These d filopon

Universit Joseph Fourier - Grenoble I Sciences et Gographie

THESE Soutenue publiquement par

Didier FILOPON le 21 dcembre 2005

pour obtenir le grade de DOCTEUR DE LUNIVERSITE JOSEPH FOURIER GRENOBLE I

Discipline : Virologie, Microbiologie, Immunologie

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Mcanismes de rgulation impliqus dans la pathognicit de Pseudomonas aeruginosa : Systme de Scrtion de

Type III, Epignse et Quorum Sensing

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Composition du Jury

Professeur D. Schneider Prsident Professeur B. Guery Rapporteur Docteur A. Filloux Rapporteur Professeur D. Haas Examinateur Professeur J. Guespin-Michel Co-directeur de thse Professeur B Polack Co-directeur de thse

Thse prpare au Groupe de Recherche et dEtude du Processus Inflammatoire - GREPI EA 2938 / CHU Grenoble et au Laboratoire de Microbiologie Du Froid LMDF EA 2123 / Evreux

Andre et Firmin

Je tiens tout dabord remercier Madame le professeur Franoise Morel et Madame le professeur Nicole Orange qui ont accept de maccueillir au sein de leur laboratoire respectif.

Un grand merci au professeur Benot Polack pour son encadrement, sa patience et pour lensemble du savoir pratique et thorique quil ma transmis. Jespre quil naura pas trop souffert de mon flegme lgendaire et je noublierai pas qu faire et refaire on nest jamais sans rien faire

Un grand merci galement au professeur Janine Guespin pour sa patience, lensemble du savoir quelle ma transmis et pour mavoir fait dcouvrir et apprcier un nouvel aspect de la microbiologie.

Merci au docteur Annabelle Mrieau pour son encadrement, sa gentillesse, le partage de ses connaissances et pour mavoir aid rapidement mintgrer lquipe du LMDF.

Je tiens aussi remercier Monsieur le professeur Dominique Schneider pour avoir accept la prsidence de ce jury de thse.

Jadresse mes remerciements aux professeurs Dieter Haas et Benot Guery ainsi quau docteur Alain Filloux pour mavoir fait lhonneur de juger ce travail.

Pour leurs conseils, leur soutien et les moments que nous avons partags, jadresse un grand merci aux membres du GREPI et du LMDF, en particulier Lauriane, Danile, Mariette, Nico, lquipe PetRoll, Galle R et surtout Galle H.

Je remercie lensemble du personnel du laboratoire denzymologie et dhmatologie de mavoir si rapidement intgr au sein de leur quipe.

Enfin et surtout, je voudrais adresser plus quun grand merci mes parents qui ont toujours t l pour moi et sans qui tout cela naurait pas t possible.

Abrviations

ADN Acide dsoxyribonuclique ADP Adnosine diphosphate ApR Rsistance lampicilline ARN Acide ribonuclique ATP Adnosine triphosphate CatR Rsistance au chloramphnicol CbR Rsistance la Carbnicilline CDO Catchol Dioxygnase DMSO Dimthylsulfoxyde dNTP mlange de nuclotides triphosphates (ATP, GTP, CTP, TTP) DO Densit Optique DR Double Recombinant EGTA Acide thylne glycol-bis(-aminothy ther) N,N,N',N'-ttra-actique EHEC Escherichia coli entrohmoragique EPEC Escherichia coli entropathogne GFP Green Fluorescent Protein GmR Rsistance la Gentamicine GTP Guanosine triphosphate HBSm "Hepes Buffer Saline" modifi Hepes Acide hydroxythyl-piprazine-thane-sulfonique IPTG isopropyl-beta-D-thigalactopyranoside kDa KiloDaltons KmR Rsistance la kanamycine LB Milieu Luria Bertani LDH Lactate Dhydrognase MOI Multiplicity of infection Pb Paires de bases PBS Tampon phosphate isotonique "Phosphate Buffer Saline" PCA Acide perchlorique PCR "Polymrase chain reaction" PIA Pseudomonas isolation agar

PNN Polynuclaires neutrophiles p/v Poids pour volume qsp Quantit suffisante pour RLU Unit de luminescence relative rpm Rotations par minute SDS Sodium dodcyl sulfate SDS-PAGE Electrophorse en gel de polyacrylamide en prsence de SDS SR Simple Recombinant SSTT Systme de scrtion de type III TAE Tampon "Tris-actate-EDTA" TBE Tampon "Tris-borate-EDTA" TCA Acide trichloroactique TcR Rsistance la Ttracycline TE Tampon "Tris-EDTA" Tris Tris(hydroxylmthyl)aminomthane U Unit enzymatique UV Ultraviolets v/v Volume pour volume VB Milieu Vogel Bonner

Table des matires INTRODUCTION ....................................................................................................... 1

I. Pseudomonas aeruginosa ............................................................................... 3 I-A. Caractristiques........................................................................................ 3 I-B. Un pathogne opportuniste....................................................................... 3 I-C. Les facteurs de virulence de Pseudomonas aeruginosa .......................... 5

II. Le systme de scrtion de type III ............................................................... 12 II-A. Le systme de scrtion de Type III de P. aeruginosa ........................... 13 II-B. La rgulation du SSTT chez les autres bacilles pathognes Gram ngatif................................................................................................................ 27

III. Le Quorum Sensing ................................................................................... 35 III-A. Gnralits.......................................................................................... 35 III-B. Le quorum sensing chez P. aeruginosa .............................................. 41

IV. Epigense .................................................................................................. 48 IV-A. Lpigense chez les bactries : Lexemple de lopron lactose chez E. coli 49 IV-B. Pr requis pour lpignse et utilit de la modlisation ..................... 51

MATERIELS ET METHODES .................................................................................. 53 I. Plasmides et Souches bactriennes.............................................................. 55

I-A. La souche de rfrence du laboratoire : CHA......................................... 56 I-B. Culture bactrienne ................................................................................ 57 I-C. Antibiotiques utiliss ............................................................................... 58 I-D. Suivi de croissance et densit bactrienne............................................. 58 I-E. Conservation des souches...................................................................... 58

II. Techniques de biologie molculaire............................................................... 59 II-A. Purification des acides nucliques.......................................................... 59 II-B. Prparation dADN plasmidique dE. coli ................................................ 60 II-C. Prparation dADN chromosomique de P. aeruginosa ........................... 60 II-D. Prparation dARN de P. aeruginosa...................................................... 61 II-E. Electrophorse dADN ............................................................................ 61 II-F. Manipulation des fragments dADN ........................................................ 62 II-G. Technique de retard sur gel (Electrophoretic Mobility Shift Assay - EMSA) 64 II-H. Clonage .................................................................................................. 66

II-I. Transformation........................................................................................ 67 II-J. Mutagense par change alllique chez Pseudomonas aeruginosa ...... 68

III. Culture cellulaire......................................................................................... 71 III-A. Interaction des bactries avec des polynuclaires neutrophiles.......... 71

IV. Exprimentation animale............................................................................ 72 V. Techniques de biochimie ............................................................................... 73

V-A. Prparation des chantillons................................................................... 73 V-B. Dosage de lactivit enzymatique Catchol Dioxygnase (CDO) ........... 74 V-C. Electrophorse SDS-PAGE................................................................. 75 V-D. Analyse des protines......................................................................... 75 V-E. Mesure de lactivation transcriptionnelle des gnes du SSTT ................ 77 V-F. Analyse du surnageant de culture bactrien........................................... 78

PRESENTATION DU TRAVAIL................................................................................ 79 RESULTATS ............................................................................................................ 83

I. Acquisition dune cytotoxicit dpendante du SSTT par un mcanisme pigntique ......................................................................................................... 85

I-A. Modlisation de la rgulation du SSTT ................................................... 87 I-B. Dmonstration exprimentale de la modification pigntique pour lacquisition dun SSTT inductible. ..................................................................... 91

II. Rgulation de lexpression du Systme de Scrtion de Type III ................ 103 II-A. Rle de la densit cellulaire .................................................................. 104 II-B. Rle du quorum sensing dans la rgulation ngative du SSTT ............ 113 II-C. Caractrisation du PARST.................................................................... 122 II-D. Autres partenaires de la rgulation du SSTT........................................ 124

CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES ................................................................... 127 BIBLIOGRAPHIE.................................................................................................... 137 ANNEXES .............................................................................................................. 155 ARTICLE 1 ............................................................................................................. 157

Introduction

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INTRODUCTION

Introduction

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Introduction

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I. Pseudomonas aeruginosa

I-A. Caractristiques

Pseudomonas aeruginosa est un bacille Gram ngatif, mobile, capable de se dvelopper dans un large spectre de tempratures (+4C +42C). Arobie, cette bactrie peut cependant utiliser les nitrates comme accepteur dlectrons en croissance anarobie. P. aeruginosa vit ltat saprophyte dans leau, le sol et sur les plantes. Dans son environnement naturel, P. aeruginosa peut tre trouve sous sa forme planctonique, mobile ou dans un biofilm, attache une surface inerte ou une source de substrat. Le gnome de P. aeruginosa a t entirement squenc en 2000. Il sagit dun des plus grand gnome bactrien connu avec 6,3 mga bases codant 5570 cadres de lectures (Stover et al., 2000). Cette bactrie possde un nombre important de gnes impliqus dans des systmes de rgulation et des fonctions mtaboliques. Cette diversit lui confre la capacit dutiliser un grand nombre de composs organiques et ainsi de se dvelopper dans de nombreuses niches cologiques mme pauvres en nutriments.

I-B. Un pathogne opportuniste

P. aeruginosa est un pathogne opportuniste capable dinfecter un large spectre dhtes : hommes, animaux, plantes (D'Argenio et al., 2001;Pukatzki, Kessin, et Mekalanos, 2002;Rahme et al., 1995). Chez lhomme, cette bactrie affecte particulirement les personnes immunodprimes, les grands brls, les patients en soins intensifs ou atteints de la mucoviscidose. Elle est capable de coloniser une grande diversit de tissus provoquant, entre autres, des bactrimies, ou des infections oculaires, intestinales, ou urinaires. P. aeruginosa est galement capable de causer des mningites et ostomylites en infectant le systme nerveux central et les structures osseuses.

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I B-1. Pseudomonas aeruginosa et la mucoviscidose

P. aeruginosa est aussi une des causes majeures de mortalit et de morbidit chez les personnes atteintes de mucoviscidose (Govan et Harris, 1986). Cette maladie hrditaire autosomique rcessive a pour origine la mutation dune protine membranaire, CFTR (Cystic Fibrosis Transconductance Regulator), qui joue un rle dans la rgulation des changes ioniques des cellules avec le milieu extrieur. Sur le plan pulmonaire, labsence ou le dysfonctionnement de cette protine provoque un changement de la composition ionique et une diminution de lhydratation du mucus bronchique. Ce mucus plus visqueux perturbe le phnomne de clairance ciliaire et constitue un terrain plus propice la colonisation bactrienne (Lyczak, Cannon, et Pier, 2002;Ratjen et Dring, 2003). Les patients atteints de mucoviscidose dveloppent une infection pulmonaire chronique conduisant une destruction des tissus pulmonaires par les toxines bactriennes et le relargage du contenu des granules des cellules phagocytaires. Un modle de pathognicit suggre deux phases dinfection : linvasion puis la persistance. Lors de linvasion initiale du poumon, P. aeruginosa exprime une grande quantit de facteurs de virulence neutralisant les dfenses immunitaires innes de lhte. Ensuite, durant la seconde phase, une fois la zone colonise, la bactrie adhrerait lpithlium et adopterait un phnotype mucode. Elle se dveloppe alors sous forme de micro-colonies entoures dun biofilm compos notamment dun oligosaccharide, lalginate. Sous cette forme, P. aeruginosa est plus rsistante face aux dfenses de lhte et aux antibiotiques. La colonisation de la totalit des poumons se ferait ensuite de proche en proche par ressortie dindividus du biofilm et ractivation du cycle dinvasion-persistance avec expression de facteurs de virulence. Aujourdhui, cot des thrapies consistant diminuer linoculum bactrien par des cures dantibiotiques rptitives, les traitements en dveloppement sorientent vers deux axes. Ils tentent de perturber ou de dtruire le biofilm pour liminer les colonies dj installes. En parallle, ils visent diminuer la cytotoxicit de la bactrie lors des phases aigus de linfection. Cette dernire approche passe par la rpression de lexpression des gnes codant les diffrents facteurs de virulence scrts par P. aeruginosa ou par linhibition de lactivit de ces facteurs.

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I-C. Les facteurs de virulence de Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa possde de nombreux facteurs de virulence lui permettant de survivre dans de nombreux environnements et de coloniser divers types dhtes (Lazdunski, 1998). Ces facteurs sont impliqus dans les diverses phases dinfection. On peut distinguer deux classes de facteurs de virulence : ceux associs la bactrie, comme les adhsines et les pili, et ceux scrts, comme les toxines et les protases. Ces facteurs associs la bactrie sont principalement impliqus dans ladhrence et la motilit. Le systme de scrtion de type III, qui constitue un facteur de virulence majeur, fait lobjet dun chapitre spar (Chapitre II).

I C-1. Les facteurs de virulence associs la bactrie

IC 1-a) Le biofilm

Outre la forme planctonique, P. aeruginosa est capable de se dvelopper sous forme de biofilm. Dans ce mode de croissance, les bactries adhrent une surface et scrtent une matrice dexopolysaccharides, dont lalginate, dans laquelle elles sont insres. La formation du biofilm ncessite plusieurs tapes et dpend de signaux environnementaux et bactriens dont ceux du quorum sensing (figure 1 et chapitre III-B) (Filloux et Vallet, 2003). Sous cette forme, P. aeruginosa prsente une

Figure 1 : Modle de formation dun biofilm par P. aeruginosa (Daprs Filloux et Vallet, 2003)

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rsistance accrue aux dfenses immunitaires et aux traitements antibiotiques notamment grce lalginate qui joue le rle de barrire physique contre les cellules immunitaires et pige les lments de la rponse immune, anticorps et radicaux libres de loxygne provenant respectivement des lymphocytes B et des polynuclaires neutrophiles (Kobayashi, 2005;Reisner et al., 2005).

IC 1-b) Le flagelle

P. aeruginosa possde un seul flagelle polaire lui confrant la capacit de nager dans un environnement aqueux ou contenant une faible quantit dagar (

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IC 1-d) Facteur dattachement de type fimbriae

Rcemment mis en vidence chez P. aeruginosa, ce type de pilus est ncessaire pour ladhrence des surfaces inertes et dans la formation du biofilm(Vallet et al., 2001).

IC 1-e) Le lipopolysaccharide (LPS)

Constituant lipidique majeur de la couche externe de la membrane, le LPS contient une rgion polysaccharidique ramifie qui couvre la totalit de la surface de la bactrie et se trouve donc implique dans la stimulation de la rponse inflammatoire et dans les interactions avec les tissus de lhte. Cette rgion polysaccharidique, appele antigne O, est variable et peut mme tre absente. Selon la prsence et la composition de lantigne O, les souches de P. aeruginosa sont plus ou moins rsistantes la phagocytose dirige par le complment. La capacit dinteraction des diffrentes formes de LPS avec la protine CFTR, joue aussi un rle important dans la pathognie de P. aeruginosa notamment chez les personnes atteintes de mucoviscidose. En effet, CFTR semble pouvoir jouer le rle de rcepteur de motif bactrien (PRM : pattern recognization molecule) activant la rponse inflammatoire. Labsence ou le dysfonctionnement de CFTR chez les patients atteints de mucoviscidose ainsi que les modifications du LPS au niveau de lantigne O pourraient empcher linteraction LPS-CFTR, retarder la rponse immunitaire et empcher llimination bactrienne facilitant ainsi linstallation et la persistance de la bactrie (Goldberg et Pier, 1996;Pier, 2002;Schroeder et al., 2002).

I C-2. Les facteurs de virulence scrts

Les facteurs de virulence secrts par P. aeruginosa interviennent principalement dans la dissmination de la bactrie et la perturbation ou la destruction des dfenses de lhte.

Lexotoxine A est la protine la plus cytotoxique produite par P. aeruginosa. Scrte sous forme dune pro-toxine inactive, elle est reconnue de faon spcifique par le

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LRP (LDL related protein)(Herz et al., 1990). Cette interaction produit le clivage de la pro-toxine et une internalisation de la partie active qui cible le facteur dlongation E2 perturbant ainsi la synthse protique(Wick et al., 1990).

Les lastases LasA et LasB, perturbent quant elles certaines fonctions physiologiques en dgradant llastine ncessaire notamment la contraction et lextension du tissu pulmonaire. LasB est galement capable dinactiver dautres protines comme les IgA, les IgG et des composs du complment modulant ainsi la rponse immunitaire (Heck et al., 1990;Hong et Ghebrehiwet, 1992).

P. aeruginosa scrte galement des phospholipases de type C (PLC) avec diffrentes spcificits de substrats (Stonehouse et al., 2002). Certaines ont une activit hmolytique (PlcN et PlcH) et peuvent jouer un rle dans la mobilit de type twiching comme PlcB (Barker et al., 2004)

Laction des phospholipases est facilite par les rhamnolipides produits par les bactries. Ces biosurfactants sont des molcules amphiphiles, qui possdent un pouvoir dtergent sur les phospholipides membranaires facilitant leur accessibilit aux phospholipases. Les rhamnolipides participent galement la structuration du biofilm (Boles, Thoendel, et Singh, 2005;Davey, Caiazza, et O'Toole, 2003).

I C-3. Rgulation des facteurs de virulence

Les tudes sur la rgulation des facteurs de virulence ont mis en vidence une grande varit de modes de contrle de lexpression des toxines et des autres structures impliques dans la pathognicit de P. aeruginosa. La synthse et la scrtion de la plupart de ces facteurs sont modules en fonction du stade de croissance bactrien (phase exponentielle ou stationnaire), du mode de dveloppement (planctonique ou biofilm) et des conditions environnementales dans lesquelles se trouve la bactrie, notamment lors de linfection dun hte. Les deux principaux mcanismes senseurs permettant de lier les changements dtat et denvironnement une expression protique adapte sont les systmes deux composants et le quorum sensing.

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Les systmes de rgulation deux composants permettent, grce la dtection et la transduction de signaux extrieurs, une rponse rapide de lorganisme face des modifications de lenvironnement. Dans la majorit des cas, le systme est constitu de deux protines et met en jeu un transfert de phosphate pour la transduction du signal. Il sagit :

dune protine kinase, gnralement situe dans une des membranes, appele senseur. En rponse un signal, cette protine sautophosphoryle.

dun rgulateur de rponse sur lequel est transfr le groupe phosphate partir du senseur qui rgule son activit. Il possde un domaine de fixation lADN et rgule la transcription.

P. aeruginosa possde de nombreux systmes de rgulation deux composants putatifs. 55 senseurs, 89 rgulateurs de rponse et 14 systmes hybrides senseur-rgulateur de rponse ont t dnombrs (Rodrigue et al., 2000;Stover et al., 2000). Le nombre important de ces systmes pourrait expliquer en partie lextrme adaptabilit de P. aeruginosa diffrents milieux.

Le second mcanisme global senseur/rgulateur face aux changements denvironnement ou dtat est le quorum sensing . Il permet lexpression coordonne de nombreux facteurs de virulence notamment en fonction de la densit cellulaire. Ltude de ce systme faisant partie du travail effectu, un chapitre dtaill lui est consacr (Chapitre III).

I C-4. Scrtion des facteurs de virulence

La scrtion des facteurs de virulence est ralise grce diffrents mcanismes qui permettent le transport actif de protines travers les membranes bactriennes. Les quatre systmes de scrtion, ubiquitaires chez les bactries Gram ngatif, ont t dcrits chez P. aeruginosa, et sont schmatiss en figure 2. Le systme de scrtion de type IV, rencontr chez Agrobacterium tumefaciens na pas t mis en vidence chez P. aeruginosa.

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IC 4-a) Le systme de scrtion de type I

Ce systme permet le transport de protines directement du cytoplasme vers le milieu extra bactrien. Il est constitu de 3 complexes protiques : une protine de transport avec une activit ATPase dans la membrane interne (AprD), une protine dans la membrane externe formant un pore (AprF), et enfin une protine de fusion membranaire (AprE) situe dans le priplasme et ancre dans la membrane interne qui ralise la liaison entre les deux premires (Kostakioti et al., 2005).

Figure 2 : Schma des principaux systmes de scrtion de protines connus chez les bactries Gram ngatives. La scrtion de lhmolysine (HlyA) dE.coli est donne en exemple pour le type I, la scrtion de lexotoxine (YopE) de Y.pestis pour le type III, la scretion de la protase IgA1 (IgAp) de Neisseria gonorhoeae pour le systme autotransporteur, et la scrtion de la pullulanase (PulA) de Klebsiella oxytoca (Daprs Kostakioti).

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IC 4-b) Le systme de scrtion de type II

La scrtion de type II seffectue en deux tapes. La premire consiste en un transport des protines travers la membrane interne au moyen du systme Sec ATP dpendant ou du systme Tat ATP indpendant dirig par un gradient de pH (Robinson, Thompson, et Woolhead, 2001). Ces deux types de transport ncessitent la prsence dune squence signal spcifique. La seconde tape correspond lexport travers la membrane externe via les systmes Xcp et HxC (homologous to xcp). Ce systme de scrtion permet notamment la scrtion de LasA, LasB, et de lexotoxine A.

IC 4-c) Le systme de scrtion de type IV

Le systme de scrtion de type IV est capable de transporter une grande varit de substrats par un mcanisme dpendant ou indpendant du contact cellulaire. La scrtion de protines ou de complexes nucloprotiques (fragment T du plasmide Ti dAgrobacterium tumefaciens) est ralise par un mcanisme indpendant de la machinerie Sec, except pour la toxine pertussique (Bordetella pertussis) (Kostakioti et al., 2005). Aucun systme de scrtion de type IV na t mis en vidence chez P. aeruginosa.

IC 4-d) Le systme de scrtion de type V

Egalement appel autotransporteur, ce systme fait appel au complexe Sec pour le transport vers lespace priplasmique. Les protines ralisent ensuite elles-mmes le pore ncessaire leur passage travers la membrane externe au moyen dune squence dadressage spcifique (Kostakioti et al., 2005).

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II. Le systme de scrtion de type III

Le systme de scrtion de type III est prsent dans de nombreux genres de bacilles Gram ngatif dont Pseudomonas, Yersinia, Salmonella, Shigella et les Escherichia entropathognes (EPEC, EHEC) (Hueck, 1998). Activ par le contact avec la cellule eucaryote, ce systme est ddi linjection deffecteurs directement du cytoplasme de la bactrie dans le cytosol de la cellule cible sans passage par le milieu extrieur. Ces effecteurs ont pour effets la mort cellulaire ou le dysfonctionnement de la cellule, en dtruisant la membrane, en perturbant les cascades de transduction des signaux ou en dsorganisant le cytosquelette (Hueck, 1998;Shaver et Hauser, 2004;Vance, Rietsch, et Mekalanos, 2005). Ils permettent aux bactries pathognes d'envahir les tissus de lorganisme infect ou de circonscrire ses dfenses. Souvent compar une aiguille, le SSTT est trs conserv au niveau structural entre les bactries Gram ngatif (Aizawa, 2001;Hueck, 1998;Plano, Day, et Ferracci, 2001;Tampakaki et al., 2004). Le SSTT dont la partie basale prsente de grandes similitudes avec le corps basal du flagelle est compos de deux structures (figure 3) : - lappareil de scrtion est un complexe protique enchss dans les membranes bactriennes. Il permet la scrtion des effecteurs spcialiss du SSTT du cytoplasme de la bactrie lextrieur sans transiter par le priplasme. - lappareil de translocation, encore appel aiguille , qui est un second complexe au niveau extrabactrien en contact avec lappareil de scrtion, sinsre dans la membrane de la cellule cible et permet linjection des effecteurs toxiques spcifiques du SSTT. Cest pourquoi on trouve souvent lappellation de facteur de virulence pour dsigner lensemble du SSTT. Bien que la structure des diffrents SSTT soit similaire, ce facteur de virulence a volu de faon particulire pour chaque espce, affectant le mode dinteraction des bactries avec la cellule cible et permettant diffrentes stratgies de pathognicit, allant de lchappement au systme immunitaire pour P. aeruginosa et Yersinia spp, linvasion des cellules pour Salmonella spp. La diversit des rles du SSTT et des environnements dans lesquels il sexprime met en vidence limportance quil joue dans les mcanismes de virulence de certains pathognes Gram ngatif et laisse supposer un haut niveau de rgulation.

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II-A. Le systme de scrtion de Type III de P. aeruginosa

Chez P. aeruginosa, le SSTT induit une mort cellulaire de type ncrose des cellules de limmunit inne (polynuclaires neutrophiles et macrophages) et permet ainsi la bactrie dchapper au systme immunitaire. Sur les cellules pithliales, le SSTT provoque une oncose par une dstructuration du cytosquelette. Lors dune infection

Figure 3 : Modlisation de la structure du flagelle et des systmes de scrtion de type III de diffrentes bactries Gram ngatif. A, structure du flagelle ; B, C, D, SSTT de Yersinia, de E. coli et de P. syringae respectivement. Seules les protines conserves entre les diffrents SSTT (et leurs homologues chez le flagelle) sont reprsentes et identifies par des couleurs et des positions similaires. Le P rod du flagelle na pas de protine homologue connue chez les SSTT. Le point dinterrogation signifie quune structure de type canal au niveau de la membrane interne na pas encore t identifie. Le constituant majeur de laiguille (needle ou Hrp pilus) est YscF chez Yersinia, EspA chez E. coli, HrpA chez P. syringae. Les protines formant le pore dans la membrane eucaryote (EM) sont LcrV, YopB, YopD chez Yersinia et EspB, D chez E. coli. Chez le pathogne des plantes, P. syringae, HrpZ est suppose tre la protine translocatrice. Les protines dont la structure a t caractrise sont reprsentes de faon schmatique. OM, membrane externe de la bactrie ; PL, peptidoglycane ; IM, membrane interne de la bactrie ; EM, membrane eucaryote ; CW, paroi cellulaire de la cellule vgtale. (Daprs Tampakak, 2004)

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pulmonaire, notamment chez les personnes atteintes de mucoviscidose, le SSTT joue un rle prpondrant dans la phase initiale de colonisation et probablement dans la progression de linfection (Corech et al., 2005;Dacheux et al., 1999;Jain et al., 2004).

II A-1. Organisation gntique et fonction principale des clusters de gnes du SSTT

A lexception des gnes codant les exotoxines, les gnes codant le systme de scrtion de type III chez Pseudomonas aeruginosa sont regroups en clusters sur le chromosome contrairement au genre Yersinia pour lequel les SSTT est situ sur un plasmide. Ils sont organiss en plusieurs oprons. Lopron exsCEBA code les principaux rgulateurs du SSTT, les oprons exsD-pscBL et pscNUpcrD codent la structure de lappareil de scrtion, et lopron pcrRGVH-popBD code des protines impliques dans lappareil de translocation.

II A-2. Les diffrentes toxines et leurs fonctions

Quatre exotoxines scrtes par le SSTT sont connues chez P. aeruginosa : ExoS, ExoT, ExoY et ExoU. Toutes les souches ne possdent pas toutes les toxines. Il semble en effet que la prvalence de chaque toxine soit diffrente selon lorigine des souches (environnement, isolats cliniques de diffrentes parties du corps) (Feltman et al., 2001). Ainsi dans ltude de Feltman, incluant des souches environnementales et diffrents isolats cliniques non clonaux, la toxine ExoT est retrouve chez la totalit des souches, la toxine ExoY est prsente 89%, et 72% des souches possdent le gne exoS. La toxine ExoU a quant elle une prvalence plus faible, 28%en moyenne, avec de fortes variations. En effet le gne exoU est retrouv dans 40% des isolats sanguins et de plaies mais dans seulement 10% des isolats respiratoires de patients atteints de mucoviscidose. De plus il semble que les gnes exoS et exoU soient trs rarement retrouvs ensemble dans une mme souche.

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IIA 2-a) Les Exotoxines ExoS et ExoT

Les toxines ExoT et ExoS sont des protines bifonctionnelles qui partagent 76% didentit. Elles possdent une activit GAP spcifique des petites protines G de la famille Rho (Goehring et al., 1999;Krall et al., 2000) et une activit ADP ribosyltransfrase lextrmit C-terminal sur des substrats diffrents : respectivement les protines de la famille Ras et CrkI / II pour ExoS et ExoT (Barbieri et Sun, 2004;Coburn et Gill, 1991;Ganesan et al., 1999;Sun et Barbieri, 2003). Leurs activits perturbent la transduction des signaux intracellulaires mdis par Ras et CrkI / II et conduisent la mort cellulaire ou au remodelage du cytosquelette dactine, induisant ainsi une inhibition de la phagocytose ou un changement de morphologie des cellules (Henriksson et al., 2002;Pederson et Barbieri, 1998;Sundin, Hallberg, et Forsberg, 2004). Le gne orf1 en orientation inverse du gne exoS code une protine qui possde dune part les caractristiques dune protine chaperonne selon la dfinition quen fait Parsot (Page et Parsot, 2002) et dautre part des homologies de squence avec SycE, chaperonne de lhomologue dExoS chez Yersinia sp. Cod en mme temps que la toxine, ce gne semble tre la chaperonne de la protine ExoS et potentiellement celle dExoT (Thse L. Qune, UJF-Grenoble, 2004).

IIA 2-b) Lexotoxine Y

ExoY est une adnylate cyclase qui prsente des homologies avec les adnylates cyclases de Bordetella pertussis (CyaA) et Bacillus anthracis (EF) (Yahr et al., 1998). Son activit ncessite un ou des facteurs eucaryotes inconnus. Cette toxine induit un arrondissement (rounding) des cellules CHO et une augmentation de la concentration en AMP cyclique corrle avec une hyperpermabilit des cellules de la microcirculation pulmonaire secondaire la formation de pores membranaires (Sayner et al., 2004). Rcemment, Cowell et al. ont montr quExoY, en perturbant le cytosquelette dactine, interviendrait en dbut dinfection en inhibant linvasion des cellules pithliales par P. aeruginosa (Cowell, Evans, et Fleiszig, 2005). Cependant, ExoY aurait seulement un rle mineur dans la cytotoxicit de P. aeruginosa lors dune infection pulmonaire aigu (Lee et al., 2005).

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IIA 2-c) Lexotoxine U

ExoU, leffecteur le plus cytotoxique inject par le SSTT de P. aeruginosa, possde une activit phospholipase de type PLA2 (Sato et al., 2003). Il est associ, in vitro, une lyse rapide des cellules et une forte pathognicit en modle animal (Hauser et al., 1998;Sawa et al., 1999).

II A-3. Rgulation de lexpression du SSTT

Il semble exister deux tats possibles pour le SSTT de P. aeruginosa. En effet, comme le montrent les tudes de Dacheux et al. et de lquipe dHauser, certaines souches de P. aeruginosa sont incapables dactiver le SSTT ou en ont perdu la capacit. Ceci, bien quelles possdent les gnes ncessaires cette activation et mme si les bactries se trouvent dans des conditions favorables lactivation de ce facteur de virulence (Dacheux, Attree, et Toussaint, 2001;Feltman et al., 2001;Jain et al., 2004). Dans ces tudes, il sagit principalement de souches issues de poumons de patients ayant dvelopps une infection chronique P. aeruginosa. Ceci suggre quil existe deux tats du SSTT chez P. aeruginosa. Lun est activable par des signaux in vivo ou in vitro qui permettent linjection ou la scrtion des toxines du SSTT, et nous le qualifieront dinductible. Lautre nest pas activable et ne permet pas la scrtion des effecteurs toxiques, bien quaucune mutation des gnes du SSTT nait t mise en vidence dans ces souches, et nous le qualifierons de non inductible. Lensemble des donnes sur la rgulation de lexpression du SSTT, prsent ci-dessous, provient de ltude du passage de ltat inductible ltat activ.

Le SSTT de P. aeruginosa est activ in vivo lors du contact de la bactrie avec la cellule cible. In vitro, le signal dactivation peut tre remplac par une dpltion du milieu en calcium (Hornef et al., 2000;Vallis et al., 1999). En labsence dinduction, il existe une faible expression des gnes du SSTT, permettant la formation dun pool de toxines prformes et dune petite quantit de structures membranaires en place mais dans une conformation ferme empchant la scrtion (Thse L. Qune, UJF-Grenoble, 2004). Le ou les signaux dactivation, encore inconnus, induisent une

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augmentation importante de la transcription de la plupart des gnes codant lappareil de scrtion/translocation et les toxines (Wolfgang et al., 2003). Lensemble des gnes constituant le SSTT de P. aeruginosa est sous le contrle dun facteur de transcription de la famille AraC, ExsA. Cet activateur transcriptionnel, coordonnant lexpression des gnes de lappareil de scrtion/translocation et des toxines, est essentiel lactivation du systme. En effet, les souches mutes pour le gne exsA sont beaucoup moins virulentes dans des modles dinfection pulmonaire (Ader et al., 2005), ont une cytotoxicit rduite sur les cellules eucaryotes (Dacheux et al., 1999;Fauvarque et al., 2002) et sont incapables de scrter les exotoxines lors dune induction in vitro, except si un gne exsA exogne est exprim de faon constitutive dans ces mutants. Les rseaux de rgulation contrlant lactivation du SSTT agissent principalement sur lexpression ou lactivit dExsA de faon directe ou indirecte. On peut distinguer deux classes de rgulateurs : ceux cods au niveau des oprons du SSTT, contrls par ExsA et ceux indpendants dExsA.

IIA 3-a) Rgulation ExsA dpendante

Lensemble des gnes des rgulateurs connus, contrls par ExsA (ExsA, ExsC, ExsB, ExsE, ExsD) sont regroups au niveau des oprons exsCEBA et exsD-pscBL. Lensemble des interactions entre ces protines rgule lactivit dExsA (figure 4).

(i) ExsA ExsA est un membre de la famille des activateurs transcriptionnels de type AraC, homologue VirF qui contrle lexpression du SSTT chez Yersinia. Il possde une activit de fixation lADN de type hlice-tour-hlice et se fixe sur les promoteurs des oprons codant les lments du SSTT au niveau de la squence consensus TXAAAAXA, environ 50 paires de bases en amont du site dinitiation de la transcription (Hovey et Frank, 1995;Yahr et al., 1995). ExsA active sa propre synthse en se fixant sur le promoteur de lopron exsCEBA, crant ainsi une boucle de rtroaction positive. Une mutation du gne exsA conduisant un dfaut dexpression ou une protine non fonctionnelle, abolit lexpression des gnes du SSTT et aboutit une souche moins virulente.

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(ii) ExsB Le produit suppos du gne exsB est homologue VirB qui est impliqu dans la rgulation du SSTT chez Yersinia enterocolitica. Le produit ou lARN issu de ce gne est un activateur dans la rgulation du SSTT puisquune dltion dexsB provoque une diminution dexpression dexsA. Cependant exsB ne semble pas coder une protine comme lont montr les tudes de Goranson et al. (Goranson, Hovey, et Frank, 1997). Cette partie de lopron exsCEBA pourrait jouer un rle dans la rgulation post-transcriptionnelle dexsA en stabilisant lARN.

(iii) ExsD Le gne exsD, premier gne de lopron exsD-pscBL sous le contrle dExsA, code un anti-activateur du SSTT de P aeruginosa. En effet, McCaw et al. ont montr que cette protine est capable de se fixer ExsA et dinhiber son activit. Une surexpression dExsD induit une inhibition du SSTT et son absence une drpression de lopron exsCEBA et par consquent de lensemble des gnes du SSTT (McCaw et al., 2002). Ceci se produit quelles que soient les conditions de culture (avec ou sans activation du SSTT par dpltion calcique ou contact cellulaire). Cependant, un mutant du gne exsD est toujours dpendant du signal dactivation (contact cellulaire ou dpltion calcique) pour scrter les toxines du SSTT mme si les gnes du systme sont drprims (McCaw et al., 2002).

(iv) ExsC ExsC est code par lopron exsCEBA sous la dpendance dExsA. Cette protine est un anti-anti-activateur de par sa capacit fixer ExsD ce qui libre ExsA et permet lactivation de la boucle de rtroaction sur exsA et laugmentation du taux de transcription des gnes du SSTT. Un mutant de ce gne voit la transcription des gnes du SSTT rprime et une surexpression induit une drpression de ces gnes indpendamment de la concentration en calcium (Dasgupta et al., 2004). De plus, daprs ses caractristiques biochimiques (faible poids molculaire, pI basique, hlice C-terminale amphiphatique) et les rcents travaux raliss par Urbanowski et al. et Rietsch et al., ExsC pourrait tre la protine chaperonne dExsE (Rietsch et al., 2005;Urbanowski, Lykken, et Yahr, 2005)

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(v) ExsE ExsE est le dernier partenaire du rseau de rgulation du SSTT. Cette protine est positionne au sommet de la cascade de rgulation centre sur lactivit dExsA et sous sa dpendance. Cette petite protine basique de 82 acides amins (poids thorique de 8,7 kDa) possde une activit de fixation ExsC. Elle est scrte in vitro par le systme de scrtion de type III lors dune dpltion du milieu en calcium. Linjection dExsE et son ventuelle toxicit dans la cellule eucaryote restent dterminer. Dans la bactrie ExsE serait lie ExsC qui jouerait le rle de chaperonne. En effet, la scrtion dExsE lors de lactivation in vitro, est diminue dun facteur 16 en labsence dExsC (Urbanowski, Lykken, et Yahr, 2005).

Les quatre protines ExsA, ExsD, ExsC et ExsE forment ainsi une cascade de rgulation sous la dpendance dExsA. ExsE, au sommet de cette cascade, couple la transcription des gnes du SSTT avec lactivation de la scrtion. En labsence dactivation, le canal de scrtion est ferm, ExsE est fixe ExsC laissant ExsD jouer son rle dinhibiteur en se fixant ExsA. Lors de lactivation, ExsE est scrte, ExsC libre fixe alors ExsD et permet ExsA dinduire la transcription des gnes du

Figure 4 : Modle dinduction in vitro du SSTT. A, en prsence de calcium le canal de scrtion est ferm par PcrV (V), ExsC est squestre par ExsE (E) et le gne exoS est peu exprim. B, lors de la dpltion calcique, ExsE est scrte librant ExsC qui squestre ExsD. ExsA libre peut alors activer lexpression dexoS. (Daprs Rietch, 2005)

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SSTT. Les vnements permettant la scrtion dExsE lors de lactivation sont encore inconnus. Lexpression des gnes du SSTT doit dpendre dun quilibre fin entre les concentrations des diffrents constituants de cette cascade. La double interaction (ExsC-ExsE, ExsC-ExsD) contrlant lexpression dExsA et la prsence dune transcription constitutive un faible taux quont montres des tudes au laboratoire et dans dautres quipes (Wolfgang et al., 2003), permet probablement au systme de dtecter et de rpondre rapidement aux stimuli dinduction limitant ainsi les dpenses en nergie. Dautres voies de rgulation, exposes ci-dessous, ajoutent un niveau supplmentaire de contrle et de flexibilit au systme. Elles permettent de coupler efficacement la transcription la scrtion et une rponse rapide une induction ou une rpression dicte par les conditions du milieu.

IIA 3-b) Rgulation ExsA indpendante

Dautres acteurs, dont lexpression nest pas connue pour tre rgule par ExsA, modulent galement lexpression du SSTT. Lensemble des interactions est rsum sur la figure 5.

(i) Effets du mtabolisme Un nombre grandissant dtudes tend montrer que la richesse nutritive de lenvironnement rencontr par les bactries et les mtabolismes mis en jeu dans ladaptation ce milieu influencent de faon spcifique lexpression des facteurs de virulence. Chez P. aeruginosa, plusieurs voies mtaboliques ou protines du mtabolisme semblent impliques directement dans la rgulation du systme de scrtion de type III.

Lquipe de Rietsch a mis en vidence quune perturbation du mtabolisme de lhistidine module lexpression du SSTT (Rietsch, Wolfgang, et Mekalanos, 2004). La surexpression du gne PA5097 (hutT) codant la permase de lhistidine est corrle avec une diminution de la transcription du gne codant la toxine ExoS et de la cytotoxicit SSTT dpendante sur des macrophages. Cette surexpression induit probablement un transport trop important de lhistidine. Laccumulation intracellulaire

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de cet acide amin provoquerait une accumulation de ses produits de dgradation et un dsquilibre entre les sources de carbone et dazote dltre pour la croissance bactrienne et la cytotoxicit. Ce phnotype peut tre partiellement corrig par la mutation du systme rgulateur deux composants, CbrAB. Ce systme de senseur-rgulateur semble impliqu dans le contrle doprons du catabolisme en rponse un dsquilibre dans lapport en carbone et en azote, sa mutation permettrait de balancer les effets dun import et dun catabolisme excessif de lhistidine. Des tudes sur dautres pathognes ont galement montr une rgulation du SSTT dpendante du mtabolisme des acides amins chez Yersinia et des acides gras chez Salmonella (Lucas et al., 2000;Ramamurthi et Schneewind, 2002).

Dautres protines du mtabolisme bactrien sont impliques dans la rgulation du SSTT. Ainsi, Dacheux et al. ont montr, dans la souche CHA issue dun patient atteint de mucoviscidose, limportance des gnes ppX codant une exopolyphosphatase et dsbA codant une thiol/disulfide oxidorductase priplasmique. Limplication de la protine DsbA dans la maturation des protines membranaires du SSTT tait dj connu chez Salmonella typhimurium (Miki, Okada, et Danbara, 2004). Les auteurs ont galement mis en vidence le rle des sous units E1 et E2 de la pyruvate dhydrognase (PDH) codes par lopron aceAB. La mutation dun de ces gnes entrane une forte diminution de la scrtion des toxines conscutive une perte dinduction du SSTT in vitro et une diminution de presque 100% de la cytotoxicit dpendant du SSTT sur des polynuclaires neutrophiles (Dacheux et al., 2002). Chez un mutant de lopron aceAB, bien que laddition dactate au milieu permette de retrouver une croissance similaire la souche parentale, elle ne permet pas une rversion de la rpression de lopron exsCEBA et donc de lactivation du SSTT. Plus quun effet mtabolique global comme cest probablement le cas pour le mtabolisme de lhistidine, la PDH de P. aeruginosa pourrait jouer un rle direct de rgulateur transcriptionnel. En rponse un stress, elle pourrait coupler modification du mtabolisme des acides tricarboxyliques et modulation de lexpression de facteurs notamment les facteurs de virulence comme cest le cas chez Bacillus thuringiensis ou Azotobacter vinelandii (Regnstrom et al., 1999;Walter et Aronson, 1999).

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Cette modulation du SSTT par les voies mtaboliques semble galement intervenir via les modifications sur les ARNs de transfert (ARNt) ncessaires la traduction dARNs spcifiques. De telles modifications sont impliques dans la rgulation de la virulence en rponse une variation des conditions nutritionnelles du milieu (Durand et Bjork, 2003;Urbonavicius, Durand, et Bjork, 2002). Chez S. flexneri labsence de modifications sur certains ARNs de transfert rduit la traduction du rgulateur VirF (homologue d ExsA) diminuant ainsi lexpression du SSTT (Durand et al., 2000). Chez P. aeruginosa, la mutation du gne truA codant une ARNt pseudo-uridine synthase entrane une absence dexpression des gnes du SSTT (Ahn et al., 2004). La pseudo-uridine joue un rle important dans la structure des ARNs structuraux (Harrington et al., 1993). Cette modification doit donc tre essentielle la stabilit et/ou la fonction dun ou de plusieurs ARNt ncessaires la traduction dun ou des rgulateurs du SSTT de P. aeruginosa. Les pompes efflux MexCD-OprJ et MexEF-OprN ont galement un effet sur la transcription des gnes du SSTT. Ces pompes dont lexpression est gnralement rprime permettent un efflux de molcules dont les antibiotiques. Des mutants surexprimant ces complexes protiques voient la transcription dexsA diminuer et ainsi celle de lensemble des gnes du SSTT lors dune activation in vitro. Ce phnotype peut tre d une scrtion du signal activant le SSTT, ou une modification du mtabolisme due une scrtion accrue de mtabolites rsultant de la surexpression des pompes efflux. Il est intressant de noter que la surexpression dautres pompes que celles cites ci-dessus ninduit pas de rpression du SSTT (Linares et al., 2005) laissant supposer un rle spcifique du ou des rgulateurs de ces pompes sur le SSTT.

(ii) Les rgulateurs globaux Le SSTT de P. aeruginosa est galement sous le contrle de rgulateurs globaux de la virulence. Ainsi la protine Vfr est essentielle la transcription des gnes du SSTT. Son activit ncessite la prsence dAMPc synthtis par deux adnylates cyclases CyaA et CyaB. Vfr, membre de la famille des protines de type CRP, rgule galement des facteurs de virulence tels que le pili de type IV et le systme de scrtion de type II (Wolfgang et al., 2003). La protine CRP (cAMP receptor protein) dE. coli interagit avec lAMPc et joue le rle de rgulateur transcriptionnel en se fixant sur les promoteurs des gnes cibles. De prcdentes tudes ont dj montr

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que lAMPc et son rcepteur sont impliqus dans la rgulation du SSTT de Yersinia enterocolitica (Petersen et Young, 2002). Les systmes de rgulateur deux composants jouent galement un rle dans la modulation de lexpression des gnes du SSTT en rponse une modification du milieu capte par le senseur. Le systme senseur-rgulateur CopR-CopS, impliqu dans la rsistance au stress induit par le Cu2+, rprime lexpression des gnes du SSTT en prsence de cuivre. Cette rpression est effectue par lintermdiaire de la protine PtrA dont lexpression est contrle par CopR-CopS. PtrA est capable de se fixer spcifiquement ExsA et den rprimer lactivit conduisant la rpression des autres gnes du SSTT. Un mutant ptrA prsente quant lui une augmentation de la scrtion des toxines ExoS et ExoT(Ha et al., 2004). Lors de linduction in vitro du SSTT, lEGTA utilis comme chlateur du Ca2+ pourrait galement ltre pour le Cu2+ induisant une diminution dexpression du gne ptrA et donc une augmentation dExsA libre. Une autre protine, RetS, aussi nomme RtsM, possdant des homologies avec les protines constituant les systmes de type senseur-rgulateur, rgule lexpression du SSTT. RetS est une protine hybride possdant la fois un domaine senseur avec une possible activit kinase et deux domaines rgulateur de rponse en tandem. Cependant, elle ne possde pas de domaine de fixation lADN comme la plupart des rgulateurs de rponse connus. RetS rgule de faon positive lexpression des gnes impliqus dans la pathognicit de P. aeruginosa, notamment la transcription dexsA. Les essais de complmentation dun mutant retS avec le rgulateur Vfr ont montr quil agit en aval de RetS(Goodman et al., 2004;Laskowski, Osborn, et Kazmierczak, 2004;Zolfaghar et al., 2005). La dpltion calcique lors de lactivation du SSTT na pas deffet sur la transcription de RetS. Cependant, il nest pas exclu que des modifications post-traductionnelles lors du changement de concentration en calcium active ce rgulateur.

(iii) Rle du quorum sensing et du phnotype mucode Lexpression des gnes du systme de scrtion de type III semble galement rgule par des systmes moduls par la densit bactrienne. Il sagit dune part du facteur sigma alternatif de rponse au stress et la densit cellulaire, RpoS et dautre part dau moins un des systmes de quorum sensing (QS) de P. aeruginosa,

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RhlI/R (voir chapitre III pour les systmes de quorum sensing). Hogardt et al. ont montr que la transcription dexoS lors dune dpltion calcique est suprieure chez un mutant dune de ces protines par rapport la souche parentale. Dans le cas du mutant rhlI, la supplmentation du milieu en C4-homosrine lactone, produite normalement par RhlI, permet de rtablir un niveau de transcription similaire la souche parentale(Hogardt et al., 2004). Le facteur de transcription RpoS et la synthase RhlI sont donc impliqus dans un mcanisme de rpression de lexpression de la toxine ExoS lors dune activation du SSTT in vitro. Il a t montr que lexpression de RpoS se trouve en partie sous le contrle du systme de quorum sensing RhlI/R (voir chapitre III-B). La rpression exerce par ces protines pourrait donc se drouler en cascade, RhlI agissant en amont de RpoS. Rcemment, Bleves et al. ont confirm le rle rpresseur de RhlI et du signal C4-HSL sur lexpression dExoS (Bleves et al., 2005). Cependant, il est intressant de noter que lexpression du gne ExoU ne semble pas drprime par une mutation du gne rpoS (Hogardt et al., 2004) et que lexpression du rgulateur exsA nest pas non plus influence par une mutation du gne rhlI (Bleves et al., 2005). Ces donnes indiqueraient que RhlI et RpoS ont une influence diffrente selon les gnes du SSTT ou les souches de P. aeruginosa. Hogardt et al. ont galement montr que lexpression dExoS est rprime lors dune croissance en biofilm, dont la formation est contrle par le quorum sensing et RpoS. Lhypothse dune rpression du SSTT, pour les bactries se dveloppant sous forme de biofilm, est appuye par deux autres tudes. La premire montre limplication du gne algR dans la rpression du SSTT (Wu et al., 2004). AlgR est un rgulateur ncessaire la synthse de lalginate, un des composants du biofilm chez P. aeruginosa sous le contrle dAlgU (Deretic et al., 1994;Wozniak et Ohman, 1994). La seconde met en vidence quun systme de rgulation trois composants, cod par lopron sadRS et le gne sadA, intervient dans la formation du biofilm et dans lexpression du SSTT. En effet un mutant sadRS est dfectif dans la formation dun biofilm mature et montre une drpression du SSTT lors de la croissance en biofilm. De plus, une surexpression de sadRS entrane une rpression du SSTT en mode de croissance planctonique. De faon surprenante, des mutants de scrtion du SSTT tests pour leur capacit former des biofilms montrent une augmentation de cette formation de biofilm (Kuchma, Connolly, et O'Toole, 2005). La relative protection contre les dfenses immunitaires confre par le biofilm rend le SSTT

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inutile dans cet environnement. Il semble donc que la bactrie ait dvelopp un systme permettant de coordonner production des composants du biofilm et extinction du SSTT. Ces observations sont en accord avec dautres tudes montrant que les bactries mucodes, isoles de patients atteints de mucoviscidose, possdent un SSTT non inductible par un signal in vitro ou in vivo (Dacheux, Attree, et Toussaint, 2001;Jain et al., 2004).

Introduction

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ME

MI

ExsA

Translocon

exsCEBA

DsBA

Toxines du SSTT

TruAARNt modifi ?

Etat mtaboliqueDisponibilit des acides

amins

?CyaAB

AMPc

Vfr

RpoS

RhlI

CopR/S

PtrA

Cu2+

RetS

Biofilm

SadARSPDH

PpX

Activation

Rpression

Facteur de transcriptionRgulateur deux composants

Enzyme

AlgR

Pompes deffluxMexCD / OprJMexEF / OprN

Gne ou opron

Translocon

ME

MI Membrane interne

Membrane externe

ME

MI

ExsA

Translocon

exsCEBA

DsBA

Toxines du SSTT

TruAARNt modifi ?

Etat mtaboliqueDisponibilit des acides

amins

?CyaAB

AMPc

Vfr

RpoS

RhlI

CopR/S

PtrA

Cu2+

RetS

Biofilm

SadARSPDH

PpX

Activation

Rpression

Facteur de transcriptionRgulateur deux composants

Enzyme

AlgR

Pompes deffluxMexCD / OprJMexEF / OprN

Gne ou opron

Translocon

ME

MI Membrane interne

Membrane externe

Figure 5 : Rgulation transcriptionnelle du SSTT indpendante dExsA chez P. aeruginosa. Les interactions des protines entre elles ou avec le promoteur des gnes ne sont pas forcment directes. Les protines avec une fonction similaire sont reprsentes par la mme forme.

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II-B. La rgulation du SSTT chez les autres bacilles pathognes Gram ngatif

II B-1. Les Yersiniae

Il existe trois espces de Yersinia pathognes. Elles infectent les rongeurs et peuvent tre transmises lhomme par lintermdiaire des ectoparasites comme les puces. Lespce la plus connue est Yersinia pestis, lagent de la peste. Les deux autres espces, Yersinia enterocolitica et Yersinia pseudotuberculosis, provoquent chez lhomme des gastro-entrites plus ou moins svres (Cornelis et Wolf-Watz, 1997). Le SSTT de ces trois espces de Yersinia pathognes est celui qui a fait lobjet du plus grand nombre dtudes avec celui des Salmonellae. Chez ces bactries, il est galement activ par le contact avec une cellule hte. In vitro, comme P. aeruginosa, il rpond la dpltion du milieu en calcium mais ncessite aussi une temprature de 37C. Lexpression des op rons du SSTT chez Yersinia dans ces conditions requiert les protines VirF et YmoA. VirF, un rgulateur de type AraC comme ExsA, est transcrit essentiellement 37C et active les oprons yop (Yersinia outer protein) codant les substrats du SSTT et lopron virC codant les composants du systme. YmoA est une histone bactrienne qui intervient dans la modification de la structure de lADN et rprime lexpression des gnes du SSTT. Lactivation des oprons yop par VirF ncessite dabord un changement de conformation de lADN favorable la transcription (Lambert, Sluiters, et Cornelis, 1992). Cette modification intervient lorsque la dgradation de YmoA par les protases ClpXP et Lon est augmente 37C (Jackso n, Silva-Herzog, et Plano, 2004). Chez P. aeruginosa, on peut galement penser que la conformation de lADN est importante pour la rgulation du SSTT puisque la protine Vfr joue un rle important. En effet, lhomologue de Vfr chez E. coli, CRP, influence la conformation de lADN lorsquelle interagit avec celui-ci et joue le rle dactivateur notamment dans la rgulation de lopron arabinose. Dautres protines interviennent dans la rgulation du SSTT chez les trois espces de Yersinia pathognes. LcrQ chez Y. pseudotuberculosis, et ses homologues YscM1 et 2 chez Y. enterocolitica sont des protines scrtes par le SSTT qui ont une activit inhibitrice sur ce systme (Ramamurthi et Schneewind, 2002). Les

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mutants LcrQ ou YscM1-2 expriment les gnes du SSTT mme dans des conditions dfavorables (forte concentration en calcium). La rgulation ralise par ces protines se droulerait au niveau post-transcriptionnel par action sur les parties non traduites des ARN messagers (Cambronne et Schneewind, 2002). Linteraction entre les protines YscM1 et 2 et la chaperonne SycH lverait cette rpression (Cambronne, Sorg, et Schneewind, 2004). Contrairement aux protines LcrQ/YscM, dont lactivit inhibitrice dans le cytoplasme est leve lors de leur liaison SycH puis leur scrtion, la protine LcrH est un rpresseur qui reste exclusivement cytoplasmique. Fixe YopD, un constituant du SSTT dont elle permet la stabilisation et une scrtion efficace, elle rprime lexpression des Yops par un mcanisme post-transcriptionnel. Bien que ne possdant pas dactivit ribonuclase, ce complexe induit indirectement une dgradation des ARNs des Yop (Anderson et al., 2002). Il existe galement une rgulation de la scrtion exerce par le couple LcrG/LcrV. LcrV est une protine secrte par le SSTT qui a comme chaperonne de type Syc LcrG. La mutation du gne lcrV induit une absence de scrtion des Yops. Celle du gne lcrG induit un phnotype dit de perte de spcificit qui se caractrise par une scrtion des toxines dans le milieu lors dune infection cellulaire alors que les Yops sont normalement exclusivement injectes et par une scrtion indpendante de la concentration en calcium in vitro (Lee, Tam, et Schneewind, 2000;Matson et Nilles, 2001).

II B-2. Salmonella typhimurium

Actuellement, Salmonella est le seul genre bactrien possder deux SSTT (Shea et al., 1996). Ces deux systmes jouent des rles diffrents dans les phases dinvasion de la bactrie. Le premier cluster de gnes, SPI.1 (Salmonella Pathogenicity Island 1), permet aux pathognes de passer la barrire de la muqueuse intestinale. Le deuxime cluster de gnes, SPI.2 (Salmonella Pathogenicity Island 2), est ncessaire la bactrie pour la phase dinvasion systmique. Ces deux systmes sont donc activs diffrents stades de linfection (Galn, 2001). Le SSTT cod par les gnes du SPI.1 (SSTT.1) est exprim par Salmonella dans la lumire du tractus intestinal, alors que le SSTT cod par les

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gnes du SPI.2 (SSTT.2) est exprim seulement quand les bactries ont pntr dans les cellules eucaryotes. Lactivation in vitro du SSTT.1 de S .typhimurium ncessite des conditions environnementales extrmement particulires. En effet, il faut simultanment un faible taux doxygne, une forte osmolarit, et un pH voisin de 8 (Bajaj et al., 1996). Ces conditions sont celles de la lumire du tractus intestinal et permettent donc aux gnes du SSTT dtre activs uniquement quand les bactries se trouvent sur le site dinvasion. La temprature nest pas un facteur environnemental dterminant pour lactivation du SSTT.1, cependant comme pour Yersinia, la protine H-NS apparente aux histones et jouant un rle dans la structure de lADN, est implique dans la rgulation de lexpression des gnes du SPI.1, mais son activit na pas t montre influence par la temprature (Schechter et al., 2003). Il existe deux facteurs de transcription cods dans le SPI.1. HilA est ncessaire lexpression de tous les gnes du SPI.1 (Bajaj, Hwang, et Lee, 1995). Ce facteur de transcription, dont le gne nest pas autorgul, est impliqu dans la perception des conditions environnementales activant le SSTT.1 et se fixe aux promoteurs des gnes invF et prgH (Bajaj et al., 1996). InvF est le deuxime facteur de transcription dont le gne se localise dans le SPI.1 et il contrle lexpression des promoteurs du cluster inv-spa (Darwin et Miller, 1999;Kaniga, Bossio, et Galan, 1994). Lactivit dInvF est conditionne par sa liaison avec SicA. SicA est la chaperonne des toxines du SPI.1, SipB et SipB. Lors de lactivation de la scrtion, SicA se retrouve libre et peut lier InvF pour activer la transcription (Miller, 2002). Deux autres facteurs de transcription rgulent lactivation du SSTT.1 mais ne sont pas cods dans le SPI.1 : SirA et PhoP. SirA est llment de rponse du systme deux composants BarA/SirA. Ce systme permet laugmentation de lexpression des gnes de virulence pendant que lexpression des gnes de mobilit diminue. SirA active la virulence directement en augmentant lexpression de HilA pendant que lactivit du flagelle est rprime indirectement via lactivation de lexpression du gne csrB (Teplitski, Goodier, et Ahmer, 2003). PhoP semble tre un rgulateur ngatif du SSTT.1. En effet, il entrane une rpression de lexpression de hilA (Garcia, Soncini, et Groisman, 1996). PhoP est active aprs avoir t phosphoryle par PhoQ, en rponse un changement de la concentration dions divalents dans le milieu. Il est donc possible que la faible concentration en calcium dans les vacuoles de phagocytose soit un signal rprimant

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lexpression du SSTT.1 aprs linternalisation des bactries. Une tude rcente a dcrit une interaction spcifique entre les protines HilE et HilD, intervenant dans la rgulation de lexpression du SSTT.1 (Baxter et al., 2003). En effet, HilD est un activateur du promoteur de hilA, la fixation de HilE sur HilD agit comme anti-activateur de cette protine. Les mcanismes de la rgulation de lexpression du SSTT.2 commencent tre dcrypts. Garmendia et al. ont montr que le systme deux composants SsrA/SsrB contrle lexpression des gnes de lappareil de scrtion et des gnes codant pour les effecteurs, en rponse diffrents signaux environnementaux de type faible osmolarit, pH acide ou encore faible concentration en calcium (Garmendia et al., 2003).

II B-3. Escherichia coli enteropathognes

Les Escherichia coli entropathognes (EPEC) sont des bactries responsables dinfections intestinales svres. Elles diffrent des autres souches dE. coli par leur capacit former des microcolonies sur la surface de ces cellules. Les EPEC sont responsables de la plupart des diarrhes infantiles dans les pays en voie de dveloppement. Aprs tre entr en contact avec lpithlium intestinal, les EPEC sattachent de faon plus intime aux cellules pithliales et entranent la disparition des microvillosits et la formation dun renflement de la cellule sur lequel la bactrie peut se dvelopper (figure 6). Ce processus de colonisation ncessite la prsence dune adhsine bactrienne, lintimine, et du SSTT (Scaletsky, Silva, et Trabulsi, 1984). Lintimine se fixe de faon spcifique sur le rcepteur Tir (translocated intimin

Figure 6 : Interaction entre EPEC et une cellule pithliale. Le SSTT permet dinduire la formation dun renflement (pedestal) sur la membrane de la cellule cible favorisant lattachement de la bactrie via linteraction intiminercepteur Tir. (Frankel et al)

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receptor), localis dans la membrane de la cellule pithliale proximit directe de la zone dattachement initiale de la bactrie sur la cellule. Ce rcepteur dorigine bactrienne est inject dans la cellule par lintermdiaire du SSTT des EPEC puis expos sur la membrane de la cellule cible ce qui permet linteraction avec lintimine. Le SSTT des EPEC est port par un locus de 35.5 kb sur lADN chromosomique de la bactrie, appel LEE (Locus of Enterocyte Effacement) compos de 5 oprons. Ce locus est aussi retrouv chez dautres souches, telles que les souches dE. coli entrohmoragiques (EHEC). Lexpression du SSTT chez les EPEC dpend de la temprature. Des bactries cultives 28C ne prs entent pas de phnotype de scrtion. La virulence maximale est observe 37C en dbut de phase exponentielle de croissance (Umanski, Rosenshine, et Friedberg, 2002). In vivo, le SSTT des EPEC est un systme contact dpendant. In vitro, la croissance en milieu de culture eucaryote (RPMI, DMEM) est ncessaire la scrtion des protines Esp (Kenny et al., 1997). En effet, les protines de type III des EPEC ne sont pas scrtes dans les milieux de culture bactrien du type milieu LB. Comme dans la plupart des autres SSTT, lactivation de la virulence chez les EPEC ncessite un activateur transcriptionnel de type AraC, PerA. Cette protine est code au niveau de lopron perABC, localis sur un plasmide de virulence nomm EPEC adherence factor (EAF) plasmid . PerA active sa propre expression et celle du rgulateur Ler, cod par le premier gne de lopron LEE1. Cette protine est essentielle pour lexpression de la majorit des oprons LEE chez les EPEC. Le plasmide EAF nest pas retrouv chez les EHEC mais il existe des homologues lactivateur PerC, cods par lopron pchABC situ sur le chromosome (Iyoda et Watanabe, 2004). Dautres gnes cods au niveau du LEE1 rgulent galement lactivation du SSTT. Il sagit de GrlR et GrlA, qui sont respectivement inhibiteur et activateur du gne ler. Dautres rgulateurs, non cods au niveau du LEE, interviennent dans la rgulation du SSTT chez les EPEC, notamment des protines associes la chromatine telle que H-NS, Fis ou IHF(Bustamante et al., 2001;Goldberg et al., 2001;Umanski, Rosenshine, et Friedberg, 2002) dont un homologue, YmoA, est galement impliqu dans la rgulation du SSTT chez Yersinia. Des gnes relis au quorum sensing sont aussi importants pour la rgulation de lexpression du LEE chez les EHEC et les EPEC. Lopron LEE1 est stimul par le rgulateur QseA, qui est activ via une cascade de transductions impliquant les signaux AI2 et AI3. Il a galement t

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montr que le facteur sigma RpoS, contrl par le quorum sensing, inhibe lexpression de lopron pchABC contrlant le SSTT tout comme chez P. aeruginosa pour laquelle RpoS inhibe lexpression dexsA (Iyoda et Watanabe, 2005;Sircili et al., 2004;Sperandio et al., 2003) (figure 7).

II B-4. Un schma de rgulation commun

Bien quils prsentent des rseaux de rgulation diffrents, les SSTT de ces diffrents bacilles Gram ngatif possdent le mme principe de rgulation. Lactivateur principal est un membre de la famille AraC et son activit dpend de ses interactions avec une autre protine. Au sommet de la cascade se trouve un rgulateur ngatif, cod par lun des oprons du SSTT, qui est une protine secrte par le SSTT. Les divergences se rencontrent au niveau des dtails de rgulation et dinteraction avec cet inhibiteur (figure 8). Chez Salmonella et Shigella, la protine qui lie le rgulateur principal (InvF et MxiE) est une chaperonne des toxines du SSTT (SicA et IpgC) qui agit comme un co-activateur. Chez Yersinia, le complexe

Figure 7 : Rgulation du SSTT (cluster LEE) chez les E. coli entropathognes (EPEC) et entrohmoragiques (EHEC). Les protines, molcules et interactions retrouves chez les EPEC sont symbolises en rouge, chez les EHEC en bleu et chez les deux types dE.coli pathognes en noir. Comme pour P. aeruginosa, on voit quil existe des boucles de rtrocontrle positives et ngatives pour la rgulation du SSTT et que RpoS rprime le SSTT en agissant sur le rgulateur cl du systme.

Ler

GrlR GrlA

PerABCPchABC LEE

H-NS

RpoS

QseA

Quorum sensing:LuxS-AI2 / AI3

Ler

GrlR GrlA

PerABCPchABC LEE

H-NS

RpoS

QseA

Quorum sensing:LuxS-AI2 / AI3

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chaperonne-substrat (YopD-LcrH) et linhibiteur scrt (LcrQ/YscM) lient les ARNm pour empcher leur traduction. Chez P. aeruginosa, cest lanti-activateur (ExsD) qui est rgul par une chaperonne du SSTT (ExsC). Il semble galement que la topologie de lADN, contrle par des protines de type histone, ait un rle dans la rpression du SSTT. Tous les acteurs de cette rgulation ne sont pas connus chez toutes les bactries. Ainsi, aucun rpresseur scrt na encore t mis en vidence chez les E. coli pathognes et le mcanisme de rpression par modification de la structure de lADN na pas t dmontr chez P. aeruginosa.

Lensemble des rseaux de rgulation montre galement que lactivation du SSTT chez les bacilles Gram ngatif et notamment chez P. aeruginosa, ncessite lintgration de conditions environnementales, en plus dtre dpendante du contact avec son hte. Ces systmes permettent ainsi lexpression de plus dune vingtaine de protines en un lieu et un moment prcis o elles sont vraiment ncessaires.

Figure 8 : Principe de base de la rgulation des SSTT avec ou sans activation de la scrtion. Lexpression des gnes par lactivateur principal, de type AraC (A), est bloque par un rpresseur (R) qui est scrt par le SSTT lors de lactivation. Les diffrents types dactions possibles du rpresseur sont reprsents mais ne sont pas retrouvs dans toutes les bactries.

RSignal dactivation

R

Gnes du SSTT

A

A

ME

MI

ME

MI

RA RA

Activateur principal

Represseur

R

A

C

CR

C

R

CCo-inducteur

RSignal dactivation

R

Gnes du SSTT

A

A

ME

MI

ME

MI

RA RA

Activateur principal

Represseur

R

A

C

CR

C

R

CCo-inducteur

Introduction

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II B-5. SSTT et mucodie

Dans le cas dune infection chronique P. aeruginosa, le SSTT et la capacit former un biofilm jouent un rle important. Le SSTT facilite la colonisation lors de la premire infection et la dissmination de la bactrie dans lhte une fois linfection installe. Le phnotype mucode avec formation du biofilm, permet la persistance de la bactrie. Cependant, la cytotoxicit dpendante du SSTT peut tre difficilement associe au dveloppement sous forme de biofilm puisque le SSTT est rprim sous ce mode de croissance. Le dveloppement de nouvelles thrapies contre P. aeruginosa, en particulier lors dune infection pulmonaire chronique, bnficierait grandement de la comprhension des mcanismes conduisant cette rpression. Dans cette optique, nous avons voulu dterminer quels sont les mcanismes mis en jeu pour le passage dune bactrie mobile, non mucode, avec un SSTT actif une bactrie mucode avec un SSTT rprim ? Le quorum sensing qui joue un rle important dans la formation du biofilm et la rgulation de nombreux facteurs de virulence pourrait tre un des mcanismes impliqus (Kuchma, Connolly, et O'Toole, 2005).

Introduction

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III. Le Quorum Sensing

III-A. Gnralits

Face une modification de leur environnement, les bactries ont besoin de coordonner la rponse dans lensemble de la population en modifiant un grand nombre de gnes. Cette rgulation est notamment permise par une communication intercellulaire, que lon pensait jusquil y a peu de temps rserve aux organismes pluricellulaires. Les bactries produisent en effet des molcules de signalisation diffusibles qui saccumulent dans lenvironnement au cours de la croissance. Ces phromones bactriennes permettent chaque cellule de sentir lorsquune unit de population ou quorum bactrien (ou densit de population) est atteint et dinitier un comportement concert de toute la population bactrienne. Lorsque la densit de population devient suffisante, ce mcanisme de rgulation globale, dfini par le terme de quorum sensing , permet aux bactries de coordonner rapidement au sein de la population, lexpression de gnes spcifiques. Dcrit pour la premire fois chez Vibrio fischeri pour le phnomne de bioluminescence, ce mcanisme a t aujourdhui identifi chez de nombreuses bactries ( Gram-ngatif et Gram-positif). Il est connu pour rguler, en fonction de la densit de population, des processus impliqus dans ladaptation mtabolique et la virulence : production de facteurs de virulence, dveloppement de la comptence gnique, formation du biofilm et mobilit (de Kievit et Iglewski, 2000;Kleerebezem et al., 1997;Withers, Swift, et Williams, 2001). Rcemment, il a t montr que ce mcanisme de rgulation globale semble pouvoir intervenir aux diffrents stades de la croissance bactrienne et durant les phnomnes de stress (Van Delden, Comte, et Bally, 2001).

La rgulation via le quorum sensing seffectue toujours selon le mme modle avec des variations spcifiques chaque organisme. Le quorum sensing fait intervenir trois acteurs principaux : un signal galement appel autoinducteur, un mcanisme permettant la synthse de ce signal et un rgulateur transcriptionnel. Bien que le

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mcanisme de quorum sensing soit retrouv chez les bactries Gram ngatif et Gram positif, les acteurs sont trs diffrents et peuvent tre classs en trois groupes : le systme LuxI/R chez les bactries Gram ngatif qui utilise gnralement des homosrines lactones comme signal, le systme des bactries Gram positif avec des oligopeptides modifis comme autoinducteur, et les systmes hybrides (Henke et Bassler, 2004). La figure 9 rsume ces trois systmes et prsente des exemples de diffrents autoinducteurs et systmes rguls par le quorum sensing.

III A-1. Le quorum sensing chez les bactries Gram positif : Oligopeptides et Rgulateurs deux composants

Chez les bactries Gram positif le signal est un oligopeptide, obtenu partir dun prcurseur protique et scrt via un transporteur ABC. Lorsque la concentration de ce peptide dans le milieu atteint le seuil de stimulation, il est dtect par un systme de signalisation deux composants (senseur-rgulateur). Linteraction du peptide avec le senseur provoque lautophosphorylation et lactivation de celui-ci qui transfre alors un groupement phosphate sur le rgulateur. Le rgulateur phosphoryl active alors la transcription de gnes cibles (Surette et Bassler, 1998). Le quorum sensing chez les bactries Gram positif est notamment impliqu dans lacquisition de la comptence gntique chez Bacillus subtilis et la virulence chez Staphylococcus aureus (Kleerebezem et al., 1997;Yarwood et Schlievert, 2003).

Introduction

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Figure 9 : Les trois principaux groupes de quorum sensing : LuxI/R , Oligopeptides et systme deux composants, et le systme hybride. Les pentagones rouge reprsentent les acyl homosrines lactones (AHLs) ; les lignes bleues les oligopeptides et les triangles oranges lautoinducteur 2 (AI-2). Les principaux autoinducteurs et systmes, contrls par le quorum sensing, les plus tudis sont exposs sous chaque groupe. HPt, histidine phosphotranfrase ; P, phosphate ; RR, rgulateur de rponse ; SHK, senseur histidine kinase (Henke et Bassler 2004).

Introduction

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III A-2. Le quorum sensing chez les bactries Gram ngatif : le systme LuxI/LuxR

Ce systme de quorum sensing est mdi par des acyl-homosrines lactones (acyl-HSLs) produites par une synthase nomme I et reconnues par un rgulateur R (figure 10). A faible densit cellulaire, le niveau basal dexpression de la synthase est faible. Les acyl-HSLs diffusent dans le milieu et saccumulent au cours de la croissance. Lorsque la concentration atteint un seuil, lacyl-HSL interagit avec son rcepteur spcifique. La formation de ce complexe entrane la modulation de lexpression des gnes cibles dont le gne de la synthase I, do lappellation dautoinducteur pour les acyl-HSLs. Du fait de la diffusion du signal et de cette boucle dauto-induction, l'induction d'une bactrie induit celle des bactries voisines aboutissant ainsi une rponse coordonne de l'ensemble de la population.

Peu de bactries Faible [acyl-HSL]

Gnes cibles teints

Croissance bactrienne Augmentation [acyl-HSL]

Gnes cibles teints

Quorum bactrien Autoinduction [acyl-HSL]

Gnes cibles actifs

r i

I

Substrat

i r

I

Substrat

+

+

Autoinduction

Acyl-HSL

Variation gnotypique/phnotypique Communication cellulaire

Gnes cibles

R R

R

Figure 10 : Mcanisme du quorum sensing mdi par les homosrines lactones. r/R : rgulateur (gne/protine) ; i/I : synthase (gne/protine), [acyl-HSL] : concentration en acyl-HSL.

Introduction

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IIIA 2-a) Les acyl-homosrines lactones

De nombreuses acyl-HSLs sont produites par les bactries. Elles se diffrencient par leur chane acyl. Ces molcules diffusent librement travers la paroi bactrienne dans le cas du signal C4-HSL de P. aeruginosa ou font lobjet dun transport actif par le biais de pompes defflux pour le signal 3-oxo-C12-HSL de la mme bactrie (Pearson, Van Delden, et Iglewski, 1999). La longueur de la chane carbone du groupe acyl, influenant lhydrophobicit de la molcule, dterminerait son mode de transport.

IIIA 2-b) Les synthases I

Trois familles de synthases dacyl-HSLs ont t dcrites et groupes selon leurs homologies de squences. Chaque classe ne partage aucune homologie avec les autres. La classe I regroupe les enzymes possdant une similarit avec LuxI (V. fischeri) (Fuqua et Greenberg, 1998). La classe II regroupe aujourdhui les enzymes LuxM (V. harveyi), AinS (V. fischeri) et VanM (V. anguillarum) (Gilson, Kuo, et Dunlap, 1995;Milton et al., 2001). La dernire classe (III) possde actuellement un seul membre, HdtS, isol chez P. fluorescens (Laue et al., 2000). Bien que ces enzymes soient diffrentes, le mcanisme de synthse des acyl-HSLs reste identique. Ces synthases catalysent la liaison de la S-adnosyl-mthionine (SAM) avec la chane dacide gras dune acyl-acyl-carrier protein (acyl-ACP), suggrant une convergence au cours de lvolution dans le mcanisme de synthse des autoinducteurs.

IIIA 2-c) Les rgulateurs R

Deux classes de rgulateurs ont t dcrites.

Les rgulateurs dits de classe I, de la famille LuxR (V. fischeri) agissent sous forme dimrique et sont constitus de deux modules fonctionnels : un domaine de liaison lhomosrine lactone en partie N-terminale. un domaine rgulateur de la transcription avec un motif hlice-tour-hlice de

fixation lADN.

Introduction

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La liaison de lautoinducteur avec le rgulateur induit une modification de structure rendant le domaine rgulateur accessible et fonctionnel. La seconde classe de rgulateurs na pour linstant t mise en vidence que chez le genre Vibrio. Il sagit de protines homologues aux senseur-rgulateur hybrides intervenant dans les systmes de rgulation deux composants. Ils ncessitent lintervention dautres partenaires pour rpondre aux autoinducteurs.

Ces systmes de type LuxI/R semblent exclusivement rservs la communication au sein dune espce. Chacune produit un signal qui diffre de celui produit par la plupart des autres bactries et les rgulateurs sont trs sensibles la structure de lautoinducteur. Une petite modification de la molcule induit une absence de reconnaissance par le senseur voire une inhibition du systme. Les bactries semblent cependant avoir dvelopp un mcanisme de communication entre espces diffrentes toujours bas sur le mode quorum sensing.

III A-3. La communication inter espces : le cas du signal AI2 et de la synthase LuxS

La premire communication inter-espces, via un mcanisme de quorum sensing diffrent de celui mdi par les acyl-HSLs ou les oligopeptides, a t mise en vidence par Bassler en 1999 entre E. coli, S. typhimurium et V. harveyi (Surette, Miller, et Bassler, 1999). Dabord dcouvert chez V. harveyi, le signal nomm AI2, est produit par un grand nombre de bactries Gram positif et Gram ngatif et ncessite la prsence de la protine LuxS. Contrairement aux autres signaux quorum sensing, la voie de synthse et les intermdiaires pour la production de lAI2 sont identiques dans toutes les bactries tudies produisant lAI2. Chez la plupart des bactries rpondant au signal AI2, celui-ci est impliqu dans la formation de biofilm regroupant plusieurs espces et dans la rgulation de facteurs de virulence entre espces (Fong et al., 2001;McNab et Lamont, 2003). Cependant le mcanisme de reconnaissance et de transmission du signal na t mis jour que chez trois espces (V. harveyi, V. cholerae, S. typhimurium). Ce type de quorum sensing pourrait tre un signal supplmentaire pour ladaptation un nouvel environnement multi bactrien. Dans le cas de bactries pathognes, la

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dtection de ce signal permettrait lexpression de systmes en adquation avec lenvironnement. Cest ce que suggrent les rsultats obtenus par Duan et al. En effet, lors dinfections pulmonaires chez le rat par P. aeruginosa en prsence de flore oropharynge, les lsions causes par le pathogne sur le tissu sont plus importantes (Duan et al., 2003).

III-B. Le quorum sensing chez P. aeruginosa

La rgulation via le quorum sensing est essentielle dans la pathognie de P. aeruginosa notamment lors des infections pulmonaires chroniques. Elle contrle entre autres ladhsion, la formation de biofilm, et lexpression dune batterie de facteurs de virulence permettant la fois la progression de linfection et la persistance des bactries dans les poumons (Imamura et al., 2005;Smith et Iglewski, 2003).

P. aeruginosa possde deux systmes complets de quorum sensing bass sur les homosrines lactones nomms LasI/R et RhlI/R (figure 11). LasI, appartenant la famille des synthases de type LuxI, synthtise la molcule signal 3-oxo-C12-HSL. Ce premier autoinducteur appel PAI1 (Pseudomonas AutoInducer 1) se lie au rgulateur LasR, homologue LuxR (Gambello et Iglewski, 1991;Pearson et al., 1994). Le couple LasR-PAI1 rgule lexpression dune varit de gnes cibles. Il active notamment lexpression de facteurs de virulence tels que les lastases LasA et LasB et lexotoxine A (ToxA). Ce premier systme de QS rgule aussi de faon positive certains gnes constituant lappareil de scrtion de type II en activant lopron xcp (Smith et Iglewski, 2003) couplant ainsi la synthse des toxines et des constituants du systme permettant leur export. Une fois activ par la 3-oxo-C12-HSL, LasR active galement le gne lasI crant ainsi une boucle dauto-induction (Seed, Passador, et Iglewski, 1995).

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Le second systme de rgulation par quorum sensing chez P. aeruginosa est cod par les gnes rhlI et rhlR. RhlI catalyse la synthse dune HSL, la C4-HSL (Ochsner et Reiser, 1995). Ce second autoinducteur, nomm PAI2, se lie au rgulateur RhlR pour lactiver. Le complexe RhlR-C4-HSL rgule notamment lexpression des gnes

lasR lasI

LasR

lasR

LasI

rhlR rhlI

RhlIRhlR

+

Activ

Activ

Inactif

Inactif

rpoS RpoS

Adaptation la phase stationnaire /

Stress

ToxALasAPQS

3-oxo-C12-HSL

C4-HSL

LasBXcp

PyocyanineLipases

+

RhlR

pqsR

pqsABCDE phnAB pqsHlasR

+

-

+

-

3-oxo-C12-HSL

PqsRPqsR PQS

QscR

+

RsaL

-

++

+

Vfr, GacA

+

++

+

C4-HSL

RpoS

RpoS

+

+/-Gnes cibles

+

rsaL

Figure 11 : Principales protines et rseaux dinteractions impliqus dans le mcanisme de quorum sensing chez Pseudomonas aeruginosa. () inhibition, (+) activation

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lasB, xcp et rhlAB (ncessaire la production des rhamnolipides) et la production de mtabolites secondaires tels que la pyocyanine et le cyanure (opron hcnAB). Les deux systmes de rgulation par quorum sensing chez P. aeruginosa sont organiss en cascade. Le systme LasI/R exerce une rgulation deux niveaux sur le systme RhlI/R. Au niveau transcriptionnel, Latifi et al. et Pesci et al. ont montr que RhlR est active par le couple LasR-PAI1 (Latifi et al., 1996;Pesci et al., 1997). Au niveau post-transcriptionnel, la 3-oxo-C12-HSL entre en comptition avec la C4-HSL pour la liaison au rgulateur RhlR, rsultant en un complexe inactif (Pesci et al., 1997). Les synthases LasI et RhlI produisent galement dautres homosrines que les PAI1 et PAI2 qui pourraient galement jouer le rle de comptiteur et moduler les interactions autoinducteur-rcepteur (Pearson et al., 1994;Winson et al., 1995).

Bien que ces deux systmes soient imbriqus, ils ne contrlent pas les mmes ensembles de gnes. Plusieurs tudes danalyse de transcriptome et de protome ont mis en vidence que les gnes rguls par le quorum sensing peuvent tre regroups en trois classes : ceux rguls exclusivement par un des autoinducteurs (le gne toxA, les gnes pour la production de pyocyanine) et ceux ncessitant les deux autoinducteurs simultanment pour voir leur expression modifie (lopron xcp). De plus, ces classes de gnes sont exprimes des stades diffrents de la croissance bactrienne (Arevalo-Ferro et al., 2003;Hentzer et al., 2003;Schuster et al., 2003;Wagner et al., 2003;Wagner, Gillis, et Iglewski, 2004). Ces tudes indiquent que larchitecture en cascade des deux systmes de quorum sensing induit une expression de gnes squentielle permettant probablement la mise en place des processus prcoces et tardifs lors dune infection. En plus des deux homosrines majoritaires, P. aeruginosa produit une 2-hepthyl-3-hydroxy-4-quinolone (PQS, Pseudomonas Quinolone Signal) (Pesci et al., 1999). Contrairement aux PAI1 et PAI2 dont la concentration est maximale lors de la transition entre la phase exponentielle et la phase stationnaire de croissance, la concentration du PQS dans le surnageant de culture est maximale forte densit cellulaire ce qui correspond une fin de phase stationnaire de croissance en milieu riche (aprs 30 42 heures post inoculation) (McKnight, Iglewski, et Pesci, 2000). La synthse du PQS ncessite lexpression des protines codes par les oprons pqsABCDE, phnAB et pqsH (D'Argenio et al., 2002;Gallagher et al., 2002). La transcription de ces gnes ncessite la prsence du rgulateur PqsR (aussi nomm

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MvfR) (Cao et al., 2001;Deziel et al., 2005;Gallagher et al., 2002). Daprs les tudes ralises par les quipes de Deziel et al. et Wade et al., ce rgulateur contrle lexpression de nombreux gnes impliqus dans la virulence dont ceux des oprons phnAB, et pqsABCDE (Deziel et al., 2005;Wade et al., 2005). Ce signal PQS est imbriqu dans les mcanismes de quorum sensing. En effet la synthse du PQS est sous la dpendance des systmes LasI/R et RhlI/R qui contrlent lexpression du gne pqsR (Wade et al., 2005). Le complexe LasR-PAI1 a un effet positif sur la transcription de pqsR tandis que le couple RhlR-PAI2 a un effet ngatif. Lexpression de PqsR induit la production de PQS qui peut alors se lier PqsR et facilite sa liaison au promoteur de lopron pqsABCDE. Cette boucle de rtroaction positive dans la production du PQS en fait un co-inducteur. Le complexe PqsR-PQS active galement la transcription de rhlI, formant cette fois une rtroaction ngative. Cet effet nest visible que chez un mutant lasR ce qui suggre que cela se produit lorsque lasR nest pas exprim (Gallagher et al., 2002). Ces trois systmes de communication intercellulaire sont fortement impliqus dans la pathognicit de la bactrie. Les diffrents mutants des rgulateurs ou des voies de synthse des signaux possdent une cytotoxicit moins leve que les souches parentales.

Jusqu' prsent, il na pas t mis en vidence que P. aeruginosa est capable de produire le signal de communication inter espces AI2, synthtis par les homologues de la synthase LuxS (voir chapitre III A-3). Le surnageant de culture de P. aeruginosa ninduit pas dactivation des biodtecteurs pour ce signal et il nexiste pas dhomologue LuxS dans le gnome de P. aeruginosa. Cependant, les lments pour rpondre au signal AI2 sont prsents comme lont montr Duan et al. Laddition dAI2 dans le milieu de culture active lexpression de facteurs de virulence, notamment Las

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