The Complete General Secretory Pathway in Gram Negative Bacteria

8/2/2019 The Complete General Secretory Pathway in Gram Negative Bacteria

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M I C R O B I O LO G I C A L R E V I E WS , M a r . 1 9 9 3 , p . 5 0 - 1 0 8 V o l . 5 7 , N o . 10 1 4 6 - 0 7 4 9 / 9 3 / 0 1 0 0 5 0 - 5 9 $ 0 2 . 0 0 / 0C o p y r i g h t 1 9 9 3 , A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g Y

T h e C o m p l e t e G e n e r a l S e c r e t o r y P a t h w a y i nG r a m - N e g a t i v e B a c t e r i a tANTHONY P . PUGSLEY

U n i t e 6 d e G e n e t i q u e M o l e c u l a i r e , I n s t i t u t P a s t e u r , 2 5 r u e d u D r . R o u x , P a r i s 7 5 7 2 4 C ed e x , F r a n c eINTRODUCTION TO THE GENERAL SECRETORY PATHWAY. . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . .. . . . 5 1TRANSLOCATION ACROSS THE CYTOPLASMIC MEMBRANE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .5 1E s s e n t i a l E l e m e n t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 1M e t h o d o l o g y......... 5 1S i g n a l p e p t i d e s......... 5 3S e c B p r o t e i n......... 5 3S e c A p r o t e i n......... 5 4I n t e g r a l m e m b r a n e S e c p r o t e i n s . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . .. . . 5 6S e c r e t o r y p r o t e i n t r a n s l o c a s e i n e u k a r y o t e s . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 5 7R e c o g n i t i o n a n d I n s e r t i o n . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . .. . . . 5 7Membrane p h o s p h o l i p i d s . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . .. . . . . . . 5 7P i l o t s a n d r e c e p t o r s . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . .. . . 5 8T r a n s l o c a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 9T r a n s l o c a t i o n c h a n n e l . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . .. 5 9An e x p o r t - s p e c i f i c d o m a i n i n t h e c y t o p l a s m i c m e m b r a n e ? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 0T r a n s l o c a t i o n c o m p e t e n c e . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . .. 6 0C o t r a n s l a t i o n a l t r a n s l o c a t i o n . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . 6 1E n e r g y r e q u i r e m e n t s . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . 6 2R e l e a s e f r o m t h e t r a n s l o c a t i o n c h a n n e l . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . 6 3A n y t h i n g E l s e ?.................. ........................ . . . . . . . . . . . .4A b a c t e r i a lS e c - I n d e p e n d e n t T r a n s l o c a t i o n ........ ............ ...6 5P r o c e s s i n g...................................66S i g n a l peptidases.......6...................6D o e s c l e a v a g e i n d i c a t e t r a n s l o c a t i o n ?9.6...7......................................00.....67E u k a r y o t i c s i g n a l p e p t i d a s e s............. . . . . . . . . 6 7 o o o o o o o o o o o o o o o o o . . . . . . . . . . . . . . . .7INTEGRAL CYTOPLASMIC MEMBRANEPROTEINS......7B i t o p i c MembraneProteins.67P o l y t o p i c MembraneProteins...... 6 9W o r k i n gmodels...............9T h e d a t a.............................oo....6 9M o n o t o p i c MembraneProteins.72P r o t e i n s w i t h a m p h i p a t h i c h e l i c a l anchors........................7 2L i p o p r o t e i n s..... 7 3PERIPLASM..........................................................74P r o t e i n F o l d i n g i n t h ePeriplasm...........74D i s u l f i d e b o n d f o r m a t i o n a n disomerization........5P r o l i n e isomerization.75G e n e r a l m o l e c u l a rchaperones.75S p e c i f i c m o l e c u l a r chaperones.76E n d o c h a p e r o n e s .........................................................76OUTER MEMBRANE PROTEINS....................77S t r u c t u r e a n d T o p o l o g y.................77P e r i p l a s m i c Intermediates.78C o n f o r m a t i o n a l C h a n g e s a n d R o l e o f LPS........7 9S e q u e n c e A l t e r a t i o n s C o m p r o m i s e O u t e r MembraneInsertion.79TERMINAL BRANCHES OF T HEGSP.80E n t e r o b a c t e r i a lT y p e I V P i l i ...... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .ooooooo_83P r o c e s s i n g a n d modification.83O t h e r a s s e m b l y f a c t o r s......................4M a i n T er m i n a l B r a n c h ........................................................ 8 5

t T h i s r e v i e w i s d e d i c a t e d t o t h e memory o f P h i l B a s s f o r d , whow a s , q u i t e s i m p l y , on e o f t h e b e s t .

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GENERAL SECRETORY PATHWAY 5 1P u l l u l a n a s e s e c r e t i o n p a t h w a y : an u p d a t e .................................... 8 6O t h e r b a c t e r i a .................................... 8 8Common e l e m e n t s i n o t h e r s y s t e m s .................................... 8 9E n e r g y c o u p l i n g .................................... 9 0S e l e c t i v i t y ........................................ 9 1O t h e r T e r m i n a l B r a n c h e s .................................... 9 1S e r r a t i a s p p . : p l u r i p o t e n t i a l p r o t e i n s e c r e t i o n . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . 9 1a - L y t i c p r o t e a s e .................................... 9 1N . g o n o r r h o e a e I g A p r o t e a s e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 1CONCLUDING REMARKS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 3ACKNOWLEDGMENTS.................................... 9 3REFERENCES .................................... 9 3

INTRODUCTION TO THE GENERAL SECRETORYPATHWAYA p p r o x i m a t e l y 20% o f t h e p o l y p e p t i d e s s y n t h e s i z e d b yb a c t e r i a a r e l o c a t e d p a r t i a l l y o r c o m p l e t e l y o u t s i d e o f t h ec y t o p l a s m . M o s t r e a c h t h e i r f i n a l d e s t i n a t i o n v i a t h e g e n e r a ls e c r e t o r y p a t h w a y ( G S P ) , t h e f i r s t s t e p o f w h i c h i s t h e i ri n s e r t i o n i n t o a n d t r a n s l o c a t i o n a c r o s s t h e c y t o p l a s m i c mem-

b r a n e . I n g r a m - p o s i t i v e b a c t e r i a , f u l l y t r a n s l o c a t e d p r o t e i n sa r e r e l e a s e d i n t o t h e e x t e r n a l m i l i e u ( F i g . 1 ) , w h e r e a s i ng r a m - n e g a t i v e b a c t e r i a , t h e y a r e r e l e a s e d i n t o t h e p e r i p l a s mo r a r e i n t e g r a t e d i n t o o r t r a n s p o r t e d a c r o s s t h e o u t e r mem-b r a n e b y o n e o f s e v e r a l t e r m i n a l b r a n c h e s o f t h e GSP ( F i g . 1a n d 2 ) .I n l i n e w i t h t h e m o s t w i d e l y a c ce p t e d t e rm i no l o g y , p r o -t e i n s t r a n s p o r t e d b y t h e GSP a r e c a l l e d s e c r e t o r y p r o t e i n s( o r p r e s e c r e t o r y p r o t e i n s i f t h e y a r e m a d e a s p r e c u r s o r s ) .E x p o r t e d p r o t e i n s a r e r e t a i n e d p a r t i a l l y o r w h o l l y w i t h i n t h ec e l l b o u n d a r y ( t h e o u t e r m e m b r a n e ) , w h e r e a s s e c r e t i o nl e a d s t o e x t r a c e l l u l a r r e l e a s e ( t h e t e r m " e x c re t i o n " i s r e -s e r v e d f o r t h e t r a n s p o r t o f n o n p r o t e i n a c e o u s c o m p o u n d s ,s u c h a s a n t i b i o t i c s , a m i n o a c i d s , a n d c ap s u l a r p o l y s a cc h a-r i d e s ) . S e c r e t o r y p r o t e i n s a r e d i s t i n g u i s h e d f r o m o t h e r p ro -t e i n s b y t h e p r e s e n c e o f a s e c r e t o r y s i g n a l s e q u e n c e ( u s u a l l ya b b r e v i a t e d t o s i g n a l s e q u e n c e ) t h a t c h a r a c t e r i s t i c a l l y i n -c l u d e s a n u n i n t e r r u p t e d s t r e t c h o f a t l e a s t 1 0 m o s t l y h y d r o -p h o b i c a m i n o a c i d s . T h i s r e v i e w d e s c r i b e s w h a t i s known

M i l i e u -P r o t e i n l a y e r

C e l l w a l l

C y t o p l a s m i c 'm e m b r a n e

4-

C y t o p l a s mG r a m - p o s i t i v e b a c t e r i u m

a b o u t t h e wa y s i g n a l s e q u e n t e - b e a r i n g p r o t e i n s r e a c h t h e i rf i n a l d e s t i n a t i o n .TRANSLOCATION ACROSS THE CYTOPLASMICMEMBRANE

T h e f i r s t s e c t i o n o f t h i s r e v i e w d e a l s w i t h t h e e a r l y s t a g e so f t h e G S P , l e a d i n g t o t r a n s p o r t a c r o s s t h e c y t o p l a s m i cm e m b r a n e . S i n c e t h i s t o p i c w a s d i s c u s s e d i n s e v e r a l e x c e l -l e n t r e c e n t r e v i e w s ( 4 5 1 , 4 7 3 , 4 8 1 , 6 0 3 ) , m o s t o f t h i s s e c t i o nw i l l b e r e s t r i c t e d t o r e c e n t d e v e l o p m e n t s a n d t o a d i s c u s s i o no f t h e m e c h a n i s m s i n v o l v e d . M o s t o f t h e w o r k was c a r r i e do u t w i t h E s c h e n i c h i a c o l i , b u t s t u d i e s w i t h o t h e r b a c t e r i a a n dw i t h e u k a r y o t e s w i l l b e m e n t i o n e d w h e r e p e r t i n e n t .

E s s e n t i a l E l e m e n t sSome e a r l y s t u d i e s i n d i c a t e d t h a t p r e s e c r e t o r y p r o t e i n sc o u l d b e t r a n s p o r t e d a c r o s s t h e c y t o p l a s m i c m e m b r a n ew i t h o u t i n v o l v i n g a n y o t h e r m e m b r a n e o r c y t o p l a s m i c p r o -t e i n s . T h e m o d e l p r o t e i n u s e d i n t h o s e s t u d i e s ( M 1 3 p r o c o a to r p r e g p V I I I ) i s now known t o b e a r a r e e x c e p t i o n amongp r e s e c r e t o r y p r o t e i n s ( s e e t h e s e c t i o n o n S ec - i nd e p en d en t

t r a n s l o c a t i o n , b e l o w ) , a n d we r e c o g n i z e t h a t p r e s e c r e t o r yp r o t e i n e x p o r t i s u s u a l l y c a t a l y z e d b y s e v e r a l c y t o s o l i c a n dm e m b r a n e p r o t e i n s .M e t h o d o l o g y . I n v i v o s t u d i e s a i m t o d e t e r m i n e c o n d i t i o n sN._i l i e uP r o t e i n l a y e rL i p o p o l y s a c c h a r i d eO u t e rm e m b r a n eC e l l w a l l &p e o p l a s mC y t o p l a s m i c~e m b r a n e

C y t o p l a s mG r a m - n e g a t i v e b a c t e r i u m

F I G . 1 . S c h e m a t i c r e p r e s e n t a t i o n o f b r a n c h e s o f t h e GSP i n g r a m - p o s i t i v e a n d g r a m - n e g a t i v e b a c t e r i a . The b a s i c p a t h w a y a n d i t s b r a n c h e sa r e i n d i c a t e d b y a r r o w s . S e c r e t e d ( w h o l l y e x t r a c e l l u l a r ) p r o t e i n s f o l l o w t h e p a t h w a y s i n d i c a t e d b y b o t h s h a d e d a n d b l a c k a r r o w s ; e x p o r t e d( i . e . , e x t r a c y t o p l a s m i c b u t n o t e x t r a c e l l u l a r ) p r o t e i n s f o l l o w o n l y t h e p a t h w a y s shown a s s h a d e d a r r o w s . The f i g u r e i s n o t m e a n t t o r e p r e s e n ts i t e s t h r o u g h w h i c h t h e p r o t e i n s m u s t p a s s b e fo r e r e ac h i ng t h e i r t a r g e t .

V O L . 5 7 , 1 9 9 3


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5 2 PUGSLEY

S p o n n s t e a n j t e o u s S e c - d e p e n d e n t i n s e r t i o n a n d t r a n s l o c a t i o ni n s e r t i o nF I G . 2 . M a i n t e r m i n a l b r a n c h e s i n t h e GSP o f g r a m - n e g a t i v e b a c t e r i a . T h e f i g u r e i l l u s t r a t e s m o s t o f t h e p a t h w a y s f o r e n v e l o p e p r o t e i ne x p o r t a n d e x t r a c e l l u l a r p r o t e i n s e c r e t i o n t h a t a r e d i s c u s s e d i n t h i s r e v i e w . T h e s i t e s a t w h i c h p r o t e i n s a c c u m u l a t e a t t h e e n d o f t h e s ep a t h w a y s a r e s h o w n i n r e l i e f c h a r a c t e r s . I n t e r m e d i a t e s t a g e s a r e s h o w n i n i t a l i c s , a n d p r o t e i n s i n v o l v e d i n t h e i r e x p o r t a n d s o r t i n g a r e b o x e d .S e c i n d i c a t e s t h e p r o t e i n s t h a t a r e e n c o d e d b y t h e s e c g e n e s a n d r e q u i r e d f o r t h e e a r l y s t a g e s o f t h e G S P . A s p e c i f i c c h a p e r o ne a n d at r a n s l o c a t o r / a s s e m b l y OMP a r e r e q u i r e d f o r t h e a s s e m b l y o f t h e m o s t common t y p e s o f p i l i f o u n d i n m e m b e r s o f t h e E n t e r o b a c t e r i a c e a e . T h es e c o n d s t a g e i n e x t r a c e l l u l a r s e c r e t i o n u s u a l l y , a l t h o u g h n o t a l w a y s , r e q u i r e s s e v e r a l p r o t e i n s ( t h e GSP p r o t e i n s ) t h a t f o r m t h e m a i n t e r m i n a lb r a n c h o f t h e G S P . T y p e I V p i l i a r e a p p a r e n t l y a s s e m b l e d f r o m c y t o p l a s m i c m e m b r a n e - a n c h o r e d p r e c u r s o r s t h a t a r e p r o c e s s e d b y p r e p i l i np e p t i d a s e ( P p p ) a n d a r e a s s e m b l e d b y a p r o c e s s t h a t , i n P s e u d o m o n a s s p e c i e s , i n v o l v e s a t l e a s t t h e P i l B a n d P i l C p r o t e i n s .

w h i c h r e d u c e o r i n c r e a s e p r o t e i n e x p o r t . M o s t p r o t e i ne x p o r t i n h i b i t o r s h a v e p l e i o t r o p i c e f f e c t s , m a k i n g r e s u l t sd i f f i c u l t t o i n t e r p r e t . Much m o r e i n f o r m a t i o n c a n b e g l e a n e df r o m s t u d y i n g g e n e t i c a l l y a l t e r i n g s i g n a l s e q u e n c e s o r p r o -t e i n s i n v o l v e d i n e x p o r t . M u t a t i o n ' s t h a t r e d u c e p r o t e i ne x p o r t ( u s u a l l y i n d i c a t e d b y t h e a c c u m u l a t i o n o f u n p r o c -e s s e d p r e s e c r e t o r y p r o t e i n s ) h a v e b e e n d i r e c t l y s e l e c t e d b y av a r i e t y o f t e c h n i q u e s . On e o f t h e m o s t w i d e l y u s e d m e t h o d s ,d e v e l o p e d a n d r e f i n e d m a i n l y i n t h e l a b o r a t o r i e s o f J o nB e c k w i t h a n d P h i l B a s s f o r d , r e l i e s o n t h e f a c t t h a t c e r t a i np r e s e c r e t o r y p r o t e i n - 3 - g a l a c t o s i d a s e h y b r i d s a r e t o x i c t oc e l l s ( b e c a u s e o f j a m m i n g o f t h e e x p o r t m a c h i n e r y b y ab l o c k e d t r a n s l o c a t i o n i n t e r m e d i a t e ) a n d c o n f e r a L a c - p h e -n o t y p e ( b e c a u s e o f t h e i n a b i l i t y o f t h e , B - g a l a c t o s i d a s e m o i -e t y t o t e t r a m e r i z e ) when t h e y a r e p r o d u c e d a t h i g h l e v e l s( 2 4 6 , 3 1 7 ) . M u t a t i o n s t h a t a l l o w g r o w t h o f t h e s e s t r a i n s ,c o n f e r a L a c ' p h e n o t y p e , o r b o t h h a v e b e e n f o u n d t o a f f e c te i t h e r t h e s e q u e n c e o f t h e s i g n a l s e q u e n c e o f t h e h y b r i dp r o t e i n , r e n d e r i n g i t l e s s e f f i c i e n t , o r g e n e s c o d i n g f o rc o m p o n e n t s o f t h e e x p o r t m a c h i n e r y , r e n d e r i n g t h e m p a r -t i a l l y o r t o t a l l y d e f e c t i v e . More r e c e n t l y , a p o w e r f u l a l t e r -n a t i v e m e t h o d f o r s e l e c t i n g m u t a t i o n s t h a t r e d u c e t h e a c t i v -i t y o f c o m p o n e n t s o f t h e e x p o r t m a c h i n e r y was d e v e l o p e d b yB e c k w i t h a n d h i s c o l l e a g u e s o n t h e b a s i s o f t h e o b s e r v a t i o nt h a t t h e l e v e l o f t h e mRNA c o d i n g f o r o n e c o m p o n e n t o f t h ee x p o r t a p p a r a t u s , SecA p r o t e i n i s m a r k e d l y i n c r e a s e d whenp r o t e i n e x p o r t e f f i c i e n c y i s c o m p r o m i s e d ( s e e , e . g . , r e f e r -e n c e s 1 8 0 a n d 4 8 3 ) ( s e e t h e s e c t i o n o n S e c A p r o t e i n , b e l o w ) .M o s t o f t h e " e x p o r t - d o w n " m u t a t i o n s s o f a r d e s c r i b e d a r ei n t h e s i x s e c g e n e s a n d h a v e s e v e r e e f f e c t s o n e x p o r t o n l ywhen t h e c e l l s a r e g r o w n a t a b n o r m a l l y h i g h o r l o w t e m p e r -

a t u r e s o r i n r i c h m e d i a ( c o n d i t i o n a l - l e t h a l p h e n o t y p e ) . T h i si n d i c a t e s t h a t t h e s e c g e n e s a r e e s s e n t i a l f o r v i a b i l i t y u n d e rn o r m a l l a b o r a t o r y g r o w t h c o n d i t i o n s ( w e l l - a e r a t e d , e x p o -n e n t i a l l y g r o w i n g c u l t u r e s i n r i c h m e d i u m a t 3 7 C ) . C o n d i -t i o n a l l e t h a l i t y may i n d i c a t e t h a t t h e s e c g e n e p r o d u c t i si n a c t i v e o r u n s t ab l e o r f a i l s t o i n t e r a c t w i t h o t h e r c o m p o -n e n t s o f t h e e x p o r t m a c h i n e r y o r w i t h p r e s e c r e t o r y p r o t e i n su n d e r n o n p e r m i s s i v e c o n d i t i o n s , t h a t i t s s y n t h e s i s i s a r -r e s t e d u n d e r n o np e rm i s s i v e c o n d i t i o n s , o r t h a t r e d u c e dl e v e l s o r a c t i v i t y c a n b e t o l e r a t e d o n l y u n d e r p e r m i s s i v ec o n d i t i o n s . T h e e f f e c t s o f e x p o r t - d e b i l i t a t i n g s e c m u t a t i o n sc r e a t e d i n v i t r o c a n n o t , o f c o u r s e , b e e a s i l y t e s t e d b e c a u s et h e y c a n n o t b e m a i n t a i n e d e x c e p t i n c e l l s t h a t a l s o c a r r y aw i l d - t y p e c o p y o f t h e g e n e . I n f u t u r e , i t s h o u l d b e p o s s i b l e t oc o n s t r u c t s t r a i n s i n w h i c h t h e s o l e , w i l d - t y p e c o p y o f a s e cg e n e i s u n d e r t h e c o n t r o l o f a t i g h t l y r e g u l a t e d p r o m o t e r ,a l l o w i n g t h e e f f e c t s o f g r a d u a l d e p l e t i o n o f i t s p r o d u c t t o b et e s t e d a s t h e g e n e i s e x p r e s s e d a t p r o g r e s s i v e l y r e d u c e dl e v e l s .A n o v e l c l a s s o f m u t a t i o n s c e r t a i n s e c g e n e s , t h e p r lm u t a t i o n s , wa s o b t a i n e d b y s e l e c t i n g f o r r e s t o r a t i o n o f t h ee x p o r t o f p r e s e c r e t o r y p r o t e i n s w i t h d e b i l i t a t e d s i g n a l s e -q u e n c e s . p r l m u t a t i o n s a l t e r t h e s e q u e n c e o f t h e S e c p r o t e i n sw i t h o u t d r a m a t i c a l l y a f f e c t i n g t h e a b i l i t y o f t h e c e l l s t oe x p o r t p r o t e i n s w i t h n o r m a l s i g n a l p e p t i d e s ; c o n s e q u e n t l y ,t h e y d o n o t a f f e c t c e l l v i a b i l i t y . C e l l s w h i c h c a r r y b o t h a p r la l l e l e a n d a w i l d - t y p e c o p y o f t h e same g e n e a r e a b l e t oc h a n n e l s e c r e t o r y p r o t e i n s i n t o e i t h e r o f t w o d i s t i n g u i s h a b l ee x p o r t m a c h i n e r i e s ( o n e c o n t a i n i n g t h e p r o d u c t o f t h e p r la l l e l e a n d o n e c o n t a i n i n g t h e w i l d - t y p e S e c p r o t e i n ) , d e p e n d -i n g o n t h e p r e s e n c e o f a b s e n c e o f a m u t a t i o n a f f e c t i n g t h e

M I C R O B I O L . R E V .


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GENERAL SECRETORY PATHWAY 5 3a c t i v i t y o f t h e s i g n a l p e p t i d e . T h u s , i f t h e m e r o d i p l o i d c e l l sp r o d u c e a p r e s e c r e t o r y p r o t e i n - 3 - g a l a c t o s i d a s e h y b r i d w i t ha s i g n a l p e p t i d e m u t a t i o n , i t w i l l b e c h a n n e l e d e x c l u s i v e l yi n t o t h e e x p o r t m a c h i n e r y c o n t a i n i n g t h e S e c p r o t e i n e n -c o d e d b y t h e p r l a l l e l e a n d w i l l t h e r e f o r e n o t b l o c k t h e e x p o r to f o t h e r , n a t u r a l p r e s e c r e t o r y p r o t e i n s t h a t c a n u s e e i t h e r o ft h e t w o m a c h i n e r i e s . Tom S i l h a v y a n d h i s c o l l e a g u e s i n t r o -d u c e d c o n d i t i o n a l - e x p o r t - n e g a t i v e m u t a t i o n s i n t o t h e w i l d -t y p e s e c g e n e s i n s u c h p r l l s e c + m e r o d i p l o i d s t o d e m o n s t r a t ei n a s i m p l e y e t e l e g a n t a s s a y t h a t d i f f e r e n t s e c g e n e p r o d u c t smay b e i n v o l v e d i n d i s t i n c t s t e p s i n p r o t e i n e x p o r t . Ad e t a i l e d d e s c r i p t i o n o f t h i s a p p r o a c h w a s p r e s e n t e d b yB i e k e r - B r a d y a n d S i l h a v y ( 3 8 ) , a n d a b r o a d e r r e v i e w o fd i f f e r e n t g e n e t i c a p p r o a c h e s t o s t u d y i n g p r o t e i n e x p o r t w a sp r e s e n t e d b y S c h a t z a n d B e c k w i t h ( 4 8 1 ) .I n v i t r o s t u d i e s o n p r o t e i n e x p o r t a i m t o r e c o n s t i t u t ep r o t e i n t r a n s p o r t b y u s i n g p u r i f i e d c o m p o n e n t s u n d e r w e l l -d e f i n e d c o n d i t i o n s . T h e b a s i c i d e a o f t h e i n v i t r o t r a n s l o c a -t i o n a s s a y i s t o m i x p r e s e c r e t o r y p r o t e i n s w i t h i n v e r t e dc y t o p l a s m i c m e m b r a n e - d e r i v e d v e s i c l e s o r w i t h l i p o s o me s .P r e s e c r e t o r y p r o t e i n s t h a t a r e t r a n s l o c a t e d a c r o s s t h e mem-b r a n e s o f t h e s e v e s i c l e s o r l i p o s o m e s w i l l b e c o m e i n a c c e s -s i b l e t o e x o g e n o u s l y a d d e d p r o t e a s e s , w h e r e a s n o n t r a n s l o -c a t e d s e c r e t o r y p r o t e i n s w i l l r e m a i n p r o t e a s e a c c e s s i b l e . Af u r t h e r i n d i c a t i o n o f a t l e a s t p a r t i a l i n s e r t i o n o r t r a n s l o c a t i o ni s p r o v i d e d b y t h e p r o c e s s i n g o f t h e s i g n a l s e q u e n c e b ys i g n a l p e p t i d a s e w h o s e c a t a l y t i c s i t e i s l o c a t e d o n t h ep e r i p l a s m i c ( l u m i n a l ) s i d e o f t h e m e m b r a n e o f i n v e r t e dv e s i c l e s . I n t h e e a r l i e s t v e r s i o n s o f t h i s a s s a y , i n v e r t e dc y t o p l a s m i c m e m b r a n e v e s i c l e s f r o m E . c o l i c e l l s w e r ea d d e d t o i n v i t r o t r a n s c r i p t i o n - t r a n s l a t i o n s y s t e m s p r o d u c i n gr a d i o l a b e l e d p r e s e c r e t o r y p r o t e i n s ( 3 7 1 a , 4 6 1 a ) . S u b s e -q u e n t l y , i t b e c a m e p o s s i b l e t o p u r i f y p r e s e c r e t o r y p r o t e i n sf r o m E . c o l i c e l l s a n d t o s t u d y t r a n s l o c a t i o n i n r e a c t i o n s i nw h i c h t h e v e s i c l e s o r c y t o s o l i c e x t r a c t s w e r e o b t a i n e d f r o ms e c m u t a n t s g r o w n a t n o n p e r m i s s i v e t e m p e r a t u r e s o r f r o mw h i c h o n e o f t h e S e c p r o t e i n s h a d b e e n d e p l e t e d . M o s tr e c e n t l y , e s s e n t i a l c o m p o n e n t s o f t h e e x p o r t m a c h i n e r y h a v eb e e n i n d i v i d u a l l y p u r i f i e d a n d f u n c t i o n a l l y r e c o n s t i t u t e d i nl i p o s o m e s ( s e e , e . g . , r e f e r e n c e s 5 , 1 3 8 , a n d 5 5 0 ; a d e t a i l e dr e v i e w i s g i v e n i n r e f e r e n c e 6 0 3 ) .S i g n a l p e p t i d e s . A l l s e c r e t o r y p r o t e i n s h a v e a s i g n a l s e -q u e n c e , w h o s e p r i m a r y f u n c t i o n i s t o h e l p d i r e c t t h e m t o t h ec y t o p l a s m i c m e m b r a n e . A s i g n a l s e q u e n c e t h a t i s c l e a v e d b ya s i g n a l p e p t i d a s e w i l l b e r e f e r r e d t o h e r e a s a s i g n a l p e p t i d e .I n e u k a r y o t i c c e l l s , s t r u c t u r a l l y s i m i l a r s i g n a l s d i r e c t p r o -t e i n s i n t o t h e s e c r e t o r y p a t h w a y v i a t h e m e m b r a n e o f t h ee n d o p l a s m i c r e t i c u l u m . To a v o i d c o n f u s i o n , f r e q u e n t l y u s e da l t e r n a t i v e t e r m s w i l l n o t b e u s e d h e r e b e c a u s e t h e y h a v eo t h e r m e a n i n g s ( e . g . , l e a d e r p e p t i d e a n d l e a d e r s e q u e n c e a r eu s e d i n s t u d i e s o f g e n e t r a n s c r i p t i o n a n d t r a n s l a t i o n ) o rb e c a u s e t h e y d e s c r i b e e u k a r y o t i c , o r g a n e l l e - s p e c i f i c r o u t i n gs i g n a l s ( e . g . , t r a n s i t p e p t i d e f o r c h l o r o p l a s t s , p r e s e q u e n c ef o r m i t o c h o n d r i a ) t h a t a r e s t r u c t u r a l l y q u i t e d i s t i n c t f r o ms i g n a l s e q u e n c e s .S t u d i e s t h a t d e f i n e d t h e e s s e n t i a l f e a t u r e s o f s i g n a l p e p -t i d e s h a v e a l r e a d y b e e n r e v i e w e d ( 4 3 0 ) . F i g u r e 3 s h o w s t h ee s s e n t i a l f e a t u r e s o f t h r e e d i f f e r e n t t y p e s o f s i g n a l p e p t i d et h a t a r e m o s t r e a d i l y d i s t i n g u i s h e d b y t h e s e q u e n c e a n dp o s i t i o n o f t h e p r o c e s s i n g s i t e . T h e s e d i f f e r e n c e s a r e u n i m -p o r t a n t f o r t h e p r e s e n t d i s c u s s i o n ; i t i s s u f f i c i e n t t o n o t e t h a ts i g n a l p e p t i d e s a r e e x c l u s i v e l y a m i n o t e r m i n a l ; t h a t t h e yh a v e a l o n g , h y d r o p h o b i c r e g i o n ( H d o m a i n ) t h a t i s u s u a l l yp r e c e d e d b y o n e o r m o r e p o s i t i v e l y c h a r g e d r e s i d u e s i n as h o r t , g e n e r a l l y h y d r o p h i l i c r e g i o n ( t h e N d o m a i n ) ; a n d t h a tn o t wo s i g n a l p e p t i d e s f r o m d i s t i n c t l y d i f f e r e n t p r e s e c r e t o r y

p r o t e i n s h a v e e x a c t l y t h e s a m e s e q u e n c e . S h o r t e n i n g o ri n t r o d u c i n g c h a r g e d o r s t r o n g l y p o l a r r e s i d u e s i n t o t h e Hd o m a i n o r e l i m i n a t i n g t h e b a s i c a m i n o a c i d s f r o m t h e Nd o m a i n u s u a l l y r e d u c e s e x p o r t e f f i c i e n c y .A l l b a c t e r i a l s i g n a l p e p t i d e s h a v e e s s e n t i a l l y s i m i l a r s t r u c -t u r a l f e a t u r e s , a l t h o u g h t h o s e o f p r e s e c r e t o r y p r o t e i n s f r o mg r a m - p o s i t i v e b a c t e r i a t e n d t o b e l o n g e r a n d t o h a v e m o r eb a s i c r e s i d u e s i n t h e i r N d o m a i n ( 5 7 6 ) . S i g n a l p e p t i d e s a r ep r o c e s s e d d u r i n g t r a n s l o c a t i o n a c r o s s t h e c y t o p l a s m i c mem-b r a n e , a n d a r e t h e r e f o r e u n l i k e l y t o i n f l u e n c e s u b s e q u e n te v e n t s i n t h e G S P . I t h a s b e e n p r o p o s e d , h o w e v e r , t h a ts i g n a l p e p t i d e s o n p r e s e c r e t o r y p r o t e i n s d e s t i n e d f o r s e c r e -t i o n o r f o r e x p o r t t o d i f f e r e n t e n v e l o p e c o m p a r t m e n t s i ng r a m - n e g a t i v e b a c t e r i a a r e s t r u c t u r a l l y d i s t i n c t ( 5 1 7 ) . T h i si d e a w a s b a s e d o n t h e a n a l y s i s o f a l i m i t e d n u m b e r o fp r o t e i n s a n d i s n o t s u p p o r t e d b y e x p e r i m e n t a l e v i d e n c es h o w i n g t h a t s i g n a l p e p t i d e s o n p r e s e c r e t o r y p r o t e i n s d e s -t i n e d f o r d i f f e r e n t l o c a t i o n s c a n b e e x c h a n g e d w i t h o u t a f f e c t -i n g t h e s o r t i n g p r o c e s s ( 2 5 0 , 4 1 6 , 4 1 7 , 5 5 3 ) .S e c B p r o t e i n . S i x S e c p r o t e i n s a r e k n o w n t o b e c o m p o -n e n t s o f t h e GSP i n E . c o l i ( T a b l e 1 ) . Two o f t h e m , S e c A a n dS e c B , a r e f o u n d i n t h e c y t o s o l , a l t h o u g h S e c A i s a l s o f o u n da s s o c i a t e d w i t h t h e c y t o p l a s m i c m e m b r a n e ( s e e t h e n e x ts e c t i o n ) . S e c B i s p r o b a b l y a t e t r a m e r a n d may b e p a r t o f ap r o t e i n c o m p l e x t h a t b i n d s t o p r e s e c r e t o r y p r o t e i n s ( 3 6 8 ,5 8 7 , 5 8 8 , 5 9 8 ; f o r a r e v i e w , s e e r e f e r e n c e 3 0 1 ) . O t h e rc o m p o n e n t s o f t h i s c o m p l e x h a v e n o t b e e n i d e n t i f i e d . S e c Bi s a p p a r e n t l y n o t e s s e n t i a l f o r v i a b i l i t y ( b u t s e e b e l o w) , a n di n s p e c t i o n o f i t s p r e d i c t e d s e q u e n c e d o e s n o t r e v e a l a n yf e a t u r e s t h a t m i g h t i n d i c a t e i t s f u n c t i o n . H o w e v e r , i t b i n d s t om o s t p r e s e c r e t o r y p r o t e i n s b u t t o o n l y v e r y f e w c y t o s o l i cp r o t e i n s ( 3 0 0 , 3 0 1 , 3 4 2 ) , i n d i c a t i n g t h a t i t i s a s p e c i f i c GSPc o m p o n e n t .C h a r a c t e r i z e d s e c B m u t a t i o ns r ed u ce t h e e f f i c i e n c y o fe x p o r t o f many b u t n o t a l l p r e s e c r e t o r y p r o t e i n s ( 3 0 2 , 3 0 2 a ) .T h i s f i n d i n g l e d t o t h e c o n c e p t o f d i s t i n c t S e c B - d e p e n d e n ta n d S e c B - i n d e p e n d e n t c l a s s e s o f p r e s e c r e t o r y p r o t e i n s( 3 0 2 a ) . I n f a c t , t h i s d i s t i n c t i o n i s n o t c l e a r - c u t ; m o s t " S e c B -d e p e n d e n t " p r o t e i n s a r e e x p o r t e d , a l b e i t s l o w l y , i n S e c B -m u t a n t s , a n d t h e S e c B - i n d e p e n d e n t e x p o r t o f o t h e r p r o t e i n so c c u r s o n l y u n d e r c e r t a i n c o n d i t i o n s ( s e e , e . g . , r e f e r e n c e s2 7 2 a n d 4 5 7 ) . T h i s m i g h t e x p l a i n why s e c B n u l l m u t a t i o n s a r el e t h a l o n l y u n d e r f a s t - g r o w t h c o n d i t i o n s . F u r t h e r m o r e , m o s ts t u d i e s o n S e c B d e p e n d e n c e u s e d s t r a i n C K 1 9 5 3 ( 3 0 2 a ) ,w h i c h c a r r i e s a T n S i n s e r t i o n t h a t c o n v e r t s t h e f i r s t AUGc o d o n o f s e c B i n t o GUG. T h i s may n o t c o m p l e t e l y e l i m i n a t eS e c B s y n t h e s i s ( 1 5 3 ) , a n d p r e s e c r e t o r y p r o t e i n s w i t h a h i g ha f f i n i t y f o r S e c B c o u l d c o n c e i v a b l y c a p t u r e a l l r e s i d u a l S e c Bt o p r e v e n t t h e " S e c B - d e p e n d e n t " e x p o r t o f o t h er p r o t e i n sw h i l e t h e ms e l ve s b e i n g e x p o r t e d n o r m a l l y . H o w e v e r , S e c Bh as b e e n s h o w n t o b i n d o n l y w e a k l y t o o n e o f t h e s o - c a l l e dS e c B - i n d e p e n d e n t p r o t e i n s ( 2 0 9 , 3 0 0 ) , i m p l y i n g t h a t a t l e a s ts o m e p r e s e c r e t o r y p r o t e i n s c a n b e e x p o r t e d w i t h o u t i n t e r -a c t i n g w i t h S e c B .B l o b e l a n d h i s c o l l e a g u e s i n t e r p r e t e d t h e i r o b s e r v a t i o nt h a t S e c B b o u n d t o p r e - m a l t o s e - b i n d i n g p r o t e i n b u t n o t t o ad e r i v a t i v e l a c k i n g m o s t o f i t s s i g n a l p e p t i d e t o i n d i c a t e t h a tS e c B b i n d s d i r e c t l y t o s i g n a l p e p t i d e s ( 5 8 8 ) . A l t h o u g h S e c Bmay b i n d t o a t l e a s t o n e o t h e r s i g n a l p e p t i d e ( 1 1 ) , a m o r ew i d e l y a cc ep t ed e x p l a n a t i o n f o r t h i s o b s e r v a t i o n i s t h a ts i g n a l p e p t i d e s r e t a r d p r o t e i n f o l d i n g s u f f i c i e n t l y ( s e e t h es e c t i o n o n t r a n s l o c a t i o n c o m p e t e n c e , b e l o w ) t o a l l o w S e c Bp r o t e i n t o b i n d t o m u l t i p l e s i t e s o n t h e p o l y p e p t i d e b a c k b o n e( 1 0 , 1 7 9 , 3 3 1 , 4 5 2 , 4 4 9 a , 5 5 5 , 5 9 4 ) a n d e s p e c i a l l y t o , - s h e e ts t r u c t u r e s ( 6 0 a , 1 1 3 , 3 4 2 ) . T h u s , S e c B i s b a s i c a l l y s i m i l a r t og e n e r a l m o l ec u l a r c h ap e ro n es , w h i c h b i n d t o e x p o s e d

V O L . 5 7 , 1 9 9 3


5/59

5 4 PUGSLEY

S t a n d a r d s i g n a l O e p t i d e

2 1 h y d r o p h o b i c a - h e l i x , r i c h i n A a n d L ,KorR d e v o i d o f P , K , R , D , E , K , H a n d R

C l e a v a g e s i t e

e l e c t r o n e u t r a lo rn e g a t i v e

i n , u s n m s s . a u a s m m a u m a . m m s I i I s . C ( . . l - l

Gt u r nL I p Q p r o t e i n s i g n a l p e p t i d e

>1 h y d r o p h o b i c a - h e l i x , r i c h i n A a n d L ,KorR d e v o i d o f P , K , R , D , E , K , H a n d R

f M

C l e a v a g e s i t e

A e l e c t r o n e u t r a lL G C o ri n e g a t i v e- 1 + 1 f

Dl i p o p r o t e i ns o r t i n g s i g n a lT y p e I V p r e p i l i n s i g n a l p e p t i d e

C l e a v a g e s i t e114-_

> 1KorR- 1 1 ; 1

h y d r o p h o b i c a - h e l i x , r i c h i n A a n d L ,d e v o i d o f P , K , R , D , K , H a n d Re l e c t r o n e u t r a lo rn e g a t i v e

f M QRG FK M4E Gt u r n

4m e t h y l a t i o nF I G . 3 . S c h e m a t i c r e p r e s e n t a t i o n o f t h e p r i n c i p a l f e a t u r e s o f t h e t h r e e t y p e s o f s i g n a l p e p t i d e f o u n d i n precursors o f b a c t e r i a l secretoryp r o t e i n s . E a c h a m i n o a c i d w i t h i n t h e f u n c t i o n a l e l e m e n t s o f t h e s i g n a l p e p t i d e s i s i n d i c a t e d b y a s o l i d or s h a d e d c i r c l e . S o l i d c i r c l e s r e p r e s e n tm a i n l y h y d r o p h o b i c or a p o l a r r e s i d u e s , a n d s h a d e d c i r c l e s r e p r e s e n t p o l a r or c h a r g e d r e s i d u e s . O p e n c i r c l e s r e p r e s e n t r e s i d u e s e l s e w h e r e i nt h e p o l y p e p t i d e . S i g n a l p e p t i d e s h a v e u p t o t h r e e d o m a i n s ( " N , " "H," a n d " C " ) . T h e N d o m a i n ( 2 t o > 1 5 r e s i d u e s ) i s p o l a r a n d c a r r i e s a

n e t p o s i t i v e c h a r g e . The H d o m a i n ( > 8 r e s i d u e s ) i s c o m p o s e d o f p r e d o m i n a n t l y h y d r o p h o b i c r e s i d u e s a n d a l a n i n e a n d l a c k s s t r o n g l y p o l a ror c h a r g e d r e s i d u e s . The h i g h l e u c i n e a n d a l a n i n e c o n t e n t ca us e s s i g n a l p e p t i d e s t o a d o p t a n a - h e l i c a l c o n f i g u r a t i o n i n a p o l a r e n v i r o n m e n t s .The C d o m a i n i s u s u a l l y l e s s h y d r o p h o b i c a n d c o n t a i n s t h e s i g n a l s t h a t ar e r e c o g n i z e d b y LepB or LspA s i g n a l p e p t i d a s e s . F o r c o n v e n i e n c e ,t h e t y p e IV p r e p i l i n s i g n a l p e p t i d e s ar e c o n s i d e r e d n o t t o h a v e t h e C d o m a i n s i n c e t h e y ar e c l e a v e d b e t w e e n t h e N a n d H d o m a i n s ( s e e t h et e x t f o r d e t a i l s ) , a l t h o u g h r e s i d u e s t y p i c a l l y f o u n d i n t h e C r e g i o n o f o t h e r s i g n a l p e p t i d e s , i n c l u d i n g t h e t u r n - i n d u c i n g a m i n o a c i d s a n d t h e"A-A" b o x , are o f t e n p r e s e n t a t t h e e n d o f t h e H d o m a i n or j u s t d o w n s t r e a m f r o m i t . Amino a c i d s a r e i n d i c a t e d i n t h e s i n g l e - l e t t e r c o d e .L i p o p r o t e i n s i g n a l p e p t i d e s are u s u a l l y s h o r t e r a n d h a v e more h y d r o p h o b i c a m i n o a c i d s i n t h e H r e g i o n . The t u r n r e s i d u e u p s t r e a m f r o m t h ec l e a v a g e s i t e i s a l s o l e s s r e a d i l y i d e n t i f i a b l e t h a n i n s t a n d a r d s i g n a l p e p t i d e s . T h e a m i n o - t e r m i n a l c y s t e i ne r e s i d u e o f t h e s e p o l y p e p t i d e s mustb e m o d i f i e d t o g l y c e r y l c y s t e i n e f o r c l e a v a g e t o occur a n d i s u s u a l l y f a t t y a c y l a t e d ( s e e t e x t ) . Th e s i g n i f i c a n c e o f t h e s e a n d o t h e r f e a t u r e s o ft h e s e s i g n a l p e p t i d e s a n d o f r e s i d u e s i n t h e r e s t o f t h e p r e c u r s o r p o l y p e p t i d e s i s d i s c u s s e d i n t h e t e x t .

p o l y p e p t i d e s e g m e n t s ( s e e t h e s e c t i o n on t r a n s l o c a t i o n com-p e t e n c e , b e l o w ) , e x c e p t t h a t SecB r e c o g n i z e s o n l y p r o t e i n s ,i n c l u d i n g some c y t o p l a s m i c p r o t e i n s ( 3 4 2 ) , t h a t f o l d s l o w l y .S e c A p r o t e i n . S e c A , w h i c h i s e s s en t i a l f o r v i a b i l i t y , i sp r o b a b l y a d i m e r or h i g h e r o l i g o m e r when i n s o l u t i o n ( 3 , 2 5 2 ,3 5 0 ; r e v i e w e d i n r e f e r e n c e 3 8 8 ) . I t b i n d s a n d h y d r o l y z e sATP ( 3 2 5 , 3 2 6 , 5 0 4 ) , a n d i t s s eq ue nce ( 4 9 1 ) i n c l u d e s as e g m e n t l o c a t e d i n t h e a m i n o - t e r m i n a l h a l f o f t h e p o l y p e p -t i d e t h a t i s i d e n t i c a l t o a s e q u e n c e ( W a l k e r box A ) n o r m a l l yf o u n d o n l y i n n u c l e o t i d e - b i n d i n g p r o t e i n s s u c h a s ATPasesor k i n a s e s ( 5 8 1 ) . S e g m e n t s o f SecA c o n t a i n i n g o n l y t h i sr e g i o n o f t h e p o l y p e p t i d e b i n d ATP ( 3 5 0 ) , b u t t h e e n t i r e

SecA m o l e c u l e h a s b e e n r e p o r t e d t o b i n d a t l e a s t t h r e e ATPm o l e c u l e s ( 3 2 5 , 3 8 8 ) , s u g g e s t i n g t h e e x i s t e n c e o f a d d i t i o n a l ,n o n c o n s e n s u s n u c l e o t i d e - b i n d i n g s i t e s . T h e r o l e o f ATPh y d r o l y s i s i n p r o t e i n t r a n s l o c a t i o n i s d i s c u s s e d b e l o w i n t h es e c t i o n on e n e r g y r e q u i r e m e n t s .A l t h o u g h t h e a b s e n c e o f a n y s e g m e n t o f s i g n i f i c a n t h y d r o -p h o b i c i t y s u g g e s t s t h a t SecA i s a c y t o s o l i c p r o t e i n , i t i s a l s of o u n d a s s o c i a t e d w i t h m e m b r a n e s a s w e l l as w i t h r i b o s o m e s( 7 4 , 3 2 4 ) . T h u s , SecA c o u l d i n t e r a c t w i t h s e c r e t o r y p r o t e i n sa s t h e y e m e r g e f r o m r i b o s o m e s , w h i l e t h e y are f r e e i n t h ec y t o s o l , or when t h e y d o c k a t t h e c y t o p l a s m i c m e m b r a n e . I nv i t r o s t u d i e s show t h a t t r a n s l o c a t i o n c a n b e c a t a l y z e d s o l e l y

f M1 + 1

ANY& A s v b . Aim&-- ASh,AID& A f f t . AM,A t W A , A d i b l y"%W'wvqmvq w,. . ,OOOOO)


I v I IAdvb. A M R . , A l o b , A g i f t , SOC00000,

o w . . 1 6 - 1 1 ct u r n A Ap G GG s si i f l

l a w . . d o l l . , A d g h k g l k kI .M OOC).


6/59

GENERAL SECRETORY PATHWAY 5 5( A

0 1C Dl a

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1 0 r A MP 0czct:k0 t~ = I C D C D C DD I . N m - ~ 1 1

0 0 o 00 .o w v - = O ) -'I ON 00

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n. ) U::~~~~~~~~~~~OI-A( - A0000NI sIs) O 7 N'IC rj4V O L . 5 7 , 1 9 9 3

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5 6 PUGSLEYb y m e m b r a n e - a s s o c i a t e d SecA u n d e r c e r t a i n c i r c u m s t a n c e s ,a l t h o u g h t h i s i s u n l i k e l y t o o c c u r i n v i v o ( 7 3 , 1 0 1 ) . SecAa s s o c i a t e s m o r e t i g h t l y w i t h m e m b r a n e s c o n t a i n i n g a c i d i cp h o s p h o l i p i d s ( p h o s p h a t i d y l g l y c e r o l a n d c a r d i o l i p i n ) a n d t h eS e c E / Y i n t e g r a l m e m b r a n e c o m p o n e n t s o f t h e GSP ( 6 8 , 3 2 6 )a n d m ay e v e n p e n e t r a t e i n t o t h e l i p i d b i l a y e r ( 6 0 , 3 8 8 , 5 5 6 a ) .

S e c A s y n t h e s i s i n c r e a s e s when e x p o r t i s b l o c k e d o r s a t u -r a t e d . I t i s t h e o n l y c o m p o n e n t o f t h e GSP t h a t r e s p o n d s i nt h i s w a y , s u g g e s t i n g t h a t o v e r p r o d u c t i o n o f SecA i s s u f f i -c i e n t t o c o m p e n s a t e f o r a n y t e m p o r a r y s a t u r a t i o n o r j a m -m i n g o f t h e GSP t h a t m i g h t n o r m a l l y o c c u r . T h i s n o v e lr e g u l a t o r y r e s p o n s e i s g o v e r n e d b y SecA i t s e l f , w h i c h b i n d st o a s i t e u p s t r e a m f r o m i t s t r a n s l a t i o n s t a r t c o d o n i n i t sp o l y c i s t r o n i c mRNA, p r e s u m a b l y t o p r e v e n t t r a n s l a t i o n .T r a n s l a t i o n i s i n c r e a s e d when t r a n s l o c a t i o n i s b l o c k e d ,p o s s i b l y b e c a u s e t h e s i z e o f t h e c y t o p l a s m i c p o o l o f SecAd i m i n i s h e s a s i t i s i n c r e a s i n g l y b o u n d t o b l o c k e d t r a n s l o c a -t i o n i n t e r m e d i a t e s ( 1 3 1 , 4 9 0 ) .S e c A c a n b e c r o s s - l i n k e d t o p r e s e c r e t o r y p r o t e i n s w h o s es i g n a l p e p t i d e s i n c l u d e a b a s i c N d o m a i n ( 4 ) , a n d p r l Dm u t a t i o n s i n t h e s e c A i p r l D g e n e i m p r o v e t h e e x p o r t o fp r e s e c r e t o r y p r o t e i n s w i t h d e f e c t i v e s i g n a l p e p t i d e s ( 1 5 9 ) .T h e s e o b s e r v a t i o n s s u g g e s t b u t d o n o t p r o v e t h a t S e c A b i n d st o s i g n a l p e p t i d e s . I n d e e d , a s d i s c u s s e d b e l o w , S e c A p r o b -a b l y b i n d s a t m u l t i p l e s i t e s a l o n g t h e l e n g t h o f p r e s e c r e t o r yp r o t e i n s d u r i n g t r a n s l o c a t i o n ( s e e t h e s e c t i o n o n e n e r g yr e q u i r e m e n t s ) .I n t e g r a l m e m b r a n e S e c p r o t e i n s . F o u r S e c p r o t e i n s h a v es e v e r a l l o n g s t r e t c h e s o f h y d r o p h o b i c a m i n o a c i d s t h a tp r o b a b l y s p a n t h e c y t o p l a s m i c m e m b r a n e . T h e f i r s t o f t h e s et o b e c h a r a c t e r i z e d wa s S e c Y , w h i c h s e e m s t o s p a n t h em e m b r a n e 1 0 t i m e s w i t h i t s a m i n o a n d c a r b o x y t e r m i n i i n t h ec y t o s o l ( 7 , 2 4 4 ) . T h i s o r g a n i z a t i o n i s s i m i l a r t o t h a t o fc y t o p l a s m i c m e m b r a n e p r o t e i n s i n v o l v e d i n s o l u t e t r a n s p o r t( e . g . , LacY l a c t o s e p e r m e a s e [ 7 5 ] ) . s e c Y m u t a t i o n s t h a te i t h e r b l o c k p r o t e i n t r a n s l o c a t i o n o r i m p r o v e t h e t r a n s l o c a -t i o n o f s e c r e t o r y p r o t e i n s w i t h d e b i l i t a t e d s i g n a l s e q u e n c e s( p r A ) a f f e c t r e s i d u e s t h r o u g h o u t t h e p o l y p e p t i d e ( 2 4 4 ) .S e c E p r o t e i n i s t h o u g h t t o h a v e t h r e e t r a n s m e m b r a n es e g m e n t s ( 4 8 3 ) , b u t a t r u n c a t e d v a r i a n t t h a t r e t a i n s o n l y t h ec a r b o x y - t e r m i n a l o n e i s s t i l l a c t i v e ( 3 7 9 , 4 8 2 ) , a n d S e c E f r o mB a c i l l u s s u b t i l i s h a s o n l y a s i n g l e t r a n s m e m b r a n e s e g m e n t( 2 4 4 ) . A l l c h a r a c t e r i z e d e x p o r t - b l o c k i n g s e c E m u t a t i o n s r e -d u c e t h e l e v e l o f s e c E e x p r e s s i o n r a t h e r t h a n a l t e r i n g t h es t r u c t u r e o f t h e p r o t e i n . S e c D a n d S e c F e a c h a p p e a r t o s p a nt h e c y t o p l a s m i c m e m b r a n e s i x t i m e s . P a r t s o f t h e i r p r i m a r ys e q u e n c e s a r e q u i t e s i m i l a r ( 1 8 0 ) , s u g g e s t i n g t h a t t h e y p e r -f o r m r e l a t e d f u n c t i o n s . None o f t h e m u t a t i o n s t h a t a l l o w t h ee x p o r t o f p r o t e i n s w i t h d e b i l i t a t e d s i g n a l p e p t i d e s map t oe i t h e r o f t h e s e l o c i , i n d i c a t i n g t h a t t h e y may a c t a t a l a t es t a g e i n e x p o r t .

T h e t w o o t h e r p r o t e i n s t h a t m i g h t f o r m p a r t o f t h e t r a n s -l o c a s e a r e l e s s w e l l c h a r a c t e r i z e d . T h e s y n t h e s i s o f l a r g ea m o u n t s o f o n e o f t h e s e , Y d r p r o t e i n , s u p p r e s s e s t h e e x p o r t -n e g a t i v e e f f e c t s o f a t r a n s - d o m i n a n t m u t a t i o n i n s e c Y i n ad i p l o i d s t r a i n t h a t c a r r i e s a w i l d - t y p e s e c Y a l l e l e ( 2 4 4 , 5 0 3 ) .T h i s s u p p r e s s i o n p h e n o t y p e i s d i f f e r e n t f r o m t h e s u p p r e s s i o no f c o n d i t i o n a l s e c m u t a t i o n s w h i c h wa s o b s e r v e d p r e v i o u s l yb y o t h e r s a n d w h i c h i s o f t e n d u e t o r e d u c e d t r a n s l a t i o n ( 3 1 6 ,4 3 0 ) . I n s t e a d , s u p p r e s s i o n o f t h e t r a n s - d o m i n a n t s e c Y mu-t a t i o n b y h i g h l e v e l s o f Y d r i s p r e s u m e d t o i n d i c a t e t h a t i ta n d SecY n o r m a l l y f o r m a c o m p l e x a n d t h a t t h e p r o d u c t o ft h e m u t a n t s e c Y a l l e l e t i t r a t e s Y d r t o p r e v e n t i t s i n t e r a c t i o nw i t h w i l d - t y p e S e c Y . L a r g e a m o u n t s o f Y d r s a t u r a t e t h ed e f e c t i v e S e c Y , a l l o w i n g some f u n c t i o n a l S e c Y - Y d r c o m -p l e x e s t o f o r m . O v e r e x p r e s s i o n o f s e c E o r secDF a l s o

s u p p r e s s e s t h e t r a n s - d o m i n a n t e f f e c t o f t h i s s e c Y a l l e l e ( 2 4 4 ) ,i m p l y i n g t h a t t h e f i v e p r o t e i n s f o r m a c o m p l e x .P u r i f i e d S e c E - Y o f t e n c o n t a i n s a p p r e c i a b l e a m o u n t s o fa n o t h e r p r o t e i n , b a n d 1 ( 6 8 ) , w h i c h m ay i n c r e a s e t h e e f f i -c i e n c y o f t r a n s l o c a t i o n ( 6 7 ) i n t h e i n v i t r o a s s a y b a s e d o np u r i f i e d c o m p o n e n t s ( 5 , 6 8 , 1 0 3 , 1 3 8 ) . B a n d 1 c a n n o t b es e p a r a t e d f r o m S e c Y w i t h o u t r e l e a s i n g S e c E , m a k i n g i td i f f i c u l t t o d e t e r m i n e w h e t h e r i t i s a n e s s e n t i a l c o m p o n e n t o ft h e t r a n s l o c a s e . I t s s t r u c t u r a l g e n e h a s r e c e n t l y b e e n c l o n e d( 6 0 2 ) : i t s f u r t h e r a n a l y s i s w i l l n o d o u b t s o o n r e v e a l w h e t h e ri t i s u n i q u e a n d w h e t h e r i t a f f e c t s p r o t e i n e x p o r t i n v i v o , a sw e l l a s p r o v i d i n g a m e a n s o f p r o d u c i n g l a r g e q u a n t i t i e s f o rp u r i f i c a t i o n a n d u s e i n r e c o n s t i t u t i o n s t u d i e s .M o s t o f t h e r e s u l t s o b t a i n e d b y g e n e t i c a n d b i o c h e m i c a la p p r o a c h e s a r e i n b r o a d a g r e e m e n t , b u t s o m e d i f f e r e n c e sr e m a i n t o b e c l a r i f i e d . F o r e x a m p l e , t h e r e a s o n why SecDa n d S e c F a r e e s s e n t i a l f o r p r o t e i n e x p o r t i n v i v o b u t h a v e n oe f f e c t i n v i t r o ( 3 4 9 ) i s n o t i m m e d i a t e l y a p p a r e n t . C u r r e n t l yu s e d i n v i t r o a s s a y s m ay b e i n a d e q u a t e t o r e v e a l a r e q u i r e -ment f o r S e c D a n d S e c F ( s e e t h e s e c t i o n o n r e l e a s e f r o m t h et r a n s l o c a t i o n c h a n n e l , b e l o w ) . H o w e v e r , t h e f a c t t h a t p r e -c u r s o r s o f a l l s e c r e t o r y p r o t e i n s a c c u m u l a t e i n a l l c o n d i t i o n a ls e c m u t a n t s ( e x c e p t s e c B m u t a n t s ) u n d e r n o n p e r m i s s i v ec o n d i t i o n s d o e s n o t n e c e s s a r i l y mean t h a t t h e y a r e i n v o l v e di n t h e t r a n s l o c a t i o n o f a l l p r o t e i n s . F o r e x a m p l e , i f a l a t es t a g e i n t h e e x p o r t o f o n l y a f e w s e c r e t o r y p r o t e i n s r e q u i r e sS e c D , S e c F , o r b o t h , t h e i r a b s e n c e w o u l d e v e n t u a l l y c a u s ea l l c h a n n e l s t o b e c o m e b l o c k e d b y t r a n s l o c a t i o n i n t e r m e d i -a t e s u n d e r n o n p e r m i s s i v e c o n d i t i o n s , a n d t h e r e f o r e t h et r a n s l o c a t i o n o f a l l p r e s e c r e t o r y p r o t e i n s ( i n c l u d i n g t h o s en o t n e e d i n g S e c D o r S e c F ) w o u l d b e a d v e r s e l y a f f e c t e d .A n o t h e r p u z z l i n g o b s e r v a t i o n wa s r e p o r t e d b y B l o b e l ' sg r o u p , who f o u n d t h a t r e c o n s t i t u t e d p r o t e o l i p o s o m e s d e v o i do f SecY were a c t i v e i n t r a n s l o c a t i o n a n d p r o p o s e d t h a t S e c Yi s n o t a n e s s e n t i a l t r a n s l o c a s e c o m p o n e n t ( 5 9 0 ) . T h i s s e e m su n l i k e l y i n v i e w o f t h e e x t e n s i v e e v i d e n c e i n d i c a t i n g d i r e c tS e c Y i n v o l v e m e n t i n t r a n s l o c a t i o n ( 3 7 , 2 4 4 , 3 2 6 , 3 7 8 , 5 8 9 ) ,b u t a p l a u s i b l e e x p l a n a t i o n h a s n o t y e t b e e n f o u n d .A n t i b o d i e s a g a i n s t S e c Y c o i m m u n o p r e c i p i t a t e S e c E a n db a n d 1 ( 6 8 ) , a n d o v e r p r o d u c t i o n o f S e c E o r S e c Y i s p o s s i b l eo n l y when t h e o t h e r ( o r a s e g m e n t t h e r e o f ) i s s i m i l a r l yo v e r p r o d u c e d ( 3 4 8 , 3 7 9 ) . T h e s e o b s e r v a t i o n s s u p p o r t t h a ti d e a t h a t S e c E , S e c Y , a n d b a n d 1 f o r m a p r e e x i s t i n g c o m -p l e x , a v o i d i n g t h e n e e d t o r e c r u i t t h e m s e p a r a t e l y f o r e a c ht r a n s l o c a t i o n e v e n t . H o w e v e r , S e c E a n d S e c Y c a n b e s e p -a r a t e d u n d e r r e l a t i v e l y m i l d p u r i f i c a t i o n c o n d i t i o n s a n d t h e nr e c o m b i n e d t o f o r m a n a c t i v e t r a n s l o c a s e ( 3 4 8 ) , i n d i c a t i n gt h a t t h e y a r e n o t n e c e s s a r i l y t i g h t l y a s s o c i a t e d .T h e s t o i c h i o m e t r y o f t r a n s l o c a s e c o m p o n e n t s h a s n o t y e tb e e n d e t e r m i n e d , b u t r e s u l t s o f o n e s t u d y i n d i c a t e t h a t S e c Emust b e f i v e t i m e s more a b u n d a n t t h a n S e c Y f o r m a x i m a l l ye f f i c i e n t t r a n s l o c a t i o n i n v i t r o ( 5 ) . S e c E was o r i g i n a l l y e s t i -m a t e d t o b e p r e s e n t a t o n l y 8 0 c o p i e s p e r c e l l ( 3 4 8 ) , b u t t h i sf i g u r e h a s n ow b e e n r e v i s e d u p w a r d t o 3 0 0 t o 6 0 0 c o p i e s( 3 4 9 , 4 8 2 ) , c l o s e t o t h e e s t i m a t e d n u m b e r o f c o p i e s o f S e c Y ,i . e . , 2 0 0 t o 4 0 0 , a n d S e c D , i . e . , 4 5 0 t o 9 0 0 , a n d l a r g e r t h a nt h e e s t i m a t e d n u m b e r o f c o p i e s o f S e c F , i . e . , 3 0 t o 6 0 ( 3 4 9 ) .T h u s , t h e u p p e r l i m i t f o r t h e n u m b e r o f t r a n s l o c a s e s i n E .c o l i i s a r o u n d 5 0 0 . E . c o l i e x p o r t s o v e r 1 0 6 p e r i p l a s m i c a n do u t e r m e m b r a n e p o l y p e p t i d e s p e r g e n e r a t i o n ( 2 5 m i n u n d e ro p t i m a l c o n d i t i o n s ) , o r a p p r o x i m a t e l y 8 0 p o l y p e p t i d e s ( > 1 0 4a m i n o a c i d r e s i d u e s ) p e r m i n p e r t r a n s l o c a s e , w h i c h s e e m se x t r a o r d i n a r i l y e f f i c i e n t . B y u s i n g a l t e r n a t i v e m e t h o d s b a s e don t h e j a m m i n g o f p r o t e i n e x p o r t , i t h a s b e e n c a l c u l a t e d t h a tt h e r e a r e a p p r o x i m a t e l y 2 0 , 0 0 0 e x p o r t s i t e s i n E . c o l i ( 2 4 6 )a n d 2 5 , 0 0 0 i n B . s u b t i l i s ( 4 0 4 ) , a l l o w i n g t h e e x p o r t o f two

MICROBIOL. REV.


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GENERAL SECRETORY PATHWAY 5 7s e c r e t o r y p r o t e i n s p e r m i n , b u t t h e s e v a l u e s may b e o v e r e s -t i m a t e s b e c a u s e o f i n c o m p l e t e j a m m i n g u n d e r t h e c o n d i t i o n su s e d .S e c r e t o r y p r o t e i n t r a n s l o c a s e i n e u k a r y o t e s . O n l y o n e o f t h et e n t a t i v e l y i d e n t i f i e d c o m p o n e n t s o f t h e t r a n s l o c a s e o f t h ee n d o p l a s m i c r e t i c u l u m o f h i g h e r e u k a r y o t e s , t h e s o - c a l l e ds i g n a l s e q u e n c e r e c e p t o r , h a s b e e n c h a r a c t e r i z e d a t t h em o l e c u l a r l e v e l ( 4 2 7 ) . I t d o e s n o t h a v e a n y s i m i l a r i t y t o t h eE . c o l i S e c p r o t e i n s , a n d i t s i n v o l v e m e n t i n p r o t e i n t r a n s l o -c a t i o n h a s r e c e n t l y b e e n c h a l l e n g e d o n t h e b a s i s o f i n v i t r os t u d i e s ( 3 6 1 ) . M o r e i n f o r m a t i o n i s a v a i l a b l e f r o m s t u d i e sw i t h t h e y e a s t S a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e . F o r e x a m p l e ,S e c 6 1 p r o t e i n , o n e o f t h r e e m e m b r a n e p r o t e i n s t h a t f o r m ac o m p l e x r e q u i r e d f o r s e c r e t o r y p r o t e i n t r a n s l o c a t i o n ( 1 2 4 ) ,h a s 2 0 % a m i n o a c i d i d e n t i t y t o E . c o l i S e c Y p r o t e i n ( 5 2 6 ,5 2 8 ) , s u g g e s t i n g t h a t t h e y h a v e a common e v o l u t i o n a r yo r i g i n . T r a n s l o c a t i o n i n t e r m e d i a t e s c a n b e c r o s s - l i n k e d t oS e c 6 1 p r o t e i n ( 3 7 1 , 4 7 6 ) , i m p l y i n g t h a t i t i s i n c l o s e a p p o s i -t i o n , i f n o t d i r e c t c o n t a c t , w i t h s e c r e t o r y p r o t e i n s i n t h et r a n s l o c a t i o n c h a n n e l .

R e c o g n i t i o n a n d I n s e r t i o nP r o t e i n s d e s t i n e d f o r i m p o r t i n t o t h e v a r i o u s o r g a n e l l e s o fe u k a r y o t i c c e l l s a r e d i s t i n g u i s h e d s o l e l y b y t h e i r t a r g e t i n gs i g n a l s . E a c h o r g a n e l l e h a s o n e o r more r e c e p t o r s t h a ts p e c i f i c a l l y r e c o g n i z e e i t h e r t h e c o g n a t e t a r g e t i n g s i g n a l o r ap i l o t p r o t e i n ( o r p r o t e i n c o m p l e x ) b o u n d t o i t ( r e v i e w e d i nr e f e r e n c e 4 3 0 ) . P r o k a r y o t e s d o n o t h a v e t h i s d i v e r s i t y o fp o t e n t i a l t a r g e t m e m b r a n e s , a n d r e c e p t o r s o r p i l o t p r o t e i n sw o u l d b e u n n e c e s s a r y i f s i g n a l p e p t i d e s s p o n t a n e o u s l y i n s e r ti n t o t h e c y t o p l a s m i c m e m b r a n e a t t r a n s l o c a t i o n s i t e s .Membrane p h o s p h o l i p i d s . P u r i f i e d s i g n a l p e p t i d e s h a v eb e e n s h o w n t o i n t e r a c t w i t h t h e s u r f a c e o f , a n d t h e n p e n e -t r a t e i n t o , a r t i f i c i a l p h o s p h o l i p i d m o n o l a y e r s a n d b i l a y e r s( 2 7 1 ) , l e a d i n g t o t h e a d o p t i o n o f a n a - h e l i c a l ( 2 8 , 2 9 , 6 1 ) o r, 8 - s h e e t ( 4 5 6 ) s t r u c t u r e a n d t o d i r e c t c o n t a c t b e t w e e n t h e Hr e g i o n a n d t h e f a t t y a c y l c h a i n s o f t h e l i p i d s ( 2 7 1 ) . S y n t h e t i cs i g n a l p e p t i d e s w i t h a d e b i l i t a t e d H s e g m e n t a r e l e s s a b l e t oi n t e r a c t w i t h l i p i d s ( 6 2 , 6 6 , 2 3 0 , 3 5 4 , 4 5 6 ) , i n d i c a t i n g t h a t t h eo b s e r v e d i n t e r a c t i o n s may b e f u n c t i o n a l l y r e l e v a n t . S i g n a lp e p t i d e s i n t e r a c t m o s t s t r o n g l y w i t h m e m b r a n e s r i c h i na c i d i c p h o s p h o l i p i d s ( 2 7 0 ) , p r o b a b l y b e c a u s e o f e l e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o n s i n v o l v i n g t h e N d o m a i n ( 3 0 4 ) . T h i s may l o w e rt h e e n e r g y b a r r i e r t o f u l l i n s e r t i o n i n t o t h e b i l a y e r b yd i s t o r t i n g t h e s u r f a c e o f t h e m e m b r a n e ( 6 2 ) . T h e s e e l e c t r o -s t a t i c i n t e r a c t i o n s may b e i nv o l ve d i n t h e f i r s t o f t h e twoe x p e r i m e n t a l l y o b s e r v e d s t a g e s i n t h e i n t e r a c t i o n b e t w e e ns i g n a l p e p t i d e - b e a r i n g p r e c u r s o r s a n d t h e E . c o l i c y t o p l a s m i cm e m b r a n e ( 5 4 6 ) . D e p l e t i o n o f a c i d i c p h o s p h o l i p i d s i n E . c o l im u t a n t s o r i n v e s i c l e s l e a d s t o i n v i v o a n d i n v i t r o d e f e c t s i np r o t e i n e x p o r t , r e s p e c t i v e l y ( 1 2 9 , 2 1 6 , 3 0 4 , 3 2 6 ) , a l t h o u g ht h i s may b e b e c a u s e S e c A i n t e r a c t s l e s s w e l l w i t h t h e s em e m b r a n e s r a t h e r t h a n b e c a u s e s i g n a l p e p t i d e i n s e r t i o n i sl e s s e f f i c i e n t ( s e e t h e s e c t i o n on S e c A p r o t e i n , a b o v e ) .E l e c t r o s t a t i c i n t e r a c t i o n s w i t h a c i d i c p h o s p h o l i p i d h e a dg r o u p s c o u l d e x p l a i n w h y t h e N d o m a i n r e m a i n s on t h ec y t o p l a s m i c s i d e o f t h e m e m b r a n e w h i l e t h e c a r b o x y - t e r m i -n a l e n d o f t h e s i g n a l p e p t i d e i s " f l i p p e d " t h r o u g h t h em e m b r a n e ( t a i l - f i r s t o r i e n t a t i o n [ F i g . 4 ] ) ( 2 9 , 1 5 2 , 3 0 4 ) .R e m o v a l o f b a s i c a m i n o a c i d s f r o m t h e N d o m a i n o r i n s e r -t i o n o f t h e s e a m i n o a c i d s i n o r a r o u n d t h e C d o m a i n s h o u l dt h e r e f o r e h a v e t h e s a m e e f f e c t a s a c i d i c p h o s p h o l i p i d d e p l e -t i o n a n d m i g h t l e a d t o t h e i n s e r t i o n o f s i g n a l p e p t i d e s i n t h er e v e r s e o r i e n t a t i o n . E x p e r i m e n t a l o b s e r v a t i o n s t e n d t o s u p -p o r t t h i s p r e d i c t i o n ( 1 5 , 4 7 , 2 3 9 , 3 1 8 , 3 4 0 , 5 3 5 , 6 2 0 ) . N e g a -

cI

c y t o p l a s m

N

N Ct a i l -f i r s t h e a d -f i r s t

F I G . 4 . C h a r g e - d e p e n d e n t o r i e n t a t i o n o f s i g n a l p e p t i d e i n s e r t i o n .S i g n a l p e p t i d e s n o r m a l l y h a v e a p o s i t i v e l y c h a r g e d a m i n o - t e r m i n a l( N ) e x t r e m i t y ( + ) a n d i n s e r t i n a t a i l - f i r s t o r i e n t a t i o n , p o s s i b l yb e c a u s e o f e l e c t r o s t a t i c i n t e r a c t i o n s w i t h n e g a t i v e l y c h a r g e d p h o s -p h o l i p i d h e a d g r o u p s . R e v e r s a l o f t h e c h a r g e d i s t r i b u t i o n a t t h e e n d so f t h e p e p t i d e c o n v e r t s i t i n t o an i n s e r t i o n s i g n a l , c a u s i n g h e a d - f i r s ti n s e r t i o n .t i v e l y c h a r g e d r e s i d u e s i n t h e N d o m a i n a l s o p r e v e n t h e a d -f i r s t i n s e r t i o n , a l t h o u g h t h e y a r e s o m e w h a t l e s s e f f e c t i v e( f o u r g l u t a m a t e s , f o r e x a m p l e , are as e f f e c t i v e as on e l y s i n e[ 1 5 ] ) . T h u s , b a s i c a n d a c i d i c r e s i d u e s d o n o t n e c e s s a r i l yc a n c e l e a c h o t h e r o u t . I n s t e a d , t h e p o l a r i t y o f s i g n a l p e p t i d ei n s e r t i o n i s d e t e r m i n e d b y w h i c h e x t r e m i t y c a r r i e s t h e s t r o n -g e s t i n s e r t i o n p o l a r i t y s i g n a l , w h i c h m ay b e c o m p o s e d o fb o t h a c i d i c a n d b a s i c r e s i d u e s . T h e a b s e n c e o f b a s i c r e s i d u e sf r o m t h e N d o m a i n i s n o t a l w a y s s u f f i c i e n t t o d r a m a t i c a l l yr e d u c e p r o t e i n e x p o r t , h o w e v e r ( 4 8 , 2 4 2 , 4 4 4 , 5 6 9 ) . O t h e rf e a t u r e s o f t h e s i g n a l p e p t i d e s u c h as h i g h o v e r a l l h y d r o p h o -b i c i t y ( 2 2 0 , 3 4 0 , 4 4 4 ) may c o m p e n s a t e f o r t h e i r a b s e n c e , b u tt h e r e d o e s n o t a p p e a r t o b e a n i n v e r s e c o r r e l a t i o n b e t w e e nt h e l e n g t h or h y d r o p h o b i c i t y o f t h e H d o m a i n a n d t h en u m b e r o f b a s i c a m i n o a c i d s i n t h e N d o m a i n o f n a t u r a ls i g n a l p e p t i d e s ( 2 2 0 ) . I n s t e a d , s i g n a l p e p t i d e s t h a t l a c k b a s i ca m i n o a c i d s f r o m t h e i r N d o m a i n are more l i k e l y t o h a v e ag l y c i n e or p r o l i n e r e s i d u e i n t h e H d o m a i n ( 3 4 0 ) , b u t t h es i g n i f i c a n c e o f t h i s c o r r e l a t i o n i s u n k n o w n . L i m i t e d n u m b e r so f b a s i c a m i n o a c i d s ar e s o m e t i m e s f o u n d i n or j u s t a f t e r t h eC d o m a i n , a l t h o u g h e x c e s s i v e n u m b e r s w i l l b l o c k e x p o r t ( 1 5 ,3 2 1 ) .T h e i n t e r a c t i o n b e t w e e n s i g n a l p e p t i d e s a n d m e m b r a n el i p i d s c o u l d i n i t i a t e p r o t e i n e x p o r t , b u t how d o t h e g e n e r a l l yh y d r o p h i l i c s e q u e n c e s b e y o n d t h e C r e g i o n i n t h e maturep a r t o f t h e p o l y p e p t i d e g e t p u l l e d i n t o a n d across t h em e m b r a n e ? A f e w p r e s e c r e t o r y p r o t e i n s a r e e x p o r t e d w i t h -o u t t h e i n v o l v e m e n t o f S e c p r o t e i n s ( s e e t h e s e c t i o n onS e c - i n d e p e n d e n t t r a n s l o c a t i o n , b e l o w ) . I n t h e s e c a s e s , t h emature p a r t o f t h e p r e s e c r e t o r y p r o t e i n must b e t r a n s l o c a t e dt h r o u g h t h e l i p i d p a r t o f t h e m e m b r a n e , w h i c h r a i s e s t h ep o s s i b i l i t y t h a t a t l e a s t p a r t i a l i n s e r t i o n o f t h e s e g m e n td o w n s t r e a m f r o m t h e C d o m a i n ( t h e e x p o r t i n i t i a t i o n d o m a i n[ 1 6 ] ) occurs w i t h o t h e r , S e c - r e q u i r i n g p r e s e c r e t o r y p r o t e i n s( s e e t h e s e c t i o n on t h e t r a n s l o c a t i o n c h a n n e l , b e l o w ) . T h es i g n a l p e p t i d e may i n i t i a l l y f o r m a m i n i l o o p , w i t h r e s i d u e sb e y o n d t h e e x p o r t i n i t i a t i o n d o m a i n b e i n g g r a d u a l l y d r a w ni n t o t h e l i p i d b i l a y e r as t h e s i g n a l p e p t i d e s t r a i g h t e n s t o s p a nt h e m e m b r a n e ( F i g . 5 ) . H y d r o p h o b i c r e s i d u e s i n t h e s i g n a lp e p t i d e m i g h t s o m e h o w s h i e l d h y d r o p h i l i c r e s i d u e s i n t h e

V O L . 5 7 , 1 9 9 3

I


9/59

5 8 PUGSLEY

1 N +

F I G . 5 . M o d e l s f o r r e c e p t o r - i n d e p e n d e n t s i g n a l p e p t i d e i n s e r t i o ni n t o t h e c y t o p l a s m i c m e m b r a n e . P a r t i a l i n s e r t i o n o f t h e s i g n a lp e p t i d e i s p r o p o s e d e i t h e r t o b e f o l l o we d b y f o r m a t i o n o f a mem-b r a n e - s p a n n i n g l o o p i n w h i c h t h e s i g n a l p e p t i d e p a i r s w i t h a n dp r o t e c t s t h e e x p o r t i n i t i a t i o n d o m a i n ( l e f t ) or t o i n d u c e t h e p h o s -p h o l i p i d s t o a d o p t a n o n b i l a y e r c o n f o r m a t i o n t h a t t r a p s t h e e x p o r ti n i t i a t i o n d o m a i n i n a c h a n n e l l i n e d b y p o l a r l i p i d h e a d g r o up s( r i g h t ) . I n s e r t i o n u s u a l l y occurs b e f o r e t r a n s l a t i o n i s c o m p l e t e d . + ,presence o f b a s i c a m i n o a c i d s i n t h e s i g n a l p e p t i d e N d o m a i n ; N a n dC , a mi n o a nd c a r b o x y t e r m i n i o f t h e p r o t e i n , r e s p e c t i v e l y .

e x p o r t i n i t i a t i o n d o m a i n f ro m c o n t a c t w i t h t h e f a t t y a c i d s .A l t e r n a t i v e l y , s i g n a l p e p t i d e - i n d u c e d p h a s e c h a n g e s i n t h emembrane ( 2 9 , 1 2 8 , 2 7 0 ) may a l l o w t h e e x p o r t i n i t i a t i o nd o m a i n t o b e e n v e l o p e d b y l i p i d s i n n o n b i l a y e r c o n f o r m a t i o nso t h a t i t i s p r o t e c t e d f r o m t h e f a t t y a c y l c h a i n s b y t h e p o l a rl i p i d h e a d groups ( F i g . 5 ) ( 1 2 8 ) .P i l o t s a n d r e c e p t o r s . S i g n a l p e p t i d e s ar e c l e a r l y a b l e t oi n t e r a c t d i r e c t l y w i t h m e m b r a n e l i p i d s a n d may i n d e e d d o s ot o i n i t i a t e t r a n s l o c a t i o n . H o w e v e r , t r a n s l o c a t i o n seems t ooccur a t a ve r y l i m i t e d n u m b e r o f s i t e s ( s e e t h e s e c t i o n oni n t e g r a l m e m b r a n e S e c p r o t e i n s a b o v e ) , a n d p r o d u c t i v ei n t e r a c t i o n b e t w e e n s i g n a l p e p t i d e s a n d t h e c y t o p l a s m i cmembrane m i g h t t h e r e f o r e b e g u i d e d b y s p e c i f i c r e c e p t o rp r o t e i n s .E i t h e r o f t h e two s o l u b l e S e c p r o t e i n s ( S e c A a n d S e c B )c o u l d p i l o t n a s c e n t p r e s e c r e t o r y p r o t e i n s t o t h e t r a n s l o c a s e .S e c B p r o b a b l y b i n d s t o m u l t i p l e s i t e s on p r e s e c r e t o r y pro-t e i n s r a t h e r t h a n s p e c i f i c a l l y t o s i g n a l p e p t i d e s ( s e e t h es e c t i o n on S e c B p r o t e i n , a b o v e ) , i n l i n e w i t h t h e w i d e l ya c c e p t e d v i e w t h a t SecB i s a G S P - s p e c i f i c m o l e c u l a r c h a p -e r o n e ( s e e t h e s e c t i o n on t r a n s l o c a t i o n competence, b e l o w ) .H o w e v e r , d e Cock a n d Tommassen ( 1 1 6 ) p r o p o s e d t h a t i t sp r i m a r y f u n c t i o n i s t o p i l o t s e c r e t o r y p r o t e i n s t o t h e cyto-p l a s m i c membrane b y i n t e r a c t i n g w i t h m e m b r a n e - a s s o c i a t e dSecA p r o t e i n ( 1 2 , 2 1 0 , 3 1 5 ) ( s e e b e l o w ) . T h u s , SecB andSecA c o u l d b e p i l o t a n d t r a n s l o c a s e - a s s o c i a t e d d o c k i n gp r o t e i n s , r e s p e c t i v e l y . A l t e r n a t i v e l y , c y t o p l a s m i c SecA pro-t e i n b o u n d t o p r e s e c r e t o r y p r o t e i n s may i n t e r a c t w i t h i n t e -g r a l membrane components o f t h e t r a n s l o c a s e or w i t h a c i d i cp h o s p h o l i p i d s ( 6 0 , 5 5 6 a ) ( s e e t h e s e c t i o n on SecA p r o t e i n ,a b o v e ) , t h e r e b y g u i d i n g p r e s e c r e t o r y p r o t e i n s t o t h e cyto-p l a s m i c m e m b r a n e or t o t h e t r a n s l o c a s e . C l e a r l y , s u c h a

p i l o t - d o c k i n g p r o t e i n s y s t e m m i g h t o b v i a t e t h e n e e d f o r as p e c i f i c s i g n a l p e p t i d e r e c e p t o r i n t h e t r a n s l o c a s e c o m p l e x ,t h e r e b y r e l e g a t i n g t h e s i g n a l p e p t i d e t o t h e p u r e l y n o n s p e -c i f i c r o l e o f a n c h o r i n g t h e p r e s e c r e t o r y p r o t e i n t o t h e c y t o -p l a s m i c m e m b r a n e .O n e o f t h e m a j o r , c i r c u m s t a n t i a l a r g u m e n t s a g a i n s t s p e -c i f i c s i g n a l p e p t i d e r e c o g n i t i o n b y a n y c o m p o n e n t o f t h e GSPi s t h a t t h e s e q u e n c e s o f t h e s e p e p t i d e s a r e h i g h l y v a r i a b l e . I fs u c h a s i g n a l p e p t i d e r e c e p t o r d o e s e x i s t , i t c o u l d b e a n y o n eo f t h e f o u r c y t o p l a s m i c m e m b r a n e S e c p r o t e i n s o r mem-b r a n e- b o u nd S ec A . E xp e r i m en t a l a p p r o a c h e s u s e d t o i d e n -t i f y s i m i l a r r e c e p t o r s i n o t h e r s y s t e m s ( a n t i - i d i o t y p e a n t i b o d -i e s [ 3 9 3 , 3 9 4 ; b u t s e e a l s o r e f e r e n c e s 1 6 3 a n d 3 5 7 ] , s e l e c t i v ep r o t e o l y s i s o f s u r f a c e p r o t e i n s [ 4 0 6 , 4 0 7 ] , c r o s s - l i n k i n g [ 1 ,3 3 , 1 9 0 , 2 1 9 , 6 0 4 ] , a f f i n i t y p u r i f i c a t i o n [ 3 2 2 ] , b i n d i n g i n h i b i -t i o n b y s p e c i f i c a n t i b o d i e s [ 5 2 0 , 5 2 1 ] o r c o m p e t i t i v e l i g a n d s[ 7 1 , 8 9 , 1 9 3 , 4 0 6 , 4 9 3 ] , a n d e x t r a c t i o n a n d r e c o n s t i t u t i o n[ 4 0 6 , 5 2 9 ] ) h a v e n o t b e e n w i d e l y u s e d t o s e a r c h f o r s i g n a lp e p t i d e r e c e p t o r s i n b a c t e r i a . A n t i b o d i e s a g a i n s t t h e Nt e r m i n u s o f S e c Y a r e r e p o r t e d t o p r e ve nt p r e cu r s o r b i n d i n gt o i n v e r t e d m e m b r a n e v e s i c l e s ( 5 8 9 ) , a s d o e s t r y p s i n t r e a t -m e n t , w h i c h may i n a c t i v a t e S e c Y ( 5 3 7 , 5 3 8 ) . S y n t h e t i cb a c t e r i a l s i g n a l p e p t i d e s p r e v e n t i n v i t r o t r a n s l o c a t i o n i n t oc y t o p l a s m i c m e m b r a n e v e s i c l e s ( 8 5 ) , b u t t h e i n s e r t i o n o fl a r g e a m o u n t s o f s y n t h e t i c s i g n a l p e p t i d e i n t o m e m b r a n e sm i g h t p e r t u r b t h e m s u f f i c i e n t l y ( 1 2 8 , 2 7 0 ) t o a f f e c t s e v e r a lp r o c e s s e s , i n c l u d i n g t r a n s l o c a t i o n . S i m o n a n d B l o b e l ( 5 1 3 )r e c e n t l y r e p o r t e d t h a t s i g n a l p e p t i d e s c a n o p e n t h e p u t a t i v et r a n s l o c a t i o n c h a n n e l i n a r t i f i c i a l c y t o p l a s m i c m e m b r a n eb i l a y e r s ( s e e t h e s e c t i o n o n t h e t r a n s l o c a t i o n c h a n n e l , b e l o w )b u t o n l y w h e n a d d e d t o t h e c y t o p l a s m i c s i d e . T h i s w a si n t e r p r e t e d t o s h o w t h a t s i g n a l p e p t i d e s b i n d t o a s p e c i f i cr e c e p t o r o n t h e c y t o p l a s m i c f a c e o f t h e t r a n s l o c a s e . How-e v e r , s i g n a l p e p t i d e s n o r m a l l y i n s e r t i n a t a i l - f i r s t o r i e n t a t i o n( s e e t h e s e c t i o n o n s i g n a l p e p t i d e s , a b o v e ) a n d w o u l d b e i nr e v e r s e o r i e n t a t i o n t o t h e t r a n s l o c a s e , a n d t h u s p o s s i b l yu n a b l e t o o p e n t h e c h a n n e l , i f i n s e r t e d f r o m t h e p e r i p l a s m i cs i d e o f t h e m e m b r a n e .T h e f a c t t h a t p r l m u t a t i o n s i n s e c E o r s e c Y f a c i l i t a t e t h ee x p o r t o f p r o t e i n s w i t h d e b i l i t a t e d s i g n a l p e p t i d e s ( 1 4 9 , 3 3 0 ,4 4 5 , 4 7 4 , 5 2 4 ) o r e x p o r t i n i t i a t i o n d o m a i n s ( 3 3 0 , 4 4 5 ) h a sb e e n i n t e r p r e t e d t o i n d i c a t e t h a t w e a k e n e d s i g n a l s c a n b er e c o g n i z e d b y r e c e p t o r s r e n d e r e d l e s s s t r i n g e n t b y t h e p r lm u t a t i o n ( 2 4 4 ) . G en et i c e v i d en ce s u g g e s t s t h a t S e c E i sr e q u i r e d b e f o r e S e c Y ( 3 7 ) a n d h e n c e i s m o r e l i k e l y t h a nS e c Y t o b e t h e s i g n a l p e p t i d e r e c e p t o r . A l t e r n a t i v e l y , S e c Emay b e t h e d o c k i n g p r o t e i n t h a t b i n d s SecA w h i l e S e c Y mayb e t h e s i g n a l p e p t i d e r e c e p t o r . S u r p r i s i n g l y , p r l m u t a t i o n sa r e g e n e r a l l y w e l l t o l e r a t e d a n d d o n o t a p p e a r t o c a u s e t h ee x p o r t o f n o r m a l l y c y t o p l a s m i c p r o t e i n s . T h i s i m p l i e s t h a te v e n p r e s e c r e t o r y p r o t e i n s w i t h s e v e r e l y d e b i l i t a t e d s i g n a lp e p t i d e s a r e n e v e r t h e l e s s s p e c i f i c a l l y s e l e c t e d f o r e x p o r t i nt h e p r l m u t a n t s . T h e r e s i d u a l s i g n a l p e p t i d e may t h e r e f o r er e t a i n s o m e r e c e p t o r - b i n d i n g a c t i v i t y , o r t h e s i g n a l p e p t i d emay n o t b e t h e o n l y f e a t u r e o f p r e s ec re t o ry p r o t e i n s w h i c hd e t e r m i n e s t h a t t h e y w i l l b e e x p o r t e d . T h u s , a n a l t e r n a t i v ee x p l a n a t i o n f o r t h e e x p o r t o f p re s ec r et o r y p r o t e i n s w i t hd e b i l i t a t e d s i g n a l p e p t i d e s i n p r l m u t a n t s i s t h a t t h e y r e t a i nt h e i r a b i l i t y t o b i n d S e c B a n d S e c A , w h i c h c o u l d t h e n g u i d et h e m t o t h e t r a n s l o c a s e c o m p l e x i n t h e a b s e n c e o f a s i g n a lp e p t i d e - r e c e p t o r i n t e r a c t i o n .I t i s c l e a r l y s t i l l t o o e a r l y t o b e c a t e g o r i c a l a b o u t howp r e s e c r e t o r y p r o t e i n s f i n d t h e t r a n s l o c a s e . T h e c o m p e l l i n ge v i d e n c e t h a t s i g n a l p e p t i d e s h a v e a s t r o n g a f f i n i t y f o rm e m b r a n e l i p i d s c a n n o t b e o v e rl o o k e d, b u t i t i s e q u a l l yp o s s i b l e t h a t t h e h y d r o p h o b i c H d o m a i n o f t h e s i g n a l p e p t i d e


I I I I I I I I I I I I 1 1_ I u u u u u u u u u u u 0 0 0A - A - A - A - - A - A - A - A - A - A - A+ c y t o p a s m-40-d!T

n o1 6 e - - . I l


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GENERAL SECRETORY PATHWAY 5 9

A l A 2 B T r a n s l o c a s e Cl11 / C 2 D

t t I I

P i l o t p r o t e i nF I G . 6 . M o d e l s f o r r e ce p t o r -d e p e nd e nt d o c k i n g a n d i n s e r t i o n o f s i g n a l p e p t i d e - b e a r i n g p r e c u r s o r p r o t e i n s i n t o t h e c y t o p l a s m i c m e m b r a n ea t s p e c i f i c t r a n s l o c a s e s i t e s . T h e m o d e l o n t h e l e f t ( A t o B ) s h o w s s p o n t a n e o u s i n s e r t i o n ( A l ) o f a l o o p e d s i g n a l p e p t i d e ( t h i c k l i n e ) , w h i c hd i f f u s e s i n t h e p l a n e o f t h e m e m b r a n e u n t i l i t e n c o u n t e r s i t s r e c e p t o r i n t h e t r a n s l o c a s e ( A l a n d A 2 ) o r w h i c h b i n d s d i r e c t l y t o a r e c e p t o r o nt h e t r a n s l o c a s e ( A 2 ) , w h i c h t h e n o p e n s l a t e r a l l y t o e n g u l f t h e e x p o r t i n i t i a t i o n d o m a i n ( B ) . I n t h e a l t e r n a t i v e m o d e l o n t h e r i g h t ( C a nd D ) ,a p i l o t p r o t e i n b o u n d t o t h e m a t u r e p a r t o f t h e s e c r e t o r y p r o t e i n b i n d s t o a s p e c i f i c r e c e p t o r i n t h e t r a n s l o c a s e ( C l o r C 2 ) a n d c a n t h u s f a c i l i t a t ed i r e c t c o n t a c t b e t w e e n t h e s i g n a l p e p t i d e a n d i t s r e c e p t o r e i t h e r b e f o r e o r a f t e r i n s e r t i o n i n t o t h e l i p i d p h a s e o f t h e m e m b r a n e ( D ) .i s i m p o r t a n t f o r r e c o g n i t i o n b y i t s c o g n a t e r e c e p t o r . On ea t t r a c t i v e i d e a i s t h a t s i g n a l p e p t i d e s i n t e r a c t w i t h t r a n s l o -c a s e c o m p o n e n t s ( S ec E o r S e c Y ) a t t h e i r i n t e r f a c e w i t h t h em e m b r a n e l i p i d s . P i l o t p r o t e i n s b o u n d e l s e w h e r e t o t h ep r e s e c r e t o r y p r o t e i n m ay e n s u r e c o n t a c t b e t w e e n i t a n d t h et r a n s l o c a s e e i t h e r b e f o r e o r a f t e r s i g n a l p e p t i d e i n s e r t i o n i n t ot h e l i p i d b i l a y e r , a s i l l u s t r a t e d i n F i g . 6 . I t s h o u l d b e p o s s i b l et o d e v i s e t e s t s b a s e d o n v e s i c l e f u s i o n t e c h n i q u e s o r o n t h es e q u e n t i a l e x p r e s s i o n o f s e c g e n e s t o d e t e r m i n e w h e t h e rp r e s e c r e t o r y p r o t e i n s w h o s e s i g n a l p e p t i d e s a r e i n s e r t e d i n t ot h e c y t o p l a s m i c m e m b r a n e d e v o i d o f t r a n s l o c a s e c o m p o -n e n t s c a n t h en b e t r a n s l o c a t e d when t h e m i s s i n g c o m p o n e n t sa r e s u p p l i e d .

T r a n s l o c a t i o nT r a n s l o c a t i o n c h a n n e l . As we l e a r n m o r e a b o u t t h e g e n e r a la s p e c t s o f p r o t e i n t r a f f i c , i t b e c o m e s i n c r e a s i n g l y u n l i k e l yt h a t n o m o r e t h a n a f e w e x c e p t i o n a l p r o t e i n s c a n b e c o m -p l e t e l y t r a n s l o c a t e d t h r o u g h t h e l i p i d p a r t o f a b i o l o g i c a lm e m b r a n e . I t i s w i d e l y b e l i e v e d t h a t t r a n s l o c a t e d s e g m e n t s

o f p r e s e c r e t o r y p r o t e i n s , w h i c h a r e l a r g e l y t o t o t a l l y d e v o i do f s e g m e n t s o f s i g n i f i c a n t h y d r o p h o b i c i t y , c r o s s t h e b a c t e r i a lc y t o p l a s m i c m e m b r a n e v i a a s p e c i f i c c h a n n e l f o r m e d , i n E .c o l i , b y o n e o r more o f t h e i n t e g r a l m e m b r a n e S e c p r o t e i n s .T h e y a r e t h e r e f o r e c o m p l e t e l y p r o t e c t e d f r o m c o n t a c t w i t ht h e h y d r o p h o b i c e n v i r o n m e n t o f t h e l i p i d b i l a y e r . T h i sc o n s i d e r a b l y r e d u c e s t h e e n e r g y c o s t s t h a t w o u l d o t h e r w i s eb e i n c u r r e d i n t r a n s l o c a t i o n o f l a r g e , p o l a r p o l y p e p t i d es e g m e n t s t h r o u g h t h e l i p i d b i l a y e r . A l t h o u g h s t i l l f a r f r o mp r o v e n , t h i s v i e w wa s r e c e n t l y c o n s i d e r a b l y s t r e n g t h e n e d b yt h e o b s e r v a t i o n t h a t t r a p p e d i n v i t r o t r a n s l o c a t i o n i n t e r m e -d i a t e s c a n b e c r o s s - l i n k e d t o SecY p r o t e i n a n d d o n o t a p p e a rt o b e i n c l o s e a p p o s i t i o n t o m e m b r a n e l i p i d s ( 6 0 2 ) .A p a r a l l e l h a s a l r e a d y b e e n d r a w n b e t w e e n SecY a n d

s o l u t e p e r m e a s e s i n t h e b a c t e r i a l c y t o p l a s m i c m e m b r a n e , a l lo f w h i c h h a v e s e v e r a l m e m b r a n e - s p a n n i n g s e g m e n t s t h a tl i n e a c h a nn el t h r o u g h w h i c h s p e c i f i c s o l u t e s a r e t r a n s -p o r t e d . I t m ay b e i n s t r u c t i v e t o c o n s i d e r s e c r e t o r y p o l y p e p -t i d e s a s n o t h i n g m o r e t h a t a s e r i e s o f a m i n o a c i d s w h i c h ,i n s t e a d o f b e i n g t r a n s p o r t e d i n d i v i d u a l l y t h r o u g h a p e r -m e a s e , a r e t r a n s p o r t e d a s a s i n g l e l o n g c h a i n r a t h e r l i k e as t r i n g o f b e a d s . H o w e v e r , u n l i k e s m a l l s o l u t e s , w h i c h e n t e rt h e p e r m e a s e a t o n e s i d e o f t h e m e m b r a n e a n d e x i t a t t h eo t h e r , s e c r e t o r y p r o t e i n s a r e b e l i e v e d t o f o r m l o o p s t r u c -t u r e s i n t h e c y t o p l a s m i c m e m b r a n e , a n d ma y b e a n c h o r ed t ot h i s m e m b r a n e b y t h e i r l i p i d - e m b e d d e d s i g n a l p e p t i d e , b e -f o r e t h e y e n t e r t h e t r a n s l o c a s e c h a n n e l . To e x p l a i n how t h es e c r e t o r y p r o t e i n g a i n s a c c e s s t o t h e i n s i d e o f t h e t r a n s l o -c a s e , S i m o n a n d B l o b e l ( 5 1 3 ) p r o p o s e t h a t t h e c h a n n e l o p e n sl a t e r a l l y t o e n g u l f t h e e x p o r t i n i t i a t i o n d o m a i n a s o r a f t e r i t i sp u l l e d i n t o t h e m e m b r a n e . S u c h a n e v e n t i s r e p r e s e n t e ds c h e m a t i c a l l y i n F i g . 7 , p a n e l I , i n w h i c h t h e r e s t i n g t r a n s -l o c a s e ( f o r r e a s o n s o f s i m p l i c i t y , o n l y t h e SecY c o m p o n e n ti s s h o w n ) i s d e p i c t e d a s a c o l l a p s e d b u n d l e o f t r a n s m e m -b r a n e s e g m e n t s w i t h o u t a c e n t r a l c h a n n e l . T h i s w o u l d p r e -v e n t t h e l e a k a g e o f c y t o s o l i c s o l u t e s a c r o s s t h e m e m b r a n ewhen t h e t r a n s l o c a s e c h a n n e l i s n o t b e i n g u s e d . T h e s i g n a lt h a t t r i g g e r s c h a n n e l o p e n i n g c o u l d b e t h e s i g n a l p e p t i d ei t s e l f , a s p r o p o s e d b y S i m o n a n d B l o b e l ( 5 1 3 ) , o r t h ep r e s e n c e o f t h e e x p o r t i n i t i a t i o n d o m a i n a t l e a s t p a r t i a l l ye m b e d d e d i n t h e b i l a y e r ( F i g . 5 ) . In F i g . 7 , p a n e l I I , t h ep r e s e n c e o f o n e o r b o t h i n i t i a t e s t h e u n b u n d l i n g o f t h et r a n s l o c a s e c h a n n e l , w h o s e s i g n a l p e p t i d e t e m p o r a r i l y f o r m st h e 1 1 t h t r a n s m e m b r a n e s e g m e n t , f o r c i n g t h e e x p o r t i n i t i a -t i o n d o m a i n i n t o t h e l u m e n o f t h e c h a n n e l a s i t f o r m s . T h ec h a n n e l b e c o m e s o p e n a t e a c h e n d o n l y when t h e e x p o r ti n i t i a t i o n d o m a i n i s f u l l y w i t h i n t h e l u m e n o f t h e t r a n s l o c a s ea n d f u r t h e r t r a n s l o c a t i o n c a n o c c u r . E x t r a m e m b r a n o u s

V O L . 5 7 , 1 9 9 3


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GENERAL SECRETORY PATHWAY 6 1

b e c o m e j a m m e d d u r i n g t r a n s l o c a t i o n . N e v e r t h e l e s s , e v e nb r a n c h e d o r h i g h l y f o l d e d p o l y p e p t i d e s c a n b e t r a n s l o c a t e da c r o s s c e r t a i n e u k a r y o t i c o r g a n e l l e m e m b r a n e s ( 5 6 6 , 5 6 7 ,5 8 2 ) , a n d t h e q u e s t i o n o f how much h i g h l y o r d e r e d s t r u c t u r ec a n b e t o l e r a t e d b y d i f f e r e n t p r o t e i n t r a n s l o c a t i o n s y s t e m s i ss t i l l u n r e s o l v e d .S i g n a l p e p t i d e - p - g a l a c t o s i d a s e h y b r i d s a r e t h e b e s t - c h a r -a c t e r i z e d e x a m p l e s o f h i g h l y f o l d e d p r e s e c r e t o r y p r o t e i n st h a t c a n n o t b e e f f i c i e n t l y e x p o r t e d b y E . c o l i ( 1 7 2 , 2 4 6 , 3 1 7 ) .A l t h o u g h s e v e r a l o t h e r e x a m p l e s o f s i m i l a r p h e n o m e n a h a v eb e e n r e p o r t e d , t h e r e i s n o t h i n g i n t r i n s i c t o c y t o p l a s m i cp r o t e i n s t h a t p r e v e n t s t h e i r e x p o r t when f u s e d t o s i g n a lp e p t i d e s ( 4 3 0 ; s e e r ef er en ce s 4 3 a n d 5 3 5 f o r r e c e n t e x a m -p l e s ) . A c r u c i a l f a c t o r d e t e r m i n i n g w h e t h e r s i g n a l p e p t i d e -c y t o p l a s m i c - p r o t e i n h y b r i d s c a n b e e x p o r t e d e f f i c i e n t l y m ayb e t h e r a t e a t w h i c h t h e y f o l d a n d o l i g o m e r i z e p r i o r t ot r a n s l o c a t i o n ( 4 3 0 ) . T r a n s l o c a t i o n - c o m p e t e n t p r e s e c r e t o r yp r o t e i n s a r e n o t n e c e s s a r i l y d e v o i d o f s e c o n d a r y o r t e r t i a r ys t r u c t u r e , h o w e v e r ( 3 1 4 ) . F o r e x a m p l e , a s m a l l l o o p f o r m e db y a d i s u l f i d e b o n d d o e s n o t p r e v e n t i n v i t r o t r a n s l o c a t i o n o fa n a t u r a l p r e s e c r e t o r y p r o t e i n o f E . c o l i ( 5 4 2 , 5 4 4 ) , a n d a na r t i f i c i a l l y b i o t i n a t e d p r e s e c r e t o r y h y b r i d p r o t e i n i s e x p o r t e di n v i v o ( 4 5 7 ) . T h u s , l i m i t e d t e r t i a r y s t r u c t u r e s ( k i n k s - i n - t h e -t h r e a d a n a l o g y ) d o n o t c a u s e l o s s o f t r a n s l o c a t i o n c o m p e -t e n c e , b u t more h i g h l y o r d e r e d s t r u c t u r e s ( k n o t s - i n - t h e -t h r e a d a n a l o g y , c o r r e s p o n d i n g t o p r e f o l d e d , - g a l a c t o s i d a s e[ 3 1 7 ] , t r i m e t h o p r i m - c o m p l e x e d d i h y d r o f o l a t e r e d u c t a s e [ 1 7 2 ] ,o r a g g r e g a t e d s t a t e s [ 3 1 4 ] ) may d o s o .C o n s i d e r a b l e e f f o r t h a s b e e n d e v o t e d t o d e t e r m i n i n g t h ec o n d i t i o n s t h a t a l l o w p r e s e c r e t o r y p r o t e i n s t o r e t a i n t r a n s -l o c a t i o n c o m p e t e n c e . S i g n a l p e p t i d e s r e t a r d t h e r e f o l d i n g o fd e n a t u r e d p r e s e c r e t o r y p r o t e i n s ( 3 0 7 , 3 3 1 , 3 9 6 ) . T h e i r a b i l i t yt o s i m i l a r l y r e t a r d t h e f o l d i n g o f n a s c e n t c h a i n s i n v i v o w o u l di n c r e a s e t h e t i m e s p a n d u r i n g w h i c h m o l e c u l a r c h a p e r o n e sc o u l d b i n d t o p r e s e c r e t o r y p r o t e i n s t o f u r t h e r r e t a r d t h e i rp r e m a t u r e f o l d i n g . S e v e r a l e x c e l l e n t r e v i e w s p r e s e n t d i f f e r -e n t v i e w s o f t h e f u n c t i o n o f m o l e c u l a r c h a p e r o n e s i n t h ef o l d i n g o f n a s c e n t p o l y p e p t i d e s , i n t h e r e f o l d i n g o f d e n a t u r e dp o l y p e p t i d e s , a n d i n t h e m a i n t e n a n c e o f p o l y p e p t i d e s i n af o r m s u i t a b l e f o r h o m o - o r h e t e r o - o l i g o m e r i z a t i o n ( 1 8 8 , 3 0 9 ,3 1 2 , 4 6 9 ) . From t h e s e , i t s e e m s t h a t m o l e c u l a r c h a p e r o n e sp r e v e n t i l l i c i t i n t e r a c t i o n s b e t w e e n d i f f e r e n t p a r t s o f t h esame p o l y p e p t i d e b y k e e p i n g t h e m a p a r t w h i l e a l l o w i n go t h e r , p e r m i s s i b l e i n t e r a c t i o n s t o o c c u r . B a c t e r i a h a v e manyc y t o p l a s m i c m o l e c u l a r c h a p e r o n e s . M o s t o f t h e m p r e s u m -a b l y b i n d t o p r e s e c r e t o r y p r o t e i n s s i n c e , a l t h o u g h e a c h o ft h e m p r o b a b l y r e c o g n i z e s d i f f e r e n t s t r u c t u r a l f e a t u r e s , t h e yd o n o t h a v e s t r i c t b i n d i n g - s i t e s p e c i f i c i t i e s ( 1 6 4 , 3 1 0 , 5 0 2 ) .S e v e r a l o f t h e m may p e r f o r m t h e same o r o v e r l a p p i n gf u n c t i o n s i n p r o t e i n e x p o r t . A t l e a s t o n e m a j o r g e n e r a lc h a p e r o n e , GroEL ( a member o f t h e 6 0 - k D a h e a t s h o c kp r o t e i n f a m i l y , o f t e n r e f e r r e d t o a s H S P 6 0 ) , c a n m a i n t a i np u r i f i e d , d e n a t u r e d p r e s e c r e t o r y p r o t e i n s i n a t r a n s l o c a t i o n -c o m p e t e n t s t a t e w h e n t h e d e n a t u r a n t i s d i l u t e d o u t ( 4 4 , 3 1 5 ) ,a s c a n a n o t h e r c y t o s o l i c p r o t e i n ( t r i g g e r f a c t o r ) ( 9 8 , 9 9 ) ,w h i c h d o e s n o t a p p e a r t o b e i n v o l v e d i n e x p o r t i n v i v o ( 1 9 9 ) .O t h e r g e n e r a l m o l e c u l a r c h a p e r o n e s p r o b a b l y h a v e s i m i l a ra c t i v i t i e s , b u t t h e o n l y d o c u m e n t e d e f f e c t s o f m a n i p u l a t i n gt h e l e v e l s o f m a j o r g e n e r a l c h a p e r o n e s on p r o t e i n e x p o r t i nE . c o l i a r e t h e s l i g h t l y r e d u c e d r a t e o f p r e - T E M P - l a c t a m a s ep r o c e s s i n g i n t h e a b

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