE c o r r e s p o n d , i n p a r t a t l e a s t , t o t h e p h y s i o l o g i c a l r e c e p t o r s i t e ( s ) o f ACh?T h e p r e s e n t e x p e r i m e n t a l e v i d e n c e i s s t i l l t o o f r a g m e n t a r y t o a l l o w a d e f i n i t i v ea n s w e r t o t h i s q u e s t i o n . We s h a l l o n l y p r e s e n t s o m e e x p e r i m e n t a l d a t a w h i c hi n d i c a t e t h a t t he r e a c t i v i t y t o w a r d TDF o f b o t h AChE a n d t h e m a c r o m o l e c u -l a r r e c e p t o r ( s ) o f ACh p r e s e n t s t r i k i n g s i m i l a r i t i e s .

K a r l i n a n d a s s o c i a t e s 6 - 8 h a v e c o m p a r e d t h e e f f e c t s o f a d i s u l f i d e b o n d r e d u c -i n g a g e n t , d i t h i o t h r e i t o l , i n v i v o o n t h e e l e c t r o p l a x p r e p a r a t i o n a n d i n v i t r o o np u r i f i e d A C h E . 3 T h e y h a v e s h o w n t h a t DTT t r e a t m e n t p e r t u r b s t h e e l e c t r o -p l a x r e s p o n s e t o a v a r i e t y o f c h o l i n e r g i c a g e n t s . F o r i n s t a n c e , t h e r e s p o n s e t oa t y p i c a l r e c e p t o r a c t i v a t o r , c a r b a m y l c h o l i n e , i s r e d u c e d w h i l e h e x a m e t h o n i u m ,a c o m p o u n d r e p o r t e d t o b e a r e c e p t o r i n h i b i t o r i n t h e n o r m a l c e l l , b e c o m e s ar e c e p t o r a c t i v a t o r i n t h e D T T - t r e a t e d c e l l ( D T T - c e l l ) . On t h e o t h e r h a n d , DTTh a s n o e f f e c t on AChE a c t i v i t y i n v i t r o , a n d K a r l i n c o n c l u d e d f r o m t h e s e e x p e r i -m e n t s t h a t AChE a n d t h e A C h - m a c r o m o l e c u l a r r e c e p t o r w e r e d i s t i n c t m a c r o -m o l e c u l a r e n t i t i e s . 7

1 2 3 9

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BIOCHEMISTRY: PODLESKI ET AL.We h a v e r e i n v e s t i g a t e d t h i s p o i n t i n s o m e d e t a i l , u s i n g TDF a s a p r o b e . I tw a s f o u n d t h a t T D F , a n i r r e v e r s i b l e r e c e p t o r i n h i b i t o r o f t h e n o r m a l c e l l , b e -c o m e s a r e v e r s i b l e r e c e p t o r a c t i v a t o r o f t h e D T T - c e l l . F u r t h e r m o r e , a f t e r e x -t e n s i v e e x p o s u r e o f AChE t o DTT i n v i t r o , TDF b e c o m e s a r e v e r s i b l e c o m p e t i t i v ei n h i b i t o r o f AChE u s i n g i n d o p h e n y l a c e t a t e a s t h e s u b s t r a t e . T h e s e r e s u l t s s u g -g e s t t h a t b o t h AChE a n d t h e m a c r o m o l e c u l a r r e c e p t o r f o r ACh p o s s e s s d i s u l f i d eb o n d s w h o s e r u p t u r e l e a d s t o p a r a l l e l a l t e r a t i o n s o f t h e p r o p e r t i e s o f b o t h c o m -

p o n e n t s .( 1 ) I n v i v o E f f e c t o f DTT o n t h e R e a c t i o n o f TDF w i t h t h e E l e c t r o p l a x . -A s s h o w n p r e v i o u s l y , e x p o s u r e o f t h e i n n e r v a t e d m e m b r a n e o f t h e e l e c t r o p l a xt o TDF d o e s n o t r e s u l t i n a n y c h a n g e o f m e m b r a n e p o t e n t i a l o r r e s i s t a n c e ,w h i l e , o n t h e o t h e r h a n d , t h e c e l l r e s p o n s e t o r e c e p t o r a c t i v a t o r s s u c h a s c a r -b a m y l c h o l i n e ( C a r b ) o r d e c a m e t h o n i u m ( D e c a ) i s r e d u c e d . TDF b e h a v e s a sa n i r r e v e r s i b l e r e c e p t o r i n h i b i t o r . D r a m a t i c a l t e r a t i o n s o c c u r f o l l o w i n g a t e n -m i n u t e t r e a t m e n t o f t h e i n n e r v a t e d m e m b r a n e o f t h e e l e c t r o p l a x w i t h 1 0 - 3 MDTT i n R i n g e r ' s s o l u t i o n b u f f e r e d a t pH 8 . 0 w i t h 2 X 1 0 - 3 M T r i s . A t 5 X1 0 - 7 l T D F , a n d a t h i g h e r TDF c o n c e n t r a t i o n s a d e p o l a r i z a t i o n a n d a d e -c r e a s e o f m e m b r a n e r e s i s t a n c e a r e r e c o r d e d : i n o t h e r w o r d s , TDF a c t s a s a na c t i v a t o r o f t h e D T T - c e l l ( F i g . l b ) .C o n t i n u o u s p e r f u s i o n w i t h TDF g i v e s , i n t h e s e c o n d i t i o n s , s t e a d y - s t a t e d e -p o l a r i z a t i o n s l i k e a t y p i c a l a c t i v a t o r i n a n u n t r e a t e d c e l l . F o r c o n c e n t r a t i o no f TDF a b o v e 1 0 - 5 M , s t e a d y s t a t e s a r e n o l o n g e r o b s e r v e d , a n d a n i n i t i a l d e -p o l a r i z a t i o n i s r a p i d l y f o l l o w e d b y a r e p o l a r i z a t i o n ( F i g . l a ) .I n o r d e r t o r e d u c e t h e n o n s p e c i f i c b i n d i n g o f TDF t o t h e m e m b r a n e , e x p e r i -

2 . 1 0 - 5 M 0 ' M T D F 2 x 1 0 - 5 MC a r b I F C a r bm V 'r 1 7 0 | Ah r A- 1 7 0Ar, 1 0 3 O T Y6M T D F a>17AI S [ _ p

- 1 5 0m V v 5 x 1 0 6 M h - 1 0 0- 1 7 0 [ E 1 0 - 6 M T O F b

- 1 5 0 CmVm V OM T O F , h

_ - 1 7 0 A5 OR i 5 0 [ t10Ma0m V I o 0 - 8 MdTC ( a )MTDFfn0a5MdTCDF .-*- -1 0 . R

- 1 6 0-140

P ~ ~~~~~~~~~~P0 7-140 ~~~~0i n 0 h 2 0 m i nF I G . 1 . - R e v e r s i b l e d e p o l a r i z a t i o n o f t h e e l e c t r o p l a x m e m b r a n e b y TDF a f t e r a 1 0 - m i me x p o s u r e t o 1 0 - ' 1 M DTT. ( a ) E f f e c t o f v a r i o u s c o n c e n t r a t i o n s o f TDF a n d b l o c k a d e b y d -t u b o c u r a r i n e . F i r s t l i n e : c o n t r o l ; s e c o n d , t h i r d , f o u r t h , a n d f i f t h l i n e s : t h e c e l l w a s e x p o s e d t o1 0 - 3 MDTT i n R i n g e r ' s s o l u t i o n b u f f e r e d w i t h 2 X 1 0 - 3 M T r i s p H 8 . 0 . ( b ) R e v e r s i b i l i t y o ft h e e f f e c t o f TDF o n m e m b r a n e r e s i s t a n c e a n d p o t e n t i a l . A b b r e v i a t i o n s : r , R i n g e r ' s s o l u t i o n ;P , R i n g e r ' s s o l u t i o n s u p p l e m e n t e d w i t h 5 X 1 0 - 2 M Na p h o s p h a t e p H 5 . 7 ; h , 1 0 - 3 M i ,h i s t i d i n e i n P , t o q u e n c h u n r e a c t e d TDF; C a r b , c a r b a m y l c h o l i n e c h l o r i d e ; d T C , d - t u b o c u r a r i n ec h l o r i d e .

1 2 4 0 P R O C . N . A . S .

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BIOCHEMISTRY: PODLESKI ET AL.m e n t s w e r e p e r f o r m e d a t a c i d i c p H ( c l o s e t o p H 5 . 7 ) w h e r e t h e r e a c t i v i t y o f t h ed i a z o n i u m g r o u p i s d e c r e a s e d . A t t h i s p H t h e r e s p o n s e o f t h e n o r m a l c e l l t oC a r b i s r e d u c e d b y a f a c t o r o f 2 . I t i s r e m a r k a b l e t h a t i n t h e s a m e c o n d i t i o n st h e r e s p o n s e o f t h e D T T - c e l l t o TDF i s l a r g e . TDF f o l l o w i n g DTT t r e a t m e n tt h u s a c t s a s o n e o f t h e m o s t p o w e r f u l a c t i v a t o r s k n o w n o f t h e e l e c t r o p l a x .O n e o f t h e m o s t s t r i k i n g f e a t u r e s o f t he r e s p o n s e o f t h e D T T - c e l l t o TDFc o n c e r n s t he r e v e r s i b i l i t y o f TDF a c t i o n . A s s h o w n o n F i g u r e l b , b o t h t h ed e p o l a r i z a t i o n a n d t h e d e c r e a s e o f m e m b r a n e r e s i s t a n c e p r o d u c e d b y TDF a r er e v e r s e d b y p e r f u s i o n w i t h R i n g e r ' s s o l u t i o n s u p p l e m e n t e d w i t h 5 X 1 0 - 2 A Is o d i u m p h o s p h a t e p H 5 . 7 : TDF a c t s a s a r e v e r s i b l e r e c e p t o r a c t i v a t o r . T h er a t e o f r e p o l a r i z a t i o n , m e a s u r e d i n t h e s e c o n d i t i o n s , a r e much s l o w e r t h a n t h o s er e c o r d e d w i t h t h e n o r m a l c e l l u s i n g a c t i v a t o r s s u c h a s C a r b o r D e c a , b u t a t a l lTDF c o n c e n t r a t i o n s t e s t e d , t h e r e v e r s i o n o f TDF e f f e c t i s c o m p l e t e i n l e s s t h a n2 0 m i n u t e s . M o r e o v e r t h e D T T - c e l l s t i l l r e s p o n d s t o C a r b a f t e r TDF e x -p o s u r e .

I n a p r e v i o u s w o r k 9 ' 1 0 we h a v e p r e s e n t e d e x p e r i m e n t a l e v i d e n c e t h a t t h eb i n d i n g s i t e s f o r D e c a a n d C a r b m i g h t b e t o p o g r a p h i c a l l y d i s t i n c t . I t w a s t h e no f i n t e r e s t t o r e i n v e s t i g a t e t h e e f f e c t o f DTT o n t h e c e l l r e s p o n s e t o b o t h C a r ba n d D e c a . We c o n f i r m e d t h e o b s e r v a t i o n o f K a r l i n a n d B a r t e l s 6 t h a t t he r e -s p o n s e t o C a r b i s d e c r e a s e d a f t e r DTT t r e a t m e n t , b u t i n a d d i t i o n we f o u n dt h a t t h e r e s p o n s e t o D e c a i s p o t e n t i a t e d i n s t e a d o f b e i n g r e d u c e d ( s u c h a no b s e r v a t i o n h a s a l s o b e e n m a d e i n d e p e n d e n t l y b y K a r l i n " 1 ) . F u r t h e r m o r e weo b s e r v e d t h a t t h e a m p l i t u d e o f t h e r e s p o n s e t o D e c a i s n o t s t a b l e w i t h t i m e ( F i g .2 ) : A b o u t 2 0 m i n u t e s a f t e r DTT e x p o s u r e t h e a m p l i t u d e o f t he r e s p o n s e d e -c r e a s e s b y 5 0 p e r c e n t , w h i l e i n t h e c a s e o f t h e n o r m a l c e l l r e p e t i t i v e e x p o s u r e st o 4 X 1 0 - M D e c a ( f o u r t i m e s t h e c o n c e n t r a t i o n u s e d i n F i g . 2 ) a l w a y s g i v et h e s a m e r e s p o n s e . O f i n t e r e s t i s t h e f a c t t h a t t h e r e s p o n s e t o TDF f o l l o w i n g

C -O

DE 0 e. 8 0 v v '- 6 0 [ iArAA A r loArA m i n

F I G . 2 . - D i f f e r e n t i a l e f f e c t s o fDTT o n t h e e l e c t r o p l a x r e -s p o n s e t o d e c a m e t h o n i u m , c a r b -a m y l c h o l i n e , a n d TDF. T h ec e l l w a s e x p o s e d t o 1 0 - 1 MDTT i n T r i s R i n g e r p H 8 ( r a ) f o r5 m i n . F i r s t l i n e : t h e a m p l i t u d eo f t h e p o t e n t i a t e d r e s p o n s e t o1 0 - M d e c a m e t h o n i u m . ( D e c a )d e c r e a s e s a s a f u n c t i o n o f t i m e .S e c o n d l i n e : t h e a m p l i t u d e o ft h e r e d u c e d r e s p o n s e t o 2 X1 0 - 5 M C a r b ( C a r b ) i s s t a b l ew i t h t i m e . T h i r d a n d f o u r t hl i n e s : e f f e c t o f PMB o n t h eD T T - c e l l P ( s e e F i g . 1 ) .

Of)...0 j .0 .0bI I I I Im V e n , ox'QOO U _ ,c- 8 0 T v T t T I T T v 2-- 6 0 L- , J A AI A A A A A A A AA r a r r r r r r r r r

I

m V om- 8 0 T v- 6 0 E - v- k

r r

I/ P - x o X* - 0 1 -I , ) b - I m I- s00 0 0 C . a00

r , ramr rr~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ m i n7E n I- b s bm V * T T- 8 0r60E r p 0 m i n

V O L . 6 2 3 , 1 9 6 9 1 2 4 1

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BIOCHEMISTRY: PODLESKI ET A L .DTT a l s o d e c r e a s e s w i t h t i m e , w h i l e i n t h e s a m e c o n d i t i o n s t h e r e s p o n s e t oC a r b r e m a i n s s t a b l e . *A v a r i e t y o f s u l f h y d r y l g r o u p r e a g e n t s w a s t h e n t e s t e d f o l l o w i n g DTT t r e a t -m e n t . 1 0 - 3 M d i t h i o b i s d i n i t r o b e n z o i c a c i d (DTNB) w a s f o u n d t o r e v e r s e t h ee f f e c t o f DTT c o m p l e t e l y , w h e r e a s a f t e r 1 0 - 4 M N - e t h y l m a l e i m i d e (NEM) b o t ht h e p o t e n t i a t i o n o f t h e D e c a r e s p o n s e a n d t h e e v o k e d d e p o l a r i z a t i o n b y TDFw e r e n e a r l y a b o l i s h e d . On t h e o t h e r h a n d , 1 0 - 4 M p - h y d r o x y m e r c u r i b e n z o a t e(PBM) m a r k e d l y d e c r e a s e d t h e p o t e n t i a t i o n o f t h e r e s p o n s e t o D e c a w i t h o u th a v i n g a n y e f f e c t o n t h e r e s p o n s e s t o TDF o r C a r b ( F i g . 2 ) . C o n t r o l e x p e r i -m e n t s s h o w e d t h a t t h e s e r e a g e n t s , a t t h e c o n c e n t r a t i o n u s e d , h a v e n o e f f e c t o nt h e r e s p o n s e o f t h e n o r m a l c e l l t o r e c e p t o r a c t i v a t o r s .

T h i s g r o u p o f r e s u l t s s u g g e s t s t h a t t h e r e c e p t o r m e c h a n i s m i n v o l v e d i n t h ee v o k e d r e s p o n s e t o TDF, t h e p o t e n t i a t e d r e s p o n s e t o D e c a , a n d t h e r e d u c e dr e s p o n s e t o C a r b f o l l o w i n g DTT e x p o s u r e a r e d i f f e r e n t . T h i s c o n c l u s i o n i s i na g r e e m e n t w i t h t h e s u g g e s t i o n m a d e e a r l i e r , o n d i f f e r e n t g r o u n d s , t h a t t h e r e -c e p t o r s i t e s f o r C a r b a n d D e c a a r e a t l e a s t p a r t i a l l y d i s t i n c t . 9 ' 1 0( 2 ) E f f e c t o f DTT o n t h e R e a c t i o n o f TDF w i t h A c e t y l c h o l i n e s t e r a s e . - W es t u d i e d i n p a r a l l e l t h e i n v i t r o e f f e c t o f TDF o n p u r i f i e d a c e t y l c h o l i n e s t e r a s e p r e -p a r e d f r o m e l e c t r i c t i s s u e . ' We f i r s t c o n f i r m e d t h e o b s e r v a t i o n o f K a r l i n t h a tn e i t h e r t h e a f f i n i t y n o r t h e m a x i m a l v e l o c i t y o f AChE i s m o d i f i e d a f t e r DTT e x -p o s u r e , w i t h b o t h n e u t r a l a n d p o l a r s u b s t r a t e s . H o w e v e r , a s i l l u s t r a t e d i nF i g u r e 3 , a f t e r s e v e r a l h o u r s ' e x p o s u r e o f AChE t o 1 0 - 2 MDTT ( D T T - A C h E ) ,TDF n o l o n g e r i n a c t i v a t e s AChE i r r e v e r s i b l y . I t s t i l l i n h i b i t s AChE a s s a y e do n a n e u t r a l s u b s t r a t e , b u t r e v e r s i b l y . T h e k i n e t i c s o f i n h i b i t i o n f o l l o w s t h es t r a i g h t f o r w a r d M i c h a e l i s a n d M e n t e n l a w s f o r c o m p e t i t i v e i n h i b i t i o n .W i t h n a t i v e AChE t h e c o v a l e n t b i n d i n g o f TDF a t t h e a c t i v e s i t e i s a s s u m e dt o i n v o l v e , a t f i r s t , t h e e s t a b l i s h m e n t o f a r e v e r s i b l e t r a n s i t o r y c o m p l e x :

k iE + TDF = ( E m TDF) E. I L; 2 k 3

T h e q u e s t i o n i s : W h i c h o f t h e t w o s t e p s i s a l t e r e d a f t e r e x p o s u r e o f AChEt o DTT? I n o r d e r t o a n s w e r t h i s q u e s t i o n we f i r s t d e t e r m i n e d KT = k 2 / k , o ft h e f i r s t s t e p b y g r a p h i c a n a l y s i s o f t h e k i n e t i c d a t a o b t a i n e d w i t h n a t i v e AChE( F i g . 4 ) a n d t h e n m e a s u r e d t h e K , o f TDF f o r t h e c o m p e t i t i v e i n h i b i t i o n o fDTT-AChE.I t w a s f o u n d t h a t t h e v a l u e s m e a s u r e d f o r b o t h c o n s t a n t s a r e i d e n t i c a l ;KT = K , = 2 . 5 X 1 0 - 5 M. DTT t r e a t m e n t t h u s a p p e a r s t o i m p a i r o n l y t h ec o v a l e n t a t t a c h m e n t o f TDF t o t h e e n z y m e , p r e s u m a b l y b y d e c r e a s i n g t h er e a c t i v i t y o f t h e a m i n o a c i d s i d e c h a i n l o c a t e d i n t h e n e i g h b o r h o o d o f t h e a c t i v es i t e w h i c h b o n d s t o t h e d i a z o n i u m g r o u p .We t h e n t r i e d t o r e v e r s e t h e e f f e c t o f DTT b y s u b s e q u e n t i n c u b a t i o n o fDTT-AChE w i t h v a r i o u s t h i o l - g r o u p r e a g e n t s . T h r e e o f t h e m w e r e t e s t e d :PMB, NEM, a n d DTNB; o n l y PMB s h o w e d a n e f f e c t . A f t e r PMB e x p o s u r e ,TDF a g a i n i r r e v e r s i b l y i n h i b i t s A C h E , b u t t h e k i n e t i c s o f i n h i b i t i o n d i f f e r f r o mt h o s e o b s e r v e d w i t h t h e n a t i v e p r o t e i n . W i t h i n d o p h e n y l a c e t a t e a s t h e s u b -s t r a t e , o n l y t h e f i r s t p h a s e o f i n a c t i v a t i o n o c c u r s : i t i s n o l o n g e r f o l l o w e d b y a

1 2 4 2 P R O C . N . A . S .

8/3/2019 Thomas Podleski et al- Compared Effects of Dithiothreitol on the Interaction of an Affinity-Labeling Reagent with Ac

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BIOCHEMISTRY: PODLESKI ET A L .A B 1 0 - 2 M D T Tl i , L ^_ 1 6 h o u r s ,

6xOI5MF/

6 2 o I O M T O F

& I ^ ' 0 0 n o T D Fl o I O 3 2 x o 0 3 3 1 0 3 4 x I O 3

M - 1[ I P A ]

v to 0A A

: O / n ~ ~ . 1 - ~ ~ t o l/10-2M D T TI G 5 O 2 h o u S

00 2 ( h o u r s ]

F I G . 3 . - I n v i t r o e f f e c t o f DTT on A C h E . ( a ) A b o l i t i o n o f t h e i r r e v e r s i b l e i n h i b i t i o no f AChE b y TDF a f t e r exposure t o 1 0 - 2 M DTT. A s o l u t i o n o f AChE f r o m e l e c t r i ce e l ( s p e c i f i c a c t i v i t y : 1 6 0 u m o l e s IPA h y d r o l y z e d / mg p r o t e i n ) c o n t a i n i n g 0 . 7 mg pro-t e i n / m l made i n 5 X 1 0 - 2 MNa p h o s p h a t e , p H 7 . 0 , was i n c u b a t e d w i t h 1 0 - 2 M DTTf o r t h e i n d i c a t e d p e r i o d o f t i m e a t 4 V C ; t h e r e a c t i o n was s t o p p e d b y r a p i d f i l t r a t i o n o ft h e m i x t u r e on a G - 2 5 S e p h a d e x c o l u m n . The f r a c t i o n h a v i n g t h e h i g h e s t a c t i v i t yw h i c h c o n t a i n e d a r o u n d 0 . 3 5 mg p r o t e i n / m l was made 1 0 - 4 M w i t h TDF. The m i x -t u r e was t h e n d i l u t e d 2 0 0 - f o l d a t t h e i n d i c a t e d t i m e a n d AChE a c t i v i t y a s s a y e d on IPAf o l l o w i n g t h e m e t h o d o f K r a m e r a n d G a m s o n . 1 5AChE was a g i f t o f D r . W. L e u z i n g e r f r o m C o l u m b i a U n i v e r s i t y a n d TDF was f r o mD r s . H . M a u t n e r , Y a l e U n i v e r s i t y , a n d M. J u l i a , I n s t i t u t P a s t e u r .( b ) C o m p e t i t i v e i n h i b i t i o n o f IPA h y d r o l y s i s b y TDF a f t e r 1 6 h r exposure o f AChEt o 1 0 - 2 M DTT. DTT-AChE was p r e p a r e d a c c o r d i n g t o t h e m e t h o d d e s c r i b e d i nt he l e g e n d o f ( a ) . T h e c o n c e n t r a t i o n o f p r o t e i n i n t h e assay medium ( 5 X 1 0 - 2 Ms o d i u m p h o s p h a t e p H 7 . 0 ) was 1 . 7 5 u g / m l .

r e a c t i v a t i o n p h a s e . We h a v e i n t e r p r e t e d t h i s s e c o n d p h a s e as d u e t o t h e c o v a l e n tb i n d i n g o f TDF t o p e r i p h e r a l a n i o n i c s i t e s d i s t i n c t f r o m t h e a n i o n i c s i t e o f t h ea c t i v e c e n t e r : i n t h e DTT-PMB e nz ym e e i t h e r TDF no l o n g e r r e a c t s w i t h t h e s es i t e s or t h e " i n d i r e c t " i n t e r a c t i o n b e t w e e n t h e s e s i t e s a n d t h e e n z y m e - a c t i v ec e n t e r no l o n g e r occurs; i n o t h e r w o r d s , i n t h e t e r m i n o l o g y u s e d w i t h r e g u l a t o r yenzymes, the enzyme is "desensitized." Experiments are presently in progresst o d i s t i n g u i s h b e t w e e n t h e s e t w o a l t e r n a t i v e s .

D i s c u s s i o n . - T h e e x p e r i m e n t s p r e s e n t e d i n t h i s p a p e r i n d i c a t e t h a t DTT, ac o m p o u n d known t o r e d u c e d i s u l f i d e b o n d s i n p r o t e i n s , a l t e r s i n a p a r a l l e l mannert h e r e a c t i v i t y o f b o t h AChE a n d ACh r e c e p t o r s t o w a r d TDF, an a f f i n i t y - l a b e l -

F I G . 4 . - D e t e r m i n a t i o n o f t h e d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t o ft h e t r a n s i e n t r e v e r s i b l e c o m p l e x (AChE - T D F ) e s t a b -l i s h e d as t h e f i r s t s t e p o f t h e a f f i n i t y l a b e l i n g o f n a t i v eAChE b y TDF. A s o l u t i o n o f p u r i f i e d AChE ( S i g m aC h e m i c a l C o . ) i n 5 X 1 0 - 2 M Na p h o s p h a t e b u f f e r e d a tp H 7 . 0 c o n t a i n i n g 1 . 5 ;g o f p r o t e i n / m l i s s u p p l e m e n t e d a tzero t i m e w i t h TDF a t t h e i n d i c a t e d c o n c e n t r a t i o n ( t h et e m p e r a t u r e was 2 3 0 C ) . At t i m e A t a s a m p l e i s d i l u t e d1 0 0 - f o l d i n t h e assay medium c o n t a i n i n g 5 X 1 0 - 2 MNap h o s p h a t e pH 7 . 0 , 5 . 0 X 1 0 - 4 M 5 , 5 ' - d i t h i o b i s - 2 - n i t r o -b e n z o i c a c i d , a n d 5 . 0 X 1 0 - 4 M a c e t y l t h i o c h o l i n e , andt h e e n z y m a t i c a c t i v i t y U i s m e a s u r e d . U o i s t h e a c t i v i t ym e a s u r e d i n t h e a b s e n c e o f TDF. I n t h i s e x p e r i m e n t A twas 1 m m n .

4 o [ T D F ] x A tZ 3 x l o g U o1 5

l 0

KT ,

m o l e s o' x M i n - I )

/+ b

K 3 a 3 . 5 m i n -K T a 2 . 5 5 X I O 5 M

I 2 3 4 51 0 5 x [ T D F ] ( m o l e s o t f ' )

7 55 0

2 5

V O L . 6 3 , 1 9 6 9 1 2 4 3

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BIOCHEMISTRY: PODLESKI ET A L .i n g r e a g e n t . T h e m o s t s t r i k i n g f e a t u r e i s t h a t i n b o t h c a s e s , a f t e r DTT t r e a t -m e n t , TDF s t i l l e x h i b i t s a h i g h a f f i n i t y f o r b o t h m a c r o m o l e c u l e s b u t i t s e f f e c t ss e e m t o b e r e v e r s i b l e . We m u s t e m p h a s i z e , h o w e v e r , t h a t t h e c o m p a r i s o n o f t h er e a c t i v i t y o f b o t h ACh b i n d i n g p r o t e i n s c a n h a r d l y b e r i g o r o u s l y d o n e i n t h e s a m ec o n d i t i o n s . F i r s t o f a l l , w i t h t h e n a t i v e e l e c t r o p l a x , t h e k i n e t i c c o n s t a n t s o f t h ei r r e v e r s i b l e b i n d i n g o f TDF t o t h e m e m b r a n e s i t e a r e n o t a c c e s s i b l e s i n c e t h ep r o d u c t o f t h e r e a c t i o n o f TDF w i t h t h e m e m b r a n e i s n o t y e t m e a s u r e d q u a n t i -t a t i v e l y . I n a d d i t i o n , we u s e d d i f f e r e n t r a n g e s o f DTT c o n c e n t r a t i o n w i t hAChE a n d t h e e l e c t r o p l a x . W i t h t h e e l e c t r o p l a x a f i v e - m i n u t e e x p o s u r e t o1 0 - 3 M DTT i s s u f f i c i e n t t o b r i n g a b o u t a p r o f o u n d a l t e r a t i o n o f t h e c e l l r e -s p o n s e . W i t h AChE a t r e a t m e n t o f s e v e r a l h o u r s w i t h 1 0 - 2 MDTT i s r e q u i r e df o r a n o b s e r v a b l e e f f e c t . H o w e v e r , s u c h a d i f f e r e n c e s h o u l d n o t b e o v e r e m p h a -s i z e d s i n c e t h e r e a c t i v i t y o f p r o t e i n s i n t e g r a t e d i n a m e m b r a n e a n d d i s p e r s e d i ns o l u t i o n m i g h t b e w i d e l y d i f f e r e n t . F i n a l l y , t h e m o s t i m p o r t a n t f a c t i s t h a t t h ec o n c e n t r a t i o n o f TDF w h i c h p r o m o t e s a r e v e r s i b l e d e p o l a r i z a t i o n o f t h e DTT-c e l l a r e m u c h l o w e r t h a n t h o s e t h a t we u s e d , w i t h s i m i l a r e x p o s u r e t i m e , t o o b t a i na n i r r e v e r s i b l e i n h i b i t i o n o f t h e n a t i v e c e l l . H o w e v e r , a s p r e v i o u s l y m e n t i o n e d ,t h e r e s p o n s e o f t h e D T T - c e l l t o TDF i s m a x i m a l a r o u n d 5 X 1 0 - 6 M; i n t h e s ec o n d i t i o n s i t c a n b e r e a s o n a b l y a s s u m e d t h a t t h e m a j o r i t y o f TDF b i n d i n g s i t e sw h i c h a r e i n v o l v e d i n t h e d e p o l a r i z a t i o n p r o c e s s a r e o c c u p i e d b y TDF, a n d f o re x p o s u r e t i m e s i d e n t i c a l t o t h o s e u s e d f o r t h e a f f i n i t y l a b e l i n g o f t h e n a t i v e r e c e p -t o r , n o i r r e v e r s i b l e e f f e c t s a r e o b s e r v e d . A r e a s o n a b l e i n t e r p r e t a t i o n i s t h a t t h ea f f i n i t y o f TDF f o r t h e m e m b r a n e i n c r e a s e s a f t e r DTT t r e a t m e n t a n d t h a t TDFn o l o n g e r r e a c t s c o v a l e n t l y w i t h t h e s e h i g h - a f f i n i t y r e c e p t o r s i t e s .

I n t h e c a s e o f AChE t h e s i t u a t i o n i s much s i m p l e r a n d we h a v e s h o w n t h a t t h eK , f o r t h e r e v e r s i b l e i n h i b i t i o n o f DTT-AChE b y TDF i s a l m o s t i d e n t i c a l t ot h e d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t o f t h e f i r s t r e v e r s i b l e c o m p l e x TDF-AChE e s t a b l i s h e di n t h e c o u r s e o f t h e a f f i n i t y l a b e l i n g o f t h e a c t i v e s i t e o f n a t i v e A C h E . O n l yt h e r a t e o f t h e c o v a l e n t a t t a c h m e n t o f TDF t o AChE a c t i v e c e n t e r i s d e c r e a s e d .T h u s t h e n u m b e r , n a t u r e , a n d p o s i t i o n o f t h e a m i n o a c i d s i d e c h a i n s w h i c ha c c o u n t f o r t h e r e c o g n i t i o n o f TDF a t t h e AChE a c t i v e c e n t e r h a v e n o t b e e nd r a s t i c a l l y a l t e r e d a f t e r DTT t r e a t m e n t . DTT p r o m o t e s a m i n o r b u t c h a r a c t e r -i s t i c r e a r r a n g e m e n t o f AChE w h i c h d e c r e a s e s t h e r e a c t i v i t y o f a n a m i n o a c i d s i d ec h a i n ( p r e s u m a b l y a t y r o s y l ) w h i c h r e a c t s w i t h t h e d i a z o n i u m g r o u p . A s i m i l a ri n t e r p r e t a t i o n c a n b e p r o p o s e d f o r t h e r e v e r s i b i l i t y o f TDF a c t i o n o n t h e mem-b r a n e , a l t h o u g h i t c a n n o t b e r u l e d o u t t h a t t h e TDF b i n d i n g s i t e s w h i c h a c -c o u n t f o r t h e d e p o l a r i z a t i o n o f t h e DTT c e l l d o n o t d e r i v e f r o m t h e c l a s s o f s i t ew h i c h r e a c t s w i t h TDF i n t h e n o r m a l c e l l , b u t c o r r e s p o n d t o a n e n t i r e l y n e wc l a s s u n m a s k e d b y DTT t r e a t m e n t .I n t h e c o u r s e o f t h e s e s t u d i e s w e h a v e c o m p a r e d t h e e f f e c t s o f DTT o n t h ee l e c t r o p l a x r e s p o n s e t o a v a r i e t y o f c h o l i n e r g i c a g e n t s . S e v e r a l r e s u l t s t e n d t os u g g e s t t h a t d i s t i n c t s i t e s a c c o u n t f o r t h e p e r m e a b i l i t y c h a n g e s c a u s e d b y d e -c a m e t h o n i u m a n d c a r b a m y l c h o l i n e . ( 1 ) A f t e r DTT t r e a t m e n t t he r e s p o n s e t oD e c a i s p o t e n t i a t e d w h i l e t he r e s p o n s e t o C a r b i s d e c r e a s e d . I n a d d i t i o n , t h ep o t e n t i a t i o n o f t h e r e s p o n s e t o D e c a t e n d s t o d e c a y w i t h t i m e , w h i l e t h e i n a c t i v a -t i o n o f C a r b r e s p o n s e r e m a i n s s t a b l e . PMB f o l l o w i n g DTT t r e a t m e n t b l o c k s

1 2 4 ! 4 P R O C . N . A . S .

8/3/2019 Thomas Podleski et al- Compared Effects of Dithiothreitol on the Interaction of an Affinity-Labeling Reagent with Ac

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BIOCHEMISTRY: PODLESKI ET A L .t h e p o t e n t i a t e d r e s p o n s e t o D e c a b u t d o e s n o t a f f e c t t h e r e d u c e d r e s p o n s e t oC a r b . ( 2 ) I n a n o r m a l c e l l , a s p r e v i o u s l y m e n t i o n e d , t h e d o s e - r e s p o n s e c u r v et o C a r b i s c o n v e r t e d f r o m a s i g m o i d i n t o a n h y p e r b o l a i n t h e p r e s e n c e o f D e c a . 9( 3 ) When t h e r e s p o n s e s t o C a r b a n d D e c a a r e c o m p a r e d a f t e r a b r i e f e x p o s u r eo f t h e n o r m a l c e l l t o TDF, t h e r e s p o n s e t o D e c a i s f o u n d t o b e m o r e e x t e n s i v e l yd e c r e a s e d t h a n t h e r e s p o n s e t o C a r b . ' 0T h e e x p e r i m e n t a l d a t a , h o w e v e r , a r e s t i l l t o o f r a g m e n t a r y t o l e t u s c o n c l u d ew h e t h e r o r n o t t h e s e d i f f e r e n t s i t e s a r e c a r r i e d b y t h e s a m e m a c r o m o l e c u l a r c o m -p l e x , a l t h o u g h t h e e x p e r i m e n t r e f e r r e d t o i n s e c t i o n ( 2 ) s t r o n g l y s u p p o r t s t h i sc o n c l u s i o n .T h e p o s s i b i l i t y t h a t t h e AChE m o l e c u l e w o u l d b e t h e m a c r o m o l e c u l a r r e -c e p t o r f o r a t l e a s t o n e c l a s s o f t h e s e b i n d i n g s i t e s s t i l l r e m a i n s . I n c o n n e c t i o nw i t h t h i s p r o b l e m i t s h o u l d b e m e n t i o n e d t h a t ( a ) AChE p r e s e n t s a h i g h a f f i n i t yf o r D e c a i n h i g h s a l t m e d i a ( t h e KD o f t h e c o m p l e x A C h E - D e c a , m e a s u r e d b ye q u i l i b r i u m d i a l y s i s , i s 1 . 6 5 X 1 0 - M i n 5 X 1 0 - 2 M N a - p h o s p h a t e b u f f e r e da t p H 7 . 0 ) ; 1 2 ( b ) D e c a b i n d i n g t o AChE i s c o m p l e t e l y a b o l i s h e d a f t e r e x p o s u r e o fAChE t o T D F . 1 2 I t i s s u g g e s t e d t h a t i f t h e AChE m o l e c u l e w e r e i n v o l v e d i ns o m e e l e c t r o g e n i c p r o c e s s a s a m a c r o m o l e c u l a r r e c e p t o r , i t w o u l d b e l i k e l y t oc a r r y t h e r e c e p t o r s i t e f o r D e c a .An i m p o r t a n t f e a t u r e o f t h e c o n s e q u e n c e o f DTT t r e a t m e n t i s t h a t TDF,a n i n h i b i t o r o f t h e n o r m a l c e l l , b e c o m e s a n a c t i v a t o r , a r e s u l t w h i c h p a r a l l e l st h e o b s e r v a t i o n s m a d e b y K a r l i n a n d W i n n i k w i t h h e x a m e t h o n i u m . 8 F o l l o w i n go u r g e n e r a l h y p o t h e s i s t h a t t h e m o l e c u l a r m e c h a n i s m s w h i c h a c c o u n t f o r mem-b r a n e e x c i t a t i o n r e s e m b l e i n many r e s p e c t s t h e r e g u l a t o r y i n t e r a c t i o n m e d i a t e db y a l l o s t e r i c p r o t e i n s , we w i s h t o p o i n t o u t t h a t t h i s e f f e c t o f DTT i s h i g h l yr e m i n i s c e n t o f s o m e p r o p e r t i e s o b s e r v e d s e v e r a l y e a r s a g o w i t h a b a c t e r i a lr e g u l a t o r y e n z y m e , t h e b i o s y n t h e t i c L - t h r e o n i n e d e a m i n a s e . I n d e e d s o m em u t a t i o n i n t h e s t r u c t u r a l g e n e o f L - t h r e o n i n e d e a m i n a s e l e a d s t o a n i n v e r s i o no f i t s r e s p o n s e t o t h e f e e d b a c k i n h i b i t o r , - i s o l e u c i n e ; i 1 - i s o l e u c i n e a c t s a s a na c t i v a t o r o f t h e m u t a n t p r o t e i n . " 3 T h e s e e f f e c t s c a n b e i n t e r p r e t e d i n t e r m s o ft h e t h e o r y t h a t we h a v e e x t e n s i v e l y d i s c u s s e d p r e v i o u s l y t o a c c o u n t f o r a l l o s t e r i ci n t e r a c t i o n i n r e g u l a t o r y e n z y m e s a n d e x c i t a b l e m e m b r a n e s . ' 4

R e s e a r c h i n t h e D e p a r t m e n t o f M o l e c u l a r B i o l o g y a t t h e P a s t e u r I n s t i t u t e h a s b e e na i d e d b y g r a n t s f r o m t h e U . S . N a t i o n a l I n s t i t u t e s o f H e a l t h , t h e D e l e g a t i o n G 6 n 6 r a l e Al a R e c h e r c h e S c i e n t i f i q u e e t T e c h n i q u e , t h e C e n t r e N a t i o n a l d e l a R e c h e r c h e S c i e n t i f i q u e ,t h e C o l l e g e d e F r a n c e , a n d t h e C o m m i s s a r i a t a l ' E n e r g i e A t o m i q u e .* T h e H i l l c o e f f i c i e n t ( n H ) o f t h e r e s p o n s e c u r v e t o D e c a i m m e d i a t e l y f o l l o w i n g DTT t r e a t -m e a n t i s c l o s e t o 2 a s i n t h e c o n t r o l , w h e r e a s t h e nH o f t h e r e s p o n s e t o C a r b i s r e d u c e d t o 1 .H o w e v e r , 3 0 m i n a f t e r DTT t r e a t m e n t t h e n H o f t h e r e s i d u a l r e s p o n s e t o D e c a d e c r e a s e s a s w e l l ,t o a v a l u e c l o s e t o 1 . T h e a p p a r e n t d e p o l a r i z i n g e f f e c t o f TDF i s d u e t o TDF a n d n o t t o ap r o d u c t o f t h e r e a c t i o n o f TDF w i t h DTT: i f t h e n a t i v e e l e c t r o p l a x i s e x p o s e d t o a m i x t u r e o fT J ) F a n d DTT, n o d e p o l a r i z a t i o n o c c u r s .1 C h a n g e u x , J . - P . , T . I t . P o d l e s k i , a n d L . W o f s y , t h e s e P R O C E E D I N G S , 5 8 , 2 0 6 3 ( 1 9 6 7 ) .2 N a c h m a n s o h n , D . , C h e m i c a l a n d M o l e c u l a r B a s i s o f N e r v e A c t i v i t y ( N e w Y o r k : A c a d e m i c

P r e s s , 1 9 5 9 ) .3 K r e m z n e r , L . T . , a n d I . B . W i l s o n , J . B i o l . C h e m . , 2 3 8 , 1 7 1 4 ( 1 9 6 3 ) ; L e u z i n g e r , W . , a n dA . L . B a k e r , t h e s e P R O C E E D I N G S , 5 7 , 4 4 6 ( 1 9 6 7 ) .4 M e u n i e r , J . - C . , a n d J . - P . C h a n g e u x , F . E . B . S . L e t t e r s , 2 , 2 2 4 ( 1 9 6 9 ) .3 , C h a n g e u x , J . - P . , M o l . P h a r m a c o l . , 2 , 3 6 9 ( 1 9 6 6 ) .

V O L . 6 3 , 1 9 6 9 1 2 4 5

8/3/2019 Thomas Podleski et al- Compared Effects of Dithiothreitol on the Interaction of an Affinity-Labeling Reagent with Ac

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1 2 4 6 BIOCHEMISTRY: PODLESKI ET A L . P R O C . N . A . S .f f K a r l i n , A , a n d E . B a r t e l s , B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a , 1 2 6 , 5 2 5 ( 1 9 6 6 ) .7 K a r l i n , A . , B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a , 1 3 7 , 3 5 8 ( 1 9 6 7 ) .8 K a r l i n , A . , a n d M. W i n n i k , t h e s e P R O C E E D I N G S , 6 0 , 6 6 8 ( 1 9 6 8 ) .9 C h a n g e u x , J . - P . , a n d T . R . P o d l e s k i , t h e s e P R O C E E D I N G S , 5 9 , 9 4 4 ( 1 9 6 8 ) .1 0 P o d l e s k i , T . R . , a n d J . - P . C h a n g e u x , " F u n d a m e n t a l c o n c e p t s o f d r u g - r e c e p t o r i n t e r -a c t i o n s , " i n P r o c e e d i n g s o f t h e T h i r d A n n u a l B u f f a l o - M i l a n S y m p o s i u m o n M o l e c u l a r P h a r m a -c o l o g y ( A u g u s t 1 9 6 8 ) .1Ka r l i n , A . , J . G e n . P h y s i o l . , 5 4 , 2 4 5 ( 1 9 6 9 ) .1 2 C h a n g e u x , J . - P . , T . R . P o d l e s k i , a n d J . - C . M e u n i e r , J . G e n . P h y s i o l . , 5 4 , 2 2 5 ( 1 9 6 9 ) ;M e u n i e r , J . - C . a n d J . - P . C h a n g e u x , u n p u b l i s h e d r e s u l t s .

1 3 S a n c h e z , C . , a n d J . - P . C h a n g e u x , B u l l . S o c . C h i m . B i o l . , 4 8 , 7 0 5 ( 1 9 6 6 ) .1 4 C h a n g e u x , J . - P . , a n d J . T h i e r y , i n R e g u l a t o r y F u n c t i o n s o f B i o l o g i c a l M e m b r a n e s , e d .J . J a r n e f e l t ( N e w Y o r k : E l s e v i e r P u b l . C o . , 1 9 6 8 ) , p . 1 1 6 ; C h a n g e u x , J . - P . , J . T h i 6 r y , Y .T u n g , a n d C . K i t t e l , t h e s e P R O C E E D I N G S , 5 7 , 3 3 5 ( 1 9 6 7 ) ; M o n o d , J . , J . W y m a n , a n d J . - P .C h a n g e u x , J . M o l . B i o l . , 1 2 , 8 8 ( 1 9 6 5 ) ; R u b i n , M . , a n d J . - P . C h a n g e u x , J . M o l . B i o l . , 2 1 ,2 6 5 ( 1 9 6 6 ) ; K a r l i n , A . , J . T h e o r e t . B i o l . , 1 6 , 3 0 6 ( 1 9 6 7 ) .1 5 K r a m e r , D . N . , a n d R . M. G a m s o n , A n a l . C h e m . , 3 0 , 2 5 1 ( 1 9 5 8 ) .