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17.10.2013
The Nature of Hydrogen Bonds in
Cytidine-H+-Cytidine DNA Base Pairs
A. L. Lieblein, M. Krämer, A. Dreuw, B. Fürtig, H. Schwalbe, Angew. Chem. Int. Ed.
2012, 51, 4067 –4070.
Seminar „Moderne Anwendungen der Magnetischen
Resonanz“
Annabell Peters
17.10.20
1 17.10.2013
i-Motiv
• Nicht kanonische Basenpaarung
• Semiprotonierte Cytidin···H+···Cytidin-Basenpaare (C·C+)
• pH-Wert ≈ 6
• DNA Sequenz: d(CCCTAA)3CCC
C8
A6
C7
C9
C14
T16
C15
C13
A17
A12 T10
A11
5‘
3‘
C2
T4
C3
C1
C20
A18
C19
C21
A5
Abb. 1: C·C+ Basenpaar.
Abb.2: DNA i-Motiv-Struktur.
N
O
R1
N
H
H
H
N
O
R2
N
H
H
N
N+
2 17.10.2013
Art der Wasserstoffbrückenbindung
1. Symmetrische Wasserstoffbrückenbindung
N------H------N
2. Asymmetrische Wasserstoffbrückenbindung
ka
kb
Na----H--------Nb Na--------H----Nb
N
NO
NH2N
N+
O
NH2
H
R1
R2
N
N
O
NH2
R2
N+
NO
NH2
R1
H
ka
kb
Abb. 3: NH+N Wasserstoffbindungen im semiprotonierten C·C+ Basenpaar.
3 17.10.2013
Untersuchung der C·C+- Bindung
NMR Spektroskopisch
• Selektiv Isotopenmarkierte DNA Stränge
• 1D 15N HMQC, 2D 1H-15N HMQC NMR Experimente
• Bestimmung von:
1J(NH) Kopplungskonstanten
1H 15N chemische Verschiebungen
Solvenz Austauschparameter
Quantenmechanische Untersuchungen
• density functional theory (DFT)
• Bestimmung von:
Elektronische Struktur der Wasserstoffbindung
Dynamik der Wasserstoffbindung
4 17.10.2013
NMR- Untersuchungen
• Labeling:
Immer ein Cytidin ist 50% 13C und 50% 15N angereichert
12 verschiedene, selektiv markierte DNA Sequenzen
• 1J(N3a,H3) und 1J(N3b,H3) Kopplungskonstanten von allen Cytidinen konnten
bestimmt werden
• 2hJ(N3a, N3b) und 1hJ(H3,N3) Kopplungen wurden größtenteils unterdrückt
• Wasserstoffaustauschexperimente:
Austauschhalbzeit t1/2 im Sekundenbereich
Austausch ist langsamer als in einer DNA-Doppelhelix, da C·C+-Basenpaare stabiler
sind
5 17.10.2013
Chemische Verschiebung
• 1H chemische Verschiebung ist gleich (Δδ(1H)≈0.01-0.02 ppm)
• 15N chemische Verschiebung ist unterschiedlich (Δδ(15N)≈0.45-2.92 ppm)
Basenpaar δ(1H) [ppm] δ(15N) [ppm]
Δδ(15N)
[ppm]
(15N)C7-C19 15.31 193.40 2.92
C7-(15N)C19 15.32 190.48
(15N)C3-C15 15.46 190.73 0.61
C3-(15N)C15 15.47 190.12
(15N)C8-C20 15.73 191.11 0.45
C8-(15N)C20 15.74 191.56
(15N)C2-C14 15.62 192.60 2.73
C2-(15N)C14 15.60 189.87
(15N)C9-C21 15.53 191.51 -
C9-(15N)C21 - -
(15N)C13-C1 15.49 190.20 1.32
C13-(15N)C1 15.47 191.52
Abb.4: 1D 15N-HMQC, 2D 1H15N-HMQC von C3 und
C15.[1]
Tab. 1:1H und15N chemische Verschiebungen aus 15N-
HMQC.[1]
6 17.10.2013
Kopplungskonstanten
Basenpaar
1J(NH) [Hz] Δ1J(NH) [Hz]
theoretisch (c/h/m) expt theoretisch expt
(15N)C7-C19 54.3/4.6/23.8 36 12.0 10
C7-(15N)C19 55.1/5.1/35.8 46
(15N)C3-C15 63.2/0.0/28.9 42 5.3 2
C3-(15N)C15 63.2/0.0/34.2 44
(15N)C8-C20 63.6/0.1/31.1 42 1.4 0
C8-(15N)C20 63.5/0.1/32.5 42
(15N)C2-C14 64.0/0.1/27.6 39 8.9 7
C2-(15N)C14 63.9/0.1/36.5 46
(15N)C9-C21 64.3/0.2/29.9 41 4.8 -
C9-(15N)C21 64.3/0.3/34.7 -
(15N)C13-C1 63.8/0.0/28.6 45 6.7 0*
C13-(15N)C1 63.9/0.0/35.3 45*
Tab. 2: experimentell Bestimmte und berechnete 1J(NH) Kopplungskonstanten der
Wasserstoffbindung in den Basenpaaren (c: kovalent gebunden, h: Wasserstoffbrückenbindung,
m: populationsgewichteter Mittelwert, *große Fehler in den experimentellen Werten).
7 17.10.2013
Konformere
• 2 verschiedene Konformere des DNA i-Motivs
• 1J(NH) Kopplungskonstanten beider Konformere sind
ähnlich
Abb. 5: Haupt-und Nebenkonformation des DNA i-Motivs.[2]
Abb. 6: 15N gefiltertes 1D Experiment.[1]
8 17.10.2013
Quantenmechanische Untersuchungen
• Berechnung der NMR Parameter mittels DFT
• Modelle wurden konstruiert aus
NMR Daten (PDB)
Geometrieoptimierung
• Berechnung von:
Energiedifferenzen
Relative Bolzmanverteilung
1J(NH) Kopplungskonstanten
9 17.10.2013
Quantenmechanische Untersuchungen
• Protonentransfer-Barriere beruht auf dem N-N-Abstand
• Normaler N-N Abstand: 2,6-2,8 Å
Energiebarriere höchstens 6 kcal mol-1
Protonentransfer mind. 108 s-1
Abb. 7: Energiebarriere und resultierende
Wasserstoff-Austauschrate zwischen den
Stickstoffatomen in einem C·C+ Basenpaar.[1]
10 17.10.2013
Berechnete und Experimentelle Werte
Basenpaare ΔE [kcal mol−1] Relative population 1J(NH) [Hz] Δ1J(NH) [Hz]
theory expt theoretisch (c/h/m) expt theoretisch expt
(15N)C7-C19 0.278 0.62 0.78
54.3/4.6/23.8 36 12.0 10
C7-(15N)C19 55.1/5.1/35.8 46
(15N)C3-C15 0.099 0.85 0.95
63.2/0.0/28.9 42 5.3 2
C3-(15N)C15 63.2/0.0/34.2 44
(15N)C8-C20 0.027 0.96 1.00
63.6/0.1/31.1 42 1.4 0
C8-(15N)C20 63.5/0.1/32.5 42
(15N)C2-C14 0.165 0.76 0.84
64.0/0.1/27.6 39 8.9 7
C2-(15N)C14 63.9/0.1/36.5 46
(15N)C9-C21 0.091 0.86 n.d.
64.3/0.2/29.9 41 4.8 -
C9-(15N)C21 64.3/0.3/34.7 -
(15N)C13-C1 0.123 0.82 1.00
63.8/0.0/28.6 45 6.7 0
C13-(15N)C1 63.9/0.0/35.3 45
Tab. 3: Berechnete sowie experimentell bestimmte Werte der N-H+-N- Bindungen im i-Motiv.[1]
11 17.10.2013
N···H+···N-Bindung
• asymmetrisches doppeltes Wannenpotential
• Verschiedene Potentialminima für den Protonentransfer
• Verschiedene Raten für den Hin- und Rück-Transfer
Abb. 8: Energiediagramm der N-H+-N-Bindung.[1]
12 17.10.2013
Positionen der Protonen
• 1J(NH) ≈45 Hz
Die Protonen sind nicht an nur einem Stickstoffatom
lokalisiert
• 1J(NH) Kopplungskonstanten und 15N chemische
Verschiebungen variieren für jedes Basenpaar
• QM Rechnungen spiegelten diese kleinen Unterschiede
wieder
Protonenkonzentration an den Cytidin-Resten C14, C15,
C19, C20 und C21 sind leicht höher
C8
A6
C7
C9
C14
T16
C15
C13
A17
A12 T10
A11
5‘
3‘
C2
T4
C3
C1
C20
A18
C19
C21
A5
Abb. 9: Das i-Motiv. Die rot
markierten Cytidine weisen eine
leicht erhöhte
Protonenkonzentration auf.
13 17.10.2013
Positionen der Protonen
• Vermutung:
asymmetrische π-Stapeln der sechs Basenpaare
elektrostatische Repulsion
• Bevorzugte Position eines Protons:
größter Abstand zum Proton des nächsten C-C+-Basenpaars
Nächstes Proton sitzt an der gegenüberliegenden Seite
der großen Furche
• Vermutung: gekoppelter Protonentransfer entlang des i-
Motivs
C8
C7
C9
H+C14
H+C15
C2
C3 C20H
+
C19H+
C21H+
≈ ≈ ≈
≈ ≈ ≈ ≈
≈
Große Furche
Kleine Furche
Abb. 10: Ausschnitt aus dem
i-Motiv. Die Protonen-
konzentration ist an den rot
markierten Cytidinen etwas
höher.
14 17.10.2013
2D 1H-15N SOFAST-HMQC
• Band-Selective Optimized Flip-Angle Short-Transient heteronuclear multiple
quantum coherence (SOFAST-HMQC) Experiment
• Für 15N und 13C-markierte Makromoleküle
• Flip-Winkel α
Ernstwinkel: βopt = cos-1(exp(-Trec/T1))
Verbesserte Wiederholungsrate ohne Verlust an S/N pro Messzeit
• Bandenselektive 1H Pulse
Verbesserte Spin-Gitter Relaxation T1
α
z
x
y
Abb.11 Darstellung des
Flipwinkels im Vektorraum.
Abb.12: Pulssequenz des SOFAST-HMQC Experiments. X = 13C oder 15N.
15 17.10.2013
Quellen
[1] A. L. Lieblein, M. Krämer, A. Dreuw, B. Fürtig, H. Schwalbe, Angew. Chem. Int.
Ed. 2012, 51, 4067 –4070.
[2] A. L. Lieblein, J. Buck, K. Schlepckow, B. Fürtig, H. Schwalbe, Angew. Chem.
2012, 124, 255 – 259.
[3] P. Schanda, B. Brutscher, J Am Chem Soc 2005, 127, 8014-8015.
[4] P. Schandaa, E. Kupce, B. Brutschera, J Biomol NMR 2005, 33, 199-211.