Journal of Bacteriology and Virology 2016. Vol. 46, No. 3 p.115 – 127 http://dx.doi.org/10.4167/jbv.2016.46.3.115

The Characteristics of RNA Vaccine; its Strengths and Weaknesses

Hyo-Jung Park, Hae Li Ko, Seo-Yeon Jung, Han-Byeol Jo and Jae-Hwan Nam*

Department of Biotechnology, The Catholic University of Korea, Gyeonggi-do, Korea

Since 1990 when Wolff and co-authors proved that both RNA and DNA expression vectors containing interest gene were directly injected into mouse muscle and expressed the protein in vivo, the concept of gene vaccine has been broadly tested in the vaccine field. However, due to the limitations of technology and the misconception about RNA, most previous studies have focused on the DNA vaccine. Recently, the RNA vaccine has emerged as a new game-changing disruptive innovation technology in the vaccine field. This review has covered the characteristics of the RNA vaccine, including its strengths and weaknesses. Finally, we have suggested future directions for the RNA vaccine. Key Words: RNA vaccine, IRES, Cap, Virus, in vitro transcription

I. INTRODUCTION

1990년 Wolff 등은 마우스의 다리 근육에 respiratory

syncytial virus의 long terminal repeat (LTR) 프로모터를 가진 luciferase DNA와 T7 프로모터를 이용하여 in vitro transcription을 통해 확보된 luciferase RNA를 직접 주사한 후, 이 유전자가 마우스 근육에서 발현되는 것을 확인하

였다 (1). 그 이후 적절한 프로모터의 조절 하에, 원하는 유전자를 갖는 플라스미드와 타켓 유전자의 mRNA를 직접 동물에 주사한 결과를 보고하는 많은 논문들이 발표되

었다. 이처럼 발현을 원하는 유전자를 직접 동물에 접종

하여 타켓 유전자를 발현할 수 있게 됨으로써, 결국 발현

한 단백질에 대한 면역 반응의 유도가 가능하게 되었고, 이는 유전자 백신(gene vaccine 혹은 nucleic acid vaccine)의 가능성을 확인해 주었다. 실제로 유전자 백신을 구성

하는 플랫폼 벡터로는 바이러스 게놈이나, 플라스미드 상태의 DNA와 그 외 다양한 유래의 RNA도 있다 (2~5). 그런데 흥미롭게도 PubMed (http://pubmed.gov)의 색인 단어를 "DNA vaccine"과 "RNA vaccine"으로 넣어 관련 발표 논문들의 색인 개수를 확인해 보면 각각 4,424개와 35개의 논문을 발견할 수 있다(2016년 8월 6일 기준). 물론 색인 단어를 "RNA 백신"은 "messenger RNA 백신" 혹은 "mRNA 백신"으로, "DNA 백신"은 "plasmid 백신" 등으로 바꾸어 검색하면 약간 다른 결과가 나오지만, DNA 백신 관련 논문이 RNA 백신 관련 논문에 비해 월등히 많다는 사실은 변함이 없다. 즉, 기본적으로 지금까지의 유전자 백신 연구의 전체 흐름은 DNA 백신을 중심으로 이루어졌

다고 볼 수 있다. 그러나 처음으로 유전자 발현 벡터의 가능성을 보여준 Wolff 등의 결과를 보면 DNA와 RNA, 모두 마우스 근육 내에서 유사한 발현 정도를 보인다. 더구나 1994년 Hillenman이 제시한 재조합 백신 플랫폼의

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Review Article

Received: August 6, 2016/ Revised: August 8, 2016/ Accepted: August 11, 2016 *Corresponding author: Jae-Hwan Nam, Ph.D. Department of Biotechnology, The Catholic University of Korea, 43-1 Yeokgok 2-dong, Wonmi-gu,

Bucheon, Gyeonggi-do, 14662, Korea. Phone: +82-2-2164-4852, Fax: +82-2-2164-4917, e-mail: jhnam@catholic.ac.kr

**This research was supported by the Korean Healthcare Technology R&D project of the Ministry of Health & Welfare (HI13C0826), Basic Science ResearchProgram through the National Research Foundation of Korea (NRF) funded by the Ministry of Science, ICT & Future Planning (NRF-2015M3A9B5030157),and by a grant from the KHIDI funded by the Ministry of Health & Welfare, Republic of Korea (HI15C2955), and KFDA (16172INFECTION268).

○CC This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/license/by-nc/3.0/).

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이상적인 조건들(즉, 안전성, 효능성, 임상 가능성, 개발 가능성, 인허가 가능성 등)을 (6) RNA 백신이 충분히 만족시키고 있다 (7). 그러나 과거에는 RNA를 다루는 것보다는 생물학적으로 좀 더 안정한 플라스미드 상태의 DNA를 다루는 것이 편리하였고, 대장균에서 플라스미드를 생산하는 것이 RNA를 만들기 위해 시험관내 전사(in vitro transcription)을 수행하는 것보다 비용 및 효율적인 면에서 유리하였기 때문에 지금까지의 많은 연구들이 DNA를 중심으로 이루어졌다 (8). 그럼에도 불구하고, DNA를 기반으로 한 유전자 백신 중에서 현재까지 인간에게 사용이 허가된 백신은 호주에서 일본뇌염 바이러스 DNA 백신이 허가된 것을 제외하고는 없는 상태이다 (9, 10). 따라서 본 논문에서는 지금까지 간과되어 왔던 RNA를 활용한 유전자 백신의 장점 및 면역 반응, 그리고 이를 제작하기 위한 플랫폼에 대해서 간단히 논하고자 한다.

II. DNA 백신의 문제점 및 RNA 백신의 특징 30여 년 전, Wolff 등이 유전 물질인 DNA와 RNA를 직접 동물에 접종하면 타켓 유전자가 발현하고 (1), 이 발현에 의해 면역이 가능함이 알려진 이후, RNA보다는 DNA가 플라스미드(pDNA) 상태이기 때문에 확보가 용이하고, 더 안정한 형태의 핵산으로 생각되었다 (8). 그러나 유전자를 기초로 한 백신 분야에서 DNA를 사용하는 방법이 널리 연구되어졌음에도 불구하고 여전히 naked 플라스미드 백신이 상업적 백신 플랫폼으로 널리 사용되지 못했다. 그 이유는 다음과 같이 세 가지로 나누어 볼 수 있다. 첫째, 안전성 문제가 완전히 극복되지 못하였다. 주사한

naked DNA가 세포 안에서 단백질로 발현하기 위해서는 반드시 핵으로 들어가서 mRNA로 전사되어야 되는데 이 과정에서 핵으로 들어간 DNA가 숙주 염색체에 무작위적

으로 끼어들 가능성을 가지고 있다(Fig. 1). 또한 면역한 naked DNA에 대한 항 DNA 반응이 일어나서 숙주 DNA에 대한 자가 면역 반응이 일어날 위험성이 있을 수 있다. 둘째, 낮은 전달 감염의 효율이 걸림돌이다. Naked

pDNA 백신을 주사하게 되면 pDNA는 반드시 타켓 세포의 세포막과 핵막, 즉 두 개의 벽을 뚫어야 되는데 이 때 주입한 pDNA의 대부분이 세포 안 밖의 효소 작용을 통해 파괴되고, 일부만 핵 안으로 들어가게 된다(Fig. 1). 따라서 적절한 면역원성을 보여주기 위해서는 매우 과량의 pDNA를 주사하여야 하는 문제점이 있다 (11). 셋째, naked pDNA만을 면역하였을 때는 일반적으로 타켓 항원 단백질에 대해 체액성 면역 반응(humoral immune response)이 낮아 감염을 예방하고자 하는 감염원에 대해 충분한 중화항체 생성이 되지 않는다. 이는 불충분한 선천성 면역 반응과도 관련이 있다 (8). 최근에는 이러한 DNA 백신의 문제점을 극복하는 방안으로써, 새로이 주목을 받고 있는 유전자 백신인 RNA 백신이 활발히 연구되고 있다. RNA 백신은 DNA 백신과 마찬가지로 유전자만을 면역하기 때문에 기본적인 유사성을 가지고 있으나, DNA 백신이 가진 문제점을 극복할 수 있다고 알려져 있다. 첫째, RNA 백신은 DNA 백신에 비해서 인체에 대한 안전성이 우수하다. 즉, RNA 백신은 그 특성상 DNA 백신처럼 mRNA 전사를 위해 반드시 핵으로 들어가야 할 필요 없이 세포질 내에서 바로 단백질을 합성할 수 있다(Fig. 1). 따라서 핵 내에서 숙주의 염색체 내로 끼어들 가능성이 없다(no danger of genomic integration). 더구나 DNA 백신을 대장균에서 선별 생산하기 위해 사용하는 선별 마커인 항생제 저항 유전자가 RNA 백신 제작에는 불필요하다 (12). 또한 DNA에 비해 반감기가 짧아 장기 유전자 변형(persistence genetic transformation)을 유도하지 않는다 (7).

Figure 1. Different mechanism betweenDNA vaccines and the RNA vaccines makes different features such as efficiencyand stability.

RNA Vaccine 117

일반적인 RNA 백신은 세포 안에 전달하게 되면 단기간

만 활성화 되어 타켓 단백질을 발현하게 되고, 수일 안에 효소학적 반응으로 인해 파괴된다 (13). 그러나 처음 발현

한 타켓 항원(단백질)에 대한 특이적인 면역 반응은 남아 있게 된다. 이러한 특징을 Roesler 등은 '면역 후 사라짐

(immunization and disappear)'이라고 불렀고 (14), 본 논문의 저자들은 "치고 빠지기(hit-and-run)" 특징으로 부르기도 한다. 따라서 RNA 백신은 안전하게 인체에 적용 가능하다.

둘째, RNA 백신은 상대적으로 DNA 백신에 비해서 적은 양을 사용하여도 된다. DNA 백신과는 달리 RNA 백신

은 전술한 것처럼 핵으로 들어 갈 필요가 없기 때문에 핵막을 통과할 필요가 없고, 오직 세포막만을 통과하면 된다. 따라서 DNA 백신은 세포막과 핵막 두 개를 통과하기 위해서 과량의 DNA를 주입해야 하지만 RNA 백신은 DNA 백신보다 더 적은 양으로 같은 정도의 타켓 항원(단백질)을 발현하는 것으로 알려져 있다. 또한 RNA 자체가 면역

보강원성을 가지고 있어 DNA 백신에 비해 소량만으로도 동일한 면역 효과를 볼 수 있다.

셋째, 모든 제작 공정을 인공적으로 할 수 있어 생물학

적 오염에 대한 위험 없이 소규모 GMP 생산 시설에서도 안전하게 백신을 생산할 수 있다. 일반적인 백신(불활화 백신, 약독화 백신)을 생산하기 위해서는 대용량의 세포 배양기나 많은 수의 유정란(계란)이 필요하며, 재조합 단백질 백신조차도 곤충 세포 혹은 대장균 배양을 위해 대규모의 생물학적 배양기가 필요하다. 하지만 RNA 백신

은 소규모 GMP 실험실 수준의 시설만이 필요할 뿐이며, 직접 감염원(바이러스 혹은 병원성 미생물)을 다루지 않아도 RNA 백신을 생산할 수 있다(자세한 생산 공정은 본 논문의 뒷부분에서 언급). 따라서 RNA 백신은 소규모의 시설로 다양한 백신을 신속하게 공급할 수 있는 최적의 백신 플랫폼이라고 할 수 있다.

넷째, RNA 백신은 naked DNA 백신에 비해서 더 강한 면역 반응을 유도할 수 있다. 이러한 강한 면역 반응은 RNA 백신의 stem-loop 구조 및 RNA 자체 특성으로 인해 유도된 선천성 면역 반응과 면역된 숙주의 세포에서 발현된 타켓 항원(단백질)에 의해 유도된 후천성 면역 반응

이 상호 협력하여 나타나는 것으로 생각된다. 또한 RNA 백신 자체가 세포 내에서 복잡한 항원 복합체(complex antigen)를 생성하게 되고 이것이 항원 제시 세포의 MHC class I에 좀 더 잘 접근하게 되면서 이상적인 백신으로서 작용할 수 있게 된다 (2, 12, 15, 16).

다섯째, RNA 백신은 기존 백신에 비해 생산 용이성이 더 우수하다. RNA 백신을 생산하기 위해서는 기존의 백신처럼 바이러스나 미생물을 직접 다룰 필요가 없다. 대신 발현하고자 하는 바이러스나 미생물의 중화항체 유도 관련 부분(중화 에피톱)의 유전자만을 인공적으로 합성한 후 그 부분만을 시험관내 전사하여 RNA 백신을 생산할 수 있다. 과거에는 이런 방식으로 대량의 RNA를 생산하

는데 많은 경비와 고난이도의 기술이 필요하였으나 현재

는 시험관내 전사반응의 관련 시약, 특히 DNA-의존 RNA 중합효소의 개선을 통해 소량의 DNA 주형을 이용하여 대량의 RNA를 1~2주 안에 생산할 수 있게 되었다. 최근 한 국내 회사는 RNA를 짧은 시간 안에 kg 단위로 생산

하여 해외에 납품하는 등 관련 기술이 비약적으로 발전하

고 있어 RNA 백신 생산의 기술적 난점을 극복하였다. 더구나 면역 반응을 유도하고자 하는 여러 개의 항원을 동시에 제작하여 혼합한 후 면역할 수 있으며, 발현고자 하는 항원의 유전자 길이에 특별한 제약이 없어 백신 제작

의 응용성 및 간편성이 증가하였다. 위에서 언급한 다양한 RNA 백신의 장점은 이 분야에

서 축적된 기술력을 바탕으로 상업적 성공과 임상적 가능

성을 높이고 있다. 따라서 RNA 백신은 기존 백신 생산 체계를 대신할 수 있는 새로운 백신 생산 플랫폼이며, "판도를 바꿀 수 있는 혁명적 기술(game-changing disruptive innovation technology)"이 될 수 있다.

III. RNA 백신의 구조

RNA 백신은 기본적으로 다음과 같은 세 가지 구성 부

위를 가지고 있다. 첫째, 단백질 번역을 시작하는 번역 복합체(translational initiation complex)가 결합하는 부위인 5'-비발현 부위(5'-untranslation region, 5'-UTR), 둘째, 타켓 항원을 발현하는 open reading frame (ORF) 부분과 셋째, 단백질 합성이 끝나는 부분이면서 5'-UTR 부분과 함께 단백질 발현 효율에 관여하는 3'-비발현 부위(3'-untranslation region, 3'-UTR) 부분이다(Fig. 2).

3.1. 5'-UTR (Cap vs. IRES)

5'-UTR 부분은 크게 두 가지 종류로 나누어진다. 대부

분의 진핵 세포의 mRNA는 5' 말단에 7-methyl-guanosine (cap)을 가진 프로모터 부분인 RNA를 가지고 있고, 단백

질 합성을 위해 단백질 합성 시작 복합체(translation in-

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itiation complex)가 cap을 인식하고 시작 코돈인 AUG까지 진행하여 단백질 합성을 시작한다. 그러나 일부 RNA는 cap 대신 IRES (Internal Ribosome Entry Site) 서열을 가진 RNA가 있어 단백질 합성을 한다. IRES는 일부 진핵 세포 mRNA 뿐만 아니라 많은 바이러스들이 가지고 있다(Fig. 2). 이를 기준으로 mRNA가 단백질 합성을 하는 방법은 크게 cap 의존 전사반응과 IRES 의존 전사반응으로 나누어 질 수 있다.

Cap 구조는 보통 단백질 합성을 개시하는 역할과 nu- clease의 작용으로부터 mRNA의 파괴를 막는 작용을 한다. 시험관내 전사의 첫 과정은 pDNA (plasmid DNA)에 제한효소를 처리하여 선형화 시킨 후 T7, T3 혹은 SP6 RNA 중합효소를 이용하여 만든 mRNA에 m7G(5')-ppp-(5')G(보통 regular cap analog라 한다)를 붙여서 capped mRNA를 만

들어 사용한다 (17, 18). 그러나 이러한 cap analog는 종종 반대 방향으로 결합하여 m7G nucleotide가 cap에 작용하지 못하게 된다. 결론적으로 regular cap analog를 이용하여 만들어진 mRNA의 1/3 가량은 cap에 methylation이 없게 되고 이러한 mRNA는 단백질 합성을 할 수 없다 (19, 20). 이러한 일을 방지하기 위해 cap analog 없이 먼저 시험관내 전사를 수행한 후 상업적으로 이용 가능한 vaccinia virus capping 효소를 사용하여 cap 반응을 수행하는 방법이 있으며, 이러한 cap의 역방향 반응을 막는 'anti-reverse' cap analog (ARCA)를 사용하고 있다 (21). ARCA는 메틸화가 일어난(base-methylated) guanosine의 3'-O-methylation만이 메틸화가 안된(non-methylated) guanosine의 nucleotide에 결합한다. 따라서 ARCA-capped mRNA는 regular cap analog-capped mRNA보다 두 배 이상의 효율로 단백질 합성이 일어나고, mRNA의 반감기 역시 길다 (20, 22, 23). 최근에는 ARCA의 효율을 좀 더 개선하는 방향으로 다양한 변형이 이루어졌다 (24, 25). 그러나 이러한 capping 반응은 RNA 백신의 대량 생산의 제작 단가를 높이는 요소 중 하나로써 실제 상업적 백신 생산의 중요한 방해 요소가 될 수 있어 반드시 개선이 이루어져야 하는 부분이다.

IRES 구조는 1988년에 Picornaviridae인 encephalomyo- carditis virus (EMCV)와 poliovirus (PV)에서 처음으로 밝혀졌고, 2차 및 3차 구조를 복잡하게 형성하는 cis-acting 염기서열을 가진 5'-UTR 구조를 갖는다. 일반적으로 IRES 구조를 가진 바이러스는 positive sense RNA 바이러스이며, 2009년까지 최소한 68종의 바이러스가, 진핵 세포에서는 115개의 유전자가 IRES 구조를 가지고 있다고 보고되었다 (26). IRES-의존 전사를 위해서는 특별한 단백질이 필요한데, 특히 RNA-Protein binding proteins (RBPs)이 단백질 발현 시작에 핵심적 역할을 수행한다. 이러한 RBP는 바이러스 감염 같은 다양한 외적/내적 스트레스에 의해서 활성화 되어 IRES에 의한 단백질 발현을 조절한다 (27). 이외에도 최근에는 HCV IRES가 작용하기 위해서는 miRNA (micro RNA)-122가 반드시 필요하다는 것이 밝혀졌다 (28). 최근 이를 발표한 Rice 그룹에서는 다른 종류의 바이러스 성장에도 또 다른 cellular miRNA가 관여할 것으로 추정하고 이러한 miRNA를 동정하기 위해 다음과 같은 시스템을 구축하였다. 즉, RISC 구조의 일부이며, miRNA를 타켓으로 인도하는 Argonaute (AGO)와 교차결합과 면역침전(crosslinking and immunoprecipitation, CLIP)를 이용한 AGO-CLIP 시스템과 micro RNA-target chimeras를 활용하

Figure 2. (A) RNA vaccine contain in 5'-UTR region, ORF (OpenReading Frame, Gene of Interest, GOI) and 3'-UTR region. (B) Various modifications on 5'-UTR region of vaccines are essential for initiation of translation. IRES: Internal Ribosome Entry site, Cap-like: Cap-like structures. (C) Translation of some mRNAs depends on interactions between 5'-UTR and 3'-UTR region. PABP:Poly A Binding Protein, IFC: a Complex of translation Initiation Factors.

RNA Vaccine 119

여 15개의 다른 바이러스들에 대한 micro RNA 결합을 조사하였다. 이를 통해 miR-17이 bovine viral diarrhea virus (BVDV)의 3'-UTR 부분에 결합하고 이것이 BVDV의 복

제에 필수적인 역할을 하는 것을 확인하였다 (29). 일부 바이러스 IRES는 cap을 이용하거나 cap 구조와 유사한 바이러스 단백질(예: Coxsackie virus B3의 3B 유전자에서 유래한 Vpg 단백질)을 이용하여 cap 유사 구조를 만들기

도 하며, IRES를 가진 다른 바이러스들은 cap 구조 없이 단백질 발현을 시작할 수 있다(Fig. 2). 현재까지는 IRES 공통 서열이나 IRES 공통 RNA 구조는 확인되지 않았다. 따라서 IRES의 이러한 특징은 이를 RNA 백신 플랫폼으

로 활용하고자 할 때 반드시 고려해야 한다.

3.2. 3'-UTR (poly A tail)

3'-UTR 부분은 5'-UTR과 함께 단백질의 발현 효율 및 mRNA가 세포 내에서 파괴되지 않고 안정적으로 유지되

는데 매우 중요한 역할을 한다. 특히 RNA 백신을 개발하

기 위해서는 5'-UTR과 3'-UTR 사이의 상호 작용이 중요

하며(Fig. 2), 이를 위해 각 부분을 다른 종류의 유전자에

서 빌려와 제작할 수도 있다. 3'-UTR와 더불어 그 뒤쪽에 3-말단 방향으로 결합하는

poly A tail이 단백질 합성 개시 효율 및 mRNA 안정성

(stability) 증가에 큰 영향을 미친다고 알려져 있으며, 다양한 연구들을 통해 가장 적합한 길이의 poly A tail에 대한 연구결과도 있다 (30). 그러나 연구에 사용된 세포의 종류와 mRNA 상태, mRNA를 세포로 전달한 방법 등에 따라 54에서 98 잔기(residues)까지, 혹은 64에서 150 잔기

까지는 단백질 발현 효율이 증가하며 (31, 32), poly A tail의 길이가 길수록 발현 효율이 좋아진다는 결과의 보고도 있다 (32). 반면 poly A가 60 잔기인 경우까지만 단백질 발현이 증가하고, 그 이상의 poly A tail 길이의 경우는 오히려 발현 효율이 감소한다는 보고도 있다 (33). 따라서 RNA 백신 제작을 위해서는 기본적으로 50~60 잔기 정도

의 poly A tail을 결합한 후 그 이상의 길이 증가는 사용하

는 5' 및 3'-UTR의 종류, 전달하고자 하는 세포의 종류, 전달 방법에 따라 다양하게 조절하는 것이 필요하다.

3.3. ORF (Open-Reading Frame, Gene of Interest, GOI)

RNA 백신에서 ORF는 보통 발현하고자 하는 타켓 단백질(GOI)를 가리킨다. 이론상으로는 RNA 백신에서 발현

할 수 있는 타켓 ORF (GOI)의 길이는 제한이 없다. 따라

서 ORF (GOI) 길이에 따른 발현 효율은 RNA 백신 개발

에 큰 고려 대상이 아니다. 그러나 codon usage는 보통 다양한 종에서 단백질 발현에 영향을 미칠 수 있다 (34). 그러나 사람의 codon usage bias는 보통 단백질 발현에 큰 영향을 미치지 않는다고 알려져 있기 때문에 (35, 36), 사람

을 대상으로 하는 RNA 백신 개발에서는 고려 대상이 아니다. 그럼에도 불구하고 시작 코돈은 반드시 Kozak 서열

을 가지고 있어야 하며, 종결 코돈 근처의 염기서열도 최적화 할 필요가 있다 (37, 38). 이외에도 발현하고자 하는 타켓 유전자 mRNA의 코돈 서열 중 세 번째 부분을 GC로 바꾸어 아미노산의 변화 없이 타켓 유전자의 GC%를 증가시켜 mRNA의 안정성을 높이기도 한다.

IV. RNA 백신 개발을 위한 플랫폼

4.1. 바이러스 플랫폼

바이러스를 기반으로 한 RNA 백신의 두 가지 주요 형태는 전통적인 형태의 non-replicon RNA이고, 또 다른 하나는 self-replicon RNA로서, 각각 장단점을 가지고 있다.

첫 번째, RNA 백신의 가장 단순한 형태의 구조인 naked RNA 백신은 양 끝에 짧은 5'-UTR 부위와 3'-UTR 부위

가 있고 그 사이에 발현하고자 하는 단백질의 유전 정보

(ORF/GOI)가 있다(Fig. 2). 이 구조의 장점은 단순성에 있다. 즉 non-replicon RNA 플랫폼은 단백질 발현 조절에만 관여하는 양 말단의 UTR만 가지고 있고, 이 부분은 단백

질 발현이 일어나지 않아 기본적으로는 숙주와 상호 작용하거나 면역 반응에 영향을 미칠 수 없다는 점이다. 따라서 발현을 원하는 가운데의 ORF (GOI) 부분에서만 단백질을 발현한다. 그러나 mRNA의 지속적인 발현을 제한

하려는 세포의 특성 때문에, 상대적으로 고농도의 RNA 투여가 필요하며, 만일 아무런 변형을 가하지 않은 naked RNA를 면역하면 생체 내에서 일시적이거나 낮은 수준의 발현만 가능할 수도 있다.

두 번째, self-replicon RNA 백신은 일반적인 mRNA(보통 10 kb) 보다 길고, 세포 내로 전달된 RNA 복제를 도울 수 있는 바이러스 유래 비구조 단백질, 특히 바이러스

성 RNA 중합효소 복합체를 가지고 있어, 이를 중심으로 replication complex(예: alphaviral replicase polyprotein, P1234)를 만들어 이론상으로는 한 개의 바이러스 RNA 게놈으

로부터 200,000 minus-strand copies를 만들 수 있다(Fig. 3). 따라서 오직 한 개의 self-replicon RNA만이 세포 내로 들

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어가도 면역 반응을 유도할 수 있는 충분한 양의 타켓 단백질이 만들어진다 (8). 그러나 바이러스에서 유래한 비구조 단백질도 동시에 발현하게 되어 이것이 숙주에 어떤 영향을 미칠지는 알 수 없다.

RNA 백신에 일반적으로 사용하는 알파바이러스는 positive-sense RNA 바이러스로서 비구조 유전자(nsp1-4) 및 구조 유전자(Capsid, E2/E1)를 포함하는 게놈 구조를 가지고 있다(Fig. 3). 이러한 알파바이러스 게놈으로부터 구조 유전자를 제거하고, 외래 관심 유전자(Gene of Interest, GOI)가 포함된 self-amplifying (replicon) RNA를 숙주 세포로 도입하면 이 replicon에 내재되어 있는 바이러스성 RNA 중합효소 복합체에 의해 자가 증폭된다(Fig. 3). 이 replicon-based RNA 백신은 구조 유전자의 결여로 인해 감염성 바이러스는 만들어지지 않으며, RNA의 cell-cell 전달 또한 일어나지 않게 된다. 그러나 바이러스의 구조 유전자 대신 삽입한 외래 유전자가 숙주 세포 내로 유입된 subgenomic RNA로부터 과발현 된다. 이러한 구조를 viral replicon particle (VRP)이라 하며, 다양한 VRP가 백신 후보로서 연구되어 왔다. 특히 alphavirus 유래 VRP는 마우스와 영장류에서 발현된 타켓 항원 특이 체액성 면역 반응과 세포성 면역 반응을 모두 잘 유도할 수 있음이 확인되

었기에 효과적인 백신으로 활용 가능함을 보였으며, 최근 임상 제1상 시험에서 사람의 체액성 및 세포성 면역 반응을 유도할 수 있음이 확인되었다 (39). 또한 최근에는 이러한 RNA 백신을 lipid nanoparticle (LNP)로 제작하여 투여하면 면역 효과가 증가함이 확인되었다 (40). 지금까지 다양한 alphavirus를 사용하여 replicon 벡터가 개발되어져 왔으며, 이 중 venezuelan equine encephalitis virus (VEEV), sindbis virus (SINV), semliki forest virus (SFV) 등이 가장 활발히 연구되어지고 있다.

4.2. 진핵세포 mRNA 플랫폼

바이러스에서 유래한 UTR을 원하는 타켓 유전자를 발현하는데 사용하는 대신에 사람 세포 유래 mRNA의 UTR 부분을 활용하여 RNA 백신 플랫폼을 개발하는 시도도 있다. 독일 CureVac 회사에서는 다양한 리보소옴(ribosome) 단백질 UTR을 활용한 플랫폼을 개발하였다. 예를 들면 5' 말단 oligopyrimidine tract이 없는 human ribosomal large protein 32의 5'-UTR, human ribosomal small protein 9의 3'-UTR, 64개의 poly A, 30개의 cytidylates를 가진 poly C 및 histone stem-loop 서열을 이용한 RNA 플랫폼을 개발하여 이용하고 있다(Fig. 4). 바이러스 유전자 유래 UTR을

Figure 3. (A) Schematic structure of self-replicon RNA vaccine contains in structural and nonstructural protein coding region to replicate.51-nt CSE: 51-nt Conserved Sequence Element, SG promoter: sub-genomic promoter (B) Replacement of structural protein coding region with GOI (Gene of Interest).

Figure 4. Platform structure of RNA vaccine of CureVec company. AAAAn: Poly A. CCCCCn: Poly C.

RNA Vaccine 121

이용하는 것과, 진핵 세포 유래 유전자 UTR을 백신 플랫

폼 개발에 이용하는 것은 각각 장단점을 가지고 있으므

로, 그것을 잘 파악하여 목표로 하는 백신 개발에 가장 적절한 방식을 활용해야 한다.

V. mRNA 백신의 면역학적 특징

유전자 백신은 기본적으로 발현하고자 하는 단백질의

유전자(DNA 혹은 RNA)를 다양한 벡터를 사용하여 동물

에 접종하여 타켓 항원을 발현하는 시스템이다. 흥미로운 점은 유전자로부터 발현되는 단백질의 양은 실제로 면역

원성과 직접적인 비례 관계에 있지는 않다는 점이다 (8, 41). 즉, 발현되는 항원이 많다고 하여 반드시 그 항원의 면역원성 또한 비례하여 증가한다는 것은 아니다. 일반적

으로 유전자 백신을 동물에 주사하게 되면, 유전자 백신

(DNA 혹은 RNA)이 동물 근육 세포에 다양한 방식으로 전달 감염된다. 이렇게 전달 감염된 근육 세포는 항원 특이적인 T 세포에 의해서 용해(lysis)되기 때문에 실제로 항원이 발현되는 기간이나 항원의 양은 시험관 외 세포 배양 실험에서 예측한 정도가 아니다. 따라서 어떻게 유전자 백신이 제한된 발현 양과 기간을 통해 면역 반응을 유도하는지를 정확히 이해하기 위한 추가적인 연구가 필요하다. 실제로 시험관 외 세포 배양 연구를 통해 얻어진 결과는 생체 내 동물 실험의 결과와 일치하지 않는 경우

가 많다. 그 이유는 유전자 백신이 투여된 후 면역 반응

에 수반되는 선천성 면역 수용체의 종 특이적 발현과 항원 인식 패턴 차이, 세포 종류별로 선천성 면역 수용체 발현양의 차이가 있기 때문이다. 이는 위에서 언급한 알파

바이러스를 기본으로 하여 활용한 self-replicon RNA 백신

이 단순히 항원 발현의 양이 많기 때문에 항원에 대한 면역원성이 높다고 설명하기 보다는 또 다른 요인의 영향일 수도 있음을 시사하고 있다.

전술한 바와 같이, RNA 백신은 RNA를 동물에 면역하

는 시스템이다. 흥미롭게도 RNA 자체가 면역보강제의 효과를 지니고 있다. 이미 2004년에 RNA의 분해를 막기 위해 cationic protein을 결합시키거나(trans protection), phospho- diester backbone을 화학적으로 변형(phosphorothioate RNA: cis protection)을 한 RNA가 면역보강제로 작용한다는 결과가 발표되었으며 (42), 2005년에는 protamine-condensed RNA가 RNase에 의해 잘 분해되지 않으며, MyD88 기전

을 통해 가지돌기세포(dendritic cell, DC) 및 단핵구 뿐만

아니라 B cell, NK cell, 과립구를 활성화 시키는 강력한 위험 신호)로 작용하는 것이 확인되어졌고 이러한 면역 반응에는 Toll-like receptor (TLR) 7/8이 관여하고 있음이 알려졌다 (43). Protamine이 RNA 백신에서 이러한 면역 촉진을 보여주는 이유는 protamine-condensed RNA의 크기

가 naked RNA보다 커지게 되어 2종류의 면역 세포에 모두 작용하기 때문이다. 즉, protamine condensed RNA는 2가지 크기를 가지게 되는데 이때 nano-particle(약 220 nm)을 형성한 것은 plasmacytoid DC에 의해 탐식되어 인터페론 알파를 분비하게 되고, micro-particle(약 1,200 nm)을 형성

한 것은 단핵구를 자극하여 TNF-α를 분비하게 된다 (44). 이러한 점은 protamine-condensed RNA가 자가 면역보강제

로 작용하여 효과적인 백신으로 작용할 수 있음을 보여주

고 있다. 1963년 Isaacs 등은 외래 RNA를 세포에 노출시키면 세

포에서 인터페론이 유도되는 것을 확인하였으며 (45), 이러한 효과는 인위적 유도체인 double-strand RNA에 의해

서도 일어남이 확인되었다 (46). 따라서 RNA 백신에 노출

된 동물 세포는 전형적인 선천성 면역 반응을 유도하기 시작한다. Single-strand RNA (ssRNA)이나 double-strand RNA (dsRNA)는 세포질 내의 endosome에 존재하는 패턴 인식 수용체(PRR)인 TLR7/8 및 TLR3에 의해서 인식되어지며, uncapped RNA 분자를 인지하는 RIG-I 및 RNA-dependent Protein Kinase (PKR), 2'-5' oligo A synthetase, MDA5 같은 PRR 역시 노출된 RNA를 인식하여 염증성 사이토카인을 유도하여 선천성 면역을 유도하여 RNA 백신에 의한 면역 반응의 촉진에 기여하게 된다 (8, 47~50). 흥미로운 점은 전술한 것처럼 이러한 RNA의 노출이 PKR 및 Ribonuclease L (RNaseL)의 활성을 통해 제1형 인터페론을 유도하며, 이 인터페론은 일반적으로 유전자의 단백질 번역을 억제하게 된다. 그러나 흥미롭게도 알파바이러스 기반 RNA 백신을 통해 연구된 결과에 의하면 이렇게 유도된 인터페론은 단지 숙주 단백질의 합성에만 영향을 미치고, 알파바이러스 벡터에 encoded된 항원 발현에는 영향을 미치지 않는다 (51). 이것은 제1형 인터페론은 일반적인 단백질 합성은 억제하나, 자신이 분비된 세포에 작용하여(autocrine 효과), 백신 항원을 encoded한 단백질 발현에는 영향을 미치지 못함을 의미한다. 대신 이렇게 유도된 인터페론은 선천성 면역 반응의 유도를 촉진한다. 따라서 RNA 백신의 면역

은 RNA 백신 자체의 특성으로 선천성 면역을 촉진하고 발현된 항원 단백질에 의해 후천 면역 반응을 유도하여,

122 H-J Park, et al.

두 가지 면역 반응이 마치 엘라 피츠제럴드와 루이 암스

트롱의 완벽한 재즈 듀엣처럼 백신의 면역보강효과를 증강시키는 것이다.

이러한 점들은 RNA 백신에 의해 동물 세포에서 발현

되는 단백질의 양보다는 RNA 백신을 구성하는 벡터의 종류 및 면역에 필요한 적합한 RNA 백신의 양(dose, dose titration, 단순히 양적 증가가 아닌 적절한 양), protamine 같은 화합물을 활용한 최적의 RNA의 변형 등이 우수한 면역 반응을 유도하는데 중요함을 의미한다.

VI. RNA 백신의 활용

RNA를 활용한 최초의 백신은 1993년 인플루엔자 바이

러스 nucleo-protein (NP)을 encoding 하는 RNA를 liposome을 이용하여 encapsulation하여 NP-specific cytotoxic T cell 반응을 유도한 논문이었다 (52). 이후 2012년에 인플루

엔자 A 타입의 hemagglutinin (HA)를 encoding하고 있는 protamine-condensed RNA 백신으로 CureVac 'RNActive' 플랫폼을 가진 백신이 고안되었다. 이 RNA 백신으로 면역

된 마우스는 주령과 관계없이(생후 1일과 18개월 마우스) 바이러스 공격으로부터 마우스를 효과적으로 방어하였으

며, 동일한 RNA 백신이 면역된 페렛이나 돼지도 상업적

으로 사용되고 있는 백신과 동등한 정도의 효능을 보여

주었다 (12). 사실 RNA 백신은 주로 암 치료용 백신의 개발에 활용되어 왔으며, RNA 백신 회사인 CureVac 회사의 파이프라인에 의하면 암 치료용 백신 분야에서 가장 발 빠른 연구 성과(임상 제I/II상)를 보여주고 있다. 이것은 RNA 백신이 선천성/후천성 면역 반응을 모두 강력히 유도할 수 있어 암 항원에 대한 특이적 면역 반응을 효과적

으로 유도하여 암세포를 다각적으로 공격하기 때문이다. 그러나 최근 이 회사는 다양한 감염성 질환(인플루엔자 바이러스 H5N1, HIV 1, 2형 및 APHIS/CDC 및 보툴리눔 신경독소, 에볼라, Marburg viruses, 탄저균, Hendra, Nipah viruses, 수족구바이러스, CSFV)에 대한 백신 플랫폼으로 RNA 백신을 활용하고자 하는 연구를 추진하는 것으로 보인다.

VII. RNA 백신 제작

RNA 백신을 제작하기 위해서는 일반적인 시험관내 전

사반응을 통해 mRNA를 생산하기 때문에 모든 제작 공정

을 시험관 내에서 수행하게 된다. 즉, 효소적으로 말단이 절단되어 선형화된 DNA를 주형으로 이용하여 T7, SP6, 혹은 T3 RNA polymerase에 의해서 RNA를 시험관에서 합성하기 때문에 일반적인 생백신이나 사백신 제조에 사용

하는 살아 있는 바이러스나 미생물을 직접 다룰 필요가 없다 (9). 더구나 재조합 백신(재조합 단백질) 생산을 위해 반드시 사용해야 하는 효모, 대장균, 곤충 세포 배양 등이 불필요하다. 사실 DNA 백신 생산을 위해서도 플라스미드 DNA를 확보하기 위해 대규모의 대장균 배양기가 필요하

지만, RNA 백신 생산을 위해서는 매우 소량의 주형 DNA (template DNA)만이 필요하기 때문에 실험실 수준의 설비

만으로도 RNA 백신의 생산이 가능하다. 그리고, 살아 있는 감염원을 취급할 필요가 없는 RNA 백신의 특징은 백신 생산의 안전성 확보에 매우 중요하며, 또한 대규모 생물학적 반응기가 불필요한 점은 RNA 백신 생산 설비의 소규모화가 가능하기 때문에 백신 생산의 유연성을 확보

하는 데에 있어서도 매우 중요하다. 시험관내 전사반응을 위한 T7 및 SP6 RNA 중합효소

는 1980년대에 박테리오파지에서 발견되어 상업적으로 이용되고 있다 (53~55). 실험실 수준에서 밀리그램 단위의 RNA를 생산하는 것은 기존의 소규모 상업적 키트로 충분

히 가능하다. 그러나, 임상용의 RNA 백신 생산을 위한 대규모 합성은 또 다른 노하우가 필요하다. 일반적으로 시험관내 전사반응을 위해서는 RNA 중합효소가 결합하는 프로모터를 가진 선형화된 DNA 주형, nucleotide triphos- phates, RNA polymerase, RNase 오염 방지를 위한 ribo- nuclease inhibitor, 전사를 방해하는 pyrophosphate를 파괴

하는 phyrophosphatase, MgCl2, 적절한 pH buffer 등이 필요

하다 (9). 이러한 RNA 백신 생산 요소 중 상업적 생산에 가장 중요한 것은 RNA 중합효소와 capping 효소이다. 이 두 개의 효소가 RNA 백신 생산 효율 및 경제성에 가장 큰 영향을 미치고 있다. 최근 CureVac에서는 상업적으로 활용 가능한 정도의 RNA를 대량 생산할 수 있는 시스템

을 개발하여 이미 암 치료에 사용하고 있으며 (17, 18), 국내 일부 회사에서도 대규모로 RNA를 생산할 수 있는 기술력을 확보한 상태이다.

이외에도 RNA 백신의 효율에 영향을 미치는 부분은 시험관내 전사반응의 결과로 얻어진 RNA를 정제하는 부분

이다. RNA 정제도(purity)에 따라 백신 면역 효과에서 차이가 나기 때문에 합성 후 공정에서 가장 중요한 부분은 정제 공정이다. 일반적으로 전임상 단계라면 RNA를 LiCl

RNA Vaccine 123

및 에탄올로 정제하여도 충분하나, 임상에서 RNA 백신을 사용한다면 모든 공정은 반드시 GMP 시설에서 크로마토

크래픽(HPLC) 정제를 하여야 한다.

VIII. RNA 백신 접종 경로 및 숙주 전달 RNA 백신은 다양한 루트를 통해 투여할 수 있다. 즉,

근육(intramuscular) (1, 56~58), 피내(intradermal) (12, 59, 60), 피하(subcutaneous) (52), 정맥(intravenous) (52), 비장(intra- splenic) (61), 및 림프절 내 투여(intranodal) (62, 63) 경로 등이다. 특히 최근에 RNA 백신을 림프절 내로 주사하여 더 좋은 면역 효과를 얻은 결과도 있다 (7). 그러나 이렇

게 다양한 경로를 이용하여 RNA 백신을 접종할 수 있음

에도 불구하고 실제로 사람에게 적용할 수 있는 경로는 근육과 같이 일부로 제한된다. 따라서 실제 감염성 질환

에 대한 예방용 백신을 개발할 때는 접종 경로를 기존 백신 루트를 고려하여 선정하여야 한다.

RNA 백신의 접종 경로뿐만 아니라 전달 방법 역시 적절한 면역 반응을 유도하는데 중요하다. 사실 위에서 전술한 것처럼 DNA 백신과는 달리 RNA 백신은 세포막만

을 통과하면 되기 때문에 실제 면역에서 적은 양만을 사용해도 같은 면역 효과를 볼 수 있다 (64). 일반적으로 사용하는 근육 주사를 통해 백신을 면역하는 것보다 특별한 장치를 사용하여 면역하는 것이 면역 효과를 높이는 동시

에 사용하는 백신의 양을 줄일 수 있다 (7). 예를 들면 유전자 총(gene gun)을 사용하여 human alpha 1 antitrypsin이나 melanoma-associated antigen TRP2 등에 대한 유전자 백신이 성공적으로 수행되었다 (65, 66). 최근에는 전기충격

(electroporation)법 역시 유전자 백신을 효율적으로 전달할 수 있음이 확인되었다 (7). 이외에도 항원제시세포에 원하

는 항원을 생체 외 mRNA 전달 감염(ex vivo mRNA trans- fection) 하는 방법이 실제 임상에 적용되고 있다 (7).

IX. RNA 백신의 안정성(stability)

DNA 백신의 분해는 주로 depurination/β-elimination 및

free radical oxidation 때문이며, 보통 특정 킬레이트들과 free hydroxyl radical 제거제를 사용하면 30℃에서 1년 동안 안정된 형태를 유지한다고 알려져 있다 (67).

일반적으로 mRNA는 리보오스 당의 2' 위치 내 hydroxyl group이 존재하기 때문에 불안정한 분자 구조로 간주된다.

이것은 RNA 분자의 나선 형태가 DNA에서 발견되는 가장 일반적인 형태의 B-form이 아닌 A-form의 기하 구조

이기 때문이다. 따라서 RNA는 형태학적으로는 유연하나 분자 내 에테르 교환 반응으로 RNA의 phosphodiester 결합이 절단된다. 그러므로 안정적으로 RNA를 유지하기 위해서는 동결 건조 형태로 보관하는 것이 좋다. Jone 등은 동결 건조된 self-amplifying RNA가 4℃에서 10개월 동안 안정적으로 보관이 가능하다고 보고하였고, Petsch 등은 lyophilized mRNA influenza 백신은 37℃에서 3주 동안 안정적으로 보관이 가능하다고 보고하였다 (12, 68). 이러한 결과들은 RNA의 안정적 보관을 위해서는 동결 건조 방법이 유용함을 보여준다.

RNA 분해 효소(RNase)에는 크게 endonucleases, 5' exo- nucleases, 3' exonucleases, 세 가지 형태가 있다 (69). 따라

서 RNA의 장기 보관에는 반드시 이러한 효소와의 접촉

을 차단하여야 한다. 최근, Geall 등은 외부 유전자를 가진 self-amplifying RNA를 지방 나노분자(lipid nanoparticle, LNP)가 둘러싸면(encapsulation), 투여하는 부위에서 RNA 분해효소에 의한 공격으로부터 보호가 가능하며, 효율적

인 전달 감염이 이루어지고 외부 유전자가 더 많이 발현

되어 그 결과 발현된 해당 단백질에 대한 더 우수한 면역

원성을 보여주었다 (56). 또한 Probst 등은 피하 주사를 통한 naked mRNA 전달을 위한 다른 전략을 제시했다. 마우

스의 피부에서 extracellular RNase의 작용을 억제하기 위해 전달하고자 하는 naked mRNA에 RNase 억제제를 첨가하

면 RNase들에 의한 mRNA의 효소학적 분해를 효율적으

로 막을 수 있었다 (70). 사실 세포는 RNA의 불안전성을 이용하여 생리적 변화

의 필요에 따라 단백질 합성을 빠르게 조절할 수 있다. 만약 특정한 유전자 전사의 증감 조절 후, 해당되는 mRNA가 불안정 하다면 정상 상태(steady state)로 빠르게 돌아간

다. 그러나 어떤 세포는 15분에서 24시간까지 mRNA의 반감기가 서로 다르다. 이러한 다양한 mRNA의 반감기는 mRNA의 안정성과 mRNA의 발현 수준 연구에서 반드시 고려되어야만 한다. 세포 내 mRNA 분해 기전은 복잡하

고 많은 효소와 및 경로와 관련되어 있으며, 이것은 진핵 세포 유전자 발현 조절에 중심적인 역할을 한다. 따라서 이러한 기전의 정확한 이해는 RNA 백신 개발에 매우 중요하다.

124 H-J Park, et al.

X. CONCLUSION

전술한 것처럼, RNA 백신 플랫폼은 현재의 백신 생산

법을 완전히 새롭게 변화시킬 혁신적인 백신 생산 기술

이다. 최근 들어 메르스 바이러스 같은 신변종 바이러스

나 지카 바이러스 같이 과거부터 존재하였으나 갑자기 문제를 야기하는 바이러스들이 새롭게 발생하는 경우가 많다. 하지만 이러한 모든 감염원에 대해서 항상 백신을 준비하는 것은 현실적으로 불가능한 일이다. 만일 위기 상황 시에 의료진 등 필수 안전 요원에게 신속하게 백신을 처방할 수 있는 적합한 백신 생산 플랫폼이 개발된다면 2015년 메르스 바이러스 사태 같은 국가 위기 상황을 적절히 컨트롤 할 수 있을 것이다. 국가 위기 대응 백신 시스템을 기존의 전통적인 단백질 기반 백신으로 만든다면, 모든 감염원에 대한 백신을 생산하여, 보관하다 일정 기간 후에 폐기 처분하여야 하는 불합리함이 있다. 이러한 위기 대응 백신 조건에 가장 부합하는 생산 플랫폼은 RNA 백신이 유일하다. RNA 백신 생산은 매우 소량의 주형 DNA만을 가지고 있으면 1~2주 안으로 국가 필수 필요량인 30만 도스를 생산할 수 있다. 이것이 가능한 이유는 RNA 백신 플랫폼의 경우, 생물학적 반응기가 불필요하며, 감염

원을 직접 다룰 필요가 없이 모든 관련 유전자를 합성으

로 처리하여 백신을 생산할 수 있는 유일한 백신 생산 플랫폼이기 때문이다. 따라서 현재 국내 유입이 우려되는 다양한 감염원에 대해서 유전자를 합성하여 RNA 백신을 개발한 후 전임상 및 phase 1/2까지의 연구만을 수행 후 필요한 주형 DNA을 보관하다 위기 상황에서 1~2주 안에 신속히 백신을 생산하는 것이 가장 현실적인 대안이 될 것이다.

그럼에도 불구하고, RNA 백신 개발에는 여러 가지 난점

이 있다. 첫째는 정확한 작용 기전(mode of action)이 아직 불분명하여 이 부분에 대한 연구가 집중되어야 한다. 두 번째는 좀 더 효율적이며 특허 이슈가 없는 새로운 RNA 백신 생산 시스템을 개발하여야 한다. 세 번째는 in vitro transcription 수행 시 염기서열의 정확성이 보장되는 시스

템이 개발되어야 한다. 이처럼 아직까지는 여러 가지 문제점이 해결되어야 함에도 불구하고 RNA 백신 연구는 전 세계적으로 시작 단계이기 때문에 국내에서 충분히 first-in-class 제품을 만들 수 있으며, 그 가능성 또한 매우 밝다고 할 수 있다.

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