2556 · The types of volatiles compounds were analyzed by GC-MS. The results revealed that 15 % HVP gave the The results revealed that 15 % HVP gave the highest acceptance from the

การผลตโปรตนไฮโดรไลเซทจากพชโดยการยอยดวยเอนไซม

โดย

นางสาวปยนช ไพโรจนกลยา

การคนควาอสระนเปนสวนหนงของการศกษาตามหลกสตรปรญญาวทยาศาสตรมหาบณฑต

สาขาวชาเทคโนโลยอาหาร สาขาวชาเทคโนโลยอาหาร ภาควชาเทคโนโลยอาหาร

บณฑตวทยาลย มหาวทยาลยศลปากร ปการศกษา 2556

ลขสทธของบณฑตวทยาลย มหาวทยาลยศลปากร

สำนกหอ

สมดกลาง

การผลตโปรตนไฮโดรไลเซทจากพชโดยการยอยดวยเอนไซม

โดย

นางสาวปยนช ไพโรจนกลยา

การคนควาอสระนเปนสวนหนงของการศกษาตามหลกสตรปรญญาวทยาศาสตรมหาบณฑต

สาขาวชาเทคโนโลยอาหาร สาขาวชาเทคโนโลยอาหาร ภาควชาเทคโนโลยอาหาร

บณฑตวทยาลย มหาวทยาลยศลปากร ปการศกษา 2556

ลขสทธของบณฑตวทยาลย มหาวทยาลยศลปากร

สำนกหอ


PROTEIN HYDROLYSATE PRODUCTION FROM ENZYMATIC HYDROLYSIS OF

PLANT PROTEIN

By

Miss Piyanuch Pairojkallaya

An Independent Study Submitted in Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree

Master of Science Program in Food Technology Department of Food Technology

Graduate School, Silpakorn University Academic Year 2013

Copyright of Graduate School, Silpakorn University

สำนกหอ


บณฑตวทยาลย มหาวทยาลยศลปากร อนมตใหการคนควาอสระเรอง “ การผลตโปรตนไฮโดรไลเซทจากพชโดยการยอยดวยเอนไซม ” เสนอโดย นางสาวปยนช ไพโรจนกลยา เปนสวนหนงของการศกษาตามหลกสตรปรญญาวทยาศาสตรมหาบณฑต สาขาวชาเทคโนโลยอาหาร

……........................................................... (รองศาสตราจารย ดร.ปานใจ ธารทศนวงศ) คณบดบณฑตวทยาลย

วนท..........เดอน.................... พ.ศ...........

อาจารยทปรกษาการคนควาอสระ ผชวยศาสตราจารย ดร.อรณศร ลจรจาเนยร คณะกรรมการตรวจสอบการคนควาอสระ .................................................... ประธานกรรมการ (ผชวยศาสตราจารย ดร.ดวงใจ ถรธรรมถาวร ) ............/......................../.............. .................................................... กรรมการ (ผชวยศาสตราจารย ดร.ประสงค ศรวงศวไลชาต) ............/......................../.............. .................................................... กรรมการ (ผชวยศาสตราจารย ดร.อรณศร ลจรจาเนยร) ............/......................../..............

สำนกหอ


ง

53403312 : สาขาวชาเทคโนโลยอาหาร คาสาคญ : โปรตนไฮโดรไลเซทจากพช / สารประกอบหอมระเหย ปยนช ไพโรจนกลยา : การผลตโปรตนไฮโดรไลเซทจากพชโดยการยอยดวยเอนไซม. อาจารยทปรกษาการคนควาอสระ : ผชวยศาสตราจารย ดร.อรณศร ลจรจาเนยร. 163 หนา. โปรตนผกไฮโดรไลเซท (Hydrolyzed Vegetable Protein, HVP) เปนวตถดบหลกในอตสาหกรรมเครองปรงรสหรอการปรงแตงกลนรส HVP มกจะผลตจากการยอยโปรตนผกดวยกรด ซงในกระบวนการผลตจะเกดสาร mono และ dichloropropanols และ monochloropropanediols ซงเปนสาเหตกอใหเกดสารกอมะเรง อกทงยงพบวามปรมาณเกลอทสงดวย (ประมาณรอยละ 40) ดงนนการศกษานจะศกษาถงสภาวะการผลตโปรตนไฮโดรไลเซทจากโปรตนสกดจากถวเหลอง (soy protein isolate, SPI) ดวยการยอยดวยเอนไซมโปรตเอสทางการคา 4 ชนด ไดแก Collupulin MG, Protease G6, Protamex และ Protease G1 ทกจกรรมของเอนไซมเดยวกนและทสภาวะทเหมาะสมของแตละเอนไซม ซงวดผลดวยวธการแสดงผลตอบสนองแบบพนผวตอบสนอง (Response surface methodology, RSM) พบวาเอนไซม Collupulin MG เปนเอนไซมทเหมาะสมทสด เนองจากใหรอยละการยอยสลาย (degree of hydrolysis, DH) และรอยละผลผลต (%yield) ดทสด สภาวะเหมาะสมในการยอยโปรตนสกดจากถวเหลองดวยเอนไซม Collupulin MG ซงมกจกรรมของเอนไซมเปน 318.25 หนวยตอกรมโปรตนซบสเตรท (Units/g protein substrate) คอ pH 5.0 – 6.5 และอณหภม 70 องศาเซลเซยส ใชเวลาในการยอย 12 ชวโมง ซงใหคาระดบการยอยและรอยละผลผลตเทากบ 49.18 และ 31.16 ตามลาดบ และเมอทาการวดคาส L*, a* และ b* ไดคา 8.10, -0.88 และ 2.85 ตามลาดบ หลงจากนนนา HVP ทผลตไดมาใชเปนสารตงตนในการผลตกลนรสไกโดยกระบวนการ ใหความรอน โดยแปรผนปรมาณ HVP รอยละ 5, 15 และ 25 (นาหนก/ปรมาตร) และเตม L-cysteine•HCl• H2O 2.6 กรม, L-glycine 1.4 กรม, ribose 1.5 กรม, glucose 2.3 กรม, นาและ50% โซเดยมไฮดรอกไซด 2 มลลลตร ใหความรอนทอณหภม 95 องศาเซลเซยส นาน 2 ชวโมง หลงจากนนทาการทดสอบทางประสาทสมผสและวดปรมาณสารประกอบหอมระเหยดวยเครอง GC-MS ซงพบวาสารใหกลนรสไกทผลตจากกระบวนการใหความรอนทประกอบดวย HVP รอยละ 15 ใหคะแนนการยอมรบมากทสด ซงสอดคลองกบผลการวเคราะหสารหอมระเหยดวยเครอง GC-MS ทพบ 4,5-Dimethylthiazole ซงใหคณลกษณะกลนไกปรมาณมากทสด ซงใหปรมาณสาร 4,5-Dimethylthiazole เทากบ 0.535 ไมโครกรมตอกรมน าหนกแหง สวนทความเขมขนของ HVP รอยละ 5 และ 25 ใหปรมาณ 4,5-Dimethylthiazole เทากบ 0.018 และ 0.078 ไมโครกรมตอกรมน าหนกแหง ตามลาดบ

สาขาวชาเทคโนโลยอาหาร ภาควชาเทคโนโลยอาหาร บณฑตวทยาลย มหาวทยาลยศลปากร ลายมอชอนกศกษา........................................ ปการศกษา 2556 ลายมอชออาจารยทปรกษาการคนควาอสระ ........................................

สำนกหอ


จ

53403312 : MAJOR : (FOOD TECHNOLOGY) KEY WORD : HYDROLYSATE VEGETABLE PROTEIN (HVP) / VOLATILE COMPOUNDS

PIYANUCH PAIROJKALLAYA : PROTEIN HYDROLYSATE PRODUCTION FROM

ENZYMATIC HYDROLYSIS OF PLANT PROTEIN. INDEPENDENT STUDY ADVISOR : ASST.

PROF. ARUNSRI LEEJEERAJUMNEAN, Ph.D. 163 pp.

Hydrolyzed vegetable protein (HVP) is the main raw material used in the seasoning or flavor industry. HVP is produced from hydrolysis of plant protein by acid. However, there is some carcinogens, such as mono and dichloropropanols and monochloropropanediols produced during the processing. In addition, during the HVP production by acid hydrolysis, high concentration of salt, around 40 %, is also occurred. The aim of this research was to study the optimum condition for HVP production from enzymatic hydrolyzes by using soy protein isolate (SPI) as substrate.The optimum condition for producing enzymatic hydrolyzed vegetable protein from soy protein isolate by four commercial proteolytic enzymes, Collupulin MG, Protease G6, Protamex and Protease G1 at the same enzyme activity and specifically condition of each enzyme was studied. The result was evaluated by using response surface methodology. Collupulin MG was the most suitable enzyme because it gave the highest degree of hydrolysis (DH) and % yield. The optimum condition of Collupulin MG in hydrolysis SPI was achieved at the lowest enzyme activity, 318.3 units/ gram protein SPI when hydrolyzed at 70 OC, pH 5.0-6.5 for 12 hours . With the highest degree of hydrolysis and % yield, 49.18 and 31.16, respectively. The color of finished product, liquid HVP was light brown with L*, a* and b* value of 8.10 , -0.88 and 2.85 respectively. After that the HVP was used to produce chicken flavor by thermal processing method. Three concentrations of HVP 5, 15 and 25% (W/V) were used and L-cysteine•HCl• H2O 2.6 g., L-glycine 1.4 g., ribose 1.5 g., glucose 2.3 g., water and 50% NaOH 2 ml. were added.The solution were heated at 95 OC for 2 hours. Then, the chicken flavors were determined the sensory evaluation by consumer test. The types of volatiles compounds were analyzed by GC-MS. The results revealed that 15 % HVP gave the

highest acceptance from the consumer test and gave the hightest 4,5- dimethyl thiazole, 0.535 µg/g dry wt. The other concentrations of HVP, 5 and 25 gave 4,5- dimethyl thiazole 0.018 and 0.078 µg/g dry wt., respectively. So, it showed the high potential to produce chicken flavor from HVP hydrolyzed by enzymatic method from SPI.

Department of Food Technology Graduate School, Silpakorn University

Student's signature ........................................ Academic Year 2013

Independent Study Advisor's signature .......................................

สำนกหอ


ฉ

กตตกรรมประกาศ

ขาพเจาขอกราบขอบพระคณผชวยศาสตราจารย ดร.อรณศร ลจรจาเนยร อาจารยทปรกษา ทกรณาชแนะใหคาปรกษา และชวยตรวจสอบแกไขขอบกพรองของสารนพนธเลมนใหถกตองและสมบรณยงขน ผชวยศาสตราจารย ดร.ดวงใจ ถรธรรมถาวร และผชวยศาสตราจารย ดร.ประสงค ศรวงศวไลชาต ทใหคาแนะนาและตรวจสอบสารนพนธฉบบนใหถกตองสมบรณมากยงขน

ขอกราบขอบพระคณคณาจารยภาควชาเทคโนโลยอาหารทกทานทไดใหความร คาแนะนาและใหขอชแนะตลอดการศกษาทผานมา

ขอขอบพระคณเจาหนาทในภาควชาเทคโนโลยอาหารทกทาน ทชวยอานวยความสะดวกในการสบคนฐานขอมลตางๆ และขอขอบคณเจาหนาทและบรรณารกษของหอสมดมหาวทยาลยศลปากร วทยาเขตพระราชวงสนามจนทร ททาใหขาพเจามขอมลในการศกษาคนควา

ขอบคณเพอนๆในบรษท เอฟ-พลส จากด ทกคนทคอยใหกาลงใจและใหความชวยเหลอเปนอยางดในทกเรอง

สดทายนขอกราบขอบพระคณบดามารดา และครอบครวของขาพเจาทใหกาลงใจขาพเจาตลอดมา

สำนกหอ


ช

สารบญ หนา

บทคดยอภาษาไทย ง บทคดยอภาษาองกฤษ จ กตตกรรมประกาศ ฉ สารบญ ช สารบญตาราง ฌ สารบญภาพ ถ บทท 1 บทนา 1 ความเปนมาและความสาคญของปญหา 1 วตถประสงคของงานวจย 2 สมมตฐานของงานวจย 2

ขอบเขตของงานวจย 2 2 เอกสารและงานวจยทเกยวของ 3

การผลตโปรตนไฮโดรไลเซทดวยกรด 4 สาร 3MCPD 5 การผลตโปรตนไฮโดรไลเซทดวยเอนไซม 6 ปจจยทสงผลตอการผลตสารใหกลนรสจากการยอยสลายโปรตนจากพช 11 สารประกอบทไดจากการยอยสลายโปรตนจากพชดวยเอนไซม 17 3 วธดาเนนงานวจย 25 วตถดบ สารเคม และอปกรณทใชในการวจย 25 วธการทดลอง 27 4 ผลการทดลองและการอภปรายผลการทดลอง 34 องคประกอบทางเคมของโปรตนสกดจากถวเหลอง 34 การคดเลอกชนดเอนไซมทเหมาะสม 35 สภาวะทเหมาะสมตอการผลต HVP 37 ระยะเวลาทเหมาะสมในการผลต HVP 44

สำนกหอ


ซ

บทท หนา 4 พฒนาโปรตนไฮโดรไลเซททไดจากการยอยโปรตนถวเหลองสกดโดยใช เอนไซมเปนสารใหกลนรส 48 วเคราะหองคประกอบของสารใหกลนรสไก 50 5 สรปผลการทดลอง 57 รายการอางอง 59 ภาคผนวก 65 ภาคผนวก ก วธวเคราะหคณภาพทางเคม 66 ภาคผนวก ข ขอมลการทดลอง 76 ภาคผนวก ค แบบทดสอบทางประสาทสมผส 161 ประวตผวจย 163

สำนกหอ


ฌ

สารบญตาราง ตารางท หนา 1 รสชาตของกรดอะมโนทมโครงสรางแบบ L-form 18 2 สารประกอบใหกลนรสหลกในกระบวน thermal process flavor, คณลกษณะตางๆ และคา threshold 24

3 อตราสวนผสมในกระบวนการผลตกลนรสไกจากกระบวนการ thermal process flavor 32 4 รอยละปรมาณองคประกอบตาง ๆ ในโปรตนสกดจากถวเหลอง 34 5 เปรยบเทยบการยอยโปรตนสกดจากถวเหลองดวยเอนไซมชนดตางๆทมกจกรรมเปน 200 หนวยตอกรมโปรตนท pH และอณหภมทเหมาะสมจาเพาะสาหรบเอนไซม

แตละชนดเปนเวลา 3 ชวโมง 36 6 คารอยละการยอยสลายและรอยละผลผลตของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอย ดวยเอนไซม Collupulin MG ทสภาวะตางๆ ตามแผนการทดลองแบบพนทผว ตอบสนองเปนเวลา 3 ชวโมง 38 7 เปรยบเทยบและยนยนการคดเลอกสภาวะทเหมาะสมตอการยอยโปรตนสกดจาก ถวเหลองดวยเอนไซม Collupulin MG เปนเวลา 3 ชวโมง 44 8 ผลของระยะเวลาตอโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม

Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 318.25 หนวยตอกรมโปรตนท pH 5.0 และอณหภม 70 องศาเซลเซยส 45

9 ผลการทดสอบดานประสาทสมผสของกลนรสไกทผานกระบวนการ thermal process flavor โดยม HVP ทความเขมขนตางกนเปนสารตงตน 50 10 ผลการวเคราะหปรมาณสารหอมระเหยทไดจากการกระบวนการ thermal process flavor ทใชปรมาณ HVP ความเขมขนรอยละ 5, 15 และ 25 และ กลนรสไกทางการคา 52 11 การละลายของวตถดบทใชทอณหภม 20 องศาเซลเซยส 55 12 เปรยบเทยบสารหอมระเหยทไดจากกระบวนการ thermal process flavor และ

กลนรสไกทางการคา 55 13 คณลกษณะของกลนรสไกทไดจากกระบวนการ thermal process flavor 55

สำนกหอ


ญ

ตารางท หนา 14 รอยละปรมาณโปรตนทเปนองคประกอบในโปรตนสกดจากถวเหลอง 77 15 รอยละปรมาณไขมนทเปนองคประกอบในโปรตนสกดจากถวเหลอง 77 16 รอยละปรมาณเถาทเปนองคประกอบในโปรตนสกดจากถวเหลอง 78 17 รอยละปรมาณความชนทเปนองคประกอบในโปรตนสกดจากถวเหลอง 78 18 คาการดดกลนแสงของ Standard Tyrosine ทความเขมขนตางๆ ทความยาวคลน

660 นาโนเมตร 79 19 คากจกรรมของเอนไซม Protease G1 (หนวยตอกรมของแขง) 80 20 คากจกรรมของเอนไซม Protamex (หนวยตอกรมของแขง) 81 21 คากจกรรมของเอนไซม Collupulin MG (หนวยตอกรมของแขง) 82 22 คากจกรรมของเอนไซม Protease G6 (หนวยตอกรมของแขง) 83 23 รอยละการยอยสลายของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Protease G1 ทมกจกรรมเปน 200 หนวยตอกรมของแขงท pH 7.0 และอณหภม 50 องศาเซลเซยส เปนเวลา 3 ชวโมง 84 24 รอยละการยอยสลายของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Protamex ทมกจกรรมเปน 200 หนวยตอกรมของแขงท pH 6.0 และอณหภม 50 องศาเซลเซยส เปนเวลา 3 ชวโมง 85 25 รอยละการยอยสลายของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 200 หนวยตอกรมของแขงท pH 6.5 และอณหภม 65 องศาเซลเซยส เปนเวลา 3 ชวโมง 86 26 รอยละการยอยสลายของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Protease G6 ทมกจกรรมเปน 200 หนวยตอกรมของแขงท pH 9.5 และอณหภม 60 องศาเซลเซยส เปนเวลา 3 ชวโมง 87 27 รอยละผลผลตของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Protease G1 ทมกจกรรมเปน 200 หนวยตอกรมของแขงท pH 7.0 และอณหภม 50 องศาเซลเซยส เปนเวลา 3 ชวโมง 88

สำนกหอ


ฎ

ตารางท หนา 28 รอยละผลผลตของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Protamex ทมกจกรรมเปน 200 หนวยตอกรมของแขงท pH 6.0 และอณหภม 50 องศาเซลเซยส เปนเวลา 3 ชวโมง 89 29 รอยละผลผลตของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 200 หนวยตอกรมของแขงท pH 6.5 และอณหภม 65 องศาเซลเซยส เปนเวลา 3 ชวโมง 90 30 รอยละผลผลตของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Protease G6 ทมกจกรรมเปน 200 หนวยตอกรมของแขงท pH 9.5 และอณหภม 60 องศาเซลเซยส เปนเวลา 3 ชวโมง 91 31 ผลการเปรยบเทยบการยอยโปรตนสกดของถวเหลองดวยเอนไซมชนดตางๆ ทมกจกรรมเปน 200 หนวยตอกรมของแขงท pH และอณหภมทเหมาะสมจาเพาะ สาหรบเอนไซมแตละชนด 92 32 รอยละการยอยสลายของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 200 หนวยตอกรมของแขงท pH 5.0 และ อณหภม 50 องศาเซลเซยส เปนเวลา 3 ชวโมง 93 33 รอยละการยอยสลายของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 200 หนวยตอกรมของแขงท pH 7.0 และ อณหภม 50 องศาเซลเซยสเปนเวลา 3 ชวโมง 94 34 รอยละการยอยสลายของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 200 หนวยตอกรมของแขงท pH 5.0 และ อณหภม 70 องศาเซลเซยส เปนเวลา 3 ชวโมง 95 35 รอยละการยอยสลายของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 200 หนวยตอกรมของแขงท pH 7.0 และ อณหภม 70 องศาเซลเซยส เปนเวลา 3 ชวโมง 96 36 รอยละการยอยสลายของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม

Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 400 หนวยตอกรมของแขงท pH 5.0 และ

อณหภม 50 องศาเซลเซยส เปนเวลา 3 ชวโมง 97

สำนกหอ


ฏ

ตารางท หนา 37 รอยละการยอยสลายของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 200 หนวยตอกรมของแขงท pH 7.0 และ อณหภม 50 องศาเซลเซยส เปนเวลา 3 ชวโมง 98 38 รอยละการยอยสลายของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 400 หนวยตอกรมของแขงท pH 5.0 และ อณหภม 70 องศาเซลเซยส เปนเวลา 3 ชวโมง 99 39 รอยละการยอยสลายของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 400 หนวยตอกรมของแขงท pH 7.0 และ อณหภม 70 องศาเซลเซยส เปนเวลา 3 ชวโมง 100 40 รอยละการยอยสลายของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 300 หนวยตอกรมของแขงท pH 4.32 และ อณหภม 60 องศาเซลเซยส เปนเวลา 3 ชวโมง 101 41 รอยละการยอยสลายของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 300 หนวยตอกรมของแขงท pH 7.68 และ อณหภม 60 องศาเซลเซยส เปนเวลา 3 ชวโมง 102 42 รอยละการยอยสลายของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 300 หนวยตอกรมของแขงท pH 6.0 และ อณหภม 43.18 องศาเซลเซยส เปนเวลา 3 ชวโมง 103 43 รอยละการยอยสลายของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 300 หนวยตอกรมของแขงท pH 6.0 และ อณหภม 76.82 องศาเซลเซยส เปนเวลา 3 ชวโมง 104 44 รอยละการยอยสลายของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 131.82 หนวยตอกรมของแขงท pH 6.0 และ อณหภม 60 องศาเซลเซยส เปนเวลา 3 ชวโมง 105 45 รอยละการยอยสลายของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 468.18 หนวยตอกรมของแขงท pH 6.0 และ อณหภม 60 องศาเซลเซยส เปนเวลา 3 ชวโมง 106

สำนกหอ


ฐ

ตารางท หนา 46 รอยละการยอยสลายของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 300 หนวยตอกรมของแขงท pH 6.0 และ อณหภม 60 องศาเซลเซยส เปนเวลา 3 ชวโมง(1) 107 47 รอยละการยอยสลายของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 300 หนวยตอกรมของแขงท pH 6.0 และ อณหภม 60 องศาเซลเซยส เปนเวลา 3 ชวโมง(2) 108 48 รอยละการยอยสลายของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 300 หนวยตอกรมของแขงท pH 6.0 และ อณหภม 60 องศาเซลเซยส เปนเวลา 3 ชวโมง (3) 109 49 รอยละการยอยสลายของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 300 หนวยตอกรมของแขงท pH 6.0 และ อณหภม 60 องศาเซลเซยส เปนเวลา 3 ชวโมง (4) 110 50 รอยละการยอยสลายของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 300 หนวยตอกรมของแขงท pH 6.0 และ อณหภม 60 องศาเซลเซยส เปนเวลา 3 ชวโมง (5) 111 51 รอยละการยอยสลายของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 300 หนวยตอกรมของแขงท pH 6.0 และ อณหภม 60 องศาเซลเซยส เปนเวลา 3 ชวโมง (6) 112 52 รอยละผลผลตของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 200 หนวยตอกรมของแขงท pH 5.0 และ อณหภม 50 องศาเซลเซยส เปนเวลา 3 ชวโมง 113 53 รอยละผลผลตของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 200 หนวยตอกรมของแขงท pH 7.0 และ อณหภม 50 องศาเซลเซยส เปนเวลา 3 ชวโมง 114 54 รอยละผลผลตของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 200 หนวยตอกรมของแขงท pH 5.0 และ อณหภม 70 องศาเซลเซยส เปนเวลา 3 ชวโมง 115

สำนกหอ


ฑ

ตารางท หนา 55 รอยละผลผลตของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 200 หนวยตอกรมของแขงท pH 7.0 และ อณหภม 70 องศาเซลเซยส เปนเวลา 3 ชวโมง 116 56 รอยละผลผลตของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 400 หนวยตอกรมของแขงท pH 5.0 และ อณหภม 50 องศาเซลเซยส เปนเวลา 3 ชวโมง 117 57 รอยละผลผลตของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 400 หนวยตอกรมของแขงท pH 7.0 และ อณหภม 50 องศาเซลเซยส เปนเวลา 3 ชวโมง 118 58 รอยละผลผลตของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 400 หนวยตอกรมของแขงท pH 5.0 และ อณหภม 70 องศาเซลเซยส เปนเวลา 3 ชวโมง 119 59 รอยละผลผลตของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 400 หนวยตอกรมของแขงท pH 7.0 และ อณหภม 70 องศาเซลเซยส เปนเวลา 3 ชวโมง 120 60 รอยละผลผลตของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 300 หนวยตอกรมของแขงท pH 4.32 และ อณหภม 60 องศาเซลเซยส เปนเวลา 3 ชวโมง 121 61 รอยละผลผลตของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 300 หนวยตอกรมของแขงท pH 7.68 และ อณหภม 60 องศาเซลเซยส เปนเวลา 3 ชวโมง 122 62 รอยละผลผลตของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 300 หนวยตอกรมของแขงท pH 6.0 และ อณหภม 43.18 องศาเซลเซยส เปนเวลา 3 ชวโมง 123

63 รอยละผลผลตของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม

Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 300 หนวยตอกรมของแขงท pH 6.0 และ

อณหภม 76.82 องศาเซลเซยส เปนเวลา 3 ชวโมง 124

สำนกหอ


ฒ

ตารางท หนา 64 รอยละผลผลตของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 131.82 หนวยตอกรมของแขงท pH 6.0 และ อณหภม 60 องศาเซลเซยส เปนเวลา 3 ชวโมง 125 65 รอยละผลผลตของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 466.18 หนวยตอกรมของแขงท pH 6.0 และ อณหภม 60 องศาเซลเซยส เปนเวลา 3 ชวโมง 126 66 รอยละผลผลตของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 300 หนวยตอกรมของแขงท pH 6.0 และ อณหภม 60 องศาเซลเซยส เปนเวลา 3 ชวโมง(1) 127 67 รอยละผลผลตของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 300 หนวยตอกรมของแขงท pH 6.0 และ อณหภม 60 องศาเซลเซยส เปนเวลา 3 ชวโมง(2) 128 68 รอยละผลผลตของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 300 หนวยตอกรมของแขงท pH 6.0 และ อณหภม 60 องศาเซลเซยส เปนเวลา 3 ชวโมง(3) 129 69 รอยละผลผลตของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 300 หนวยตอกรมของแขงท pH 6.0 และ อณหภม 60 องศาเซลเซยส เปนเวลา 3 ชวโมง(4) 130 70 รอยละผลผลตของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 300 หนวยตอกรมของแขงท pH 6.0 และ อณหภม 60 องศาเซลเซยส เปนเวลา 3 ชวโมง(5) 131 71 รอยละผลผลตของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 300 หนวยตอกรมของแขงท pH 6.0 และ อณหภม 60 องศาเซลเซยส เปนเวลา 3 ชวโมง(6) 132

72 ระดบการยอยสลายของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม

Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 318.25 หนวยตอกรมของแขงท pH 5.0 และ

อณหภม 70 องศาเซลเซยส เปนเวลา 3 ชวโมง 139

สำนกหอ


ณ

ตารางท หนา 73 ระดบการยอยสลายของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 318.21 หนวยตอกรมของแขงท pH 7.0 และ อณหภม 70 องศาเซลเซยส เปนเวลา 3 ชวโมง 140 74 ระดบการยอยสลายของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 320.23 หนวยตอกรมของแขงท pH 6.29 และ อณหภม 70 องศาเซลเซยส เปนเวลา 3 ชวโมง 141 75 รอยละผลผลตของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 318.25 หนวยตอกรมของแขงท pH 5.0 และ อณหภม 70 องศาเซลเซยส เปนเวลา 3 ชวโมง 142 76 รอยละผลผลตของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 318.25 หนวยตอกรมของแขงท pH 5.0 และ อณหภม 70 องศาเซลเซยส เปนเวลา 3 ชวโมง 143 77 รอยละผลผลตของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 320.23 หนวยตอกรมของแขงท pH 6.29 และ อณหภม 70 องศาเซลเซยส เปนเวลา 3 ชวโมง 144 78 รอยละการยอยสลายของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 318.25 หนวยตอกรมของแขงท pH 5.0 และ อณหภม 70 องศาเซลเซยส เปนเวลา 1 ชวโมง 145 79 รอยละการยอยสลายของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 318.25 หนวยตอกรมของแขงท pH 5.0 และ อณหภม 70 องศาเซลเซยส เปนเวลา 2 ชวโมง 146 80 รอยละการยอยสลายของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 318.25 หนวยตอกรมของแขงท pH 5.0 และ อณหภม 70 องศาเซลเซยส เปนเวลา 3 ชวโมง 147 81 รอยละการยอยสลายของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 318.25 หนวยตอกรมของแขงท pH 5.0 และ อณหภม 70 องศาเซลเซยส เปนเวลา 6 ชวโมง 148

สำนกหอ


ด

ตารางท หนา 82 ระดบการยอยสลายของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 318.25 หนวยตอกรมของแขงท pH 5.0 และ อณหภม 70 องศาเซลเซยส เปนเวลา 9 ชวโมง 149 83 รอยละการยอยสลายของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 318.25 หนวยตอกรมของแขงท pH 5.0 และ อณหภม 70 องศาเซลเซยส เปนเวลา 12 ชวโมง 150 84 รอยละการยอยสลายของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 318.25 หนวยตอกรมของแขงท pH 5.0 และ อณหภม 70 องศาเซลเซยส เปนเวลา 24 ชวโมง 151 85 รอยละผลผลตของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 318.25 หนวยตอกรมของแขงท pH 5.0 และ อณหภม 70 องศาเซลเซยส เปนเวลา 1 ชวโมง 152 86 รอยละผลผลตของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 318.25 หนวยตอกรมของแขงท pH 5.0 และ อณหภม 70 องศาเซลเซยส เปนเวลา 2 ชวโมง 153 87 รอยละผลผลตโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 318.25 หนวยตอกรมของแขงท pH 5.0 และ อณหภม 70 องศาเซลเซยส เปนเวลา 3 ชวโมง 154 88 รอยละผลผลตโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 318.25 หนวยตอกรมของแขงท pH 5.0 และ อณหภม 70 องศาเซลเซยส เปนเวลา 6 ชวโมง 155 89 รอยละผลผลตโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 318.25 หนวยตอกรมของแขงท pH 5.0 และ อณหภม 70 องศาเซลเซยส เปนเวลา 9 ชวโมง 156 90 รอยละผลผลตโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 318.25 หนวยตอกรมของแขงท pH 5.0 และ อณหภม 70 องศาเซลเซยส เปนเวลา 12 ชวโมง 157

สำนกหอ


ต

ตารางท หนา 91 รอยละผลผลตโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 318.25 หนวยตอกรมของแขงท pH 5.0 และ อณหภม 70 องศาเซลเซยส เปนเวลา 24 ชวโมง 158 92 อทธพลของระยะเวลาตอคาสของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 318.25 หนวยตอกรมของแขงท pH 5.0 และ อณหภม 70 องศาเซลเซยส เปนเวลา 24 ชวโมง 159

สำนกหอ


ถ

สารบญภาพ ภาพท หนา 1 กระบวนการผลต HVP ดวยกรดในระดบอตสาหกรรม 4 2 กระบวนการผลต HVP ดวยเอนไซม 7 3 การตดพนธะเปปไทดดวยเอนไซมเอกโซเปปตเดส 8 4 แสดงรอยละของปรมาณเปปไทดทไดเปรยบเทยบกบเวลาทใชในการยอยสลาย โดยใชเอนไซมโปรตเอสตางๆ (Alcalase, Flavourzyme, Pepsin, Neutrase, Protamex และ Trypsin) 10 5 ผลการทดสอบทางประสาทสมผสจากการยอยโปรตนจากกากถวลสงดวยเอนไซม โปรตเอสแตละชนด 11 6 ปรมาณกรดอะมโนอสระเปรยบเทยบกบอณหภม 12 7 ผลของอณหภมทเพมขนเปรยบเทยบกบปรมาณสารประกอบทระเหยได 12 8 ผลของ pH ตอปรมาณสารประกอบทระเหยได 13 9 ผลความเขมขนของเอนไซมและเวลาในการยอยสลายทสงผลตอรอยละการยอยสลาย ของโปรตนไฮโดรเลเซทจากกากถวเขยวดวยเอนไซม 15

10 กลไกการเกดสารประกอบไพราซน 20 11 กลไกการเกดสารประกอบฟราน 21 12 กลไกการเกดสารประกอบ thiazole 22 13 กลไกการเกดสารประกอบอลดไฮด 23 14 พนทผวตอบสนองสาหรบอทธพลของ pH และอณหภมตอรอยละการยอยสลาย ทกจกรรมเอนไซม Collupulin MG เปน 300 หนวยตอกรมโปรตน 40

15 พนทผวตอบสนองสาหรบอทธพลของ pH และอณหภมตอรอยละผลผลตทกจกรรม ของเอนไซม Collupulin MG เปน 300 หนวยตอกรมโปรตน 43

16 ผลของระยะเวลาตอรอยละการยอยสลายโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอย ดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 318.25 หนวยตอกรมโปรตน ท pH 5.0 และอณหภม 70 องศาเซลเซยส 46 17 อทธพลของระยะเวลาตอคา L* ของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวย เอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 318.25 หนวยตอกรมโปรตน ท pH 5.0 และอณหภม 70 องศาเซลเซยส 47

สำนกหอ


ท

ภาพท หนา 18 Chromatograms of thermal process flavor 51 19 องคประกอบสารหอมระเหยทใช HVP รอยละ5 , HVP รอยละ15 และ HVP รอยละ 25 ในกระบวนการผลตสารใหกลนรส 53 20 เปรยบเทยบองคประกอบสารหอมระเหยทใช HVP รอยละ 5 , HVP รอยละ 15 และ HVP รอยละ 25 ในกระบวนการผลตสารใหกลนรส 54 21 Chromatograms กลนรสไกจากกระบวนการ thermal process flavor (HVP รอยละ15)

เปรยบเทยบกบ Chromatograms ของกลนรสไกทางการคา 56 22 กราฟแสดงความสมพนธระหวางปรมาณของ Standard Tyrosine ทความเขมขนตางๆ และคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 660 นาโนเมตร 79

23 ลกษณะคาความเบยงเบนมาตรฐานของการออกแบบพนทผวตอบสนองทไดจากการ ทดลอง 134

สำนกหอ


1

บทท 1 บทน า

1. ความเปนมาและความส าคญของปญหา

อตสาหกรรมเครองปรงรสของไทยยงคงเตบโตอยางตอเนอง มการพฒนาสอตสาหกรรมขนาดใหญมากขน รวมทงมการปรบปรงรปแบบผลตภณฑทหลากหลายและเหมาะสมตอความตองการของผบรโภค สถานการณสงออกเครองปรงรสในป 2551 ปรมาณสงออก 177,128.14 ตน มลคา 9,846.76 ลานบาท ขยายตวเพมขนรอยละ 21.62 ตลาดสงออกหลกไดแก ญปน มลคาสงออก 1,747.87 ลานบาท, สหรฐอเมรกา มลคาสงออก 1,296.15 ลานบาท และฟลปปนส มลคาสงออก 985.83 ลานบาท (อตสาหกรรมเครองเทศเครองปรงรส, 2551) โดยในการประกอบอตสาหกรรมอาหารหรอการปรงอาหารในครวเรอนไดมการเตมกลนรสลงไปอยางกวางขวาง ซงสารใหกลนรสถกนามาใชในผลตภณฑอาหารโดยตรงโดยใชเปนสวนประกอบทสาคญในการทาใหเกดกลนรสทดในอาหารแปรรปทงคาวและหวาน หรอใชเปนสวนประกอบหลกของสารแตงกลนรสหลายชนด เชนเปนสวนประกอบในซปกอน ซอส ผลตภณฑเนอสตว ผลตภณฑนมและกาแฟ แตเนองจากกลนรสทเตมลงไปมราคาแพงและตองนาเขาจากตางประเทศ ทาใหตนทนของบรษทมราคาสง ดงนนในงานวจยนจงเปนการศกษาเพอพฒนากระบวนการผลต HVP ทมคณภาพ และเพอเปนแนวทางในการลดการนาเขา HVP ซงในแตละปประเทศไทยนาเขา HVP ในปรมาณมากเพอนามาใชเปนสารแตงกลนรสและเพมกลนรสในผลตภณฑอาหารตางๆทใหกลนรสเนอสตว ปจจบนมการใชสารใหกลนรสในอตสาหกรรมอาหารเพมมากขนเนองจาก ระหวางกระบวนการผลตและการเกบรกษาผลตภณฑอาหารจะเกดการสญเสยสารใหกลนรส ซงการสญเสยนสามารถทดแทนไดโดยการเตมสารใหกลนรสเลยนแบบธรรมชาต หรอสารใหกลนรสสงเคราะหลงในผลตภณฑ สารใหกลนรสทงสองชนดนมขอดคอ สามารถผลตไดโดยมคณภาพทสมาเสมอ HVP นยมใชเปนสารปรงแตงกลนรสในอตสาหกรรมอาหารทวโลก มคณสมบตในการปรบปรงและเสรมกลนรสของผลตภณฑอาหารประเภทเนอสตว เนองจากองคประกอบทางเคมของ HVPคลายคลงกบสารประกอบทเกดขนระหวางการหงตมเนอ (Olsman, 1979) กระบวนการผลต HVP นยมใชกรดทมความเขมขนและอณหภมสง อยางไรกตามวธการนไดผลตภณฑทเปนผลพลอยไดท

สำนกหอ


2

เกดจากกระบวนการผลต (by product) คอ 3-monochloro-propanediols (3-MCPD) ซงจดเปนสารพษในกลมของ chlorohydrins ทกอใหเกดมะเรงในรางกายได (Sahasakmontri, 2001) 2. วตถประสงคของงานวจย

2.1 เพอศกษาสภาวะทเหมาะสมในการผลต HVP โดยใชเอนไซม 2.2 เพอทดลองนา HVP จากโปรตนสกดจากถวเหลองใชเปนสารตงตนในการผลตสาร

ปรงแตงกลนรส 2.3 เพอผลตสารปรงแตงกลนรสไกจากกระบวนการใชความรอน (thermal process flavor)

และศกษาถงชนดของสารหอมระเหยทได (volatile compounds) เปรยบเทยบกบกลนรสทางการคา

3. สมมตฐานของงานวจย 3.1 อณหภม pH กจกรรมของเอนไซมและเวลาในการยอยโปรตนสกดจากถวเหลองมผล

ตอรอยละการยอยสลาย (degree of hydrolysis, DH) และรอยละของผลผลต (% yield) 3.2 กลนรสทผลตจากโปรตนถวเหลองสกดทผานการยอยดวยเอนไซมเปนสารตงตนม

คณสมบตใกลเคยงกบกลนรสทางการคา

4. ขอบเขตของงานวจย 4.1 ศกษาสภาวะทใชในการผลต HVP จากโปรตนสกดจากถวเหลองซงไดแก อณหภม pH

กจกรรมของเอนไซม และเวลา 4.2 ศกษาองคประกอบของสารใหกลนรสทผลตไดเปรยบเทยบกบกลนรสทางการคา

สำนกหอ


3

บทท 2 เอกสารและงานวจยทเกยวของ

Hydrolyzed vegetable protein (HVP) หรอ hydrolyzed plant protein (HPP) เปนผลตภณฑ

ทประกอบดวยกรดอะมโน เปปไทด และสารประกอบอนๆ เชน เกลอ ซงไดจากปฏกรยาการยอยสลายโปรตนจากพช

HVP เปนวตถดบในอาหารทวไป มกนยมใชเปนสารเพมกลนรส และพบเปนองคประกอบอยในผลตภณฑนาซปเนอ น าสลด เครองปรงรส ผลตภณฑอาหารแชเยอกแขง สวนผสมนาเกรว สลดเตรยมสาเรจ อาหารสาเรจรปพรอมรบประทาน (ready to eat ) สวนผสมของซอสและนาหมก สวนผสมของขนมขบเคยว โดยมรายการทงหมด 117 ผลตภณฑ ท FDA ไดบนทกไว โดยมกจะประกอบไปดวยผงชรส (monosodium glutamate, MSG) ซงปรมาณของผงชรสใน HVP นขนอยกบชนดโปรตนทใชและกระบวนการยอย นอกจากน HVP สามารถนามาใชในผลตภณฑอาหารไดโดยตรง เปนสวนประกอบทสาคญในการทาใหเกดกลนรสทดในอาหารแปรรปตางๆหลายชนดทงอาหารคาวและหวาน (savory and sweet flavoring) ทงในรปซปกอน ซอส ผลตภณฑเนอสตว และผลตภณฑนมและกาแฟ (Kaempfen, 1995) หรอใชเปนสวนประกอบหลกของสารแตงกลนรสหลายชนด ใชเปนแหลงโปรตนในผลตภณฑจากเนอสตว โดยเตมลงในแปงหรอทาเปนรปแคปซลเพอเพมปรมาณโปรตนใหแกคนทมอาการขาดโปรตน (ณฏฐา และคณะ, 2548)

ในปจจบนการยอยสลายโปรตนโดยการใชเอนไซมโปรตเอสจากแหลงตางๆกาลงไดรบความสนใจมาก เนองจากเปนวธทมประสทธภาพมากทสด การยอยสลายโปรตนดวยเอนไซม โปรตเอสจะใหโปรตนทมเปปไทดขนาดเลกและกรดอะมโนอสระในปรมาณสงสด เนองจากเอนไซมมความจาเพาะตอสารตงตนและ pH ทใชผลตโปรตนไฮโดรไลเซทจงสามารถเลอกใชชนดของเอนไซมและภาวะการยอยสลายไดตามความเหมาะสมเพอใหไดโปรตนไฮโดรไลเซททมคณภาพและคณสมบตเชงหนาทตามตองการ (Trakanchaiwong, 2002) โดยผลตภณฑทไดเรยกวา enzymatic hydrolyzed vegetable protein (e-HVP) ซงมคณสมบตเสรมกลนและรสชาตเชนเดยวกบ HVP ทผลตไดจากกระบวนการผลตทใชกรด แตมขอดคอมปรมาณเกลอและสาร 3-MCPD ซงเปนสารกอมะเรงในปรมาณตา ทาใหสามารถนาไปประยกตใชกบอาหารมงสวรตและอาหารเพอ

สำนกหอ


4

สขภาพ โดยเฉพาะสาหรบผทปวยเปนโรคหวใจ เบาหวาน และความดนโลหตสง (Cigic และ Zelenik-Blatnik, 2004) 1. การผลตโปรตนไฮโดรไลเซทดวยกรด

ภาพท 1 กระบวนการผลต HVP ดวยกรดในระดบอตสาหกรรม ทมา : Manley และ Fagerson (1971)

กระบวนการผลต HVP ในระดบอตสาหกรรมแสดงดงภาพท 1 โดยนาโปรตนจากพชมาทาปฏกรยาการยอยสลายดวยกรดทอณหภม 100–125 องศาเซลเซยส ภายใตความดนปกตหรอ ความดนสง เวลาทใชขนอยกบชนดของโปรตนและความดน หลงจากปฏกรยาเสรจสนลงนาของผสมทไดไปทาใหเยน แลวจงเตมโซเดยมไฮดรอกไซดลงไปเพอปรบใหม pH 5–6 (ขนอยกบชนดของโปรตนและกลนรสทตองการ) นาของผสมทไดเขาเครองกรองเพอกาจดสาร humin ซงเปน โพลเมอรของกรดอะมโนและคารโบไฮเดรททเกดขนในระหวางการยอยสลายและขนตอนการปรบ pH โดยทรปโตเฟนไทโรซน ซสทน ฟนลอะลานน เมทไธโอนน และอารจนน เปนกรด อะมโนทมสวนสาคญในการเกดสาร humin หลงจากนนนาของผสมทไดมาทาใหเขมขนมากขน จะทาใหเกลอ และกรดอะมโนทไมละลายตกตะกอนออกมา นาเขาเครองกรองอกครงแลวนาสวนใสทไดไปรวมกบสารใหกลนรสอนๆ หลงจากนนผานเขาขนตอนการทาแหง HVP ทมจาหนายทวไป

5

สวนมากจะอยในรปผง นอกจากนอาจจะผลตในรปของเหลว หรอกงแขงกงเหลว (ของแขงทงหมดรอยละ 82–89) ทงนขนอยกบความตองการของตลาด (Manley และ Fagerson, 1971)

ขอไดเปรยบของการผลต HVP ดวยกรด คอ ตนทนในการผลตตา ระยะเวลาในการผลตสน ไดกลนรสทดและเขมขน แตมขอดอยคอ มปรมาณเกลอสงประมาณรอยละ 40 (Aaslyng และคณะ, 1998) และเกดสาร 3-monochloropropanediols (3-MCPD) ซงจดเปนสารพษทอาจกอใหเกดมะเรงในรางกาย

2. สาร 3-MCPD

3-MCPD มชอเตมวา 3-monochloropropane-1,2diol หรอ 3-chloro-1,2-propanediol เปนสารปนเปอนในกลมคลอโรโพรพานอล (chloropropanol) จากการวจยพบวาสารชนดนไมคงตวในสภาวะทเปนกลางหรอดาง นอกจากนยงกอใหเกดมะเรงในหนทดลองทไดรบสารนในปรมาณมากและตดตอกนเปนเวลานาน โดยพบวาถาใหกบหนในปรมาณ 0.5 มลกรมตอนาหนกตว 1 กโลกรม จะทาใหสเปรมผดปกตและเปนหมนไดรอยละ 2.5 จงจดสารนเปนสารกอมะเรง (genotoxic carcinogen) (สานกงานคณะกรรมการอาหารและยา, 2544) สานกงานมาตรฐานอาหารขององกฤษตรวจพบสาร 3-MCPD ในซอสปรงรส โดยสาร 3-MCPD เปนผลพลอยไดในกระบวนการผลตโปรตนไฮโดรไลเซทแบบวธการดงเดม โดยการใชเมลดพชทมโปรตนสงทผานการสกดนามนออกแลวเปนวตถดบ (defatted vegetable protein) ยอยสลายโปรตนดวยกรดเกลอเขมขน โดยใชอณหภมมากกวา 100 องศาเซลเซยส ภายใตความดนสง ซงเปนวธทใชกนโดยทวไปและตนทนไมสงนก (คงศกด, 2544) ทาใหเกดสารกลมคลอโรโพรพานอล (chloropropanols) หลายชนด เชน 3-MCPD, 3-chloro-1,2-dihydroxypropane (achloro hydrine),2-MCPD (2-chloro-1,3propanediol), 1,3-DCP (1,3-dichloro-2-propanol หรอ 2-dichlorohydrine) แตสารพษทพบในซอสถวเหลองสวนใหญ คอ 3-MCPD และ 1,3-DCP ดงนนสานกงานคณะกรรมการอาหารและยารวมกบกรมวทยาศาสตรการแพทย ผประกอบการ และนกวชาการทเกยวของ จงทาการศกษาและพฒนากรรมวธผลต เพอลดปรมาณหรอปองกนการเกดสารปนเปอนในซอสปรงรส เพอความปลอดภยของผบรโภคและลดปญหาดานการสงออก โดยการหมกดวยจลนทรยหรอเตมเอนไซมโปรตเอสเพอยอยสลายโปรตนในวตถดบ แลวนาไปใชประโยชนในดานตางๆโดยเฉพาะจากสารปรงแตงกลนรส (สานกงานคณะกรรมการอาหารและยา, 2544)

Jantawat และคณะ (1998) ไดรายงานวากรดไฮโดรคลอรกทใชในสดสวนทตา จะทาใหโปรตนถกยอยสลายเปนกรดอะมโนอสระ และเกดการสะสมของกรดอะมโน แตทวาการใชกรดไฮโดรคลอรกในสดสวนทมากขนจะทาใหกรดอะมโนบางสวนถกดงหมอะมโนจากโมเลกลออก

6

(deamination) และเปนผลใหเกดการลดลงของระดบอะมโนไนโตรเจนทงหมด เชนเดยวกบสดสวน อะมโนไนโตรเจนกบไนโตรเจนทงหมด ซงสงผลใหไดรบคะแนนดานกลนของตวอยางทตากวา ดงนนการทาเกดการทาลายโครงสรางของกรดอะมโนทนอยกวา จะทาใหไดกลนรสทดกวา และนอกจากนแอมโมเนยซงเปนผลตภณฑสดทายจากการทาลายโครงสรางกรดอะมโน จะทาใหเกดกลนคณภาพตาลง ในขณะเดยวกนการใชอณหภมทสงรวมกบการยอยดวยกรดจะทาใหเกดการทาลายโครงสรางของกรดอะมโนดวย

มการปรบปรงกระบวนการผลตเพอลดการปนเปอนของสารดงกลาว โดยมหลายแนวทางคอ

- การยอยสลายโปรตนโดยใชดางรวมในกระบวนการผลต - การใชวตถดบทมไขมนนอย เชน การใชแปงถวเหลองทมการสกดไขมนออกแลว - การปรบลดปรมาณกรด อณหภมและเวลาทใชในกระบวนการผลต - ปรบเปลยนวธการผลตโดยใชเอนไซมแทนกรดเกลอ

3. การผลตโปรตนไฮโดรไลเซทดวยเอนไซม

กระบวนการยอยสลายดวยเอนไซมเปนเทคนคทใชสภาวะการยอยทออนกวากรด โดยการปรบ pH ใหอยในชวง 5-7 ขนอยกบสภาวะทเหมาะสมตอเอนไซมทจะแตกพนธะเปปไทดของแหลงโปรตน ดวยการใชเอนไซมโปรตเอสทมขายทางการคา เชน Flavourzyme, Alcalase, Trypsin, Bromelain นอกจากนการยอยดวยเอนไซมไมไดมขอดเพยงการลดการผลตสารกอมะเรงใหนอยลงเมอเทยบกบวธการทใชสารเคม แตยงใหความจาเพาะตอการเกดปฏกรยาและเกดการกาจดหม อะมโนไดในสภาวะทตาลง ดวย pH ทเปนกลางและทอณหภมหอง (Sonklin และคณะ, 2011)

หลกการสาคญของการยอยสลายโปรตน คอ เพอใหไดโปรตนทมคณสมบตหนาทเหมาะสมตอการนาไปใชในผลตภณฑอาหารทงคณภาพดานเนอสมผส ความคงตว และกลนรส ดงนนจงตองเลอกชนดของเอนไซม สภาวะในการยอยสลาย ไดแก pH อณหภม เวลา ความเขมขนของสารตงตนและเอนไซม เปนตน

เอนไซมเปนกลมโปรตนททาหนาทพเศษแตกตางจากโปรตนและชวโมเลกลขนาดใหญชนดอนๆ กลาวคอ มความสามารถเรงปฏกรยาในสงมชวตไดอยางมประสทธภาพสงกวาตวเรงสงเคราะหหลายลานเทา ดวยปรมาณเอนไซมระดบไมโครโมลาร นอกจากนเอนไซมสามารถเรงปฏกรยาไดภายใตสภาวะไมรนแรง ซงเหมาะสมอยางยงกบภาวะภายในเซลลและเนอเยอของสงมชวตโดยทวไป เอนไซมมความจาเพาะตอสบสเตรท โดยเอนไซมชนดทเปน

7

เอนโดเปปตเดส (endopeptidase) จะยอยสลายพนธะเปปไทดจากดานใน สวนเอกโซเปปตเดส (exopeptidase) ยอยสลายพนธะเปปไทดจากปลายดานนอก (Adler-Nissen, 1986) และสามารถเรงปฏกรยาโดยไมทาใหเกดผลตภณฑอน ตลอดทงเอนไซมจะเพมอตราเรวของปฏกรยาโดยลดพลงงานกระตน (activation energy) ของปฏกรยา (ปราณ, 2543)

การยอยสลายโปรตนจากพชดวยเอนไซม เอนไซมทนามาใชในการยอยสลายคอ โปรตเอส ซงมชอทางการคาไดแก Flavourzyme, Alcalase, Novozymes, Cucurbita, Pomiferin, Hieronymin, Trypsin, Papain และ Bromelain (Kong และคณะ, 2008) ซงมขอดคอไมกอใหเกดสารกอมะเรงและใหสารใหกลนรสทหลากหลาย แตพบวามขอเสยคอโปรตนไฮโดรไลเซททไดอาจมรสขมไมเปนทยอมรบของผบรโภค (สปราณ, 2539) โดยเมอทาการยอยสลายแลวจะไดกรดอะมโนอสระหรอเปปไทดสายสนจานวนมาก ซงในปฏกรยาเมลลารด กรดอะมโนและเปปไทดจะกอใหเกดสารใหกลนรส ซงกระบวนการผลต HVP ดวยเอนไซมแสดงดงภาพท 2

water+vegetable protein+enzyme

hydrolysis with stirring system optimum pH, temperature

enzyme inactivation

neutralization

centrifuge

insoluble fraction soluble fraction

spray drying

protein hydrolysate

ภาพท 2 กระบวนการผลต HVP ดวยเอนไซม

ทมา : Yu และ Tan (1990)

8

เอนไซมโปรตเอสจดแบงกลมตามลกษณะการยอยสลายพนธะเปปไทดซงสามารถแบงออกไดเปน 2 กลมใหญๆ คอ การยอยสลายพนธะเปปไทดจากปลายสายโพลเปปไทดและการยอยสลายพนธะเปปไทดอยางอสระภายในสายของโพลเปปไทด (Antonov, 1993)

1. เอกโซเปปตเดส (exopeptidase)

มหนาทในการสลายพนธะเปปไทดจากปลายของเสนเปปไทด ดงภาพท 3 ทาใหได เปปไทดเปนแบบ Hydrophilic จงไมกอใหเกดรสขม

ภาพท 3 การตดพนธะเปปไทดดวยเอนไซมเอกโซเปปตเดส ทมา : ปราณ (2543) เอกโซเปปตเดสสามารถแบงออกเปน 2 ประเภทคอ

1.1 Aminopeptidases เปนเอนไซมทสลายพนธะเปปไทดจากปลายดาน N-terminal (-NH3) ของสายเปปไทดและไดผลตภณฑเปนกรดอะมโนอสระไดเปปไทดหรอไตรเปปไทด โดยทวไป aminopeptidases เปนเอนไซมจาพวก intracellular enzymes พบไดอยางกวางขวางทงแบคทเรยและราเชน Aspergillus oryzae, Escherichia coli, Bacillus licheniformis (Watson, 1979)

1.2 Carboxypeptidases เปนเอนไซมทสลายพนธะเปปไทดจากปลายดาน C-terminal (-COOH) ของสายเปปไทดและไดผลตภณฑเปนกรดอะมโนอสระหรอไดเปปไทด carboxypeptidases แบงออกเปน 3 กลม ขนอยกบหมอะมโนทอยในบรเวณเรงของเอนไซม (active site) ไดแก serine carboxypeptidases, metallocarboxypeptidases และ cysteine carboxypeptidase 2. เอนโดเปปตเดส (endopeptidase)

เปนเอนไซมทยอยสลายพนธะเปปไทดทอยดานในของสายโพลเปปไทดหรอโปรตน ซงแบงออกเปน 4 กลมใหญ โดยอาศยความแตกตางของสภาวะในการเรงปฏกรยาของเอนไซม ไดแก

ตดบรเวณปลายสาย

สาย

9

2.1 Serine protease เปนเอนไซมทมหมของกรดอะมโน serine อยทบรเวณเรงของเอนไซม (active site) ถกยบย งดวยสาร diisoproplfulorophoshate (DFP), phenylmethylsulfonly fluoride (PMSF), 3,4-dichloroisocoumarin (3,4-DCI) และ tosyl-L-lysine chloromethyl ketone (TLCK) ชวง pH ทเหมาะสมตอการเรงปฏกรยาของเอนไซมอยระหวาง 7-11 มวลโมเลกลอยระหวาง 18-35 กโลดาลตน serine protease แบงออกเปน 2 พวก คอ serine alkaline protease และ subtilisin

2.2 Aspartic protease หรอ acidic protease เปนเอนไซมทมคารบอกซลของกรดอะมโน aspartic acid หรอ glutamic acid อยทบรเวณเรงของเอนไซม ถกยบย งการทางานโดย pepstatainและ diazoketone เชน diazoacetyl-DL-norleucine methyl ester (DAN) และ 1,2-epoxy-3-(p-nitrophenoxy) propane (EPNP) ชวง pH ทเหมาะสมตอการเรงปฏกรยาของเอนไซมอยในชวง 3-4 มมวลโมเลกลอยระหวาง 30-45 กโลดาลตน เกดปฏกรยาจาเพาะไดดกบกรดอะมโนทมโครงสรางเปน aromatic amino acid เอนไซมทอยในกลมน ไดแก เรนนนและเปปซน จลนทรยทผลตเอนไซมน ไดแกราสกล Aspergillus spp., Penicillium spp., Rhizopus spp., Neurospota spp., Endothia spp. และ Mucor spp.

2.3 Cysteine protease หรอ thiol protease เปนเอนไซมททางานไดดในชวง pH ทเปนกลาง คอ 5-8 ถกเรงปฏกรยาเมอมสารรดวซ ไดแก HCN หรอ cysteine และถกยบย งปฏกรยาดวยสารพวก sulfhydryl เชน p-chlormercuribenzoate (PCMB) มมวลโมเลกลอยระหวาง 30-50 กโลดาลตน เอนไซมทอยในกลมนเปนเอนไซมทไดจากพชชนสง เชน ปาเปนจากยางมะละกอและโบรมเลนจากสบปะรด และจากจลนทรยบางชนด เชน Clostridium histolyticum และ Streptococcus spp.

2.4 Metalloprotease เปนเอนไซมทมอะตอมของโลหะ (divalent metal ion) อยในโครงสรางซงมกเปนพวกสงกะส เรงปฏกรยาไดดกบพนธะเปปไทดตรงตาแหนงทกรดอะมโน lysine สารทยบย งปฏกรยาไดแก สารพวก chelating agent เชน EDTA มความเสถยรในชวง pH 5-9 เปนจลนทรยทผลตเอนไซมน ไดแก แบคทเรยสกล Bacillus spp., Pseudomonas spp. และ Clostridium spp. เปนตน เมอใชเอนไซมยอยสลายโปรตน จะพบวาผลผลตทไดเปนเปปไทดสายสนๆ และกรด อะมโนอสระรวมทงกลมของสารประกอบคารโบไฮเดรท ฟอสเฟต และกรดนวคลอก เปนตน (Whitaker, 1994) เอนไซมทใชผลตโปรตนไฮโดรไลเซทมหลายชนด ซงแตละชนดจะมคณสมบตเฉพาะแตกตางกน ดงตวอยาง

Chuan และคณะ (2009) พบวาหากใชเอนไซมตางชนดกนจะสงผลตอปรมาณเปปไทดทผลตได โดยทดสอบจากการนาเอนไซมชนดตางๆมาทาการยอยสลายโปรตนจากปานเพอผลตโปรตนไอโซเลท (Hemp protein isolate : HPI) ดงแสดงดงภาพท 4 ซงพบวารอยละการยอยสลาย

10

จะสงมากใน 2 ชวโมงแรกหลงจากนนจะเรมมรอยละการยอยสลายลดลง โดยพบวาเอนไซม Alcalase และ Pepsin ปรมาณเปปไทดเพมขนอยางรวดเรวใน 2 ชวโมงแรก และตามมาดวยเอนไซม Protamex และ Neutrase และเอนไซม Flavourzyme และ Trypsin จะเพมขนชาทสด และเมอเวลาในการยอยสลายผานไป 2-4 ชวโมงพบวารอยละการยอยสลายจะลดลง อกทงการใชเอนไซมแตละชนดจะทาใหรสชาตของโปรตนไฮโดรไลเซททผลตไดมรสชาตแตกตางกน

ดงการศกษาของ Guowan และคณะ (2011) พบวาเมอนาเอนไซม 4 ชนดไดแก crude protease extract (CPE) เปนเอนไซมทผลตไดจาก Aspergillus oryzae HN 3.042, Alcalase, Protemax และ Papain มาทาการยอยสลายโปรตนจากกากถวลสงพบวาเมอทาการทดสอบทางประสาทสมผสพบวา CPE มประสทธภาพในการยอยมากทสดเนองจากผลการทดสอบทางประสาทสมผสใหรสอมาม รสเคม และ full-bodied มากทสดเนองมาจาก CPE มอะมโนกลมกรด กลตามก ซงเปนตวชวยเรองการ enhance flavor อกทงใหรสขมตากวา Papain และ Alcalase และพบวาเอนไซมทใหรสขมนอยทสดคอ Protamax แตใหรสอมาม รสเคม และ full-bodied ตาทสด ดงภาพท 5

ภาพท 4 แสดงรอยละของปรมาณเปปไทดทไดเปรยบเทยบกบเวลาทใชในการยอยสลายโดยใช

เอนไซมโปรตเอสตาง ๆ (Alcalase, Flavourzyme, Pepsin, Neutrase, Protamex และ Trypsin)

ทมา : Chuan และคณะ (2009)

Hydrolysis Time (min)

Yield

of so

luble

pept

ide (%

)

11

ภาพท 5 ผลการทดสอบทางประสาทสมผสจากการยอยโปรตนจากกากถวลสงดวยเอนไซม

โปรตเอสแตละชนด ทมา : Guowan และคณะ (2011) 4. ปจจยทสงผลตอการผลตสารใหกลนรสจากการยอยสลายโปรตนจากพช

ในการเกดกลนรสเนอของผลตภณฑเนอสตวนน ปฏกรยาทเกยวของกบการเกดสาร ประกอบทใหกลนรสสามารถแบงไดเปน 3 ปฏกรยาหลกๆ ไดแก

- ปฏกรยาการแตกสลาย (degradation) ของวตามน โดยเฉพาะไทอามน - การแตกสลายดวยความรอน (thermal degradation) ของคารโบไฮเดรทและเอมน - การเกดปฏกรยาเมลลารด (maillard reaction) ในการผลต HVP จากการใชเอนไซมรวมในการผลตนน จะมปจจยทหลากหลายสงผลตอ

HVP ทจะไดรบเปนผลตภณฑและสาหรบการนาไปใชตอ โดยจะกลาวถงปจจยทนาสนใจทสงผลตอ HVP ทไดจากกระบวนการผลตดวยเอนไซม อาทเชน

1.อณหภม (temperature) โดยพบวาเมอทาการเพมอณหภมขนจะทาใหปรมาณกรดอะมโนอสระเพมมากขน และท

อณหภม 130 องศาเซลเซยส ปรมาณกรดอะมโนอสระเพมขนจากในตอนเรมการยอยสลายรอยละ 26.34 ซงสอดคลองกบการศกษาของ Patel และ Borchardt (1990) ทกลาววาเมอเพมอณหภมขนทาใหปรมาณเปปไทดเพมขน แตในปฏกรยาเมลลารด พบวาปรมาณกรดอะมโนอสระลดลงอยางมนยสาคญทางสถตเมอเพมอณหภมขนอาจเนองจากเกดปฏสมพนธระหวางกรดอะมโนกบนาตาล ดงภาพท 6

Xingfeng และคณะ (2010) พบวาเมอทาการเพมอณหภมทาใหปรมาณของสารประกอบทระเหยไดเพมมากขนท pH เทากบ 4, 6 และ 8 เมออณหภมตากวา 140 องศาเซลเซยสอตราการ

12

เพมขนของสารประกอบทระเหยไดท pH 4, 6 และ 8 ไมแตกตางกนแตหากอณหภมสงเกน 140 องศาเซลเซยส ปรมาณสารประกอบทระเหยไดท pH เทากบ 4 จะเพมขนอยางรวดเรว ดงภาพท 7

ภาพท 6 ปรมาณกรดอะมโนอสระเปรยบเทยบกบอณหภม ทมา : Xiaohong และคณะ (2010)

ภาพท 7 ผลของอณหภมทเพมขนเปรยบเทยบกบปรมาณสารประกอบทระเหยได ทมา : Xingfeng และคณะ (2010)

โปรตนไฮโดรไลเซทจากเอนไซมเมออณหภมเพมขนเรอยๆ จะชวยเพมพลงงานจลน

ใหกบระบบทาใหสารทถกกระตนมพลงงานสงปฏกรยาเกดขนอยางรวดเรว แตการเพมอณหภมนน

13

มขดจากด กลาวคอถาอณหภมสงมาก จะสงผลใหเอนไซมเกดการเสยสภาพธรรมชาตทาใหโครงรปสามมตเกดการหกงอ และหยดปฏกรยาของเอนไซมในทสด (พชรา, 2543)

Cigic และ Zelenik-Blatnik (2004) รายงานวาอณหภมมอทธพลตอรอยละการยอยสลายอณหภมทเพมขนมผลทาใหการเรงของปฏกรยาโดยเอนไซมเพมขน แตอณหภมทเพมสงมากเกนไปอาจมผลใหเกดการสญเสยธรรมชาตของเอนไซม

2. คาความเปนกรดดาง (pH) pH มผลตอคารอยละการยอยสลายของโปรตนไฮโดรไลเซท เนองจากเอนไซมจดเปน

โปรตนชนดหนงดงนนเมอคา pH สงหรอตาเกนไปทาใหโครงสรางของเอนไซมถกทาลายและสญเสยกจกรรมของเอนไซมได โดยเอนไซมแตละชนดมคา pH ทเหมาะสมในการทางานแตกตางกน (Eskin และHenderson, 1971)

Xingfeng และคณะ (2010) ไดทาการเปรยบเทยบปรมาณสารประกอบทระเหยไดทอณหภมตา (100 และ 120 องศาเซลเซยส) พบวาท pH 8 มปรมาณสารประกอบทระเหยไดมากกวาท pH 4 และ pH 6 แตในทางกลบกนเมออณหภมเพมขน (160 และ 180 องศาเซลเซยส) ท pH 4 มปรมาณสารประกอบทระเหยไดมากกวาท pH 6 และ pH 8 ดงภาพท 8

ภาพท 8 ผลของ pH ตอปรมาณสารประกอบทระเหยได ทมา : Xingfeng และคณะ (2010)

14

Meynier และ Mottram (1995) ไดศกษาถงความสมพนธระหวางคา pH กบปรมาณสารประกอบทระเหยไดจากปฏกรยาเมลลารด พบวาคา pH สงผลกระทบตอกลนและสารประกอบทระเหยไดจากธรรมชาตทงหมด

3.ระยะเวลา (time) เมอระยะเวลาในการยอยสลายเพมขน ปรมาณของอะมโนไนโตรเจนทถกยอยสลายจะ

เพมขนดวยนนคอ โปรตนจะถกยอยมากขน ไดเปนกรดอะมโนและไดเปปไทด โดยไดเปปไทดบางชนดมความคงตว จงไมถกยอยสลายตอไป ซงกรดอะมโนและไดเปปไทดเหลานเปนองคประกอบสาคญตอการใหกลนรสของโปรตนไฮโดรไลเซท ทาใหโปรตนไฮโดรไลเซททไดมกลนรสทด ทงนหากในวตถดบมปรมาณของโปรตนสงระยะเวลาทใชยอยควรนานขน เนองจากระยะเวลาในการยอยสลายนนขนอยกบปรมาณโปรตนในวตถดบทใชยอยสลาย (Manley และ Fagerson, 1971) Chanikan และคณะ (2011) ทาการยอยสลายถวเขยวดวยเอนไซมโบรมเลนพบวาเมอเพมระยะเวลาในการยอยสลายและเพมความเขมขนของเอนไซมขนพบวา รอยละของผลผลตและ รอยละการยอยสลายกจะเพมขน ดงภาพท 9

ไพลน (2548) พบวาเมอใชปรมาณของเอนไซม Flavourzyme® รอยละ 24 ยอยสลายเปนเวลา 12 ชวโมง มรอยละการยอยสลายและเกลอสงสด คอ รอยละ 1.70 และ 4.80 ตามลาดบ นอกจากนปรมาณของเอนไซม Flavourzyme® รอยละ 1 ยอยสลายเปนเวลา 6 ชวโมง มรอยละการยอยสลายและปรมาณเกลอตาสด รอยละ 0.53 และ 1.40 ตามลาดบ เนองจากเมอปรมาณของเอนไซมเพมขนโอกาสทเอนไซมจะจบกบโมเลกลของโปรตนยอมมมากขน จงเกดการยอยสลายเพมมากขน เปนผลใหรอยละการยอยสลายเพมสงขน แตเมอเพมปรมาณเอนไซมมากขนจนกระทงปรมาณของเอนไซมทใชเพยงพอกบปรมาณของโปรตนทมอยรอยละการยอยสลายจะคงท

15

ภาพท 9 ผลความเขมขนของเอนไซมและเวลาในการยอยสลายทสงผลตอรอยละการยอยสลายของ

โปรตนไฮโดรเลเซทจากกากถวเขยวดวยเอนไซม (a) รอยละของผลผลต (b) รอยละการยอยสลาย

ทมา : Chanikan และคณะ (2011) แตในงานวจยของ Roach และ Gehrke (1970) พบวาการใชเอนไซม Flavourzyme® ความ

เขมขนรอยละ 5 ยอยสลายนาน 6 ชวโมง เปนสภาวะเหมาะสมในการยอยสลายสารละลายกาก

16

ถวเขยวจะเหนไดวาในการยอยสลายกากถวเขยวใชปรมาณเอนไซมสง คาดวาเนองจากเอนไซม Flavourzyme® ทใชในงานวจยนมกจกรรมจาเพาะตา (500 LAPU/g) อกทงในกากถวเขยวมองคประกอบอนนอกเหนอจากโปรตน โดยเฉพาะไขมนอาจขดขวางการยอยสลายโปรตน โดยเกดการสรางพนธะกบโมเลกลของโปรตน ทาใหการเขาจบของเอนไซมกบสายเปปไทดของโปรตนเกดไดยาก เปนผลมาจาก sterichindrance ของ bulky side chain ในโมเลกลของโปรตนมผลทาใหมคารอยละการยอยสลายตา

4.เอนไซม (enzyme) และความเขมขนความเอนไซม ความแตกตางในความจาเพาะระหวางเอนไซมโปรตเอสแตละชนดนนเปนสงสาคญอยาง

ยงทจะตองนามาพจารณา เพอเปนแนวทางในคดเลอกชนดของเอนไซมทจะใช ขนอยกบชนดของแหลงโปรตนทจะนามาใชหรอผลตภณฑทคาดหวงวาจะได ซงโปรตนสายเดยวกนนนอาจผลตโปรตนไฮโดรไลเซทไดแตกตางกนจากการใชเอนไซมตางชนดกน (Tavano, 2013)

จากรายงานของ Aaslyng และคณะ (1998) กลาววาการใชเอนไซมผสมเชน Flavourzyme และ Alchalase จะสามารถลดความขมใน HVP ไดมากกวา HVP จากการยอยดวยกรด เนองจากมปรมาณเปปไทดทยดเกาะกบลวซนนอยกวา และรอยละการยอยสลาย (%degree of hydrolrsis, DH) ของการยอยดวยเอนไซมแบบผสมทประกอบไปดวยเอนโดเปปตเดส (endopeptidase) และ เอกโซเปปตเดส (exopeptidase) จะมคาสงกวาเมอเทยบกบการใชเอกโซเปปตเดสเพยงอยางเดยว แตกยงคงตากวาการยอยดวยกรด เชนเดยวกบปรมาณกรดอะมโนอสระเมอเทยบเปนรอยละของโปรตนทพบในการยอยเอนไซมจะนอยกวาการยอยดวยกรด ในขณะทขนาดเปปไทดและมวลโมเลกลของเปปไทดในการยอยดวยเอนไซมสงกวาการยอยดวยกรด

โดย Sonklin และคณะ (2011) ไดทาการศกษาการยอยโปรตนถวเขยวดวยเอนไซม โบรมเลน(bromelain) ซงเปนเอนโดเปปตเดส พบวาความเขมขนของสารทจะไดรบขนอยกบคารอยละการยอยสลายและความจาเพาะของเอนไซมโปรตเอส นอกจากนการเพมของคารอยละ การยอยสลาย และกรดอะมโนประเภทไฮโดรโฟรบกทมากขน สามารถกอใหเกดการรวมตวภายในสายเปปไทด สงผลใหมความขมเพมมากขน เนองจากกรดอะมโนประเภทไฮโดรโฟรบกเปนตวแทนสาหรบความขม จะถกปลดปลอยโดยเอนโดเปปตเดส โดยการใชเอนไซมโบรมเลนจะทาใหเกดกรดอะมโนประเภทไฮโดรโฟรบกสงกวาไฮโดรฟลก โดยพบวาความเขมขนของเอนไซมทเพมสงขน ทาใหมโอกาสทเอนไซมจะจบกบโมเลกลของโปรตนมากขนเปนผลใหคารอยละการยอยสลายเพมขน แตเมอเพมปรมาณเอนไซมมากขนจนกระทงปรมาณเอนไซมทใชเพยงพอกบปรมาณโปรตนทมอย คารอยละการยอยสลายจะคงท แมเพมปรมาณเอนไซมมากขนอกกไมทาใหคารอยละการยอยสลายเพมขน

17

Xingfeng และคณะ (2010) ทาการยอยสลาย Brassica sp. ดวยเอนไซม Neutral Protease เปนระยะเวลา 1, 2, 3, 4, 5 และ 6 ชวโมง และวางแผนการทดลองโดยใช Response surface methodology (RSM) พบวารอยละการยอยสลายท 5.15, 11.5, 13.0, 16.4, 21.5 และ 26.8 โดยพบวาปรมาณของสารหอมระเหยกลนรสเนอเพมมากขนหากเพมอตราการยอยสลาย

Tarky และคณะ (1973) รายงานวา กลไกการยอยสลายโปรตนดวยเอนไซมนนเรมจากการทเอนไซมแขงขนกนดดซบทบรเวณผวของสารตงตนแลวเขาไปทาใหพนธะเพปไทดของโปรตนเกดการแตกตวและปลดปลอยกรดอะมโนหรอเพปไทดทละลายไดสสารละลาย ดงนนเมอความเขมขนของเอนไซมมากขนจะทาใหโปรตนถกยอยสลายมากขน ปรมาณโปรตนของโปรตนไฮโดรไลเซททผลตไดจงมคามากขน 5. สารประกอบทไดจากการยอยสลายโปรตนจากพชดวยเอนไซม

Hydrolyzed Vegetable Protein (HVP) พฒนาขนโดย Julius Maggi นกเคมชาวสวสซงการผลต HVP จะตองเลอกวตถดบตงตนและสภาวะการผลตทเหมาะสม ถงแมวาปฏกรยาเมลลารดจะเปนเสนทางหลกในการทาใหเกดกลนรส แตเสนทางหลกของปฏกรยาทางเคมกมสวนสาคญเชนกน สารใหกลนรสทสาคญซงทาใหเกดกลนรส meat-like, cooked และ roasted flavors ไดแก heterocyclic compounds (ตารางท 1) สารเหลานผลตโดยวธการสงเคราะหและผานการรบรองความปลอดภยและจดอยใน GRAS (Generally Recognized As Safe) status โดย ผเชยวชาญจาก FEMA’s (Flavor and Extract Manufacturer’s Association) หรอ FDA (Food and Drug Administration)

สารประกอบทใหกลนรสในเนอสตวและ HVP เกดจากการทาปฏกรยาของสารเรมตนในการใหกลนรส (flavor precursor) เปนสารประกอบทมนาหนกโมเลกลตาและละลายนาได สวนโปรตนทไมละลายนาและมนาหนกโมเลกลมากไมมบทบาทสาคญตอกลนหอมของเนอสตว (Manley และ Fagerson, 1971)

สารใหรสชาตอาหารทนยมใชสวนใหญนยมใชสารทใหรสชาตอาหารธรรมชาต ประเภทของสารทใชจดอยในกลมกรดอะมโนซงเปนองคประกอบของโปรตนนนเอง กรดอะมโนแตละตวจะมรสชาตเฉพาะแตกตางกนไป เชน อะลานน ไกลซน โปรลน และซลน เปนตวแทนของรสหวาน อารจนน ฟนลอะลานน ฮสทดน วาลนและทรปโตเฟนเปนตวแทนของรสขม กรดกลตามกและแอสปารตกเปนตวแทนของรสเปรยว

18

ตารางท 1 รสชาตของกรดอะมโนทมโครงสรางแบบ L-form กรดอะมโน สตรโครงสราง รสชาต

อารจนน

หอมหวาน

กรดแอสพาตก

หอมเปรยว

ซสเตอน

เคมเลกนอย

ลซน*

ขม

เมทไธโอนน*

หวานขม

ทรโอนน *

หวานเปรยวขม

ทรปโตเฟน

ขมเลกนอย

วาลน*

หวานขม

หมายเหต * เปนกรดอะมโนจาเปนทรางกายตองการ ทมา: Dzanic และคณะ (1985)

ปฏกรยาการเกดสารสนาตาล (browning reaction) เปนปฏกรยาหนงทเกยวของกบการเกด

กลนหอมคลายเนอสตว (meat like aroma) โดยกลนหอมของเนอหม เนอวว และเนอแกะ มความคลายกนเนองจากกรดอะมโนและคารโบไฮเดรททเปนองคประกอบในเนอสตวเหลานคลายกน อยางไรกตาม ในเนอสตวแตละชนดมสารประกอบทละลายในไขมน (fat soluble material) ตางกน ทาใหกลนหอมของเนอสตวแตละชนดแตกตางกน โดยสาร polypeptides และ hypoxanthine เปนสารประกอบทมบทบาทสาคญเกยวกบกลนหอมของเนอ (Manley และ Fagerson, 1971)

เมอนาสารตงตนในการเกดกลนเนอสตว ซงแบงไดเปนสองชนด คอ สวนทละลายนาได ไดแกกรดอะมโน เปปไทด คารโบไฮเดรท นวคลโอไทด และไทอามน เปนตน และสวนทละลายในไขมน โดยสวนใหญเกดปฏกรยาเมลลารดระหวางกรดอะมโนและนาตาลรดวซทาใหเกดเปนกลนรสเนอสตวขน โดยเฉพาะปฏกรยาของซสทอนและนาตาลทาใหเกดกลนเนอสตว โดยเฉพาะ

19

กลนไกและกลนหม กลมของสารตงตนในการเกดปฏกรยาเมลลารดของกลนรสเนอสตว เชน กรดอะมโน นาตาลรดวซ วตามน และสารประกอบซลเฟอร สารตงตนเหลานจะเกดปฏกรยาในสภาวะทมความรอนสง โดยทสารตงตนแตละชนดจะมกลนรสทเฉพาะตว เชนปฏกรยาระหวาง ซสทอนและนาตาลไรโบสใหกลนรสไก

กลนรสมความสมพนธกบองคประกอบทางเคมของวตถดบ ดงนนสารประกอบทาใหเกดกลนทไดแตกตางกน กลนรสของอาหารจากเนอสตวจะเกดขนในระหวางการประกอบอาหาร หรอหลงจากการไดรบความรอน โดยกลมของสารประกอบททาใหเกดกลนสวนใหญ ไดแก 1. สารประกอบทระเหยไมได (non-volatile compounds) สารประกอบทระเหยไมได ไดแก กรดอะมโน เปปไทด นาตาลรดวซ วตามน และ นวคลโอไทดบางชนด เปนตน โดยสารเหลานสามารถเกดปฏกรยา หรอการแตกสลายเกดเปนสารตวกลางหรอเกดเปนสารประกอบใหกลนรสเนอและปลดปลอยกลนในระหวางกระบวนการใหความรอน (Shahidi, 1994) กรดอะมโนแตละชนดจะมกลนรสตางกน (Dzanic และคณะ, 1985) ดงตารางท 1 บางชนดมรสหวาน แตบางชนดมรสขม โดยกรดอะมโนทจาเปน (essential amino acid) จะใหกลนรสดกวากรดอะมโนทไมจาเปน (non essential amino acid) ซงสวนใหญจะมรสขม กรดกลตามกเปนกรดทใหรสชาตทดซงจะอยในรปของเกลอโซเดยม ไดแก โมโนโซเดยมกลตาเมต รสชาตของเกลอโมโนโซเดยมกลตาเมตมชอเรยกในภาษาญปนวา อมาม (umami) มความหมายเชนเดยวกบคาวา tastiness (Boudreau, 1979) เกลอของกรดกลตามกสามารถเกดปฏกรยา cyclization ได pyrolidone carboxylic acid ซงเปนสารเพมกลนรสชนดหนง

สารประกอบเปปไทดสวนมากจะใหรสขม เกดจากหมไมชอบนาของกรดอะมโนทมฤทธเปนกลาง (hydrophobic amino acid) เชน ทรปโตเฟน ฟนลอะลานน ไอโซลวซน ลวซนและวาลน เปนตน หรอเปปไทดทมกรดอะมโนเหลานเปนองคประกอบ แตเปปไทดทไดจากการยอยสลายโปรตน จะมรสตามกรดอะมโนทอยปลายโมเลกลสารประกอบไดเปปไทดของกรดกลตามก ทจบกนตรงตาแหนง γ-carboxyl group เชน glutamylaspartic, glutamylserine และ glutamylglutamic acid จะใหกลนรสทด (Manley และคณะ, 1981) 2. สารประกอบทระเหยได (volatile compounds)

กรดอะมโนมบทบาทสาคญตอกลนรสในดานทเปนสารเรมตน (precursor) ของสารประกอบทระเหยได เชน ฟราโนน (furanone) ไพราซน และสารประกอบซลเฟอร (Dzanic และคณะ, 1985) จากการศกษาและแยกองคประกอบของสารประกอบทระเหยไดในเนอวว เนอไก

20

เนอหม และเนอแกะพบวามสารประกอบหลายชนดประกอบไปดวยสารประกอบอนทรยตางๆ ไดแก

2.1 ไพราซน (pyrazines) ไพราซนเปนสารประกอบไนโตรเจนทระเหยไดทมปรมาณมากทสด คอ รอยละ 20 ของ

สารประกอบทระเหยไดทงหมด โดยไพราซนเปนสารประกอบทเกดจากปฏกรยารวมตวระหวางกรดอะมโนกบอลดไฮดหรอคโตน (Manley และคณะ, 1981) กลไกการเกดไพราซนดงแสดงในภาพท 10 ไพราซนเกดจากปฏกรยาเมลลารดระหวางกรดอะมโนและนาตาลรดวซ โดยเกดขนไดตงแตระยะแรกของการใหความรอน

ไพราซนเปนสารประกอบทมกลนคลายถวคว แตกลนของ HVP ทวไปไมมกลนคลาย ถวคว อยางไรกตามเมอเพม pH ของ HVP จนเปนดาง พบวาจะมกลนถวควเกดขน บทบาทของ ไพราซนทมตอการเกดกลนหอมของ HVP ยงไมเปนททราบแนชด แตเมอกาจดไพราซนออกไป พบวากลนหอมของ HVP เปลยนแปลงไป (Manley และ Fagerson, 1971)

ภาพท 10 กลไกการเกดสารประกอบไพราซน ทมา : Manley และ Fagerson, 1971

2.2 ฟรานและฟราโนน (furans and furanones) สารประกอบฟรานและฟราโนนในโปรตนไฮโดรไลเซท สารประกอบนถงแมวาจะม

ปรมาณไมสงนก แตมผลตอกลนรสเนองจากมคา threshold ของกลนและรสตา และใหกลน sweet roasted ซงเปนทตองการ ฟราโนนทสาคญ คอ 3-hydroxy-4-methyl-5-ethyl-2(5H) furanone ใหกลน sweet caramel (Manley และคณะ, 1981)

21

สารประกอบฟรานมกเกดจากปฏกรยาเมลลารดเปนสาคญ หรออาจเกดจากการออกซเดชนไขมนจากการใหความรอน และการแตกตวของไทอะมนหรอ 5'นวคลโอไทด การแตกตวของสารประกอบ amadori ในปฏกรยาเมลลารดจะใหสารประกอบฟรานดงภาพท 11

ภาพท 11 กลไกการเกดสารประกอบฟราน ทมา : Henk, 1991

22

2.3 สารประกอบซลเฟอร (sulfur containing compounds) สารประกอบซลเฟอรมความสาคญตอกลนรสเนอ (meat flavor)มาก โดยพบวาถาแยก

สารประกอบซลเฟอรจากกลนเนอไกตมจะทาใหกลนเนอหายไป (Manley และคณะ, 1981) สารประเภทอะลฟาตกทมซลเฟอรเปนองคประกอบ (aliphatic sulfides) ใหกลนเนอ

(Mottram, 1992) มกพบในซอวและโปรตนไฮโดรไลเซททผานการใหความรอน ซงมผลตอกลนของโปรตนไฮโดรไลเซทมากเนองจากมคา threshold ตา (Aaslyng และคณะ, 1998)

thiazoles พบในระบบทประกอบไปดวย cysteine และ reducing sugar หรอ dicarbonyl หรอการทนาตาลผสมกบ hydrogen sulfide และแอมโมเนย แลวนามาใหความรอนดงภาพท 12

ภาพท 12 กลไกการเกดสารประกอบ thiazole ทมา : Henk, 1991

2.4 อลดไฮด (aldehydes) อลดไฮดมปรมาณมากทสด คอ ประมาณรอยละ 32 ของสวนทระเหยไดทงหมด เกดจาก

ปฏกรยาสลายตวของกรดอะมโน (strecker degradation) เชน ลซน เปนสารเรมตนของไอโซวาเลอ- อลดไฮด (isovaleraldehyde) ในการกระบวนการ strecker degrasation ของ α-กรดอะมโนจะให อลดไฮด ดงภาพท 13

23

ภาพท 13 กลไกการเกดสารประกอบอลดไฮด ทมา : Henk, 1991

Sonklin และคณะ (2010) ศกษาการผลตผงกลนรสไกทผลตจากโปรตนไอโซเลตกาก

ถวเขยว โดยใชเทคนคเอนแคปซเลชน ใชแปงขาวเจาเปนสารเคลอบ แปรปรมาณกลนไกรอยละ 20, 30 และ 40 (โดยนาหนก) เมอวเคราะหปรมาณองคประกอบของสารใหกลนรสไก ดวย DHS-SPME-HS-CG-MS พบองคประกอบหลกของสารใหกลนรสไก คอ 2-methyl-3-furyl-disulfide และ 2-methyl-3-furanthiol

24

ตารางท 2 สารประกอบใหกลนรสหลกในกระบวน thermal process flavor , คณลกษณะตางๆ และคา threshold

Key aromatic compounds Range of flavor type Rang of threshold (in water)

Aldehydes Fruity, Green 15 ppm to 0.2 ppb Pyrazines Roasted, Green, Popcorn,

Nutty 25 ppm to 0.006 ppb

Furanones Sweet Caramel 10 ppm to 0.03 ppb Furans Thiazoles/thiazolines Thiophenes Polysulfides

Sweet-burnt, Rum-like,Roasted Cooked onion, Meaty Fried onion, Mustard-like Onion, Garlic

5 ppm to 6 ppb 3 ppm to 0.003 ppb 0.2 ppm to 1 ppb 0.05 ppm to 2 ppb

ทมา : Charles และ Sajid (1995) งานวจยน มงเนนทการศกษาสภาวะทเหมาะสมสาหรบการยอยโปรตนสกดจากถวเหลอง

ดวยเอนไซมเพอผลตโปรตนผกไฮโดรไลเซท สาหรบใชเปนสารตงตนในกระบวนการผลตสารใหกลนรสเนอสตวในรปขนหนด ซงการใชเอนไซมในการผลตไมกอใหสาร 3-MCPD อกทงเปนการเพมมลคาใหผลตภณฑทางการเกษตร เนองจาก HVP มราคาสงและปจจบนประเทศไทยมการนาเขา HVP เพอนามาใชในอตสาหกรรมอาหาร ซงเปนอตสาหกรรมหลกภายในประเทศ

25

บทท 3 วธด าเนนงานวจย

1. วตถดบ สารเคม และอปกรณทใชในการวจย

1.1 วตถดบ - Soy Protein Isolate (Mighty, Thailand) - เอนไซม Collupulin MG (Papain) (Siam Victory, Thailand ) - เอนไซม Protease G1 (Siam Victory, Thailand) - เอนไซม Protease G6 (Siam Victory, Thailand) - เอนไซม Protamex (Brenntag, Thailand) - Ribose (Jebsen & Jebsen, Thailand) - Glucose (Jebsen & Jebsen, Thailand) - L-cysteine•HCl• H2O (Tinnakorn Chemical and Supply, Thailand) - Glyciene (Tinnakorn Chemical and Supply, Thailand)

1.2 สารเคม 1. Non-specific Protease Activity Assay

- Casein (Fluka, Switzerland) - Potassium phosphate dibasic, trihydrate (Sigma- Aldrich, Japan) - Trichloroacetic acid (Merck, Germany) - Anhydrous sodium carbonate (Univar, Australia) - Sodium Acetate Buffer (Univar, Australia) - Calcium Acetate (Sigma- Aldrich, Japan) - L-Tyrosine (Sigma- Aldrich, USA) - Folin's reagent (Merck, Germany) - Sodium carbonate (Univar, Australia) - Hydrochrolic acid (HCl) (Merck, Germany) - Sodium hydroxide (NaOH) (Merck, Germany) - Acetic acid (Merck, Germany)

26

2. O-Phthaldialdehyde Method (OPA Method) สาหรบวเคราะหคารอยละการยอยสลาย (% DH) - di-Na tetraborate (Merck, Germany) - Na-dodecyl-sulfate (SDS) (Sigma- Aldrich, Canada) - 0-Phthaldialdehyde 97% (OPA) (Sigma- Aldrich, China) - DL-Dithiothreitol 99% (DDT) (Sigma- Aldrich, Canada) - Ethanol (Merck, Germany) - Standard serine (Sigma- Aldrich, USA)

1.3 อปกรณทใชในการวจย - เครองชง 4 ตาแหนง (Sartorius รน CP224S) - เครองวดความเปนกรด-ดาง ( pH meter) (Eutech Instruments รน Cyberscan

510) - Hot plate with magnetic stirrer (LMS รน HTS-1003) - เครองวดคาส Colorview (Miniscan รน XE Plus บรษท Hunter Lab, USA) - Spectrophotometer (Spectronic Unicam รน Genesys 10 series) - เครอง Gas Chromatography-Mass Spectrometryr (GC-MS) (Hewlett

Packard, USA) คอลมน HP-5MS - เครองกลนวเคราะหปรมาณไนโตรเจน (C. Gerhardt รน Vapodest 33) - ชดสกดไขมน (Soxhlet extractor) (Tecator รน 1047) - เตาเผา (Carbolite, UK) - เครองระเหยตวทาละลายแบบหมน (Buchi รน R-205) - ตอบลมรอน ( Hot Air Oven ) (Binder, Germany) - อางควบคมอณหภม (Water Bath) (Memmert, Germany) - Micropipette (Gilson, Frace) - Vortex mixer (S.I. รน G560, U.S.A) - กระดาษกรอง what man no 1 และ what man no 5 (Whatman, England) - เครองแกวอนๆ เชน Beaker, Volumetric flask, striring rod, test tube เปนตน

27

2. วธการทดลอง 2.1 วเคราะห proximate analysis ของ Soy Protein Isolated

- วเคราะหปรมาณความชน (AOAC, 1990) - วเคราะหปรมาณโปรตนโดยใชวธเจลดาล (AOAC, 1990) - วเคราะหไขมน (Crude fat) (AOAC, 1990) - วเคราะหปรมาณเถา (AOAC, 1990) - วเคราะหปรมาณเยอใยหยาบ (Crude fiber) (AOAC, 1990) - วเคราะหคารโบไฮเดรต (AOAC, 1990)

2.2 คดเลอกชนดของเอนไซมยอยสลายโปรตนชนดตางๆ ทเหมาะส าหรบน ามาใช ในการผลต Hydrolyzed Vegetable Protein (HVP)

1. วเคราะหกจกรรมของเอนไซมแตละชนดดวยวธ Non-specific Protease Activity Assay (Casein Substrate) (Cupp-Enyard, 2008) (วธการเตรยมสารเคม ดงภาคผนวก ก)

- เตม 0.65% casein solution 5 มลลลตรลงในหลอดทดลองทง 4 หลอด บมท 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 5 นาท

- เตม enzyme solution ในปรมาตรสาหรบแตละ dilution (ยกเวนหลอด blank) เขยาใหเขากนโดยใช vortex และบมท 37 องศาเซลเซยสเปนเวลา 10 นาท เตม TCA reagent จานวน 5 มลลลตรลงแตละหลอด เพอหยดปฏกรยา

- เตม enzyme solution ใหมปรมาตรสดทายเปน 1 มลลลตรในทกๆหลอดรวมถงหลอด blank บมสารละลายท 37 องศาเซลเซยสเปนเวลา 30 นาท

- กรองสารละลายดวย 0.45 µm polyethersulfone filter - นาสวนทไดจากการกรองมา 2 มลลลตรใสในหลอดทดลอง เตม sodium

carbonateปรมาณ 5 มลลลตรในแตละหลอด สารละลายจะขนจากนนเตม Folin's reagent 1 มลลลตรทนท

- เขยาดวย vortex และบมท 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 30 นาท - วดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 660 นาโนเมตร พรอมทงบนทกคาและ

คานวณ วธการค านวณ

นาคาการดดกลนแสง ทไดมาคานวณหาปรมาณ Tyrosine (ไมโครโมล) จากกราฟมาตรฐานจากนนคานวณตามสมการตอไปน

28

Units/ml enzyme = โดยท 11 มาจาก ปรมาตรทงหมด (มลลลตร) ของการวเคราะห 10 มาจาก ระยะเวลาของการวเคราะห (นาท) ตอ unit definition 1 มาจาก ปรมาตรของเอนไซมทใช (มลลลตร) 2 มาจาก ปรมาตรทใชในการวดส (มลลลตร)

หากเปน solid enzyme สามารถหากจกรรมของเอนไซม ไดจาก Units/mg solid enzyme = 2. คดเลอกชนดของเอนไซมทเหมาะสมสาหรบนามาใชในการผลต HVP

ละลายโปรตนถวเหลองสกด (SPI) ในนากลน (5 กรม/100 มลลลตร) และปรบ pH ใหเหมาะสมกบการทางานของเอนไซม จากนนใสเอนไซมใหมกจกรรมของเอนไซมเปน 200 หนวยตอกรมโปรตน โดยใชสมการ

ME = MP * A * % P

เมอ ME คอ ปรมาณเอนไซมทใช หนวยเปนกรม MP คอ ปรมาณโปรตนถวเหลองสกด (SPI) ทใชในการยอยดวยเอนไซม หนวย

เปนกรม A คอ กจกรรมของเอนไซมทวดได หนวยเปน หนวยตอกรม % P คอ รอยละปรมาณโปรตนในโปรตนถวเหลองสกด E คอ กจกรรมของเอนไซมทตองการ (หนวยตอกรมของแขง)

นาไปอนใน Water Bath ตามอณหภมทเหมาะสมกบการทางานของเอนไซมชนดนนๆ ยอยสลายโปรตนเปนระยะเวลา 3 ชวโมง และหยดปฏกรยาโดยใหความรอนท 90 องศาเซลเซยส เปนเวลา 15 นาท จากนนนาสวนทไดจากการกรอง นาสวนใสไปวเคราะหคารอยละการยอยสลาย (% DH) ตามวธในขอ 3 และรอยละผลผลต (% yield) ตามวธในขอ 4

100 * E

µmoles Tyrosine equivalents released *11

1*10*2

Units/ml enzyme

mg solid/ml enzyme

29

3. วเคราะหคารอยละการยอยสลาย (degree of hydrolysis, %DH) โดยใชวธ o-phthaldialdehyde (OPA method) (Nielsen และคณะ, 2001)

- เตรยมหลอด standard, blank, และ sample อยางละ 4 หลอดทดลอง - เตม OPA reagent 3 มลลลตร ลงในหลอดทดลองทง 12 หลอด - สารละลายทนามาวดเตรยมโดยการใช 400 µl ของ standard (blank หรอ

sample) เตมลงในหลอดทดลองทม OPA reagent อย ทาการผสมเปนเวลา 5 วนาท และตงทงไว 2 นาท กอนทาการวดท 340 นาโนเมตร (อณหภมหอง)

- เรมวดจาก standard 2 หลอด ตามดวย blank 1 สลบกบ sample 2 , blank 2 สลบกบ sample 3 ไปเรอยๆ จนถง sample 4 ตามดวย standard อก 2 หลอดทเหลอ

- คานวณคารอยละการยอยสลายจากสมการ สมการท 1;

*

เมอ ODsample คอ คาการดดกลนแสงของตวอยางท 340 นาโนเมตร ODblank คอ คาการดดกลนแสงของนาท 340 นาโนเมตร ODstandard คอ คาการดดกลนแสงของเซอรนท 340 นาโนเมตร X คอ ปรมาณตวอยาง หนวยเปนกรม P คอ รอยละโปรตนในตวอยาง

สมการท 2; h =

เมอ β คอ 0.342 (คาจาเพาะของโปรตนถวเหลอง) (Adler-Nissen, 1986)

α คอ 0.970 (คาจาเพาะของโปรตนถวเหลอง) (Adler-Nissen, 1986)

Serine-NH2 = ODsample-ODblank

ODstandard-ODblank

0.9516 meqv/L*0.1*100/X*P

Serine-NH2 - β

α

30

สมการท 3; DH = * 100%

เมอ h คอ จานวนพนธะทถกยอย htot คอ จานวนพนธะเปปไทดทงหมดตอโปรตนสมมลย (คาจาเพาะของ

โปรตนถวเหลอง คอ 7.8) (Nielsen และคณะ, 2001) 4. วเคราะหรอยละผลผลต (% yield) โดยใชเครองระเหยตวทาละลายแบบหมน (ยหอ Buchi รน R-205) (Sonklin และคณะ, 2011)

ปเปตสารละลายตวอยางปรมาตร 10 ลล ล ใสในขวดกนกลม (round bottom flask) พรอมบนทกน าหนก และระเหยตวอยางดวยเครองระเหยตวทาละลายแบบหมน โดยใชอณหภม 60 อ ล ในการระเหย ระเหยจนสารละลายมลกษณะขนเปนเพสต จากนนนาขวดกนกลมไปอบในเครองอบลมรอน (hot air oven) ทอณหภม 105 องศาเซลเซยส จนมนาหนกคงท นาไปชงนาหนกหลงอบและคานวณหารอยละผลผลตดงสมการ

% yield = นาหนกเพสต (กรม) * 100

เมอ % yield คอ รอยละผลผลต มหนวยเปนกรมเพสตตอกรมตวอยาง

นาหนกเพสต คอ นาหนกตวอยางกอนอบ–นาหนกตวอยางหลงอบ มหนวยเปนกรม

5. นาคารอยละการยอยสลาย และรอยละผลผลตไปวเคราะหความแตกตาง

โดยใชแผนการทดลองแบบ CRD ดวยโปรแกรม SPSS version 16.0 2.3 ศกษาสภาวะทเหมาะสมในการผลต HVP จากโปรตนถวเหลองสกดโดยใชเอนไซมท

ผานการคดเลอกจากขอ 2.2 1. วางแบบการทดลอง โดยใชแผนการทดลอง Response Surface Methodology

ดวยโปรแกรม Design Expert 6.0.5

นาหนกตวอยางทใช (กรม)

h

htot

31

2. ดาเนนการยอยโปรตนถวเหลองสกดดวยเอนไซมทคดเลอกแลว ตามสภาวะทไดจากแผนการทดลองขางตน พรอมทงวเคราะหผลไดแก รอยละผลผลต (% yield) รอยละการยอยสลาย (% DH)

3. นาคารอยละการยอยสลาย (% DH) รอยละผลผลต (% yield) ไปวเคราะหผล โดยใชแผนการทดลอง Response Surface Methodology ดวยโปรแกรม Design Expert 6.0.5 (วเคราะห โดยกาหนดใหเลอกสภาวะทมรอยละการยอยสลายและรอยละผลผลตสงทสดในขณะทใชกจกรรมของเอนไซมทตาทสด)

4. เปรยบเทยบและยนยนการคดเลอกสภาวะทเหมาะสมตอการยอยโปรตนสกดจากถวเหลองดวยเอนไซมทคดเลอก โดยยอยเปนเวลา 3 ชวโมง พรอมทงวดและวเคราะหผล

2.4 ศกษาระยะเวลาทเหมาะสมตอการผลต HVP จากโปรตนถวเหลองสกดภายใต

สภาวะทเหมาะสมจากขอ 2.3 1. หาระยะเวลาทเหมาะสมสาหรบนามาใชในการผลต HVP

ละลายโปรตนถวเหลองสกดรอยละ 5 ในนากลน (5 กรม/100 มลลลตร) และปรบ pH ใหไดตามสภาวะทเหมาะสมตามขอ 2.3 จากนนใสเอนไซมใหม แอคตวตของเอนไซมตามขอ 2.3 นาไปอนใน Water Bath ตามอณหภมทเหมาะสมตามทเลอกไวในขอ 2.3 ยอยสลายโปรตนเปนระยะเวลา 1, 2, 3, 6, 9, 12 และ 24 ชวโมง และหยดปฏกรยาโดยใหความรอนท 90 องศาเซลเซยส เปนเวลา 15 นาท จากนนนาสวนทไดจากการกรอง นาสวนใสไปวเคราะหคารอยละการยอยสลาย (% DH) รอยละผลผลต (% yield) และคาส 2. นาคารอยละการยอยสลาย รอยละผลผลต และคาส ไปวเคราะหความแตกตาง โดยใชแผนการทดลองแบบ CRD ดวยโปรแกรม SPSS version 16.0

2.5 พฒนาโปรตนไฮโดรไลเซททไดจากการยอยโปรตนถวเหลองสกดโดยใชเอนไซมเปน

สารใหกลนรส 1. เตรยมโปรตนไฮโดรไลเซทจากโปรตนถวเหลองสกดใหอยในรปเขมขน (นา

โปรตนไฮโดรไลเซททผลตจากสภาวะทเหมาะสมทสดมาทาการระเหยเอานาออก โดยใสโปรตนไฮโดรไลเซทในรปของเหลว 60 กรม ลงในบกเกอรขนาด 1,000

32

มลลลตร ใสลงใน water bath อณหภม 70 องศาเซลเซยส เปนเวลา 2 ชวโมงครง) เพอใชเปนสารตงตนในกระบวนการ thermal process flavor 2. ผสมสวนผสมโดยแปรผนรอยละของนาและ HVP ดงตารางท 3

ตารางท 3 อตราสวนผสมในกระบวนการผลตกลนรสไกจากกระบวนการ thermal process flavor ลาดบท สวนผสม นาหนก

(กรม) คดเปนรอยละ

1 L-cysteine•HCl• H2O 02.60 11.79 2 L-glycine 01.40 06.35 3 นาตาลไรโบส 01.50 06.80 4 นาตาลกลโคส 02.30 10.43 5 สารละลายโซเดยมไฮดรอกไซด 50% 02.00 09.04 6 โปรตนไฮโดรไลเซทเขมขน (สตร 1)

โปรตนไฮโดรไลเซทเขมขน (สตร 2) โปรตนไฮโดรไลเซทเขมขน (สตร 3)

01.10 03.31 05.52

05.00 15.00 25.00

7 นา (สตร 1) นา (สตร 2) นา (สตร 3)

11.16 08.95 06.74

50.59 40.59 30.59

ทมา : ดดแปลงจาก Manley และคณะ (1999)

ใหความรอนทอณหภม 95 องศาเซลเซยส เปนเวลา 2 ชวโมง ไดเปน process flavor กลนไกในรปของเหลว และทดสอบความแตกตางทางดานประสาทสมผสแบบ generic descriptive analysis ประยกตดดแปลงมาจาก Kamchoom, 2010 โดยทดสอบดานส กลนรสไก รสหวานและรสขม เปรยบเทยบกบกลนรสไกทางการคาซงนาเขาโดยบรษท Firmenich (Thailand) (ผลตจากประเทศจน) ดวยผทดสอบทผานการฝกฝนจานวน 10 คน (ภาคผนวก ค) และวเคราะหความแตกตางทางสถตดวยดวยโปรแกรม SPSS version 16.0

33

2.6 วเคราะหองคประกอบของสารใหกลนรสไก (Sonklin และคณะ, 2010) วเคราะหปรมาณองคประกอบของสารใหกลนรสไกทไดจาก

กระบวนการ thermal process flavor ทผลตจาก HVP ทง 3 ความเขมขนเปรยบเทยบกบกลนรสไกทางการคาดวย GC-MS ไฟเบอรทใชคอ 75 µm Carboxen/PDMS 1. เตรยมตวอยางทใชวเคราะห โดยการอนสารตวอยางปรมาตร 4 มลลลตร (กลนรสไกทางการคาเนองจากมลกษณะเปนผงจงตองนาไปละลายนาดวยอตราสวน 1:1 กอน) อนทอณหภม 80 องศาเซลเซยส เปนเวลา 10 นาท จากนนใหไฟเบอรดดซบไอสารระเหยเปนเวลา 30 นาท

2. วเคราะหองคประกอบสารโดยนาไฟเบอรฉดเขาเครอง GC โดยใชคอลมน HP-5MS และกาซฮเลยมเปนตวพา ใหเวลาในการชะสารระเหยออกจากไฟเบอรเปนเวลา 5 นาท โปรแกรมระบบโดยเรมจากอณหภม 55 องศาเซลเซยสคงไว 5 นาท เพมอณหภมเปน 180 องศาเซลเซยสดวยอตราเรว 10 องศาเซลเซยส/นาท และเพมอณหภมจาก 180 องศาเซลเซยสเปน 200 องศาเซลเซยส ดวยอตราเรว 20 องศาเซลเซยส/นาท คงไว 10 นาท วเคราะหสารระเหยดวยเครอง MSD (scan range 35-450 amu) ทอณหภม 250 องศาเซลเซยส โดยใช 2, 4, 6-trimethyl pyridine เปน internal standard และคานวณปรมาณสารหอมระเหยดงสมการ

ปรมาณสารหอมระเหย (ppm.) = Ax Qi

เมอ Ax คอ พนทสารหอมระเหย (*107)

Ai คอ พนทใตกราฟของ 2, 4, 6-trimethyl pyridine Qi คอ ปรมาณ 2, 4, 6-trimethyl pyridine

Ai

34

บทท 4 ผลการทดลองและการอภปรายผลการทดลอง

1. องคประกอบทางเคมของโปรตนสกดจากถวเหลอง

วตถดบตงตนทใชในการทดลองน คอ โปรตนสกดจากถวเหลองทมโปรตนทสง และมปรมาณคารโบไฮเดรตและไขมนทตาเทากบรอยละ 0.11 (ตารางท 4) รวมถงมตนทนตา จงมความเหมาะสมในการนามาใชเปนวตถดบตงตนในการผลต HVP

ตารางท 4 รอยละปรมาณองคประกอบตางๆ ในโปรตนสกดจากถวเหลอง

วตถดบทใชในการผลต HVP ควรมโปรตนไมตากวารอยละ 30 โดยนาหนกแหง ควรม

ปรมาณไขมนในปรมาณทตาทสด เนองจากไขมนในวตถดบอาจเกดพนธะเชอมขามกบโมเลกล

ของโปรตน เกดเปนสารประกอบเชงซอนระหวางระหวางไขมนและโปรตน ซงโครงสรางดงกลาว

สามารถทนตอการยอยดวยเอนไซมได และควรมปรมาณคารไฮเดรทตา เพราะปรมาณ

คารโบไฮเดรททมากเกนไปอาจทาปฏกรยากบกรดอะมโนทไดจากการยอยสลายโปรตนทาให

สญเสยกรดอะมโนไป (Mutilangi และคณะ, 1996) และสาหรบปรมาณเถานนโดยทวมกพบอย

ในชวงรอยละ 5-20 ในผลตภณฑจากถวเหลองทางการคา ซงเปนเกลอทเหลอตกคางจากการยบย ง

การทางาน (antitryptic activity) ของสารยบย งการทางานของทรปซน (trypsin inhibitor) ท

องคประกอบ ปรมาณ (รอยละนาหนกตอน าหนก)

โปรตน 85.30 ± 0.280

ไขมน 0 0.11 ± 0.002

เถา 0 4.14 ± 0.180

ความชน 0 6.74 ± 0.050

เยอใย 00.08 ± 0.005

คารโบไฮเดรท 0 3.63 ± 0.040

35

พบในถวเหลองและจากการใชความเปนกรดดางในการตกตะกอนโปรตนอกดวย (Henn และ

Netto, 1998)

2. การคดเลอกชนดเอนไซมทเหมาะสม ผลตภณฑโปรตนไฮโดรไลเซททไดจากการยอยสลายดวยเอนไซมกลมทเปนเอนโด

เปปทเดส มความแตกตางจากการใชเอนไซมกลมเอกโซเปปทเดสกลาวคอ กลมเอนโดเปปทเดส สามารถยอยพนธะเปปไทดเปนแบบสมโดยยอยจากภายในสายของโพลเปปไทด และยอยไปเรอยๆ จนกวาจะมการหยดย งการทางานของเอนไซมหรอจนกวาซบสเตรทจะหมด แตเอนไซมกลม เอกโซเปปทเดสจะมความจาเพาะเจาะจงในการยอยสลายพนธะเปปไทดในตาแหนงทมความเหมาะสมกบการทางานของเอนไซมนนๆ การยอยโพลเปปไทดไปเรอยๆ ของเอนโดเปปทเดสทาใหสามารถยอยสลายไดพนธะเปปไทดทมความหลากหลายทงชนดและขนาดโมเลกล ทาใหสารละลายโปรตนไฮโดรไลเซททไดมเปปไทด และกรดอะมโนหลากหลายชนด ทาใหไดกรด อะมโนทจาเปนตอรางกายของผบรโภคอกดวย แตสาหรบเอกโซเปปทเดสนนจะใชในกรณทตองการใหไดโปรตนไฮโดรไลเซทมขนาดเปปไทดทมขนาดเฉพาะ ซงอาจจะนาไปใชเฉพาะงานเชนใชเปนสารอมลซไฟเออร (Tavano, 2013)

นาเอนไซมโปรตเอสทางการคา 4 ชนด ไดแก Protease G6, Protamex, Protease G1 และ Collupulin MG ซงเปนเอนไซมกลมเอนโดเปปทเดสมายอยโปรตนสกดจากถวเหลองเพอเปรยบเทยบและคดเลอกชนดเอนไซมทเหมาะสมสาหรบการผลต HVP จากโปรตนสกดจาก ถวเหลองดวยเอนไซม โดยนาเอนไซมแตละชนดมาทาการวดคากจกรรมของเอนไซมดวยวธของ Cupp-Enyard (2008) (ภาคผนวก ข ตารางท 19-22) พบวาเอนไซม Protease G6 และ Protamex มคากจกรรมของเอนไซมตงตนไมแตกตางกนและมคาสงทสด รองลงมาคอ เอนไซม Protease G1 และ Collupulin MG ตามลาดบ (ตารางท 4) และเมอนาเอนไซมทง 4 ชนดมายอยทสภาวะ pH และอณหภมทเหมาะสมจาเพาะสาหรบเอนไซมแตละชนดโดยทมกจกรรมของเอนไซมเปน 200 หนวยตอกรมโปรตนเปนระยะเวลา 3 ชวโมงเทาๆกน (ภาคผนวก ข ตารางท 23-31) จะเหนวาโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin MG นนมรอยละการยอยสลายและรอยละผลผลตสงทสดอยางมนยสาคญทางสถตเมอเทยบกบการยอยดวยเอนไซมชนดอนๆ โดยมเอนไซม Protease G6 ทสามารถยอยโปรตนสกดจากถวเหลองไดรอยละการยอยสลายไมตางกบเอนไซม Collupulin MG อยางมนยสาคญและไมตางกบเอนไซม Protamex และ Protease G1 ทมคารองลงมา ในขณะทเอนไซม Protease G1, Protamex และ Protease G6 สามารถยอยโปรตนสกดจากถวเหลองไดรอยละผลผลตรองลงมาจากเอนไซม Collupulin MG ตามลาดบ โดยทเอนไซม Protamex และ

36

Protease G6 สามารถยอยโปรตนสกดจากถวเหลองไดรอยละผลผลตไมแตกตางกนอยางมนยสาคญทางสถต ดงแสดงในตารางท 5 ตารางท 5 เปรยบเทยบการยอยโปรตนสกดจากถวเหลองดวยเอนไซมชนดตางๆ ทมกจกรรมเปน

200 หนวยตอกรมโปรตนท pH และอณหภมทเหมาะสมจาเพาะสาหรบเอนไซมแตละชนดเปนเวลา 3 ชวโมง

ชนดเอนไซม pH อณหภม (องศาเซลเซยส)

กจกรรมของ เอนไซมตงตน (หนวยตอกรมโปรตน)

รอยละการยอยสลาย

รอยละผลผลต

Protease G6 9.5 60 520.75 ± 36.35a 25.60 ± 0.63ab 05.50 ± 0.26c

Protamex 6.0 50 485.46 ± 22.29a 22.88 ± 0.68b 06.08 ± 0.36c

Protease G1 7.0 50 160.73 ±06.39b 21.61 ± 1.29b 07.80 ± 1.15b

Collupulin MG 6.5 65 073.87 ± 03.53c 27.55 ± 4.41a 23.24 ± 0.75a

** ตวอกษร a, b, c ทแตกตางกนในแนวตง หมายถง มความแตกตางอยางมนยสาคญทางสถต (p≤0.05)

จากตารางท 5 พบวารอยละผลผลตทไดจากการใชเอนไซม Collupulin MG มรอยละผลผลตมากทสดเมอเปรยบเทยบกบรอยละผลผลตทไดจากเอนไซม Protease G6, Protamex และ Protease G1 อาจเนองมาจากเอนไซม Collupulin MG ม Maltodextrin เปนตวพามากกวารอยละ 88.5 ในขณะทเอนไซมอนๆไมมการใชตวพา (Siam victory, 2012)

เอนไซม Collupulin MG มคากจกรรมของเอนไซมตงตนนอยทสด แตเมอนามายอยโปรตนสกดจากถวเหลองโดยปรบคากจกรรมของเอนไซมเปน 200 หนวยตอกรมโปรตนเทากบเอนไซมชนดอน แลวสามารถยอยไดดทสดนน อาจเนองจากคากจกรรมของเอนไซมตงตนนนวดจากการใชเคซนเปนสารตงตน แลวเอนไซม Collupulin MG อาจมความสมพนธในการยอยเคซนไดนอยกวาเอนไซมอนๆ เปนไปในทางเดยวกนกบทพบในการทดลองของ Su และคณะ (2011) ทไดทดสอบคากจกรรมของเอนไซมตงตนของสารสกดเอนไซมโปรตเอสหยาบจาก Aspergillus oryzae เทยบกบเอนไซมทางการคาอนๆ โดยใชเคซนเปนสารตงตน พบวาสารสกดเอนไซม

37

โปรตเอสหยาบมคากจกรรมของเอนไซมตงตนนอยกวาเมอเทยบกบเอนไซมทางการคาชนดอน แตเมอนามายอยกากถวลสงกาจดไขมนแลวกลบมคารอยละการยอยสลายทสงกวาเอนไซมทางการคาชนดอนอยางมนยสาคญทางสถต จงทาการเลอกเอนไซม Collupulin MG ซงเปนเอนไซมโปรตเอสทสกดไดจากมะละกอ (Carica papaya) มาทาการทดลองเพอหาสภาวะทเหมาะสมในการยอยโปรตนสกดจากถวเหลองเพอผลต HVP ตอไป

4.3 สภาวะทเหมาะสมตอการผลต HVP การศกษานวางแผนการทดลองแบบพนทผวตอบสนอง โดยกาหนดปจจยทตองการทราบ 3 ปจจย คอ pH กาหนดใหอยในชวง 5-7 เนองจากเปนชวง pH ทเหมาะสมตอการทางานของกลมเอนไซมทไดจากมะละกอและอยชวงเหมาะสมตอการผลต HVP ทตองการควบคมปรมาณเกลอ อณหภม กาหนดใหอยในชวง 50-70 องศาเซลเซยส เนองจากเปนชวงอณหภมทเหมาะสมตอการทางานของกลมเอนไซมทไดจากมะละกอ และกจกรรมของเอนไซม กาหนดใหอยชวง 200-400 หนวยตอกรมโปรตน แลวไดกาหนดตวแปรตอบสนองทจะใชในการตดสนสภาวะทเหมาะสมจานวน 2 ตวแปร คอ รอยละการยอยสลายและรอยละผลผลต การวดรอยละการยอยสลายโปรตนเปนสงจาเปนสาหรบปฏกรยาการยอยสลาย เพอแสดงถงจานวนพนธะเปปไทดทถกทาลายระหวางปฏกรยา จงมการกาหนดคาทใชบงบอกถงความกาวหนาของปฏกรยาในรปของรอยละไนโตรเจนทละลายไดเปรยบเทยบกบปรมาณไนโตรเจนทงหมดในวตถดบ (Greenberg และ Shipe, 1979)

ขอดของการใชคารอยละการยอยสลายในการตดตามระดบการเกดการยอยสลายของโปรตนคอ คาดงกลาวไมขนอยกบปรมาณสารตงตน อตราสวนระหวางเอนไซมและสารตงตน และอณหภม ถงแมปรมาณสารตงตนและเอนไซมของ 2 ตวอยางไมเทากน แตมอตราสวนทเทากน รอยละการยอยสลายของทงสองตวอยางกจะเทากน เวลาเปนตวแปรซงบงบอกถงระดบการเกดการยอยสลายทไมดนก เนองจากรอยละการยอยสลายทเวลาตางๆจะขนอยกบปรมาณสารตงตน เอนไซม และอณหภม (จรวฒน, 2541)

เมอนาคาตวแปรตอบสนองทไดจากการทดลองทสภาวะตางๆ ตามแผนการทดลอง (ตารางท 6) (ผลของระดบการยอยสลายและรอยละผลผลตแสดงดงภาคผนวก ข ตารางท 32-71) มาทาการวเคราะหดวยวธทางสถต พบวาจากคาสมประสทธความถดถอย (regression coefficient) ระหวาง pH (A) อณหภม (B) และกจกรรมของเอนไซม (C) สงผลตอระดบการยอยสลายเชง quadratic และมความสมพนธอยางมนยสาคญทางสถต (p≤ 0.05) (ภาพท 14)

38

ตารางท 6 คารอยละการยอยสลายและรอยละผลผลตของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin MG ทสภาวะตางๆ ตามแผนการทดลองแบบพนทผวตอบสนอง เปนเวลา 3 ชวโมง

สภาวะท pH อณหภม (องศาเซลเซยส)

กจกรรมของเอนไซม ( หนวยตอกรม โปรตนซบสเตรท)

รอยละการ ยอยสลาย (% DH)

รอยละผลผลต (% yield)

1 5 50 200 31.21 32.22

2 7 50 200 34.54 29.69

3 5 70 200 33.56 30.87

4 7 70 200 40.12 46.90

5 5 50 400 41.87 46.85

6 7 50 400 48.21 47.66

7 5 70 400 46.95 49.07

8 7 70 400 41.38 42.08

9 4.32 60 300 39.70 40.16

10 7.68 60 300 32.60 39.73

39

ตารางท 6 (ตอ) คารอยละการยอยสลายและรอยละผลผลตของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการ ยอยดวยเอนไซม Collupulin MG ทสภาวะตางๆ ตามแผนการทดลองแบบพนทผว

ตอบสนอง เปนเวลา 3 ชวโมง

สภาวะ

ท pH

อณหภม

(องศา

เซลเซยส)

กจกรรมของเอนไซม

( หนวยตอกรม

โปรตนซบสเตรท)

รอยละการ

ยอยสลาย

(% DH)

รอยละ

ผลผลต

(% yield)

11 6 43.18 300 44.81 36.84

12 6 76.82 300 23.94 23.94

13 6 60 131.82 43.04 54.94

14 6 60 468.18 40.84 40.72

15 6 60 300 35.82 42.07

16 6 60 300 35.61 40.81

17 6 60 300 38.83 39.19

18 6 60 300 39.45 42.63

19 6 60 300 36.47 38.39

20 6 60 300 31.21 32.22

40

(a)

(b)

ภาพท 14 พนทผวตอบสนองสาหรบอทธพลของ pH และอณหภมตอรอยละการยอยสลายทกจกรรมของเอนไซม Collupulin MG เปน 300 หนวยตอกรมโปรตน (a) response surface plot (b) Contour plot

41

ซงมสมการอธบายความสมพนธทดทสดระหวางรอยละการยอยสลาย (% DH) กบคา pH (A) อณหภม (B) และกจกรรมของเอนไซม (C) คอ

% DH = 37.81 - 0.12 A + 3.01B + 5.89C + 1.10A2 + 0.45B2 - 1.39C2 - 0.71AB - 0.028AC (1) จากสมการท 1 จะเหนไดวาความสมพนธระหวาง pH (A) ตอรอยละการยอยสลายเปนเชง

ลบ นนกคอเมอ pH (A) เพมขน คารอยละการยอยสลายกจะลดตาลง แตในทางตรงกนขามหาก pH (A) ลดตาลง คารอยละการยอยสลายกจะเพมขนนนเอง ทงนเนองจากกรดไฮโดรคลอรกทใชในการปรบ pH ของตวอยางนนสงผลตอรอยละการยอยสลาย ซงสอดคลองกบการทดลองของ Chan และ Ma (1999) ทกลาววาการทรทเมนทโปรตนถวเหลองดวยกรดไฮโดรคลอรก ทมความเขมขนตงแต 0.01-0.3 นอรมล ในสภาวะกรดอยางออนนน จะสงผลใหรอยละการยอยสลายเพมสงขนตามความเขมขนของกรดทใช แตกไมไดทาลายพนธะเปปไทดในวงกวาง เปนเพยงผลขางเคยงจากปฏกรยายอยสลายดวยกรด

อณหภมและกจกรรมของเอนไซมนนสงผลในแงบวกตอรอยละการยอยสลาย กลาวคอเมอเพมหรอลดอณหภมและกจกรรมของเอนไซม คารอยละการยอยสลายเพมขนและลดลงตามไปเชนกน ทงนเนองมาจากการใหความรอนจะทาใหสวนบรเวณเรง (active site) ภายในโปรตนเปดออกมาและเพมความงายตอการจบกบโปรตนของเอนไซม (Rehman และ Shah, 2005)

จะเหนวาจากคาสมประสทธความถดถอย (regression coefficient) ระหวาง pH อณหภม และกจกรรมของเอนไซม สงผลตอรอยละผลผลตเชง linear และ quadratic และมเพยงกจกรรมของเอนไซมเทานนทมความสมพนธกบรอยละผลผลตอยางมนยสาคญทางสถต (p ≤ 0.05) (ภาพท 15) ซงจะสงผลเชงผลในเชงบวกตอรอยละผลผลต โดยสงเกตไดจากสมการท 2 ซงใชในการอธบายความสมพนธของรอยละผลผลต (% yield) กบ pH (A) อณหภม (B) และกจกรรมของเอนไซม (C) ดงน

% yield = 40.65 + 0.11A - 0.26B + 8.77C + 0.091A2 - 0.91B2 - 0.50C2 + 0.058AB - 0.25AC + 0.59BC (2) ผลการทดลองนสอดคลองกบ แพรวไพลนและคณะ (2552) ทพบวาโปรตนไฮโดรไลเซท

จากเหดหอมและเหดนางรมทยอยสลายดวยเอนไซมโบรมเลนทงสองชนดมรอยละผลผลตเพมขนเมอความเขมขนของเอนไซมเพมขนอยางมนยสาคญทางสถต (p ≤ 0.05)

ตอมาไดทาการหาสภาวะทเหมาะสมตอการผลต HVP ดวยการใชโปรแกรม design expert 6.0.5 โดยกาหนดขอจากดใหเปนสภาวะทใชเอนไซมทมกจกรรมของเอนไซมตาทสด แลวสามารถ

42

ผลต HVP ทมรอยละการยอยสลายและรอยละผลผลตไดสงทสด ภายใต pH และอณหภมทกาหนดไวตอนตน จงสามารถทานายได 3 สภาวะทสอดคลองตอขอจากดของสภาวะทตองการ (ภาคผนวก ข หนา 138) และเมอการทดลองเพอยนยนสภาวะทเหมาะสมทสด (ตารางท 7) (ผลของรอยละการยอยสลายและรอยละผลผลตแสดงดงภาคผนวก ข ตารางท 72-77) พบวาสภาวะท 1 สามารถผลต HVP ทรอยละการยอยสลายและรอยละผลผลตสงทสด และสภาวะ ท 3 นนสามารถผลต HVP ทมรอยละผลผลตสงไมแตกตางจากสภาวะท 1 แตไดรอยละการยอยสลายทตากวาสภาวะท 1 อยางมนยสาคญทางสถต ในขณะทสภาวะท 2 นนสามารถผลต HVP ทมรอยละการยอยสลายและรอยละผลผลตสงไมแตกตางจากสภาวะท 1 อยางมนยสาคญทางสถต ดงนนสภาวะทเหมาะสมทสดสาหรบการผลต HVP จากการยอยโปรตนสกดจากถวเหลองดวยเอนไซม Collupulin MG คอ สภาวะทมการยอยโปรตนสกดจากถวเหลองดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมของเอนไซมเปน 318.25 หนวยตอกรมโปรตนทชวง pH 5-6.5 และอณหภม 70 องศาเซลเซยส ซงจะนาไปทาการทดลองเพอหาระยะเวลาทเหมาะสมในการผลตตอไป

43

(a)

(b)

ภาพท 15 พนทผวตอบสนองสาหรบอทธพลของ pH และอณหภมตอรอยละผลผลตทกจกรรมของ

เอนไซม Collupulin MG เปน 300 หนวยตอกรมโปรตน (a) response surface plot (b) Contour plot

44

ตารางท 7 เปรยบเทยบและยนยนการคดเลอกสภาวะทเหมาะสมตอการยอยโปรตนสกดจาก ถวเหลองดวยเอนไซม Collupulin MG เปนเวลา 3 ชวโมง

สภาวะท pH อณหภม (องศาเซลเซยส)

กจกรรมของเอนไซม (หนวยตอกรมโปรตนซบสเตรท)

รอยละการยอยสลาย (% DH)


1 5.00 70 318.25 40.06 1.45a 32.60 0.43ab

2 6.29 70 320.23 39.06 1.58ab 31.41 0.92b 3 7.00 70 318.21 36.44 0.87b 33.49 0.75a

** ตวอกษร a, b ทแตกตางกนในแนวตง หมายถง มความแตกตางอยางมนยสาคญทางสถต (p≤0.05)

4. ระยะเวลาทเหมาะสมในการผลต HVP

จากการทดลองเพอหาระยะเวลาทเหมาะสมหลงจากทไดสภาวะทเหมาะสมสาหรบการผลต HVP แลว พบวาในชวงระยะเวลาททาการยอยโปรตนสกดจากถวเหลองดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมของเอนไซมเปน 318.25 หนวยตอกรมโปรตนทชวง pH 5-6.5 (ในการดาเนนการยอยกาหนดใหคา pH เทากบ 5) และอณหภม 70 องศาเซลเซยส เปนระยะเวลาตงแต 1-24 ชวโมง (ผลของรอยละการยอยสลายและรอยละผลผลตแสดงดงภาคผนวก ข ตารางท 78-91) พบวาการยอยเปนเวลา 24 ชวโมงนนใหคารอยละการยอยสลายทสงทสด แตไมแตกตางจากการยอยเปนเวลา 12 ชวโมงอยางมนยสาคญทางสถต รองลงมาเปนการยอยทเวลา 9 และ 6 ชวโมงซงไดรอยละการยอยสลายทไมแตกตางกน และการยอยทเวลา 3, 2 และ 1 ชวโมงนนไดรอยละการยอยสลายลดหลนกนลงมาตามลาดบ (ตารางท 8)

45

ตารางท 8 ผลของระยะเวลาตอโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 318.25 หนวยตอกรมโปรตนท pH 5.0 และอณหภม 70 องศาเซลเซยส

ระยะ เวลา ทใช

(ชวโมง)

รอยละการ ยอยสลาย (% DH)


คาส

L* a* b*

1 31.75 ± 2.19e 31.00 ± 1.95a 15.03 ± 0.85a -1.32 ± 0.23c 5.55 ± 1.66a

2 34.45 ± 2.33d 32.07 ± 0.87a 11.76 ± 0.13b -1.27 ± 0.21c 3.40 ± 0.49b

3 38.48 ± 0.74c 31.03 ± 0.94a 11.43 ± 0.49bc -1.18 ± 0.04bc 3.35 ± 0.41b

6 43.01 ± 0.68b 30.23 ± 0.74a 10.57 ± 0.14c -1.11 ± 0.03bc 3.15 ± 0.28b

9 43.18 ± 0.45b 30.35 ± 0.27a 09.60 ± 0.70d -1.01 ± 0.19bc 2.91 ± 0.82b

12 49.18 ± 1.88a 31.16 ± 1.25a 08.10 ± 0.63e -0.88 ± 0.34b 2.85 ± 0.27b

24 51.14 ± 1.10a 32.02 ± 0.69a 08.07 ± 0.37e -0.31 ± 0.02a 2.78 ± 0.05b

** ตวอกษร a, b, c, d, e ทแตกตางกนในแนวตง หมายถง มความแตกตางอยางมนยสาคญทางสถต (p≤0.05)

โดยอตราการเกดปฏกรยาของรอยละการยอยสลายนน เพมขนอยางรวดเรวในชวง 6

ชวโมงแรกของการยอยและจะลดลงในชวงเวลาหลงจากนน (ภาพท 16) ทงนอาจเนองมาจากการลดลงของพนธะเปปไทดทจาเพาะสาหรบการทางานของเอนไซม การยบย งของผลตภณฑ การหยดการทางานของเอนไซม รวมไปถงลกษณะภาวการณแขงขนระหวางวตถดบตงตน (โปรตนทยงไมถกยอย) และพนธะเปปไทดทสรางขนอยางตอเนองตลอดระยะเวลาการยอยสลาย (Netto และ Galeazzi, 1998)

46

ภาพท 16 ผลของระยะเวลาตอรอยละการยอยสลายโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวย

เอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 318.25 หนวยตอกรมโปรตนท pH 5.0 และอณหภม 70 องศาเซลเซยส

ดานรอยละผลผลตนนพบวาทการยอยดวยระยะเวลาตงแต 1 ชวโมง จนถง 24 ชวโมงไม

พบการเปลยนแปลงของรอยละผลผลตทได อาจเนองมาจากรอยละผลผลตทจะสงนนขนกบการละลายของโปรตนทสงขน (Palupi และคณะ, 2010) และสอดคลองกบ Wu และคณะ (2000) ทพบวาการยอยโปรตนสกดจากถวเหลองดวยเอนไซมปาเปน (papain) ท pH 5 เปนระยะเวลา 60 นาท จะทาใหเปปไทดทไดนนสามารถละลายไดเกอบทงหมด (รอยละ 89) ซงการยอยดวยเอนไซมปาเปนนอาจทาใหไดเปปไทดในขนาดเลกลงและมการปลดปลอยหมทชอบนา (hydrophilic group) ออกมามากขนดงนนจงทาใหรอยละผลผลตหลงจากการยอยเปนระยะเวลา 1 ชวโมงเปนตนไปไมเกดการเปลยนแปลง

47

ภาพท 17 อทธพลของระยะเวลาตอคา L* ของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวย


นอกจากนระยะเวลาทใชในการผลต HVP นนยงสงอทธพลตอคาความสวาง (L*), คาส

แดง-เขยว (a*) และคาสเหลอง-นาเงน (b*) ของผลตภณฑทไดอกดวย (ภาคผนวก ข ตารางท 92)โดยจะเหนวาความสวางและคาสเหลอง-นาเงนมแนวโนมทจะลดตาลงเมอระยะเวลาทใชในการยอยนนเพมมากขน และคาสแดง-เขยวมแนวโนมทจะเพมสงขนเมอระยะเวลาทใชในการยอยนนเพมมากขน (ภาพท 17) ซงสอดคลองกบงานวจยของ Palupi และคณะ (2010) ทพบวา เมอระยะเวลาทใชในการยอยสลายโปรตนเหดฟาง (Volvariella volvaceae) ดวยเอนไซมปาเปนเพมมากขน ไฮโดรไลเซทจะมสทเขมขน โดยอาจเนองมาจากระยะเวลาทใชในการยอยสลายทนานขน จะทาผลตเปปไทดในปรมาณทมากขน ซงเปนแหลงเอมนปฐมภม (primary amine) ทสามารถเกดปฏกรยาเมลลารดรวมกบกลโคสทมอยในองคประกอบคารโบไฮเดรตในวตถดบกเปนได ดงนนอาจกลาวโดยสรปไดวาระยะเวลา 12 ชวโมงเปนระยะเวลาทเหมาะสมในการผลต HVP จากการยอยโปรตนสกดจากถวเหลองดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมของเอนไซมเปน 318.25 หนวยตอกรมโปรตน ชวง pH ท 5-6.5 และอณหภม 70 องศาเซลเซยส เนองจากระยะเวลา 12 ชวโมงนนเปนระยะเวลาทสนและประหยดตนทนมากกวาระยะเวลา 24 ชวโมง

48

5. พฒนาโปรตนไฮโดรไลเซททไดจากการยอยโปรตนถวเหลองสกดโดยใชเอนไซมเปนสารใหกลนรส การนา HVP ไปใชเปนสารปรงแตงกลนรสอาหาร ตองคานงถงปรมาณทเหมาะสม เนองจากถาใชในปรมาณทสงเกนไป อาจทาใหเกดตนทนในการผลตสงหรอถาใชในปรมาณนอยเกนไปอาจไมชวยเสรมใหกลนรสของอาหารดขน ทงนขนอยกบชนดและลกษณะเฉพาะตวของอาหารนนๆดวย

แมวาโปรตนไฮโดรไลเซทเขมขนทผลตจาก Collupulin MG มกรดอะมโนเปนองคประกอบ ซงมบทบาทในการเปนสารตงตนของปฏกรยาการเกดกลนรสเนอสตว (Pendergast, 1973) โดยเกดปฏกรยาเมลลารดระหวางกรดอะมโนกบนาตาลรดวซหรอสารประกอบคารบอนลทมอยในโปรตนไฮโดรไลเซทในภาวะทอณหภมสง แตปรมาณทมอยเปนปรมาณทไมสามารถทาใหเกดกลนรสเนอเฉพาะได ในการทดลองมการเตมซสทอนเพมอก เนองจากตองการใหเกดปฏกรยากบนาตาลไรโบสซงเปนนาตาลรดวซทเตมลงไป เพอใหเกดกลนรสไกทเดนชด เนองจากโปรตนไฮโดรไลเซทมกรดอะมโนและนาตาลรดวซหลายชนด เมอใหความรอนเพอเกดปฏกรยาเมลลารดอาจไดกลนรสเนอสตว ทไมสามารถบงชประเภทของกลนรสเนอสตวได (Varavinit และคณะ, 2000) อยางไรกตาม กลนรสเนอสตวยงขนอยกบสภาวะการผลต ชนดและระดบของสารตงตนในการเกดกลนรสเนอสตวแตละชนด (Hofmann และ Schieberle, 1997) ดงนนโปรตนไฮโดรไลเซทจงเปนสวนผสมทสาคญในอตสาหกรรมการผลตสารปรงแตงกลนรส โดยเฉพาะการผลตสารใหกลนรสเนอ สาระสาคญทใหกลนไกซงเกดจากปฏกรยาเมลลารด ไดแก 2-methyl-3-furanthiol, 2-furfurylthiol, methionol,2,4,5-trimethyl-thiazole, nonanol และ 2-transnonenal รวมทงรสชาตทเกดขนในโปรตนไฮโดรไลเซทซงเกดจากกรดอะมโนชนดตางๆ (Nagodawithana และ Reed, 1991)

เมอทาการทดสอบดานประสาทสมผสดวยวธ generic descriptive analysis ระหวางกลนรสไกทางการคากบกลนรสไกทผลตจากกระบวนการ thermal process flavor โดยใช HVP ทมความเขมขนแตกตางกนและนามาวเคราะหความแตกตาง (ตารางท 9) พบวา - การทดสอบดานความเขมสพบวากลนรสไกทางการคามความแตกตางอยางมนยสาคญทางสถตทระดบความเชอมน p≤0.05 กบกลนรสไกทผลตจากกระบวนการ thermal process flavor ทม HVP รอยละ 5, 15 และ 25 เปนสวนประกอบ โดยพบวาสของกลนไกทางการคามสทออนกวากลนรสไกทผลตจากกระบวนการ thermal process flavor - การทดสอบดานกลนรสไกของกลนรสไกทางการคาไมมความแตกตางอยางมนยสาคญทางสถตทระดบความเชอมน p≤0.05 กบกลนรสไกทผลตจากกระบวนการ thermal process flavor ทม HVP รอยละ 15 เปนสวนประกอบ แตพบวามความแตกตางอยางมนยสาคญทางสถตทระดบความเชอมน

49

p≤0.05 กบกลนรสไกทผลตจากกระบวนการ thermal process flavor ทม HVP รอยละ 5 และ 25 โดยพบวากลนรสไกทางการคามกลนรสไกทเขมกวากลนรสไกทผลตจากกระบวนการ thermal process flavor อาจเนองจากในกระบวนการผลตกลนรสไกทางการคามการเตมสวนผสมทไปชวยในการเสรมใหกลนรสไกเขมขน - การทดสอบดานความหวานของกลนรสไกทางการคาแตกตางอยางมนยสาคญทางสถตทระดบความเชอมน p≤0.05 กบกลนรสไกทผลตจากกระบวนการ thermal process flavor ทม HVP รอยละ 5, 15 และ 25 เปนสวนประกอบ โดยพบวากลนรสไกทางการคามความหวานมากกวากลนรสไกทผลตจากกระบวนการ thermal process flavor อาจเนองจากกลนรสไกทางการคามการเตมวตถดบชนดอนเพอเปนการเสรมรส - การทดสอบดานความขมของกลนรสไกทางการคาไมมความแตกตางอยางมนยสาคญทางสถตทระดบความเชอมน p≤0.05 กบกลนรสไกทผลตจากกระบวนการ thermal process flavor ทม HVP รอยละ 5, 15 และ 25 เปนสวนประกอบ โดยพบวากลนรสไกทางการคามความขมนอยกวากลนรสไกทผลตจากกระบวนการ thermal process flavor

ผลการทดลองนสอดคลองกบการทดลองของไพลน (2548) ซงไดทาการผลตสารปรงแตงกลนรสจากกากถวเขยวโดยใชเอนไซม Flavourzyme® ในการยอย และนา HVP ทคดเลอกจากสภาวะทดทสดมาทาใหเขมขนและนามาใชในกระบวนการ thermal process flavor ในปรมาณ รอยละ 10 มคะแนนการยอมรบทางประสาทสมผสดานกลนและรสชาตสงทสดเมอเปรยบเทยบกบทรอยละ 5

50

ตารางท 9 ผลการทดสอบดานประสาทสมผสของกลนรสไกทผานกระบวนการ thermal process flavor โดยม HVP ทความเขมขนตางกนเปนสารตงตน

ตวอยาง ส กลนรสไก ความหวาน ความขม

Commercial chicken flavor

8.10±0.75b 12.53±0.22a 12.54±0.39a 5.55±0.34a

Thermal process flavor (HVP5%)

10.44±0.26a 08.31±0.30b 09.30±0.32b 6.75±0.35a


10.86±0.32a 11.55±0.24a 09.30±0.32b 6.24±0.33a


11.22±0.50a 09.54±0.24b 09.15±0.28b 6.75±0.49a

** ตวอกษร a, b ทแตกตางกนในแนวตง หมายถง มความแตกตางอยางมนยสาคญทางสถต (p≤0.05)

6. วเคราะหองคประกอบของสารใหกลนรสไก กรดอะมโนทมอยในผลตภณฑโปรตนไฮโดรไลเซทและทเตมลงไปมบทบาทในการเปนสารตงตนของปฏกรยาการเกดกลนรสเนอสตว โดยเฉพาะกรดอะมโนทมซลเฟอรเปนองคประกอบ เชน ซสทอน และเมทไธโอนน (Varavinit และคณะ 2000) โดยทาปฏกรยากบนาตาลรดวซหรอสารประกอบคารบอนลทมอยในโปรตนไฮโดรไลเซทในสภาวะทอณหภมสง โดยปฏกรยาทเกดนเรยกวาปฏกรยาเมลลารด ดงนนโปรตนไฮโดรไลเซทจงเปนสวนผสมทสาคญในอตสาหกรรมการผลตกลนรสโดยเฉพาะการผลตสารใหกลนรสเนอ โดยเมอนาตวอยางกลนรสไกทผลตจากกระบวนการ thermal process flavor โดยใช HVP ทมความเขมขนรอยละ 5, 15 และ 25 ไปวเคราะหสารหอมระเหยดวยเครอง GC-MS พบวามสารประกอบหอมระเหยทสาคญอย 4 กลม ไดแก Furans, Sulfurs, Alkanes และ Pyrazines โดยพบทสารทสาคญคอ 1,2-Furanylethanone และ 4,5-Dimethylthiazole โดยพบท retention time เทากบ 6.61 และ 17.26 ตามลาดบ ดงภาพท 18

51

ภาพท 18 Chromatograms of thermal process flavor (a = HVP รอยละ5, b = HVP รอยละ15, c = HVP รอยละ25)

(b)

4,5-Dimethylthiazole (a)

(c)

4,5-Dimethylthiazole


1,2-Furanylethanone

1,2-Furanylethanone

1,2-Furanylethanone

52

จากการวเคราะหองคประกอบสารหอมระเหยทง 4 กลมพบสารประกอบทมปรมาณมากทสดคอ 4,5-Dimethylthiazole ดงตารางท 10 และเมอทาการเปรยบเทยบสารหอมระเหยของกลนรสไกทผลตจากกระบวนการ thermal process flavor ทประกอบดวย HVP ความเขมขนรอยละ 5, 15 และ 25 จะพบสารประกอบหอมระเหยกลมซลเฟอรมปรมาณมากทสด (ภาพท 19) อาจเนองจากในกระบวนการ thermal process flavor มการเตมซสเทอนเพมลงไป ซงสารกลมซลเฟอรเปนสารประกอบหอมระเหยกลมสาคญทใหกลนรสเนอสตว ตารางท 10 ผลการวเคราะหปรมาณสารหอมระเหยทไดจากการกระบวนการ thermal process

flavor ทใชปรมาณ HVP ความเขมขนรอยละ 5, 15 และ 25 และกลนรสไกทางการคา Retention time

(min) Compounds

ปรมาณสาร (µg/g dry wt.)

HVP 5% HVP 15% HVP 25% Commercial

16.35 Tridecane - 0.015 - -

18.63 Cyclododecane 0.016 - - -

21.25 Hexadecane 0.014 0.008 0.006 0.008

23.21 Octadecane 0.003 0.003 - 0.006

25.42 Nonadecane - 0.001 0.001 -

2.31 2-Methylfuran - 0.009 - -

6.61 1,2-Furanylethanone 0.063 0.089 0.137 0.075

9.57 2,2'-Bifuran - 0.013 0.004 -

5.40 Methimazole 0.423 0.089 0.352 0.025

13.08 2,4-Dimethyl-5-

propylthiazole

- 0.008 - -

17.28 4,5-Dimethylthiazole 0.018 0.535 0.078 0.128

24.17 Cyclic octaatomic sulfur 0.007 - - -

4.52 Methylpyrazine - 0.002 - -

12.55 2-Methyl-6-

methylthiopyrazine

- - 0.007 -

53

ภาพท 19 องคประกอบสารหอมระเหยทใช HVP รอยละ 5 (a), HVP รอยละ 15 (b) และ

HVP รอยละ 25 (c) ในกระบวนการผลตสารใหกลนรส

Pyrazines

(µg/g

dry w

t.)

(a)

(b)

(c)

(µg/g

dry w

t.) (µg

/g dr

y wt.)

ปรมา

ณสาร

หอมร

ะเหย

ปรมา

ณสาร

หอมร

ะเหย

ปรมา

ณสาร

หอมร

ะเหย

Alkanes Sulfurs Furans Pyrazines

54

ภาพท 20 เปรยบเทยบองคประกอบสารหอมระเหยทใช HVP รอยละ5 , HVP รอยละ15 และ

HVP รอยละ25 และกลนรสไกทางการคา

เมอนากลนรสทผลตจากกระบวนการ thermal process flavor (ความชนรอยละ 57.24)ไปทาการวเคราะหเทยบกบกลนรสไกทางการคา (ความชนรอยละ 1.9) ดงแสดงในภาพท 20 chromatograms จากภาพพบวาปรมาณสารประกอบฟรานจากกระบวนการ thermal process flavor ทประกอบดวย HVP รอยละ 25 มปรมาณสารประกอบฟรานมากทสด อาจเนองจากทความเขมขนรอยละ 25 มปรมาณ HVP มากทสดและ HVP ทผลตขนนวตถดบตงตนคอถวเหลอง และปรมาณสารประกอบฟรานจากกระบวนการ thermal process flavor ทประกอบดวย HVP รอยละ 15 พบวามปรมาณสารประกอบซลเฟอร ซงเปนองคประกอบทใหกลนรสเนอสตวมากกวา HVP รอยละ 5, 25 และกลนรสไกทไดจากการคา ดงแสดงในตารางท 12 ซงสอดคลองกบการทดสอบทางประสาทสมผสทพบวาผทดสอบใหการยอมรบกลนรสไกทประกอบดวย HVP รอยละ 15 มากทสดเมอเปรยบเทยบกบกลนรสไกทประกอบดวย HVP รอยละ 5 และ 25 อาจเนองจากปจจยทมผลตอกลนทผลตในกระบวนการ thermal process flavor ซงไดแกปรมาณของกรดอะมโนและคาการละลายทตางกน (Whitaker และ Tannenbaun, 1977) กลาวคอทความเขมขนของ HVP รอยละ 5 มปรมาณกรดอะมโนอยนอยเกนไปและทความเขมขนของ HVP รอยละ 25 มปรมาณนาอยนอยทาใหวตถดบบางตวละลายไดไมหมด เนองจากในปฏกรยาเมลลารดตองการนาในปรมาณทพอเหมาะเพอทาใหสวนผสมละลาย ซงความสามารถในการละลายของวตถดบแตละตวเปนดงตารางท 11 ซงจะเหนไดวา cysteine ตองการนารอยละ 35 จงจะทาให cysteine เกดการละลายได

(µg/g

dry w

t.) ปร

มาณส

ารหอ

มระเห

ย

55

ตารางท 11 คาการละลายของวตถดบทใชทอณหภม 20 องศาเซลเซยส วตถดบ ความสามารถในการละลาย (กรม/100 มลลลตร) Cysteine 0065.00.00 Glyciene 0025.00.00 Glucose 87.67

ทมา : MSDS (2006)

และเมอนาสารหอมระเหยมาทไดจากกระบวนการ thermal process flavor มาวเคราะหคณลกษณะของกลนแตละชนดพบวา 4,5-Dimethylthiazole ใหคณลกษณะเปนกลนรสไก และ 1,2-Furanylethanone ใหคณลกษณะกลนถว ซงคณลกษณะแสดงดงตารางท 13

ตารางท 12 เปรยบเทยบสารหอมระเหยทไดจากกระบวนการ thermal process flavor และกลนรส

ไกทางการคา

ตวอยาง ปรมาณสารประกอบหอมระเหย (µg/g dry wt.)

Alkanes Furans Sulfurs Pyrazines

Thermal process flavor (5%HVP) 0.034 0.063 0.447 0.000

Thermal process flavor (15%HVP) 0.027 0.110 0.631 0.002

Thermal process flavor (25% HVP) 0.007 0.140 0.430 0.007

Commercial chicken flavor 0.014 0.075 0.153 0.000

ตารางท 13 คณลกษณะของกลนรสไกทไดจากกระบวนการ thermal process flavor Compounds Odor descriptions Threshold

Hexadecane Sweet, oily - 4,5-Dimethylthiazole roasted, meaty, boiled poultry-like odour - 2-Methylfuran beany,grassy - 1,2-Furanylethanone nutty 4*10-3 mg/kg 2,2'-Bifuran green,beany 6*10-3 mg/kg Methylpyrazine nutty,roasted peanut 0.6*1 mg/kg ทมา : Henk (1991) และ George (2010)

56

(a)

(b)

ภาพท 21 Chromatograms กลนรสไกจากกระบวนการ thermal process flavor (HVP รอยละ15) (a) เปรยบเทยบกบ Chromatograms ของกลนรสไกทางการคา (b)

จากผลการทดลองทงหมดสามารถสรปไดวาสภาวะทเหมาะสมสาหรบการผลตโปรตนไฮโดรไลเซทจากโปรตนถวเหลองสกดคอสภาวะทมการยอยโปรตนสกดจากถวเหลองดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมของเอนไซมเปน 318.25 หนวยตอกรมโปรตนท pH 5-6.5 และอณหภม 70 องศาเซลเซยส ระยะเวลา 12 ชวโมง และเมอนา HVP ดงกลาวไปใชเปนสารตงตนในการผลตสารใหกลนรสไกพบวาท HVP รอยละ 15 ใหสารประกอบ 4,5-Dimethylthiazole ซงเปนสารทมคณลกษณะใหกลนรสไกในปรมาณมากทสด

1,2-Furanylethanone


1,2-Furanylethanone


57

บทท 5 สรปผลการทดลอง

จากการศกษาเพอหาสภาวะทเหมาะสมในการผลตโปรตนไฮโดรไลเซทจากโปรตนสกดจากถวเหลองทมองคประกอบทางเคมเปนรอยละโปรตน ไขมน เถา ความชน เยอใย และคารโบไฮเดรตเทากบ 85.31 0.28, 0.11 0.002, 4.14 0.18, 6.74 0.05, 0.08 0.005 และ 3.63 ตามลาดบ แลวผานการยอยดวยเอนไซมทางการคาชนดตาง ๆ พบวาเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมของเอนไซมตงตนตาทสดเปน 73.87 3.53 หนวยตอกรมของแขง และสามารถยอยโปรตนสกดจากถวเหลองไดรอยละการยอยสลายและรอยละผลผลตสงทสด คอ 27.55 4.41 และ 23.24 0.75 และเมอนามาทดสอบสภาวะทเหมาะสมดวยการออกแบบแบบพนผวตอบสนอง พบวา pH (A) อณหภม (B) และกจกรรมของเอนไซม (C) สงผลตอรอยละการยอยสลายเชง

quadratic มสมการอธบายความสมพนธเปน %DH = 37.81 - 0.12 A + 3.01B + 5.89C + 1.10A2 +

0.45B2 - 1.39C2 - 0.71AB - 0.028AC + 0.72BC และมความสมพนธตอรอยละการยอยสลายอยางมนยสาคญทางสถต (p ≤ 0.05) โดยท pH มความสมพนธเชงลบตอรอยละการยอยสลาย สวนอณหภมและกจกรรมของเอนไซมนนสงผลในแงบวกตอรอยละการยอยสลาย และสงผลตอรอยละผลผลตเชง linear และ quadratic มสมการทใชในการอธบายความสมพนธเปน %yield = 40.65 +

0.11A - 0.26B + 8.77C + 0.091A2 - 0.91B2 - 0.50C2 + 0.058AB - 0.25AC + 0.59BC แตมเพยงกจกรรมของเอนไซมเทานนทมความสมพนธกบรอยละผลผลตอยางมนยสาคญทางสถต (p ≤ 0.05) ซงสงเชงผลในเชงบวกตอรอยละผลผลต แลวสามารถหาสภาวะทเหมาะสมตอการผลต HVP ไดเปนสภาวะทมการยอยโปรตนสกดจากถวเหลองดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมของเอนไซมเปน 318.25 หนวยตอกรมโปรตน ท pH 5-6.5 และอณหภม 70 องศาเซลเซยส ระยะเวลา 12 ชวโมงซงทาใหมรอยละการยอยสลายและรอยละผลผลตเปน 49.18 1.88 และ 31.16 1.25

ตามลาดบ เมอนา HVP ทผลตไดไปทาใหเขมขนเพอใชเปนสารตงตนในการผลต thermal process flavor กลนไกแลวนาไปวเคราะหองคประกอบดวยเครอง GC-MS พบองคประกอบสารใหกลนรส 4 กลมไดแก Furans, Sulfurs, Alkanes และ Pyrazines ซงสารประกอบทสาคญทพบคอ 1,2-Furanylethanone ซงใหคณลกษณะของกลนถว โดยพบสาร 1,2-Furanylethanone ในกลนรสทผลต

58

จากกระบวนการ thermal process flavor ทใช HVP รอยละ 25 ในปรมาณมากทสด คอมปรมาณเทากบ 0.137 ไมโครกรมตอกรมนาหนกแหงและทรองลงมาคอท HVP รอยละ 5 และรอยละ 15 ซงปรมาณเทากบ 0.063 และ 0.089 ไมโครกรมตอกรมนาหนกแหง ตามลาดบ และพบสาร 4,5-Dimethylthiazole ซงใหคณลกษณะกลนไกโดยพบสาร 4,5-Dimethylthiazole ในกลนรสทผลตจากกระบวนการ thermal process flavor ทใช HVP รอยละ 15 ในปรมาณมากทสด คอมปรมาณเทากบ 0.535 ไมโครกรมตอกรมนาหนกแหงและทรองลงมาคอท HVP รอยละ 25 และรอยละ 5 ซงปรมาณเทากบ 0.078 และ 0.018 ไมโครกรมตอกรมนาหนกแหง ตามลาดบ

59

รายการอางอง

คงศกด สหะศกดมนตร. 2544. การพฒนากรรมวธการผลตนาซอสปรงรสโดยใชเอนไซมเพอลดสาร3-MCPD. วทยานพนธปรญญาวทยาศาสตรมหาบณฑต สาขาพฒนาผลตภณฑ อตสาหกรรมเกษตร. คณะอตสาหกรรมการเกษตร. มหาวทยาลยเกษตรศาสตร. 106 หนา.

จรวฒน ยงสวสดกล. 2541. เอกสารประกอบการสอนเรอง Food enzyme. สานกวชาเทคโนโลย อาหาร. คณะเทคโนโลยการเกษตร มหาวทยาลยเทคโนโลยสรนาร. ณฏฐา เลาหกลจตต อรพน เกดชชน และ ทรงศลป พจนชนะชย. 2548. การสกดโปรตน ไฮโดรไลเซสเปนสารปรงแตงกลนรสทมสาร 3-MCPD ตา. สาขาเทคโนโลยชวเคม คณะทรพยากรชวภาพและเทคโนโลย มหาวทยาลยเทคโนโลยพระจอมเกลาธนบร. ปราณ อานเปรอง. 2543. เอนไซมทางอาหาร. พมพครงท 3. จฬาลงกรณมหาวทยาลย. กรงเทพฯ. 440 หนา. พชรา วระกะลส. 2543. เอนไซม. พมพครงท 2. จฬาลงกรณมหาวทยาลย. กรงเทพฯ. 344 หนา. แพรวไพลน ตนตบตร ณฎฐา เลาหกลจตต อรพน เกดชชน และ ปนดา บรรจงสนศร. 2552.

คณสมบตของการยอยสลายเหดดวยเอนไซมโบรมเลนสาหรบใชเปนสารปรงแตงกลนรส. วทยาศาสตรเกษตร. 40(3): 101-104.

ไพลน เพชรทวพรเดช. 2548. การผลตสารปรงแตงกลนรสจากกากถวเขยวโดยใชเอนไซม โปรตเอส. สาขาวชาเทคโนโลยชวเคม. คณะทรพยากรชวภาพและเทคโนโลย. มหาวทยาลยเทคโนโลยพระจอมเกลาธนบร. 56 หนา.

สานกงานคณะกรรมการอาหารและยา. 2544. การวเคราะหการปนเปอนสารกอมะเรง 3-MCPD ในซอสปรงรส. LAB. Today. ปท 1. สงหาคม. หนา 25-29. สปราณ แยมพราย. 2539. การผลตโปรตนไฮโดรไลเซทจากของเหลอจากโรงงานผลตซรมเพอใช

เปนอมลซไฟเออร. สาขาวชาวทยาศาสตรการอาหาร ภาควชาวทยาศาสตรและเทคโนโลยการอาหารคณะอตสาหกรรมการเกษตร มหาวทยาลยเกษตรศาสตร. 119 หนา.

อตสาหกรรมเครองเทศเครองปรงรส. 2551. http://library.cmu.ac.th/rsc/?writereport.php&contid =3. สบคนวนท 2 สงหาคม 2554.

Aaslyng, D.M., Magnl, M., Leif, P., Per, N., Hanne, F. and Lone, M.L. 1998. Chemical and sensory characterization of hydrolyzed vegetable protein, a savory flavoring. Journal

of Agricultural and Food Chemistry. 46: 481-489. Adler-Nissen, J. 1986. Enzymic hydrolysis of food protein. Vanderbilt New York. 421 p.

60

Antonov, V.K. 1993. Chemistry of proteolysis, Springer-Verlag Berlin. Germany. 33-96. Boudreau, J.C. 1979. Food Taste Chemistry. ACS Symposium series. 262 p. Chan, W. M. and Ma, C. Y. 1999. Acid modification of protein from soymilk residue (okara).

Food Research International. 32: 119-127. Chanikan, S., Natta, L., and Orapin, K. 2011. Physicochemical and flavor charateristics of

flavoring agent from mungbean protein hydrolyzed by bromelain. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 59: 8475-8483.

Charles, H.M. and Sajid A. 1995. The development of process flavors. Trends in Food Science and Technology. 6: 46.

Chuan, H.T., Xian, S. W. and Xian, Q. Y. 2009. Enzymatic hydrolysis of hemp (Cannabis sativa L.) protein isolate by various proteases and antioxidant properties of the resulting hydrolysates. Journal of Food Chemistry. 114: 1484-1490.

Cigic, B. and Zelenik-Blatnik, M. 2004. Preparation and characterization of chicken egg white hydrolysate. Acta Chemistry. 51: 177-188.

Cupp-Enyard, C. 2008. Sigma’s non-specific protease activity assay-Casein as a substrate. Journal of Visualized Experiments. 19: 899.

Dzanic, H., Mujic, I.and Sudarski-Hack V. 1985. Protein hydrolysates from soy grits and dehydrated alfalfa flour. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 33: 683–685.

Eskin, N.A. and Henderson, H. M. 1971. Biochemistry of food, Academic Press. 240 p. George, A.B. 2010. Fenaroli’s handbook of flavor ingredients. 6th ed. Taylor and Francis Group.

New York. 1827 p. Greenberg, N.A. and Shipe, W.F. 1979. Comparison of abilities of TCA, picric, sulphosalicylic

and tungstic acids to precipitate protein hydrolysates and proteins. Journal of Food Science. 44: 735-737.

Guowan, S., Jiaoyan, R., Bao, Y., Chun, C. and Mouming, Z. 2011. Comparison of hydrolysis characteristics on defatted peanut meal proteins between a protease extract from Aspergillus oryzae and commercial proteases. Journal of Food Chemistry. 126: 1306–1311.

Henk, M. 1991. Volatile compoumds in food and Beverages. 1st. Marcell Dekkder, INC. New york. 784 p.

61

Henn, R.L., and Netto, F.M. 1998. Biochemical Characterization and enzymatic hydrolysis of different commercial soybean protein isolates. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 46: 3009-3015.

Hofmann, T., and Schieberle, P. 1997. Identification of potent aroma compounds in thermally treated mixtures of glucose/cysteine and rhamnose/cysteine using aroma extract dilution techniques. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 45: 898-906.

Jantawat, P., Chinprahast, N. and U. Siripatrawan. 1998. Effects of hydrolysing conditions on chemical and sensory properties of hydrolysed mungbean protein. Journal of the Scientific

Society. 24: 147–154. Kaempfen, M. 1995. Ingredients-purely a matter of taste conditions on chemical and sensory

properties of hydrolysed mungbean protein. Journal of the Scientific Society of Thailand. 24: 147-154.

Kamchoom, V., Oupadissakoon, C. and Suwonsichon T. 2010. Sensory characteristics and categorization of pineapple paste from 2 varieties of pineapple. Master Thesis major field agro-industrial product development, department of product development, Kasetsart University.

Kong, X., Guo, M., Hua, Y., Cao, D. and Zhang, C. 2008. Enzymatic preparation of immune- modulating hydrolysates from soy proteins. Bioresource Technology. 99: 8873–8879. Manley, C.H., Choudhury, H.B. and Mazeika, P. 1999. Food Flavorings. Maryland. 283-323. Manley, C.H. and Fagerson, I.S. 1971. Aspects of aroma and taste characteristics of hydrolyzed

vegetable protein. The Flavor Industry. 2(12): 686-690. Manley, C.H., McCann, J.S. and Swane, R.L.Jr. 1981. The Chemical base of the taste and flavor

enhancing properties of hydrolyzed protein. The Quality of Food and Beverage Chemistry and Technology. 1: 61-82.

MSDS. Material Safety Data Sheet according to 1907/2006/EC. Meynier, A., and Mottram, D. S. 1995. The effect of pH on the formation of volatile compound

in meat-related model systems. Food Chemistry. 52: 361–366. Mottram, D.S. 1992. The chemistry of meat flavor. Meat Focus International. 87-93. Mutilangi, W.A.M., Panyam, D., and Kilara, A. 1996. Functional properties of hydrolysates from

proteolysis of heat-denatured whey protein isolate. Journal of Food Science. 61: 270-274.

62

Nagodawithana, T.W. and Reed, G. 1991. Yeast technology. 2nd. Van Nostrand Reinhold. New York. 454 p.

Netto, F.M. and Galeazzl, M.A.M. 1998. Production and characterization of enzymatic hydrolysate from soy protein isolate. Academic Press. 624-631.

Nielsen, P.M., Petersen, D., and Dambmann, C. 2001. Improved method for determining food protein degree of hydrolysis. Journal of Food Chemistry and Toxicology. 665: 642-646. Olsman, H. 1979. Hydrolyzed and autolyzed vegetable protein as functional food ingredients.

Journal of the American Oil Chemists’ Society. 56(3): 375-376. Palupi, N.W., Windrati, W.S. and Tamtarini. 2010. The effect of enzymatic hydrolysis on the

properties of protein hydrolysate from paddy mushroom. Makara, Teknologi. 14(2): 73-76.

Patel, K. and Borchardt, R. T. 1990. Chemical pathways of peptide degradation II. Kinetics of deamidation of an asparaginyl residue in a model hexapeptide. Pharmaceutical

Research. 7: 703–711. Pendergast, K. 1973. Versatility of Proteins Hydrolysate. Food Manufacture. 48(4): 37-39. Rehman, Z. and Shah, W.H. 2005. Thermal heat processing effects on antinutrients, protein and

starch digestibility of food legumes. Food Chemistry. 91: 327-331 Roach, D., and Gehrke, C.W. 1970. The hydrolysis of proteins. Journal of Chromatography.

52(5): 393-404. Sahasakmontri, K. 2001. Process Development of seasoning sauce using enzyme to reduce 3-

MCPD substance. Master Thesis major field agro-industrial product development, department of product development, Kasetsart University.

Shahidi, F. 1994. Flavor of meat and meat products. Blackie Acadimic and Professional. London. 298 p.

Siam victory chemicals Co.,Ltd. 2012. Product specification of Collupulin MG. Thailand. Sonklin, Ch., Laohakunjit, N. and Kerdchoechuen, O. 2010. Encapsulation Technique of chicken

flavor from protein hydrolysate. Journal of Agricultural Science. 41: 629-632. Sonklin, C., Laohakunjit, N. and Kerchoechuen, O. 2011. Physicochemical and flavor

charateristics of flavoring agent from mungbean protein hydrolyzed by bromelain. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 59: 8475-8483.

63

Su, G., Ren, J., Yang, B., Cui, C. and Zhao, M. 2011. Comparison of hydrolysis characteristics on defatted peanut meal proteins between a protease extract from Aspergillus oryzae and commercial proteases. Food Chemistry. 126: 1306-1311.

Tarky, W., O.P. Agawara and G.M. Pigott. 1973. Protein hydrolysate from waste. Journal of Food Science. 38: 917-918

Tavano, O.L. 2013. Protein hydrolysis using proteases: an important tool for food biotechnology. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 90: 1-11.

Trakanchaiwong, R. 2002. The Production of low fat Protein hydrolysate from surimi industry by-product. Master thesis major field food science, department of food science and technology , Kasetsart University.

Varavinit, S., Shobsngob, S., Bhidyachakorawat, M. and Suphantharika, M. 2000. Production of meat-like flavor. Science asia. (26): 219-224.

Watson, R.R. 1979. Substrate specificities of aminopeptidases: a specific method for microbial differentiation. Method in Microbilolgy. (9): 1-14.

Whitaker, J.R. and Tannenbaun, S.R. 1977. Food Proteins. AVI Publ. Co. Inc. Westport. Connecticut. 337-346.

Whitaker, J.R. 1994. Principle of enzymology for the food science. Marcel Dekker. New York. 625 p.

Wu, Y.F., Baek, H.H., Gerard, P.D. and Cadwallader, K.R. 2000. Development of a meat-like process flavoring from soybean-based enzyme-hydrolyzed vegetable protein (E-HVP).

Journal of Food Science. 65 (7): 1220-1227. Xiaohong, L., Ping L., Shuquin X., Chengsheng J., Daniel M., Xiaoming Z., Wenshui X.,

Huaixiang T. and Zuobing X. 2010. Temperature effect on the non-volatile compounds of maillard reaction products derived from xylose-soybean peptide system : Further insights into thermal degradation and cross-linking. Journal of Food Chemistry. 120: 967-972. Xingfeng, G., Shaojun T. and Darryl M. S. 2010. Generation of meat-like flavourings from

enzymetic hydrolysates of proteins from Brassica sp. Journal of Food Chemistry. 119: 167-172.

64

Yu, S.Y. and Tan, L.K. 1990. Acceptibility of creaker (Keropok) with fish protein hydrolysate. International Journal of Food Science and Technology. 25: 204-208.

ภาคผนวก

ภาคผนวก ก

67

วธวเคราะหคณภาพทางเคม

1. การวเคราะหปรมาณความชน (Moisture) (AOAC, 1990) 1.1 วธการวเคราะห อบจานอลมเนยมพรอมดวยฝาปดในตอบลมรอน ทอณหภม 105 องศาเซลเซยส นาน 6 ชวโมง นามาใสเดซกเคเตอร (desicator) ทงไวใหเยน จากนนนาไปชงหานาหนกทแนนอน ชงตวอยางทจะวเคราะหใสในจานอลมเนยมใหไดนาหนกทแนนอนประมาณ 2-5 กรม แลวนาเขาอบทตอบลมรอนทอณหภม 105 องศาเซลเซยส นาน 6 ชวโมง นามาใสเดซกเคเตอรทงไวใหเยน นามาชงนาหนก แลวนาตวอยางไปอบซ าอกครงจนไดนาหนกคงท 1.2 วธการคานวณ รอยละของปรมาณความชน = (W2 - W3) x 100 (W2 – W1) เมอ W1 คอ นาหนกของจานอลมเนยม หนวยเปนกรม W2 คอ นาหนกของจานอลมเนยมและตวอยางกอนอบ หนวยเปนกรม W3 คอ นาหนกของจานอลมเนยมและตวอยางหลงอบ หนวยเปนกรม 2. การวเคราะหปรมาณโปรตนโดยใชวธเจลดาล (Crude protein, CP) (AOAC, 1990) 2.1 อปกรณทใชวเคราะห 2.1.1 ขวดยอยโปรตน (Kjeldahl flask) ขนาด 250 มลลลตร 2.1.2 ชดกลนโปรตน 2.1.3 ขวดปรบปรมาตรขนาด 100 มลลลตร 2.1.4 ขวดรปชมพขนาด 50 มลลลตร 2.1.5 ปเปต ขนาด 5, 10 มลลลตร 2.1.6 บวเรตขนาด 25 มลลลตร

2.1.7 ลกแกว 2.2 สารเคมทใชวเคราะห

2.2.1 กรดซลฟรกเขมขน 2.2.2 สารเรงปฏกรยา ใชคอปเปอรซลเฟต (CuSO4) 1 สวนตอโปแตสเซยม ซลเฟต (K2SO4) 9 สวน 2.2.3 สารละลายของโซเดยมไฮดรอกไซด และโซเดยมไธโอซลเฟตเขมขนรอยละ

68

60 ชงสารโซเดยมไฮดรอกไซด 60 กรม และโซเดยมไธโอซลเฟต 5 กรม ละลายในนากลนปรบปรมาตรเปน 100 มลลลตร 2.2.4 สารละลายกรดบอรรกเขมขนรอยละ 4 ละลายกรดบอรรก 40 กรม ดวยนา กลนปรบปรมาตรใหได 1000 มลลลตร 2.2.5 สารละลายกรดเกลอเขมขน 0.02 นอรมล 2.2.6 อนดเคเตอรใช fashiro indicator เตรยมเปน stock solution ชง เมทธลลนบล (methylene blue) 0.2 กรม ละลายในเอทธานอล (ethanol) 200 มลลลตร และชงเมทธลเรด (methyl red) 0.05 กรม ละลายใน เอทธานอล 50 มลลลตร เวลาใชนามาผสมในอตราสวน stock solution 1 สวน : เอทธานอล 1 สวน : นากลน 2 สวน 2.3 วธการวเคราะห 2.3.1 ชงตวอยางอาหารบนกระดาษกรองใหไดนาหนกแนนอน ประมาณ 1-2 กรม ใสลงขวดยอยโปรตน 2.3.2 เตมสารเรงปฏกรยา 5 กรม และกรดซลฟรกเขมขน 20 มลลลตร 2.3.3 ใสลกแกว 2 เมด นาไปยอยบนเตาไฟในตควนจนกระทงไดสารละลายใส ปลอยทงใหเยน 2.3.4 เตมนากลนรอนลงไปลางบรเวณคอขวดใหทว และใหความรอนตอไปจน เกดควนของกรดซลฟรกปลอยทงใหเยน 2.3.5 นามาถายลงในขวดปรบปรมาตรขนาด 100 มลลลตร ใชนากลนลางขวด ยอยโปรตนใหหมดสารละลายตวอยาง แลวปรบปรมาตรใหได 100 มลลลตร 2.3.6 จดอปกรณกลน

2.3.7 นาขวดรปชมพขนาด 50 มลลลตร เตมกรดบอรรกเขมขนรอยละ 4 ลงไป 5มลลลตร ผสมนากลน 5 มลลลตร และเตมอนดเคเตอรเรยบรอยแลวไปรองรบของเหลวทจะกลน โดยใหสวนปลายของอปกรณควบแนนจมลงในสารละลายกรดน

2.3.8 ดดสารละลายตวอยางดวยปเปตขนาดความจ 10 มลลลตร ใสลงในชองใส ตวอยางแลวเตมสารละลายโซเดยมไฮดรอกไซดลงไป 20 มลลลตร 2.3.9 กลนประมาณ 10 นาท ลางปลายอปกรณควบแนนดวยนากลนลงในขวด รองรบ

69

2.3.10 ไตเตรตสารละลายทกลนไดกบสารละลายกรดเกลอทมความเขมขน 0.02 นอรมล จะไดจดยตเปนสมวง 2.3.11 ทา blank ดวยวธการเดยวกนตงแตขอ 2.2.2 ถง 2.2.10 2.4 วธการคานวณ ปรมาณโปรตน (รอยละ) = (a-b) x N x 14 x Factor W โดยท a = ปรมาณของสารละลายกรดเกลอทใชเปนมลลลตร b = ปรมาณของสารละลายกรดเกลอทใชกบ blank เปนมลลลตร N = ความเขมขนของสารละลายกรดเกลอเปนนอรมล Factor = ตวเลขทเหมาะสม โปรตนถวเหลองใช 5.71 (นาหนกกรมสมมลยของไนโตรเจน = 14.007) 3. การวเคราะหปรมาณไขมน (Crude fat หรอ Ether extract, EE) (AOAC, 1990) 3.1 อปกรณทใชวเคราะห 3.1.1 ชดสกดไขมน (Soxhlet extractor) (ยหอ TECATOR รน 1047) 3.1.2 หลอดใสตวอยาง (extraction thimble) 3.1.3 สาล 3.1.4 ตอบไฟฟา 3.1.5 เครองชงไฟฟาอยางละเอยด 3.1.6 โถดดความชน 3.2 สารเคมทใชวเคราะห 3.2.1 ปโตรเลยม อเทอร 3.3 วธการวเคราะห 3.3.1 ชงตวอยางใส thimble (W1) (ตวอยางตองแหงและบดใหเปนเนอเดยวกน) ประมาณ 5 กรม 3.3.2 นา thimble ดงกลาวไปใสในเครอง Soxhlet extractor 3.3.3 ชงนาหนกของ extraction cup (W2) 3.3.4 เตมตวทาละลายปโตรเลยม อเทอรลงใน extraction cup ปรมาตร 50 มลลลตร แลวนาไปใสในเครอง extraction unit

70

3.3.5 ทาการสกด (boiling) นาน 90 นาท และทาการชะลาง (rinsing) นาน 180 นาท 3.3.6 นาไปอบในตอบลมรอนทอณหภม 105 องศาเซลเซยส นาน 30 นาท เพอ ระเหยตวทาละลายออกไป 3.3.7 นาไปเกบไวในเดซกเคเตอร ทงไวใหเยนและนามาชงนาหนก (W3) 3.4 วธการคานวณ ปรมาณไขมน (รอยละ) = (W3 – W2) x 100 W1 เมอ W1 คอ นาหนกตวอยางทจะวเคราะห หนวยเปนกรม W2 คอ นาหนก extraction cup หนวยเปนกรม W3 คอ นาหนก extraction cup และไขมนทไดจากการสกด หนวยเปนกรม 4. การวเคราะหปรมาณเถา (Ash) (AOAC, 1990) 4.1 อปกรณทใชวเคราะห 4.1.1 เตาเผาไฟฟา 4.1.2 จานกระเบองเคลอบ 4.1.3 เดซกเคเตอร 4.2 วธการวเคราะห 4.2.1 นาจานกระเบองเคลอบมาเผาทอณหภม 550 องศาเซลเซยสและชงนาหนก ใหไดนาหนกทแนนอน (W1) 4.2.2 ชงตวอยางมา 2-5 กรม (W) ใสในจานกระเบองเคลอบ 4.2.3 นาไปเผาดวยไฟออนๆ จนหมดควน แลวนามาเผาในเตาเผาไฟฟาท อณหภม 550 องศาเซลเซยส นาน 2-3 ชวโมง หรอจนกระทงไดเถาสขาว 4.2.4 นาออกมาใสในเดซกเคเตอรทงไวใหเยน แลวนามาชงนาหนก

4.2.5 นามาเผาตอจนไดนาหนกตางกนไมเกน 12 มลลกรม จดนาหนกทนอยทสด ถอเปนนาหนกของจานกระเบองเคลอบและตวอยางเผาจนไดนาหนกคงท

(W2) 4.3 วธการคานวณ รอยละของปรมาณเถา = (W2 - W1) x 100 W

71

เมอ W คอ นาหนกตวอยางกอนเผา หนวยเปนกรม W1 คอ นาหนกของจานกระเบองเคลอบหลงจากเผาจนไดนาหนกคงท หนวยเปนกรม W2 คอ นาหนกของจานกระเบองเคลอบและตวอยาง ภายหลงจากเผา จนไดนาหนกคงท หนวยเปนกรม 5. การวเคราะหหาปรมาณเยอใย (Crude fiber, CF) (AOAC, 1990) 5.1 อปกรณทใชวเคราะห 5.1.1 เครองชงชนดทศนยม 4 ตาแหนง 5.1.2 เครองวเคราะหหาเยอใย 5.1.3 ครซเบล (Fritted glass crucible) 5.1.4. ตอบ (Oven) 5.1.5. เตาเผา (Muffle furnace) 5.1.6. โถดดความชน 5.2 สารเคมทใชวเคราะห 5.2.1 สารละลายกรดซลฟรก (H2SO4) ความเขมขน 1.25% 5.2.2 สารละลายโซเดยมไฮดรอกไซด (NaOH) ความเขมขน 1.25% 5.3 วธเตรยมสารละลาย 5.3.1 สารละลายกรดซลฟรก ความเขมขน 1.25% (0.255 ± 0.005N) - ตวงนาประมาณ 500 มลลลตร ใสในบกเกอร ขนาด 2 ลตร - ชงกรดซลฟรก 12.5 กรม แลวคอย ๆ เทใสในบกเกอร ใชแทงแกวคน สารละลายใหเขากน แลวเตมนากลนจนครบ 1 ลตร ปลอยใหเยนแลว จงเทใสขวดเกบสารละลาย 5.3.2 สารละลายโซเดยมไฮดรอกไซด ความเขมขน 1.25% (0.313 ± 0.005N) - ตมนากลนใหเดอดนานประมาณ 20 นาท แลวปลอยใหเยนใน ภาชนะทมฝาปด - ชงโซเดยมไฮดรอกไซด 12.5 กรม ใสในบกเกอร ขนาด 2 ลตร ตวงนา กลนทตมเดอดแลว (ในขอ1.) ประมาณ 500 มลลลตร ใสในบกเกอร ใชแทงแกวคนเปนระยะ ๆ ใหโซเดยมไฮดรอกไซดละลายจนหมด แลว

72

เตมนากลนอก 500 มลลลตรหรอเตมจนครบ 1 ลตร คนใหเขากน ปลอยใหเยนแลวจงเทใสขวดเกบสารละลาย 5.4 วธการวเคราะห 5.4.1 นาตวอยางอาหารทสกดไขมนออกถายลงใน beaker ขนาด 600 มลลลตร

5.4.2 ตวงสารละลายกรดซลฟรก 1.25% ประมาณ 200 มลลลตร นาเขาเครองยอยเมอสารเดอดปรบความรอนลง ใหอณหภม (reflux) จบเวลา 30 นาท

5.4.3 เมอครบถายตวอยางลงใสผากรอง ลางดวยนารอน ประมาณ 1 ลตร แลว ถายตวอยางลงในบกเกอรตามเดม 5.4.4 ตวงสารละลายโซเดยมไฮดรอกไซด 1.25% ทอนไวประมาณ 200 มลลลตร นาเขาเครองยอยเมอสารเดอดปรบความรอนลง ใหอณหภม (reflux) จบ เวลา 30 นาท

5.4.5 เมอครบเวลาถายตวอยางลงใสครซเบล และลางตวอยางดวยนารอนจนหมด ดาง จะใชนารอนประมาณ 1,500 มลลลตร นาครซเบลทมเยอใยไป อบจนแหงทอณหภม 105 องศาเซลเซยส นาน 16-18 ชวโมง จากนนนา ครซเบลออกมาใสโถดดความชน ปลอยใหเยนจากนนชงนาหนก จดบนทก

5.4.6 นาครซเบลทชงนาหนกแลวเขาในเตาเผาทอณหภม 550 องศาเซลเซยส นาน 2 ชวโมง จากนนเปดฝาเตาเผา รอใหถวยมอณหภมลดลงประมาณ 150-200 องศาเชลเซยส แลวนาใสโถดดความชนปลอยใหเยน แลวชง นาหนก ครซเบล จดบนทก (โดยสวนของเยอใยคอสวนทถกเผาหายไป)

5.5 วธการคานวณ % เยอใย = (W2 – W3) x 100 W1 เมอ W1 คอ นาหนกตวอยางทจะวเคราะห หนวยเปนกรม W2 คอ นาหนก crucible + นาหนกตวอยางหลงการอบ หนวยเปนกรม W3 คอ นาหนก crucible + นาหนกตวอยางหลงการเผา หนวยเปนกรม 6. การวเคราะหหาคารโบไฮเดรท (AOAC, 1990) การวเคราะหหาคารโบไฮเดรททยอยไดงาย โดยการคานวณจาก % NFE = 100 - [%Moisture+%Ash+%CP+%EE+%CF] เมอ % NFE (Nitrogen free extract) คอ คารโบไฮเดรตทยอยไดงาย

73

%Moisture คอ เปอรเซนตความชน %Ash คอ รอยละปรมาณเถา %CP (Crude protein) คอ รอยละปรมาณโปรตน %EE (Ether extract) คอ รอยละปรมาณไขมน %CF (Crude fiber) คอ รอยละปรมาณเยอใย 7. วธการเตรยมสารเคมส าหรบการวเคราะหกจกรรมของเอนไซมดวยวธ Non-specific Protease Activity Assay (Casein Substrate) 7.1 สารเคมทใชวเคราะห 7.1.1 สารละลาย 50 mM Potassium Phosphate buffer, pH 7.5 - ละลาย potassium phosphate dibasic, trihydrate ในนากลน โดยใช ปรมาณ 11.4 มลลกรมตอ 1 มลลลตร - ปรบ pH ดวย 1 M HCl - อนใหมอณหภม 37 องศาเซลเซยส กอนนามาใช

7.1.2 สารละลาย 0.65% w/v casein - ทาการผสม casein ใน 50 mM Potassium Phosphate buffer โดยใช ปรมาณ 6.5 มลลกรม ตอ 1 มลลลตร - คอยๆเพมอณหภมของสารละลายพรอมกบคนอยางเบามอ ใหถง 80-85 องศาเซลเซยส เปนเวลาประมาณ 10 นาท จนกระทงได สารละลายแขวนลอยเนอเดยว (*หามใหสารละลายนเดอดเปนอนขาด) - ปรบ pH (ถาจาเปน) ดวย 1 M HCL หรอ NaOH 7.1.3 สารละลาย 110 mM Trichloroacetic acid

- เจอจางจาก 6.1 N stock ดวยนากลน ในอตราสวน 1:55 7.1.4 สารละลาย 500 mM Sodium Carbonate - ละลาย anhydrous sodium carbonate ในนากลน โดยใชปรมาณ 53 มลลกรม ตอ 1 มลลลตร

7.1.5 สารละลาย Enzyme dilulent - เตรยม 10 mM ของ Sodium Acetate Buffer ใน 5mM Calcium Acetate pH 7.5 - ใชในการเจอจางหรอละลายเอนไซมทอณหภม 37 องศาเซลเซยส

74

7.1.6 สารละลายมาตรฐาน 1.1 mM L-tyrosine - ละลาย L-tyrosine ในนากลน โดยใชปรมาณ 0.2 มลลกรม ตอ 1 มลลลตร - ใหความรอนอยางชาๆจนกระทง L-tyrosine ละลาย (*หามใหสารละลายเดอด) - ปลอยใหเยนทอณหภมหองกอนนาไปใช 7.1.7 Protease solution - ละลายใน enzyme diluent (จากขอ 7.1.5) ใหมกจกรรมของเอนไซม ประมาณ 0.1-0.2 หนวยตอมลลลตร 7.2 Tyrosine standard dilutions 7.2.1 เตรยมหลอดทดลองจานวน 6 หลอด 7.2.2 เตม 1.1 mM L-tyrosine standard stock solution ปรมาณ 0, 0.05, 0.10, 0.20, 0.40 และ 0.50 มลลลตร ในแตละหลอด ตามลาดบ 7.2.3 เตมนากลน จนมปรมาตรสดทายเปน 2 มลลลตร ในทกๆหลอด 7.2.4 เตม sodium carbonate ปรมาณ 5 มลลลตร ในแตละหลอด สารละลายจะขน จากนนเตม Folin's reagent 1 มลลลตร ทนท 7.2.5 เขยาดวย vortex และบมท 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 30 นาท 7.2.6 วดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 660 นาโนเมตร พรอมบนทกคา 7.2.7 นาคาทไดไปสรางกราฟมาตรฐานโดยใหแกน x เปนจานวน µmol tyrosine และแกน y เปนคาดดกลนแสงทวดได

Volume of Tyrosine Standard µmoles Tyrosine 0.05 0.055 0.10 0.111 0.20 0.221 0.40 0.442 0.50 0.553

75

8. การวเคราะหระดบการยอยสลายโปรตนดวยวธ OPA 8.1 อปกรณทใชวเคราะห - หลอดทดลอง: ขนาด 16 มลลลตร - เครองชงสตาแหนง - Spectrophotometer ทความยาวคลน 340 นาโนเมตร - ไมโครปเปต - Magnetic stirrer - Whirlmixer

8.2 วธเตรยมสารเคมทใชวเคราะห 8.2.1 OPA reagent - ละลาย di-Na-tetraborate 7.260 กรม รวมกบ Na-dodecyl-sulfate (SDS) 200 มลลกรม ในนากลน 150 มลลลตร (อยางสมบรณ) - เตมลงใน 4 มลลลตร ethanol ทม o-phthaldialdehyde 97% (OPA) 160 มลลกรม ละลายอยกอนแลว (rinse ดวยนากลน) - เตม dithiothreitol 99% (DTT) 176 มลลกรม ลงไปในสารละลาย (rinse ดวยนากลน) - ปรบปรมาตรเปน 200 มลลลตร ดวยนากลน 8.2.2 Standard serine - standard serine 50 มลลกรม เจอจางเปน 500 มลลลตร ดวยนากลน (0.9516 meqv/L) 8.2.3 สารละลายตวอยาง - ตวอยาง 0.1-1.0 กรม (ประกอบดวยโปรตน 8-80%) ละลายในนากลน 100 มลลลตร

ภาคผนวก ข

77

ขอมลการทดลอง 1.ผลการวเคราะห Proximate Analysis ตารางท 14 รอยละปรมาณโปรตนทเปนองคประกอบในโปรตนสกดจากถวเหลอง

ตารางท 15 รอยละปรมาณไขมนทเปนองคประกอบในโปรตนสกดจากถวเหลอง

ตวอยาง ครงท นาหนกตวอยาง (กรม)

นาหนกถวย (กรม)

นาหนกถวย+ไขมน (กรม)

นาหนกไขมน (กรม)

รอยละปรมาณไขมน รอยละปรมาณไขมนโดยเฉลย

โปรตนสกดจากถวเหลอง

1 2.24 25.3286 25.3311 0.0025 0.11 0.11 0.002

2 2.0878 24.9145 24.9169 0.0024 0.11

ตวอยาง ครงท นาหนกตวอยาง(มลลกรม)

ความเขมขนของกรด HCl ทใช (N)

ปรมาตรกรด HCl ทใชในการไตเตรต blank (มลลลตร)

ปรมาตรกรด HCl ทใชในการไตเตรตตวอยาง(มลลลตร)

รอยละปรมาณโปรตน

รอยละปรมาณโปรตนโดยเฉลย


1 1,100 0.1 0.3 118.1 85.50 85.31 0.28

2 1,030 0.1 0.3 110.1 85.11

78

ตารางท 16 รอยละปรมาณเถาทเปนองคประกอบในโปรตนสกดจากถวเหลอง

ตวอยาง ครงท นาหนก crucible (กรม)

นาหนกฝา (กรม)

นาหนกตวอยาง(กรม)

นาหนก crucible+ฝา+เถา (กรม)

นาหนกเถา (กรม)

รอยละปรมาณเถา รอยละปรมาณเถาโดยเฉลย

1 22.1782 14.7295 2.0025 36.9912 0.0835 4.17

4.14 0.18 โปรตนสกดจากถวเหลอง

2 22.1883 15.7722 2.0042 38.0396 0.0791 3.95

3 23.129 13.4503 2.0094 36.6656 0.0863 4.29

ตารางท 17 รอยละปรมาณความชนทเปนองคประกอบในโปรตนสกดจากถวเหลอง

ตวอยาง ครงท นาหนกตวอยางกอนอบ (กรม)

นาหนกตวอยางหลงอบ (กรม)

นาหนกความชนทหายไป (กรม)

รอยละปรมาณความชน รอยละปรมาณความชนโดยเฉลย

1 2.0549 1.9157 0.1392 6.77


2 2.05 1.9115 0.1385 6.76 6.74 0.05

3 2.0058 1.8719 0.1339 6.68

79

การสรางกราฟ Standard curve ของ Tyrosine ตารางท 18 คาการดดกลนแสงของ Standard Tyrosine ทความเขมขนตางๆ ทความยาวคลน 660 นาโนเมตร

ภาพท 22 กราฟแสดงความสมพนธระหวางปรมาณของ Standard Tyrosine ทความเขมขนตางๆ และคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 660 นาโนเมตร

ปรมาณ Tyrosine (ไมโครโมล)

คาการดดกลนแสงทความยาวคลน 660 นาโนเมตร

0 0 0.055 0.104 0.111 0.214 0.221 0.427 0.442 0.812 0.553 0.965

80

คากจกรรมของเอนไซมแตละชนด ตารางท 19 คากจกรรมของเอนไซม Protease G1 (หนวยตอกรมของแขง)

ความเขมขนของสารละลายเอนไซม (มลลกรมเอนไซม/

มลลลตรสารละลาย)

ปรมาตรสารละลาย

เอนไซมทใช (มลลลตร)

คาการดดกลนแสงท 660 นาโนเมตร

ปรมาณTyrosine ทปลดปลอยออกมา

(ไมโครโมล)

คากจกรรมของเอนไซม ในสารละลายเอนไซม

(หนวย/มลลลตรสารละลาย)

คากจกรรมของเอนไซม (หนวย/มลลกรมของแขง)

คากจกรรมของเอนไซม (หนวย/กรมของแขง)

1.405

0.5

0.402 0.220 0.242 0.172 172.40 0.374 0.204 0.225 0.160 159.96 0.389 0.213 0.234 0.167 166.63

0.7

0.533 0.295 0.231 0.165 164.72 0.509 0.281 0.221 0.157 157.10 0.505 0.279 0.219 0.156 155.83

1.0

0.745 0.415 0.228 0.162 162.40 0.710 0.395 0.217 0.155 154.63 0.702 0.390 0.215 0.153 152.85

(เฉลย) 160.73 6.39

81

ตารางท 20 คากจกรรมของเอนไซม Protamex (หนวยตอกรมของแขง) ความเขมขนของสารละลายเอนไซม (มลลกรมเอนไซม/มลลลตรสารละลาย)

ปรมาตรสารละลายเอนไซมทใช (มลลลตร)


ปรมาณTyrosine ทปลดปลอยออกมา (ไมโครโมล)

คากจกรรมของเอนไซม ในสารละลายเอนไซม (หนวย/มลลลตรสารละลาย)



0.510

0.5

0.404 0.221 0.221 0.477 477.40 0.427 0.234 0.234 0.506 505.55 0.387 0.212 0.212 0.457 456.59

0.7

0.603 0.334 0.334 0.515 515.00 0.603 0.334 0.334 0.515 515.00 0.578 0.320 0.320 0.493 493.14

1.0

0.766 0.427 0.427 0.460 460.26 0.786 0.438 0.438 0.473 472.50 0.788 0.439 0.439 0.474 473.73

(เฉลย) 485.46 22.29

82

ตารางท 21 คากจกรรมของเอนไซม Collupulin MG (หนวยตอกรมของแขง) ความเขมขนของสารละลายเอนไซม (มลลกรมเอนไซม/มลลลตรสารละลาย)







3.010

0.5

0.404 0.221 0.243 0.081 80.89 0.353 0.192 0.212 0.070 70.31 0.356 0.194 0.214 0.071 70.93

0.7

0.521 0.288 0.226 0.075 75.11 0.527 0.291 0.229 0.076 76.00 0.496 0.274 0.215 0.071 71.41

1.0

0.701 0.390 0.214 0.071 71.24 0.711 0.396 0.218 0.072 72.28 0.753 0.419 0.231 0.077 76.64

(เฉลย) 73.87 3.53

83

ตารางท 22 คากจกรรมของเอนไซม Protease G6 (หนวยตอกรมของแขง) ความเขมขนของสารละลายเอนไซม (มลลกรมเอนไซม/มลลลตรสารละลาย)







0.580

0.5

0.543 0.300 0.330 0.569 569.40 0.511 0.282 0.310 0.535 534.95 0.539 0.298 0.328 0.565 565.09

0.7

0.722 0.402 0.316 0.544 544.33 0.675 0.375 0.295 0.508 508.20 0.695 0.386 0.304 0.524 523.57

1.0

0.938 0.524 0.288 0.497 497.28 0.887 0.495 0.273 0.470 469.83 0.895 0.500 0.275 0.474 474.14

(เฉลย) 520.75 36.35

84

ผลรอยละการยอยสลายเพอการคดเลอกชนดเอนไซมทเหมาะสมตอการผลต HVP ตารางท 23 รอยละการยอยสลายของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Protease G1 ทมกจกรรมเปน 200 หนวยตอกรมของแขงท pH 7.0 และอณหภม

50 องศาเซลเซยส เปนเวลา 3 ชวโมง

ครงท

คาการดดกลนแสงของ ตวอยาง

คาการดดกลนแสงของ blank

คาการดดกลนแสงของสารมาตรฐาน

นาหนกตวอยาง (กรม)

รอยละโปรตน

Serine-NH2

(meqv serine-NH2/กรมโปรตน)

h รอยละการยอยสลาย

1

0.782 0.154 0.814 1.0230 4.2655 0.969 0.647 22.90 0.770 0.185 0.810

0.793 0.174 0.831

0.784 0.155 0.800

(เฉลย) 0.782 0.167 0.814

2

0.727 0.157 0.818 1.0168 4.2655 1.113 0.795 20.33 0.705 0.184 0.822

0.729 0.177 0.809

0.719 0.154 0.800

(เฉลย) 0.720 0.168 0.812

3

0.766 0.156 0.828 1.0168 4.2655 1.193 0.878 21.62 0.741 0.186 0.826

0.745 0.184 0.812

0.743 0.155 0.782

(เฉลย) 0.749 0.170 0.812

เฉลยโดยรวม 21.61 1.29

85

ตารางท 24 รอยละการยอยสลายของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Protamex ทมกจกรรมเปน 200 หนวยตอกรมของแขงท pH 6.0 และอณหภม 50 องศาเซลเซยส เปนเวลา 3 ชวโมง

ครงท






Serine-NH2


h รอยละการ ยอยสลาย

1

0.778 0.194 0.839 1.0288 4.2655 1.340 1.029 22.12 0.788 0.170 0.813

0.768 0.190 0.815

0.788 0.197 0.835

(เฉลย) 0.781 0.188 0.826

2

0.816 0.198 0.825 1.0331 4.2655 1.580 1.276 23.42 0.824 0.173 0.813

0.792 0.192 0.815

0.802 0.197 0.834

(เฉลย) 0.809 0.190 0.822

3

0.794 0.195 0.831 1.0073 4.2655 1.457 1.149 23.10 0.806 0.174 0.82

0.769 0.191 0.815

0.788 0.195 0.835

(เฉลย) 0.789 0.189 0.825


86

ตารางท 25 รอยละการยอยสลายของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 200 หนวยตอกรมของแขงท pH 6.5 และอณหภม 65 องศาเซลเซยส เปนเวลา 3 ชวโมง

ครงท






Serine-NH2



1

0.948 0.28 0.926 1.003 4.266 2.319 2.038 26.13 0.949 0.266 0.918

0.938 0.276 0.899

0.935 0.279 0.918

(เฉลย) 0.943 0.275 0.915

2

1.075 0.289 0.917 1.0002 4.266 2.800 2.534 32.49 1.075 0.277 0.923

1.069 0.289 0.895

1.067 0.280 0.910

(เฉลย) 1.072 0.284 0.911

3

0.889 0.281 0.909 1.0003 4.266 2.160 1.874 24.03 0.890 0.275 0.900

0.875 0.278 0.902

0.890 0.282 0.912

(เฉลย) 0.886 0.279 0.90575


87

ตารางท 26 รอยละการยอยสลายของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Protease G6 ทมกจกรรมเปน 200 หนวยตอกรมของแขงท pH 9.5 และอณหภม 60 องศาเซลเซยส เปนเวลา 3 ชวโมง

ครงท






Serine-NH2



1

0.876 0.215 0.883 1.0008 4.2655 1.643 1.341 24.87 0.870 0.242 0.885

0.884 0.235 0.894

0.887 0.227 0.861

(เฉลย) 0.879 0.230 0.881

2

0.874 0.191 0.844 1.0085 4.2655 1.797 1.500 26.02 0.862 0.183 0.821

0.841 0.192 0.830

0.878 0.189 0.845

(เฉลย) 0.864 0.189 0.835

3

0.872 0.195 0.844 1.0083 4.2655 1.870 1.576 25.91 0.867 0.182 0.821

0.848 0.199 0.830

0.857 0.194 0.845

(เฉลย) 0.861 0.193 0.835


88

ผลรอยละผลผลตเพอการคดเลอกชนดเอนไซมทเหมาะสมตอการผลต HVP ตารางท 27 รอยละผลผลตของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Protease

G1 ทมกจกรรมเปน 200 หนวยตอกรมของแขงท pH 7.0 และอณหภม 50 องศา เซลเซยส เปนเวลา 3 ชวโมง

ครงท

นาหนกตวอยาง+ภาชนะกอนทาการระเหย (กรม)

นาหนกตวอยาง+ภาชนะหลงทาการระเหย (กรม)

นาหนกเพสต (กรม)


รอยละผลผลต (กรมเพสตตอกรมตวอยาง)

1 57.2403 58.212 0.9717

10.0750 9.64

59.3212 60.3392 1.0180 10.10 59.3212 60.0906 0.7694 7.64

(เฉลย) 9.13

2 59.3212 60.0576 0.7364

10.1008 7.29

57.2403 57.9570 0.7167 7.10 57.2403 57.9696 0.7293 7.22

(เฉลย) 7.20

3 55.5153 56.1893 0.6740

10.1046 6.67

55.5153 56.2213 0.7060 6.99 57.2403 58.0034 0.7631 7.55

(เฉลย) 7.07


89

ตารางท 28 รอยละผลผลตของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Protamex ทมกจกรรมเปน 200 หนวยตอกรมของแขง ณ pH 6.0 และอณหภม 50 องศา เซลเซยส เปนเวลา 3 ชวโมง

ครงท






1 56.4112 57.0705 0.6593

10.1537 6.49

59.3249 60.0066 0.6817 6.71 59.3249 59.9384 0.6135 6.04

(เฉลย) 6.42

2 57.2952 57.8968 0.6016

10.1169 5.95

56.4112 57.0172 0.606 5.99 57.2952 57.8198 0.5246 5.19

(เฉลย) 5.71

3 55.5041 56.1637 0.6596

10.1173 6.52

55.5041 56.1012 0.5971 5.90 55.5041 56.1042 0.6001 5.93

(เฉลย) 6.12


90

ตารางท 29 รอยละผลผลตของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 200 หนวยตอกรมของแขงท pH 6.5 และอณหภม 65 องศา เซลเซยส เปนเวลา 3 ชวโมง

ครงท






1 59.3279 60.5848 1.2569

5.1095 24.61

55.5035 56.685 1.1815 23.12

(เฉลย) 23.86

2 57.2479 58.4879 1.2400

5.1921 23.94

56.4261 57.621 1.1949 22.96

(เฉลย) 23.45

3 52.9825 54.1706 1.1881

5.0469 23.46

54.3105 55.385 1.0745 21.36

(เฉลย) 22.41


91

ตารางท 30 รอยละผลผลตของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Protease G6 ทมกจกรรมเปน 200 หนวยตอกรมของแขงท pH 9.5 และอณหภม 60 องศา เซลเซยส เปนเวลา 3 ชวโมง

ครงท






1 55.5060 56.0738 0.5678

10.0750 5.64

55.5060 56.0614 0.5554 5.51 59.3300 59.9517 0.6217 6.17

(เฉลย) 5.77

2 57.2504 57.7831 0.5327

10.1008 5.27

57.2504 57.8276 0.5772 5.71 55.5060 56.0578 0.5518 5.46

(เฉลย) 5.48

3 59.3300 59.8900 0.56

10.1046 5.54

57.2504 57.7615 0.5111 5.06 55.5060 56.0264 0.5204 5.15

(เฉลย) 5.25


92

ตารางท 31 ผลการเปรยบเทยบการยอยโปรตนสกดของถวเหลองดวยเอนไซมชนดตางๆ ทมกจกรรม เปน 200 หนวยตอกรมของแขงท pH และอณหภมทเหมาะสมจาเพาะสาหรบเอนไซมแตละชนด

ชนดเอนไซม pH อณหภม(องศา

เซลเซยส)

กจกรรมของเอนไซมตงตน (หนวยตอกรมของแขง)

รอยละการ ยอยสลาย

รอยละผลผลต

Protease G6 9.5 60 520.75 36.35a 25.60 0.63ab 5.50 0.26c

Protamex 6.0 50 485.46 22.29a 22.88 0.68b 6.08 0.36c

Protease G1 7.0 50 160.73 6.39b 21.61 1.29b 7.80 1.15b

Collupulin MG 6.5 65 73.87 3.53c 27.55 4.41a 23.24 0.75a

93

ผลรอยละการยอยสลายเพอหาสภาวะทเหมาะสมตอการผลต HVP โดยใชเอนไซมทผานการคดเลอก ตารางท 32 รอยละการยอยสลายของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 200 หนวยตอกรมของแขงท pH 5.0 และอณหภม 50 องศาเซลเซยสเปนเวลา 3 ชวโมง

ครงท






Serine-NH2



1

0.728 0.172 0.861 0.7263 4.266 2.538 2.264 29.031 0.746 0.164 0.861

0.738 0.162 0.856

0.751 0.170 0.867

(เฉลย) 0.741 0.167 0.861

2

0.726 0.161 0.86 0.7162 4.266 2.489 2.213 28.372 0.731 0.163 0.864

0.725 0.171 0.865

0.721 0.163 0.879

(เฉลย) 0.726 0.165 0.867

3

0.77 0.17 0.852 0.7203 4.266 2.700 2.431 31.162 0.774 0.175 0.853

0.773 0.161 0.861

0.771 0.171 0.877

(เฉลย) 0.772 0.16925 0.86075


94


ครงท






Serine-NH2



1

0.806 0.163 0.847 0.7504 4.266 2.781 2.514 32.234 0.813 0.154 0.854

0.802 0.161 0.849

0.811 0.163 0.861

(เฉลย) 0.808 0.160 0.853

2

0.79 0.164 0.847 0.7384 4.266 2.765 2.498 32.030 0.8 0.156 0.847

0.783 0.164 0.844

0.795 0.166 0.863

(เฉลย) 0.792 0.163 0.850

3

0.736 0.155 0.829 0.7276 4.266 2.563 2.290 29.361 0.73 0.164 0.858

0.736 0.164 0.857

0.739 0.158 0.848

(เฉลย) 0.73525 0.16025 0.848


95


ครงท






Serine-NH2



1

0.815 0.144 0.84 0.7154 4.266 2.980 2.719 34.865 0.829 0.152 0.853

0.813 0.154 0.856

0.826 0.145 0.859

(เฉลย) 0.821 0.149 0.852

2

0.832 0.149 0.846 0.7303 4.266 2.938 2.677 34.316 0.825 0.139 0.841

0.813 0.148 0.847

0.815 0.149 0.858

(เฉลย) 0.821 0.146 0.848

3

0.818 0.148 0.836 0.7269 4.266 2.948 2.687 34.448 0.808 0.152 0.826

0.804 0.149 0.835

0.808 0.152 0.849

(เฉลย) 0.8095 0.15025 0.8365


96


ครงท






Serine-NH2



1

0.849 0.145 0.869 0.8027 4.266 2.830 2.565 32.884 0.915 0.152 0.875

0.88 0.151 0.869

0.902 0.143 0.88

(เฉลย) 0.887 0.148 0.873

2

0.944 0.155 0.89 0.8012 4.266 2.970 2.709 34.736 0.942 0.147 0.877

0.93 0.159 0.877

0.905 0.156 0.883

(เฉลย) 0.930 0.154 0.882

3

0.911 0.153 0.87 0.8017 4.266 2.844 2.580 33.071 0.908 0.153 0.892

0.916 0.143 0.899

0.878 0.153 0.887

(เฉลย) 0.90325 0.1505 0.887


97


ครงท






Serine-NH2



1

1.095 0.147 0.902 0.8144 4.266 3.352 2.540 32.563 1.034 0.159 0.899

1.067 0.156 0.903

1.086 0.148 0.907

(เฉลย) 1.071 0.153 0.903

2

1.075 0.15 0.923 0.8098 4.266 3.288 3.037 38.935 1.062 0.161 0.92

1.083 0.159 0.93

1.073 0.152 0.925

(เฉลย) 1.073 0.156 0.925

3

1.102 0.16 0.889 0.825 4.266 3.493 3.249 41.648 1.099 0.16 0.872

1.117 0.152 0.897

1.106 0.162 0.91

(เฉลย) 1.106 0.1585 0.892


98


ครงท






Serine-NH2



1

0.923 0.171 0.854 0.7212 4.266 3.372 3.124 40.049 0.929 0.161 0.86

0.911 0.163 0.857

0.926 0.17 0.868

(เฉลย) 0.922 0.166 0.860

2

0.979 0.172 0.860 0.7248 4.266 3.592 3.350 42.954 0.998 0.163 0.864

0.994 0.162 0.896

0.989 0.171 0.869

(เฉลย) 0.990 0.167 0.872

3

0.998 0.163 0.881 0.7272 4.266 3.566 3.323 42.608 0.987 0.169 0.871

0.984 0.175 0.872

0.982 0.164 0.869

(เฉลย) 0.98775 0.16775 0.87325


99


ครงท






Serine-NH2



1

1.220 0.157 0.856 0.8268 4.266 4.006 3.777 48.429 1.198 0.149 0.862

1.213 0.156 0.863

1.214 0.156 0.884

(เฉลย) 1.211 0.155 0.866

2

1.156 0.159 0.847 0.8147 4.266 3.968 3.738 47.919 1.209 0.151 0.869

1.209 0.16 0.891

1.224 0.161 0.9

(เฉลย) 1.200 0.158 0.877

3

1.199 0.162 0.889 0.8054 4.266 3.995 3.766 48.285 1.196 0.156 0.856

1.21 0.162 0.884

1.191 0.162 0.893

(เฉลย) 1.199 0.1605 0.8805


100


ครงท






Serine-NH2



1

1.081 0.167 0.854 0.7577 4.266 3.906 3.674 47.102 1.074 0.157 0.841

1.071 0.168 0.845

1.072 0.166 0.862

(เฉลย) 1.075 0.165 0.851

2

1.046 0.168 0.844 0.7227 4.266 3.983 3.754 48.127 1.049 0.159 0.844

1.032 0.166 0.841

1.049 0.168 0.856

(เฉลย) 1.044 0.165 0.846

3

1.037 0.169 0.851 0.7419 4.266 3.793 3.558 45.617 1.026 0.159 0.848

1.022 0.168 0.843

1.035 0.17 0.862

(เฉลย) 1.03 0.1665 0.851


101

ตารางท 40 รอยละการยอยสลายของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 300 หนวยตอกรมของแขงท pH 4.32 และ อณหภม 60 องศาเซลเซยส เปนเวลา 3 ชวโมง

ครงท






Serine-NH2



1

0.948 0.166 0.862 0.7272 4.266 3.481 3.236 41.484 0.945 0.175 0.859

0.950 0.176 0.853

0.951 0.166 0.851

(เฉลย) 0.949 0.171 0.856

2

0.981 0.169 0.866 0.7368 4.266 3.504 3.260 41.798 0.97 0.177 0.871

0.972 0.178 0.861

0.977 0.17 0.866

(เฉลย) 0.975 0.174 0.866

3

0.924 0.150 0.840 0.7202 4.266 3.434 3.188 40.872 0.925 0.160 0.858

0.936 0.159 0.870

0.946 0.151 0.858

(เฉลย) 0.93275 0.155 0.8565


102

ตารางท 41 รอยละการยอยสลายของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 300 หนวยตอกรมของแขงท pH 7.68 และ อณหภม 60 องศาเซลเซยส เปนเวลา 3 ชวโมง

ครงท






Serine-NH2



1

1.188 0.211 0.872 1.0028 4.266 3.341 3.092 39.643 1.173 0.204 0.842

1.164 0.229 0.859

1.178 0.229 0.850

(เฉลย) 1.176 0.218 0.856

2

1.211 0.251 0.863 1.0385 4.266 3.295 3.044 39.028 1.241 0.207 0.862

1.199 0.228 0.861

1.21 0.247 0.908

(เฉลย) 1.215 0.233 0.874

3

1.263 0.247 0.862 1.0877 4.266 3.401 3.153 40.429 1.301 0.205 0.851

1.263 0.215 0.844

1.273 0.243 0.880

(เฉลย) 1.275 0.2275 0.85925


103

ตารางท 42 รอยละการยอยสลายของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 300 หนวยตอกรมของแขงท pH 6.0 และอณหภม 43.18 องศาเซลเซยส เปนเวลา 3 ชวโมง

ครงท






Serine-NH2



1

0.903 0.17 0.867 0.801 4.266 2.806 2.540 32.563 0.890 0.183 0.895

0.891 0.179 0.909

0.887 0.171 0.879

(เฉลย) 0.893 0.176 0.888

2

0.874 0.19 0.882 0.813 4.266 2.704 2.435 31.222 0.879 0.18 0.898

0.886 0.172 0.88

0.88 0.191 0.900

(เฉลย) 0.880 0.183 0.890

3

0.901 0.193 0.888 0.8162 4.266 2.917 2.654 34.030 0.953 0.183 0.905

0.935 0.175 0.887

0.977 0.193 0.896

(เฉลย) 0.942 0.186 0.894


104

ตารางท 43 รอยละการยอยสลายของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 300 หนวยตอกรมของแขงท pH 6.0 และอณหภม 76.82 องศาเซลเซยส เปนเวลา 3 ชวโมง

ครงท






Serine-NH2



1

1.345 0.162 0.874 1.0131 4.266 3.662 3.423 43.884 1.326 0.153 0.868

1.323 0.171 0.851

1.333 0.166 0.870

(เฉลย) 1.332 0.163 0.866

2

1.409 0.164 0.875 1.0098 4.266 3.849 3.615 46.349 1.383 0.181 0.867

1.400 0.156 0.866

1.396 0.176 0.888

(เฉลย) 1.397 0.169 0.874

3

1.359 0.166 0.875 1.0157 4.266 3.686 3.447 44.196 1.369 0.153 0.880

1.353 0.164 0.864

1.360 0.167 0.886

(เฉลย) 1.360 0.163 0.876


105

ตารางท 44 รอยละการยอยสลายของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 131.82 หนวยตอกรมของแขงท pH 6.0 และ อณหภม 60 องศาเซลเซยส เปนเวลา 3 ชวโมง

ครงท






Serine-NH2



1

0.869 0.159 0.889 0.9962 4.266 2.187 1.902 24.381 0.840 0.146 0.868

0.841 0.175 0.855

0.865 0.159 0.870

(เฉลย) 0.854 0.160 0.871

2

0.818 0.157 0.908 0.992 4.266 2.022 1.732 22.202 0.799 0.147 0.867

0.797 0.179 0.866

0.811 0.160 0.874

(เฉลย) 0.806 0.161 0.879

3

0.847 0.198 0.852 0.9922 4.266 2.251 1.968 25.230 0.871 0.160 0.863

0.874 0.147 0.832

0.842 0.183 0.884

(เฉลย) 0.8585 0.172 0.85775


106


ครงท






Serine-NH2



1

1.130 0.162 0.884 0.8157 4.266 3.622 3.382 43.355 1.117 0.154 0.886

1.149 0.154 0.906

1.124 0.143 0.887

(เฉลย) 1.130 0.153 0.891

2

1.166 0.156 0.871 0.8223 4.266 3.686 3.447 44.196 1.193 0.158 0.894

1.123 0.148 0.889

1.137 0.156 0.909

(เฉลย) 1.155 0.155 0.891

3

1.088 0.154 0.888 0.8076 4.266 3.488 3.243 41.583 1.102 0.145 0.893

1.091 0.154 0.896

1.099 0.154 0.918

(เฉลย) 1.095 0.152 0.899


107


ครงท






Serine-NH2



1

0.934 0.172 0.843 0.7326 4.266 3.450 3.204 41.080 0.934 0.164 0.84

0.929 0.172 0.836

0.925 0.172 0.846

(เฉลย) 0.931 0.170 0.841

2

0.967 0.163 0.85 0.7387 4.266 3.545 3.302 42.335 0.961 0.172 0.851

0.975 0.175 0.851

0.967 0.166 0.845

(เฉลย) 0.968 0.169 0.849

3

0.898 0.174 0.843 0.7334 4.266 3.300 3.049 39.092 0.919 0.173 0.870

0.924 0.164 0.852

0.913 0.174 0.857

(เฉลย) 0.914 0.171 0.856


108


ครงท






Serine-NH2



1

0.996 0.148 0.897 0.8270 4.266 2.984 2.724 34.923 0.984 0.157 0.896

0.919 0.156 0.894

0.989 0.148 0.886

(เฉลย) 0.972 0.152 0.893

2

1.014 0.148 0.902 0.8040 4.266 3.136 2.881 36.934 0.999 0.157 0.919

1.015 0.158 0.918

1.026 0.148 0.918

(เฉลย) 1.014 0.153 0.914

3

0.990 0.152 0.900 0.8172 4.266 3.036 2.777 35.607 0.983 0.155 0.899

0.998 0.157 0.897

1.004 0.158 0.941

(เฉลย) 0.994 0.156 0.909


109


ครงท






Serine-NH2



1

0.855 0.167 0.870 0.7135 4.266 3.069 2.811 36.041 0.853 0.171 0.857

0.864 0.166 0.876

0.858 0.167 0.879

(เฉลย) 0.858 0.168 0.871

2

0.885 0.172 0.882 0.7438 4.266 2.997 2.737 35.095 0.879 0.174 0.886

0.877 0.167 0.880

0.896 0.168 0.891

(เฉลย) 0.884 0.170 0.885

3

0.86 0.178 0.874 0.717 4.266 3.042 2.784 35.687 0.876 0.172 0.877

0.859 0.171 0.877

0.865 0.178 0.895

(เฉลย) 0.865 0.175 0.881


110


ครงท






Serine-NH2



1

0.928 0.163 0.844 0.7288 4.266 3.351 3.102 39.765 0.936 0.169 0.884

0.943 0.160 0.869

0.914 0.162 0.859

(เฉลย) 0.930 0.164 0.864

2

0.89 0.155 0.856 0.7318 4.266 3.258 3.006 38.536 0.91 0.153 0.857

0.903 0.162 0.854

0.911 0.153 0.855

(เฉลย) 0.904 0.156 0.856

3

0.895 0.163 0.852 0.7348 4.266 3.232 2.979 38.195 0.910 0.168 0.865

0.924 0.165 0.872

0.910 0.171 0.870

(เฉลย) 0.90975 0.16675 0.86475


111


ครงท






Serine-NH2



1

1.080 0.161 0.862 0.8183 4.266 3.423 3.176 40.720 1.062 0.158 0.891

1.064 0.17 0.872

1.038 0.168 0.889

(เฉลย) 1.061 0.164 0.879

2

1.027 0.17 0.87 0.8123 4.266 3.299 3.048 39.078 1.018 0.161 0.879

1.021 0.169 0.873

1.021 0.170 0.893

(เฉลย) 1.022 0.168 0.879

3

1.015 0.172 0.878 0.8007 4.266 3.259 3.007 38.553 0.993 0.163 0.875

0.993 0.17 0.885

0.999 0.172 0.880

(เฉลย) 1.000 0.169 0.880


112


ครงท






Serine-NH2



1

1.131 0.181 0.845 0.995 4.266 3.174 2.920 37.437 1.174 0.159 0.855

1.142 0.150 0.846

1.123 0.182 0.880

(เฉลย) 1.143 0.168 0.857

2

1.139 0.153 0.879 1.019 4.266 3.002 2.742 35.155 1.111 0.164 0.863

1.116 0.180 0.865

1.140 0.163 0.858

(เฉลย) 1.127 0.165 0.866

3

1.153 0.159 0.853 1.015 4.266 3.128 2.873 36.829 1.171 0.186 0.871

1.185 0.148 0.878

1.150 0.158 0.866

(เฉลย) 1.165 0.163 0.867


113

ผลรอยละผลผลตเพอหาสภาวะทเหมาะสมตอการผลต HVP โดยใชเอนไซมทผานการคดเลอก ตารางท 52 รอยละผลผลตของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 200 หนวยตอกรมของแขงท pH 5.0 และอณหภม 50 องศา เซลเซยส เปนเวลา 3 ชวโมง

ครงท






1 57.2504 60.4353 3.1849

10.7672 29.42

55.5064 58.8282 3.3218 31.02

(เฉลย) 30.22

2 56.3931 59.7797 3.3866

10.9436 31.00

57.2387 60.5232 3.2845 29.96

(เฉลย) 30.48

3 55.4986 61.5284 4.2994

10.8528 29.82

57.2323 59.8100 4.3984 29.09

(เฉลย) 29.45


114


ครงท






1 55.5060 59.2115 3.7055

10.9015 34.32

59.3289 63.0727 3.7438 34.01

(เฉลย) 34.17

2 56.4073 59.9525 3.5452

10.9426 32.03

57.2449 60.7574 3.5125 32.47

(เฉลย) 32.25

3 55.4985 58.6728 3.1743

10.8561 29.50

59.3165 62.7082 3.3917 30.97

(เฉลย) 30.23


115


ครงท






1 56.3918 59.8582 3.4664

10.8590 32.09

57.2321 60.5914 3.3593 30.78

(เฉลย) 31.43

2 55.4842 58.3847 2.9005

10.7969 26.90

56.3998 59.4873 3.0875 28.56

(เฉลย) 27.73

3 57.2380 60.4465 3.2085

10.8449 29.56

55.4788 58.7574 3.2786 30.26

(เฉลย) 29.91


116


ครงท






1 55.4820 59.0023 3.5203

10.9595 32.25

59.3059 62.5538 3.2479 29.52

(เฉลย) 30.88

2 56.3868 59.6984 3.3116

10.8543 30.57

57.2243 60.6773 3.4530 31.75

(เฉลย) 31.16

3 55.4721 58.8403 3.3682

10.8554 31.09

59.3105 62.5788 3.2683 30.05

(เฉลย) 30.57


117

ตารางท 56 รอยละผลผลตของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 400 หนวยตอกรมของแขงท pH 5.0 และอณหภม 50 องศา เซลเซยสเปนเวลา 3 ชวโมง

ครงท






1 56.4152 61.3923 4.9771

11.1315 44.68

57.2501 62.2662 5.0161 45.10

(เฉลย) 44.89

2 56.4093 61.6571 5.2478

11.1802 46.64

57.2467 62.4664 5.2197 46.99

(เฉลย) 46.81

3 55.5043 61.0541 5.5498

11.2318 49.15

59.3286 64.7879 5.4593 48.86

(เฉลย) 49.01


118


ครงท






1 56.3961 61.6550 5.2589

11.3799 46.31

55.4860 60.8578 5.3718 47.11

(เฉลย) 46.71

2 56.3836 61.7488 5.3652

11.3928 47.25

57.2316 62.8235 5.5919 48.92

(เฉลย) 48.09

3 55.4852 60.5899 5.1047

11.2715 45.15

56.3997 61.6080 5.2083 46.35

(เฉลย) 45.75


119


ครงท






1 56.4028 61.6808 5.2780

11.1133 47.59

57.2443 62.4941 5.2498 47.15

(เฉลย) 47.37

2 55.4939 60.6835 5.1896

11.1722 45.82

56.3933 61.4950 5.1017 46.30

(เฉลย) 46.06

3 57.2313 62.8841 5.6528

11.3306 49.80

55.4982 61.0786 5.5804 49.34

(เฉลย) 49.57


120


ครงท






1 56.4134 61.7210 5.3076

11.2652 47.03

57.2502 62.7170 5.4668 48.62

(เฉลย) 47.82

2 56.3930 61.9611 5.5681

11.0932 49.42

56.4092 62.0042 5.5950 51.24

(เฉลย) 50.33

3 57.2384 62.8827 5.6443

11.2790 50.07

55.4979 60.9203 5.4224 48.05

(เฉลย) 49.06


121


ครงท






1 56.4132 61.2008 4.7876

11.0119 42.69

57.2495 61.9454 4.6959 43.44

(เฉลย) 43.07

2 55.5060 60.0284 4.5224

10.7975 42.79

56.3945 61.0051 4.6106 41.82

(เฉลย) 42.30

3 57.2395 61.9018 4.6623

11.1513 41.76

55.4993 59.9589 4.4596 40.04

(เฉลย) 40.90


122


ครงท






1 55.4831 59.9130 4.4299

10.9692 39.99

59.3049 63.7193 4.4144 40.65

(เฉลย) 40.32

2 56.3909 60.7026 4.3117

11.2815 38.21

57.2249 61.9194 4.6945 41.63

(เฉลย) 39.92

3 55.4784 59.9456 4.4672

11.1501 40.00

59.2998 63.8116 4.5118 40.53

(เฉลย) 40.26


123

ตารางท 62 รอยละผลผลตของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 300 หนวยตอกรมของแขงท pH 6.0 และอณหภม 43.18

องศาเซลเซยส เปนเวลา 3 ชวโมง

ครงท






1 56.3859 60.9173 4.5314

11.0522 40.87

57.2536 61.3596 4.1060 37.27

(เฉลย) 39.07

2 55.4792 59.7523 4.2731

11.1200 38.40

59.3019 63.9116 4.6097 41.48

(เฉลย) 39.94

3 56.3820 60.7992 4.4172

11.1320 39.28

57.2219 61.7464 4.5245 41.07

(เฉลย) 40.17


124

ตารางท 63 รอยละผลผลตของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 300 หนวยตอกรมของแขงท pH 6.0 และอณหภม 76.82


ครงท






1 55.5073 59.5527 4.0454

11.2219 35.95

59.3375 63.2753 3.9378 35.19

(เฉลย) 35.57

2 56.3915 60.6713 4.2798

11.3420 37.60

57.2273 61.3971 4.1698 36.90

(เฉลย) 37.25

3 55.6632 59.8271 4.1639

11.0130 37.52

59.3896 63.5324 4.1428 37.91

(เฉลย) 37.71


125

ตารางท 64 รอยละผลผลตของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 131.82 หนวยตอกรมของแขงท pH 6.0 และอณหภม 60


ครงท






1 55.4835 58.0177 2.5342

10.5279 23.96

59.3041 61.9171 2.6130 24.93

(เฉลย) 24.45

2 56.3891 59.0271 2.6380

10.6460 24.79

57.2243 59.6329 2.4086 22.62

(เฉลย) 23.70

3 55.4618 57.9960 2.5342

10.6955 23.71

59.2913 61.8191 2.5278 23.62

(เฉลย) 23.66


126



ครงท






1 55.5047 61.4372 5.9325

10.9768 53.14

59.3174 65.2469 5.9295 54.96

(เฉลย) 54.05

2 55.5066 61.2566 5.7500

10.9857 52.22

59.3299 65.4178 6.0879 55.55

(เฉลย) 53.88

3 56.4065 63.0524 6.6459

11.3751 58.12

57.2433 63.5457 6.3024 55.70

(เฉลย) 56.91


127

ตารางท 66 รอยละผลผลตของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 300 หนวยตอกรมของแขงท pH 6.0 และอณหภม 60 องศา เซลเซยส เปนเวลา 3 ชวโมง (1)

ครงท






1 56.3856 60.9885 4.6029

10.9775 41.72

57.2196 61.4547 4.2351 38.78

(เฉลย) 40.25

2 55.4825 60.2384 4.7559

11.2013 41.92

59.3039 63.8329 4.5290 40.96

(เฉลย) 41.44

3 56.3904 60.8110 4.4206

11.1389 39.47

57.2241 61.8185 4.5944 41.47

(เฉลย) 40.47


128

ตารางท 67 รอยละผลผลตของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 300 หนวยตอกรมของแขงท pH 6.0 และอณหภม 60 องศา เซลเซยสเปนเวลา 3 ชวโมง (2)

ครงท






1 56.4143 60.9853 4.5710

10.9954 41.41

57.2401 61.5658 4.3257 39.50

(เฉลย) 40.45

2 55.4968 60.0242 4.5274

11.0113 41.06

59.3223 64.2360 4.9137 44.69

(เฉลย) 42.87

3 55.5060 60.0429 4.5369

11.0157 41.68

59.3290 64.2411 4.9121 44.07

(เฉลย) 42.87


129


ครงท






1 57.2239 61.8092 4.5853

11.1636 41.00

55.4905 60.1234 4.6329 41.57

(เฉลย) 41.29

2 56.3926 61.0495 4.6569

11.1242 41.76

57.2392 61.7173 4.4781 40.36

(เฉลย) 41.06

3 55.4988 60.1017 4.6029

11.2141 41.00

56.3888 60.7735 4.3847 39.14

(เฉลย) 40.07


130


ครงท






1 56.4046 60.6007 4.1961

11.1084 37.62

57.2212 61.4122 4.1910 37.89

(เฉลย) 37.75

2 55.4932 59.9546 4.4614

11.1244 40.19

56.3854 60.9084 4.5230 40.57

(เฉลย) 40.38

3 57.2290 61.5284 4.2994

11.0253 38.74

55.4116 59.8100 4.3984 40.16

(เฉลย) 39.45


131


ครงท






1 56.4126 61.0288 4.6162

11.0720 41.90

57.2451 61.7331 4.4880 40.33

(เฉลย) 41.12

2 55.4927 60.1309 4.6382

11.1298 41.54

59.3227 64.0943 4.7716 43.02

(เฉลย) 42.28

3 56.4075 61.4177 5.0102

11.0393 45.31

57.3259 62.1387 4.8128 43.67

(เฉลย) 44.49


132


ครงท






1 55.4553 59.3828 3.9275

11.1690 35.07

59.2985 63.4991 4.2006 37.72

(เฉลย) 36.69

2 56.3656 60.7729 4.4073

11.2082 39.50

57.2148 61.7329 4.5181 40.13

(เฉลย) 39.81

3 56.3928 60.7118 4.3190

11.2431 38.38

57.2280 61.6683 4.4403 39.53

(เฉลย) 38.95


133

ผลการวเคราะหความสมพนธเชงพนทผวตอบสนองของรอยละการยอยสลายและรอยละผลผลต Design Summary Study Type Response Surface Experiments 20 Initial Design Central Composite Blocks No Blocks Design Model Quadratic

Response Name Units Obs Minimum Maximum Trans Model

Y1 %DH

20 23.94 48.21 None Quadratic

Y2 %yield


Y3 L*


Y4 a*

20 -2.24 0.31 None Quadratic

Y5 b*


Factor Name Units Type Low Actual High Actual Low Coded High Coded

A pH

Numeric 5 7 -1 1

B Temp. C Numeric 50 70 -1 1

C Enz. Activity unit/g protein Numeric 200 400 -1 1

134

ภาพท 23 ลกษณะคาความเบยงเบนมาตรฐานของการออกแบบพนทผวตอบสนองทไดจากการ

ทดลอง การวเคราะหทางสถตของพนทผวตอบสนองสาหรบรอยละการยอยสลาย Response: %DH ANOVA for Response Surface Quadratic Model Analysis of variance table [Partial sum of squares] Sum of Mean F Source Squares DF Square Value Prob > F Model 659.47 9 73.27 23.99 < 0.0001 significant A 0.20 1 0.20 0.064 0.8049 B 123.51 1 123.51 40.44 < 0.0001 C 473.90 1 473.90 155.17 < 0.0001

135

A2 17.47 1 17.47 5.72 0.0379

B2 2.95 1 2.95 0.96 0.3492

C2 27.93 1 27.93 9.14 0.0128 AB 4.03 1 4.03 1.32 0.2774 AC 6.101E-003 1 6.101E-003 1.998E-003 0.9652 BC 4.19 1 4.19 1.37 0.2684 Residual 30.54 10 3.05 Lack of Fit 7.06 5 1.41 0.30 0.8933 not significant Pure Error 23.48 5 4.70 Cor Total 690.01 19 Std. Dev. 1.75 R-Squared 0.9557 Mean 37.92 Adj R-Squared 0.9159 C.V. 4.61 Pred R-Squared 0.8734 PRESS 87.38 Adeq Precision 19.814 Final Equation in Terms of Coded Factors:

%DH = 37.81 - 0.12 A + 3.01B + 5.89C + 1.10A2 + 0.45B2 - 1.39C2 - 0.71AB - 0.028AC + 0.72BC Final Equation in Terms of Actual Factors:

%DH = 33.18313 - 8.98921*pH - 0.033208*Temp + 0.10065*Enz. Activity +1.10086*pH2

+ 4.52138E-003*Temp.2 - 1.39210E-004*Enz. Activity2 - 0.070971*pH*Temp. - 2.76164E-004*pH*Enz. Activity + 7.24020E-004*Temp.*Enz. Activity

136

การวเคราะหทางสถตของพนทผวตอบสนองสาหรบรอยละผลผลต Response: %yield ANOVA for Response Surface Quadratic Model Analysis of variance table [Partial sum of squares] Sum of Mean F Source Squares DF Square Value Prob > F Model 1070.49 9 118.94 49.11 < 0.0001 significant A 0.16 1 0.16 0.065 0.8037 B 0.94 1 0.94 0.39 0.5479 C 1050.90 1 1050.90 433.90 < 0.0001

A2 0.12 1 0.12 0.049 0.8292

B2 12.02 1 12.02 4.96 0.0501

C2 3.67 1 3.67 1.52 0.2462 AB 0.027 1 0.027 0.011 0.9180 AC 0.50 1 0.50 0.21 0.6585 BC 2.75 1 2.75 1.13 0.3119 Residual 24.22 10 2.42 Lack of Fit 11.01 5 2.20 0.83 0.5765 not significant Pure Error 13.21 5 2.64 Cor Total 1094.71 19 Std. Dev. 1.56 R-Squared 0.9779 Mean 39.74 Adj R-Squared 0.9580 C.V. 3.92 Pred R-Squared 0.9052 PRESS 103.83 Adeq Precision 26.812

137

Final Equation in Terms of Coded Factors:

%yield = 40.65 + 0.11A - 0.26B + 8.77C + 0.091A2 - 0.91B2 - 0.50C2 + 0.058AB - 0.25AC + 0.59BC Final Equation in Terms of Actual Factors:

%yield = -10.76159 - 0.57896*pH + 0.85887*Temp. + 0.097895*Enz. Activity +

0.090798*pH2-9.13108E-003*Temp.2 - 5.04942E-005*Enz. Activity2 + 5.81124E-003*pH*Temp.-2.50601E-003*pH*Enz. Activity + 5.85988E-004*Temp.*Enz. Activity

138

ผลการวเคราะหหาสภาวะทเหมาะสมตอการผลต HVP จากโปรตนสกดจากถวเหลองดวยเอนไซม Collupulin MG โดยใชโปรแกรม Design Expert 6.0.5 Constraints Lower Upper Lower Upper Name Goal Limit Limit Weight Weight Importance pH is in range 5 7 1 1 3 Temp. is in range 50 70 1 1 3 Enz. Activity minimize 200 400 1 1 3 %DH maximize 23.9387 48.2112 1 1 5 %yield maximize 23.9327 54.9421 1 1 4 Solutions Number pH Temp. Enz. Activity %DH %yield Desirability 1 5.00 70.00 318.25 44.37 41.1343 0.611 2 7.00 70.00 318.21 42.6985 41.3696 0.593 3 6.29 70.00 320.23 42.4063 41.3848 0.585

139

ผลรอยละการยอยสลายเพอการคดเลอกสภาวะทเหมาะสมตอการผลต HVP ตารางท 72 รอยละการยอยสลายของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม

Collupulin MG ทม กจกรรมเปน 318.25 หนวยตอกรมของแขงท pH 5.0 และ อณหภม 70 องศาเซลเซยส เปนเวลา 3 ชวโมง

ครงท






Serine-NH2 (meqv serine-NH2/กรมโปรตน)


1

0.891 0.2 0.834 0.7343 4.266 3.250 2.998 38.430 0.931 0.183 0.866

0.928 0.148 0.868

0.893 0.192 0.885

(เฉลย) 0.911 0.181 0.863

2

0.945 0.149 0.879 0.71 4.266 3.459 3.213 41.192 0.909 0.181 0.867

0.94 0.194 0.879

0.951 0.15 0.839

(เฉลย) 0.936 0.169 0.866

3

0.958 0.15 0.883 0.7277 4.266 3.410 3.163 40.555 0.927 0.181 0.873

0.942 0.196 0.875

0.958 0.151 0.84

(เฉลย) 0.94625 0.1695 0.86775


140

ตารางท 73 รอยละการยอยสลายของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin MG ทม กจกรรมเปน 318.21 หนวยตอกรมของแขงท pH 7.0 และ อณหภม 70 องศาเซลเซยส เปนเวลา 3 ชวโมง

ครงท

คาการดดกลนแสงของตวอยาง





Serine-NH2



1

0.827 0.179 0.838 0.7182 4.266 3.026 2.767 35.480 0.859 0.196 0.882

0.876 0.149 0.873

0.832 0.18 0.872

(เฉลย) 0.849 0.176 0.866

2

0.851 0.179 0.831 0.7158 4.266 3.116 2.859 36.658 0.88 0.195 0.884

0.896 0.15 0.887

0.851 0.178 0.877

(เฉลย) 0.870 0.176 0.870

3

0.902 0.179 0.885 0.7284 4.266 3.155 2.900 37.182 0.879 0.151 0.845

0.859 0.193 0.844

0.901 0.184 0.884

(เฉลย) 0.88525 0.17675 0.8645


141

ตารางท 74 รอยละการยอยสลายของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin MG ทม กจกรรมเปน 320.23 หนวยตอกรมของแขงท pH 6.29 และ อณหภม 70 องศาเซลเซยส เปนเวลา 3 ชวโมง

ครงท

คาการดดกลนแสงของตวอยาง





Serine-NH2



1

0.934 0.187 0.887 0.7182 4.266 3.348 3.099 39.730 0.927 0.156 0.853

0.889 0.200 0.846 0.928 0.185 0.879 (เฉลย) 0.920 0.182 0.866

2

0.875 0.206 0.863 0.7187 4.266 3.161 2.906 37.261 0.918 0.192 0.892

0.911 0.156 0.881 0.878 0.203 0.895 (เฉลย) 0.896 0.189 0.883

3

0.9 0.19 0.852 0.7086 4.266 3.383 3.135 40.192 0.941 0.204 0.901

0.949 0.158 0.878 0.909 0.191 0.863 (เฉลย) 0.92475 0.18575 0.8735


142

ผลรอยละผลผลตเพอการคดเลอกสภาวะทเหมาะสมตอการผลต HVP ตารางท 75 รอยละผลผลตของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin

MG ทมกจกรรมเปน 318.25 หนวยตอกรมของแขงท pH 5.0 และอณหภม 70


ครงท






1 56.4177 60.1796 3.7619 11.0929

11.1348 33.91

57.2524 60.8301 3.5777 32.13

(เฉลย) 33.02

2 55.5100 59.0486 3.5386 11.0174

11.2109 32.12

56.4030 60.1174 3.7144 33.13

(เฉลย) 32.63

3 56.4061 59.9646 3.5585 11.0689

11.0214 32.15

55.4860 59.0311 3.5451 32.17

(เฉลย) 32.16


143



ครงท






1 56.4072 60.1154 3.7082 10.9704

10.8016 33.80

55.4992 59.1711 3.6719 33.99

(เฉลย) 33.90

2 56.4040 59.9306 3.5266 10.9611

10.9237 32.17

57.2425 60.8543 3.6118 33.06

(เฉลย) 32.62

3 55.4840 59.1193 3.6353 10.9871

10.4997 33.09

57.2363 60.8896 3.6533 34.79

(เฉลย) 33.94


144



ครงท






1 56.3967 59.7499 3.3532 10.9348

10.9703 30.67

56.3973 59.7327 3.3354 30.40

(เฉลย) 30.53

2 57.2419 60.6262 3.3843 10.9161

11.0208 31.00

57.2293 60.7175 3.4882 31.65

(เฉลย) 31.33

3 55.5033 59.1141 3.6108 11.1079

11.0994 32.51

55.4902 59.0695 3.5793 32.25

(เฉลย) 32.38


145

ผลรอยละการยอยสลายเพอการคดเลอกระยะเวลาทเหมาะสมตอการผลต HVP ตารางท 78 รอยละการยอยสลายของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin MG ทมกจกรรมเปน 318.25 หนวยตอกรมของแขงท pH 5.0 และ อณหภม 70 องศาเซลเซยส เปนเวลา 1 ชวโมง

ครงท






Serine-NH2



1

0.825 0.166 0.881 0.7158 4.266 2.933 2.671 34.24 0.837 0.155 0.852

0.816 0.162 0.866

0.831 0.161 0.877

(เฉลย) 0.827 0.161 0.869

2

0.740 0.155 0.872 0.708 4.266 2.620 2.349 30.11 0.758 0.158 0.875

0.753 0.158 0.87

0.757 0.162 0.872

(เฉลย) 0.752 0.158 0.872

3

0.767 0.158 0.874 0.7058 4.266 2.680 2.410 30.90 0.771 0.157 0.865

0.759 0.161 0.878

0.769 0.157 0.886

(เฉลย) 0.767 0.158 0.876


146


ครงท






Serine-NH2



1

0.889 0.160 0.888 0.7169 4.266 3.093 2.836 36.36 0.886 0.164 0.884

0.903 0.162 0.908

0.887 0.160 0.903

(เฉลย) 0.891 0.162 0.896

2

0.875 0.169 0.883 0.734 4.266 2.999 2.739 35.12 0.879 0.163 0.886

0.877 0.162 0.882

0.871 0.168 0.889

(เฉลย) 0.876 0.166 0.885

3

0.798 0.172 0.88 0.7136 4.266 2.752 2.485 31.86 0.804 0.163 0.884

0.800 0.165 0.891

0.804 0.168 0.896

(เฉลย) 0.802 0.167 0.888


147


ครงท






Serine-NH2



1

0.924 0.160 0.884 0.7121 4.266 3.318 3.068 39.332 0.926 0.155 0.880

0.925 0.154 0.878

0.923 0.162 0.885

(เฉลย) 0.925 0.158 0.882

2

0.911 0.160 0.876 0.7179 4.266 3.215 2.961 37.966 0.912 0.155 0.882

0.904 0.155 0.889

0.907 0.159 0.887

(เฉลย) 0.909 0.157 0.884

3

0.909 0.161 0.883 0.7102 4.266 3.228 2.975 38.143 0.915 0.153 0.884

0.901 0.153 0.897

0.921 0.160 0.901

(เฉลย) 0.912 0.157 0.891


148


ครงท






Serine-NH2



1

0.874 0.173 0.889 0.6153 4.266 3.572 3.329 42.685 0.885 0.166 0.864

0.871 0.165 0.891

0.875 0.169 0.904

(เฉลย) 0.876 0.168 0.887

2

0.882 0.168 0.885 0.6289 4.266 3.562 3.320 42.560 0.900 0.167 0.884

0.893 0.169 0.89

0.894 0.169 0.898

(เฉลย) 0.892 0.168 0.889

3

0.928 0.173 0.888 0.6135 4.266 3.655 3.416 43.793 0.949 0.166 0.936

0.940 0.166 0.884

0.946 0.174 1.039

(เฉลย) 0.941 0.170 0.937


149


ครงท






Serine-NH2



1

0.856 0.161 0.871 0.6037 4.266 3.628 3.388 43.431 0.851 0.166 0.855

0.845 0.17 0.862

0.850 0.161 0.865

(เฉลย) 0.851 0.165 0.863

2

0.869 0.194 0.879 0.6028 4.266 3.629 3.388 43.440 0.877 0.187 0.873

0.861 0.189 0.877

0.867 0.193 0.899

(เฉลย) 0.869 0.191 0.882

3

0.889 0.169 0.867 0.6169 4.266 3.570 3.327 42.659 0.896 0.166 0.864

0.893 0.166 0.973

0.895 0.171 0.907

(เฉลย) 0.893 0.168 0.903


150


ครงท






Serine-NH2



1

0.988 0.157 0.895 0.6102 4.266 4.124 3.899 49.984 0.988 0.161 0.887

0.992 0.159 0.898

0.976 0.161 0.889

(เฉลย) 0.986 0.160 0.892

2

0.988 0.162 0.891 0.6034 4.266 4.165 3.941 50.524 0.992 0.171 0.898

0.992 0.16 0.897

0.981 0.163 0.897

(เฉลย) 0.988 0.164 0.896

3

0.931 0.159 0.898 0.6043 4.266 3.900 3.668 47.031 0.929 0.164 0.896

0.941 0.173 0.891

0.943 0.163 0.894

(เฉลย) 0.936 0.165 0.895


151


ครงท






Serine-NH2



1

1.008 0.163 0.907 0.5943 4.266 4.304 4.085 52.367 1.001 0.165 0.911

0.994 0.17 0.865

0.999 0.164 0.892

(เฉลย) 1.001 0.166 0.894

2

0.995 0.166 0.896 0.6053 4.266 4.189 3.965 50.840 0.996 0.173 0.904

1.019 0.195 0.916

1.007 0.168 0.903

(เฉลย) 1.004 0.176 0.905

3

0.993 0.167 0.884 0.6065 4.266 4.142 3.917 50.224 0.999 0.175 0.913

1.005 0.166 0.907

0.973 0.165 0.897

(เฉลย) 0.993 0.168 0.900


152

ผลรอยละผลผลตเพอการคดเลอกระยะเวลาทเหมาะสมตอการผลต HVP ตารางท 85 รอยละผลผลตของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวยเอนไซม Collupulin

MG ทมกจกรรมเปน 318.25 หนวยตอกรมของแขงท pH 5.0 และอณหภม 70


ครงท






1 56.4109 60.0391 3.6282 10.9612

11.0194 33.10

57.2489 60.9278 3.6789 33.39

(เฉลย) 33.24

2 55.6482 58.8317 3.1835 10.9369

10.9834 29.11

56.4008 59.7357 3.3349 30.36

(เฉลย) 29.74

3 57.2272 60.4384 3.2112 11.0077

11.0200 29.17

55.4961 58.9002 3.4041 30.89

(เฉลย) 30.03


153



ครงท






1 56.3888 59.7532 3.3644 10.9886

11.0270 30.62

57.2487 60.8828 3.6341 32.96

(เฉลย) 31.79

2 55.5248 58.9547 3.4299 10.9098

10.9185 31.44

56.4033 59.8246 3.4213 31.33

(เฉลย) 31.39

3 55.4771 59.0555 3.5784 10.8856

11.0090 32.87

56.3942 60.0523 3.6581 33.23

(เฉลย) 33.05


154



ครงท






1 56.4106 60.0269 3.6163 11.0053

11.0637 32.86

56.3916 59.8545 3.4629 31.30

(เฉลย) 32.08

2 55.5056 58.9264 3.4208 10.907

10.953 31.36

106.1799 109.3719 3.192 29.14

(เฉลย) 30.25

3 126.3389 129.7041 3.3652 10.9495

10.9899 30.73

97.9202 101.301 3.3808 30.76

(เฉลย) 30.75


155



ครงท






1 56.395 59.7165 3.3215 10.9807

10.9884 30.25

55.4779 58.7595 3.2816 29.86

(เฉลย) 30.06

2 106.1801 109.4622 3.2821 11.0143

11.0796 29.80

126.3256 129.5805 3.2549 29.38

(เฉลย) 29.59

3 97.9144 101.2433 3.3289 10.9646

10.9454 30.36

56.3986 59.8713 3.4727 31.73

(เฉลย) 31.04


156



ครงท






1 55.499 58.933 3.434 10.931

10.9204 31.42

106.1872 109.3664 3.1792 29.11

(เฉลย) 30.26

2 126.3453 129.6875 3.3422 10.9574

10.9909 30.50

97.9359 101.2089 3.273 29.78

(เฉลย) 30.14

3 56.3913 59.6972 3.3059 10.9762

10.9455 30.12

55.4842 58.8994 3.4152 31.20

(เฉลย) 30.66


157



ครงท






1 106.1883 109.5636 3.3753 10.9375

10.9408 30.86

126.3421 129.6055 3.2634 29.83

(เฉลย) 30.34

2 97.8966 101.4205 3.5239 10.9835

11.0428 32.08

56.3873 60.0484 3.6611 33.15

(เฉลย) 32.62

3 106.1969 109.4929 3.296 10.9019

10.9335 30.23

126.3485 129.7188 3.3703 30.83

(เฉลย) 30.53


158



ครงท






1 56.4131 59.9986 3.5855 10.9053

10.9367 32.88

55.5061 59.0752 3.5691 32.63

(เฉลย) 32.76

2 106.231 109.6847 3.4537 11.0522

11.0664 31.25

126.3775 129.8684 3.4909 31.55

(เฉลย) 31.40

3 97.9515 101.564 3.6125 11.0144

10.9378 32.80

55.4928 58.8854 3.3926 31.02

(เฉลย) 31.91


159

คาสเพอการคดเลอกระยะเวลาทเหมาะสมตอการผลต HVP ตารางท 92 อทธพลของระยะเวลาตอคาสของโปรตนสกดจากถวเหลองทผานการยอยดวย


ระยะเวลาทใช (ชวโมง)

L* a* b*

1 15.99 -0.51 7.46

14.72 -0.98 4.41

14.38 -1.06 4.78

(เฉลย) 15.03 0.85 -0.85 0.30 5.55 1.66 2 11.68 -1.36 3.31

11.91 -1.43 3.92

11.68 -1.03 2.96

(เฉลย) 11.76 0.13 -1.27 0.21 3.40 0.49 3 14.99 0.18 3.37

14.07 -0.44 3.24

13.23 -0.62 2.84

(เฉลย) 14.10 0.88 -0.29 0.4 3.15 0.28 6 10.56 -1.24 3.75

10.44 -1.19 2.93

10.71 -1.11 3.37

(เฉลย) 10.57 0.14 -1.18 0.07 3.35 0.41 9 9.3 -0.89 2.46

9.1 -1.23 2.41

10.4 -0.91 3.85

(เฉลย) 9.60 0.70 -1.01 0.19 2.91 0.82

160

ระยะเวลาทใช (ชวโมง)

L* a* b*

12 8.02 -0.53 3.08

7.51 -0.89 2.55

8.77 -1.21 2.91

(เฉลย) 9.60 0.70 -1.01 0.19 2.91 0.82 24 7.84 -0.3 3.37

8.5 -0.3 3.24

7.87 -0.33 2.84

(เฉลย) 8.07 0.37 -0.31 0.02 3.15 0.28

ภาคผนวก ค

162

แบบทดสอบทางประสาทสมผส การทดสอบ Generic Descriptive Analysis

ชอ วนท รหส ค าแนะน าแกผทดสอบ : ผทดสอบจะไดรบตวอยางสารละลาย 4 ตวอยาง ใหทาการประเมนตวอยางตามลาดบทนาเสนอ ถาตองการความชวยเหลอใด ๆ หรอตองการตวอยางเพมใหทาการใหสญญาณ และลางปากดวยนากอนทาการทดสอบและระหวางทาการทดสอบจากตวอยางหนงไปยงอกตวอยางหนงทกครง เมอเสรจสนการทดสอบใหทาการสงสญญาณอกครง ขอบคณคะ 1. ส weak strong 2. กลนไก weak strong 3. รสชาต 3.1หวาน weak strong 3.2 ขม weak strong

163

ประวตผวจย

ชอ – สกล นางสาวปยนช ไพโรจนกลยา ทอย 146 ถนนกมภล ตาบลหวยจรเข อาเภอเมองนครปฐม จงหวดนครปฐม ทท างาน บรษท เอฟ-พลส จากด ประวตการศกษา

พ.ศ. 2544 สาเรจการศกษาวทยาศาสตรบณฑต วชาเอกวทยาศาสตรและเทคโนโลยการอาหาร มหาวทยาลยราชภฏสวนดสต

พ.ศ. 2553 ศกษาตอระดบปรญญามหาบณฑต สาขาวชาเทคโนโลยอาหาร มหาวทยาลยศลปากร อาเภอเมองนครปฐม จงหวดนครปฐม

ประวตการท างาน พ.ศ. 2548 - 2551 เจาหนาทฝายควบคมคณภาพ บรษท เอฟ-พลส จากด พ.ศ. 2552 – 2553 หวหนาแผนกควบคมคณภาพ บรษท เอฟ-พลส จากด พ.ศ. 2554 – 2555 ผชวยผจดการฝายควบคมคณภาพ บรษท เอฟ-พลส จากด พ.ศ. 2556 – ปจจบน ผจดการฝายควบคมคณภาพ บรษท เอฟ-พลส จากด การน าเสนอผลงาน ธนวาคม พ.ศ. 2556 สทธพงศ โพธสขสรกล, ประภสสร สดศร, ปยนช ไพโรจนกลยาและ อรณศร ลจรจาเนยร. การศกษาสภาวะทเหมาะสมสาหรบการยอย

โปรตนสกดจากถวเหลองเพอผลตผกไฮโดรไลซดวยเอนไซม. การประชมวชาการระดบชาตทางดานวศวกรรมศาสตรและเทคโนโลย. 2556. คณะวศวกรรมศาสตรและเทคโนโลยอตสาหกรรม มหาวทยาลยศลปากร.

Documents

2556 · The types of volatiles compounds were analyzed by GC-MS. The results revealed that 15 % HVP gave the The results revealed that 15 % HVP gave the highest acceptance from the