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Facultad de Ciencias Agropecuarias
Departamento de Medicina Veterinaria y Zootecnia
Maestría en Salud Animal Avanzada
4ta Edición
Tesis en opción al grado de Master en Ciencia
Título: Digestibilidad in vitro de tres leguminosas tropicales: efecto del
inóculo microbiano y la adición de levadura.
Title: In vitro digestibility of three tropical legumes: effect of the
microbial inoculum and yeast addition.
Maestrante: Dr. MVZ. Beydis Reguera Barreto
Tutor: MSc. Einar Artiles Ortega. Dr. MVZ.
PhD. Raciel Lima Orozco. Dr. MV.
Curso: 2017-2018
Digestibilidad in vitro de tres leguminosas tropicales: efecto del inóculo microbiano y la
adición de levadura. [In vitro digestibility of three tropical legumes: effect of the microbial
inoculum and yeast addition].
Beydis Reguera Barreto Dr. MVZ., fue soportado por el Laboratory for Animal Nutrition
and Animal Product Quality (LANUPRO, University of Ghent, Ghent, Belgium), y el
Laboratorio de Nutrición Animal en conjunto con el Laboratorio de Espectrofotometría,
ambos del Centro de Investigaciones Agropecuarias de la Facultad de Ciencias
Agropecuarias de la Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas (Cuba).
Para referir esta tesis:
Reguera-Barreto, B. 2018. Digestibilidad in vitro de tres leguminosas tropicales: efecto
del inóculo microbiano y la adición de levadura. M.Sc. disertación, Universidad Central
“Marta Abreu” de Las Villas, Santa Clara, Cuba.
RESUMEN
Este estudio evaluó el efecto de las comunidades microbianas ruminales incubadas
durante 14 d con diferentes fuentes de carbohidratos, con o sin levadura sobre la
degradación in vitro de tres leguminosas tropicales: Leucaena leucocephala,
Mucuna pruriens y Canavalia ensiformis, y determinó la influencia de los taninos
sobre la degradabilidad de las mismas. Los forrajes fueron químicamente
caracterizados, y se determinó la presencia de fenoles y taninos totales, y taninos
condensados, evaluándose la actividad biológica de los taninos. Las leguminosas
en estudio no difieren significativamente en los valores de materia seca, proteína
bruta y taninos condensados. L. leucocephala tuvo valores de FDN y FDA dos veces
superior al resto, y al igual que M. pruriens, mostró valores altamente significativos
en fenoles y taninos totales. Los inóculos obtenidos durante 14 d consecutivos de
incubación in vitro no mostraron diferencias en la capacidad de degradación de las
leguminosas. Sin embargo, la degradación de estas con inóculos suplementados
con levadura activa o inactiva se asemejó a la degradación con inóculo fresco,
mientras que con inóculos sin levadura la degradación fue menor. Los valores de
actividad biológica de los taninos no indicaron diferencias significativas en las tres
leguminosas. En conclusión, las comunidades microbianas cultivadas durante 14
días estimulan la fermentación ruminal de las tres leguminosas, y la presencia de
taninos totales y condensados no influyeron en la degradabilidad aparente de los
carbohidratos ni en los patrones de fermentación de las plantas en estudio.
Palabras claves: incubación consecutiva, ARDC, taninos, actividad biológica.
ABSTRACT
This study was carry out to assess the effect of ruminal microbial communities
incubated during 14 d with different sources of carbohydrates, with or without yeast
on the in vitro degradation of three tropical legumes: Leucaena leucocephala,
Mucuna pruriens and Canavalia ensiformis, and determined the influence of tannins
on the degradability of them. The forages were chemically characterized, and the
presence of phenols and total tannins, and condensed tannins were determined,
evaluating the biological activity of the tannins. The legumes under study do not differ
significantly in the values of dry matter, crude protein and condensed tannins. L.
leucocephala had NDF and ADF values twice higher than the rest, and like as M.
pruriens, and showed highly significant values in phenols and total tannins. The
inocula obtained during 14 consecutive days of in vitro incubation did not show
differences in the degradation capacity of legumes. However, the degradation of
these with inocula supplemented with active or inactive yeast resembled the
degradation with fresh inoculum, whereas with inoculum without yeast degradation
was lower. The values of biological activity of the tannins did not indicate significant
differences in the three legumes. In conclusion, the microbial communities cultivated
for 14 days stimulate the ruminal fermentation of the three legumes, and the
presence of total and condensed tannins did not influence the apparent degradability
of the carbohydrates or the fermentation patterns of the plants under study.
Keywords: consecutive incubation, ARDC, tannins, biological activity.
ÍNDICE.
INTRODUCCIÓN: ................................................................................................................... 1
CAPÍTULO I. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA ...................................................................... 4
I.1. Características de las leguminosas tropicales ......................................................... 4
I.2. Adaptación de la flora microbiana mediante incubaciones consecutivas y la
suplementación con levaduras para mejorar la digestibilidad de los alimentos. ...... 6
I.3. Presencia de taninos en las leguminosas. ............................................................... 7
I.4. Efecto de los taninos en la fermentación ruminal.................................................... 9
I.5. Uso de Polietilenglicol (PEG) para determinar digestibilidad en leguminosas
con taninos ......................................................................................................................... 12
CAPÍTULO II. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL......................................................... 14
II.1. Obtención del forraje de las leguminosas y preparación de las harinas .......... 14
II.2. Análisis químico proximal ......................................................................................... 14
II.3. Incubación consecutiva con o sin levadura y con diferentes fuentes de
carbohidratos...................................................................................................................... 14
II.4. Incubación ruminal in vitro (24 h) de tres leguminosas tropicales ..................... 15
II.7. Determinación de la actividad biológica de los taninos ....................................... 17
II.8. Análisis estadístico .................................................................................................... 18
CAPÍTULO III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN................................................................ 20
III.1. Análisis químico proximal, fenoles y taninos totales, y taninos condensados
de las leguminosas estudiadas ....................................................................................... 20
III.2. Cultivo consecutivo por lotes .................................................................................. 21
III.3. Incubaciones de rumen in vitro (24 h) de leguminosas...................................... 22
III.4. Actividad biológica de los taninos .......................................................................... 25
CONCLUSIONES: ................................................................................................................ 27
RECOMENDACIONES: ...................................................................................................... 28
BIBLIOGRAFÍA: ................................................................................................................... 29
INTRODUCCIÓN
1
INTRODUCCIÓN:
Los compuestos secundarios producidos por las plantas ejercen actividades
beneficiosas en el organismo animal, debido a su actividad antioxidante y sus
efectos favorables sobre procesos inflamatorios y tumorales, pero sus actividades
más conocidas son como estimulantes digestivos, antisépticos y antimicrobianos
(McArthur et al., 1993). El uso de extractos vegetales en la alimentación animal
constituye actualmente una alternativa natural a los aditivos antibióticos promotores
del crecimiento (Windisch et al., 2008). Existe un gran número de compuestos
secundarios que pueden utilizarse como aditivos en la alimentación de los
rumiantes, pero entre ellos destacan las saponinas, los aceites esenciales y los
taninos (Jouany y Morgavi, 2007).
Las plantas producen taninos como un mecanismo de defensa ante los ataques de
bacterias, hongos e insectos, y además de la preferencia por los herbívoros ya que
generan astringencia, lo que reduce la calidad nutricional de las mismas (McArthur
et al., 1993). Estos complejos se disocian a valores de pH inferiores a 3,5 (pH en el
abomaso) y superiores a 7,5 (pH en el intestino delgado), por lo que las proteínas
pueden ser digeridas en el estómago e intestino delgado sin haberse degradado en
el rumen (Min et al., 2003).
Generalmente las plantas leguminosas tropicales se caracterizan por sus altas
concentraciones de taninos condensados (TC) que tienen alta afinidad por las
proteínas, carbohidratos y otros constituyentes de las plantas, afectando
notablemente la digestibilidad de los nutrientes (Waghorn, 2008; Tiemann et al.,
2008).
Sin embargo, los efectos negativos sobre la digestibilidad dependen de la
concentración de taninos en las plantas, que no guarda un patrón común en éstas,
por ejemplo en Leucaena leucocephala el 0,018-0,046 g/ 100 g MS de la materia
seca son taninos (García et al., 2008; Galindo et al., 2009), en Mucuna pruriens del
0,01-0,033 g/100 g MS de la materia seca (Siddhuraju et al., 2000; Betancur-Ancona
et al., 2004; Kala y Mohan, 2010), mientras que en Canavalia ensiformis los valores
son generalmente insignificantes (Mora et al., 1986; León et al., 1989; Betancur-
Ancona et al., 2004; Estupiñan et al., 2007;). Concentraciones entre el 0,02 g/100 g
MS y 0,04 g/100 g MS de taninos en la materia seca son consideradas óptimas para
la obtención de beneficios de estas plantas (Aerts el al., 1999; Min et al., 2003).
INTRODUCCIÓN
2
Los taninos poseen efectos antimicrobianos y pueden afectar negativamente al
crecimiento de determinados microorganismos ruminales, lo que resulta en efectos
perjudiciales (como la reducción del crecimiento bacteriano) o beneficiosos (por
ejemplo, reducción de la producción de metano y la degradación proteica).
Finalmente, los efectos de los taninos sobre los procesos digestivos varían
ampliamente en función de su estructura química y de la dosis administrada (Frutos
et al., 2004), pero tienen gran potencial para modificar la fermentación ruminal.
En un experimento in vitro precedente realizado por Artiles-Ortega et al., (2016) con
líquido ruminal de ovejas alimentadas a base de heno, encontraron valores de
fermentación aparente de carbohidratos de 43.7, 40.2 y 26.9 g/100 g de MS en
Canavalia ensiformis, Mucuna pruriens y Leucaena leucocephala respectivamente,
donde el diseño experimental no permitió inferir si la presencia de taninos en estas
leguminosas influyó en estos valores de digestibilidad.
Problema científico: Es poco conocido el efecto de la adaptación de la flora
microbiana a diferentes fuentes de carbohidratos y su interacción con la
suplementación de levadura sobre la degradación ruminal in vitro de Leucaena
leucocephala, Mucuna pruriens y Canavalia ensiformis.
Hipótesis: La fermentación ruminal in vitro de Leucaena leucocephala, Mucuna
pruriens y Canavalia ensiformis puede diferir cuando los inóculos microbianos
ruminales han sido previamente sometidos a estrés nutritivo (diferentes fuentes de
carbohidratos) y suplementados o no con levadura.
Objetivo general: Evaluar el efecto de las comunidades microbianas cultivadas
durante 14 días frente a diferentes fuentes de carbohidratos, ya sea en presencia o
no de levadura sobre la fermentación ruminal in vitro de tres leguminosas tropicales.
Objetivos específicos:
1. Evaluar el efecto de inóculos ruminales adaptados a diferentes fuentes de
carbohidratos sobre la digestibilidad in vitro de forrajes de L. leucocephala , M.
pruriens y C. ensiformis.
2. Evaluar el efecto de inóculos ruminales adaptados a diferentes fuentes de
carbohidratos en combinación con la suplementación in vitro de levadura sobre la
digestibilidad in vitro de forrajes de L. leucocephala , M. pruriens y C. ensiformis.
INTRODUCCIÓN
3
3. Determinar la composición químico proximal y las concentraciones de fenoles y
taninos totales y taninos condensados en Canavalia ensiformis, Mucuna pruriens
y Leucaena leucocephala.
4. Determinar la digestibilidad ruminal aparente de carbohidratos y la actividad
biológica de los taninos en Canavalia ensiformis, Mucuna pruriens y Leucaena
leucocephala.
CAPÍTULO I. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
4
CAPÍTULO I. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
I.1. Características de las leguminosas tropicales
Las leguminosas tropicales (por ejemplo, L. leucocephala, M. pruriens, C ensiformis)
son forrajes prometedores para rumiantes ya que poseen un alto potencial
productivo de granos y follaje, y un alto contenido de sustancias nitrogenadas con un
elevado valor nutritivo (Cáceres et al , 1995; Siddhuraju et al., 2000 ; Aye y Adegun,
2013), pero los factores anti-nutricionales (FAN) que contienen afectan
negativamente la fermentación de estas en el rumen (Bhat et al., 1998; Bhatta et al.,
2009; Jayanegara et al., 2015).
Las legumbres son una fuente barata de proteínas, presentando características
nutricionales importantes como: concentraciones elevadas de hidratos de carbono,
contenidos altos de fibra y bajos de grasa (excepto las semillas oleaginosas), y altos
tenores de ácidos grasos insaturados. Además, poseen niveles importantes de
complejo de vitaminas B, y minerales (García et al., 2006). También son conocidas
por contener cierta cantidad de compuestos bioactivadores cuyos efectos
beneficiosos necesitan ser explorados para la explotación (Sridhar y Seena, 2006).
En las leguminosas pratenses tropicales disminuye el valor nutritivo al madurar la
planta, debido a que los cambios en la relación hoja-tallo son menos marcados que
en gramíneas, lo que representa una ventaja sobre estas últimas (Norton y Poppi,
1995).
En el caso de las leguminosas temporales, estos cambios en la proporción de los
componentes de la planta, hacen que su calidad bromatológica se mantenga, aún
más que en las leguminosas perennes, debido a las características morfológicas de
sus vainas y al valor nutritivo de sus granos (Díaz, 2000).
Debido a su alto aporte de nutrientes, y el paso de proteína no degradada al
abomaso, Leucaena se ha convertido en una de las leguminosas más usadas en la
alimentación de rumiantes (Barros-Rodríguez et al., 2014). Un alto contenido de
proteína bruta, que varía entre 24 y 30 % dependiendo de la variedad y la época del
año (García et al., 2008) y valores de digestibilidad de proteínas y materia seca
medidas in vivo que alcanzan 63 % y del 60-70 % respectivamente (Barros-
Rodríguez et al., 2012), permiten que sea ampliamente aceptado el uso de esta
como un suplemento de proteína en los sistemas de producción ganadera en las
regiones tropicales (Galindo et al., 2009).
CAPÍTULO I. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
5
La composición bromatológica de las leguminosas puede variar grandemente en
dependencia del lugar donde se desarrolla el cultivo, la época de siembra o la época
de corte del mismo, por ejemplo en cultivares de L. leucocephala en Sao Pablo,
Brasil se obtuvieron valores de 93.6 g/100 g MS y 23.6 g/100 g MS de materia
orgánica y proteína bruta respectivamente (Soltan et al., 2013) mientras que en
Egipto la proteína bruta obtuvo valores de 20.4 g/100 g MS (Sallam et al., 2010) y en
Cuba los valores alcanzan los 90.7 g/100 g MS de materia orgánica y los 27.0 g/100
g MS de proteína cruda (Rodríguez et al., 2008).
Canavalia ensiformis es una leguminosa que destaca especialmente por su
contenido de proteínas, por lo que ha sido empleada como una fuente proteica en la
alimentación tanto de monogástricos como de rumiantes (Belmar, 1999). C.
ensiformis podría ser un cultivo del futuro como alternativa en la alimentación
animal; esta planta se destaca por su adaptación a un amplio rango de condiciones
climáticas y agronómicas, con capacidad de producir en suelos con bajos contenidos
de nutrientes y regiones con pocas precipitaciones (Beyra et al., 2004).
Un trabajo realizado por Estupiñan et al. (2007) demuestra que la composición
química de los componentes de la pared celular de C. ensiformis varía en diferentes
edades de corte, por ejemplo, la fibra detergente neutra varía en valores de 49.16 –
52.10 – 52.66 – 54.74 g/100 g MS a edades de corte de 60 – 75 – 90 - 105 días
respectivamente.
Canavalia es una leguminosa de alta producción de forraje (7 hasta 12.4 t/ha) y
elevado contenido de proteína bruta en sus hojas y posee un alto potencial de
aminoácidos esenciales, con excepción del triptófano (Sridhar y Seena, 2006).
Los hallazgos de Díaz (2000) evidenciaron la posibilidad agronómica que
manifiestan la especie C. ensiformis para la producción de forrajes y forrajes
integrales, cuando se siembran al inicio de la estación lluviosa, bajo las condiciones
de Cuba. Posteriormente, Díaz et al. (2002) demostraron la posibilidad
bromatológica que manifiesta esta leguminosa para la producción de forrajes,
forrajes integrales y granos, cuando se siembran al final del período lluvioso en
Cuba y además su calidad bromatológica superior al resto de las leguminosas
evaluadas en el estudio (Lablab purpureus y Stizolobium niveum).
CAPÍTULO I. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
6
I.2. Adaptación de la flora microbiana mediante incubaciones consecutivas y la
suplementación con levaduras para mejorar la digestibilidad de los alimentos.
Gaviria et al. (2015) reportaron que la degradabilidad de L. leucocephala solo fue
mayor cuando se combinó con la hierba de guinea, pero no fue diferente entre la
combinación de Leucaena con hierba de guinea (Panicum maximum) y con la hierba
de guinea suplementada (melaza y harina de arroz).
En otro estudio, Blandino y Pineda (2015) informaron que la digestibilidad in vitro de
C. ensiformis con harina de caña de azúcar fue de 71.8 – 73.4 % (5 a 10 % de la
tasa de inclusión de Canavalia), y Mora et al. (1983) demostraron que los niveles
crecientes de inclusión de granos de harina de C. ensiformis en las dietas de forraje
de ovejas disminuyó la digestibilidad de la materia seca (MS) (de 61.7 a 57.4 %
respectivamente).
Además, Herawaty et al. (2013) demostraron que el uso de paja de arroz como un
sustituto del pasto fue similar a los resultados obtenidos con pasto cuando se le
añade 0,5 % de Saccharomyces cerevisiae y 15 % de L. leucocephala.
La incubación ruminal consecutiva in vitro podría permitir una modificación de la
actividad o la composición de la microflora del rumen, Theodorou et al. (1987)
mostró variaciones en la capacidad de la población microbiana ruminal de adaptarse
a los compuestos fenólicos empleando este tipo de incubación como adaptación a
estos compuestos.
Por otro lado, Kondwani (2007), demostraron que tienen una alta digestibilidad y
producción de gas a pesar de su contenido de L- Dopa usando la incubación
consecutiva para adaptar la microflora a los contenidos de este factor presente en
las semillas de Mucuna.
Además, Mbiriri et al. (2015) usando una incubación consecutiva informó que se
observaron adaptaciones microbianas en el rumen cuando se utilizaron como
aditivos dos sustancias diferentes (carvacrol y timol).
En adición, la suplementación con levadura también se ha sugerido para modificar la
comunidad microbiana del rumen (Öztürk et al.,2015), y por tanto mejorar la
fermentación (Chaucheyras et al., 2008). La mejora de la fermentación en el rumen
con la adición de la levadura se atribuyó a la capacidad que tiene esta para
incrementar el número de microorganismos ruminales, especialmente hongos y
poblaciones de bacterias fibrolíticas (Mao et al., 2013). Por otra parte, la
CAPÍTULO I. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
7
suplementación in vitro con levaduras vivas afectó la fermentación ruminal en mayor
grado que las levaduras inactivadas, pero ninguno de ellos mostró efectos
significativos (Opsi et al., 2012).
I.3. Presencia de taninos en las leguminosas.
Los taninos son metabolitos secundarios generados por las plantas para su defensa
contra microorganismos patógenos y la depredación por insectos o herbívoros
(Barry y Manley, 1987; Wallace, 2004), y en relación con estos últimos, afectan los
procesos metabólicos del animal y/o la tasa de crecimiento de algunos
microorganismos después de su ingestión. Son sustancias astringentes que
producen sabores amargos que se encuentran a menudo en las hojas de la planta
(Durmic y Blache, 2012).
Los taninos son un complejo químico de polifenoles hidrosolubles, que se pueden
combinar con otros polímeros como la celulosa, hemicelulosa y pectinas para formar
complejos estables (Mangan, 1988), especialmente cuando se combinan con
proteínas, disminuyen su digestibilidad (Waghorn, 2008).
La presencia de taninos se relaciona con una disponibilidad biológica menor de
algunos nutrientes porque forman complejos con la fibra, las proteínas y otras
macromoléculas e iones metálicos mediante puentes de hidrógeno, enlaces
covalentes, enlaces iónicos e interacciones hidrófobas (Schofield et al., 2001).
Las especies forrajeras que contengan taninos y, además, un adecuado contenido
de proteínas constituyen excelentes fuentes suplementarias para la alimentación de
rumiantes en el trópico (García et al., 2006; Lezcano et al., 2012).
Por el contrario, cuando los niveles de taninos en las forrajeras son cuantiosos
pueden ocasionar pérdidas de nutrimentos y un mal aprovechamiento de las
raciones en los rumiantes, además de toxicidad aguda en animales monogástricos
(Abdulrazak et al., 2000), aspectos estos importantes a la hora de definir la inclusión
de estas leguminosas como alimentos para estos animales en los diferentes
sistemas de crianza.
Hay dos tipos de taninos, hidrolizables (TH) y condensables (TC). Los TC se
localizan en las hojas de numerosas plantas y arbustos, y son compuestos definidos
como compuestos proantocianina-flavonoides con enlace carbono-carbono uniendo
el monómero flavonoide individual que puede ser catequina, galocatequina,
epicatequina y epigalocatequina (Perchellet et al., 1996).
CAPÍTULO I. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
8
Los TC son sustancias complejas con capacidad de reaccionar con macromoléculas
y proteínas del forraje, según su concentración, estructura química y peso molecular.
No son hidrolizables por ácidos ni enzimas y son conocidos como poliflavonoides o
proantocianidinas, ya que están constituidos por flavonoides con diferente grado de
condensación, además de carbohidratos y trazas de aminoácidos y tienen un peso
molecular que fluctúa entre 1 900 y 28 000 Da (Posada et al., 2005).
Estos se encuentran comúnmente en las especies forrajeras de la zona templada y
en leguminosas utilizadas en los sistemas de producción pastoril. La concentración
en estas especies es muy variable: 0.01 a 10 % de la materia seca (MS). Sin
embargo, en un rango de concentración de 0.2-0.4 g/100 g MS, producen cambios a
nivel nutricional productivo y sanitario en los animales que los consumen (Paolini et
al., 2003). Estos polifenoles producen una reducción en el consumo, la digestibilidad
de la proteína, materia seca y fracciones minerales (Ojeda et al., 2010).
Según Barbehenn y Constabel (2011) los taninos hidrolizables (TH) son ésteres
fácilmente hidrolizables por ácidos, bases y enzimas, formados por una molécula de
azúcar (generalmente glucosa) unida a un número variable de ácidos fenólicos,
ácido gálico y elágico, agrupándose así en galotaninos y elagitaninos. Tienen una
distribución limitada en la naturaleza pero abundan en frutos, vainas y hojas de
algunas dicotiledóneas y su peso molecular varía desde 500 a 3 000 Da. Los TH son
generalmente tóxicos para los animales (Haslam et al., 1977; Pérez-Maldonado y
Norton, 1996).
L. leucocephala ha sido ampliamente estudiada en cuanto a la presencia y cantidad
de taninos, estando su estudio y aplicación distribuido ampliamente por todo el
mundo. Trabajos realizados en Egipto por Sallam et al. (2010) y Soltan et al. (2013),
encontraron valores de 0.03 y 0.05 g/100 g MS de taninos condensados,
respectivamente. En América los valores son muy distantes en dependencia del país
en que se muestrea, por ejemplo, García et al. (2008) en evaluaciones en Venezuela
encuentran valores de 0.03- 0.05 g/100 g MS y Soltan et al. (2013) en Brasil de 0.02
g/100 g MS, mientras que Rahim et al. (2012) determinaron que los taninos
condensados se encuentran en la especie en valores de 0.09 g/100 g MS. Por otro
lado, en Cuba la cantidad de taninos condensados en Leucaena oscila entre 0.02-
0.05 g/100 g MS (Galindo et al., 2009).
Siddhuraju et al. (1996), y Siddhuraju et al. (2000) demostraron que M. pruriens
presenta niveles de taninos condensados dentro del rango de 0.01-0.05 g/100 g MS
CAPÍTULO I. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
9
en la India. Por otro lado, en México los valores oscilaron entre 0.014- 0.023 g/100 g
MS (Kalidass y Mohan, 2011) y en Nigeria, Amira et al. (2014) indicaron niveles de
0.026 g/100 g MS de taninos condensados en esta especie.
I.4. Efecto de los taninos en la fermentación ruminal.
Dependiendo de su concentración los TC pueden tener efectos beneficiosos o
nocivos; los efectos favorables se presentan con concentraciones moderadas (2-4
%), mientras que los efectos nocivos se presentan cuando las concentraciones son
relativamente altas (6-12 %) (Aerts el al., 1999).
Getachew et al. (2000) determinó algunos efectos adversos de los taninos como
son: disminución de la ingesta y la digestibilidad, efectos sistémicos debido a la
asimilación de productos de degradación de los taninos hidrolizables en el tracto
digestivo, inhibición de enzimas digestivas y pérdida de proteína endógena.
Por otro lado, los taninos pueden generar varios efectos positivos pero los más
estudiados son su actividad como antiparasitarios biológicos (McSweeney et al.,
2001; Min y Hart, 2003). Estos provocan la disminución de la solubilidad y
degradabilidad de las proteínas de la pastura de alfalfa, la cual es generadora de
altas concentraciones de amoníaco ruminal y, por ende, más exigente en energía
para detoxificar la urea metabólica (Conti et al., 2007), y generan una mayor eficacia
energética de la dieta al reducirse la producción de metano (Gurbuz, 2009).
Otras interacciones a tener en cuenta son taninos-protozoos que depende del tipo
de taninos, su origen y los niveles de suplementación (Carmona, 2007; Patra y
Saxena, 2011), y taninos-hongos que depende de la naturaleza de la asociación del
tanino con la enzima (Barahona et al., 2006).
Los taninos se unen a proteínas y polisacáridos estructurales (celulosa,
hemicelulosa y pectina, minerales, almidón) retrasando su tasa de digestión e
interfiriendo con la actividad de las enzimas microbianas (McSweeney et al., 2001;
Min et al., 2003).
El efecto de los taninos retardando la digestión de la fibra es considerado un efecto
secundario comparado con la digestión del nitrógeno (N) (Pereira-Filho et al., 2005;
Animut et al., 2008).
Los taninos, por lo general, mejoran la asimilación del N por los rumiantes ya que
reducen la cantidad de N amoniacal (N-NH3) producido en el rumen (Patra y
Saxena, 2011), además reducen el número de bacterias totales y celulolíticas en el
CAPÍTULO I. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
10
rumen lo que está relacionado con la reducción o mantenimiento de la producción de
ácidos grasos volátiles (Patra et al., 2006; Cieslak et al., 2012).
Las altas emisiones de CH4 ocurren particularmente cuando los forrajes de
gramíneas son los ingredientes principales en las dietas para rumiantes,
considerando que las legumbres parecen tener una más baja producción potencial
de CH4. Sin embargo, la mayoría de los esfuerzos por mitigar la producción de CH4
a través de la variación de los forrajes dietéticos produce una reducción en la
degradación de la fibra ruminal o la digestibilidad de los nutrientes en el tracto
gastrointestinal (Tan et al., 2011; Abdalla et al., 2012; Goel y Makkar, 2012).
Un posible beneficio adicional de la utilización de leguminosas en la alimentación de
los rumiantes son los efectos derivados de los compuestos secundarios que
contiene, por ejemplo: taninos, que tienen un posible efecto en la disminución de los
gases de efecto invernadero (Barros-Rodríguez et al., 2014).
Aumentando la dosis en la dieta a 2.5 % de taninos, la producción del metano en el
ganado y ovejas se disminuye en un 15 %, pero a este efecto también podría
atribuirse un 5 % de reducción de digestibilidad de la fibra. Recientemente, se ha
demostrado in vitro que las propiedades antimetanogénicas de la Leucaena (Soltan
et al., 2012) puede ser resultado de las cantidades significativas de CT que
contienen sus hojas (33 - 61 g/kg MS) (Tan et al., 2011; Soltan et al., 2012).
Además, es una fuente de minerales tales como azufre, que actúa como potenciador
de las poblaciones de la microbiota ruminal (principalmente hongos y bacterias
celulolíticas) (Aregheore, 1999).
La digestibilidad in vitro de la proteína de M. pruriens presenta un nivel mayor
comparado otras especies. La presencia de factores antinutricionales no es un
problema para el consumo de estas semillas, una vez sean sometidas a un proceso
adecuado. En vista de su composición química y nutricional, las semillas de estas
leguminosas pueden ser empleadas como materia prima en la elaboración de
alimentos balanceados para animales. Ha sido demostrado que en este forraje los
niveles de fenoles y taninos es eliminado mediante el secado (Siddhuraju et al.,
1996) y autoclaviado (Vijayakumari et al., 1996) y su reducción mejora la
digestibilidad de la proteína.
En las semillas de Mucuna pruriens, Josephine y Janardhanan (1992) reportaron
que la mayor proporción de taninos se encuentra en la testa de la semilla y solo
trazas en los cotiledones.
CAPÍTULO I. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
11
Aunque se han detectado factores anti-nutricionales en M. pruriens (sobre todo en
los granos), no hay evidencia de un efecto perjudicial de estos compuestos cuando
se alimenta con este forraje a los rumiantes en grandes cantidades (Castillo-Caamal
et al., 2003; Pérez-Hernández et al., 2003). La inclusión de vainas de M. pruriens en
las dietas no tienen un efecto negativo en el consumo total de MS (Loyra-Tzab et al.,
2013).
La inclusión de Canavalia tiene un posible efecto sobre las bacterias Gram positivas
ruminales y una disminución en el rumen de amoníaco acompañado por un aumento
de la concentración de aminoácidos libres (Domínguez-Bello y Stewart, 1990) lo que
causaría la depresión de la digestión observado en algunos reportes. Algunos
autores también reportan un incremento de flagelados (clase no común de
protozoario ruminal) y un aumento neto de la población de protozoarios en bovinos
alimentados con Canavalia (Sandoval-Castro y Herrera, 2001).
Numerosos autores señalan que las semillas de Canavalia no contiene taninos o
están presentes en valores muy bajos (Rajaram y Janardhanan, 1992; Betancur-
Ancona et al., 2004; Sridhar y Seena, 2006) y atribuyen los efectos negativos de la
inclusión en la dieta de rumiantes de este forraje a compuestos antrinuticionales
como la canavanina y la concanavanina A (Natelson, 1985; Rodrigues y Torne,
1992; Sridhar y Seena, 2006). La inclusión de taninos, por ejemplo, con utilización
de la harina de plátano verde, puede detoxificar la Canavalia, al formar complejos
irreversibles con los tóxicos, pero puede también reducir la disponibilidad de la
fracción nitrogenada restante (Escobar et al., 1983).
Escobar et al. (1983) informan un buen consumo de Canavalia en animales
adaptados, y recomiendan que estos deben tener un período de adaptación de
alrededor de 30 días. El potencial de la Canavalia para los rumiantes es más amplio
que en las aves y los cerdos, incluyendo el uso de la planta entera como: a) un
componente de un pastizal de gramíneas y leguminosas; b) un banco de proteína
con un pastoreo intensivo adecuadamente controlado; y c) en un sistema de
alimentación en confinamiento total o parcial; puede resultar viable,
alternativamente, usar el grano, las legumbres y las vainas o el follaje remanente
después de la cosecha del grano.
CAPÍTULO I. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
12
I.5. Uso de Polietilenglicol (PEG) para determinar digestibilidad en
leguminosas con taninos
Para evaluar la actividad de taninos en la fermentación ruminal de árboles y
arbustos tropicales se utiliza frecuentemente la técnica de producción de gas in vitro
combinada con un agente inactivador de taninos como el polietilenglicol (PEG) (Ben
Salem et al., 2005; Makkar, 2005).
El PEG (OH(C2H4O)nH) es un detergente iónico que se adhiere a los taninos
hidrolizables y condensados mediante enlaces hidrofóbicos en un rango de pH que
va desde 2 a 8,5 (Getachew et al., 2000). Este compuesto desplaza a los TC de los
complejos tanino-proteína formando complejos insolubles e irreversibles con las
proteínas vegetales y, además formando complejos PEG-taninos que son solubles,
evitando de esta forma la formación tanino-proteína (Jones y Mangan 1977; Barry y
Manley, 1986).
La unión es más fuerte entre PEG y taninos que con las proteínas de la planta por lo
que el tratamiento con PEG se utiliza para separar los efectos nutricionales
atribuibles a los TC en rumiantes alimentados con forrajes que lo contengan
(Getachew et al., 2002).
La afinidad de los taninos al PEG es mayor que las de las otras moléculas presentes
en la solución de incubación y el sustrato fermentado, por lo que los taninos son
inactivados, y el tratamiento con PEG funciona como un control libre de taninos
(Muetzel y Becker, 2006). Getachew et al. (2002) concluyó en un estudio que las
muestras que contengan fenoles y taninos totales por encima de 0,4 y 0,2 g/100 g
DM, respectivamente, no producen un aumento en la producción de gas en conjunto
con PEG.
Los estudios de la proporción de inclusión de PEG para lograr una neutralización
completa de los taninos varían notablemente (Makkar et al., 1995; Kamalak et al.,
2005) por lo que estas proporciones no pueden ser universalmente aplicables.
La eficacia de la inclusión de PEG puede variar por especies de forraje, lo que se
debe a la estructura química y peso molecular diferente de los taninos (Makkar et al.,
1995). También esta inclusión de PEG puede variar en la misma especie si crece en
ambientes significativamente diferentes, por lo que determinar los niveles de
inclusión de PEG óptimos es crítico para evaluar el costo eficaz de forrajes taníferos
en los países en vías de desarrollo (Edwards et al., 2012).
CAPÍTULO I. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
13
Según este propio autor, con niveles de inclusión de 200 mg/g MS de la muestra es
suficiente para el diagnóstico de la actividad biológica de los taninos in vitro en
forrajes de tres especies de leguminosas, dentro de las cuales se encontró L.
leucocephala.
CAPÍTULO II. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL
14
CAPÍTULO II. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL
II.1. Obtención del forraje de las leguminosas y preparación de las harinas
La harina de forraje de cada leguminosa tropical se preparó de la siguiente manera:
para C. ensiformis y M. pruriens se utilizó una mezcla de granos y forraje [base seca
1:1], mientras que para L. leucocephala solo se utilizó forraje. Las tres leguminosas
tropicales fueron cultivadas en la vaquería "Tres Caminos" (22º25'22.9 "N, 80º03'13"
W) de la UBPC "Desembarco del Granma", ubicada en Santa Clara, en el centro de
Cuba.
M. pruriens se sembró intercalada con pasto Elefante (King Grass) en una parcela
de 1 ha, mientras que C. ensiformis y L. leucocephala se sembraron en diferentes
parcelas de 0.2 y 1 ha, respectivamente. La precipitación, temperatura y humedad
promedio durante el período de cultivo fueron de 47.5 ± 42.13 mm, 26.3 ± 2.02ºC y
82.5 ± 4.19 %, respectivamente. Los cultivos no fueron fertilizados ni irrigados.
El forraje fresco de las tres leguminosas se cosechó por separado alrededor del
mediodía al finalizar temporada lluviosa (23/10/2014 - 27/10/2014). M. pruriens y C.
ensiformis se cosecharon a unos 5 cm por encima del nivel del suelo (planta entera
en etapa de floración), y los materiales de L. leucocephala se cortaron de las ramas
jóvenes (se extrajeron los tallos para obtener solo las ramitas y las hojas). Además,
los granos de M. pruriens y C. ensiformis se obtuvieron en las mismas parcelas en la
etapa de grano seco.
II.2. Análisis químico proximal
El análisis químico proximal fue realizado de acuerdo a lo descrito en AOAC (2005)
(MS: material seca – número ID 930.15; PB: proteína bruta – como 6.25 x N -
número ID 954.01); MO: materia orgánica (EC, 2009) y el fraccionamiento de la fibra
según Van Soest et al. (1991). Además, se realizó determinación de Fenoles y
Taninos totales, y taninos condensados según lo recomendado por Makkar et al.
(2007).
II.3. Incubación consecutiva con o sin levadura y con diferentes fuentes de
carbohidratos
La incubación ruminal consecutiva in vitro se llevó a cabo de acuerdo a lo
recomendado por Castro-Montoya et al (2015), con algunas modificaciones que se
muestran a continuación: los frascos de incubación de 120 mL recibieron uno de tres
CAPÍTULO II. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL
15
sustratos (530 mg de celulosa, 470 mg de almidón o 500 mg de mixto [1:1 almidón y
celulosa]) según lo planteado por Vlaeminck et al (2014), en combinación con uno
de tres tratamientos con Saccharomyces cerevisiae (40 mg de células de levadura
vivas [AY], 40 mg de levadura inactivada [IY] [AY esterilizada en autoclave a 121°C
durante 20 min] o sin levadura [-Y]). La fuente de levadura fue Yea Sacc®, cultivo de
levadura vivo basado en la cepa CNCM I-1026 (Alltech, Deinze, Bélgica) (Hassim et
al., 2012).
Posteriormente, los frascos se cerraron con tapones de goma y se enjuagaron
exhaustivamente con CO2 para obtener condiciones anaeróbicas. Para la primera
incubación, el fluido ruminal se obtuvo a partir de tres ovejas fistuladas de la raza
Texel [aprobado por la comisión ética del Instituto de Investigación Agrícola y
Pesquera (ILVO), Bélgica (EC 2014, 241)] alimentadas con heno ad libitum y con
acceso libre al agua potable.
El fluido ruminal obtenido se recogió en matraces aislados para el transporte y se
mezcló, homogenizó y filtró según lo planteado por Castro-Montoya et al. (2015), y
modificado para suministrar N extra (g/L de agua destilada: hidrolizado de caseína
ácida: 1.25; peptona: 1.25; Na2HPO4.12H2O: 2.685; KH2PO4: 1.1625; MgCl2.6H2O:
0.093; NaHCO3: 6.555; NH4HCO3: 0.75) y se incubaron a 39°C en una incubadora
con agitación intermitente (Edmund Bühler GmbH SM - 30 Control, Alemania),
empleándose tres frascos/tratamiento como réplicas estadísticas (Figura 1).
Después de 48 h, todos los frascos se retiraron de la incubadora y se transfirió 10
mL de cada uno con una jeringa estéril a otro nuevo con los mismos sustratos y
suplementos de levadura, y se les añadieron 40 mL del buffer mencionado
anteriormente en combinación con fluido ruminal clarificado de acuerdo con Kenters
et al. (2011) (3:1 v/v). Todos los frascos se incubaron de nuevo durante 48 h y se
realizaron transferencias consecutivas durante un período de 12 días.
II.4. Incubación ruminal in vitro (24 h) de tres leguminosas tropicales
Las incubaciones ruminales in vitro (24 h) se llevaron a cabo siguiendo el método
descrito por Vlaeminck et al. (2014), con inóculos derivados de la última
transferencia de las incubaciones consecutivas descritas anteriormente. Se
transfirieron 5 mL de cada inóculo a un nuevo frasco de 120 mL al cuál se le añadió
24 mL del mismo buffer descrito anteriormente mezclado con líquido ruminal
clarificado (3:1 v/v), y una de tres leguminosas (mezcla de granos y forraje de
CAPÍTULO II. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL
16
Mucuna pruriens o C. ensiformis [250 mg, 1:1 base seca], o 250 mg de forraje de
Leucaena leucocephala (Figura 1), y se incubaron durante 24 h a 39ºC en
incubadora con agitación intermitente (Edmund Bühler GmbH SM - 30 Control,
Alemania).
Leyenda: Color carmelita: sustrato (530 mg de celulosa, 470 mg de almidón, o 500 mg de mixto [1:1 celulosa y
almidón]) y suplementación con levadura (40 mg de levadura viva [AY], 40 mg de levadura inactivada [IY] [AY
autoclaveada a 121º C durante 20 min] o sin levadura [-Y]); Color azul: Buffer; Color dorado y : inóculo
frescamente obtenido a partir de ovejas fistuladas; Color naranja: Buffer + Fluido ruminal clarificado; Color
verde: Legumbres (250 mg): Canavalia ensiformis, Mucuna pruriens, o Leucaena leucocephala; Color rojo:
inóculo obtenido a partir de la incubación consecutiva.
Figura 1. Representación esquemática de la incubación consecutive durante 14 d, así como la
incubación ruminal in vitro (24 h) de las tres legumbres tropicales.
El control de los tratamientos se preparó con 6 mL de inóculo fresco obtenido de las
mismas ovejas, y 18 mL de tampón bicarbonato/fosfato. Se incubaron bajo las
mismas condiciones descritas anteriormente. Todos los frascos se retiraron de la
incubadora después de 24 h, deteniéndose la actividad fermentativa en un baño de
CAPÍTULO II. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL
17
hielo. Después de 5 minutos, se prepararon las muestras para el análisis de ácidos
grasos de cadena corta (AGCC), y bases púricas y pirimidínicas.
II.5. Análisis de los productos finales de la fermentación.
La producción total de AGCC, la proporción molar de cada AGCC y la
degradabilidad ruminal aparente de carbohidratos (ARDC) fueron empleados como
proxy de la capacidad fermentativa. El análisis de los AGCC fue realizada según lo
descrito por Castro-Montoya et al (2012).
ARDC fue calculado como sigue:
ARDC (g/100 g MS) = (acetato/2+propionato/2+butirato+caproato)*162
Donde 162 es asumido como peso molecular de 1 mol de carbohidratos
fermentables; acetato, propionato, butirato y caproato son expresados en mol/100 g
MS de sustrato añadido (Demeyer, 1991). Como se puede observar a la relación
estequiométrica descrita previamente por el autor mencionado, se le añadió el
caproato basado en los mismos principios estequiométricos de formación de AGCC
a partir de carbohidratos fermentables como lo subrayó Demeyer (1991).
II.6. Análisis de bases púricas y pirimidínicas.
La determinación de bases nitrogenadas (púricas y pirimidínicas) se realizó basado
en lo metodología propuesta por Makkar and Becker (1999) con algunas
adaptaciones, las cuales fueron descritas detalladamente por Vlaeminck et al.
(2005). El total de nucleobases (mg/mL) fue calculada como la suma de la cantidad
de purinas y pirimidinas.
II.7. Determinación de la actividad biológica de los taninos
La determinación de la actividad biológica de los taninos se realizó según lo
recomendado por Makkar et al. (1995) con algunas modificaciones.
La incubación ruminal in vitro (24 h), fue llevada a cabo siguiendo la metodología
descrita por Vlaeminck et al. (2014). El fluido ruminal fue obtenido de tres ovejas
fistuladas (aprobado por el comité de ética del Instituto de Investigación
Agropecuaria y Pesquera (ILVO), Bélgica (EC 2009, 114), las cuales fueron
alimentadas con heno ad libitum y libre acceso al agua.
Se emplearon frascos de 120 mL, cada uno recibió una de tres leguminosas (250
mg de harina mixta de granos y follaje de Canavalia ensiformis [50:50 en base seca],
CAPÍTULO II. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL
18
250 mg de harina mixta de granos y follaje de Mucuna pruriens [50:50 en base
seca], o 250 mg de harina de forraje of Leucaena leucocephala) en combinación con
la adición o no de 250 mg de polietilenglicol (PEG 6000).
El fluido ruminal obtenido fue colectado en frascos aislados para su mezclado y
transporte, fueron homogenizados y filtrados a través de una tamiz con poros de 1
mm bajo continuo enjuagado con CO2 y mantenidos luego en baño María a 39ºC
para ser usados como fuente de inóculo. El fluido ruminal colado y una mezcla
anaeróbica saturada con CO2 (lavado con CO2 durante 30 min) de buffer
carbonato/fosfato (conteniendo en g/L de agua destilada: Na2HPO4.12H2O: 3.58;
KH2PO4: 1.55; MgCl2.6H2O: 0.124; NaHCO3: 8.74; NH4HCO3: 1.0) fue añadida a
cada frasco de incubación.
Un mL de etano fue añadido como estándar interno y se incubaron durante 48 h
a39ºC en una incubadora con agitación intermitente (Edmund Bühler GmbH SM – 30
Control, Alemania). Fueron utilizados tres frascos por tratamiento como replicas
estadísticas.
Todos los frascos fueron extraídos de la incubadora luego de 24 h, y la actividad
fermentativa fue detenida en un baño con agua helada. Luego de 5 min se les midió
el contenido de gases por cromatografía gaseosa (GC) (3000 micro – GC, Agilent,
USA) y las muestras fueron preparadas para el análisis de ácidos grasos de cadena
corta (AGCC) por GC (Shimadzu 2010, Shimadzu Corporation‘s-Hertogenbosch,
The Netherlands).
II.8. Análisis estadístico
Todos los datos fueron analizados usando SPSS 21.0 (SPSS, 2012). Se usó un
modelo lineal general (GLM) para analizar la producción de AGCC, nucleobases y la
degradabilidad ruminal aparente de carbohidratos (ARDC) para cada una de las
leguminosas, de acuerdo con Y =μ+Ai=1-3+Bj=1-3+ ABij+ξ, con Ai=1-3 efecto del sustrato
(celulosa vs. almidón vs. mixto) utilizado en la incubación consecutiva, Bj = 1-3 el
efecto de la levadura (levadura activa vs. levadura inactiva vs. sin levadura) durante
la incubación consecutiva, ABij la interacción entre los factores indicados; y ξ el error
residual. Las diferencias se declararon significativas a P<0.05 mediante el
procedimiento de Tukey para comparaciones múltiples. Además, se completó una
prueba de Dunnett para evaluar si el ARDC con inóculo derivado de la incubación
consecutiva difería de aquellos con inóculo fresco.
CAPÍTULO II. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL
19
Los valores de los indicadores obtenidos en el análisis químico proximal se
analizaron usando el paquete estadístico SPSS 21.0 (SPSS software for Windows,
release 11.0; SPSS, 2012). El Modelo Lineal General fue empleado para analizar los
datos de acuerdo al modelo Yij=µ+Ai+ξij, siendo Yij la respuesta esperada; µ la
media total; Ai el efecto de la leguminosa (factor fijado), y ξij el error residual. Las
diferencias fueron declaradas significantes con P<0.05 y la comparación de las
proporciones fue hecha usando el procedimiento Tukey’s para múltiples
comparaciones.
La actividad biológica de los taninos y la fermentación ruminal in vitro de cada
leguminosa individualmente fueron analizados estadísticamente mediante un Modelo
Lineal General de acuerdo al modelo Yij=µ+Ai+ξij, siendo Yij la respuesta esperada;
µ la media total; Ai el efecto de la inclusión de PEG (factor fijado), y ξij el error
residual. Las diferencias fueron declaradas significantes con P < 0.05 y la
comparación de las proporciones fue hecha usando el procedimiento Tukey’s para
múltiples comparaciones.
CAPÍTULO III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
20
CAPÍTULO III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
III.1. Análisis químico proximal, fenoles y taninos totales, y taninos
condensados de las leguminosas estudiadas
Existe una amplia variación en cuanto a la composición bromatológica de las tres
leguminosas, siendo de especial atención los niveles de FDN y FAD (Tabla 1), así
como los valores de PB.
Tabla 1. Análisis químico proximal de Leucaena leucocephala, Mucuna pruriens y
Canavalia ensiformis (n = 3).
Legumbres MS Cenizas PB FDN FDA FT TT TC
Leucaena 916.5 61.3a 297.2 532.5a 318.7a 47.4a 47.3a 0.4
Canavalia 952.3 53.9b 237.0 284.0c 146.5b 7.0b 6.9b 0.1
Mucuna 954.7 62.8a 253.9 316.0b 181.6b 44.6a 44.6a 0.3
SEM 3.14 0.09 4.2 0.68 2.82 0.15 0.15 0.01
Leyenda: MS: materia seca (g/kg MF); PB: proteína bruta, FDN: fibra detergente neutra, FDA: fibra
detergente ácida (g/kg MS); FT: fenoles totales (eq-g ácido tánico/kg MS); TT: taninos totales (eq-g
ácido tánico/kg MS); TC: taninos condensados (eq-g leucocianidina/kg MS); SEM: Error estándar de
la media.
a, b, c media con diferentes superíndices en la misma columna denota diferencias significativas
(P<0.05) de acuerdo con la prueba de Tukey’s.
Las tres leguminosas contienen valores similares, que no difieren significativamente
(P>0.05), en cuanto a MS, PB y TC. L. leucocephala presenta mayor contenido de
PB y valores significativamente superiores en FDN y FDA (P<0.05), mientras que los
valores más significativos de MS son los obtenidos por las especies Canavalia
ensiformis y Mucuna pruriens aunque no difieren de Leucaena. Esta elevación de la
fibra en Leucaena se debe a que al ser una planta arbustiva, su crecimiento es más
prolongado, acumulando mayores niveles de lignina en sus tallos y hojas que en las
leguminosas rastreras.
Sallam et al (2010) exponen que L. leucocephala tiene altos valores de NDF, ADF y
compuestos fenólicos particularmente TC, indicando que este compuesto es un
factor limitante de la fermentación in vitro, lo que además es consistente con lo
planteado por Haque et al. (2008) que reportan una correlación negativa entre NDF
y ADF, y el rango y extensión de producción de gas (incluyendo la degradabilidad).
CAPÍTULO III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
21
Existen diferencias significativas en las cantidades de FT, TT entre Leucaena y
Mucuna con respecto a Canavalia, no siendo así con respecto a los TC. Podemos
observar que los valores más altos los posee también Leucaena mientras que
Canavalia presenta escasas cantidades de estos metabolitos secundarios. Los
valores de TC obtenidos en Leucaena coinciden con los resultados de Soltan et al.
(2013) en Egipto, y Galindo et al. (2009) en Cuba; este último autor plantea que los
TC de esta especie en Cuba oscilan entre 0.9 y 0.5 g/kg MS. En Mucuna los
resultados coinciden con los de Siddhuraju et al. (2000), y en Canavalia son más
altos que los encontrados por Betancur-Ancon et al. (2004) y Sridhar y Seena (2006)
que solo contabilizaron trazas de taninos condensados en esta especie.
III.2. Cultivo consecutivo por lotes
La incubación consecutiva durante dos semanas usando diferentes fuentes de
carbohidratos, afectó la producción total de AGCC (P <0,05) (Tabla 2), la cual fue
1,6 veces mayor cuando se usó almidón como sustrato en comparación con la
celulosa.
Tabla 2. Efecto del tipo de sustrato (celulosa, almidón o mezcla) sobre la producción
total de AGCC (μmol / mL) y nucleobases (mg / mL) después de 14 días de
incubación discontinua consecutiva (n = 9).
Parámetros Cellulose Starch Mixture SEM p-value
Producción total de
AGCC 1920b 3128a 2246b 124.8 <0.001
Nucleobases 8c 22a 16b 1.2 <0.001
Los valores con diferentes superíndices (a, b, c) difieren significativamente (P <0,05) de acuerdo con la prueba
de Tukey’s .
Además, la incubación con almidón como fuente de carbohidrato dio como resultado
un aumento de aproximadamente tres veces en la cantidad nucleobases en
comparación con la incubación con celulosa. Lo anterior expuesto sugiere que el
inóculo derivado de las incubaciones consecutivas con almidón, potencialmente
contenía tres veces más bacterias (Tabla 2).
La suplementación con levadura no cambió (P> 0,05) la producción total de AGCC ni
la cantidad de nucleobases (datos no mostrados).
CAPÍTULO III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
22
III.3. Incubaciones de rumen in vitro (24 h) de leguminosas
Aunque los inóculos derivados de la incubación con almidón contenían más
nucleobases, la producción neta de nucleobases durante las 24 h de incubación con
las leguminosas generalmente generó menos nucleobases en la incubación con
almidón - inóculo (Tabla 3), mientras que la cantidad producida no fue afectada por
la exposición del inóculo a la levadura.
Tabla 3. Cuantificación de la producción neta de nucleobases (mg / mL) durante 24
h de incubación in vitro con diferentes leguminosas utilizando inóculo de cultivo
consecutivo que había sido expuesto a almidón, celulosa o su mezcla en presencia
(Ay e IY) o ausencia (- Y) de levadura (n = 3).
Adaptación del inóculo a C. ensiformis M. pruriens L. leucocephala
Substrato Suplementos A
Celulosa
AY 10.7cd 12.8 10.4
IY 12.0bcd 13.1 11.1
-Y 10.5d 13.0 9.9
Almidón
AY 7.3e 11.6 10.5
IY 7.2e 10.6 9.1
-Y 6.4e 9.6 9.5
Mixto
AY 14.7a 14.9 9.9
IY 12.8abc 13.5 9.9
-Y 13.1ab 15.0 13.3
SEM 0.56 0.40 0.33
P – value B
S <0.001 <0.001 0.204
YS 0.051 0.507 0.451
S x YS 0.032 0.385 0.068
Los valores con diferentes superíndices (a,b,c,d) en una misma columna difieren significativamente (P<0.05) según
la prueba de Tukey’s .
A Suplementos: AY = levadura activa; IY = levadura inactivada; - Y = sin levadura.
B S = sustrato, YS = suplemento de levadura; S x YS = interacción sustrato x suplemento de levadura.
Las cantidades más bajas de nucleobases generalmente estaban de acuerdo con
una menor producción neta de AGCC en incubación con almidón - inóculo, como se
observó para las tres leguminosas (Tabla 4). Independientemente de la
suplementación de levadura, los inóculos obtenidos después de 14 días de
CAPÍTULO III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
23
exposición a almidón como fuente de carbohidratos degradaron menos las tres
leguminosas tropicales en comparación con la celulosa y el inóculo expuesto a la
mezcla.
Tabla 4. Degradación ruminal aparente de carbohidratos (g / g de MS) de tres
leguminosas tropicales durante 24 h de incubación in vitro utilizando inóculo de
cultivo consecutivo que había sido expuesto a almidón, celulosa o su mezcla en
presencia (AY y IY) o ausencia (-Y) de levadura (n = 3).
Adaptación del inóculo a C. ensiformis M. pruriens L. leucocephala
Substrate Supplements A
Celulosa
AY 0.47a 0.36 0.28ab
IY 0.38c 0.36 0.35a
-Y 0.41abc 0.38 0.24ab
Almidón
AY 0.35c* 0.40 0.20b
IY 0.39bc 0.36 0.23b
-Y 0.40bc 0.32* 0.23b
Mixto
AY 0.45ab 0.38 0.24ab
IY 0.45ab 0.37 0.22b
-Y 0.40bc 0.39 0.31ab
SEM 0.008 0.006 0.011
Control 0.44 0.40 0.28
P – value B
S 0.004 0.371 0.004
YS 0.417 0.469 0.417
S x YS 0.006 0.105 0.006
Los valores con diferentes superíndices en la misma columna (a, b, c, d, e, f) difieren significativamente (P<0,05)
según la prueba de Tukey’s.
Los valores con * difieren significativamente (P <0,05) de acuerdo con la prueba de Dunnett.
A Suplementos: AY = levadura activa; IY = levadura inactivada; - Y = sin levadura.
B S = sustrato, YS = suplemento de levadura; S x YS = interacción sustrato x suplemento de levadura.
La suplementación de levadura al cultivo consecutivo no indujo un cambio
consistente en el inóculo con respecto a su capacidad para degradar las tres
leguminosas tropicales. De hecho, para todas las leguminosas el efecto de la
levadura dependía de la fuente de hidratos de carbono (PS x YS <0,05).
El inóculo de celulosa al que se había suplementado la levadura activa dio como
resultado una degradación más amplia de C. ensiformis (Tabla 4), aunque esto no
CAPÍTULO III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
24
difirió del inóculo fresco o del inóculo de celulosa sin levadura. Por otra parte, la
ausencia de levadura durante 14 días de incubación consecutiva con almidón, dio
como resultado un inóculo que mostró una capacidad considerablemente inferior
para degradar M. pruriens (Tabla 4).
La suplementación de levadura inactivada a cultivos consecutivos con celulosa dio
como resultado un inóculo que degradaba más ampliamente L. leucocephala. No
obstante, ARDC cuando se empleó el inóculo procedente de la incubación
consecutiva no superó la degradación con inóculo de fluido ruminal fresco (Tabla 4).
Se ha informado que la levadura estimula el crecimiento de microorganismos
beneficiosos en el rumen (Denev et al., 2007) y aumenta el número microbiano
(Kholif et al., 2016), específicamente anaerobios ruminales totales, bacterias
celulolíticas (Castillo-González et al. , 2014), hongos (Chaucheyras et al., 1995, Mao
et al., 2013) y bacterias acetogénicas que convierten el hidrógeno molecular en
acetato (Chaucheyras et al., 1995).
Otros estudios sugirieron que los cultivos de levadura potencian el crecimiento de
las bacterias que utilizan ácido láctico (Jouany, 2001), mientras que la población de
protozoos en general no es estimulada por la levadura (Doreau y Jouany, 1998, Mao
et al, 2013). Sin embargo, en el presente estudio, la suplementación con levadura no
cambió el número de nucleobases al final de los 14 d de cultivo consecutivo, ni
resultó en inoculaciones que aumentaran la producción de biomasa microbiana
durante la degradación de las tres leguminosas tropicales.
Después de 14 d de cultivo consecutivo se crearon diferentes poblaciones
microbianas que mostraron diferencias en los parámetros de fermentación después
de 24 h de fermentación in vitro de las tres leguminosas. Los inóculos obtenidos
después de la exposición al almidón como fuente de hidratos de carbono - bajo
condiciones extremas de estrés de nutrimentos - aumentaron la cantidad de
caproato producido en detrimento de la cantidad de propionato producido. Sin
embargo, la capacidad de degradación ruminal aparente de carbohidratos de los
diferentes inóculos obtenidos después del cultivo consecutivo tuvo un
comportamiento similar al obtenido con inóculo fresco.
De hecho, los inóculos de ovejas adultas no adaptadas cambiaron después de 14 d
de incubación consecutiva en condiciones extremas de nutrimentos, pero no
mostraron diferencias en su capacidad para degradar las leguminosas,
CAPÍTULO III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
25
especialmente L. leucocephala, que fue significativamente inferior a las otras
leguminosas.
III.4. Actividad biológica de los taninos
Luego de 24 h de incubación in vitro con y sin PEG de las tres leguminosas en
estudio (Tabla 5) se pudo apreciar que no existieron diferencias significativas entre
los valores obtenidos para los patrones de fermentación y la digestibilidad aparente
de los carbohidratos (P>0.05), excepto para la proporción molar de butírico, el cual
fue significativamente superior (P<0.05) cuando fue empleado el PEG en la
incubación de Canavalia y Leucaena, no así en el caso de Mucuna.
Tabla 5. Efecto del PEG sobre los productos finales de la fermentación de cada
leguminosa [metano (mL/g OM), AGCC totales (µmol/g OM), proporción molar de
los AGCC (mmol/mol AGCC), (ARDC g/100g MS)] (n=6).
Parámetros Canavalia
SEM Mucuna
SEM Leucaena
SEM - PEG + PEG - PEG + PEG - PEG + PEG
CH4 44,8 45,8 1,20 52,0 49,2 0,87 29,0 28,4 1,30
AGCC Totales 5966,0 5796,2 103,0
0 5679,2 5712,8 76,9
4 3745,2 3737,7 29,7
4
acético 610,2 601,8 3,40 591,4 600,4 4,70 660,3 650,4 3,31
propiónico 263,4 263,5 1,90 252,5 240,6 3,67 233,2 234,5 1,84
butírico 82,6b 90,9a 3,74 95,2 98,9 1,48 68,9b 74,4a 1,32
ARDC 47,5 46,5 0,81 45,0 45,5 0,61 29,57 29,58 0,23
PEG: Polietilenglicol, CH4: metano, AGCC: Ácidos Grasos de Cadena Corta, ARDC: Degradabilidad
Ruminal Aparente de los Carbohidratos, SEM: Error estándar de la media.
a, b, c media con diferentes superíndices en la misma fila dentro del efecto principal denota diferencias
significativas (P<0.05) de acuerdo con la prueba de Tukey’s.
La inclusión de PEG en legumbres tropicales resulta en un incremento de
producción de gas, particularmente en plantas ricas en taninos condensados (Sallam
et al., 2010). No se encontraron diferencias significativas en la producción de
metano en ninguna de las especies estudiadas con PEG y sin este compuesto, lo
que sugiere que la producción in vitro de metano en estos forrajes no fue afectada
por la presencia de taninos, lo que difiere con los resultados de Sallam et al. (2010)
que encontró una reducción de metano del 88 % en el fluido ruminal con inclusión de
PEG en L. leucocephala. Sin embargo, otra investigación realizada por el propio
autor en el 2013 plantea que en el experimento in vivo usando PEG los taninos
CAPÍTULO III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
26
presentes en esta leguminosa no afectaron la digestibilidad de la MS ni de los
nutrientes.
Consecuentemente, es improbable que la baja degradabilidad ruminal in vitro de L.
leucocephala sea causada por la concentración de taninos presentes en ella,
pudiendo deberse a los bajos tenores de TC contenidos en las tres leguminosas
estudiadas. En efecto, existen otros compuestos fenólicos que son más fácilmente
degradados por los microrganismos ruminales (Bhat et al., 1998; Patra and Saxena,
2011).
CONCLUSIONES
27
CONCLUSIONES:
1- Las leguminosas en estudio presentan valores similares de MS y PB,
presentando L leucocephala las mayores concentraciones de cenizas, FDN y
FDA.
2- Leucaena y Mucuna presentan mayores concentraciones de fenoles y taninos
totales, siendo bajas las concentraciones de taninos condensados para las
tres leguminosas en estudio.
3- Las comunidades microbianas cultivadas in vitro durante 14 d con diferentes
fuentes de carbohidratos en presencia de suplementos de levadura estimulan
la fermentación ruminal de Leucaena leucocephala, Mucuna pruriens y
Canavalia ensiformis, la cual depende de las fuentes de carbohidratos
empleadas en la misma.
4- Los taninos totales y condensados no influyeron en la degradabilidad
aparente de los carbohidratos ni en los patrones de fermentación de las tres
leguminosas en estudio.
RECOMENDACIONES
28
RECOMENDACIONES:
1- Realizar análisis de digestibilidad in vitro con líquido ruminal de ovejas
tropicales adaptadas al consumo de estos alimentos para comparar con los
realizados en ambos experimentos.
2- Determinar la presencia de otros factores antinutricionales (factor inhibidor de
tripsina y quimiotripsina, mimosina e intermediarios, canavanina, y Con A) y
su influencia en la digestibilidad de estas leguminosas.
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OPINIÓN DEL TUTOR
41
OPINIÓN DEL TUTOR.
La tesis de maestría presentada por la aspirante Dr. MVZ. Beydis Reguera Barreto,
titulada “Digestibilidad in vitro de tres leguminosas tropicales: efecto del inóculo
microbiano y la adición de levadura”, se enmarca en la línea científica del Grupo de
Producción Animal adscrito al Centro de Investigaciones Agropecuarias de la
Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad Central “Marta Abreu” de Las
Vilas.
La tesis posee actualidad dada la importancia de la producción local de alimentos
capaces de reducir importaciones y con ellos costos productivos en los sistemas de
crianza ganadera, así como, del incremento en la degradabilidad y asimilación de
estos alimentos especies. El presente trabajo es novedoso ya que evalúa el efecto
de la modificación microbiana ruminal ante situaciones de estrés alimentario
suplementado o no con levadura, sobre la degradabilidad de tres leguminosas
tropicales poco empleadas en la alimentación del ganado lechero y de carne. La
investigación demuestra que la degradabilidad de estas leguminosas y el empleo de
levadura dependen del sustrato empleado como fuente de carbono en la adaptación
de la flora microbiana, y que las concentraciones de taninos no influyeron en la
degradabilidad de las plantas, especialmente de L. leucocephala.
La tesis cumple con la estructura metodológica reglamentada para la confección de
la misma, durante el desarrollo del trabajo el aspirante alcanzó un satisfactorio grado
de cumplimiento de los objetivos propuestos, mostrando un elevado nivel de
independencia y dedicación; resolviendo satisfactoriamente los problemas prácticos
y científico-técnicos que se le presentaron durante el desarrollo de la misma, lo que
demuestra la experiencia y preparación del aspirante que lo hacen merecedor del
grado científico al que aspira.
_________________________
Dr. MVZ. Beydis Reguera Barreto
Aspirante
_________________________
MSc. Einar Artiles Ortega
Tutor
Santa Clara, Septiembre 12, 2018