Tesis Doctoral Sobre Virus

5/14/2018 Tesis Doctoral Sobre Virus - slidepdf.com

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Dinamica evolutiva de virus RNA

Samuel Ojosnegros Martos

14 de Noviembre, 2008

TESIS DOCTORAL

Universidad Autonoma de MadridFacultad de Ciencias

Departamento de Biologıa Molecular

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Memoria presentada por el licenciado en biologıa Samuel Ojosnegros Martos para optar al gradode Doctor por la Universidad Autonoma de Madrid. Madrid, Noviembre, 2008.

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El trabajo presentado en esta Tesis Doctoral ha sido realizado en el Centro de Biologıa Molecular”Severo Ochoa”, bajo la direccion del Dr. Esteban Domingo Solans y financiado por una becapredoctoral de Formacion de Personal Universitario (FPU) del Ministerio de Educacion y Ciencia.

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A SergioA mis padres

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Agradecimientos

Quiero agradecer al Dr. Esteban Domingo que me aceptara en su laboratorio, desde la visita que realice en2002. Gracias por concederme tu tiempo y tus conesjos en tantos y tantos problemas que han ido surgiendo.Seguiremos defendiendo las cuasiespecies!

Gracias a la Dra. Crsitina Escarmıs por por estar dispuesta a ayudarme en cualquier momento, gracias

por entenderlo todo y por las infinitas lecciones de biologıa molecular. La mitad de esta tesis es tuya.Susanna Manrubia me ha transmitido su vision teorica de los procesos biologicos. Gracias por ese re-

galo y por todo el tiempo que pacientemente me has dedicado. Tambien tengo que agradecerle la estrechacolaboracion y diseno de experimentos en el proyecto con los virus defectivos.

El estudio de la poblacion del virus de la fiebre aftosa C-S8cp260 supone la continaci on del trabajorealizado por el Dr. Juan F. Garcıa-Arriaza, quien me enseno las peculiaridades de esta poblacion viral, ylas tecnicas basicas de la virologıa y la biologıa molecular.

La realizaciom de esta tesis doctoral no hubiera sido posible sin la colaboraci on cinetıfica de una seriede personas que han accedido a implicarse en los proyectos en los que he trabajado:

El Dr. Carlos Briones del Centro de Astrobiologıa (Madrid) ha presatdo sus conocimientos y consejospara la realizacion de toda la filogenia presente en esta Tesis doctoral.

El Dr. Juan Cristina del Centro de Investigaciones Nucleares (Montevideo, Uruguay), estandarizo lamanera de utilizar el software PAQ y me enseno una larga serie de software bioinformatico para elanalisis de secuencias de acidos nucleicos. El Dr. Cristina ha colaborado en la relizacion de la filogeniadel capıtulo 5.4 de esta Tesis doctoral.

El Dr. Martin Nowak de la Universidad de Harvard (Cambridge, USA), amablemente me acogio en elinsituto que dirige, el Program for Evolutionary Dynamics (PED), se ofrecio a sufragar parte de losgastos de mi estancia y superviso el modelo matematico que desarrolle en el PED (encontarndo algunfallo).

El Dr. Niko Beerenwinkel, del PED, en la Universidad de Harvard (Cambridge, USA) y ETH-Basel,colaboro en el desarrollo de un modelo matematico que describe la replicacion de virus en cultivoscelulares.

El Dr. Tibor Antal, del PED, en la Universidad de Harvard (Cambridge, USA) reliz o el estudio analıticodel modelo matematico anteriormente citado.

El estudio de la poblacion C-S8p260 del virus de la fiebre aftosa, como candidato a vacuna inactivada,no hubiera sido posible sin la colaboracion de la Dra. Noemı Sevilla en el Centro de Investigacion enSanidad Animal y el modelo animal de los ratones C57/BL6, establecido por ella.

El Dr. Albert Cardona, en UCLA (University of California Los Angeles) y en el Institut of Neuro-informatics of ETH (INI), Zurich, generosa y pacientemente ha resuleto todas mis dudas sobre pro-gramacion. El codigo fuente del Apendice informatico se redacto en colaboracion con el Dr. Cardona,durante una visita al INI.

Los analisis electroforeticos de expresion de proteınas virales se han realizado en colaboracion con laDra. Celia Perales, companera de laboratorio.

Durante estos anos he compartido trabajo y buenos ratos con multitud de companeros en Madrid. Atodos ellos les doy las gracias por hacer inolvidable el tiempo que ha durado esta Tesis doctoral. A miscompaneros del labo: Arman, sin ti la vida en el labo serıa mas aburrida, p ero vivirıamos mas tranquilos ;).A Ruben le debo en esta tesis el haber aprendido a clonar, y una larga serie de cosas igualmente absurdas (ej.AT-AT=AT-ST). Mercedes y Ana, necesitarıa una tesis entera para agradecer la ayuda que constantementeme habeis prestado a lo largo de estos cinco anos, gracias!! Celia, pin! pin!, que ya he acabado! Vaya gelacosnos hemos currado! Maca, gracias por ser tan maja, desde el principio. En fin, gracias a todos los companeroscon los que hemos compartido tantas horas y habeis soportado mis seminarios: Vero, Marta, Hector, WalterDino, Teresa, Moni, Claudia, Ana Grande, y claro, ¡¡¡Juanillo!!! el encumbrao. Gracias a Hector Tejero porensenarme los secretos de los modelos SIR aplicados a la virologıa. No puedo olvidarme a la gente del labode Luis Menendez (inclusive), Tanix, y Monik-K, gracias por divertirme tanto, todo lo que se me ocurre



decirte no se puede poner en una tesis (es un cumplido). Glori y Carola, gracias por amenizar los ultimosanos de la Tesis. La gente de cultivos, Pepa, Ma Angeles y al mejor de todo el centro, Alfonso. Mada y Charosiempre han estado dispuestas a echarme una mano. El departamento de inform atica ha sufrido duramentemis continuos ataques, gracias a Diego y a Santi (al autor de los ratones dibujados en esta Tesis).

En el CISA recibı la ayuda de muchısima gente que no puedo enumerar aquı, especialmente de Horacioen inumerables ocasiones (te debo tantas!!!), gracias tambien al Dr. Javier Salguero y a Miguel Angel, y

como no, gracias Ester por la ayuda y la compania en el CISA y ahora en el CBM.Gracias a toda la gente del laboratorio de Juan Ortın y de Amelia Nieto (inclusives), el Dr. Thomas Lutz

me salvo la Tesis y la vida con sus conocimientos de LATEX. Emilıaco! p edazo de bloques que nos hacemos!No me puedo olvidar de Estela y Alex, mis neoyorkinos favoritos y de Garaigorta, chicos, lo peor de estetrabajo es que nos centrifuga a todos a miles de km.

Quiero agradecer a todos los colegas de Girona y Barcelona que han estudiado conmigo (o no) y hancomprendido y apoyado este proyecto personal. Pau, gracias por ensenarme a dar siempre el maximo de unomismo. JR, Toni, Nestor, Javi y Marcos: acabe tios! Gracias a la ayuda de la Dra. Pilar Perez. Oscar, graciaspor tu ayuda con la estadıstica, por cierto, segun Lorenz: x = σ (y − x) ; y = rx − y − xz; z = xy − bz,es decir, el caos es un tipo de orden. No me puedo olvidar de mi nueva familia y nuestros viajes!. Luisillo,doctorazo, cuando me muera, en herencia te dejare el Samguayoflife (ahora lo necesito). Jordi, mi oraculocientıfico, todo lo que sabes del RNA y las real-time te lo he ensenado yo (por eso no te salen), en fin, gracias

por todo tıo.Nada de lo que hago serıa posible, o serıa mas difıcil, sin la ayuda de mis hermanos y especialmente de

mis padres, que creen en mi y me apoyan siempre, haga lo que haga. Sois geniales, todos!

Nuria, hemos cerrado una etapa juntos, ¡¡¡a por otra!!!

Gracias a todos.Las RNAasas no existen, ciencia total!!! ciencia total!!!

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Abreviaturas

ACM: Anticuerpo monoclonalAZC: 5-Azacitidina (AZC)BHK-21: Celulas de rinon de hamster (Baby

Hamster Kidney )cDNA: DNA copiad: Distancia mediaDEAE: Dietil aminoetiloDf: Degrees of freedom , grados de libertadDIs: Partıculas defectivas interferentesDMEM: Medio mınimo de Eagle modificadopor DulbeccoDNA: Acido desoxirribonucleicodNTP: 2´-desoxinucleosido-5´-trifosfatoe.c.p.: Efecto citopatico

EDTA: Etilen diamino tetracetatoFA: Fiebre aftosaFU: 5-FluorouraciloG: GuanidinioH: Heparinah.p.e.: Horas post-electroporacionIRES: Sitio interno de entrada de ribosomas(Internal Ribosome Entry Site)Kb, Pb: Kilobases, pares de basesLCMV: Virus de la coriomeningitis linfocitariadel raton

M: MolarMDI: Multiplicidad de infeccionMP: Maxima parsimoniaMV: Maxima verosimilitudNJ:neighbor-joining

nt: NucleotidoPAQ: Partition Analysis of Quasispecies

PBS: Solucion salina tamponada con fosfatoPCR: Reaccion en cadena de la polimerasaPFUs: Unidades formadoras de placaPoliA: Poliadenilato

PoliC: PoliribocitidilatoPV: PoliovirusR: RibavirinaRNA: Acido ribonucleicoRpRd: RNA polimerasa RNA dependienteRT: RetrotranscriptasaRT-PCR: Reaccion de transcripcion inversaseguida de amplificacion por reaccion en cadenade la polimerasaSARS: Sındrome respiratorio severo agudo

SBF: Suero Bovino FetalSDD: Seleccion dependiente de densidadSPC: Suero policlonalSIDA: Sındrome de inmunodeficiencia adquiridaST: Genoma estandar

5’ UTR y 3’ UTR: Regiones no traducidas delos extremos 5´ y 3´, respectivamenteVFA: Virus de la fiebre aftosaVHC: Virus de la hepatitis CVIH-1: Virus de la inmunodeficiencia humanatipo 1VSV: Virus de la estomatitis vesicular∆: Delecion

Codigo de aminoacidos

A (Ala) Alanina I (Ile) IsoleucinaR (Arg) Arginina C (Cys) CisteınaK (Lys) Lisina S (Ser) SerinaD (Asp) Aspartico L (Leu) LeucinaT (Thr) Treonina E (Glu) GlutamicoM (Met) Metionina V (Val)ValinaF (Phe) Fenilalanina N (Asn) AsparaginaW (Trp) Triptofano G (Gly) GlicinaP (Pro) Prolina Y (Tyr) TirosinaH (His) Histidina Q (Gln) Glutamina

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Indice

1. Summary (resumen en ingles) 14

2. Introduccion 15

2.1. Variabilidad genetica de virus RNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 152.1.1. Bases moleculares de la variabilidad genetica de virus RNA. . . . . . . . . . . 152.1.2. Frecuencias de mutacion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 152.1.3. Recombinacion y reordenamientos genicos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 172.1.4. Estructura poblacional - Cuasiespecies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 172.1.5. La importancia del espectro de mutantes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 182.1.6. Filogenia como herramienta para el estudio de la estructura de cuasiespecies. 19

2.2. Eficacia biologica de un virus: fitness . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 192.2.1. Procesos de variacion de la eficacia biologica . . . . . . . . . . . . . . . . . . 212.2.2. Fitness en detalle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 222.2.3. Evolucion de estrategias de fitness virales: seleccion dependiente de densidad 23

2.3. Mutagenesis letal como estrategia antiviral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 242.3.1. Evidencias experimentales de extincion de VFA mediante mutagenesis letal . 25

2.4. El virus de la fiebre aftosa (VFA) como modelo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 252.4.1. La fiebre aftosa (FA) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 252.4.2. Organizacion genomica y proteınas codificadas por el virus de la fiebre aftosa 262.4.3. Estructura de la partıcula de VFA y entrada en la celula . . . . . . . . . . . . 282.4.4. Traduccion del genoma viral y procesamiento proteolıtico de la poliproteına

viral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 282.4.5. Replicacion del genoma de VFA y de otros picornavirus . . . . . . . . . . . . 30

2.5. Vacunacion frente a la fiebre aftosa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 302.5.1. Vacunas inactivadas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

2.5.2. Vacunas basadas en peptidos o proteınas expresadas por vectores . . . . . . . 302.5.3. Vacunas vivas atenuadas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31

2.6. Partıculas defectivas interferentes (DIs) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 312.6.1. Generacion de las partıculas DIs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 312.6.2. Tipos de partıculas DIs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 322.6.3. Presencia de partıculas DIs en los diferentes sistemas virales . . . . . . . . . . 332.6.4. Caracterısticas biologicas de las partıculas DIs . . . . . . . . . . . . . . . . . 332.6.5. Deleciones internas en VFA. Implicacion en la evolucion de la segmentacion

viral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 342.6.6. Origen de la segmentacion viral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

3. Objetivos 39

4. Materiales y Metodos 404.1. Cultivo de celulas eucarioticas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 404.2. Variantes del VFA empleadas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 404.3. Infecciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

4.3.1. Infecciones en medio lıquido de monocapas celulares . . . . . . . . . . . . . . 414.3.2. Plaqueo de virus en medio de agar semisolido en celulas BHK-21 . . . . . . . 424.3.3. Correccion del tıtulo en los plaqueos de las poblaciones de defectivos que

infectan por complementacion de dos tipos de partıculas . . . . . . . . . . . . 42

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4.3.4. Pases placa a placa de clones del VFA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 434.3.5. Ensayo de centros infecciosos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43

4.4. Curvas de crecimiento viral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 434.5. Cuantificacion de celulas BHK-21 y analisis de viabilidad . . . . . . . . . . . . . . . 434.6. Ensayo de virulencia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44

4.7. Ensayo de virulencia-interferencia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 444.8. Purificacion de virus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 444.9. Anticuerpos monoclonales y policlonales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 444.10. Tecnicas utilizadas en experimentos con ratones C57BL/6 . . . . . . . . . . . . . . . 45

4.10.1. Infecciones in vivo con ratones C57BL/6 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 454.10.2. Sangrado de animales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 454.10.3. Extraccion de suero . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 454.10.4. Ensayos de seroneutralizacion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 454.10.5. Ensayo de ELISA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45

4.11. Extraccion de RNA vırico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 464.11.1. Extraccion de RNA vırico extracelular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46

4.11.2. Extraccion de RNA vırico intracelular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 464.12. Obtencion de cDNA y amplificacion por RT-PCR del RNA viral . . . . . . . . . . . 464.13. Purificacion de fragmentos de PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 494.14. Cuantificacion de RNA vırico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 494.15. Diseno de iniciadores para la amplificacion especıfica de mutantes virales . . . . . . . 504.16. Cineticas de produccion de RNA vırico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 514.17. Experimentos de competicion y determinacion de la eficacia biologica relativa o fitness 514.18. Tratamiento con RNAasa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 514.19. Clona je Molecular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52

4.19.1. Clonaje molecular de la region no estructural del VFA pase 260 . . . . . . . . 524.19.2. Construccion de plasmidos con la delecion ∆417 desplazada 3 nucleotidos

hacia el 5’ o 3’ del RNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 524.19.3. Construccion de un plasmido con la delecion ∆417 en el contexto de C-S8c1 . 524.19.4. Transcripcion de plasmidos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54

4.20. Analisis de la replicacion en celulas BHK-21 de RNAs transcritos in vivo . . . . . . . 544.20.1. Electroporacion de celulas BHK-21 con RNAs transcritos del virus de cDNA

del genoma del virus de la fiebre aftosa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 544.20.2. Marcajes metabolicos y obtencion de extractos celulares . . . . . . . . . . . . 564.20.3. Analisis de proteınas en gel de poliacrilamida y fluorografıa . . . . . . . . . . 564.20.4. Inmunodeteccion de proteınas mediante Western-blot . . . . . . . . . . . . . 56

4.21. Secuenciacion de DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 574.22. Disoluciones y tampones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57

4.23. Metodos filogeneticos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 574.23.1. Alineamiento y edicion de secuencias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 574.23.2. Analisis filogenetico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58

4.24. Caracterizacion de los espectros de mutantes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 584.25. Metodos Numericos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 594.26. Programacion con C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59

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5. Resultados 605.1. Evolucion del clon VFA C-S8c1 hacia la segmentacion viral . . . . . . . . . . . . . . 60

5.1.1. Descripcion de una poblacion muy heterogenea de genomas defectivos: evi-dencia de un estado de inestabilidad evolutiva . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60

5.1.2. Secuencia nucleotıdica en torno a los sitios delecionados: evidencia de recom-

binacion promiscua . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 605.1.3. Estabilidad de la delecion ∆417 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 655.1.4. La capacidad replicativa de los ∆RNA es dependiente del contexto de secuencia 69

5.2. Estudio de la ventaja selectiva de los virus defectivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . 715.2.1. Determinacion de la eficacia biologica de C-S8p260 y C-S8p260p3d . . . . . . 715.2.2. Cineticas de replicacion del RNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 735.2.3. Cinetica de expresion de proteınas virales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 755.2.4. Determinacion de la infectividad especıfica y su relacion con fitness . . . . . . 765.2.5. Analisis de la estabilidad de los virus C-S8p260 y C-S8p260p3d . . . . . . . . 80

5.3. Vacunacion de ratones C57BL/6 con virus defectivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . 825.3.1. Proteccion por la vacunacion con C-S8p260 y C-S8p260p3d . . . . . . . . . . 84

5.3.2. La vacunacion con virus defectivos confiere proteccion esteril . . . . . . . . . 855.3.3. Capacidad inmunogena de la vacunacion con C-S8p260 . . . . . . . . . . . . 855.3.4. Los ratones vacunados con C-S8p260 generan anticuerpos neutralizantes . . . 85

5.4. Topologıa de poblaciones virales sometidas a mutagenesis . . . . . . . . . . . . . . . 885.4.1. Evaluacion filogenetica de la diversificacion genetica inducida por la mu-

tagenesis en las poblaciones de VFA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 885.4.2. Partition analysis of quasispecies (PAQ) aplicado al analisis clonal de pobla-

ciones de VFA mutagenizadas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 945.4.3. Analisis mutacional y tasas de fijacion de nucleotidos . . . . . . . . . . . . . . 965.4.4. Evidencia de seleccion purificadora durante la mutagenesis incrementada . . . 975.4.5. Extincion viral sin un exceso aparente de mutaciones . . . . . . . . . . . . . 99

5.5. Diversificacion de un clon de VFA en dos poblaciones con diferentes estrategias evo-lutivas: colonizadores y competidores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1015.5.1. Deteccion de clones recombinantes en la poblacion C-S8p200 . . . . . . . . . 1025.5.2. Origen de la subpoblacio n M A R L S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 25.5.3. Las poblaciones tipo-MARLS estan suprimidas por la cuasiespecie . . . . . . 1045.5.4. Seleccion dependiente de densidad en las poblaciones tipo-MARLS y tipo-p2001065.5.5. Las poblaciones tipo-MARLS son mas virulentas que las poblaciones tipo-p2001065.5.6. Posible compromiso entre la produccion de progenie y la virulencia . . . . . . 1065.5.7. Las poblaciones tipo-p200 interfieren con las poblaciones tipo-MARLS, mo-

dula ndo la virulencia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 95.5.8. Modelo matematico de replicacion y competicion de virus en celulas en cultivo109

6. Discusion 1126.1. Origen y evolucion de la segmentacion genomica: el VFA como modelo . . . . . . . . 112

6.1.1. Descripcion de una cuasiespecie de virus defectivos en el transcurso de laevolucion hacia un virus segmentado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112

6.1.2. Recombinacion exuberante . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1126.1.3. El modelo de la delecion maestra . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1136.1.4. Analisis de la estabilidad de la delecion ∆417 . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1136.1.5. Importancia del contexto de secuencia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114

6.2. Ventaja selectiva del sistema segmentado de VFA C-S8p260 . . . . . . . . . . . . . . 114

12



6.2.1. La presencia de deleciones es un determinante de fitness. . . . . . . . . . . . . 1146.2.2. Las tasas de replicacion del RNA y de expresion de proteınas son constantes

en el virus ST y en el defectivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1156.2.3. El virus segmentado posee mayor infectividad especıfica que el virus ST. . . . 1156.2.4. El virus defectivo es mas estable que el virus ST . . . . . . . . . . . . . . . . 116

6.2.5. Origen polifiletico de la segmentacion viral: conclusiones a partir de la evo-lucion de las DIs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116

6.3. Desarrollo de una vacuna atenuada basada en la poblacion C-S8p260 . . . . . . . . . 1176.3.1. La vacunacion con la poblacion viral C-S8p260 proporciona una proteccion

esteril al desafıo de ratones C57BL/6 con el clon de VFA C-S8c1 . . . . . . . 1176.3.2. La vacunacion con la poblacion viral C-S8p260 proporciona niveles altos de

anticuerpos neutralizantes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1186.4. El estudio de la topologıa filogenetica y de particion de cuasiespecies revelan los

patrones evolutivos de poblaciones virales sometidas a mutagenesis incrementada . . 1186.4.1. Analisis PAQ y filogenetico revelan cambios drasticos y rapidos en la estruc-

tura poblacional . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119

6.4.2. Las poblaciones mutagenizadas estan sometidas a seleccion purificadora . . . 1206.5. Estrategias de fitness virales: la hipotesis de los dos nichos ecologicos . . . . . . . . . 121

6.5.1. Colonizadores y competidores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1216.5.2. Diversificacion genetica con un origen clonal comun . . . . . . . . . . . . . . 1216.5.3. Seleccion dependiente de densidad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1226.5.4. Evolucio n de la virulencia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 3

7. Conclusiones 125

8. Apendice filogenetico 126

9. Apendice matematico: modelo basico de dinamica viral en cultivos celulares 1289.1. Competicion de dos virus en cultivos celulares . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1299.2. Dinamica in silico frente dinamica in vitro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 129

9.2.1. Condiciones iniciales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1319.2.2. Determinacion de la cantidad de virus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1319.2.3. Predicciones del modelo y resultados experimentales . . . . . . . . . . . . . . 132

9.3. Para metro s del mo delo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 29.4. Analisis matematico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 134

9.4.1. Ley de conservacion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1349.4.2. Espacio de parametros . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135

10.Apendice informatico 13610.1. Codigo fuente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 139

11.Bibliografıa 163

12.Artıculos publicados 179

13



1. Summary (resumen en ingles)

Quasispecies dynamics is involved in several aspects of RNA virus pathogenesis. It derives fromhigh error rates during RNA virus replication, large viral population sizes and short replicativecycles. These features lead necessarily to highly polymorphic populations in which the time needed

to fix a specific mutation is longer than the time that it takes to generate new variants.A clonal population of foot-and-mouth disease virus (FMDV) evolved towards dominance of genomes with internal deletions, that were infectious by complementation in the absence of standardvirus. In this thesis, the genome composition of intermediate passages in the course of evolution of the segmented version of FMDV has been analyzed. Multiple minority genomes harboring internaldeletions have been characterized. The results provide evidence of a transient state with geneticinstability. Increased thermal stability of the viral particles containing genomic RNA with internaldeletions, relative to the stability of the standard FMDV, has been associated with the selectiveadvantage of the segmented version relative to standard FMDV. No significant differences havebeen noted in virus entry into cells, levels of intracellular RNA, viral protein synthesis or virus exitfrom the cell.

The segmented form of FMDV induced anti-FMDV neutralizing antibodies, and protectedB57/BL6 mice against challenge with a lethal dose of the standard virus. Thus, the segmentedFMDV version constitutes a live-attenuated vaccine candidate.

In the present thesis, populations of FMDV subjected to lethal mutagenesis by base and nucleo-side analogues have been analyzed by PAQ (Partition Analysis of Quasispecies), and by standardphylogenetic methods. The results have documented expansions and compressions of mutant spec-trum complexity, as well as the operation of negative selection in the course of mutagenesis. Ex-tinction can occur with modest increases of mutant spectrum complexity. The results suggest thatPAQ can be very useful to unveil changes in the internal composition of mutant spectra subjectedto mutagenesis or other perturbations.

The diversification of a clonal population of FMDV into two distinct subpopulations has been

characterized. Recombinant forms between components of the two subpopulations have been identi-fied by nucleotide sequence comparisons and phylogenetic analysis. The two subpopulations differedin virulence (cell killing ability), replication rate, and interference exerted on other FMDV popu-lations. The results fit an ecological model in which the virus differentiated into ”colonizers” and”competitors” for limited and patched resources, in this case the host cells.

The three main aspects of viral dynamics examined in the present thesis have characterized major evolutionary transitions into new genotypic and phenotypic traits. Some transitions (towardssegmentation, differentiation into resource-coping strategies) have occurred in the course of unper-turbed evolution, while others (internal changes of mutant spectrum composition) were triggeredby enhanced mutagenesis.

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2. Introduccion

2.1. Variabilidad genetica de virus RNA

2.1.1. Bases moleculares de la variabilidad genetica de virus RNA.

Los virus son agentes biologicos que carecen de un metabolismo propio y dependen necesaria-mente de la celula para su replicacion. Son capaces de reconocer a la celula (Baranowski y col. 2001),entrar en ella (Hogle 2002), utilizar los sistemas de transporte intracelular (Henry y col. 2006), detraduccion y modificacion de proteınas (Kash y col. 2006) y ası generar su progenie. Todos, portanto, son parasitos y, con distinto grado de virulencia, son capaces de persistir (Domingo y col.1998) o matar a la celula hospedadora (Buenz y Howe 2006). La diversidad viral es extensa, laclasificacion actual incluye 3 ordenes, 73 familias, 9 subfamilias, 287 generos y 1938 especies y aunexiste un gran numero de virus sin clasificar (Fauquet y col. 2005; Fauquet y Fargette 2005). Losvirus que poseen RNA como material genetico son los mas abundantes en la biosfera, constituyendomas del 70 % de los virus patogenos que infectan organismos superiores. Son por tanto los agentescausantes de un gran numero de enfermedades en el hombre como gripe, sarampion, varias formas

de hepatitis, poliomielitis, SIDA y enfermedades de gran importancia veterinaria como la fiebreaftosa (FA) o la lengua azul, y otras denominadas emergentes como las fiebres hemorragicas aso-ciadas a hantavirus, arenavirus o filovirus (Duarte y col. 1994; Morse 1994; Murphy 1994; Murphyy Nathanson 1994; Weaver 1998).

La estructura de un virus RNA es generalmente simple. La partıcula se compone de un reducidogrupo de proteınas que protegen el genoma que incluye la informacion para la transcripcion yreplicacion del RNA y para la expresion de proteınas vıricas (Flint y col. 2004). El mensaje geneticose copia con fidelidad limitada durante la replicacion viral, dando lugar a la alta variabilidad geneticade los virus RNA (Figura 1) (Domingo 2006; Domingo y col. 1978).

2.1.2. Frecuencias de mutacion

Los valores de tasa de mutacion en la replicacion de virus RNA se han estimado en 10−3 a 10−5

errores por nucleotido copiado (Drake 1993; Drake y Holland 1999; Holland y col. 1982; Domingo ycol. 2001a). Es un valor muy superior a los 10−8 a 10−11 errores por nucleotido copiado estimadospara los procesos normales de replicacion de DNA celular (Drake 1991; Drake 1993; Goodman yFygenson 1998; Kunkel y Alexander 1986; Kunkel y col. 1986). Dado que los genomas de virus RNAtienen un tamano de entre 3kb y 32kb, de media se espera que ocurran entre 0,1 y 1 mutacionespor genoma y ronda de replicacion (Drake y Holland 1999). Esta velocidad de mutacion es tan altaque la mayorıa de la progenie viral puede ser no viable (Coffin 1995).

Existen al menos dos factores moleculares que contribuyen a la mayor tasa de error de los virusRNA:

1. Mayor infidelidad de las RNA replicasas en comparacion con las DNA polimerasas replicativas.Ausencia de actividad correctora de errores de las replicasas de RNA (actividad exonucleasa3→5’), documentada tanto por metodos bioquımicos (Coffin y col. 1997; Steinhauer y col.1992) como por comparacion de dominios estructurales de replicasas de RNA y polimerasasde DNA celulares (Bressanelli y col. 1999; Ferrer-Orta y col. 2006b; Hansen y col. 1997;Kohlstaedt y col. 1992).

2. Ausencia de mecanismos celulares conocidos de reparacion postreplicativa que puedan actuarsobre hıbridos RNA-DNA o de intermediarios replicativos de RNA bicatenarios (Modrich y

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Secuencia

consenso

Secuencia

consenso

Eficacia biológica

relativa

_ +

Figura 1: Esquema de la estructura en cuasiespecies de los virus RNA. Enel esquema central se representa una distribucion heterogenea de genomas, tıpica delos virus ARN. Las lıneas representan genomas virales y los sımbolos sobre las lıneasrepresentan mutaciones. Debajo del espectro de mutantes se indica la secuencia consensoo promedio de la distribucion. La cuasiespecie inicial, en el centro, puede evolucionarhacia aumentos de eficacia biologica (flecha ancha) al ser sometida a pases con grandestamanos poblacionales, o hacia disminuciones de eficacia biologica (flechas pequenas)al ser sometida a cuellos de botella poblacionales sucesivos o pases placa a placa. Los

pases con grandes tamanos poblacionales favorecen la competicion entre las variantes yconlleva un aumento de la eficacia biologica relativa del virus. Los pases placa a placadan lugar a una acumulacion estocastica de mutaciones deletereas y a una ba jada de laeficacia biologica relativa del virus.

16



Lahue 1996). Ademas, las RNA polimerasas son propensas al deslizamiento (slippage) al copiartramos homopolımericos, originando delecciones e inserciones (Bebenek y Kunkel 1993).

Existen tambien unas familias de proteınas celulares, las citosin y adenosin desaminasas (APO-BEC y ADAR), capaces de editar genomas o transcritos virales como en Hepatitis δ, virus de la

inmunodeficiencia humana (VIH) (Harris y col. 2003; Mangeat y col. 2003; Zhang y col. 2003),hepatitis B (Suspene y col. 2005) o incluso en virus DNA como el papilomavirus (Vartanian ycol. 2008). Estas actividades pueden ser tambien una fuente de variacion genetica en algunos virusRNA.

2.1.3. Recombinacion y reordenamientos genicos.

La recombinacion es la formacion de nuevas combinaciones de fragmentos de material genetico,covalentemente unidos, procedentes de diferentes genomas parentales o diferentes zonas de un mismogenoma (revision en Domingo 2007). La recombinacion es una importante fuente de variabilidadgenetica, especialmente en virus RNA de polaridad positiva (Simmonds y Welch 2006). Su valorevolutivo se asocia a dos propiedades: (i) provee a los virus RNA de un mecanismo para contrarrestar

la desventaja asociada a las altas tasas de mutaci on (Mikkelsen y Pedersen 2000) y (ii) permiteexplorar nuevas combinaciones geneticas procedentes de virus parentales de origen distinto (Hahny col. 1988).

Se han descrito distintos tipos de recombinacion: (i) homologa frente a no homologa, en funcionde la identidad de secuencia en los puntos de cruce de las cadenas y (ii) replicativa frente a no repli-cativa, en funcion de si se requiere o no la replicacion del genoma viral (Domingo 2007; Chetveriny col. 2005; Kirkegaard y Baltimore 1986b; Urbanowicz y col. 2005; Gmyl y col. 1999; Chetverinay col. 1999; Gmyl y col. 2003).

La frecuencia de recombinacion varıa tanto para virus DNA como para virus RNA. Bujarskiy colaboradores han propuesto que la recombinacion puede ser un hecho habitual en el geneticadel RNA (Urbanowicz y col. 2005). En el VIH se estima que la frecuencia de recombinacion esmayor que la de mutacion puntual (Jetzt y col. 2000; Wain-Hobson y col. 2003). En el virus de lafiebre aftosa (VFA), el modelo viral utilizado en esta Tesis Doctoral, se ha estimado que entre el10 % y 20 % de los genomas progenie en coinfecciones en cultivos celulares son recombinantes (King1988; Carrillo y col. 2005; Knowles y Samuel 2003; Sobrino y Domingo 2004).Se han detectadovariantes del VFA con cambios de bloques genomicos, algunos con efectos fenotıpicos importantes,como por ejemplo deleciones en la proteına 3A, que alteran el rango de hospedador y la virulencia(Beard y Mason 2000; Giraudo y col. 1990), y existe evidencia creciente de circulacion de VFAsrecombinantes (Jackson y col. 2007).

Los reordenamientos genicos constituyen una importante fuente de variacion en virus con geno-ma segmentado (Webster 1999a). El reordenamiento de segmentos procedentes de cepas humanasy aviares del virus de la gripe tipo A se ha asociado a epidemias como la causante de la gripeespanola de 1918, y las epidemias de 1957 y 1968 (Vana y Westover 2008).

2.1.4. Estructura poblacional - Cuasiespecies

Las altas tasas de error de los virus RNA, sus tiempos cortos de replicaicon genomica y los altostamanos poblacionales, junto con la accion de la seleccion natural, configuran un sistema darvinianoextremo, en el que la velocidad con la que se generan nuevas variantes supera la velocidad a la queestas se fijan (Manrubia y col. 2005). Esta dinamica de mutacion-seleccion rapida en virus RNAconlleva necesariamente a la coexistencia de multiples variantes en una poblacion, que constituyeun conjunto de individuos muy relacionados entre si, pero no identicos (Figura 1). A esta estructura

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poblacional se la conoce como cuasiespecies virales (Domingo 2006; Domingo y col. 2006; Domingoy col. 1978; Eigen 1993; Manrubia y col. 2005; Nowak 1992; Domingo 2007; Holland y col. 1982).

La existencia de una estructura poblacional en forma de cuasiespecies supuso la confirmacionexperimental de la teorıa previamente desarrollada por Manfred Eigen y Peter Schuster, sobre elorigen de la vida y evolucion molecular de replicones primitivos (Biebricher y Eigen 2005; Eigen

1971; Eigen y col. 1988; Eigen y Schuster 1979). Las primeras demostraciones de la organizacionen cuasiespecies de virus RNA fueron la del fago Qβ , la del VFA (Domingo y col. 1980; Domingo ycol. 1978) y la del virus de la estomatitis vesicular (VSV) (Holland y col. 1982). Hasta el momen-to, los virus RNA examinados a nivel poblacional muestran un complejo espectro de mutantes yevolucionan tal como predice la dinamica de cuasiespecies (Domingo y col. 2001a; Domingo y col.1999b; Figlerowicz y col. 2003). Se han descrito casos de virus DNA que parecen tambien tener uncomportamiento de cuasiespecies al igual que los virus RNA (L opez-Bueno y col. 2006).

En una escala temporal superior, los virus evolucionan en la naturaleza con distinta velocidad,medida como sustituciones por nucleotido y ano, no necesariamente relacionada con su tasa deerror (Domingo 2007; Holmes 2008). Virus dentro de una misma especie pueden presentar serotiposcon homologıas de nucleotidos menor del 50 % o 75 % (Grenfell y col. 2004; Knowles y Palmenberg

1998).

2.1.5. La importancia del espectro de mutantes

Las cuasiespecies vıricas son un importante reservorio genetico de variantes virales estructu-rado por la accion de la mutacion, la seleccion, tanto positiva como negativa, y en determinadascircunstancias de la deriva genetica y otros procesos estocasticos (Domingo y col. 1988; Domingoy col. 1985; Wimmer y col. 1993; Novella y col. 1995; Quer y col. 2001). La replicaci on con erroresconstituye, por tanto, un mecanismo evolutivo que proporciona a los virus la capacidad de subsistiren un medio continuamente cambiante. Esta capacidad adaptativa se ha demostrado, entre otros,en los siguientes casos:

1. Evasion de la respuesta inmune. Se han descrito mutaciones de escape tanto a celulas T comoa la neutralizacion por anticuerpos (Borrego y col. 1993; Carman y col. 1993; Martınez y col.1997; Borrego y col. 1993; Carman y col. 1993; Martınez y col. 1997), incluso en individuosvacunados (Webster 1999b).

2. Evasion a agentes antivirales (Domingo y Holland 1992; Domingo y col. 2001c; Domingo ycol. 1997; Hirsch y col. 2003; Hirsch y col. 2000).

3. Alteraciones del tropismo celular. Se han descrito cambios puntuales en proteınas involucradasen la interaccion con anticuerpos que confieren al virus la capacidad de reconocer receptoresalternativos, lo que en ocasiones conlleva a una expansion del tropismo celular (Baranowski

y col. 2001; Baranowski y col. 2003; Regoes y col. 2005).

4. Alteracion de la virulencia. Durante la replicacion de los virus RNA emergen variantes conun incremento en la virulencia. Los determinantes moleculares del aumento de virulencia enVFA se han asignado a diferentes proteınas , tanto estructurales como de replicacion o zonasno codificantes de proteınas (Herrera y col. 2007; Martinez-Salas y col. 1993; Escarmis y col.1998; Baranowski y col. 1998; Herrera y col. 2007; Bae y Yoon 1993; Tu y col. 1995; Kim ycol. 2005; Nunez y col. 2001; Mason y col. 2003).

5. Posible implicacion en aparicion de enfermedades emergentes o reemergentes (Drosten y col.2003; Lazaro y Escarmıs 2002; Mahy 2005).

18



La importancia del espectro de mutantes se ha resaltado recientemete con dos estudios parale-los, realizados con un mutante del virus de la poliomelitis (PV)(Pfeiffer y Kirkegaard 2003; Arnoldy col. 2005) que mostro un incremento en la fidelidad sin comprometer su capacidad replicativa.Este mutante generaba una cuasiespecie con menor diversidad que el virus salvaje. En ratones sus-ceptibles infectados, la reduccion de la diversidad viral condujo a la perdida del neurotropismo y

por tanto a un fenotipo atenuado (Pfeiffer y Kirkegaard 2005; Vignuzzi y col. 2006). La expansionde la diversidad de la cuasiespecie mediante mutagenesis quımica restauro el neurotropismo y la pa-togenesis. Estos resultados establecen una relacion directa entre la tasa de mutacion, la complejidaddel espectro de mutantes y la patogenia viral in vivo.

2.1.6. Filogenia como herramienta para el estudio de la estructura de cuasiespecies.

La filogenia es una herramienta util para describir y clasificar la variabilidad de los virus RNA(Domingo 2007; Flint y col. 2004; Granoff y Webster 1999; Salemi y Vandamme 2004; Holmes 2004),puesto que estos se diversifican en la naturaleza en cualquiera de las escalas (tanto temporalescomo espaciales) estudiadas (Duffy y col. 2008). En muchos virus, como en el caso del VFA, existen

grandes subtipos localizados geograficamente por todo el mundo (Knowles y Samuel 2003). Se handescrito tambien, variantes antigenicas dentro de un serotipo viral (Mateu y col. 1988). Asimismose han descrito variantes geneticos y antigenicos dentro de un animal infectado (Domingo y col.1980; Gebauer y col. 1988), incluso en cultivos celulares el VFA se diversifica rapidamente (Sobrinoy col. 1983; Fares y col. 2001).

El estudio de la topologıa de un arbol filogenetico construido con muestras tomadas duranteuna serie temporal o geografica se denomina filodinamica (Grenfell y col. 2004), y refleja el patronevolutivo que puede seguir una especie viral (Figura 2). La mayorıa de los estudios filogeneticosse han realizado con secuencias consenso de las poblaciones virales, que representan una mediaponderada de las multiples secuencias presentes en cada tiempo y muestra de virus (Domingo 2007).Sin embargo, el analisis clonal de las poblaciones virales puede revelar una compleja estructura,

que no se puede deducir de la secuencia consenso (Figura 2-D).Se ha descrito un metodo no jerarquico, el Analisis de Particion de Cuasiespecies (PAQ) (Baccamy col. 2001) para el estudio de secuencias dentro de un espectro de mutantes. Este metodo agrupasecuencias que minimizan la distancia genetica (de Hamming) entre ellas. De este modo multiplesgrupos, solapados o no solapados, se pueden representar en una serie temporal, que refleja ladinamica que siguen los individuos de una misma cuasiespecie (Figura 2-E). El PAQ se ha empleadocon exito para analizar subpoblaciones de la anemia equina infecciosa (Baccam y col. 2003), elretrotransposon Ty1-copia (Galindo y col. 2004), en secuencias regulatorias del virus de la diarreabovina (Jones y col. 2002), o aislados secuenciales del virus de la hepatitis A (Costa-Mattioli y col.2006).

En nuestro laboratorio se han descrito y secuenciado una serie de espectros de mutantes proce-

dentes de poblaciones que han replicado en cultivos celulares en presencia de mutagenos (Sierra ycol. 2007; Sierra y col. 2000; Gonzalez-Lopez y col. 2005; Gonzalez-Lopez y col. 2004; ver seccion2.3). La adaptacion del VFA a la replicacion en condiciones de mutagenesis incrementada im-plico cambios drasticos de todo el espectro de mutantes que se han comparado mediante metodosfilogeneticos y PAQ, como parte de esta Tesis Doctoral.

2.2. Eficacia biologica de un virus: fitness

La eficacia biologica o fitness de una variante viral es la contribucion esperada de esa variante ala descendencia de la siguiente generacion en un ambiente determinado (Maynard Smith 1998). Dos

19



A B C

D E

tiempo

Figura 2: Estudio de la evolucion de virus a traves de la topologıa de arbolesfilogeneticos. A) Arbol representativo de la evolucion (a nivel epidemiologico) del virusde la gripe o de clones virales en cultivos celulares. Representa una selecci on constantey lineal de nuevas variantes virales partir de las previas. En este arbol y en el resto,las secuencias virales se representan con un cırculo que significa que dicha secuencia esel promedio de una constelacion de mutantes. B) Arbol filogenetico representativo devirus que realizan infecciones cronicas tipo VIH o virus de la hepatitis C. Se caracterizapor ramas largas divergentes entre las distintas variantes virales. C) Evolucion conmucha divergencia inter-subtipo y muy relacionados intra-subtipo (tıpica de Dengue).D) Diversificacion de HIV en un paciente infectado, documentado por secuenciacion de

clones moleculares. E) Analisis por particion de cuasiespecies (PAQ). Los cırculos (oesferas) representan subpoblaciones virales de una misma muestra analizada duranteuna serie temporal. El tamano de cada esfera puede representar el tamano de cadasubpoblacion (numero de individuos) o la diversidad de cada subpoblaci on. Notese lavariacion fluctuante a lo largo de la serie de la composicion de cada poblacion. Esquemasbasados en (Grenfell y col. 2004) y (Domingo 2007).

20



virus con diferente capacidad replicativa pueden contribuir de manera muy similar a la siguientegeneracion, cuando estos replican de manera independiente. Por este motivo, en virologıa, se haadoptado la cuantificacion de la capacidad replicativa en competicion y obtener ası un valor deeficacia biologica relativa. El valor de fitness de un virus refleja su grado de adaptacion al entorno(Domingo y col. 1999a; Domingo y Holland 1997).

Para estimar la fitness relativa de un virus se realizan experimentos de competicion en cultivoscelulares o en un organismo hospedador. En cultivos celulares, los dos virus se mezclan con unasproporciones dadas, y se realiza una infeccion con ellos. A diferentes tiempos durante la infecciono tras observar efecto citopatico completo, se realizan determinaciones de la proporcion de cadatipo viral (Quinones-Mateu y Arts 2006). Cuando se obtiene una serie temporal (varios tiemposdentro de una misma infeccion, o varias infecciones seriadas), clasicamente se ha tomado comovalor de fitness el incremento respecto al tiempo de la frecuencia de cada virus (Figura 3), o masprecisamente, la pendiente de la relacion logarıtmica de las frecuencias de los genotipos durante laserie temporal (Holland y col. 1991). Esta pendiente representa el incremento medio por pase (opor unidad temporal) de la frecuencia de la variante viral estudiada. Para poder diferenciar los dosvirus se utilizan marcadores geneticos que sean distinguibles mediante (i) PCR a tiempo real con

iniciadores especıficos (Arias y col. 2004), (ii) secuenciacion de mutaciones especıficas de un tipoviral (Garcıa-Arriaza y col. 2006), (iii) fluorometrıa si uno lleva insertada una proteına fluorescente(Quinones-Mateu y Arts 2006), (iv) titulacion de los virus en presencia de anticuerpo cuando unode los dos es resistente al anticuerpo (Holland y col. 1991; Novella y col. 2004).

2.2.1. Procesos de variacion de la eficacia biologica

El teorema fundamental de la seleccion natural de Fisher dice: ”El ritmo de aumento en fitness

de una poblacion en cualquier momento es igual a su variacion genetica en fitness en ese momento”(Edwards 1994; Fisher 1930; Maynard Smith 1998; Fisher 1941). Por tanto cuanto mayor sea lavariabilidad dentro de una poblacion, mayor sera la probabilidad de que existan y se seleccionen

individuos mejor adaptados. Las poblaciones de virus RNA, dada su naturaleza de replicacion enforma de cuasiespecies, poseen una elevada variabilidad genetica. Cuando al virus se le permite repli-car con elevados tamanos poblacionales, se establece una competicion entre las diferentes variantesgeneticas. En estas circunstancias, la seleccion positiva actua seleccionando aquellas variantes demayor eficacia biologica (Figura 1) (Escarmis y col. 1999; Novella y col. 1995). La din amica delas cuasiespecies vıricas en relacion con los cambios de eficacia biologica se ha documentado connumerosos estudios empleando virus bacterianos, virus animales y virus de plantas (Domingo 2000;Domingo 2006; Domingo y col. 2001a). Los cuellos de botella poblacionales constituyen el otroextremo en el regimen de pases de un virus. Si durante un nuevo proceso de infeccion, el tamanopoblacional efectivo se ve reducido drasticamente (cuello de botella poblacional), se puede producirla amplificacion de subpoblaciones de genomas, independientemente de su adaptacion o ventaja

selectiva en el entorno. Ello puede dar lugar a la fijacion de genomas con mutaciones no necesa-riamente adaptativas, en la secuencia consenso de la poblacion viral. Este proceso se conoce comotrinquete de Muller (Muller 1964) y establece que en organismos asexuales se produciran perdidasen la eficacia biologica, como resultado de la acumulacion de mutaciones deletereas, cuando losmecanismos compensatorios, como el sexo o la recombinacion, esten impedidos. Este proceso hasido ampliamente demostrado con diversos virus RNA , y el propio VFA (Chao 1990; Escarmis ycol. 1996; Escarmıs y col. 2008; de la Iglesia y Elena 2007; Novella 2004; Yuste y col. 1999). Esteproceso es habitual en la macroevolucion de los virus, ya que la transmision huesped a huespedpuede implicar un cuello de botella poblacional (Chao 1997).

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0 1 2 3 4

V i r u s 1 / V i r u s 2

10-2

y = 0,318·e0,917x

R2 = 0,9218

10-1

100

101

102

0 1 2 3 4

10-2

y = 0,318·e0,917x

R2 = 0,9218

10-1

100

101

102

Número de pase

Figura 3: Esquema tıpico de una competicion viral para determinar fitness re-

lativa. La grafica representa la proporcion de dos variantes virales en un inoculo inicial(pase 0) y al final de una infeccion citolıtica (a lo largo de 4 pases). Cada punto repre-senta el resultado de una infeccion realizada a partir del preparado viral de la infecci onprevia. La pendiente de la grafica representa la variacion temporal en la proporcion decada genotipo. Dado que el incremento en x (numero de pases) es 1 en cada punto, lapendiente en este caso es e0,917 = 2, 6 =valor de fitness relativa.

2.2.2. Fitness en detalle

Se ha criticado que el valor obtenido de la variacion temporal de la proporcion de cada virus, enun ensayo de competicion, es realmente la diferencia absoluta en fitness entre dos virus, en lugar deser la autentica fitness relativa (Maree y col. 2000). Para calcular el clasico coeficiente de seleccion,en principio mas generalizable, se han propuesto tres modelos matematicos, cada uno actualizando ycorrigiendo el previo (Bonhoeffer y col. 2002; Maree y col. 2000; Wu y col. 2006). Sorprendentementeninguno de estos modelos contempla la posibilidad de que una misma celula sea coinfectada por dosvariantes virales distintas. Cuando las mediciones de fitness en cultivo celular se realizan con unamultiplicidad de infeccion (MDI) algo menor que uno, durante las primeras rondas de infecci on losvirus replican en celulas sin coinfectar, pero a medida que la infeccion progresa, cuando la carga viralsobrepasa un umbral, las distintas variantes virales coinfectan celulas. En ausencia de coinfeccion,el virus con la mayor tasa de replicaicon es aquel que tiene mayor fitness, (Aguirre y Manrubia

2007; Aguirre y Manrubia 2008; Nowak y May 2000). En los modelos matem aticos que describenlos experimentos de competicion, al no introducir ecuaciones que contemplen explıcitamente laposibilidad de que las celulas sean coinfectadas por distintas variantes, se esta realizando la anteriorsuposicion, es decir, el virus que replica a mayor velocidad es el de mayor fitness. La velocidad dereplicacion relativa de un virus y su fitness relativa no son procesos necesariamente analogos,una suposicion erronea realizada por diversos autores (Bull y col. 2000; Maree y col. 2000). Sifueran procesos analogos, el resultado de medir los niveles de replicacion de dos virus en cultivosseparados serıa identico que al hacerlo en competicion. Sin embargo, la posibilidad de que lascelulas sean coinfectadas por distintas variantes existe en los experimentos en cultivos (Domingo2007) y es habitual en infecciones in vivo (Jung y col. 2002). Dado que se han descrito interacciones

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importantes, que pueden alterar el resultado de una competicion, en celulas que estan coinfectadaspor diferentes variantes virales (Baulcombe 1996; Bull y Molineux 1992; Chao 1997; Chao y Tran1997; Gonzalez-Lopez y col. 2004; Grande-Perez y col. 2005b; Holland 1990; Novella y col. 2004;Russel 1992; Sachs y Bull 2005; Turner y Chao 1998; Turner y Chao 1999; Wilke y col. 2004b; Peralesy col. 2007; Valcarcel y Ortin 1989; Holland y col. 1989), los ensayos de fitness pueden concluir

resultados muy diferentes en funcion del grado de coinfeccion que se permita en el experimento.

2.2.3. Evolucion de estrategias de fitness virales: seleccion dependiente de densidad

Un conjunto de celulas, ya sea un organo, un tejido o una monocapa de celulas en cultivo, espara el virus un recurso parcheado (discreto) cuya unidad funcional es la celula. La distribucionparcheada de los recursos favorece la aparicion de diferentes adaptaciones, en funcion del modo enel que se aprovecha el recurso. Existen modelos de ecologıa teorica que predicen la especializacionde individuos en dos estrategias basicas: colonizadores y competidores (Tilman 2007). Los coloniza-dores son aquellos individuos con mayor capacidad de ocupar y agotar el recurso. Los competidoresson capaces de desplazar a otros individuos cuando compiten por un mismo recurso (May y Nowak

1994; May y Nowak 1995; Nowak y May 1994).Aunque no se ha llegado a describir en detalle estas estrategias evolutivas en virus RNA, existenevidencias de que los virus puedan adoptar diferentes tipos de adaptaci on en funcion de la densidadde individuos (Turner y Chao 1999). La MDI en virologıa corresponde al concepto ecologico dedensidad, en este caso del numero de virus infecciosos por celula. Modulando la MDI en unainfeccion se puede modular el grado de coinfeccion de las celulas, y por tanto el grado de interacciono replicacion individual de los virus dentro de una celula (Wilke y Novella 2003). En infecciones conbaja MDI (<1) los virus replican principalmente solos en las celulas. La probabilidad de coinfeccionde una celula por dos o mas partıculas aumenta con la MDI y, por tanto, la competencia intracelularentre distintas variantes. Se han descrito experimentos con virus RNA que demuestran que al variarla MDI, los virus evolucionan de manera diferente:

La primera observacion se realizo con el VFA (Sevilla y col. 1998b). Se infectaron cultivoscelulares con varias poblaciones a alta o baja MDI durante pases seriados. Posteriormenteestas poblaciones fueron competidas entre ellas. Se observo que las poblaciones evolucionadasen regımenes de alta MDI ganaban en competicion solo cuando esta sucedıa a alta MDI,mientras que las poblaciones evolucionadas a baja MDI, ganaban en competicion cuandoesta se realizaba con infecciones a baja MDI. Dado que con la MDI se modula el gradode coinfeccion en un cultivo celular, es de suponer por un lado que las poblaciones viralesoptimizaron la capacidad replicativa cuando replicaron aisladamente, y que por otro ladooptimizaron la competencia intracelular. Por tanto el experimento de Sevilla y colaboradoresfue la primera demostracion de seleccion dependiente de densidad (SDD) en virus RNA.

Otras observaciones de SDD se realizaron con el rabdovirus VSV. Un experimento demostro queun virus de alto fitness unicamente se seleccionaba durante infecciones realizadas a baja MDI.En condiciones de alta MDI el virus permanecıa en una proporcion baja en la poblacion, hechoque se atribuyo a un efecto de supresion de la poblacion (de la Torre y Holland 1990).

Otra serie de experimentos con VSV demostro que la SDD tambien actuaba en unos clonesaislados en cultivos celulares (Novella y col. 2004). En este caso la SDD se atribuy o a que unode los virus presentaba un defecto en algun producto genico, que era complementado por lasproteınas aportadas en trans por el virus competidor, cuando coinfectaban la misma celula(Wilke y col. 2004a; Wilke y col. 2006).

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Experimentos con el bacteriofago φ6 produjeron los mismos resultados que los citados paraVFA. Dos variantes virales que replicaron a alta o baja MDI, produjeron progenie que eramas eficaz en las condiciones de densidad en las que habıan replicado (Turner y Chao 1998).La ventaja de los virus adaptados a replicar a alta MDI se atribuy o a que podıan ser maseficaces explotando las proteınas del virus competidor, adaptado a replicar a baja MDI, en

la que apenas se produce competicion intracelular. Por este motivo estos virus se estudiarondesde el punto de vista del dilema del prisionero de la teorıa de juegos (Maynard Smith1998). A los virus adaptados a alta MDI se les llamo desertores (que es una traduccionerronea de defectors, mantenida historicamente), ya que aprovechan las proteınas que el otrovirus comparte en el citoplasma como un cooperador (Nowak y Sigmund 1999; Nowak 2006).

Existen ciertos estudios teoricos que describen la evolucion de virus adaptados a la replicacionen coinfeccion o individualmente, que predice un estado de equilibrio entre las dos estrategiasreplicativas (Bull y col. 2006).Otro estudio predijo que la replicacion en presencia de coin-feccion en el VIH, puede seleccionar virus con menor capacidad replicativa (Wodarz y Levy2007).

La observacion de casi identicos resultados en virus tan dispares, y con el mismo virus endos experimentos diferentes (de la Torre y Holland 1990; Novella y col. 2004), refleja el car actergeneral del resultado que puede tener la adaptacion de los virus RNA a replicar en un ambienteparcheado. Aunque se hayan apuntado ideas (no demostradas) que expliquen el comportamientode los virus que replican a alta MDI, no existe ningun experimento ni propuesta de lo que sucedecon los virus que replican a baja MDI. En esta Tesis Doctoral propondremos la hipotesis de losdos nichos ecologicos, que predice que en un ambiente parcheado, como lo es un grupo de celulas,durante la replicacion de virus RNA, estos adoptaran dos estrategias, aquella adaptada a competirpor el conjunto de las celulas (virus colonizadores) y aquella adaptada a competir por una celula(virus competidores). Propondremos el caracter general de esta hipotesis, su posible relevancia in

vivo y la dependencia sensible de la densidad en la evoluci on de estas estrategias, basandonos enexperimentos y en un modelo matematico.

2.3. Mutagenesis letal como estrategia antiviral

Los virus RNA, dada la elevada tasa de mutacion durante su ciclo de replicacion, viven en ellımite entre la adaptacion y la extincion por la constante proximidad a la perdida de su informaciongenetica (Domingo 2000; Biebricher y Eigen 2005; Eigen 1971; Swetina y Schuster 1982). La cercanıade estos virus al colapso genetico se quiso comprobar incrementando artificialmente su tasa demutacion con mutagenos quımicos (Holland y col. 1990) en un proceso que se ha denominadomutagenesis letal (Loeb y col. 1999) (para revisiones lease Anderson y col. 2004; Domingo 2005;Graci y Cameron 2004). El uso de mutagenesis incrementada se ha empleado eficientemente en

cultivos celulares para disminuir la carga viral o extinguir virus RNA de diversas familias como esel caso del lentivirus VIH (Loeb y col. 1999; Tapia y col. 2005), con picornavirus como PV (Crotty ycol. 2000; Crotty y col. 2001), el VFA (Sierra y col. 2000; Pariente y col. 2003; Pariente y col. 2005;Gonzalez-Lopez y col. 2004), con el arenavirus de la coriomeningitis linfocitaria de raton (LCMV)(Grande-Perez y col. 2002; Grande-Perez y col. 2005b), o Hantavirus (Severson y col. 2003; Jonssony col. 2005; Chung y col. 2007), entre otros.

Ciertos mutagenos pueden actuar in vivo reduciendo efectivamente la infectividad de virus, comose demostro para LCMV en infecciones en raton (Ruiz-Jarabo y col. 2003). El analogo de nucleosidoribavirina (1-β -D ribofuranosil-1, 2, 3- triazol- 3 carboxamida) (R), se emplea habitualmente en eltratamiento de la infeccion por el virus de la hepatitis C (HCV). Existen evidencias que sugieren

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que la R pueda actuar como mutageno de HCV in vivo (Asahina y col. 2005), aunque tambienexisten estudios que sugieren otros mecanismos de actuacion (Chevaliez y col. 2007).

2.3.1. Evidencias experimentales de extincion de VFA mediante mutagenesis letal

En nuestro laboratorio hemos empleado el VFA como sistema modelo para la mutagenesis letal,sometiendo clones y poblaciones virales a tratamiento con 5-fluorouracilo (FU), R, o 5-azacitidina(AZC) (Domingo 2003; Pariente y col. 2005; Domingo 2005). Los agentes mutagenicos FU, AZC yR, pueden producir la extincion del virus durante infecciones citolıticas o persistentes en cultivoscelulares (Sierra y col. 2000; Pariente y col. 2001; Pariente y col. 2003; Airaksinen y col. 2003).

Las principales conclusiones de la mutagenesis letal con virus RNA (incluyendo VFA, LCMV yHIV) son las siguientes:

1. Una baja capacidad replicativa y bajas cargas virales favorecen la extincion viral en presenciadel mutageno (Sierra y col. 2000; Pariente y col. 2001).

2. La combinacion de agentes mutagenicos con inhibidores de la replicacion viral (FU, clorurode guanidinio, (G) y heparina, (H), en el caso de VFA, y 5-hidroxidesoxicitidina con AZTen el caso de HIV-1) fue mas efectiva en provocar la extincion del virus que los agentesmutagenicos o inhibidores administrados aisladamente (Pariente y col. 2003; Tapia y col.2005). En el proceso de extincion viral la infectividad especıfica desciende entre 102 a 103

veces sin modificacion de la secuencia consenso de la poblacion (Gonzalez-Lopez y col. 2005;Grande-Perez y col. 2005a). En cambio, se producen aumentos en la complejidad del espectrode mutantes, medida por comparacion de frecuencias de mutacion y entropıa de Shannon(Pariente y col. 2005).

3. El RNA preextincion (extraıdo de la ultima poblacion viral que presenta infectividad) inter-fiere con la infectividad del RNA infeccioso presente en la misma poblacion (Gonzalez-Lopezy col. 2004).

4. Datos experimentales con LCMV, apoyados por un modelo matematico, sugieren que el in-cremento de mutagenesis favorece la aparicion de dominantes negativos (genomas defectivosdenominados defectores) que interfieren con la replicacion de virus competentes, acelerandola extincion. A este proceso se le ha llamado defeccion letal (Grande-Perez y col. 2005b).

En los experimentos con LCMV y VFA la accion de mutagenos elimino la infectividad antes que lacapacidad de replicar (Grande-Perez y col. 2005b). Por tanto un mutante resistente a un mut agenono necesariamente puede manifestar una ventaja replicativa sobre sus competidores no infecciosos.Ello podrıa dificultar la seleccion de virus con mutaciones de resistencia a un mutageno, para las quehay pocas descripciones (Young y col. 2003; Pfeiffer y Kirkegaard 2003). Un estudio reciente conVFA ha detectado una serie de poblaciones capaces de resistir a la presion mutagenica ejercida por

la R. Estas poblaciones presentaban una mutacion de resistencia a R en la polimerasa (3D) del virus(M296I), que se impone en la secuencia consenso (Sierra y col. 2007). En la presente Tesis Doctoral,la serie evolutiva que dio lugar a poblaciones resistentes a R se analizara bioinformaticamente, y seinvestigara la participacion del espectro de mutantes en el proceso de mutagenesis letal.

2.4. El virus de la fiebre aftosa (VFA) como modelo

2.4.1. La fiebre aftosa (FA)

La enfermedad de la FA fue descrita por primera vez en la India en 1025, y posteriormenteen el siglo XVI por el humanista italiano Girolamo Fracastorius (1546). En 1897 Loeffler y Forsch

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describieron, por primera vez que la etiologıa de una enfermedad animal estaba causada por unvirus, o elemento filtrable, el VFA (Loeffler y Frosch 1897). FA es una enfermedad infecciosa, dediseminacion y contagio muy rapido, que afecta a artiodactilos (animales de pezuna hendida),fundamentalmente a ganado bovino y porcino. Es la enfermedad animal que causa mas perdidaseconomicas en la ganaderıa. Como ejemplos, el brote de 2001 en el Reino Unido costo unos 6 billones

de libras y una falsa alarma de aftosa en EEUU que duro menos de 24h costo 50 millones de dolares.El virus se transmite principalmente por la vıa fecal-oral, aunque existen multiples vıas de

transmision, incluidas el contacto directo, transporte mecanico, aerosoles, ingestion, etc. El viruspenetra en el organismo a traves de los epitelios causando una infeccion aguda caracterizada porfiebre y ampollas o aftas, principalmente en lengua, boca y pezunas. A pesar de que la enfermedadcursa con una alta morbilidad, en animales adultos la mortalidad no suele superar el 5 %, mientrasque en animales jovenes afectados de miocarditis asociada al VFA, la tasa de mortalidad se aproximaal 50 % (Sutmoller y col. 2003) (revisiones en Sobrino y col. 2001; Sobrino y Domingo 2004). Tras lafase aguda de la enfermedad se puede establecer una infeccion persistente en rumiantes en la que elvirus persiste de forma asintomatica en el esofago y garganta por periodos prolongados de tiempo.Estos animales portadores asintomaticos constituyen una reserva natural de virus muy extendida en

todo el mundo y se sospecha que pueden originar nuevos brotes de la enfermedad aguda en animalessanos, dificultando aun mas el control de la enfermedad (van Bekkum y col. 1959; Pereira 1981;Gebauer y col. 1988; Salt 1993; Salt 2004). Las estrategias de control de la enfermedad utilizadastradicionalmente se basan en la vacunacion sistematica de animales susceptibles. Sin embargo,la continua aparicion de brotes del VFA en numerosas regiones del mundo, incluyendo aquellospaıses que fueron declarados libres de la enfermedad (por ejemplo en Taiwan, Japon, Grecia, ReinoUnido)(Samuel y Knowles 2001) han resaltado la necesidad de adquirir un mejor entendimiento delvirus y su interaccion con el huesped, ası como del desarrollo de vacunas mas eficaces.

2.4.2. Organizacion genomica y proteınas codificadas por el virus de la fiebre aftosa

El VFA pertenece al genero aftovirus de la familia Picornaviridae y orden Picornavirales, poseeun genoma RNA de cadena simple y de polaridad positiva de alrededor de 8 Kb de longitud,envuelto en una capsida icosaedrica desnuda (sin envuelta lipıdica) (Figura 4). El peptido viralVPg (codificado por 3B), actua como cebador en la iniciacion de la replicacion de los picornavirus(Paul y col. 1998; Ferrer-Orta y col. 2006a; Paul y col., 1998; Paul, 2002; Nayak y col., 2005). Lareplicacion del RNA esta catalizada por una RNA polimerasa RNA-dependiente (RpRd, abreviadacomo 3D) codificada por la region 3D del genoma. La baja fidelidad de copia de esta proteına es elorigen de la variabilidad genetica del VFA (Ferrer-Orta y col. 2006b). Se han descrito siete serotiposdistintos del VFA (A, O, C, Asia1, SAT1, SAT2 y SAT3), mas de 65 subtipos y numerosos variantesantigenicos (Knowles y Samuel 2003; Pereira 1977; Mateu y col. 1988; Carrillo y col. 2005). Laelevada variabilidad natural del VFA constituye uno de los principales obstaculos para el control de

la enfermedad por vacunacion (Barteling 1987; Domingo y col. 1980; Domingo y col. 1990; Domingoy Holland 1992; Sobrino y Domingo 2004; Domingo y Holland 1992).

El virus de referencia empleado en nuestro laboratorio es el C-S8c1. Es un clon biologico puri-ficado de aftas de un cerdo enfermo (Sta. Pau, Girona,1970) tras dos clonajes sucesivos en cultivoscelulares (Sobrino y col. 1983). Pertenece al subtipo europeo C1 dentro del serotipo C. El genomadel VFA C-S8c1 tiene 8115 nucleotidos de longitud, sin contar los tramos homopolimericos de po-lirribocitidilato (poliC) y poliadenilato (poliA), que son heterogeneos en longitud (Escarmıs y col.1992; Escarmis y col. 1996; Toja y col. 1999)(Figura 5)

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Bucle GH

VP2

VP1

VP3

Figura 4: Organizacion genomica y estructura de la partıcula del virus de lafiebre aftosa (VFA). El genoma de VFA se organiza en una region codificante deuna unica poliproteına viral flanqueada por dos regiones no codificantes 5’ UTR en elextremo 5’ y 3’ UTR en el extremo 3’ del genoma con un poli A terminal (AA..A).La region 5’ UTR presenta un sitio interno de uni on al ribosoma (IRES), encargado dereclutar el ribosoma celular. Tras el procesamiento de la poliproteına viral se generan lasproteınas estructurales (P1) y no estructurales (P2 y P3). Tambien se libera la proteasalıder (L). El peptido VPg (3B) esta unido covalentemente al extremo 5’ del genoma. B)Esquema de la capsida de VFA. La partıcula viral presenta una capsida icosaedrica y seconstituye por el ensamblaje de 12 pentameros alrededor del genoma. Cada pentameroesta formado por 5 protomeros biologicos producidos tras la sıntesis y procesamiento

de la poliproteına viral. Cada protomero contiene una unidad de las proteınas de lacapsida: VP1, VP2, VP3 y VP4 que esta en la cara interna y no se representa. C)Representacion de la estructura tridimensional de un protomero biologico de FMDVcon el bucle GH expuesto.

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2.4.3. Estructura de la partıcula de VFA y entrada en la celula

La partıcula del VFA esta formada por cuatro proteınas (VP1, VP2, VP3, VP4) que formanlos monomeros basicos de la capsida viral (Figura 4) (Acharya y col. 1989; Lea y col. 1994).Las proteınas VP2, VP3 y VP1 (tambien denominadas 1B, 1C y 1D, respectivamente) forman lasuperficie externa de la estructura. La proteına VP4 (1A), que se encuentra miristilada, forma lasuperficie interna de la capsida y esta en contacto con el genoma viral, que esta muy compactadoen el interior de la partıcula (Acharya y col. 1989; Belsham y Martınez-Salas 2004).

El VFA reconoce a las celulas diana a traves del triplete de aminoacidos RGD en el bucle GH dela proteına VP1 de la capsida. Este triplete se une a una serie de integrinas que actuan de receptorescelulares (αvβ 1, αvβ 3, αvβ 6, αvβ 8)(Burman y col. 2006; Jackson y col. 2004; Baranowski y col.2003; Baxt y Rieder 2004). Este bucle de union al receptor coincide con el sitio antigenico principalde VFA (sitio A) (Mateu y col. 1996; Mateu y Verdaguer 2004; Verdaguer y col. 1994; Verdaguery col. 1995) (Figura 4). En poblaciones de VFA adaptadas a replicar en cultivos celulares traspases seriados, se han descrito el uso de receptores alternativos al estandar (Jackson y col. 1996;Baranowski y col. 2000). La estructura cristalina de la partıcula viral revelo que el bucle GHesta desordenado, muy expuesto y es flexible (Acharya y col. 1989; Verdaguer y col. 1999) (Figura4), con el motivo RGD conservado rodeado de aminoacidos altamente variables.(Carrillo y col. 2005;Domingo y col. 2004).

2.4.4. Traduccion del genoma viral y procesamiento proteolıtico de la poliproteınaviral

El genoma de VFA se traduce de manera independiente de cap a partir de un sitio interno deentrada del ribosoma (IRES) que presenta una compleja estructura secundaria, y es capaz de unirseal ribosoma (Martinez-Salas 2008; Martinez-Salas y col. 2008). La sıntesis de la poliproteına viralse produce a partir de 2 codones de iniciaci on diferentes (en la misma fase de lectura) y generandos proteasas lider (L) de distinto tamano, Lab y Lb, que se separan del resto de la poliproteına

por su autoprocesamiento en cis. La proteasa L procesa un factor celular de inicio de la traducci on(eIF4G) (Martınez-Salas y col. 2001; Belsham y Martınez-Salas 2004) de manera que el ribosomano puede reconocer la estructura cap de los RNA celulares, impidiendo, por tanto, la traducci onde mensajeros celulares.

Toda la region codificadora se traduce de manera seguida generando una poliproteına que seprocesa principalmente por la accion de la proteasa 3C, liberandose las distintas proteınas viralesmaduras (Figura 5). La proteasa 3C participa ademas en el procesamiento del factor de la traduccioneIF4G ayudando a la sıntesis independiente de cap (Belsham y col. 2000). Hay 10 cortes proteolıticosen la poliproteına viral producidos por 3C y otros 3 cortes que no son producidos por 3C (Figura5). El primero es el autoprocesamiento de la proteasa L. El segundo, entre 2A y 2B, no es un corteproteolıtico, sino que 2A impide la formacion del enlace peptıdico que une 2A con 2B (Ryan y col.

2004; Donnelly y col. 2001). Tras el procesamiento por L y 2A se genera el precursor P1-2A. Elprocesamiento proteolıtico de la proteasa 3C libera el peptido 2A y corta P1 en VP0 (VP4-VP2),VP3 y VP1. Los pentameros se ensamblan alrededor del genoma y ello produce el tercer corte en lapoliproteına independiente de 3C, el procesamiento de VP0 en VP4 y VP2. Este corte resulta en lamaduracion de la capsida (Rowlands 2003; Sobrino y Domingo 2004). El resto de cortes proteolıticosen la poliproteına viral se producen por la accion de 3C (Figura 5).

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2 A

3 B

L 1B 1C 1D 2B 2C 3A 3C 3DVPg A(n)

IRES

1 AA

L P1-2A 2BC P3B

P1-2A 2BC P3

3CD3AB1

3A

VPg

1 2 3

3D

pro

pol3C

pro2C2B

C 1

2

3VP0 VP3 VP1

PSEUDO-

NUDOS

CRE

Figura 5: Representacion esquematica del procesamiento de la poliproteınaviral. A) Esquema del genoma de VFA. B) Se representan los 3 precursores intermedios

que se generan tras la sıntesis de la poliproteına viral. Se producen tres procesamientosen cis a medida que se sintetiza la poliproteına. La separacion entre L y P1-2A se producepor el corte de L sobre si misma. El corte entre P1-2A y 2BC se produce por un saltode la sıntesis mediado por 2A. El corte entre 2BC y P3 se produce por 3C. C) Los3 polipeptidos obtenidos tras la sıntesis de la poliproteına viral (1) se procesan dandolugar a los diferentes peptidos y proteınas maduras (3). Algunos productos intermediosdel procesamiento, como 3AB1 y 3CD son de gran relevancia en el ciclo de infecci ondel virus. El procesamiento en trans se produce por la proteasa 3C madura, aunquetambien pueden mostrar actividad proteasa algunos de sus precursores.

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2.4.5. Replicacion del genoma de VFA y de otros picornavirus

El RNA de todos los picornavirus se copia por la accion de la RNA polimerasa RNA-dependiente(RpRd), codificada en la region 3D del genoma (Cameron y col. 2002; Ferrer-Orta y col. 2006b;Ferrer-Orta y col. 2004). En el VFA, la region 3B codifica para 3 VPg diferentes que actuan comocebador en el inicio de la replicacion (Paul y col. 1998; Ferrer-Orta y col. 2006a). Durante el inicio dela sıntesis de la cadena positiva se requiere la actuacion de la region genomica cre u ori I (elementode replicacion en cis) como molde del proceso de uridilacion de VPg. La molecula 3CD estimulaesta reaccion (Paul y col. 2000; Paul y col. 2003; Yin y col. 2003). Sin embargo, no se requiere lapresencia de cre en la iniciacion de la sıntesis de la cadena negativa (Murray y Barton 2003). Elelemento cre se encuentra en la region no codificante del extremo 5’ del genoma, justo antes deldominio conservado 1 del IRES. (Figura 5; Belsham y Martınez-Salas 2004).

Hay evidencia de que la replicacion del genoma en picornavirus esta asociada a la cara cito-plasmatica de la membrana del retıculo endoplasmico, con 3D reclutada en la membrana por elpolipeptido 3AB (Lyle y col. 2002b; Paul 2002). Se ha propuesto un modelo en el que un tapizde polimerasas estarıa recubriendo la membrana externa del retıculo endoplasmatico de celulasinfectadas formando una malla catalıtica (Lyle y col. 2002a).

2.5. Vacunacion frente a la fiebre aftosa

Poco despues desde la descripcion de Loeffler y Frosch de la etiologıa viral de la FA, se abordo lapreparacion de una vacuna que confiriera proteccion frente a la enfermedad. Intentos de aislar unacepa atenuada o de atenuar el virus mediante pases en cultivos celulares fracasaron ya que el viruscontinuaba siendo virulento, o cambiaba sus propiedades antigenicas (Barteling 2004). Por estemotivo, y hasta el dıa de hoy, las vacunas mas efectivas contra la FA han sido las vacunas fabri-cadas con virus vivo e inactivado quımicamente. Se han realizado ademas diversas aproximacionesexperimentales, como vacunas vivas atenuadas o basadas en peptidos.

2.5.1. Vacunas inactivadas

La vacuna contra VFA se prepara por infeccion de celulas BHK-21 a nivel industrial (Stokery Macpherson 1964). Para cada serotipo se elige una muestra viral diferente, a ser posible inmu-nodominante (Rweyemamu 1978). El virus se inactiva con etilenimina binaria (BEI), mas efectivaque el formaldehıdo (Bahnemann 1990). Conjuntamente se suministra un adyuvante, actualmentese utiliza la saponina o el adyuvante incompleto de Freund (Freund y Thomson 1945).

La proteccion de la vacuna inactivada generalmente no alcanza el 100 %. Ademas, la duracion dela inmunidad es muy limitada (Doel 2003), por lo que se suministran varias dosis de recuerdo de lavacuna. Tıpicamente se vacuna dos veces al animal, con un espacio de un mes de separacion, y luegose puede vacunar durante cada ano. Las vacunas vivas atenuadas contra otros picornavirus, como

el PV, producen inmunidad duradera y han permitido la erradicacion de la poliomelitis en variaszonas del mundo (Murdin y col. 1996). La vacuna inactivada de la FA s olo protege, generalmente,contra el serotipo contra el que esta preparada.

2.5.2. Vacunas basadas en peptidos o proteınas expresadas por vectores

Las vacunas basadas en peptidos consisten en suministrar al animal peptidos que incluyen de-terminantes antigenicos del VFA (Rowlands 2004). El VFA posee un sitio antigenico mayoritario(Acharya y col. 1989; Strohmaier y col. 1982; Rowlands y col. 1983), el denominado bucle GH, alta-mente expuesto en la superficie del virion, implicado en la neutralizacion del virus por anticuerpos

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(Figura 4) (Verdaguer y col. 1997; Verdaguer y col. 1995). Se han probado vacunas experimen-tales que incluıan ese y otros peptidos aislados o conjugados a diferentes proteınas (DiMarchi ycol. 1986; Ruppert y col. 1994), peptidos expresados por vectores (Moraes y col. 2002; Qian y col.2004; Grubman 2005; Ren y col. 2008), o capsidas vacıas de VFA (Clarke y col. 1987). El principalproblema de las vacunas basadas en peptidos es la falta de estimulacion de una respuesta inmune

potente y duradera y la facilidad de escape del virus a este tipo de vacunas (Taboga y col. 1997).

2.5.3. Vacunas vivas atenuadas

Las vacunas vivas tıpicamente confieren una inmunidad muy eficiente, ya que los antıgenosdel virus mantienen su conformacion nativa, y la replicacion intracelular estimula la respuestainmune celular. Esta ultima tiene mayor relevancia de lo que inicialmente se supuso en el controlde la FA (McCullough y Sobrino 2004). Recientemente, basado en el clon infeccioso del VFA, seha disenado por genetica reversa un virus con la proteasa L completamente delecionada capaz dereplicar (Piccone y col. 1995). La inoculacion de este virus en ganado vacuno no desencadeno laenfermedad y confirio una proteccion similar que la inoculacion del mismo virus inactivado con

BEI (Mason y col. 1997). Cerdos vacunados con este virus tambien presentaron una proteccionparcial (Chinsangaram y col. 1998). En otra aproximacion, se inocularon cerdos con un plasmidorecombinante que codificaba el genoma del VFA sin el dominio de union a la celula. De este modo,la expresion del plasmido producıa progenie viral, pero esta no era capaz de realizar una segundaronda de infeccion. Sin embargo, la proteccion conferida por la vacuna fue limitada. No existe hastala fecha, por tanto, ninguna aproximacion vacunal realmente satisfactoria en cuanto proteccion yseguridad de virus vivos atenuados del VFA. Parte del trabajo de esta Tesis Doctoral consisti o enexplorar el empelo del VFA segmentado (poblacion C-S8p260 descrita en 2.6.5) como nueva vacunafrente a la FA. Para ello se emplearon ratones adultos C57/BL6 susceptibles a la infecci on por elVFA (Salguero y col. 2005).

2.6. Partıculas defectivas interferentes (DIs)En 1970 Huang y Baltimore propusieron por primera vez el termino partıcula defectiva interfe-

rente (DI), refiriendose a aquellas partıculas virales que carecen de parte del genoma viral (DNA oRNA), que son empaquetadas dentro de las proteınas estructurales del virus, pero que necesitan lapresencia de un virus estandar (ST) que actue de donador de proteınas (helper ) para su replicaciony encapsidacion. (Huang y Baltimore 1970). Las primeras evidencias de la presencia de partıculasDIs fueron descritas para el virus de la gripe (von Magnus 1954) y para VSV (Bellet y Cooper1959).

2.6.1. Generacion de las partıculas DIs

Las partıculas DIs de virus RNA animales se originan por recombinaciones del genoma viralcomo resultado del salto de la replicasa viral de un molde RNA viral a otro, o de una regi on de unmolde a otra de la misma molecula, mecanismo denominado cambio de molde (o salto de hebra,copy-choice ; Figura 6) (Huang y Baltimore 1977; Leppert y col. 1977; Lazzarini y col. 1981; Perrault1981b; Kirkegaard y Baltimore 1986a). Otros mecanismos, como eventos de splicing aberrantes,podrıan a veces estar implicados (Holland 1992). Las DIs se seleccionan durante pases seriados devirus en cultivos a alta MDI, dado que ası se favorecen las coinfecciones. Por el contrario, pases devirus a baja MDI eliminan las DIs presentes en una preparacion viral (Stampfer y col. 1971; Hollandy col. 1976; Garcia-Arriaza y col. 2004). Las DIs generalmente son indistinguibles del virus estandarinfeccioso en tamano y apariencia, sin embargo, en algun sistema viral como VSV, el tamano suele

31



GenomaST

DI tipodeleción interna

3' 5'

5'ATC TAG

DItipoSTEM

3'5'

3'5'

3'

3'5'

5'

DI

3' 5'

5'

5'

5' 3'

A

B

C

D

Figura 6: Representacion esquematica de la generacion de partıculas DIs me-

diante el mecanismo de cambio de molde (copy-choice). Se representa mediantelıneas negras el molde de RNA de polaridad positiva y mediante lıneas grises el RNAde polaridad negativa. La replicasa se esquematiza en amarillo. La replicasa inicia lasıntesis de la cadena negativa sobre un molde de polaridad positiva (A). Posteriormen-te, la replicasa se cae del molde (B) llevando consigo la hebra naciente de RNA, parareiniciar la sıntesis de la cadena negativa en algun lugar de un molde diferente dondepuede existir cierta homologıa de secuencia (zonas rojas); (C) de este modo se generaun genoma RNA defectivo con una delecion interna (D). Si la polimerasa salta haciaatras genera repeticiones (no representado en la figura). Si copia sobre la hebra naciente(D) genera DIs del tipo stem o snapback. Cuando la polimerasa realiza multiples saltosse generan partıculas DIs tipo mosaico. Basado en (Holland 1990; Lazzarini y col. 1981;

Perrault 1981b).

ser entre el 10 % y el 60 % del tamano estandar. En virus de simetrıa icosaedrica el tamano de losgenomas defectivos viene restringido por los requerimientos de empaquetamiento por capsidas detamano estandar, de modo que solo un rango limitado de tamano de moleculas de RNA defectivaspuede encapsidarse (Cole 1975; Lundquist y col. 1979; McClure y col. 1980).

2.6.2. Tipos de partıculas DIs

Las partıculas DIs se han clasificado en 4 tipos diferentes en funcion de su estructura: (i)partıculas DIs con el extremo 5’ conservado tipo stem y tipo snapback o hairpin , por ejemplo enVSV (Lazzarini y col. 1975); (ii) partıculas DIs con el extremo 3’ conservado (por ejemplo virusSindbis (Weiss y col. 1974); (iii) partıculas DIs con delecion interna, iv) partıculas DIs tipo mosaico,que muestran complejos reordenamientos internos debidos a multiples recombinaciones (Perrault yHolland 1972).

32



2.6.3. Presencia de partıculas DIs en los diferentes sistemas virales

Se ha descrito DIs tanto en virus RNA como en virus DNA (revisiones en Barrett y Dimmock1986; Holland 1990; Schlesinger 1988). En virus RNA de cadena positiva, se han descrito DI mosaicoen alfavirus, DI por delecion interna en coronavirus y reovirus. Se han descrito DI en picornaviruscomo PV (Cole y Baltimore 1973c; Cole y col. 1971), virus Mengo (McClure y col. 1980), virus dela encefalomiocarditis murina (Radloff y Young 1983) y virus de la hepatitis A (Nuesch y col. 1988)entre otros. Deleciones en la zona 5’ del genoma del virus de Coxakie aumentaron su virulencia(Kim y col. 2005). Las DI de PV son mutantes de delecion interna y siempre se localiza en lazona que codifica las proteınas de la capsida (Lundquist y col. 1979; Nomoto y col. 1979). Se haobservado que no todas las deleciones son igualmente viables, a pesar de mantener la pauta delectura (Lundquist y col. 1979).

2.6.4. Caracterısticas biologicas de las partıculas DIs

Cole y Baltimore distinguieron los procesos de interferencia y enriquecimiento para explicar laimposicion de las DI sobre el virus ST(Cole y Baltimore 1973b; Cole y Baltimore 1973c). Esta

distincion de dos procesos moleculares no es posible separarla completamente, pues los mecanismosque dan lugar al enriquecimiento de las DI son, en ciertos virus, parte de la raz on de la interferencia.

Intereferencia. Los virus defectivos interfieren con el virus ST homologo, al aprovechar las pro-teınas que codifica, principalmente estructurales. Es necesario que las deleciones esten en fase y queel virus defectivo codifique sus proteınas propias de replicacion para que se produzca una interfe-rencia (Hagino-Yamagishi y Nomoto 1989). No hay evidencias moleculares solidas que demuestrenque las DIs sean mas eficientes aprovechando las proteınas suplementadas en trans, por el contrariola produccion viral es muy similar en las DI y en el virus ST de RNA de cadena positiva (Cole yBaltimore 1973b; Cole y Baltimore 1973c; Logan y col. 1993).

Enriquecimiento. Una vez aparecen las DI en una poblacion viral, estas se amplifican y puedendesplazar progresivamente al virus ST. No existe un mecanismo general por el cual las DI seenriquecen en una poblacion viral, de hecho ese mecanismo continua hoy siendo desconocido enla mayorıa de sistemas virales. En el caso de VSV bastan dos pases a alta MDI para generarun exceso de partıculas DIs que disminuyen la produccion de virus estandar un 99,9 % (Huang yBaltimore 1970). En PV y otros picornavirus el enriquecimiento en DIs es unicamente del ordendel 10 % en cada pase (Cole y Baltimore 1973a; McClure y col. 1980). Ademas, el proceso deenriquecimiento parece ser especıfico del tipo de sistema viral. Virus de cadena negativa tienendelecionadas secuencias en las zonas del genoma responsables de la iniciacion de la transcripcion.Estas DIs replican sin realizar el proceso de transcripcion, utilizando las proteınas expresadas por

la transcripcion y traduccion del genoma ST. De este modo, en celulas coinfectadas por virusdefectivo y ST se produce un enriquecimiento preferencial en genomas DI. Los DI de papovaviruscomo el SV40 tienen duplicaciones en el sitio de origen de replicacion del DNA. Se cree que estacaracterıstica hace que se copien preferencialmente y posteriormente puedan ser encapsidados porlas proteınas del virus ST.

En virus con deleciones internas, que son las DI mayoritarias, como las que presentan los virusde RNA de cadena positiva, no tienen afectadas las zonas implicadas en la replicacion que expliquensu mecanismo de interferencia. Experimentos con PV demostraron que tanto la sıntesis de RNAcomo la de proteınas seguıan una cinetica paralela a la del virus ST (Cole y Baltimore 1973c; Cole

33



y Baltimore 1973b; Lundquist y col. 1979). No se ha podido demostrar tampoco que las DI seanmas efectivas encapsidandose o aprovechando las proteınas del virus ST (Barclay y col. 1998b).

Evolucion y fenomenos cıclicos. En las cuasiespecies a menudo aparecen virus mutantes quemuestran mas resistencia que el virus inicial a la interferencia producida por los genomas DIs

(Jacobson y Pfau 1980; Horodyski y Holland 1980; Weiss y col. 1983; Cave y col. 1985; Huang1988; Bangham y Kirkwood 1993). Se produce por tanto una coevolucion entre DI y ST de modoque ocurren ciclos de aparicion de DI, seguido de la seleccion de virus ST resitentes a la interferenciade las DI, nueva seleccion de DI interferentes, y ası continuadamente (Horodyski y col. 1983;DePolo y col. 1987; Palma y Huang 1974; Kirkwood y Bangham 1994b). Esta dinamica evolutivaconstituyo una de las primeras evidencias de la importancia biologica de la variacion genetica,competicion y selecicon (Holland y col. 1982).

Modulacion de los procesos de enfermedad viral y persistencia vırica. Las partıculasDIs pueden modular y proteger de los efectos de la infeccion por virus ST, tanto en animales comoen plantas (revisiones en Holland 1987; Holland 1990; Huang 1988; Roux y col. 1991a; Bean y col.,

1985), aunque se desconoce si es debido a su acci on interferente o por estimulacion del sistemainmune (Barrett y Dimmock 1985; Johnston 1981; Marcus y Gaccione 1989).

Las partıculas DIs pueden facilitar el establecimiento de infecciones persistentes de celulas encultivo o in vivo, disminuyendo la muerte celular inducida por virus (Huang y Baltimore 1977;Perrault 1981b; Schlesinger 1988), reduciendo los rendimientos virales, incluso facilitando en algunoscasos la completa eliminacion del virus por parte del sistema inmune (Spandidos y Graham 1976;Cave y col. 1985).

2.6.5. Deleciones internas en VFA. Implicacion en la evolucion de la segmentacionviral

En esta Tesis Doctoral, aunque estrictamente no corresponden a la definicion clasica de DIs,se aborda el estudio de formas variantes del VFA caracterizadas por la presencia de delecionesinternas.

Durante pases seriados a alta MDI del clon de VFA C-S8c1 en cultivos de celulas BHK-21, seacumularon en el pase 143 genomas con deleciones internas localizadas en la zona que codifica laproteasa L (∆417 y ∆402; Figura 7) (Charpentier y col. 1996b). En pases sucesivos se detectaronnuevos virus con genomas con deleciones internas en fase (∆999 y ∆1017) que mapeaban en lazona de la capsida. Los genomas ∆999 y ∆1017 se detectaron siempre junto con el genoma ∆417.En el pase 260 no se pudo detectar el genoma ST mediante RT-PCR. La poblacion C-S8p260, portanto, esta compuesta mayoritariamente por dos tipos partıculas con RNAs con deleciones internasen fase, en la zona que codifica para la proteasa L y para la c apsida. Estos dos tipos de ∆RNA, al

coinfectar una misma celula, resultaron ser infecciosos mediante complementacion en ausencia devirus ST, como lo indica: (i) la cinetica de ”doble impacto” de muerte celular (Figuras 7-C y 8);(ii) la presencia de genomas defectivos y cantidades indetectables de genoma ST en placas de lisisindividuales formadas en infecciones de monocapas celulares; (iii) la observacion de muerte celulary rescate de virus con deleciones internas (sin virus ST) tras co-electroporacion de los genomas∆999 y ∆417 sintetizados in vitro (Garcia-Arriaza y col. 2004).

Analisis mediante microscopıa electronica demostraron que los genomas defectivos de C-S8p260se encapsidan en partıculas virales individuales indistinguibles de las del virus ST (Figura 9). Trastres pases seriados a baja MDI disminuye la probabilidad de coinfecci on con los dos tipos de genomasy se selecciona el virus ST C-S8p260p3d, que procede de la recombinaci on de los genomas ∆417

34



C-S8c1 C-S8p143

...

stL P 1 P 2 P3

st

417

402

C-S8p260

417

1017

999

st

C-S8p260p3d

C-S8p50

C-S8p100

C-S8p143

C-S8p200

C-S8p260p3dC-S8p260417

C-S8p260999

P1 P2 P3 AUG

L VP4 VP2 VP3 VP1

2A

2B 2C 3A

3B

3C 3D pol

B

A

C

3´UTR

C-S8p2601017

Figura 7: Evolucion del clon de VFA C-S8c1 hacia genomas segmentados queson infecciosos por complementacion. A) Esquema de pases citolıticos del clonC-S8c1 en cultivos celulares. El cuadrado negro representa el clon biologico inicial C-S8c1. Los cırculos blancos representan poblaciones virales. Las flechas grises representanpases en cultivos celulares sin diluir el virus. Las flechas delgadas representan pases convirus diluido. La ”p” detras de C-S8 indica el numero de pases al que fue sometidala poblacion. Los genomas presentes en cada poblacion se representan encima de cadapoblacion. Las deleciones se marcan en las zonas correspondientes de cada genoma concajas de color. B) Esquema del genoma de VFA como en la Figura 4. Debajo del genomase representa con lıneas la secuencia consenso del genoma de las poblaciones indicadas ala derecha. Las lıneas verticales negras representan una mutacion fijada en la poblacion.Las lıneas ro jas representan mutaciones presentes en mezcla en la secuencia consenso.C-S8p260∆417, C-S8p260∆999, C-S8p260∆1017 son los tres genomas con delecionesinternas integrantes de la poblacion C-S8p260. C-S8p260p3d es un genoma que surgepor recombinacion de los genomas C-S8p260∆999, C-S8p260∆417, en la zona que unelos dos genomas con lıneas discontinuas. C) Cinetica de doble impacto de la poblacionC-S8p260. La grafica representa un ensayo de virulencia, medida como el numero de

partıculas virales necesarias para matar 10

4

celulas BHK-21. Las poblaciones virales sedetallan en Materiales y metodos (apartado 4.2). Las poblaciones ST (C-S8c1, MARLS,C-S8p260p3d) presentan una cinetica logarıtmica de muerte celular; la poblacion C-S8p260 presenta una cinetica potencial o de doble impacto (basado en Garcia-Arriazay col. 2004; Manrubia y col. 2006).

35



REGIONa CS8p260C-S8

p50bC-S8

p100

C-S8

p143

C-S8

p200∆417 ∆ 999 ∆1017

C-S8

p260p3d

aa

changec

Fragmento S C247U C247U C247U C247U C247U C247U C247UC338U C338U C338U C338U C338U C338U C338U

Pseudonudos U467C/Ud NDG476A G476A G476A G476A G476A G476A ND G476A

C511U/C NDND U518C

IRES U856C U856C U856C U856C U856C U856C ND U856CND U1008C

Proteasa L A1043G * N2S(1039-1641) G1066G/U G1066U G1066U V10L

G1091U R18IC1105C/U C1105U P23S

A1154A/U ∆ 417 K39MC1158C/A ∆ 417 =C1180C/U ∆ 417 C1180U C1180U H48Y

∆417 =A1628U A1628U A1628U Q197L

A1640G/A K201RVP4 A1810G/A A1810G T57A(1642-1896)

VP2 C2202U ∆1017 C2202U =(1897-2550) C2250U ∆1017 =

G2285A ∆1017 G130DVP3 U2622C ∆1017 =(2551-3207) C2624U C2624U C2624U C2624U C2624U ∆1017 C2624U A25V

G2763U ∆1017 R71SC2897U/C ∆999 ∆1017 A116V

C3064G/C C3064G ∆999 C3064G C3064G H172DG3067A G3067A G3067A G3067A G3067A ∆999 G3067A G3067A E173K

∆999 U3157C S203PC3202A C3202A C3202A C3202A C3202A ∆999 C3202A C3202A Q218K

VP1 A3328G A3328G A3328G A3328G ∆999 A3328G A3328G K41E(3208-3828) A3344G/A A3344G/A A3344G ∆999 A3344G A3344G D46G

U3345A * ∆999 D46EU3387C/U U3387C ∆999 U3387C U3387C =U3433C U3433C ∆999 U3433C U3433C =

A3668G/A * ∆999 H154RU3753C/U ∆999 ND U3753C =

A3797A/G A3797G A3797G A3797G A3797G A3797G ND A3797G H197R2B A4036G/A A4036G A4036G ND A4036G T52A(3883-4344)

2C G4583A G4583A G4583A G4583A ND G4583A S80N(4345-5298) G4650A * ND =

C4748U/C C4748U/C C4748C/U * ND T135IC4824U/C C4824U/C ND C4824U =A5110G A5110G A5110G A5110G ND A5110G T256AG5133C G5133C G5133C G5133C ND G5133C Q263H

A5191G/A A5191G A5191G ND A5191G M283VND C5214U =

G5295A * ND =3A U5454C/U U5454C/U U5454U/C ND U5454C =(5299-5757) A5524G * ND I76V

A5606G/A A5606G/A A5606G ND D103GA5713G * A5713G/A A5713G/A ND A5713G N139D

3C U6372C * ND =(5971-6609)

3DU6789U/CU6789U/C

ND U6789C =

(6610-8022) U6903C * ND =G7554U G7554U G7554U * ND =

3’UTR ND

Tabla 1: Mutaciones respecto al clon CS8c1 de poblaciones de VFA tras pases citolıticosen cultivos celulares. Los residuos genomicos se numeran segun (Escarmıs y col. 2006). Lasmutaciones que aparecen en mezcla en las secuencias se indican entre parentesis. En el genomaCS8p260∆1017 solo se secuenciaron los nucleotidos 1 a 367, y 1031 a 3697. ND, no determinado.a Zonas reguladoras y proteınas codificadas en el genoma de VFA. Se indican las posiciones inicialy final de cada region en el genoma.b Las poblaciones virales se denominan con ”C-S8” seguido el numero de pases en cultivos celulares.c =, mutacion sinonima.d Mutacion en mezcla en la poblacion.

∗ indica la reversion de una mutacion.

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C-S8p260p3d C-S8p260∆999 C-S8p260∆417 C-S8p260

Figura 8: Esquema de la infectividad de las poblaciones C-S8p260p3d y C-S8p260. El virus C-S8p260p3d contiene un genoma de tamano estandar y es capazde completar independientemente el ciclo de replicacion. Los virus C-S8p260∆417 y C-S8p260∆999 no pueden completar el ciclo de replicacion independientemente, pero sı lohacen por complementacion en celulas coinfectadas por los dos tipos de virus (basadoen Garcia-Arriaza y col. 2004).

y ∆999 (Figura 7) (Garcia-Arriaza y col. 2004). Por este motivo el virus C-S8p260p3d comparteel contexto genetico con la poblacion de virus defectivos (Figura 7, Tabla 1), y sirve como virus

de referencia para investigar las diferencias entre una poblacion ST y otra dominada por ∆RNAs.Tras los 260 pases en cultivo la poblacion C-S8p260 acumulo un total de 32 mutaciones, repartidasa lo largo del genoma como muestra la Figura 7 y la Tabla 1. La influencia de esas mutaciones enla evolucion hacia la segmentacion son objeto de estudio en esta Tesis Doctoral.

2.6.6. Origen de la segmentacion viral

Se han descrito dos tipos de virus RNA con genoma segmentado: los virus multipartitos queencapsidan cada parte del genoma en una partıcula diferente, y los virus segmentados sensu estrictocomo el virus de la gripe que encapsidan todos los genomas en un mismo virion (Flint y col. 2004;Fauquet y Fargette 2005). Los virus multipartitos son tıpicos de los virus que infectan plantas,

de las superfamilias virales picorna-like y alpha-like. Durante la infeccion en plantas se producenelevados tıtulos que permiten la complementacion entre los distintos segmentos.

Mediante tecnicas de recombinacion in vitro se han generado versiones segmentadas de virusRNA no segmentados. Ası un replicon del virus Sindbis se encapsido junto con una partıculadefectiva natural del mismo virus dado que los dos genomas mantenıan los orıgenes de replicaciony las senales de encapsidacion (Geigenmuller-Gnirke y col. 1991). Tambien se construyo un virusSindbis con el genoma tripartito, que encapsidaba cada segmento en partıculas diferentes (Fayzuliny col. 2005). Se ha descrito un virus del sarampion con tres segmentos encapsidados en la mismapartıcula, que replicaba eficientemente (Takeda y col. 2006). El virus de DNA SV40 evoluciono encultivos celulares espontaneamente hacia dos genomas defectivos que codificaban las zonas 5’ y 3’

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100nm100nm

A B

Figura 9: Imagenes de microscopıa electronica de las poblaciones virales C-S8p260 y C-S8p260p3d. Las dos electromicrografıas muestran las partıculas viralespresentes en ambas poblaciones y fueron tomadas a 25.000 aumentos mediante tin-cion negativa con acetato de uranilo. El tamano medio de las partıculas virales es de30±0,1nm. A) C-S8p260. B) C-S8p260p3d. Basado en (Garcia-Arriaza y col. 2004).

del genoma respectivamente, en ausencia de virus ST detectable (O’Neill y col. 1982).La evolucion del clon de VFA C-S8c1 hacia la poblaci on C-S8p260, dominada por genomas

defectivos que son infecciosos por complementacion, se ha considerado como una transicion evolutiva

hacia la segmentacion viral. Esta transicion evolutiva fue posible gracias a la replicacion a alta MDIque permitio la complementacion entre los distintos RNAs (Garcia-Arriaza y col. 2004; Nee 1987;Szathmary 1992; Chao 1991). La poblacion segmentada de VFA constituye la primera evidencia desegmentacion en virus RNA ocurrida espontaneamente en cultivos celulares. Se han propuesto variosmodelos teoricos que discuten la evolucion de la segmentacion viral, principalmente en relacion conel origen del sexo y al incremento de la resistencia de virus a mutaciones, aumentos de la tasade replicacion, encapsidacion etc. (Nee 1987; Szathmary 1992; Chao 1991). La ventaja selectivae implicaciones en el origen de la segmentacion viral son materia de investigacion en esta TesisDoctoral.

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3. Objetivos

1. Estudiar el origen y evolucion de poblaciones de VFA con genomas defectivos que son infec-ciosos por complementacion. Implicaciones para el origen de la segmentacion viral.

Estudio de la composicion genetica de las poblaciones previas a la imposicion de los genomas

con deleciones internas.

Analisis de los requerimientos de las deleciones internas, tanto de localizacion como decontexto de secuencia, mediante mutagenesis dirigida.

Estudio de los mecanismos moleculares que confieren ventaja selectiva al sistema de VFAsegmentado

Aplicacion de las poblaciones defectivas como posible vacuna viva atenuada, con dosniveles de seguridad, empleando ratones C57/BL6.

2. Estudio genetico de poblaciones de VFA sometidas a mutagenesis incrementada. Implemen-tacion del software PAQ para describir la evolucion de los espectros de mutantes.

3. Evolucion de las estrategias de fitness asociadas a la diversificacion genetica de una pobla-cion clonal de VFA, replicando en cultivos celulares. Desarrollo de una simulacion en C dereplicacion de virus en cultivos celulares.

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4. Materiales y Metodos

4.1. Cultivo de celulas eucarioticas

Se han empleado las siguientes lıneas celulares establecidas:Celulas BHK-21 (LC), fibroblastos de rinon de hamster (Stoker y MacPherson 1964), recibidas

de L. Carrasco; estas celulas se utilizaron unicamente para experimentos de electroporacion.Celulas BHK-21 clon 2, fibroblastos de rinon de hamster, obtenidas de la ATCC que fueron

clonadas por dilucion lımite (de la Torre y col. 1988).Las celulas se cultivaron hasta confluencia en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM)

(Dulbecco y Freeman 1959), suplementado con aminoacidos no esenciales (Sigma), 50 µg/ml degentamicina (Sigma), 0.00002 % de parahidroxibenzoato de butilo (Sigma), y 5 % de suero bovinofetal (SBF) (Gibco), en una atmosfera con 7 % de CO2, 98 % de humedad y a 37o C tal como seha descrito previamente (Domingo y col. 1980).

4.2. Variantes del VFA empleadas

Se han empleado los siguientes VFA de serotipo C:

C-S8c1: es un clon biologico obtenido a partir del aislado natural C1 Santa Pau Sp/70 (SantaPau, Girona, 1970) mediante tres aislamientos sucesivos de placa en celulas BHK-21 (Sobrino y col.1983).

Poblaciones virales derivadas de C-S8c1 tras infecciones seriadas a alta multiplicidadde infeccion (MDI): son las poblaciones resultantes de pasar seriadamente el virus C-S8c1 encelulas BHK-21 a alta MDI, infectando en cada pase 2 x 106 celulas con 4-8 x 106 PFUs (MDI de2-4 PFUs por celula) (Garcıa-Arriaza y col. 2006). Estas poblaciones se identifican en esta TesisDoctoral mediante C-S8 seguido del numero de pase, precedido por una p ( C-S8p240 es la poblacionresultante de pasar C-S8c1 240 veces en las celulas BHK-21).

Clones biologicos de las poblaciones derivadas de C-S8c1: a partir de las poblaciones de-rivadas de C-S8c1 se purificaron clones biologicos, recogiendo virus de placas de lisis individuales enplaqueos con agar semisolido. En las poblaciones virales compuestas por mezcla de virus con geno-mas defectivos (con deleciones internas), y virus con genomas de tamano estandar (ST), las placasde lisis tienen tamanos bien diferenciados. El tamano grande de 2,68±0,86 mm, es el producido ge-neralmente por C-S8c1 ST, mientras que las placas de tamano pequeno, con un diametro medio de0,94±0,53 mm, se asocian a genomas defectivos (Garcia-Arriaza y col. 2004). Los clones biologicosse denominan con el nombre de la poblacion donde se originaron, seguido de G unicamente si la

placa era de tamano grande, y seguido del numero de clon (p240-G1, p225-G2, p219-G1, etc.). Porsimplicidad, para los clones biologicos se omite C-S8c1.

Poblaciones p3d: las poblaciones virales derivadas de C-S8c1 tras pases a alta MDI, p200, p219,p225 y p240 fueron sometidas a tres pases a baja multiplicidad (diluyendo 1000 veces el virus antesde cada pase). Estas poblaciones se denominan con el nombre de la poblaci on seguido de p3d(C-S8p240p3d, etc.).

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MARLS: es un clon mutante de escape al anticuerpo monoclonal (ACM) SD6. SD6 es un ACMneutralizante que reconoce el sitio antigenico A en el bucle GH de la proteına VP1 del VFA deserotipo C (Mateu y col. 1990). MARLS fue seleccionado a partir de la poblaci on C-S8c1p213(Charpentier y col. 1996a). Presenta el cambio de aminoacido L144S en la proteına VP1 (Baranowskiy col. 1998; Charpentier y col. 1996a). La eficacia biologica relativa de este clon es de 25 veces la

del clon C-S8c1 (Garcia-Arriaza y col. 2005).

C-S8p200p5d, denominado a lo largo de esta Tesis tambien ”poblacion tipo-MARLS”:es la poblacion derivada de someter el virus C-S8p200 a 5 pases a baja multiplicidad de infeccion(diluyendo 1000 veces el virus antes de cada pase).

C 922: es un virus resultante de realizar 22 pases placa a placa a partir de la poblacion C-S8p2(Escarmis y col. 1996).

Linaje RA: el clon MARLS fue pasado a alta MDI en presencia de concentraciones crecientes deRibavirina (1-β -D ribofuranosil-1, 2, 3- triazol- 3 carboxamida, R), tal como se indica en Resultados5.4 y en la Figura 32. Estos virus se denominan como RA, seguido de una p y el n umero de pase:RAp35, RAp44, etc.

RA0p35: es la poblacion RAp30 (MARLS pasado 30 veces a alta MDI en presencia de R) some-tida a 5 pases adicionales a alta MDI en ausencia de R.

CAp35: es el clon MARLS pasado a alta MDI 35 veces en ausencia de R.

Sin-drogap1, Sin-drogap25: son las poblaciones obtenidas tras pasar el clon C-S8c1, 1 y 25veces respectivamente, a alta MDI en ausencia de droga.

FUp1, FUp25: son las poblaciones obtenidas tras pasar el clon C-S8c1, 1 y 25 veces respectiva-mente, a alta MDI en presencia de 200µg/ml de 5-florouracilo (FU).

AZCp1, AZCp25: son las poblaciones obtenidas tras pasar el clon C-S8c1, 1 y 25 veces, respec-tivamente, a alta MDI en presencia de 10µg/ml de 5-azacitidina (AZC).

C-S8p3FUG: es la poblacion que se obtiene al pasar el clon C-S8c1 3 veces a alta MDI enpresencia de FU [200µg/ml] y de clorhidrato de guanidinio (G) [4mM]. Esta poblacion se considerauna poblacion preextincion, ya que es la ultima poblacion de la serie de pases de la cual se puedeextraer virus infeccioso y material genetico viral amplificable por RT-PCR.

4.3. Infecciones

4.3.1. Infecciones en medio lıquido de monocapas celulares

Los metodos de infeccion de celulas BHK-21 y CHO en medio lıquido han sido descritos en(Baranowski y col. 1998; Domingo y col. 1980). Brevemente, en el protocolo estandar se infectaron2-4 x 106 celulas con 1 x 105 a 2 x 107 PFUs de virus. Tras una hora de adsorcion a 37o C enuna atmosfera con 7 % de CO2 y 98 % de humedad (condiciones de ambiente identicas para elcrecimiento de celulas e infecciones por virus), se retiro el sobrenadante (con el virus no adsorbido)

41



y se anadio medio DMEM con 1 % de SBF, incubandose en las mismas condiciones hasta observarefecto citopatico (e.c.p.) completo (despegue de la monocapa) o hasta que hubieran transcurrido72 horas. Todas las infecciones incluyeron monocapas tratadas en paralelo pero sin virus paracomprobar la ausencia de contaminacion (control negativo).

4.3.2. Plaqueo de virus en medio de agar semisolido en celulas BHK-21

Se han aplicado los metodos de titulacion viral por plaqueo de virus en medio de agar semisolidoen celulas BHK-21 previamente descritos (Baranowski y col. 1998; Domingo y col. 1980). Se infec-taron varias monocapas conteniendo 2-4 x 106 celulas, con diluciones crecientes de virus procedentede cultivos celulares o sueros de raton. Tras una hora de adsorcion a 37o C, se retiro el sobrenadantey se anadio agar semisolido a una concentracion del 0,5 % en medio DMEM con 1 % de SBF y 1 %de dietilaminoetil (DEAE)-dextrano. A continuacion se incubo a 37o C durante 24 horas. Despuesde la incubacion se fijaron las celulas con formaldehıdo 2 % y se tineron las monocapas fijadas concristal violeta (2 % cristal violeta en formaldehıdo 2 %).

4.3.3. Correccion del tıtulo en los plaqueos de las poblaciones de defectivos que in-fectan por complementacion de dos tipos de partıculas

Los tıtulos virales (en PFU/ml) para virus estandar (ST) se calcularon del modo habitual, esdecir mediante la formula: Tıtulo = (no placas contadas / dilucion del virus) x volumen de virusempleado. En el caso de que la produccion de placas dependa de la coinfeccion de una celula pordos tipos de partıculas (como es el caso de los genomas defectivos que se complementan, estudiadosen esta Tesis Doctoral), el calculo del numero de partıculas vıricas infectivas individuales a partirdel numero de PFU requiere la siguiente correcion: Supongamos una poblacion viral compuestapor n partıculas infecciosas. En un virus ST la n corresponderıa con el tıtulo viral o PFUs. Si lapoblacion de n partıculas esta compuesta por dos tipos de partıculas (tipo A y tipo B), y se necesitala coinfeccion de una celula con al menos una partıcula de cada tipo para producir una infeccion,entonces las PFUs no se relacionan directamente con la n. La relacion entre las PFU y n es lasiguiente:

Basandonos en las probabilidades del modelo publicado por (Manrubia y col. 2006), sean0 = numero de partıculas vıricas infecciosas.N = numero de celulas totalesP F U = numero de placas contadas en una monocapa (observadas)

yn0

2, numero de partıculas de tipo A

1

N , probabilidad de que una partıcula de tipo A entre en una celula concreta

dada una cantidad inicial de partıculas n0 (mitad de tipo A, mitad de tipo B), se obtienen lasPFUs n0

2

n0

2

N = P F U (1)

simplificando,

n20

4N = P F U (2)

de ahı,

42



n0 =√

4N P F U (3)

Una vez obtenida la cantidad real de partıculas vıricas infecciosas (n0), se puede calcular eltıtulo como en el caso de un virus estandar; es decir:

tıtulo ( partıculas infecciosas/ml) = n0 volumendilucion

(4)

(ejemplo, volumen es 5 si se aplican 200µl a la monocapa, ya que en 1ml hay 5 veces 200µl).

4.3.4. Pases placa a placa de clones del VFA

Los pases placa a placa de VFA se han descrito por (Escarmis y col. 1996). Tras el plaqueo del

virus en celulas BHK-21 en medio de agar semisolido, el virus contenido en una placa aislada seresuspendio en 500µl de DMEM. La suspension viral se volvio a plaquear y se repitio el proceso elnumero de veces deseado.

4.3.5. Ensayo de centros infecciosos

Se infectaron monocapas de celulas BHK-21 confluentes a alta MDI (1-50) con diferentes po-blaciones o clones virales. Tras 1h de adsorcion las celulas se lavaron con tampon fosfato pH=6.0(para eliminar virus extracelular) y 2 veces con DMEM, se despegaron por tratamiento con tripsi-na (Difco) y se recogieron en un tubo. Una alıcuota se separo para contar celulas en la camara deNeubauer. Las celulas restantes se resuspendendieron en el volumen deseado de DMEM con 1 % desuero. A partir de este punto se procedio a utilizar las celulas como si fueran poblaciones virales,aplicandolas a monocapas de celulas BHK-21 tal y como se indica en 4.3.2.

4.4. Curvas de crecimiento viral

Las curvas de crecimiento viral se determinaron como se describe en (Baranowski y col. 1998),con ligeras modificaciones. Se infectaron monocapas celulares confluentes de BHK-21 (1 x 106

celulas) con el mismo numero de PFUs de los virus cuyo crecimiento se quiso comparar (1 x 10 4

PFUs). Despues de una hora de adsorcion las monocapas se lavaron con tampon fosfato 0.1M de pH6.0 y con DMEM y se anadio 1ml de DMEM con 1 % de SBF. A diferentes tiempos postinfeccion serecogieron alıcuotas del medio de cultivo para la determinacion del tıtulo viral mediante un ensayode plaqueo en medio de agar semisolido en celulas BHK-21 (seccion 4.3.2). La curva de crecimiento

representa el tıtulo viral (PFUs/ml) a los distintos tiempos postinfeccion.

4.5. Cuantificacion de celulas BHK-21 y analisis de viabilidad

Un volumen de celulas resuspendidas en DMEM se mezclo con un volumen igual de azul tripano(previamente calentado a 37oC); 10µl de la mezcla se anadieron a la camara de Neubauer paracontaje de las celulas al microscopio optico. Las celulas muertas se observan al microscopio con elcitoplasma tenido de color azul. Tras contar cuatro cuadrıculas grandes de la camara y calcular unpromedio, el numero de celulas se obtiene de:

No celulas/ml = celulas contadas x 2 (dilucion en azul tripano) x 104

43



4.6. Ensayo de virulencia

La virulencia para BHK-21 se define en la presente Tesis Doctoral como el mınimo numerode PFUs necesarias para lisar 104 celulas BHK-21 en un tiempo determinado. Se determino lavirulencia de varias poblaciones virales y clones biologicos a distintos tiempos postinfeccion. Paraello se infectaron pocillos de placas de 96 pocillos (104 celulas por pocillo) con diluciones seriadas delos virus, a distintos tiempos postinfeccion se fijaron las celulas con formaldehıdo 2 % y se tineronlas monocapas fijadas con cristal violeta (2 % cristal violeta en formaldehıdo 2 %). El procedimientoes el descrito anteriormente (Garcia-Arriaza y col. 2004; Herrera y col. 2007)

4.7. Ensayo de virulencia-interferencia

Este ensayo es equivalente a un ensayo de virulencia centrado s olo en un tiempo (12 o 24h) yrealizando infecciones a partir de diluciones seriadas de celulas obtenidas en un ensayo de centrosinfecciosos. Tras repartir en placas de 96 pocillos diluciones de celulas previamente infectadas(centros infecciosos), se dejaron reposar las celulas en los pocillos durante 30 min., posteriormentese anadio medio, tal como se ha descrito en la seccion 4.3.2 para plaqueos con medio de agar

semisolido.

4.8. Purificacion de virus

Las partıculas virales de C-S8c1 fueron purificadas tal como se describe en (Diez y col. 1990). Losviriones provenientes de una infeccion se purificaron parcialmente por ultracentrifugacion a travesde un colchon de sacarosa al 20 % en TNE (Mateu y col. 1987) (la composicion de los tampones sedecribe en 4.22).

4.9. Anticuerpos monoclonales y policlonales

SD6: ACM producido en raton (Mateu y col. 1990; Mateu y col. 1987). Reconoce sitio antigenicoA situado en el bucle GH de la proteına VP1 de la capsida del VFA. El epıtopo reconocido eslineal. No presenta reactividad cruzada con anticuerpos de reconocimiento del sitio conformacionalD (Lea y col. 1994). En los ensayos de inmunofluorescencia, 5C4 se utilizo a una dilucion 1:500 delsobrenadante de un cultivo de hibridoma confluyente.

5C4: ACM producido en raton (Lea y col. 1994). Reconoce el sitio antigenico D y define unepıtopo conformacional localizado en subunidades pentamericas que forman la capsida. Reconocepentameros de la capsida o estructuras de orden superior (capsida, poliproteına plegada) (Lea y col.1994; Saiz y col. 1994). No presenta reactividad cruzada con los anticuerpos de los que disponemosque reconocen el sitio A. En los ensayos de inmunofluorescencia, 5C4 se utiliz o a una dilucion 1:2000del sobrenadante de un cultivo de hibridoma confluente.

Anticuerpos policlonales (APC) α-3D, α-2C, α-L: APCs producidos en conejo, y que reconocen,respectivamente, a las proteınas 3D, 2C y L del VFA. Fueron utilizados a una dilucion 1:500 eninmunofluorescencias dobles, junto con los ACMs SD6 y 5C4.

Anticuerpos secundarios:

Cabra anti-conejo: rojo Alexa 555

Cabra anti-conejo: verde Alexa 488

Cabra anti-raton: rojo Alexa 555

Cabra anti-raton: verde Alexa 488

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Cabra anti-raton: rojo lejano Alexa 647

Fueron adquiridos de Invitrogen y se utilizo una dilucion 1:500 de todos los anticuerpos secun-darios.

4.10. Tecnicas utilizadas en experimentos con ratones C57BL/6Los ratones C57BL/6 se compraron en Harlan Interfauna Iberica, S.L. Los ratones se mantu-

vieron en condiciones libres de patogenos y se les permitio aclimatarse al nivel 3 de bioseguridad(NBS3) en el animalario del Centro de Investigacion en Sanidad Animal, INIA, Madrid, durante 1semana antes de ser utilizados en los experimentos. Se emplearon hembras de 8-10 semanas. Todoslos experimentos con animales vivos se realizaron siguiendo la normativa de la Comunidad Europea(86/609) y fueron aprobados por el comite etico del Centro.

4.10.1. Infecciones in vivo con ratones C57BL/6

Los ratones fueron inoculados en la almohadilla plantar de la pata trasera izquierda, mediante

inyeccion subcutanea, con 107 PFU de los virus C-S8p3d y C-S8c1, y 107 o 103 PFU del virus C-S8p260. Varios animales fueron inoculados con PBS como control negativo. En todos los casos losanimales fueron inoculados con un volumen total de 50µl. Los animales se examinaron diariamentebuscando sıntomas clınicos.

4.10.2. Sangrado de animales

Los animales fueron sangrados por la cola practicandoles una incision en la vena con un bis-turı esteril, y cambiando de bisturı con cada animal para evitar contaminaciones cruzadas. En cadasangrıa se extra jo un maximo de 300µl de sangre por animal.

4.10.3. Extraccion de sueroEl suero se separo de la fraccion celular mediante centrifugacion, 3 min. a 5.000 revoluciones

por minuto (r.p.m.). Se retiro el sobrenadante descartando el sedimento celular.

4.10.4. Ensayos de seroneutralizacion

Se obtuvo un preparado del clon de VFA C-S8c1 a una concentraci on tal que al plaquearlo enen medio con agar semisolido en una placa p60, se obtuvieran aproximadamente 100 placas de lisis.Dicho preparado se mezclo con concentraciones decrecientes de sueros de ratones, en una relacionde volumen 1:1. El PRN70 se calcula como el recıproco del logaritmo de la concentracion en laque se obtiene un 70 % de reduccion del numero de placas. Como control positivo de neutralizacion

se utilizaron varias diluciones de sobrenadante de hibridoma del anticuerpo SD6, y como controlnegativo diluciones de un suero irrelevante.

4.10.5. Ensayo de ELISA

Se detectaron anticuerpos anti VFA en suero de ratones mediante ELISA tal como se describe en(Novella y col. 1993). Se tapizaron placas de 96 pocillos de cloruro de polivinilo (Flow Laboratories)a 4oC durante la noche, con C-S8c1 purificado por ultracentrifugacion a traves de un colchon desacarosa (Mateu y col. 1987; cantidad de antıgeno equivalente a 100 ng de VP1). Los sueros deraton se diluyeron en PBS/3 % ovoalbumina y se analizo la presencia de anticuerpos IgG, usando

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anticuerpos de cabra anti IgG de raton unidos a peroxidasa de rabano (BioRad). Como substratode la peroxidasa se utilizo o-fenilendiamina-H2O2 (OPD) y se determino la absorbancia a 490 nm.Los tıtulos se dan como el recıproco de la dilucion mas alta que dio una lectura de absorbanciamayor de 200. Los controles sin infectar fueron negativos en la dilucion mas baja ensayada (1:10).

4.11. Extraccion de RNA vırico

4.11.1. Extraccion de RNA vırico extracelular

El RNA fue extraıdo a partir de 150 µl del sobrenadante de infeccion de monocapas celularesutilizando Trizol (Gibco). El sobrenadante se mezclo con 400 µl Trizol y se incubo 5 minutos atemperatura ambiente; se anadio cloroformo (100 µl por cada 150 µl de sobrenadante), se agito yse incubo 10 minutos a temperatura ambiente. Tras centrifugacion de 15 minutos a 12.000 r.p.m.(14.819 x g), se separaron las dos fases y los acidos nucleicos se recuperaron de la fase acuosa porprecipitacion con isopropanol.

4.11.2. Extraccion de RNA vırico intracelular

Para la extraccion del RNA intracelular, las monocapas se lavaron previamente con tamponfosfato pH 6.0 y medio de cultivo con el fin de eliminar virus no adsorbido. Posteriormente seanadieron 400µl de Trizol directamente sobre la monocapa, y se extrajo el RNA tal y como seindica en el apartado anterior.

4.12. Obtencion de cDNA y amplificacion por RT-PCR del RNA viral

Para la reaccion de transcripcion inversa del RNA viral (obtencion del cDNA a partir del RNAdel VFA) se empleo la retrotranscriptasa del virus de la mieloblastosis aviar AMV-RT (Promega).Las reacciones de amplificacion por PCR del cDNA se llevaron a cabo utilizando Ampli-Taq poli-

merasa (Perkin Elmer). En ambos casos se siguieron las instrucciones facilitadas por el fabricante,realizando el proceso de amplificacion por RT-PCR en un solo paso en el tampon y concentracionde Mg2+ optimos para la Ampli-Taq. Este tipo de amplificacion se utilizo cuando existıa riesgo defalsos positivos debido a recombinacion en la PCR.

Para algunas amplificaciones se empleo la DNA polimerasa termoestable EHF (Expand HighFidelity, Roche), que es una polimerasa de alta fidelidad de copia, con actividad correctora de errores3’→5’ exonucleasa. Tambien en este caso se realizo el proceso de RT-PCR en un solo paso con eltampon y concentracion de Mg2+ recomendados por el fabricante. Para aumentar la eficiencia en laamplificacion, en algunos casos se utilizo la retrotranscriptasa Transcriptor (Roche) para obtenercDNA en una reaccion independiente. Posteriormente el cDNA se utilizo como sustrato para unaPCR con Ampli-Taq polimerasa.

Regiona Oligonucleotidob Secuencia (5’→ 3′)c Orientaciond Posicione

FRAGMEN-

TO SSR3 TTGAAAGGGGGCGCTAGGGTC S 1

SD3 CAGCGCTAACAACCAAGTAG A 236SD4 TGAAAGGCGGGTTCGGGTG A 367

PSEUDO-

NUDOSCS8NR2 CCCTAAGTTTTACCGTCTGTCCCG S 368

continua en la pagina siguiente

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IRES ND2new TGTTACCAAGGAGGAGTTCC A 759ND1 AAACCGAGCGCTTTTATAG A 973

LR1L CGGAGGTCGGCACCTTTCCTTTAC S 1002ND5 CCGAGCTCAGGGTCATTAATTG A 1038

Proteasa

LLR1 GCTGTGGTAAACGCCATCA S 1063

[417+3 back GGAACAAATACCTTTTTCTCGCCG A 1143

[417+3 idaCACGACGGCGAGAAAAAGG-TATTTGTTCCA

S 1138

[417-3 backGGAACAAATACCAGGATCT-CGCCGTCG

A 1140

[417-3 idaTACACGACGGCGAGATCCT-GGTATTTGTTCCATACG

S 1136

Del 417 idaACGACGGCGAGAAAATGGT-ATTTGTTCCATACG

S 1139

Del 417 backCGTATGGAACAAATACCAT-

TTTCTCGCCGTCGTGTAGCA 1134

LD4 TCTCGGGCGAATTGTAGACCCAG A 1267

LR2newCACAGGGTTGGAGTTGCGC-GAGGGTG

S 1305

LD2 CAGCAAGACACATGTCCGT A 1444LR2 GGACAGGAACACGCTGTCT S 1471LU1 CTACCCATGGACGCCAGACCCG S 1539

LD1L GCCTTCCACCCTTCATTGAGTGGC A 1619VP4 4R1 CACTGGCAGCATAATTAAC S 1692

1810st-new GTGTTGGTTGTGTGTGCAG A 18084D1new TTGTTCTGGGTGTTGGTTGTGTG A 1835

4D1 AACCAGTCGTTGGTCTGG A 1844VP2 2R1new CTGGTCTAGAGACGCGCGTTCATC S 2042

MA4 CAACCTTGTGCATGTGTCC A 21402R3 CAAGTGCCCAACAGATC S 2471

2R3new CAGGTGCCCAACAGATCAAAG S 2471VP3 EDVP3new AGTTGTCACCATGTTGCCGTAAC A 2601

EDVP3 CAGTTGTCACCATGTTGCC A 2602

3R1EcoRInewCACGAATTCACGGGCAAAGG-CTACTGG

S 2744

3R1EcoRI CTGGCCGAATTCGACGTGTCGCTG S 27673D1 GTAGTACTGGGCCAAGCCGGCC A 2841

JD5 CGTACGCCACCATGTACCG A 2923JD5new GCAGGTACGCCACCATGTACCGAG A 2926

3D2 CTGCGTGTATGCAGTGGGCAGCC A 29833R2new CTTTGAGCTCCGGCTACCTGTG S 3171

3R2newbis GAGCTCCGGCTACCTGTGGA S 31753R2 CCTGTGGACGCTAGACA S 3187

VP1 NK26 GACCTTCACAAACCGG A 3333MARLS-Vp1 CACGTACTATTTTTCTGATTTG S 3414

200-Like CACGTACTACTTTTCTGATCTG S 3414

continua en la pagina siguiente

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AV1new GGATTGGTTGTGTTGTTAAGTGC A 35181R1L ACACCGTGTGTTGGCTACGGCG S 3573ED3 CTGCACCAAAGTTGAACGAT A 3697JH1 GCACGCTTCATGCGCAC A 3743

VP1/2B pUL GAGAAGAAGAAGGGCCCAGGGTTG A 3896

2B 2BR1 TTGGTGTCTGCTTTTGAGGAAC S 39882BD1 CAAACGTGCTGTCCAGAATCTC A 4189

2C 2CD1 CTCTTCTGAGGCGATCCATGC A 45042CR1 AGAGCGGGAACGTCCATATTG S 4580

2CD2new GGGCAGTACCAAACAGAATCG A 47692CR2 GGCAAACCCTTCAGCAGTAAG S 4924

3A 3AR1 AAAGGCCAACACGAGGCAGC S 53445531wt ACATTGTCATCATGATCCGCGA S 5510

5531wtnew GTCATCATGATCCGCGAGA S 55155531C 922new GTCATCATGATCCGCGCGA S 5515

3AD2 GCCTTCTGACCTGGAAGAGTTC A 5699

3C 5’3C ATGAGTGGTGCCCCACCGACCGAC S 59713CD1 CATGACCATCTTTTGCAGGTCAG A 60093CR1 CCCCCGTCGTTGGCGTGATTAAC S 63083’3C CTCGTGGTGCGGTTCAGGGTC A 6609

3D 5’3D GGGTTGATCGTTGATACCAGAGA S 66103DR3 CAAAGATGTCTGCGGAGGACAA S 6800

B2new CACTGCAGCGATGCCATGAACATC S 7351AV3 TTCATGGCATCGCTGCAGTGG A 7370

AV2new TGTGGAAGTGTCTTTTGAGGAAAG A 77833DR2 GGACTCGCCGTCCACTCCGGAC S 7894

3’ UTR R-end

TTTGGATTAAGGAAGCGGGA-

AAAGCCC A 8115Tabla 2: Oligonucleotidos sinteticos empleados para laamplificacion, secuenciacion y cuantificacion de lasdiferentes poblaciones virales y plasmidos.a Region genomica correspondiente al clon VFA C-S8c1 don-de se localiza el oligonucleotido, segun el mapa de la Figura5. en la introduccion.b Identificacion del oligonucleotido con el nombre empleadoen el texto.c Secuencia del oligonucleotido en sentido 5′ → 3′. En negritase muestran los cambios de nucleotido respecto a la secuenciade C-S8c1. Los oligonucleotidos que amplifican especıficamen-te virus mutantes tienen marcadas en rojo las posiciones queconfieren especificidad (ver Tabla 3).d S, sentido; A, antisentido.

Cuando se partio de escasa cantidad de molde, la amplificacion se realizo mediante PCR anidada(dos PCRs sucesivas) con la enzima polimerasa Ampli-Taq (Perkin Elmer), siguiendo las instruc-

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ciones del fabricante y protocolos estandar (Sambrook Russell, 2001). Los productos amplificadosse analizaron por electroforesis en un gel de agarosa al 1 % y tincion con bromuro de etidio o SybrSafe (Invitrogen). En la Tabla 2 se describen los oligonucleotidos empleados en la amplificacion delRNA de poblaciones virales y de los plasmidos que contienen genomas con deleciones (descritos enla seccion 4.19).

4.13. Purificacion de fragmentos de PCR

Los productos de amplificacion por PCR se separaron mediante electroforesis en geles de agarosaSea-Plaque, de bajo punto de fusion (Cambrex), en tampon TAE. El DNA de la banda deseadase purifico mediante cromatografıa de afinidad usando el kit Wizard PCR Preps DNA PurificationSystem (Promega) o el kit GeneClean (Bio 101), siguiendo las instrucciones del fabricante. El DNAse cuantifico por tincion con bromuro de etidio o Sybr Safe en geles de agarosa y comparaci onde la intensidad de la banda con marcadores de concentraci on conocida. Cuando fue necesarioeliminar solo los oligonucleotidos y dNTPs no incorporados, los fragmentos de DNA sintetizadospor RT-PCR se filtraron a traves de membranas de Microcon (Millipore).

4.14. Cuantificacion de RNA vırico

La cuantificacion de RNA vırico se realizo mediante el metodo de RT-PCR cuantitativa a tiemporeal con el Light-Cycler (Roche). La reaccion de amplificacion que se utiliza lleva un fluoroforo quese une de manera especıfica al DNA de doble banda. En cada ciclo de amplificacion se mide lafluorescencia emitida. El ciclo de la reaccion en el que la amplificacion pasa a ser exponencial esinversamente proporcional a la cantidad de molde inicial. La cuantificacion de RNA de las muestrasse determino por extrapolacion de los valores obtenidos en una curva patron realizada en paralelo,con RNA transcrito del plasmido pMT-28 que contiene el genoma de C-S8c1, cuya concentracionfue determinada mediante densidad optica a 260nm. La curva de fusion del producto obtenido en laPCR cuantitativa permite discriminar entre productos artefactuales de diferente peso molecular yel producto especıfico. Los oligonucleotidos empleados para la cuantificacion de los RNAs tambiense incluyen en la Tabla 2.

Se utilizaron los kits LightCycler RNA Master SYBR Green I y LightCycler RNA Amplifica-tion kit SYBR Green I (Roche), para la amplificaci on y cuantificacion de fragmentos pequenos(<500 pb) y grandes (>500 pb), respectivamente. En el caso del kit RNA Master se siguieron lasinstrucciones facilitadas por el fabricante, optimizando la concentracion de Mn2+. La mezcla dereaccion se preparo en un volumen final de 10 µl que incluyo tampon de reaccion, dNTPs, 25 ngde cada iniciador, 3mM Mn[OAc]2, la sonda SYBR Green I y la polimerasa Tth. La polimerasaTth es una enzima termoestable que posee actividad retrotranscriptasa y polimerasa, permitiendola combinacion de retrotranscripcion y PCR en la misma mezcla de reaccion. La polimerasa Tthesta unida a aptameros, que son oligonucleotidos que se unen al centro activo de la polimerasa yevitan la union de los acidos nucleicos a temperaturas debajo de la temperatura optima de la Tth.A altas temperaturas la enzima se libera de los apt ameros y se inicia el proceso de retrotranscrip-cion. Las condiciones de amplificacion incluyen un primer ciclo de retrotranscripcion (61oC durante20 min.); un ciclo de desnaturalizacion (95oC, 2 min.); 45 ciclos de amplificacion (95oC, 5 seg.;temperatura de hibridacion del iniciador, 5 seg. y 72oC durante un numero de segundos obtenidosde la division de la longitud del fragmento amplificado por 25). En el caso del kit RNA Amplifica-tion Kit se siguieron las instrucciones facilitadas por el fabricante, optimizando algunas condiciones(cantidad de MgCl2 y de Resolution Solution, una disolucion que mejora el rendimiento en moldescon elevadas estructuras secundarias). La mezcla de reaccion se preparo en un volumen final de

49



Virusa Oligont.b Oligont.c Temperaturad Especificidade

sentido antisentido hibridacion

C-S8p260p3d Lu1 1810st-new 70oC-5” Mutacion puntual

72oC-10” 1810st-newC-S8p260∆999 3R1-EcoRI PUL 50oC-5” Tamano

72oC-5” del fragmentotipo-MARLS MARLS-Vp1 ED3new 60oC-5” 2 mutaciones

70oC-11” puntualesMARLS-Vp1

tipo-p200 200-like ED3new 66oC-5” 2 mutaciones

70oC-11” puntuales

200-like

C922 5531-C9.22 new 3CD1 68oC-5” Mutacion puntual

72oC-13” 5531-C9.22new

Tabla 3: Parejas de oligonucleotidos iniciadores empleados en las amplificaciones

especıficas de virus mutantes.aPoblaciones virales discriminadas positivamente mediante las amplificaciones especıficas indicadas.b Oligonucleotido que hibrida con la cadena positiva del RNA deVFA.c Oligonucleotido que hibrida con la cadena negativa del RNA deVFA.d El primer y segundo valor de cada fila hacen referencia a la temperatura y tiempo (en segundos),respectivamente, empleados en el ciclo de hibridacion de los oligonucleotidos durante la PCR. Eltercer y cuarto valor hacen referencia a la temperatura y tiempo de elongacion, respectivamente.e La especificidad de los iniciadores se basa en las diferencias geneticas indicadas. La secuencia ymutaciones de los oligonucleotidos basados en mutaciones puntuales se detalla en la Tabla 2.

20 µl que incluyo tampon de reaccion, dNTPs, 25 ng de cada iniciador, 6mM de MgCl2, 4 µl deResolution Solution, la sonda SYBR Green I y las polimerasas AMV-RT y Taq. Las condicionesde amplificacion fueron similares a las descritas para el RNA Master, salvo que el primer ciclo deretrotranscripcion se realizo a 55oC durante 30 min.

4.15. Diseno de iniciadores para la amplificacion especıfica de mutantes virales

La amplificacion de RNA con secuencias especıficas que diferıan en 1 o 2 nucleotidos respecto alRNA estandar se realizo con iniciadores especıficos de cada secuencia (Tabla 3). Los iniciadores sedisenaron con el nucleotido discrepante (y especıfico de cada secuencia), situado en la antepenulti-ma posicion (contada en sentido 5’

→3’). Los iniciadores fueron ensayados a diferentes temperaturas

hasta conseguir especificidad de amplificacion con un exceso de entre 102 o 103 veces de secuenciascontaminantes. Para la amplificacion especıfica de la poblacion C-S8p260 se disenaron unos inicia-dores flanqueantes a la delecion de 999nt, de tal modo que en la secuencia especıfica se generaraun amplicon de 140 nt y en la secuencia contaminante uno de 1139nt (Tabla 3). Dada la bajaprocesividad de la polimerasa Tth presente en el kit de amplificacion a tiempo real, la secuencia de1139 nt nunca llego a amplificarse, obteniendose una reaccion 100 % especıfica, al menos hasta loslımites ensayados.

50



4.16. Cineticas de produccion de RNA vırico

Se infectaron en paralelo monocapas celulares confluentes de BHK-21 (1 x 106 celulas) con elmismo numero de PFUs de los virus cuyo crecimiento se quiso comparar (C-S8p260 y C-S8p260p3d).Los virus se infectaron en monocapas independientes o en mezcla, coinfectando la misma monocapa,dependiendo del ensayo. Las infecciones se realizaron con una MDI = 20 PFU/celula para evitarposibles alteraciones de medicion por segundas rondas de infeccion. Despues de una hora de adsor-cion se retiro el inoculo viral y las monocapas se lavaron con DMEM, tras los lavados se anadio 1mlde DMEM con 1 % de SBF. Para extraer el RNA intracelular, a diferentes tiempos postinfeccionse retiro el medio de cultivo de las celulas y se lavaron las monocapas con tampon fosfato 0.1M,pH 6.0 y con DMEM; tras los lavados se anadieron 400 µl de Trizol (Gibco) directamente sobre lascelulas. Se recogieron las celulas con el Trizol y se continuo el protocolo como en una extraccionde RNA estandar (apartado 4.11). Cada tiempo y cada replica de la cinetica se determino a par-tir de una monocapa independiente. Para medir la concentracion de RNA extracelular, se obtuvoRNA del sobrenadante de las monocapas de las que se extrajo el RNA intracelular, como se indicaen el apartado 4.11.1. Cuando cada virus infecto una monocapa independiente, el RNA vırico sedetermino mediante RT-PCR a tiempo real utilizando los iniciadores A-U (Tabla 2), que permitenmedir la cantidad de RNA vırico total. Cuando se realizaron coinfecciones con mezclas de virus, sedetermino la concentracion de RNA de cada tipo viral mediante las amplificaciones especıficas quese detallan en la Tabla 3.

4.17. Experimentos de competicion y determinacion de la eficacia biologicarelativa o fitness

La eficacia biologica relativa de diferentes poblaciones o clones virales respecto a un virus com-petidor, o al clon inicial de referencia C-S8c1, se determino mediante experimentos de competicionen pases seriados entre los dos virus en competicion (Holland y col. 1991). Para determinar la efi-cacia biologica respecto a C-S8c1 se utilizo como referencia el virus C 922L150 (Escarmis y col. 1999)

que tiene una eficacia biologica 10 veces superior a la del clon C-S8c1. Se realizaron infecciones aalta y a baja MDI. Se infectaron monocapas de celulas BHK-21 con MDI de entre 9,4 y 0,005 demezclas del virus problema y el virus de referencia, o de dos virus competidores en proporcionesiguales. Cuando el e.c.p. fue completo se recogio el sobrenadante de infeccion, se diluyo hasta obte-ner la MDI deseada y se empleo para infectar una nueva monocapa de celulas BHK-21. El procesose repitio hasta un total de 4 infecciones sucesivas (pases). A continuacion se extrajo el RNA viraldel inoculo inicial y del sobrenadante de infeccion de cada uno de los pases. Con los oligonucleoti-dos descritos en las Tablas 2 y 3 y mediante RT-PCR cuantitativa, se calcul o especıficamente lacantidad de RNA viral de cada virus en cada pase y en el inoculo inicial y se calculo la relacionentre ellos en cada pase. La representacion logarıtmica de la proporcion de los dos genomas quecompiten frente al numero de pases, da una curva cuya pendiente se toma como valor de eficaciabiologica relativa (Duarte y col. 1992; Holland y col. 1991) (ver Introduccion, seccion 2.2, Figura3) .

4.18. Tratamiento con RNAasa

El sobrenadante de una infeccion se incubo durante 1 hora con 4µgr/ml de RNAasa A pan-creatica (Boehringer) como se especifica en (Escarmis y col. 1998).

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4.19. Clonaje Molecular

4.19.1. Clonaje molecular de la region no estructural del VFA pase 260

La region codificante de proteınas no estructurales del VFA se clono en los plasmidos quecontenıan las deleciones presentes en el pase 260 (∆417, ∆999) y las mutaciones propias de la

zona estructural. Para obtener la zona no estructural completa se utiliz o como molde para lasamplificaciones por RT-PCR, RNA procedente de la poblacion viral C-S8p260p3d. Se amplifico casila totalidad de la zona no estructural con las parejas de iniciadores 2BD1-3CD1 y 3AR3-AV2new(Figura 10). Para evitar o limitar las mutaciones artefactuales en la PCR, se utilizo la enzimaPfu, una polimerasa de alta fidelidad (Cline y col. 1996). Los fragmentos resultantes de las dosamplificaciones se mezclaron en concentraciones equimolares y se amplificaron con los iniciadoresexternos 2BR1-AV2new, mediante la tecnica de recombinacion en la PCR. El producto resultantese purifico tras electroforesis en un gel de agarosa y se purifico como se indica en la seccion 4.13.Posteriormente el fragmento se digirio con las enzimas BglII (que corta en la posici on 4201) yBamHI (posicion 7427). El tratamiento del DNA con enzimas de restriccion (New England Biolabs)se llevo a cabo siguiendo las especificaciones del proveedor. Los fragmentos de DNA obtenidos

se purificaron como se describe en la seccion 4.13 y se ligaron a los plasmidos pMT28∆417 ypMT28∆999 (Garcia-Arriaza y col. 2004), previamente digeridos con BglII y BamHI, empleandola T4 DNA ligasa (Roche). Para impedir la religaci on del vector, previamente se elimino el grupo5’ fosfato de los extremos del vector por tratamiento con fosfatasa alcalina (USB). Los plasmidosresultantes se denominaron pMT260∆417ns y pMT260∆999ns.

4.19.2. Construccion de plasmidos con la delecion ∆417 desplazada 3 nucleotidoshacia el 5’ o 3’ del RNA

Para desplazar la delecion ∆417 tres nucleotidos respecto a su posicion en C-S8p260 se utilizaronoligonucleotidos mutagenicos que contenıan la secuencia de la delecion desplazada de su sitio inicial

(Figura 11). El plasmido pMT260∆417ns se utilizo como molde para las amplificaciones (Figura 12-A). Para generar la delecion desplazada hacia el 3´ del RNA (+3nt) se utilizo la pareja de iniciadores[417+3ida-Jd5new y [417+3 back-NR2. Para generar la delecion desplazada hacia el 5´ del RNA (-3nt) se utilizaron las parejas de iniciadores [417-3ida-Jd5new y [417-3 back-NR2. Los dos productosde amplificacion se unieron en cantidades equimolares mediante la tecnica de recombinacion en laPCR, usando los iniciadores externos NR2 y JD5new. El producto de la amplificacion resultantese digirio con las enzimas HpaI (posicion 436) y SphI (3661). El fragmento digerido se purifico y seligo al plasmido pMT260∆417ns previamente digerido con las mismas enzimas y defosforilado, taly como se indica en el apartado anterior.

4.19.3. Construccion de un plasmido con la delecion ∆417 en el contexto de C-S8c1

Para generar de novo la delecion ∆417, se utilizaron iniciadores mutagenicos que generan unfragmento de PCR con la delecion deseada (ver Figura 11). Para las amplificaciones se utilizo DNAdel plasmido pMT28 como material de partida, que contiene una copia de cDNA del clon de VFA C-S8c1 (Figura 12-B). Para la amplificacion se utilizaron las parejas de iniciadores Del417ida-Jd5newy Del417back-NR2. Estos dos fragmentos se unieron mediante la tecnica de recombinacion en laPCR mezclando cantidades equimolares de cada uno, usando como iniciadores externos NR2 yJD5new. El producto de la amplificacion resultante se digirio con las enzimas HpaI (posicion 436)y SphI (posicion 3661). El fragmento digerido se purifico y se ligo al plasmido pMT28 previamentedigerido con las mismas enzimas y defosfatado.

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V P 4

VP2 VP3 VP1

2A

2B 2C 3A

3B

3C 3D

VPG

PoliC

AA.. AL C-S8c1p260p3d

2BR1

(3998)

AV2new

(7783)

3AR3

(5704)

3CD1

(6009)

BglII

(4201)

BamHI

(7427)

HpaI (436)

BglII

(4201)

2B

2C 3A

3B

3C 3D

BamHI

(7427)

Digestión con BglII/BamHI

V P 4

VP2 VP3 VP1

2A

3DL

∆999Vector Poli A Vector

2 B

V P

4

VP2 VP3 VP1

2A

L

∆417Vector Poli A Vector3D

2 B

Digestión con BglII/BamHI

Ligasa T4

V P 4

VP2 VP3 VP1

2A

2C 3A

3B

3C 3DL

∆999

2 BVector Poli A Vector

pMT28-∆999

V P 4

VP2 VP3 VP1

2A

2C 3A

3B

3C 3DL

PoliC

2 B

∆417Vector Poli A Vector

pMT28-∆417

Figura 10: Esquema del genoma de VFA y estrategia de clonaje de la zo-na no estructural (codificante de las proteınas de replicacion) del virus C-S8p2603pd. Arriba se indica el genoma de C-S8p260p3d, que se utilizo como moldepara amplificar la zona no estructural, desde 2B (posicion 3998) hasta 3D (posicion7783). Los triangulos en este genoma marcan la posicion de los iniciadores que se usa-ron para las amplificaciones. Las rayas discontinuas representan las zonas amplificadasque se juntaron mediante la tecnica de recombinacion en la PCR. Las zonas de corte delas enzimas de restriccion con las que se digirio el material amplificado se senalan conuna flecha. Entre parentesis se indican los puntos de corte de las enzimas y la posiciondonde hibridan los oligonucleotidos. Tras juntar las dos amplificaciones indicadas me-diante recombinacion en la PCR con los iniciadores externos 2BR1-AV2new y digerir

el producto resultante con BglII/BamHI, se desprende el fragmento indicado. Los dosultimos genomas representan los plasmidos pMT28∆417 y pMT28∆999 (Garcia-Arriazay col. 2004). En color se representa la zona del genoma correspondiente a C-S8p260 yen gris se representa la zona del genoma correspondiente a C-S8c1. Los plasmidos fue-ron digeridos con BglII/BamHI para ser ligados al fragmento previamente amplificadoy recomponer ası la zona no estructural del virus C-S8p260p3d. La secuencia de losoligonucleotidos empleados se describe en la Tabla 2.

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[417+3 back

[417+3 ida

[417-3 back

[417-3 ida

Del 417 back

Del 417 ida

*

*

*

*

*

*

*

*

Figura 11: Oligonucleotidos mutagenicos para clonajes moleculares medianterecombinacion en la PCR. Los oligonucleotidos aparecen apareados con la zonacomplementaria solapante que sirve de union para juntar el producto de dos PCRs. Losasteriscos representan posiciones desapareadas al hibridar con los clones derivados delVFA C-Sc1 y de pases sucesivos de C-S8c1. La lınea vertical en la pareja Del 417 iday back marca los extremos de la delecion de 417 nucleotidos que se genera al utilizarestos iniciadores.

4.19.4. Transcripcion de plasmidos

Los plasmidos descritos en la seccion anterior se linealizaron con NdeI (Biolabs). La trans-cripcion in vitro se realizo como se describe en (Baranowski y col. 1998). La mezcla de reacci oncontenıa: 40mM HEPES KOH pH 7.7, 6 mM MgCl2, 2mM espermidina, 1mM de cada ribonucleosi-do trifosfato, 10mM dithiothreitol, 0.l µg de albumina de suero bovina (BSA) por µl, 2 unidades deRNasina (Promega) por µl, 1 unidad de SP6 RNA polimerasa (Promega) por µl, y una cantidad

de DNA molde de 250ng a 1µg. La cantidad de RNA obtenida se estimo mediante electroforesis engel de agarosa por comparacion con cantidades conocidas de RNA transcrito de pMT28.

4.20. Analisis de la replicacion en celulas BHK-21 de RNAs transcritos in vivo

4.20.1. Electroporacion de celulas BHK-21 con RNAs transcritos del virus de cDNAdel genoma del virus de la fiebre aftosa

Para las electroporaciones se sembraron celulas BHK-21 (LC) provenientes de monocapas con-fluentes, a dilucion 1:3 el dıa previo a su utilizacion. Las celulas se tripsinizaron y se recogieronen DMEM 5 % SBF. Tras sedimentar las celulas por centrifugacion (2 min., 2000 rpm, 22oC), selavaron con PBS, se centrifugaron de nuevo y se resuspendieron en PBS (2,4 ml PBS/p100). Serepartieron en 400 µl por cubeta de electroporacion (BIORAD) y se mezclaron con 1 ng de RNAtranscrito a partir de cDNA de VFA. Se electroporaron las celulas aplicando 2 pulsos consecutivos:

Voltaje: 1,5 Kvoltios

Capacitancia: 25 Fd

Resistencia: infinito

Una vez electroporadas las celulas se lavaron con 800µl de DMEM 10 % SBF y tras un nuevacentrifugacion (5 min., 2000 rpm) se resuspendieron en DMEM 10 % y se sembraron en pocillos de

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V P 4

VP2 VP3 VP1

2A

2B 2C 3A

3B

3C 3D

PoliC ∆417

LPoliA

VectorVector

NR2(368)

JD5new(2923)

[417+/-3 ida

[417+/-3 back

V P 4

VP2 VP3

∆

417+3L

V P 4

V P 4

VP2 VP3

∆417-3

L

HpaI(436)

SfiI(2826)

Digestiónm de laamplificacióncon HpaI / SfiI

VP3 VP1

2A

2B 2C 3A

3B

3C 3D

PoliCPoliA

VectorVector

Ligación con ligasaT4

Digestión delplásmidocon HpaI/SfiI

+

Figura 12: Mutagenesis dirigida para desplazar 3 nucleotidos hacia el 3’ o

el 5’ del genoma la delecion de 417 nt en el plasmido pMT260∆417ns A) Elgenoma dibujado arriba corresponde al plasmido pMT260∆417ns que se utilizo comomolde para la amplificacion. Los iniciadores utilizados se representan con triangulos.Las flechas representan los oligonucleotidos mutagenicos que llevan insertada la secuen-cia que codifica la delecion ∆417 movida de sitio 3 nucleotidos. Las lıneas discontinuasrepresentan las zonas amplificadas que se juntaron con la tecnica de recombinacion en laPCR. Los puntos de corte de las enzimas de restriccion con las que se digirio el materialamplificado se senalan con una flecha. Entre parentesis se indican la zona de corte delas enzimas y la posicion donde hibridan los oligonucleotidos. Tras juntar los productosde las dos amplificaciones indicadas mediante recombinacion en la PCR con los oligo-nucleotidos externos NR2-JD5new y digerir el producto resultante con HpaI/SfiI, se

producen los dos fragmentos mostrados (uno representa la delecion movida 3 nucleoti-dos en sentido 3’, el otro en sentido 5’). Estos fragmentos se ligaron con ligasa T4 alplasmido pMT260∆417ns, previamente digerido con HpaI/SfiI, tal como se indica.

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V P 4

VP2 VP3 VP1

2A

2B 2C 3A

3B

3C 3DL

PoliCpMT-28

NR2(368)

JD5new

(2923)

del 417ida

del417 back

HpaI(436)

SfiI(2826)

V P 4

VP2 VP3L

∆417

Digestióncon HpaI/SfiI

VP3 VP1

2A

2B 2C 3A

3B

3C 3DPoliC

Vector VectorPoli A

Digestión delplásmidocon HpaI/SfiI

+Ligacióncon ligasa T4

Figura 13: Mutagenesis dirigida para generar de novo la delecion 417 en elplasmido pMT28. Clonaje molecular de cDNA con la delecion de 417 nucleotidos enel contexto de secuencia de C-S8c1. Se sigui o la misma estrategia de clonaje que enla Figura 12, pero en este caso la amplificacion inicial se realizo a partir del plasmido

pMT28. Los oligonucleotidos representados por flechas llevan insertada una secuenciaque genera la delecion de 417 nucleotidos al usarlos en una PCR. La secuencia de losoligonucleotidos empleados se describe en la Tabla 2.

placas M24.

4.20.2. Marcajes metabolicos y obtencion de extractos celulares

Para el marcaje radiactivo de proteınas en cultivos celulares se empleo la mezcla constituida por

(S35)-metionina y (S35)-cisteına (Amersham). Para ello se incubaron las celulas con los aminoacidos(60 µCi/ml) en medio DMEM carente de metionina y cisteına durante una hora. Tras este tiempo,las monocapas celulares se lavaron, se recogieron en tampon de ruptura, se hirvieron y se analizarondirectamente mediante SDS-PAGE y autorradiografıa (Perales y col. 2007)

4.20.3. Analisis de proteınas en gel de poliacrilamida y fluorografıa

El analisis electroforetico de proteınas en geles de poliacrilamida se realizo en condiciones des-naturalizantes (SDS-PAGE). Para el analisis del material marcado radiactivamente con (S35)-metionina/cisteına, los geles se fijaron en una solucion de etanol al 20% (v/v) y acido aceticoal 7,5 % (v/v). La senal radiactiva se amplificaro mediante fluorografıa incubando los geles en unasolucion de salicilato sodico 1 M durante 1 hora. Posteriormente, los geles se secaron al vacıo y seexpusieron a pelıculas autorradiograficas (Perales y col. 2007).

4.20.4. Inmunodeteccion de proteınas mediante Western-blot

Las proteınas se separaron electroforeticamente mediante SDS-PAGE y se electrotransfirierona una membrana de nitrocelulosa (BIO-RAD) en tampon de transferencia a un amperaje de 200mA durante 15 horas. La membrana se saturaro con una solucion de leche desnatada en polvo al5 % (p/v) en PBS durante una hora con agitacion suave. A continuacion, se anadio una dilucionadecuada del anticuerpo primario en PBS con leche en polvo al 0,1 %, y se incubo durante doshoras. Transcurrido este tiempo la membrana se lavo tres veces durante 15 minutos con el tampon

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TPBS y se incubo con el anticuerpo secundario correspondiente conjugado a peroxidasa (dilucion1:10.000 en TPBS). Transcurrida una hora, se repitieron tres nuevos lavados de 15 minutos conTPBS y se procedio al revelado mediante quimioluminiscencia (ECL, Amersham) (Perales y col.2007)

4.21. Secuenciacion de DNA

Para la secuenciacion de DNA se empleo el Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (ABIPrism) y el secuenciador automatico ABI377 o ABI 3700, como se ha descrito previamente (Ruiz-Jarabo y col. 2000; Sierra y col. 2000). El analisis de las secuencias se llevo a cabo con el paqueteDNA Star 4.0 (Lasergene). Cada secuencia se determino con al menos dos reacciones independientesy se secuenciaron ambas hebras del cDNA. Los oligonucleotidos empleados para la secuenciacionde DNA se detallan en la Tabla 2.

4.22. Disoluciones y tampones

Disolucion de Tripsina: 0.5 mg/ml tripsina (Sigma); 0,016 % EDTA (Merck); 0,001 % rojofenol (Merck), disueltos en PBS.

PBS (solucion salina tamponada con fosfato): 137mM NaCl (Merck); 2.7mM KCl (Merck);1.5 mM Na2HPO4 (Merck).

TAE: 40 mM Tris-acetato pH 8.3 (Sigma); 1 mM EDTA (Merck).

TBE: 0.09 M Tris-borato pH 8.3 (Sigma); 0.002 M EDTA (Merck).

TNE: 0.1 M Tris pH 7.5 (Sigma); 0.05M EDTA; 0.5 M NaCl (Merck).

Tampon fosfato pH 6: 12 mM HNa2PO4 (Merck); 88 mM H2NaPO4 (Merck).

Tampon de electroporacion: 21 mM HEPES pH 7.05 (Sigma), 137 mM NaCl (Merck), 5 mMKCl (Merck), 0.7 mM Na2HPO4 (Merck), 6 mM glucosa (Merck).

BPTG: BSA 1 %, PBS 1x, Triton-X 100, 0.1 % glicina 1M.

Tampon S: acido cıtrico 0,025M, Na2HPO4 0,05M, pH=5.

Tampon de ruptura: 160 mM Tris-HCl pH 6,8, 0,1 M DTT, 2 % SDS, 11 % glicerol, 0,033 %azul de bromofenol.

Tampon de transferencia: 25 mM Tris-HCl, pH 8,3, 190 mM glicina, metanol al 20 % y SDSal 0,1 %.

TPBS: Tween 20 al 0,05 % (v/v) en PBS.

4.23. Metodos filogeneticos

4.23.1. Alineamiento y edicion de secuencias

Se ralizaron multiples alineamientos con el programa CLUSTAL W (Thompson y col. 1994),incluido en el paquete de software Bioedit (Hall 1999), utilizando VFA C-S8c1 o VFA MARLS(numeros de acceso de GenBank AJ133357 y AF274010, respectivamente) como secuencias dereferencia.

57



4.23.2. Analisis filogenetico

Se calculo la matriz de distancias entre distintas secuencias con el programa MEGA3.1 (Kumary col. 2004), usando el modelo de Kimura 2 paramteros (Kimura 1980). La topologıa se infirio me-diante el metodo de neighbour-joining (NJ) (Saitou y Nei 1987) usando tambien el paquete desoftware MEGA 3.1. Se usaron tambien otros procedimientos alternativos para medir la relaciongenetica entre muestras. Los metodos de maxima parsimonia (MP), utilizando el programa DNA-PARS del paquete PHYLIP, permitieron la construccion de arboles con una topologıa que requirio elmınimo numero de cambios en las secuencias para ir de un nodo a otro (Sober 1988). La robustezestadıstica de los arboles obtenidos por MP y NJ se comprobo con un remuestreo por el metodo debootstrap de 1000 veces (Felsenstein 1985). Los arboles de maxima verosimilitud (MV, MaximumLikelihood) se generaron con el programa PUZZLE (Strimmer y von Haeseler 1997), usando elmodelo de substitucion de Tamura-Nei (Tamura y Nei 1993), y las tasas con distribuci on Gammacon ocho parametros (TN-8G), como modelo de heterogeneidad.

4.24. Caracterizacion de los espectros de mutantes

Los espectros de mutantes analizados en esta Tesis corresponden a poblaciones obtenidas en ellaboratorio y que han sido descritas (Gonzalez-Lopez y col. 2005; Sierra y col. 2007; Sierra y col.2000).

La complejidad de los espectros de mutantes se calculo como la frecuencia de mutacion mınima ymaxima, expresada como el numero de mutaciones unicas y totales, respectivamente, encontradasen los clones moleculares (comparados con su secuencia consenso), dividido por el n umero totalde nucleotidos secuenciados. La entropıa de Shannon (H) normalizada es tambien una medida dela complejidad de la poblacion, ya que cuantifica la proporcion de secuencias identicas en unapoblacion. Se obtiene calculando:

H = −N

k=1

( pi ln pi) / ln pi (5)

donde N es el numero total de secuencias y pi es la frecuencia de la secuencia i. El valor de Hesta comprendido entre H=0 (todas las secuencias identicas) y H=1 (todas las secuencias distintas).

El Partition Analisis of Quasispecies (PAQ) es un software que aplica un metodo no jerarquicoque agrupa juntas, bajo un cırculo o esfera con un radio previamente establecido, secuencias queminimizan la distancia genetica (de Hamming) con respecto a un genotipo central (Baccam y col.2001). El conjunto de clones de cada poblacion viral analizada, se considero como una poblacionunica, se agrupo ba jo el mınimo radio posible, y se obtuvo un valor d, o distancia media. La d esun valor de dispersion de distancias respecto al genotipo central, y viene dado por la formula:

d =

1

n

N k=1

(Dic) (6)

donde n es el numero de vecinos dentro del grupo con centro en el genotipo c, y Dic es la distancia deHamming entre las variantes i y c. Las poblaciones se representan como esferas de area proporcionalal valor d.

Las mutaciones no sinonimas corregidas por los sitios no sinonimos (dn), y las mutacionessinonimas corregidas por sitio sinonimo (ds) se calcularon mediante el software SNAP (Korber2000).

58



K n y K s se calcularon con el numero de mutaciones no sinonimas y sinonimas respectivamente,divididas por el numero de nucleotidos (sin ningun tipo de correccion). Se utilizo el software basadoen ventanas, K-estimator (Comeron 1999). Se analizaron ventanas (regiones) de 200 nucle otidos,moviendo en cada paso la ventana 100 nucleotidos, hasta cubrir toda la region genomica codificantede la poliproteına de VFA.

4.25. Metodos Numericos

Las simulaciones numericas se realizaron disenando programas especıficos en lenguaje C. Laimplementacion matematica se realizo utilizando la Librerıa Cientıfica de GNU (GSL), disponiblecomo software libre bajo la licencia publica de GNU en www.gnu.org/software/gsl.

4.26. Programacion con C

El programa disenado para describir la replicacion viral se ha escrito en lenguaje C. El programafunciona en un PC con un sistema Linux o Windows. Se compil o desde un PC con una distribucionLinux Ubuntu utilizando el programa E-Macs que incluye la GNU compiler collection (gcc). Todosestos programas son libres bajo la licencia publica de GNU. Las animaciones se realizaron mediantelos programas ImageJ y Blender.

59



5. Resultados

5.1. Evolucion del clon VFA C-S8c1 hacia la segmentacion viral

5.1.1. Descripcion de una poblacion muy heterogenea de genomas defectivos: eviden-cia de un estado de inestabilidad evolutiva

El clon de VFA C-S8c1 fue sometido en cultivos celulares a 260 pases citolıticos seriados yevoluciono hacia la adquisicion de genomas con deleciones internas en fase que eran infecciosas porcomplementacion (Garcia-Arriaza y col. 2004). Se describio la aparicion de una delecion de 417nucleotidos (∆417) en la zona codificante para la proteasa L y de 999 y 1017 nucle otidos (∆999,∆1017) en la region codificante de la capsida (Figura 14). Tras los 260 pases, los genomas condeleciones (∆RNAs) se impusieron en la poblacion C-S8p260 y se estimo que su cantidad era comomınimo 10.000 veces superior a la del virus con genoma de tamano estandar. La complementacionsucede cuando un virus delecionado en la L y otro delecionado en la c apsida coinfectan la mismacelula (Garcia-Arriaza y col. 2004).

Un analisis de genomas presentes en placas de lisis individuales obtenidos de la poblacion vi-

ral C-S8p260 mostro que, 61 de 62 placas analizadas contenıa un genoma con la delecion ∆417acompanado siempre de una de las otras dos deleciones, ∆999 o ∆1017. Solo una de las 62 placascontenıa un genoma de tamano estandar (Garcia-Arriaza y col. 2004).

Para investigar el grado de homogeneidad en el tipo de deleciones, previo a la imposicion de lastres ya mencionadas, se analizo la composicion genomica de virus procedentes de placas procedentesde los pases C-S8p219 y C-S8p225 (ver Materiales y metodos, apartado 4.3.2 y 4.3.4 para detallesde la seleccion de clones biologicos). En estos pases la imposicion de los virus defectivos aun noera total y el genoma estandar era detectable mediante RT-PCR (Garcıa-Arriaza y col. 2006).Contrariamente a los resultados obtenidos con la poblacion C-S8p260, la composicion genomica delos virus en 4 de 10 placas en la poblacion C-S8p219 y en 3 de 10 placas en la poblacion C-S8p225diferıa de la composicion media de la secuencia consenso poblacional (χ2, p<0,001). Los resultados

mostraron la existencia de 7 deleciones adicionales que mantienen la fase de lectura, localizadasentre los residuos genomicos 1813 (en la region codificante de VP4) y 3658 (region codificante deVP1) (Figuras 14 y 15). El genoma ∆417 estaba presente en todas las placas analizadas. Por tanto,la evolucion del sistema de VFA alcanzo niveles muy altos de hetereogeneidad genetica, en formade un espectro amplio de diferentes genomas de delecion, que nunca llegaron a imponerse en lapoblacion, incluso despues de 260 pases (Figura 14). Las deleciones tampoco se detectaron despuesde 460 pases (Garcıa-Arriaza y col 06).

5.1.2. Secuencia nucleotıdica en torno a los sitios delecionados: evidencia de recom-binacion promiscua

Dado que los ∆RNAs derivan del clon biologico C-S8c1, que contiene un genoma estandar unico,las deleciones se debieron generar por recombinacion intramolecular o intermolecular, como progeniedel RNA de C-S8c1. Para comprender mejor los mecanismos moleculares que generaron los ∆RNAs,se compararon las secuencias nucleotıdicas en las zonas flanqueantes de los sitios delecionados, delos 11 genomas descritos con deleciones internas, tanto en clones individuales como en poblacionesno clonadas (Figura 16). En 6 de las 11 deleciones analizadas se encontraron secuencias identicasde 4 a 18 nucleotidos, de manera continua o interrumpida flanqueando la zona delecionada. Paradeterminar la frecuencia con la que esas secuencias repetidas estaban presentes en el genoma deVFA, se buscaron y contabilizaron a lo largo del genoma de los virus C-S8p100 y C-S8p200. Labusqueda mostro que una de las dos secuencias que flanquean las deleciones ∆417 y ∆645 no estaban

60



Lb

Lab

…...

……...

.

.

.

.

.

….......

V P 4

V P2 VP3 VP1 2B 2C 3A 3C 3D

VPG

PoliC

AA.L

2A 3B

Figura 14: Esquemas del genoma de VFA y de la posicion de las deleciones internas identificadas

tras pases del clon C-S8c1 en celulas BHK-21. A) Genoma de VFA. Las zonas 5’ y 3’ no codificantes

(5’ UTR, 3’ UTR) se representan con rayas horizontales y las zonas codificantes mediante rectangulos en los

que se incluye el nombre de las proteınas, tal como se ha descrito en la Introduccion (Figuras 4, 5 y 7). Se

senalan los dos codones AUG en fase de lectura que inician la sıntesis de las dos formas de la proteasa L (Lab,

Lb). Debajo del genoma se indican las deleciones encontradas en diferentes genomas defectivos; el numero

acompanado de ∆ indica el tamano de la delecion en nucleotidos, determinado mediante secuenciacion de

nucleotidos. Los rectangulos coloreados representan las deleciones encontradas en las secuencias consenso

de diferentes poblaciones. Los rectangulos negros representan las deleciones encontradas tras aislar virus de

placas individuales a partir de las poblaciones C-S8p219 y C-S8p225. Debajo, las lıneas delgadas horizontales

identifican las amplificaciones por RT-PCR realizadas y delimitan los productos de amplificacion utilizados

para mapear las diferentes deleciones. Los iniciadores empleados en las amplificaciones indicadas fueron los

siguientes: amplificacion 10: LR1L (s) y 4D1new (a); 17: 3R1-ECOR1new (s) y 2BD1 (a); 21: LR1L (s) y

2BD1 (a); 29: LR2new (s) y JD5new (a); 37 2R3new (s) y PUL (a); 38: 4R1 (s) y 3D1B (a); LJ: LR1L (s) y

JD5new (a); L2: 2R2new (s) y 3D2(a); s, sentido; a, antisentido. Las secuencias de los iniciadores se describen

en la Tabla 2. B) Esquema de los pases seriados del clon C-S8c1 y los genomas identificados en las diferentes

poblaciones. Los clones biologicos se representan como cuadrados negros y las poblaciones no clonadas como

cırculos blancos; las flechas grises grandes representan pases a alta MDI; las flechas delgadas representan

pases a baja MDI; el numero despues de ”p” indica el numero de pase; ST, genoma de VFA con tamano

estandar. La posicion de la delecion se muestra como una porcion coloreada en el esquema del genoma, con

el codigo de colores de la parte A) de esta figura. Las poblaciones que se indican con p3d derivan de 3 pases

de C-S8p260 a baja MDI, que ocasionan la perdida de los ∆RNA y la recuperacion de virus ST como unico

genoma detectable. Debajo de las poblaciones se indican las deleciones caracterizadas en el analisis clonal

(placas individuales) de las poblaciones C-S8p219 y C-S8p225.61



6 7 8 9 10 6 7 8 9 10

p219 p225

p 3 d p 2

6 0

4370

2899248822011933

∆417∆999

St

M

Figura 15: Variabilidad de tamanos genomicos en clones individuales. Electro-foresis en gel de agarosa-TAE de los productos de amplificacion, mediante la RT-PCR21 (Figura 14) de clones individuales de las poblaciones C-S8p219 y C-S8p225. Se indicala poblacion de origen y el numero de clon. En el carril M se muestran DNAs marcado-res de tamano, obtenidos por digestion del DNA de φ29 con HindIII, con indicacion deltamano esperado de las bandas. El DNA obtenido con RNA de C-S8p260p3d (p3d) se

muestra como control del tamano de genoma estandar. El DNA obtenido con RNA delvirus C-S8p260 (p260) se muestra como control del tamano de las deleciones ∆417, ∆999 y ∆ 1017 (estas dos ultimas producen DNAs que no se separan en esta electrofore-sis). Se puede observar un gran numero de tamanos intermedios en los diferentes clonesindividuales.

representadas en ninguna otra zona del genoma. El resto de secuencias estaban repetidas desde 1a 44 veces; en particular los tetra y pentanucleotidos estaban presentes entre 15 y 44 veces en elgenoma. Ademas las secuencias flanqueantes de las deleciones ∆744-5’, ∆885 y ∆603 no mostraron

repeticiones, continuas o interrumpidas, de mas de tres nucleotidos. Los resultados sugieren que nohay un requerimiento estricto, a nivel de secuencia nucleotıdica, para que eventos de recombinacionden lugar a los ∆RNA como se ha descrito tambien en otros sistemas virales (Gmyl y col. 2003;Urbanowicz y col. 2005).

62



∆402

..cg[ACAACug…....au]ACGACca..

5´

1183 1586

3´

∆417

..aa[AGGUCUUUUACUCCAGACcc……cc]UGGUAUUUGUUCCAUACga..

1153 1571

5´ 3´

∆999

..ca[GCGAaa………….ggGCGAu]ag..

2793 3793

5´ 3´

∆1017

..gaAGAC[cg…….………..………...ccAGAC]aa..

1932 2950

5´ 3´

∆540

..cgcgUAC[AUgc…………accuUAC]GUcu..

2196 2737

5´ 3´

∆519

..cc[AACAUGac………ac]UUCAUGuu..

2352 2872

5´ 3´∆645

..ac[ACACAACCAac….ca]CCACAAACAca..

1813 2459

5´ 3´

∆744 -3’

..uaCAUG[gu……………cg]CAUGcu..

2913 3658

5´ 3´

∆744-5’

..au[UCUCACUac...……….…ua]CCUGGAUgu..

1937 2682

5´ 3´

∆603

..guaCA[ug…….…..…………caacCA]au..

2911 35152909 3513

5´ 3´

∆885

..uu[GGACACAUGca……cc]AAGUUCACGuu..

2121 3007

5´ 3´A B

1928 2946

..cgAC[AACug…....auAC]GACca..

..ga[AGACcg…….………..………...cc]AGACaa.. ..gua[CAug…….…..…………caac]CAau..

1185 1588

..cgcg[UACAUgc…………accu]UACGUcu..

27342193

Figura 16: Secuencias de nucleotidos que flanquean a los sitios delecionados enlos ∆RNAs de VFA. La localizacion de las diferentes deleciones, y su identificacion seresumen en la Figura 14 y la Tabla 4. Las deleciones se representan como cajas de color(detectadas en una secuencia consenso) o negras (detectadas en clones individuales).La localizacion de las diferentes deleciones, y su identificacion se resumen en la Figura14 y la Tabla 4. Las secuencias de nucleotidos en el sitio de cada delecion donde seha encontrado homologıa de secuencia se indican en mayusculas. Se indican en rojo losnucleotidos donde hay identidad, interrumpidos por nucleotidos heterologos marcadosen azul. Las zonas delecionadas se muestran entre corchetes; los residuos gen omicosaparecen numerados segun (Escarmıs y col. 2006).

63



Composicion de la plC-S8p219, no de placa

Amplificaciona 1 2 3 4c 5 6c 7/8 9 10

10 ∆417 ∆417 ∆417 ∆417 ∆417 ∆417 ∆417 ∆417 No ∆

17 ∆999 ∆999 ∆999 ∆999∆744-

3’∆603 ∆999 ∆999 (∆999)

21 ∆417 ∆417 ∆417 ∆417 ∆417 ∆417 ∆417 ∆417 (∆417)

∆999 ∆999 ∆999 ST ST ∆999 ∆999 ∆999 (∆999)

ST∆744-

5’∆645

∆744-

3’∆603 ST ST

29 ST∆744-

5’

NoST

ST ST STNoST

ST ST

∆645

37 ND ND ND ND ∆744-

3’∆603 ∆999 ∆999 No ∆

38 No ∆∆744-

5’No ∆ ND ND ND ND ND ND

Tabla 4: Deleciones genomicas detectadas mediante amplificacion del RNA viraC-S8p225 y C-S8p219.a Las amplificaciones por RT-PCR se identifican con numeros que corresponden a las amsecuencia de nucleotidos de los iniciadores se detalla en la Tabla 2.b Cada columna muestra los tipos de genomas identificados en la placa correspondiente, ind

de una delecion del tamano indicado; para cada amplificacion se senala la presencia de unfragmentos de DNA obtenidos. ST significa presencia de genoma con tamano estandar; unindicada se amplifico con muy baja eficiencia; No ∆ significa que no se detect o ningun gense detecto genoma estandar. ND, no determinado. Las deleciones que no se detectaron ense detectaron en placas individuales se marcan en negrita.c Las placas numero 4 y 6 de la poblacion C-S8p219 presentan una delecion adicional. Seplaca 4, y con las RT-PCR 21 y 17 en la placa 6. Estas deleciones no se pudieron secuencd La RT-PCR disenada con un iniciador localizado dentro de las deleciones ∆519 o ∆885

6 4



5.1.3. Estabilidad de la delecion ∆417

Durante el analisis clonal descrito en la seccion anterior, se detecto el genoma ∆417 en to-das las placas de lisis estudiadas, procedentes de las poblaciones C-S8p219 y C-S8p225. No sedetecto ningun otro genoma con deleciones en la zona codificante de la proteasa L. Sin embargo,como se ha descrito en el apartado anterior, no parece existir un requerimiento de secuencia estrictoevidente en la evolucion de C-S8c1 para la generacion de ∆RNAs. Para comprobar la estabilidad yconstancia de la delecion ∆417 se realizaron una serie de construcciones en el clon infeccioso pMT28de VFA (Toja y col. 1999), encaminadas a alterar tanto la zona delecionada como el contexto desecuencia (Figura 17). Se obtuvieron plasmidos codificantes de RNA con la delecion ∆417 y ∆999en el contexto de secuencia del virus C-S8p260 en toda la zona codificante de proteınas, denomina-dos pMT260∆417ns y pMT260∆999ns, respectivamente (Figura 17). El plasmido pMT260∆417nsse utilizo como material de partida para desplazar la delecion ∆417 tres nucleotidos hacia el 5’,o tres nucleotidos hacia el 3’ del RNA (obteniendose plasmidos denominados, respectivamente,pMT260∆417ns+3 y pMT260∆417ns-3). Estos plasmidos mantenıan sendas deleciones ∆417 enfase de lectura (Figura 19). La delecion ∆417 se introdujo tambien en un plasmido con el contextode secuencia de C-S8c1 (denominado pMT28∆417).

Los genomas con las deleciones ∆417 se electroporaron individualmente en celulas BHK-21. Serealizo un marcaje metabolico de una hora a distintos tiempos (entre 2 y 5 horas) post electropora-cion (p.e.) y las proteınas marcadas presentes en los extractos celulares se analizaron electroforeti-camente (Figura 18-A). El patron e intensidad de las bandas de proteınas reflejan la intensidadde la expresion de proteınas virales y de la parada de expresion de proteınas celulares (shut off ).Entre las horas 3 y 4, la parada de la expresion de proteınas celulares se hizo evidente en las celulaselectroporadas con las tres construcciones. Dado que la mayor parte de la region del RNA quecodifica la proteasa L, encargada del corte proteolıtico del complejo de union al cap (Devaney ycol. 1988), esta delecionada, la intensidad de la parada no se correlaciona necesariamente en estosRNAs con su nivel de replicacion. En menor grado que la proteasa L, la proteasa viral 3C, puede

intervenir tambien en la parada de sıntesis de proteınas celulares (Belsham y col. 2000). Las celulaselectroporadas con transcritos del plasmido pMT28, que contienen la secuencia completa del clonparental C-S8c1, provocaron una parada de sıntesis de proteınas celulares muy intensa desde lasprimeras 2 horas de replicacion. La expresion de proteınas especificas vıricas examinada medianteWestern-blot revelo unos niveles altos de replicacion en todas las celulas electroporadas con los∆RNA ensayados, similar a la expresion en celulas electroporadas con transcritos del plasmidopMT28 (Figura 18-A).

Para analizar la infectividad y virulencia de los RNAs con la delecion ∆417 en su sitio originalo desplazada 3 nucleotidos, se electroporaron celulas BHK-21 con los ∆RNAs individualmente oen mezcla junto con el RNA transcrito del plasmido pMT260∆999ns. Todos los RNAs produjeronun efecto citopatico evidente a las 5 h.p.e., siendo ligeramente superior el observado en las celulas

coelectroporadas con RNAs de pMT260∆417ns y pMT∆999ns (no se muestran los resultados). Alas 9 h.p.e., las celulas electroporadas con cualquiera de los RNAs ensayados presentaban un efectocitopatico casi total. Los datos de replicacion y de virulencia fueron, por tanto, paralelos, ya quetodos los ∆RNA fueron capaces de replicar en cultivos celulares y de producir efecto citopaticoen un corto espacio de tiempo p.e., lo que sugiere que el desplazamiento de tres nucleotidos en laposicion de la delecion no impide la replicacion del RNA.

Cuando se analizo la infectividad del sobrenadante de las celulas, recogido a las 8 h.p.e., se obser-varon diferencias significativas en cuanto a la produccion viral. Unicamente las celulas coelectropo-radas con los dos ∆RNA con las deleciones en el sitio original (pMT260∆417ns y pMT260∆999ns)y la coelectroporacion con pMT260∆417ns+3 y pMT260∆999ns, produjeron un tıtulo viral supe-

65



V P 4 VP2 VP3 VP1

2A

2B 2C 3A

3B

3C 3DL

VPG

PoliC

AA.. A pMT28

V P 4

VP2 VP3 VP1 2C 3A

3B

3C 3DL

VPG

PoliC

AA.. A2 B pMT999

V P 4

VP2 VP3 VP1

2A

2C 3A

3B

3C 3DL

VPG

PoliC

AA.. A2 B

417

pMT417

V P 4

VP2 VP3 VP1

2A

2C 3A

3B

3C 3DL

VPG

PoliC

AA.. A2 B pMT260999ns

V P 4

VP2 VP3 VP1

2A

2B 2C 3A

3B

3C 3D

VPG

PoliC

AA.. A

417L pMT260417ns

V P 4

VP2 VP3 VP1

2A

2B 2C 3A

3B

3C 3D

VPG

PoliC

AA.. A

417+3

L

V P 4

pMT260417+3ns

V P 4

VP2 VP3 VP1

2A

2B 2C 3A

3B

3C 3D

VPG

PoliC

AA.. A

417-3

L pMT260417-3ns

V P 4

VP2 VP3 VP1

2A

2B 2C 3A

3B

3C 3DL

VPG

PoliC

AA.. A

417

pMT28417

V P 4

VP2 VP3 VP1

2A

2B 2C 3A

3B

3C 3D

VPG

PoliC

AA.. AL pMT260p3d

4201

7427

436

Figura 17: Derivados del plasmido pMT28 con deleciones en distintos con-textos de secuencia. Las zonas 5´ y 3´ no codificantes se representan con rayashorizontales y las zonas codificantes mediante rectangulos con el nombre de las pro-teınas codificadas. La proteına VPg y el tramo de poli C se representan como un cırculoy una raya vertical, respectivamente, en la zona 5´ no codificante. Las cajas en gris olıneas en negro corresponden a la region clonada a partir de C-S8c1 y las zonas en color

corresponden a las zonas clonadas a partir de C-S8p260. Cuando aparecen indicados,los numeros en la parte superior de cada genoma indican el primer y ultimo nucleotidode la region clonada perteneciente a C-S8p260. A la derecha de cada genoma se indicael nombre de la construccion.

66



P F U / m l

105

104

103

2-3 H.P.E.Mr (KDa)

211.8121

100.2

54.3

38.7

29.8

20

3-4 4-5 2-3 3-4 4-5 2-3 3-4 4-5 2-3 3-4 4-52-3 3-4 4-5

B H K - 2 1

p M

T 2 8

p M

T 2 6 0

∆ 4 1 7 n

s

p M

T 2 6 0

∆ 4 1 7 +

3 n s

p M

T 2 6 0

∆ 4 1 7 - 3 n

s

3CD

A

3D

2C

B

Actina38.7

VP3

VP1

B H K

- 2 1

p M T 2

6 0 ∆ 9 9

9 n s

p M T 2

6 0 ∆ 4 1 7 n

s

p M T 2 6

0 ∆ 9 9

9 n s +

p M T 2

6 0 ∆ 4 1 7 n

s

p M T 2 6

0 ∆ 9 9

9 n s +

p M T 2 6 0

∆ 4 1 7 - 3 n

s

p M T 2 6

0 ∆ 9 9

9 n s +

p M T 2 6 0

∆ 4 1 7 +

3 n s

p M T 2 6 0

∆ 9 9

9 n s +

p M T 2

8 ∆ 4 1 7

Figura 18: Capacidad replicativa e infecciosa de RNAs derivados de pMT28. A) Seelectroporaron celulas BHK-21 con un sobrenadante de celulas no infectadas (BHK), o con 50µgde RNA de transcritos infecciosos que expresan el VFA C-S8c1 (pMT28) o RNA de transcritosincluyendo la delecion ∆417 en el contexto de secuencia de C-S8c1 (pMT260∆417ns), la deleciondeplazada 3 nucleotidos hacia el 3´ del RNA (pMT260∆417+3ns) o la delecion desplazada 3 nu-cleotidos hacia el 5´ del RNA (pMT260∆417-3ns). Las proteınas se marcaron con [35S]Met/Cysa las 2-3h, 3-4h y 4-5h post-electroporacion, y se separaron mediante electroforesis en geles deacrilamida SDS-PAGE; Mr (kDa), marcador de masa molecular de proteınas. Las proteınas virales

correspondientes a las bandas mayoritarias se indican en la derecha. El panel inferior correspondeal Western-blot anti actina. B) Tıtulo de virus infeccioso en cada uno de los sobrenadantes. Elsobrenadante se recogio al observar efecto citopatico completo (aproximadamente 8h p.e.). Cadabarra representa la media y la desviacion estandar de cuatro titulaciones. Se inocularon 200µl desobrenadante en un pocillo de 35cm2. La lınea horizontal marca el lımite de deteccion del expe-rimento: 1x104 PFU/ml. Los metodos de titulacion y de correccion del tıtulo se describen en losapartados 4.3.2. y 4.3.3. de Materiales y metodos. Estos ensayos se realizaron en colaboracion conla Dra. C.Perales

67



pMT260 417ns

...GAG AAA A|UG GUA UUU...

...GAG AAA AAG G|UA UUU......GAG A|UC CUG G UA UUU...

∆417:

417+3:417-3:

5' 3'

Glu Lys Met Val PheLys

Ile Leu

5' 3'

V P 4

VP2 VP3 VP1

VPG

PoliC

417-3

L pMT260 417-3

GAC GGC GAG A

............................UC CUG GUAIle

.....

V P 4

VP2 VP3 VP1

VPG

PoliC

417+3

L V P 4 pMT260 417+3

GAG AAA AAG G

.............................UA UUU GUU.Val

.....

V P 4

VP2 VP3 VP1

VPG

PoliC

417

L

MetGAG AAA A

.............................U

G GUA UUU GUU.

.....

∆417:

∆417+3:

∆417-3:

Figura 19: Representacion esquematica de las deleciones ∆417 y

∆417+3/∆417-3. El panel izquierdo representa la parte 5´ del genoma de VFA. Encada genoma se muestra la localizacion de la delecion delecion en la zona que codificaL. En rojo se indica el nuevo codon que se genera en la delecion original y en la deleciondesplazada tres nucleotidos hacia el 5´ del RNA (∆417-3ns) o tres nucleotidos haciael 3´ del RNA (∆417+3ns); los aminoacidos codificados son Met, Val e Ile, respectiva-mente. El esquema en la parte derecha muestra las secuencias de nucleotidos alineadasque se generan en cada delecion. En negrita se indica el triplete que se genera al juntarlos dos nuevos extremos de la delecion. En rojo se indica los nucleotidos diferentes enlas deleciones desplazadas respecto a ∆417. Debajo se muestran las mismas secuenciastraducidas en aminoacidos. Los puntos representan posiciones en las que el aminoacidoes el mismo que en ∆417ns. En rojo se marcan los aminoacidos diferentes.

rior al lımite de deteccion del experimento (Figura 18-B). Sin embargo el tıtulo producido por lacoelectroporacion pMT260∆417ns y pMT260∆999ns fue 3.4 veces mayor que en la coelectropo-racion con pMT260∆417ns+3 y pMT260∆999ns (en experimentos paralelos, la coelectroporacionpMT260∆417ns y pMT260∆999ns produjo un tıtulos hasta 6.2 veces mayores que la coelectropora-cion pMT260∆417ns+3 y pMT260∆999ns). Por tanto, a pesar de que la replicacion de los ∆RNAno se ve alterada al desplazar la delecion, sı se altera el ciclo viral completo, puesto que los RNAscon la delecion desplazada del sitio original presentaron menor produccion viral que los plasmidoscon las deleciones originales.

Al desplazar 3 nucleotidos la delecion ∆417 se genero una nueva secuencia en el entorno delsitio de la delecion. Sin embargo, debido a que existıa cierta homologıa en los extremos flanquean-tes a la delecion, las dos nuevas secuencias generadas presentan un unico nucleotido diferenteen pMT260∆417+3ns y 3 nucleotidos diferentes en pMT260∆417-3ns, que corresponden a 1 y 2aminoacidos diferentes, respectivamente (Figura 19). No obstante, en los tres casos esas diferenciasse localizan en la region que codifica la proteasa L, la cual esta delecionada en un 70 %. Por tanto lasdiferencias en la produccion viral se debieron a cambios mınimos en la secuencia de nucleotidos queafectaron a una proteına no funcional. Estos resultados apoyan la hipotesis inicial de que cambiosmenores en la delecion ∆417 pueden afectar sensiblemente el ciclo de replicaci on viral.

68



5.1.4. La capacidad replicativa de los ∆RNA es dependiente del contexto de secuencia

Durante los 260 pases a los que fue sometido C-S8c1 en celulas BHK-21, los ∆RNA acumularonun total de 32 mutaciones puntuales repartidas a lo largo del genoma: 6 en la region no traducidadel 5’ del RNA, 12 en la region que codifica las proteınas estructurales, 14 en la region que codificalas proteınas de replicacion y ninguna en la region 3’ no traducida (determinadas a partir de lasecuencia consenso de C-S8p260 (Garcia-Arriaza y col. 2004) (Tabla 1 en la Introducci on). Parainvestigar la influencia que estas mutaciones pudieran tener en la aparicion o mantenimiento de los∆RNA, se obtuvieron plasmidos codificantes de RNA con las deleciones en el contexto de secuenciadel virus C-S8p260 en la zona codificante de proteınas no estructurales, y el contexto de secuenciadel virus C-S8c1 de la zona codificante de proteınas de replicacion (denominados pMT∆417 ypMT∆999, respectivamente) (Figura 17). Tambien se obtuvieron plasmidos codificantes de RNAcon las deleciones ∆417 y ∆999 en el contexto de secuencia del virus C-S8p260 en toda la zonacodificante de proteınas, tanto estructurales como de replicacion, denominados pMT260∆417ns ypMT260∆999ns, respectivamente (Figura 17).

Se estudio la expresion de proteınas y produccion de progenie viral en distintos ∆RNAs. Los∆RNAs en los dos contextos de secuencia (de C-S8c1 y de C-S8p260) se electroporaron individual-mente o en mezcla (∆417 + ∆999) en celulas BHK-21. Se realizo un marcaje metabolico a distintash.p.e. Los niveles de proteınas en extractos celulares se analizaron electroforeticamente (Figura20-A,B). El patron e intensidad de las bandas de proteınas reflejan la intensidad de la expresionde proteınas virales y de la parada de expresion de proteınas celulares. Los genomas con ∆417 in-dujeron la parada de expresion de proteınas celulares, incluso desde horas tempranas, unicamenteen el contexto de secuencia de C-S8p260. Los genomas con ∆999 en ambos contextos de secuenciaindujeron la parada desde horas tempranas. La coelectroporacion de los transcritos pMT260∆417nsy pMT260∆999ns indujo mayor parada que la electroporacion de RNA de pMT∆417 y pMT∆999,como indica la densitometrıa de los geles de electroforesis. La sıntesis de actina celular a las 6h.p.e., en celulas electroporadas con pMT∆417, pMT∆999 o la mezcla fue del 82,03 %, 32,21 % y

32,57 % respectivamente, comparado con la sıntesis observada en celulas electroporadas con tamponde carga (BHK, Figura 20). La sıntesis de actina celular a las 6 h.p.e., en celulas electroporadas conpMT260∆417ns, pMT260∆999ns o la mezcla fue del 14,84 %, 13,94 % y 12,07 % respectivamente.

Las proteınas procesadas VP3 y 3D, y el intermediario funcional 3CD se detectaron de maneramuy evidente en las coelectroporaciones con pMT260∆417ns y pMT260∆999ns. En cambio, estasproteınas se detectaron solo levemente, o no se detectaron, en las coelectroporaciones con RNA depMT∆417 o RNA de pMT∆999. En la electroporacion con RNA de pMT260∆417ns tambien sedetecto la proteına VP3, que no se detecto en las electroporaciones con pMT260∆999ns, como erade esperar ya que este RNA tiene delecionada la region que codifica para esta proteına (Figura17). Las proteınas 3D y 3CD tambien se detectaron desde horas tempranas en las electroporacionesindividuales con RNA de pMT260∆417ns o RNA de pMT260∆999ns.

La citopatologıa producida por los distintos transcritos fue muy paralela a los datos de replica-cion. Las coelectroporaciones con pMT260∆417ns y pMT260∆999ns (en mezcla o individualmente)produjeron mas del 90 % de efecto citopatico en las primeras 8 h.p.e. (el efecto citopatico fue algomenor en las celulas electroporadas unicamente con pMT260∆417ns). Las celulas electroporadascon los transcritos de pMT∆417 y pMT∆999 solo presentaron un efecto citopatico evidente cuandolos dos fueron coelectroporados, alcanzando un maximo del 50 % a las 8 h.p.e.

La produccion de progenie infecciosa durante las primeras 8 h.p.e. s olo se pudo detectar en lascelulas coelectroporadas con pMT260∆417ns y pMT260∆999ns. El tıtulo incremento desde 1,9·104

hasta 6,6·104 PFUs a las 8 h.p.e. (Figura 18-B).Estos resultados demuestran que tanto la expresion de proteınas virales, como la virulencia para

69



p M T ∆

9 9 9

B H K

p M T ∆

4 1 7

4 6 8 H.P.E.

p M T ∆

9 9 9 +

p M T ∆

4 1 7

p M T ∆

9 9 9

B H K

p M T ∆

4 1 7

p M T ∆

9 9 9 +

p M T ∆

4 1 7

p M T ∆

9 9 9

B H K

p M T ∆

4 1 7

p M T ∆

9 9 9 +

p M T ∆

4 1 7

211.8

121100.2

54.3

38.7

29.8

20

Mr (KDa)

VP329.8

B H K

p M T 2

6 0 ∆ 4 1 7 n

s

4 6 8 H.P.E.

3D

p M T 2

6 0 ∆ 9 9 9 n s + p M

T 2 6 0

∆ 4 1 7 n

s

p M T 2

6 0 ∆ 9 9 9 n s

B H K

p M T 2

6 0 ∆ 4 1 7 n

s

B H K

Actina

p M T 2

6 0 ∆ 9 9 9 n s

211.8

121100.2

54.3

38.7

29.8

20

Mr (KDa)

54.3

38.738.7 Actina

3D54.3

VP329.8

p M T 2

6 0 ∆ 9 9 9 n s + p M

T 2 6 0

∆ 4 1 7 n

s

p M T 2

6 0 ∆ 9 9 9 n s + p M

T 2 6 0

∆ 4 1 7 n

s

p M T 2

6 0 ∆ 9 9 9 n s

p M T 2

6 0 ∆ 4 1 7 n

s

3CD

pMT260∆999nspMT260∆417nspMT260∆999ns

+ pMT260∆417ns

BHK

h.p.e.

T í t u l o v i r a l ( P F U s / m l )

4 6 8

pMT∆999

pMT∆417

pMT∆999

+ pMT∆417

BHK

h.p.e.4 6 8

T í t u l o v i r a l ( P F U s / m l )

103

104

105

103

104

10

5

RNA de genomas de VFA Efecto citopático4 h 6 h 8 h

pMT28 + + + +

pMT∆999 - - -pMT∆417 - - -

pMT∆999 + pMT∆417 - - -

a

+ + + +

- - -- - -- - -

pMT260∆999ns + + + + + +

pMT260∆417ns +/- + + +pMT260∆999ns + pMT260∆417ns + + + + + +

+ + + + + +

+/ + + ++ + + + + +

BHK - - -- - -

A B

C

DE

Figura 20: Comparacion del efecto de las mutaciones en la zona codificante de proteınas no estruc-turales en la capacidad replicativa e infecciosa de los RNAs transcritos. A) Las celulas se electroporaroncon un sobrenadante de celulas no infectadas (BHK), o con 25µg de RNA de transcritos de los pl asmidos pMT∆999,pMT∆417 o la mezcla de los dos. B) Mismo diseno experimental, empleando el RNA transcrito de los plasmidospMT260∆999ns, pMT260∆417ns o la mezcla de los dos. En las electroporaciones con mezclas de ∆RNAs (en A y B)se utilizo 12,5µg de cada ∆RNA. Las proteınas se marcaron con [35S]Met/Cys entre las horas 2 y 4, 4 y 6 y entrelas horas 6 y 8 post-electroporacion. Los extractos proteicos se separaron mediante SDS-PAGE; Mr (kDa), marcadorde masa molecular de proteınas. Las proteınas especıficas de virus (VP3, 3D, 3CD) se detectaron mediante reaccioncon anticuerpos monoclonales en ensayos de Western-blot (paneles inferiores). La cantidad de proteına celular secontrolo observando la cantidad de actina, visualizada mediante Western-blot (ver apartado 4.20. de Materiales yMetodos). C) Efecto citopatico observado (en unidades arbitrarias) a diferentes horas tras electroporacion de celulasBHK-21 con el RNA genomico de las construcciones indicadas. La primera columna indica los RNAs transcritos apartir de las diferentes construcciones que se detallan en Materiales y metodos y en la Figura 17; BHK, celulas elec-troporadas con tampon de carga (control negativo). (+) < 20 % celulas afectadas); (++) 20 %-80 % celulas afectadas;(+++) > 90 % celulas afectadas; (-) ausencia de efecto citopatico comparado con el control negativo. D, E) El tıtuloviral se determino en el sobrenadante obtenido a diferentes horas post electroporacion (h.p.e.); se muestra la media ydesviacion estandar. Se inocularon 200µl de sobrenadante en un pocillo de 35cm2. La l ınea horizontal marca el l ımitede deteccion del experimento: 1·104 PFU/ml. El metodo de titulacion y de correccion del tıtulo se describen en losapartados 4.3.2. y 4.3.3. de Materiales y metodos. Estos ensayos se realizaron en colaboracion con la Dra. C. Perales

70



celulas BHK-21 y la produccion de progenie infecciosa de los ∆RNA en celulas coelectroporadas, fuemucho mas intensa y eficiente cuando las deleciones se encontraban dentro del contexto de secuenciade la zona codificante de proteınas no estructurales de C-S8p260, que en el contexto correspondientedel clon parental C-S8c1. La evolucion de C-S8c1 hacia la segmentacion se favorecio por la aparicionde mutaciones puntuales que probablemente facilitaron la recombinacion asociada a la aparicion de

∆RNAs (ver Discusion, apartado 6.1.5).

5.2. Estudio de la ventaja selectiva de los virus defectivos

5.2.1. Determinacion de la eficacia biologica de C-S8p260 y C-S8p260p3d

Una de las preguntas clave que plantea la transicion evolutiva hacia la segmentacion del VFAes la base molecular de la ventaja replicativa de los genomas con deleciones que se complementan,sobre virus estandar. Como primer paso para abordar esta pregunta se investig o si la imposicionnatural de las partıculas defectivas, en las poblaciones originales (Figura 14), se correlacionaba consu eficacia biologica en un ensayo estandar en cultivos celulares. La poblacion C-S8p260, dominadapor ∆RNAs, se compitio con C-S8p260p3d (el virus estandar derivado de la misma) (Garcia-Arriaza

y col. 2004) (Introduccion, apartado 2.6.5.) a alta MDI. C-S8p260 efectivamente se impuso al STC-S8p260p3d, con una eficacia biologica relativa de 2,5 (Figura 21-A, Tabla 5).

Los ensayos de fitness con poblaciones virales con ∆RNAs requieren alta MDI para mantenerla complementacion. Esto limita el numero de pases que se pueden realizar. Para solventar esteproblema, se realizaron nuevos ensayos de competicion manteniendo la MDI alta, pero reduciendola cantidad inicial de virus defectivo e incrementando la del virus estandar de manera compensatoria.Se realizaron nuevas competiciones utilizando una relacion inicial 1:1000 de virus defectivo respectoal ST, de este modo se garantizo la complementacion del virus defectivo. Con este procedimientose consiguio realizar ensayos de entre 6 y 9 pases. Los resultados (Figura 21-B) muestran que laventaja selectiva del virus defectivo: (i) es constante a lo largo de los pases, ya que el incrementoen la poblacion de C-S8p260 es lineal en escala logarıtmica (R2 = 0,9793) (Maree y col. 2000; Wu

y col. 2006); (ii) es independiente de la frecuencia, ya que la frecuencia relativa de cada tipo degenoma viral cambia a lo largo de los pases, a medida que uno desplaza a otro. El valor de eficaciabiologica relativa obtenido fue de 2,4, un valor muy similar al obtenido previamente al realizar lacompeticion comenzando con una proporcion mayor de C-S8p260 (Figura 21-A, Tabla 2).

El virus C-S8p260p3d posee un genoma recombinante de los genomas defectivos mayoritariospresentes en C-S8p260 (Introduccion, Figura 7). Por este motivo, C-S8p260p3d y C-S8p260 com-parten el contexto genetico (Garcia-Arriaza y col. 2004) (Introduccon, Tabla 1). Por tanto, lasdiferencias observadas en eficacia biologica, parecen atribuibles a la presencia al sistema de seg-mentacion en sı y no a la presencia de mutaciones especıficas que confirieran una mayor capacidadreplicativa. No obstante, una sola mutacion en un genoma viral puede modificar su comportamientoy fitness (Domingo 2007).

Para investigar la ventaja selectiva proporcionada por el sistema de segmentacion, se compi-tio el virus defectivo C-S8p260 contra varios virus ST de distinto contexto de secuencia y distinta fitness. En paralelo, se compitio el virus ST C-S8p260p3d contra los mismos virus (Figura 21-D,E, F, Tabla 5). El virus defectivo C-S8p260 se impuso al virus ST C 922l150 (origen de los virus enMateriales y metodos, 4.2) con aproximadamente el doble de eficacia biologica relativa con la quelo hizo el ST C-S8p260p3d, en concordancia con el valor de fitness relativa obtenido tras competirdirectamente C-S8p260 y C-S8p260p3d entre si. El virus ST C-S8p260p3d perdi o en competicioncontra el virus ST de alto fitness C-S8p460p5d (ver Tabla 5). El virus defectivo C-S8p260, sinembargo, desplazo en competicion al ST C-S8p460p5d, con un valor de fitness relativa de nuevo

71



R N A p 2

6 0 p 3 d / R N A C

L 1 5 0

0 1 2 3 4 R N A p 2 6 0 / R N A p 2

6 0 p 3 d

10-2

y = 0,318·e0,917x

R2= 0,9218

R N A p 2 6 0 / R N A p 2 6

0 p 3 d

10-510

-410

-310

-210

-110

0101

102

0 2 4 6 8

10-5

10-410-310-210-110010

110

2

0 2 4 6 8

R N A p 2 6 0 / R N A p 4 6 0 p 3 d

0 2 4 6 8

10-510-410-310-210-1100101

102

1 2 3 4 5 610

-1

100

101

102

103

0 2 4 6 810- 1

10 0

10 1

10 2

10 3

10 4

10 5

10-1

100

101

102

R e l a c i ó n d e R N A

n o r m a l i z a d a

nº pase

9 2 2

0 1 2 3 4

10-2

10-510

-410

-310

-210

-110

0101

102

0 2 4 6 810-510

-410

-310

-210

-110

0101

102

10-510

-410

-310

-210

-110

0101

102

0 2 4 6 8

10-5

10-410-310-210-110010

110

2

10-5

10-410-310-210-110010

110

2

0 2 4 6 8

0 2 4 6 8

10-510-410-310-210-1100101

102

10-510-410-310-210-1100101

102

1 2 3 4 5 61 2 3 4 5 610

-1

100

101

102

103

10-1

100

101

102

103

0 2 4 6 810- 1

10 0

10 1

10 2

10 3

10 4

10 5

0 2 4 6 810- 1

10 0

10 1

10 2

10 3

10 4

10 5

10-1

100

101

102

nº pase

A C

E

B

D F

C-S8p260/C-S8p260p3d

C-S8p260/C-S8p460p5d

C-S8p260/C L150C-S8P260P3d/C9.22

922

R N A p

2 6 0 p 3 d / R N A C

L 1 5 0

9 2 2

Figura 21: Competicion entre mutantes de VFA. Los experimentos de competicionentre C-S8p260 y otras poblaciones y clones de VFA se realizaron tal y como se especi-fica en el apartado 4.17 de Materiales y metodos. Las variantes virales se compitierondos a dos en infecciones a MDI=7-14 PFU/celula, sin diluir el virus entre pases. Alfinal de cada pase se midio la relacion de genomas de los dos virus en competicion. La

pendiente del ajuste exponencial entre los diferentes puntos se tomo como valor de efi-cacia biologica (Tabla 2). Los iniciadores empleados para la deteccion especıfica de cadavirus se describen en las Tablas 2 y 3. A) Competicion entre C-S8p260 y C-S8p260p3dmezclados inicialmente en proporcion 1:1 en PFU. B) Competicion entre C-S8p260 yC-S8p260p3d mezclados inicialmente en proporcion 1:1000 en PFU (4·107 PFU de C-S8p260p3d) C)Competicion entre C-S8p260 y C-S8p460p3d mezclados inicialmente enproporcion 1:1000 en PFU (8·107 PFU de C-S8p460p3d). D) Competicion entre C-S8p260 y C 922L150 mezclados inicialmente en proporcion 1:1000 de PFU (4·107 PFU deC 922l150). E) Competicion entre C-S8p260p3d y C9

22L150 mezclados inicialmente en pro-porcion 1:1000 en PFU (4·107 PFU de C9

22L150). F) Representacion de los experimentosB-E normalizando la relacion de RNA respecto al punto inicial. Los sımbolos que se re-

presentan debajo del panel F son validos solamente para distinguir las competicionesrepresentadas en el panel F y no en los paneles A a E. El ajuste exponencial de cadacompeticion sigue las siguientes ecuaciones: 260/C-S8p260p3d: y = 0,7297e0,8986x, R2

= 0,9793; 260/p5d: y = 2,1653e0,7803x, R2 = 0,8667; 260/C922L150: y = 3,9919e1,6056x,

R2 = 0,9393; C-S8p260p3d/C922L150: y = 1,7365e0,7087x, R2 = 0,8449.

72



C-S8p260 C-S8p260p3d C-S8p460p5d C 922L150 C-S8p460

C-S8p260 2,45a 2,18 4,35 C-S8p460b

C-S8p260p3d C-S8p460p5d 2,30 NDC-S8p460p5d ND ND

C 922L150 NDC-S8p460

Tabla 5: Valor de eficacia biologica relativa de variantes del VFA. Los valores representadoscorresponden a la eficacia biologica ( fitness ) de la variante viral indicada en la primera columna,calculada como se explica en el apartado 4.17 de Materiales y metodos, a partir de los resultadosde competicion mostradas en la Figura 21. El virus competidor se indica en la fila superior. En lacompeticion entre C-S8p260p3d y C-S8p260p5d no se determino un valor de fitness y el ultimovirus fue el dominante, determinado por secuenciacion. N.D, no determinado.aMedia obtenida con los experimentos mostrados en la Figura 21-A y B.bNo se determino un valor de fitness. Virus dominante segun (Garcıa-Arriaza y col. 2006).

cercano a 2 (ver solapamiento de las curvas normalizadas C-S8p260 frente C-S8p260p3d y C-S8p260frente a C-S8p460p5d en la Figura 21-F y Tabla 5). Este resultado fue muy inesperado ya que losvirus procedentes de una misma serie evolutiva tienden a aumentar su fitness con el numero depases (Arias y col. 2004; Escarmis y col. 1999; Garcıa-Arriaza y col. 2006; Novella y col. 1995; No-vella y Ebendick-Corpus 2004). De hecho, el virus defectivo C-S8p460 sı desplazo en competicional defectivo C-S8p260, tal y como se reporto previamente (Garcıa-Arriaza y col. 2006) (Tabla 5).

Los resultados de las competiciones sugieren que el virus defectivo mantiene el doble de eficaciabiologica respecto al virus ST homologo de secuencia, tanto en competicion directa entre ellos,como al comparar su fitness relativa respecto a virus con menor eficacia biologica.

5.2.2. Cineticas de replicacion del RNA

Para localizar la fase del ciclo de replicacion viral en la que residıa la ventaja selectiva del sistemadefectivo, se determino la cinetica de sıntesis de RNA vırico. La velocidad de replicacion del RNAintracelular del virus defectivo y ST se calculo midiendo el RNA total de C-S8p260 y C-S8p260p3d,en infecciones paralelas tal y como se explica en el apartado 4.16 de Materiales y metodos (Figura22-A). Las infecciones se realizaron a alta multiplicidad de infeccion (MDI=20 PFU/celula), paraasegurar que la totalidad o la mayorıa de las celulas estaban coinfectadas y que se permitıa lacomplementacion entre los dos tipos de partıculas defectivas. Asimismo, a alta MDI se da una solaronda de infeccion evitando posibles distorsiones derivadas de infecciones sucesivas. La replicaci on

intracelular del RNA viral en los picornavirus es un proceso exponencial (Regoes y col. 2005). Latasa de sıntesis de RNA viene determinada por la pendiente en una representacion semilogarıtmica(Figura 22). Tanto C-S8p260 como C-S8p260p3d presentaron una cinetica exponencial de sıntesisde RNA tras el breve perıodo de entrada (Figura 22-A). Las dos cineticas presentan una pendientemuy similar y solapada. Los resultados sugieren que los virus defectivos no poseen una mayorvelocidad de replicacion que el virus estandar cuando los dos tipos virales replican sin coinfectarcelulas.

Para investigar si una posible ventaja replicativa del virus defectivo se manifestaba s olo encompeticion con virus estandar se determino la cinetica de replicacion del RNA viral en celulascoinfectadas. Mediante iniciadores especıficos se distinguio la proporcion del RNA de cada virus en

73



Defectivo

Estándar

101

102

103

104

105

106

107

80 130

M o l é c u l a s d e R N A / c é l u l a

0 20 40 60 80 100

tiempo (min.)

60 110 160 210 26060 110 160 210

101

102

103

104

105

106

107

101

102

103

104

105

106

107

101

102

103

104

105

106

107

30

101

102

103

104

105

106

107

M o l é c u l a s d e R N A / c é l u l a

tiempo (min.)

101

102

103

104

105

106

107

101

102

103

104

105

106

107

101

102

103

104

105

106

107

101

102

103

104

105

106

107

101

102

103

104

105

106

107

A B

C D

Figura 22: Cineticas de replicacion de RNA de virus defectivo y estandar en celulasBHK-21.Las cineticas se realizaron midiendo RNA viral intracelular o extracelular mediante RT-PCR a tiempo real, como se especifica en el apartado 4.16 de Materiales y metodos. Las celulas se

infectaron a una MDI=20 PFU/celula. Para discriminar el RNA de los competidores en las infec-ciones con mezclas de C-S8p260p3d y C-S8p260, se utilizaron iniciadores especıficos de cada viruspara RT-PCR. Para estimar la cantidad de RNA de la poblaci on C-S8p260 se midio el RNA ∆999y se multiplico por 2,5 (Garcia-Arriaza y col. 2004). Los datos estan normalizados y se muestrancomo moleculas de RNA/celula. En todos los experimentos se midio en paralelo el RNA viral encelulas sin infectar, y en todos los casos la amplificacion fue negativa. A) Cinetica de la variaciondel RNA viral total intracelular en infecciones paralelas (separadas) de C-S8p260p3d (Estandar)y C-S8p260 (Defectivo). Cada punto representa la media de dos determinaciones de dos infeccio-nes independientes en cada tiempo. Se indican los tiempos post-inoculacion. Las lıneas continua ydiscontinua representan el ajuste exponencial a la replicacion de C-S8p260p3d y C-S8p260, respec-tivamente (C-S8p260p3d: y = 888,86e0,0544x, R2 = 0,9227; C-S8p260: y = 485,35e0,065x = 0,9374).

B) Cinetica de entrada en la coinfeccion de C-S8p260p3d y C-S8p260. Cada punto representa lamedia y desviacion estandar de la cantidad de RNA intracelular determinando tres infeccionesindependientes en paralelo. El eje de abscisas representa el tiempo que se deja adsorber al virusantes de extraer el RNA intracelular. C) Cinetica de replicacion intracelular en coinfeccion de C-S8p260p3d y C-S8p260 usando iniciadores especıficos para la deteccion del genoma de cada virus.Cada punto representa la media y desviacion estandar de tres infecciones independientes realizadasen paralelo. El tiempo inicial corresponde a la incubaci on post-inoculacion. D) Cantidad de RNAen el sobrenadante de las infecciones utilizadas en C). Cada punto representa la media y desviacionestandar de tres determinaciones en infecciones paralelas

74



distintos momentos del ciclo de replicacion viral. De este modo se midio: (i) la velocidad a la queel RNA de ambos virus penetra dentro de la celula, (ii) la velocidad de replicacion en el citoplasmay (iii) la velocidad de salida al medio extracelular.

La entrada de las dos especies de RNA en la coinfeccion de celulas BHK-21 siguio tambien unacinetica paralela (Figura 22-B). Los dos tipos virales entran rapidamente en la celula, y alcanzan

ambos un primer pico de virus intracelular a los 15 minutos post-inoculaci on. Posteriormente lacantidad de RNA se mantuvo aproximadamente constante en los dos virus hasta los 60 minutospost-inoculacion. En ese punto comenzo el proceso de sıntesis de RNA de manera exponencial, quede nuevo presento una cinetica paralela y solapada en los dos tipos virales. Los procesos tempranosde replicacion viral siguen, por tanto, un curso paralelo en celulas coinfectadas por los dos tiposvirales.

Los niveles intracelulares de RNA viral en celulas coinfectadas con C-S8p260 y C-S8p260p3d sedeterminaron durante todo el ciclo de replicacion (Figura 22-C). Paralelamente se midio la cineticade salida del RNA al medio extracelular utilizando el sobrenadante de las mismas infecciones(Figura 22-D). La replicacion intracelular de los dos virus se volvio exponencial tras 60 minutospost-inoculacion (tal como se observo en el experimento mostrado en la Figura 22-B). Las pendientes

de la curva de sıntesis de RNA sugieren que los dos virus poseen la misma tasa de acumulacionde RNA, tambien en condiciones de coinfeccion. A los 160 minutos post-inoculacion la tasa deincremento exponencial de RNA intracelular disminuyo paralelamente en los dos virus, al alcanzaruna concentracion de RNA intracelular algo mayor de 105 moleculas de RNA genomico/celula.Ello quiza refleje un equilibrio entre la sıntesis de RNA y la salida de este al medio extracelularen forma de partıculas virales, puesto que la tasa de salida del RNA al medio extracelular nodisminuyo durante el ciclo de replicacion.

La tasa de salida del virus de la celula (Figura 22-D) siguio tambien una cinetica exponencialdurante el tiempo en que se realizaron las mediciones. Entre el minuto 105 y 135 post-inoculaci oncomenzo la salida de los virus al medio extracelular, que presentaron una cinetica muy paralela(Figura 22-D). Estos resultados sugieren que la replicacion de los virus ST y defectivo siguen una

cinetica muy similar tanto de acumulacion de RNA intracelular en infecciones paralelas, como develocidad de entrada, replicacion intracelular y salida al medio extracelular, en celulas coinfectadascon los dos tipos virales.

No se pudo detectar, por tanto, variaciones en la relaci on de RNA defectivo respecto al RNAST. Dicha relacion se mantuvo constante durante todo el proceso de replicacion intracelular ytambien cuando la celula liso y el RNA se libero al medio (Figura 22). Para descartar que elRNA no encapsidado interfiriese en las mediciones de RNA, enmascarando la relacion de partıculasvirales, el sobrenadante de seis coinfecciones paralelas a alta MDI con los dos virus, se trato conRNAasa A (Materiales y metodos, 4.18). El tratamiento del sobrenadante de infeccion con RNAasano altero las proporciones relativas de cada tipo viral (Figura 23), lo que sugiere que la relaci on deRNA vırico total es la misma que la relacion de RNA encapsidado.

5.2.3. Cinetica de expresion de proteınas virales

Dado que no se detectaron diferencias en la tasa de replicacion del RNA se investigo si la traduc-cion de proteınas estaba adelantada o retrasada en alguno de los dos virus. Se determino la cineticade sıntesis de proteınas virales, mediante marca je metabolico. Se electroporaron celulas BHK-21con RNA transcrito de los plasmidos pMT260p3d y la mezcla pMT260∆417ns y pMT260∆999ns(Figura 17). Las celulas se marcaron con [35S]Met/Cys como se especifica en la seccion 4.20.2 deMateriales y metodos, a distintos tipos post-electroporacion. El analisis electroforetico de extractosproteicos y de densitometrıa de proteınas especıficas virales, muestra una cinetica muy paralela en

75



10-2

10-1

10

0

101

102

SinRNAasa

ConRNAasa

M o l é c

u l a s d e

R N A p 2 6 0 / p 2 6 0 p 3 d

Figura 23: Ensayo de proteccion a RNAasa. Una parte del sobrenadante de infec-ciones con mezclas de C-S8p260 y C-S8p260p3d, despues de observar efecto citopaticocompleto, se trato durante una hora con RNAasa A, segun se especifica en el apartado4.18 de Materiales y metodos. Otra parte se trato en paralelo en ausencia de RNAasaA.

La relacion de moleculas del virus defectivo y estandar se midio mediante amplificacioncon oligonucleotidos especificos de cada virus. Se muestra el promedio de 6 determina-ciones procedentes de infecciones paralelas.

la expresion de proteınas en las celulas electroporadas con ∆RNAs respecto a las celulas electro-poradas con RNA ST (Figura 24). Por tanto, la mayor eficacia biol ogica de la poblacion C-S8p260respecto a C-S8p260p3d no se asocia con una cinetica mas rapida de expresion de proteınas virales.

5.2.4. Determinacion de la infectividad especıfica y su relacion con fitnessResultados previos en el laboratorio sugirieron que la produccion de partıculas virales totales al

final del ciclo de infeccion pudiera ser diferente en C-S8p260p3d y en C-S8p260 (Garcia-Arriaza ycol. 2004). El numero de moleculas de RNA vırico en el sobrenadante de infeccion, tras observarseefecto citopatico completo, resulto ser 2,6±0,47 veces mayor en el virus ST que en el virus defectivo(Tabla 6). Para poder confirmar estadısticamente ese resultado, se midio el numero de moleculasde RNA genomico de los dos virus en el sobrenadante resultante de 7 infecciones independientes yparalelas, tras observarse efecto citopatico completo. La cantidad de RNA total progenie producidopor C-S8p260p3d resulto ser 2,82±2,06 veces superior al de C-S8p260 (T-student, p<0,01; Tabla6), en concordancia con los resultados previamente descritos. La cuantificacion de la cantidadde partıculas virales mediante microscopıa electronica mostro que la produccion de partıculas con

genoma ST resulto ser 2,73±0,42 veces mayor que de virus con ∆RNA (Garcia-Arriaza y col. 2004),de acuerdo con los resultados obtenidos al medir moleculas de RNA. Sin embargo ambos viruspresentaron un tıtulo de 2,2·108 PFU/ml. Por tanto, estos resultados indican que la infectividadespecıfica, es decir, la relacion de virus infeccioso respecto a virus no infeccioso en el virus ST es0,38 veces la del virus defectivo (es decir, el virus defectivo tiene una infectividad especıfica 2,6veces mayor que el virus ST) (Tabla 6). Las diferencias observadas en infectividad especıfica delvirus defectivo respecto al ST, fueron muy similares a las diferencias en fitness entre los mismosvirus (Tabla 6).

Para calcular el tıtulo viral de de las poblaciones virales con genoma segmentado es necesario

76



RNA totala Partıculas Viralesb Tıtulo viralc Infectividad especıfic(no moleculas/ (no de partıculas/ (PFU/ml)

ml sobrenadante) ml sobrenadante

C-S8p260p3d 9,5 ±0, 8× 1011 1, 5± 0, 6× 109 2, 2± 1× 108 2, 4× 10−4

C-S8p260 3,6±1, 68× 1011

5, 5± 0, 8× 108

2, 2± 1, 37× 108

6, 3× 10−4

Relacione 2, 6± 0, 47 2, 73± 0, 42 1± 0, 4 0,38p260p3d/p260 (2, 8± 2, 1)f

P (T Student)g p < 0,01 p < 0,01 p > 0,05 p < 0,01

Tabla 6: Infectividad especıfica de los virus estandar y defectivo.aCantidad de RNA total medida en el sobrenadante de infecciones en celulas BHK-21, tras efecto citopatico

completo. Estos valores fueron calculados previamente (Garcia-Arriaza y col. 2004); cada valor es la media

de tres determinaciones independientes.bEste valor se obtuvo por microscopıa electronica cuantitativa, utilizando preparados virales purificados por

gradiente de sacarosa (Garcia-Arriaza y col. 2004). Cada valor fue calculado a partir de 10 determinaciones

independientes.cTıtulo viral calculado como se especifica en el apartado 4.3.2 de Materiales y metodos (promedio de 5

determinaciones independientes).dCalculado como el cociente entre el RNA total y el tıtulo viral.eEstos valores (en toda la fila) son el cociente de los valores indicados en las dos primeras filas.f El valor entre parentesis procede de dividir la estimacion en 7 experimentos independientes en esta Tesis

Doctoral (no se muestran los datos), la relaci on de moleculas de RNA vırico C-S8p260p3d/C-S8p260.gSignificacion estadıstica mediante el test T de Student de las diferencias observadas en cada columna entre

el virus defectivo y el virus estandar.

77



211.8121

100.2

54.3

38.7

29.8

20

Mr (KDa) 1 - 1 . 5

H.P.E.

BHK

3CD

VP3

Actin

1 . 5 - 2

2 - 2 . 5

2 . 5 - 3

3 - 3 . 5

3 . 5 -

4

4 - 4 . 5

pMT260p3d

pMT260∆999ns+

pMT260∆417ns

VP1

38.7

H.P.E.

S í n

t e s i

s d e

p r o

t e í n

a

A

B

C

S í n t e

s i s

p r o t e

í n a

a c u

m u

l a d a

pMT260∆999ns

+

pMT260∆417ns

pMT260p3d

3D

0

0,5

1

1,5

2

2,5

1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5

0123456789

10

1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5

0

0,5

1

1,5

2

2,5

1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 50

0,5

1

1,5

2

2,5

1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 50

0,5

1

1,5

2

2,5

1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5

0123456789

10

1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 50123456789

10

1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 50123456789

10

1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5

0

0,5

1

1,5

2

2,5

1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 50

0,5

1

1,5

2

2,5

1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 50

0,5

1

1,5

2

2,5

1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5

0123456789

10

1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 50123456789

10

1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 50123456789

10

0123456789

10

1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 51 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5

0

0,5

1

1,5

2

2,5

1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 50

0,5

1

1,5

2

2,5

1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 50

0,5

1

1,5

2

2,5

1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 50

0,5

1

1,5

2

2,5

1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 50

0,5

1

1,5

2

2,5

1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 50

0,5

1

1,5

2

2,5

1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 50

0,5

1

1,5

2

2,5

1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 50

0,5

1

1,5

2

2,5

1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 50

0,5

1

1,5

2

2,5

1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5

0123456789

10

1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 50123456789

10

1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 50123456789

10

0123456789

10

1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 51 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 50123456789

10

1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 50123456789

10

1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 50123456789

10

0123456789

10

1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 51 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 50123456789

10

1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 50123456789

10

1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 50123456789

10

0123456789

10

1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 51 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5

1 - 1 . 5

1 . 5 - 2

2 - 2 . 5

2 . 5 - 3

3 - 3 . 5

3 . 5 -

4

4 - 4 . 5

1 - 1 . 5

1 . 5 - 2

2 - 2 . 5

2 . 5 - 3

3 - 3 . 5

3 . 5 -

4

4 - 4 . 5

Figura 24: Cinetica de expresion de proteınas de virus ST o segmentado. Las celulas

se electroporaron con un sobrenadante de celulas no infectadas (BHK), o con 12,5µg de RNA de

transcritos de los plasmidos pMT260∆417ns, pMT260∆999ns y su mezcla, o con el RNA trans-

crito de pMT260p3d. Las proteınas se marcaron con [35S]Met/Cys a partir de los 30 minutos

post-electroporacion, cada 30 minutos, y se separaron mediante SDS-PAGE; Mr (kDa), marcador

de masa molecular de proteınas. Las proteınas especıficas de virus (VP3, 3D, 3CD) se detectaron

mediante reaccion especıfica con anticuerpos monoclonales en ensayos de Western-blot (pane-

les inferiores). La cantidad de proteına celular se controlo observando la cantidad de actina,

visualizada mediante Western-blot (ver apartado 4.20.4 de Materiales y Metodos). A) Patron

de expresion de proteınas en celulas BHK-21 electroporadas con RNAs de pMT260∆417ns mas

pMT260∆999ns y pMT260p3d. B) Densitometrıa de proteınas, en unidades arbitrarias, expre-

sadas por los RNAs transcritos, en los tiempos indicados. C) Datos de densitometrıa de la parte

B, sumando en cada tiempo los valores obtenidos en los tiempos anteriores. Estos ensayos se

realizaron en colaboracion con la Dra. C.Perales.

78



Lisis2

10-

100

101

I n ó c u l

o 1

L i s i s 1 2

L i s i s 2 3

10-1

100

101

BA

y = 0,132e0,6596x

R2

= 0,9975

10-1

100

101

-1

0

1

2,01

1,99

2,43

10-1

100

101

10-1

100

101

I n ó c

u l o

E n t r a

d a

( 6 0

m i n

. )

F i n a l r e

p l i c .

e x p o

n e n c i a l

( 1 2 0

m i n

. )L i s i s

( 1 4 0

m i n

. )

Inóculo Lisis1

E n t r

a d a

E n t r

a d a

E n t r

a d a R

N A

d e f e c t i v o / R N A e s t á n d a r

R N A

d e f e c t i v o / R N A e s t á n d a r

Figura 25: Diseccion de la competicion entre el virus defectivo y estandar.Celulas BHK-21 fueron coinfectadas con las mismas PFU de virus defectivo y estandara una MDI de 20 PFU/celula. Se calculo la cantidad de RNA de cada virus utilizando losiniciadores especıficos descritos en las Tabla 2 y 3, y se estimo su relacion en el inoculoinicial (inoculo), en el medio intracelular tras 60 minutos de entrada (entrada), al final dela replicacion exponencial 120 minutos despues la entrada, y en el sobrenadante cuandolas celulas estaban lisadas (lisis). A) Cada punto es la media de 5 determinacionesen infecciones realizadas en paralelo (excepto en el inoculo inicial que es la media detres determinaciones). B) El sobrenadante obtenido, tras lisar las celulas en una primeraronda de infeccion, se utilizo para iniciar una nueva infeccion. El ciclo se repitio un totalde 3 veces. Cada punto representa la media y desviacion estandar de 4 determinacionesprocedentes de infecciones independientes. El incremento en la relacion de RNA, entre elinoculo y la entrada, se indica en el interior de la gr afica). El cuadro pequeno dentro delgrande representa los valores del inoculo y lisis de la grafica principal; la lınea representaun ajuste exponencial, equivalente a una grafica de fitness con valor de eficacia biologica

relativa de 1,93. Los valores del eje de abscisas equivalen al numero de pases en unagrafica de fitness estandar.

79



aplicar una correccion matematica, como se explica en Materiales y metodos (Apartado 4.3.3).Cabe la posibilidad de que dicha correccion pudiera tener un error mayor que la diferencia de dosveces observada en infectividad especıfica. Un error de dos veces es algo factible cuando se midenvalores con ordenes de magnitud en torno a 108. Para contrastar las diferencias en infectividadespecıfica se busco un experimento alternativo que corroborara esos datos y que arrojara luz sobre

la coincidencia entre las diferencias en eficacia biologica e infectividad especıfica.Experimentos previos con el PV (Barclay y col. 1998a), midieron la capacidad infectiva de

partıculas defectivas en un preparado viral, dejando adsorber los virus a una monocapa celular ymidiendo la cantidad de partıculas que penetraban en la celula. Se aplico esta tecnica para investigarlas diferencias en infectividad especıfica del VFA defectivo y ST. Para ello se midio la cantidad deRNA de cada tipo viral que entraba dentro de las celulas, dada una relacion inicial de los dostipos de virus en el inoculo de infeccion. Cuando los dos virus entraron en la celula (60 minutospost-inoculacion), se observo un incremento en la proporcion de virus defectivo (entrada respectoinoculo en la Figura 25-A). Sin embargo, esta relacion se mantuvo constante al medirla al finaldel proceso de replicacion y tras el efecto citopatico completo, tal y como se observo previamente(Figura 22-C,D). Dado que la cinetica de entrada en la celula transcurre paralela en los dos virus

(Figura 22-B), los datos demuestran que, efectivamente, los preparados de virus defectivo son m asinfecciosos que los de virus ST, de acuerdo con los datos observados mediante determinaciones decantidad de RNA, tıtulo viral, y cuantificacion de partıculas virales por microscopıa cuantitativa.

Para investigar cuantitativamente la importancia que la ventaja de la infectividad especıficapuede tener en el ciclo de replicacion viral, se midio la relacion de los dos tipos de genomas viralesseparando el ciclo de infeccion en tres fases: (i) inoculo, es la relacion de virus en el preparadoinicial; (ii) entrada, es la relacion de virus intracelular tras los 60 minutos post-inoculacion; enese punto todo el virus infeccioso ha entrado en la celula (Figura 22-B); (iii) lisis, o relacion delos dos virus en el sobrenadante, tras observar efecto citopatico completo, aproximadamente a los240 minutos post-inoculacion (Figura 25-B). El sobrenadante del punto de ”lisis” se utiliz o comoinoculo para establecer una nueva infeccion. Este proceso se repitio hasta medir la relacion entre los

dos tipos de genomas en 3 entradas consecutivas. La relacion de RNA de los dos virus se mantuvoconstante entre el punto de entrada y de lisis, es decir, durante la replicaci on viral ningun virusaumento su proporcion relativa. Sin embargo toda la variacion en la frecuencia relativa de los dosvirus se midio entre el inoculo y el virus que ha entrado en la celula. El incremento en la relacion delos dos virus fue de aproximadamente dos veces durante los tres ciclos consecutivos (Figura 25-B).Al eliminar el punto de entrada de la grafica, se obtiene la grafica tıpica de un ensayo de fitness

con un valor aproximado de 2 (ver cuadro insertado en la Figura 25-B). Por tanto los resultadossugieren que el virus defectivo es mas infeccioso que el ST. Las diferencias en infectividad especıficadescritas previamente (Tabla 6) son del mismo rango que la eficacia biologica relativa del C-S8p260respecto a su homologo estandar C-S8p260p3d (Tabla 5).

5.2.5. Analisis de la estabilidad de los virus C-S8p260 y C-S8p260p3d

Para investigar si el aumento en la infectividad especıfica se debıa a un aumento en la estabilidadde las partıculas, se midio la infectividad de los dos tipos de partıculas vıricas tras una incubaciona 37oC. Se utilizaron preparados de virus C-S8p260 y C-S8p260p3d con aproximadamente igualnumero de PFUs. Se incubaron volumenes identicos de cada preparado viral a 37oC durante 2h.Paralelemante y durante el mismo tiempo se mantuvieron otras alıcuotas de los mismos preparadosa 0oC. Al final de la incubacion se determino el tıtulo viral de los virus. El tıtulo de C-S8p260p3dtras la incubacion a 37oC fue 104 veces menor que el mismo virus mantenido en frıo, mientras queel de C-S8p260 fue 9 veces menor, lo que representa una diferencia de 11 veces (Figura 26-A).

80



103

104

105

106

107

108

0 1 2 3 4 5 6 7 8

p260 p3d

106

107

108

109

p3d p260

2h, 4ºC

2h, 37ºC

0 1 2 3 4 5 6 7 8

p260 p3d

Tiempo (h)

P F U

/ m l

P F U

/ m l

A B

Figura 26: Comparacion de la estabilidad de las partıculas defectivas yestandar a 37oC. Alıcuotas de preparados virales del virus defectivo y estandar seincubaron a 37oC en volumenes identicos. A distintos tiempos se retiraron las alıcuotasy se mantuvieron a 0oC. Paralelamente, en todo el proceso se mantuvieron alıcuotasdel virus a 0oC. Posteriormente se titularon las muestras en paralelo. A) Media y des-viacion estandar de la titulacion de tres muestras virales sometidas a la incubacion a37oC o a 0oC durante 2h. B) Media y desviacion estandar de la titulacion de tres mues-tras de virus a cada tiempo indicado. La cinetica de inactivacion del VFA se ajusta auna exponencial negativa de valor medio equivalente al tiempo medio de inactivacionde una partıcula (Mateo y col. 2007): C-S8p260: y = 4x107xe−0,9073x, R2 = 0,9954;C-S8p260p3d: y = 4x107xe−1,1896x, R2 = 0,982.

81



10-1

100

101

102

I n ó c

u l o

1

E n t r a

d a1

I n ó c

u l o

2

E n t r a

d a2

( L i s i s

, 3 5 0

m i n

. )

R N A d

e f e c t i v o /

R N A e

s t á n d a r

Figura 27: Efecto de la estabilidad de las partıculas virales en la infectividad.Celulas BHK-21 fueron coinfectadas con las mismas PFU de virus defectivo y estandara una MDI de 20 PFU/celula. Se calculo la cantidad de RNA de cada virus utilizando

los iniciadores especıficos descritos en las Tablas 2 y 3, y se estimo su relacion en elinoculo inicial (inoculo 1), en el medio intracelular tras 60 minutos de entrada (entrada1); los datos aparecen normalizados respecto al inoculo inicial. A los 350 min. post-inoculacion (tras observarse efecto citopatico completo) se midio la relacion de cadaRNA en el medio extracelular (inoculo 2); ese preparado viral se utilizo a su vez comoinoculo para una nueva infeccion, en la que se determino la relacion de RNA viral enel medio intracelular tras 60 minutos de entrada (entrada 2). Los valores de in oculo2 y entrada 2 aparecen normalizados respecto al inoculo 2. Se muestran la media ydesviacion estandar de tres determinaciones independientes.

En un segundo experimento se determino la cinetica de inactivacion. Los tıtulos obtenidos seajustaron a una exponencial negativa (Figura 26-B) (Mateo y col. 2007). De nuevo, se observ o mayorestabilidad en las partıculas defectivas, con una vida media de 66 minutos para C-S8p260 y de 50minutos para C-S8p260p3d (p< 0,001).

Para investigar la relacion de la estabilidad de las partıculas del virus C-S8p260 con su infec-tividad especıfica, y por tanto con su eficacia biologica, se realizaron tres coinfecciones paralelas aalta MDI con los virus ST y defectivo (Figura 27). El sobrenadante de la infeccion se recogio a los350 minutos post-inoculacion (aproximadamente, 100 minutos mas tarde que en el resto de experi-mentos) para permitir la inactivacion de los virus. Ese sobrenadante se utilizo para establecer unanueva infeccion. El incremento observado previamente en la frecuencia relativa del virus defectivoentre la entrada y el inoculo (Figura 25), se incremento 5 veces cuando la infeccion se dejo duranteun tiempo sostenido a 37oC. En conclusion, los resultados obtenidos sugieren que la ventaja se-lectiva de la version segmentada de C-S8c1 se debe, primordialmente, a una mayor estabilidad delas partıculas virales. En la Discusion (apartado 6.2) se proponen posibles mecanismos molecularesque pueden subyacer a esta diferencia de estabilidad.

5.3. Vacunacion de ratones C57BL/6 con virus defectivos

El pase de virus en cultivos celulares es un metodo clasico de atenuacion de virus (revisiones enBloom y Lambert 2003; Graham y Crowe Jr. 2007). La poblacion C-S8p260 tiene una historia de

82



0 15 30 45 60 75 90 105 1200 15 30 45 60 75 90 105 120A

B

n=21

10 PFU C-S8p260p3d7

10 PFU C-S8c14

n=4 100% muertos

entre 24-48h

n=16

5·10 PFU C-S8p2606

10 PFU C-S8c14

n=4

100% muertos

entre 24-48h

n=16

10 PFU (dilución 1:100) C-S8p2603

10 PFU C-S8c14

n=4 100% muertos

entre 24-48h

1/2 3 15 30 90/1/2/3 15 30Sangría

(días)

Inoculación virus

atenuado (vacunación)

Desafío con virus letal

Figura 28: Vacunacion de ratones adultos C57BL/6 con C-S8p260 y C-S8p260p3d. A) Esquema del protocolo de vacunacion, tiempos de tomas de muestra(sangrıas, triangulos negros invertidos) y desafıo con virus letal (C-S8c1); 21 ratoneshembra C57BL/6 fueron vacunados con 1·107 PFU del virus con genoma de tamanoestandar C-S8p260p3d. A los 90 dıas post vacunacion los ratones fueron desafiadoscon una dosis letal (1·104 PFU) del clon biologico de VFA C-S8c1. Cuatro animalessin vacunar fueron inoculados con C-S8c1 como control positivo de infecci on. B) Die-

ciseis ratones hembra C57BL/6 fueron vacunados con 1·107 PFU del virus defectivoC-S8p260; 15 ratones hembra C57BL/6 fueron vacunados con una diluci on 1:100 deC-S8p260 (equivalente 1·103 PFUs del virus defectivo). A los 90 dıas post-vacunacionlos animales fueron desafiados tal como se ha descrito en A).

83



S u p e r v i v e n c i a

d e r a t o

n e s

( % )

Días

post-desafío

Días post

vacunación

0

20

40

60

80

100

0 1 2 7 15 30 90 1 2 3 15 30

107PFU de

C-S8p260p3d

Ratones no

vacunados

104 PFU

de C-S8c1

0

20

40

60

80

100

0 1 2 3 15 30 90 1 2 3 15 30

5·106 PFU de

C-S8p260

Ratones no

vacunados

104 PFU

de C-S8c1

0

20

40

60

80

100

0 1 2 3 15 30 90 1 2 3 15 30

103 PFU de

C-S8p260

Ratones no

vacunados

104 PFU

de C-S8c1

Días

post-desafío

Días post

vacunación

Días

post-desafío

Días post

vacunación

Figura 29: Respuesta de ratones C57BL/6 a la vacunacion con virus vivoatenuado y a dosis letales del VFA C-S8c1. Supervivencia de ratones C57BL/6 ala inoculacion con el virus vacunal (parte izquierda de los paneles, hasta 90 dıas post-vacunacion) y al posterior desafıo con C-S8c1 (parte derecha de los paneles). El virusvacunal o de desafıo y dosis se indica en el interior de cada panel.

260 pases en celulas BHK-21. En el transcurso de estos pases acumulo 32 mutaciones en la secuenciaconsenso, de las cuales 25 dan lugar a un cambio de aminoacido. Ninguna mutacion afecto a residuosdirectamente implicados en las propiedades antigenicas del virus (Mateu y Verdaguer 2004). Estascaracterısticas hacen de esta poblacion una excelente candidata a ser inmunogenica y atenuada.Ademas, la poblacion C-S8p260 necesita de alta MDI para mantener la complementacion e infectarcelulas productivamente (Garcia-Arriaza y col. 2004). Durante las infecciones in vivo, es probableque se den las condiciones de alta MDI en la zona inicial de inoculacion y que posteriormente el virusse diluya en el organismo desencadenando una respuesta inmune pero con baja probabilidad paradar virus progenie. Por estas razones, en colaboracion con el grupo de la Dra. Noemı Sevilla (CISA,

INIA) se investigo el virus C-S8p260 como posible candidato a cepa vırica atenuada. De resultaratenuado, este virus podrıa ser candidato a vacuna viva atenuada con dos niveles de seguridad: (i)la atenuacion propia de los multiples pases en cultivos celulares, y (ii) la necesidad de alta MDIpara complementar y producir progenie infecciosa.

La capacidad inmunogenica de C-S8p260 en ratones adultos C-57BL/6 fue estudiada adminis-trando las dosis vıricas y con el cronograma y controles descritos en la Figura 28. Paralelamente, seinocularon ratones con el virus C-S8p260p3d para ensayar la virulencia del posible virus est andarque pudiera surgir por recombinacion de los ∆RNAs tras la vacunacion con C-S8p260. El virus STC-S8p260p3d se inoculo a la concentracion maxima que se pudo obtener con preparados de infec-ciones en cultivos celulares. Se obtuvieron muestras de sangre a distintos tiempos post-inoculacionde los virus ensayados. A los 90 dıas los animales fueron desafiados con 1

·104 PFU del clon de VFA

C-S8c1, virulento para ratones C57BL/6 (Salguero y col. 2005). En paralelo, se desafiaron ratonescontrol que no habıan sido vacunados. Se obtuvieron muestras de sangre a distintos tiempos despuesdel desafıo.

5.3.1. Proteccion por la vacunacion con C-S8p260 y C-S8p260p3d

Se realizo un seguimiento periodico de los ratones con especial atencion a la aparicion de sınto-mas clınicos asociados a la infeccion por VFA (deshidratacion, apatıa, postura encorvada, ataxia,etc., descritos en (Salguero y col. 2005)). Ninguno de los ratones vacunados presento sıntomas clıni-cos evidentes. La supervivencia de los ratones a la inoculacion con el virus ST C-S8p260p3d y a

84



las distintas dosis de C-S8p260 fue del 100 %, con un total de 52 animales analizados (Figura 29).A los 90 dıas post-vacunacion todos los ratones fueron desafiados con C-S8c1. Los animales quehabıan sido inoculados con C-S8p260 o C-S8p260p3d permanecieron sin sıntomas clınicos durantemas de un mes post-desafıo. El 100 % de los ratones control sin vacunar murieron entre las 24-48hpost inoculacion. Los resultados demuestran que las poblaciones C-S8p260 y C-S8p260p3d son ate-

nuadas para ratones C-57/BL6, y que la administracion de estos dos virus protege de la infeccioncon dosis letales del clon virulento C-S8c1.

5.3.2. La vacunacion con virus defectivos confiere proteccion esteril

Para investigar si la proteccion conferida por los virus C-S8p260 y C-S8p260p3d era esteril(es decir, evitaba la replicacion viral), se titulo la infectividad viral presente en la fraccion desuero de las muestras de sangre, obtenidas de los ratones a distintos tiempos post-vacunaci on ypost-desafıo. El nivel de viremia fue indetectable en los animales inoculados con C-S8p260 trasla vacunacion y tambien despues de la inoculacion con el virus de desafıo C-S8c1 (Figura 30).Algunos de los animales inoculados con el virus estandar C-S8p260p3d presentaron viremia (14

de los 20 analizados a las 24h post-vacunacion y 17 de los 20 a las 48 h post-vacunacion), noasociada a sıntomas clınicos. Sin embargo, la viremia disminuyo a niveles indetectables a los sietedıas post-inoculacion. Estos mismos ratones presentaron viremia indetectable despues del desafıocon C-S8c1.

Los resultados indican que la vacunacion con el virus C-S8p260 confiere proteccion esteril.No se detecto replicacion del virus C-S8p260 en ningun raton vacunado, ni replicacion de C-S8c1despues del desafıo. Tampoco se detecto, mediante titulacion de sueros, la aparicion de virus STrecombinante en animales vacunados con virus defectivo.

5.3.3. Capacidad inmunogena de la vacunacion con C-S8p260

El suero de los ratones vacunados con C-S8p260 y C-S8p260p3d se analizo mediante ELISApara la deteccion de anticuerpos del tipo IgG2, a distintos tiempos post-vacunaci on y post-desafıo(Figura 31). Los resultados demostraron que, tanto los ratones vacunados con C-S8p260, como losvacunados con C-S8p260p3d, presentan un elevado tıtulo de anticuerpos anti-VFA en sangre. Enlos primeros dıas tras la vacunacion, el tıtulo de anticuerpos aumento hasta alcanzar un maximoel dıa 15 post-vacunacion, con los dos inmunogenos y dosis ensayados. Los ratones vacunados conC-S8p260p3d alcanzaron un tıtulo de anticuerpos un orden de magnitud superior que los ratonesvacunados con C-S8p260. El tıtulo alcanzado a los 15 dıas post-vacunacion se mantuvo constanteen el suero pre-desafıo y en los sueros obtenidos tras el desafıo con C-S8c1. El tıtulo de anticuerposfue muy similar al que proporciona la vacunacion de la misma estirpe de ratones con la vacuna deVFA inactivada comercial (Salguero y col. 2005).

5.3.4. Los ratones vacunados con C-S8p260 generan anticuerpos neutralizantes

La respuesta inmune contra el VFA en el hospedador natural es principalmente del tipo Th2o humoral (McCullough y Sobrino 2004). La presencia de anticuerpos neutralizantes en el suerode animales vacunados se ha correlacionado con los niveles de proteccion de vacunas frente a VFA(Barteling 2004). Para evaluar la capacidad neutralizante de los anticuerpos presentes en ratonesvacunados con las poblaciones C-S8p260 y C-S8p260p3d, se realizaron ensayos de neutralizacion deinfectividad de C-S8c1 en celulas BHK-21 (Tabla 7). Se analizaron sueros de 10 animales vacunadoscon distintas dosis de cada virus, y se calcul o el PRN70 (ver apartado 4.10.4 de Materiales ymetodos). Tanto los ratones inoculados con la dosis alta como los vacunados con la dosis baja de

85



123456789

0 1 2 7 15 30

T í t u l o v i r a l ( l o g P F U / m l s u e r o )

107 PFU

C-S8p260p3d

123456789

0 1 2 3 4

5·106 PFU

C-S8p260

B

123456789

0 1 2 3 4

103 PFU

C-S8p260

9

12345678

0 1 2 3 4

104 PFU C-S8c1

12345678

0 1 2 3 4

104 PFU C-S8c1

12345678

0 1 2 3 4

104 PFU C-S8c19 9

Días post-vacunación

Días post-desafío

A C

Figura 30: Tıtulo viral en el suero de ratones C57BL/6 vacunados. Ratoneshembra con ocho semanas de edad fueron inoculados en la almohadilla plantar condiferentes variantes y dosis del VFA, indicadas en cada panel. En los dıas indicados seextrajo sangre, se separo el suero y se titulo la carga viral del virus vacunal (C-Sp260p3do C-S8p260) en celulas BHK-21 (paneles superiores). A los 90 dıas post vacunacion losanimales fueron desafiados con 1 × 104 PFU de C-S8c1. Los dıas siguientes al desafıo(paneles inferiores) se titulo el suero extraıdo de la sangre, para detectar replicacion deC-S8c1. A) Media y desviacion estandar del tıulo viral en el suero de 19 animales. Lalınea punteada representa el lımite de deteccion del tıtulo de C-S8p260p3d o C-S8c1.B) y C) Media y desviacion estandar del tıtulo viral en el suero de 16 animales. La

lınea de puntos y rayas representa el lımite de deteccion del tıtulo de C-S8p260. Loslımites de deteccion para C-S8p260p3d (panel superior) o para C-S8c1 (panel inferior)se representan con una lınea punteada.

86



1

2

3

4

5

6

1 2 7 15 30 90 1 2 3 15 30

C-S8p260p3d

(1·107

PFU)

7

1

2

3

4

5

6

1 2 3 15 30 90 1 2 3 15 30

1

2

3

4

5

6

1 2 3 1 2 3 15 30

C-S8p260

(5·106

PFU)

T í t u l o E L I S A

( L o g 1 0 )

Días

post-vacunación

Días

post-desafío

Días

post-vacunación

Días

post-desafío

Días

post-vacunación

Días

post-desafío

C-S8p260

(5·106

PFU)

30 9 10

A B C

Figura 31: Respuesta de anticuerpos en ratones vacunados con C-S8p260p3dy C-S8p260. Tıtulo de anticuerpos IgG2 (calculado como se describe en el apartado4.10.5 de Materiales y metodos) estimado mediante ELISA en el suero de animalesvacunados. En el interior de cada panel se indica el virus y dosis de vacunaci on odesafıo con el que fueron inoculados los animales. A) Media y desviacion estandar del

tıtulo de anticuerpos en el suero de 20 animales. B) Media y desviacion estandar deltıtulo de anticuerpos en el suero de 16 animales. C) Media y desviacion estandar deltıtulo de anticuerpos en el suero de 15 animales.

C-S8p260p3da C-S8p260b

Pre-desafıo Pre-desafıo 72h post-desafıo Pre-desafıo 72h post-desafıo

raton PRN70 raton PRN70 raton PRN70 raton PRN70 raton PRN70

1 2,9 5 2,0 5 1,8 5 2,0 5 1,92 2,6 6 2,0 6 2,0 6 2,1 6 1,8

3 2,7 8 2,4 8 2,2 8 0 7 1,84 2,7 9 2,1 9 1,9 9 1,7 8 1,85 2,7 10 1,3 10 1,5 10 1,4 9 2,46 2,6 11 1,7 11 1,8 11 1,6 10 1,87 2,7 12 0,4 12 1,9 12 1,4 11 1,88 3,1 13 1,7 13 1,8 13 0,6 12 1,19 1,8 14 2,7 14 2,4 14 1,4 14 1,5

10 3,0 15 1,9 15 1,9 15 1,7 15 1,8Media 2,7 1,8 1,9 1,4 1,8

Desv. Est. ±0,3 ±0,6 ±0,2 ±0,6 ±0,3

Tabla 7: Tıtulo de anticuerpos neutralizantes en ratones vacunados con C-S8p260 yC-S8p260p3d. El tıtulo de anticuerpos neutralizantes se estimo calculando el PRN70, como seespecifica en el apartado 4.10.4 de Materiales y metodos.a Tıtulo de anticuerpos neutralizantes en sueros de ratones vacunados con 1·107 PFU deC-S8p260p3d, en el momento del desafıo con C-S8c1 (90 dıas post vacunacion). Los ratonesempleados aparecen numerados. Poblaciones virales discriminadas positivamente mediante lasamplificaciones especıficas indicadas.b Tıtulo de anticuerpos neutralizantes en sueros de ratones vacunados con 5·106 o 1·103 PFU deC-S8p260, en el momento del desafıo con C-S8c1 (90 dıas post vacunacion) y 72h despues del desafıo.

87



C-S8p260, presentaron un PRN70 cercano a 2 a las 72h post-desafıo. El suero pre-desafıo de losratones vacunados con la dosis baja presentaba un tıtulo de neutralizacion algo menor. Los animalesvacunados con C-S8p260p3d presentaron un PRN70 cercano a 3 en los sueros previos al desafıo.Los resultados confirman que la vacunacion con virus defectivo induce la aparicion de anticuerposneutralizantes dirigidos contra VFA.

5.4. Topologıa de poblaciones virales sometidas a mutagenesis

El presente estudio esta dirigido a analizar retrospectivamente grupos de secuencias de nucleoti-dos tanto consenso como de poblaciones clonales, obtenidas en nuestro laboratorio a partir de pobla-ciones del VFA sometidas a infecciones citolıticas en celulas BHK-21. Las infecciones se realizaronen ausencia o en presencia de los analogos de base o nucleosidos mutagenicos 5-fluorouracilo (FU),5-azacitidina (AZC), ribavirina (R) (Gonzalez-Lopez y col. 2004; Gonzalez-Lopez y col. 2005; Sierray col. 2007; Sierra y col. 2000) (Figura 32).

5.4.1. Evaluacion filogenetica de la diversificacion genetica inducida por la mutagene-

sis en las poblaciones de VFASe obtuvo una representacion de cada cuasiespecie determinando la secuencia de nucleotidos de

5 a 21 clones de cDNA de cada poblacion, y determinando los tipos de mutacion y la complejidaddel espectro de mutantes. Se utilizo la region codificante de la polimerasa 3D (Tabla 8). Los arbolesfilogeneticos se construyeron a partir de secuencias de nucleotidos de clones de cDNA individuales,incluyendo tambien la secuencia consenso de la poblacion correspondiente. Como secuencia externa(outgroup), se introdujeron secuencias de varios virus de referencia para establecer las relacionesmınimas y previamente conocidas, ası como para definir la estructura general del arbol. Se utilizo elalgoritmo de NJ (Saitou y Nei 1987), con el modelo de Kimura 2-parametros (Kimura 1980) parareconstruir las filogenias, tal como se describe en Materiales y metodos. En algunos casos se con-firmo la topologıa de los arboles mediante los metodos de maxima verosimilitud (MV) y maximaparsimonia (MP) (Felsenstein 1989) (vease Materiales y metodos 4.23 y apendice filogenetico). Lacomparacion de los arboles filogeneticos realizada a partir de las secuencias de nucleotidos de clonesprocedentes de poblaciones de VFA pasadas 1 y 25 veces en presencia o ausencia de AZC o FU,muestra una expansion de las distancias geneticas entre los componentes del espectro de mutantesde las poblaciones, como resultado del tratamiento con FU y, en menor medida, como resultadodel tratamiento con AZC (Figura 33). Esta expansion no se observa en el pase 1 en presencia oen ausencia de AZC o de FU. Las ramas irradian de las secuencias consenso correspondientes sinagrupaciones (clusters) discernibles dentro de cada poblacion.

En las poblaciones de VFA clon MARLS (ver Materiales y metodos, apartado 4.2), pasadasen presencia de R (Figura 34) se observo un patron mas complejo de distancias geneticas intrapo-blacionales. La topologıa general de poblaciones sometidas a un tratamiento mutagenico continuo(RAp35, RAp45 y RAp60; cuyas historias de pases se muestran en la Figura 32-B), indica de nue-vo la ausencia de agrupaciones significativas. En todos los casos, un grupo de clones divergen demanera centrıfuga a partir de la secuencia consenso, localizada en la base del grupo. A medidaque aumenta el numero de pases en presencia de R, se incrementan sustancialmente las distan-cias geneticas entre las secuencias consenso de cada poblacion y el clon parental MARLS (hasta11 veces desde el pase 35 al pase 60; Figura 34-A). Es muy notable que las dos poblaciones quefueron sometidas en paralelo a 30 pases en presencia de R y despues a 5 pases en ausencia de R,presentan una estructura interna modificada, tal y como se refleja en la topologıa mas compacta yen la distribucion de los arboles filogeneticos con ramas estructuradas en subgrupos (RA0p35* y

88



C-S8c1

p1 p25

.....

p1 p25

.....

p1 p25

.....

sin droga

[200µg/ml]

FU

A

B

…

C-S8c1 p1 p213

MARLS

.....

…

RAp35[200-800mM] R

[800mM] R

…

RAp45 RAp60

RA0p35

[800mM] R

sin droga

…

[800-5000mM] R

RAp30

…

sin droga

CAp35…

RB0p35sin droga

…

[200µg/ml]

FU

[10µg/ml]

AZC[10µg/ml]

AZC

sin droga

sin droga

…

…

[200-800mM] R

sin droga

Figura 32: Esquema de pases del clon biologico C-S8c1 en celulas BHK-21, su- jeto a diferentes tratamientos. Los clones biologicos se representan como cuadradosnegros y las poblaciones sin clonar como cırculos blancos. Las flechas gruesas indicanpases a alta MDI (1 a 5 PFU/celula). La ausencia o presencia de droga y su concentra-cion se indica encima de las flechas correspondientes. A) El clon biologico C-S8c1 fuesometido a tres series paralelas de infecciones citolıticas, en presencia de 5-fluorouracilo(FU) o de 5-azacitidina (AZC) o en ausencia de droga. B) C-S8c1 fue sometido a 213pases, a partir de cuya poblacion se aislo el clon MARLS como mutante resistente al

anticuerpo monoclonal SD6 (flecha delgada). Las poblaciones RA y RB se originarontras infecciones citolıticas seriadas, en paralelo, del clon MARLS en presencia de lasconcentraciones indicadas de R. En el pase 30 se realiz o una bifurcacion y la pobla-cion fue sometida a 5 pases adicionales en ausencia de R, dando lugar a la poblaci onRA0p35. CAp35 es la poblacion obtenida tras pasar en paralelo el clon MARLS 35 vecesen ausencia de droga.

89



C S 8 c 1

MARL S 0.001

C-S8c1

MARL S

Pase 1 Pase 25

A Z C p

1 *

F U p 1 *

s i n

d r o

g a

p 1 *

A Z C

p 2 5 *

sin droga p25 *

F U p 2 5 *

65 65

51

64

P

P

PP

P

Figura 33: Analisis filogenetico de clones moleculares individuales de las po-blaciones de VFA pasadas en ausencia y en presencia de mutagenos. Losarboles se construyeron con secuencias de la region que codifica la polimerasa 3D (nu-cleotidos 6609 a 8013; numeracion de los residuos del genoma del VFA C-S8c1 segun(Escarmis y col. 1996)). El analisis se realizo con la progenie del virus C-S8c1 obtenidatras los pases 1 y 25 en celulas BHK-21 (Figura 32-A), en presencia o ausencia de 5-fluorouracilo (FU) o 5-azacitidina (AZC) . Se utilizo el metodo de NJ, con el algoritmode Kimura 2-parametros, y un muestreo por bootstrap de 1000 veces. Los valores debootstrap mayores de 50 se indican en los nodos correspondientes. Cada punto represen-ta la secuencia de un clon individual de la siguiente manera: rojo, clones de poblaciones

pasadas en ausencia de droga (sin droga); verde, clones procedentes de poblaciones pasa-das en presencia de FU; azul, clones procedentes de poblaciones pasadas en presencia deAZC. La posicion de la secuencia consenso de las correspondientes poblaciones se indicacon un asterisco. MARLS se incluye como secuencia de referencia externa (outgroup).La barra marca la escala de distancia genetica segun el modelo de Kimura 2 parametros.Las secuencias centrales segun PAQ se indican con una flecha. El origen de los virus, losprocedimientos para el analisis clonal y las determinaciones de la secuencias se detallanen Materiales y metodos.

90



0.002

R A p 6 0 *

M A R L S

p 2 6 0 p 3 d p 2 0 0

C S 8 c1

99

100

79

98

76

C S 8 c 1 p 2

6 0 p 3 d

p 2 0 0

M AR L S

R A p 3 5 *

78(73)

76

RA 0 p 3 5 *

MARLS

p 2 6 0 p 3 d

p 2 0 0 C

S 8

c 1

98

(71)

0.002

A BCAp35*

MARLS

p200

p260p3d

C S 8 c

1

99

(65)

RAp45* M A R L S

p 2 6 0

p 3 d

p 2 0 0

C S 8 c 1

99

99(66)

(64)

P

P

P

R A p 3 5 *

M A R L

S

p 2 6 0 p 3

d

p 2 0 0

C S 8 c 1

99

8191

(63)

(62)

(70)

P

PP

R B 0 3 5

*

M AR LS

p 3 d p 2 0 0

C S 8 c 1

91

98

85

53

65

Figura 34: Analisis filogenetico de clones moleculares individuales de las subpoblacionesde MARLS pasadas en presencia o ausencia de ribavirina. Los arboles se construyeron conel metodo de NJ, con el modelo de Kimura 2-parametros, con un valor de muestreo de bootstrap de1000 veces. Los nodos con valores de bootstrap mayor de 50 se indican en el arbol. Cada arbol re-presenta una unica poblacion del linaje de MARLS representado en la Figura 32-B. Cada poblacionse identifica con el nombre de su secuencia consenso correspondiente, indicado con un asterisco.Cada punto representa la secuencia de un clon molecular individual. Las secuencias centrales segunPAQ se indican con una flecha. A) Arboles construidos con secuencias de la region que codifica lapolimerasa 3D (nucleotidos 6667 a 7997; numeracion de los residuos segun Escarmis y col. 1996).B) Comparacion de la posicion filogenetica de los clones derivados de las poblaciones RAp35 yRA0p35. Arboles construidos con los residuos 7150-7997 que corresponden a la regi on genomicaque codifica la polimerasa 3D. Notese la reestructuracion de la poblacion tras 5 pases en ausenciade R (segundo y tercer arbol respecto al primero).

91



RB0p35* en la Figura 34-B).Debido a las relaciones tan cercanas entre las secuencias de nucleotidos analizadas, los valores

de bootstrap en los arboles NJ indican que la robustez de las agrupaciones obtenidas es limitada. Apesar de ello, al reconstruir las mismas filogenias utilizando los metodos de MP y MV (ver apendicefilogenetico) la topologıa general de los arboles fue coherente con la encontrada con el metodo de

NJ.La poblacion control CAp35, obtenida tras 35 infecciones citolıticas seriadas del clon MARLS

en cultivos celulares y en ausencia de mutageno, presenta un arbol caracterıstico con una diversidadevidentemente menor que las poblaciones tratadas con mutageno (Figura 34-A). Dicha poblaciontiene unos valores de frecuencia de mutacion 12 veces menores que su paralela RAp35 pasada enpresencia de R (Tabla 8), ası como un tamano medio mucho menor de longitud de ramas.

92



PoblacionaResiduosb

No

clo-nes

Ntsecuen-ciados

Tratamientoc Muta-

cionesdTransi-cionese

Trasion

Sin droga p1 6609-8013 5 7025 Sin droga 2/2 0.50 0.50

AZCp16609-8013

5 7025 [10mg/ml] AZC 1/1 0 1

FUp16609-8013

5 7025 [200mg/ml] FU 2/2 1 0

Sin droga

p25

6609-8013

5 7025 Sin droga 1/3 1 0

AZCp256609-8013

18 25290 [10mg/ml]AZC 13/19 0.21 0.79

FUp256609-8013

5 7025 [200mg/ml] FU 14/19 1 0

CAp357150-8020 21 27951 Sin droga 17/17 0.88 0.12

RA0p357150-7997

21 18291 [800µM] R, 17/68 0.75 0.25

Sin droga

RAp356667-7997

14 18634 [500-800µM] R 55/139 0.91 0.09

RAp456667-7997

12 15972 [800µM] R 31/49 0.76 0.24

RAp606667-7997

15 18634 [800-5000µM] R 55/80 0.97 0.02

Tabla 8: Caracterizacion de los espectros de mutantes de poblaciones sometidas a dia El origen de las distintas poblaciones de VFA se detalla en Materiales y metodos, y se represenb Los residuos genomicos analizados corresponden a la zona que codifica la polimerasa 3D del gen

de VFA descrita en (Escarmis y col. 1996).c El tratamiento con drogas (AZC, azacitidina; FU, 5-fluorouracilo; R, ribavirina), y las concentrd El primer numero indica la cantidad total de mutaciones diferentes encontradas en todos los clon

repetidas; el segundo numero hace referencia al numero total de mutaciones, contando las repetide Expresado por 1 en cada poblacion.f La frecuencia de mutacion mınima es el numero de mutaciones diferentes dividido por el total dg La frecuencia de mutacion maxima es el numero de mutaciones totales dividido por el total de nh H es la entropıa de Shannon normalizada (Volkenstein, 1994).i d es la distancia genetica media.

9 3



5.4.2. Partition analysis of quasispecies (PAQ) aplicado al analisis clonal de pobla-ciones de VFA mutagenizadas

Para caracterizar en profundidad la estructura clonal de las poblaciones mutagenizadas de VFA,se aplico el programa informatico PAQ a las mismas poblaciones vıricas estudiadas por filogenia.Las secuencias, determinadas a partir de los clones moleculares de cada poblacion, fueron tratadascomo poblaciones individuales, y todas las secuencias se agruparon juntas bajo el mınimo radioposible sin tener en cuenta ninguna particion. Se midio el valor d (distancia genetica media),que se utilizo como medida de diversidad intrapoblacional (Figura 35). La ausencia de particionesintrapoblacionales es una suposicion realista a priori, dado que cada poblacion viral deriva deancestros bien definidos, y su evolucion tuvo lugar en condiciones controladas de laboratorio. Elanalisis PAQ de las poblaciones derivadas del clon C-S8c1 tras 25 pases en presencia de FU oAZC, o ausencia de mutageno, muestra una expansion de 6 veces en la diversidad intrapoblacional,como resultado de la propagacion del virus en ausencia de mutageno, y una expansion de 13,5y 9,2 veces como resultado de pases en presencia de FU o AZC, respectivamente (Figura 35-B). Estos valores ilustran de nuevo el mayor potencial mutagenico del FU que del AZC (test deTukey post hoc, p=0.004) para el VFA replicando en celulas BHK-21 (Sierra y col. 2000). Losdatos son tambien concordantes con el incremento en distancias geneticas entre componentes delas poblaciones mutagenizadas que se observa en la filogenia (comparese con la Figura 33).

El analisis por PAQ revelo un efecto dramatico al comparar las poblaciones MARLS pasadasen presencia o ausencia de R (Figura 35-B). De una manera notable, multiples pases en presenciade concentraciones de hasta 800µM de R (la concentracion de R se incremento secuencialmentea lo largo de los pases, comenzando con 200µM), dio como resultado poblaciones con diferenciassignificativas en el valor d (One-way ANOVA: F=85.5, df=65, p<0.001.). La poblacion RAp35presenta un valor d 15,5 veces mayor que la poblacion control CAp35 (test post hoc de Tukey,p<0,001), que se paso en paralelo 35 veces en ausencia de droga (Figura 35-B). La extensa diversidadalcanzada en presencia de R disminuyo significativamente, cuando la poblacion RAp35 se sometio a

pases adicionales en presencia de 800µM R. La reduccion fue de 1,9 veces en el valor d (test posthoc de Tukey, p<0,001). La diversidad no aumento significativamente (1,1 veces, test post hoc deTukey, p=0,9) despues de 15 pases adicionales en presencia de concentraciones crecientes de R,hasta alcanzar R 5000µM.

La diversidad intrapoblacional vuelve a ser baja en la poblaci on RA0p35, que es la resultantede replicar durante 5 pases en ausencia de R, despues de 30 pases en presencia de R (Figura 32-B).La distancia media d de RA0p35 es 2,1 veces menor que la de RAp35 (test post hoc de Tukey,p<0,001). Estos resultados concuerdan con la estructura mas compleja de los arboles filogeneticosde la poblacion RA0p35 respecto a la poblacion RAp35 (ver Figura 34-B para los arboles NJ y elapendice filogenetico para los arboles MV y MP).

La polimerasa 3D de la poblacion de VFA RAp35, y las poblaciones derivadas de esta, inclu-

ye la mutacion M296I, la cual disminuye la sensibilidad del VFA por la R (Sierra y col. 2007)(Introduccion, apartado 2.3.1.). Ası pues, la complejidad de la cuasiespecie puede sufrir dos tiposde transicion, primero un temprano incremento cuando las poblaciones son sometidas a una mu-tagenesis incrementada, y segundo, una reduccion de la diversidad intrapoblacional debido a laeliminacion de la R, o la seleccion de virus con mayor resistencia a R.

La modificacion de la relacion entre componentes del espectro de mutantes no se ve reflejada enla entropıa de Shannon (la cual se satura en el valor maximo, 1, en todas las poblaciones del linajeRA analizadas). Asimismo, la frecuencia maxima de mutacion varıa en una rango estrecho de entre1,7 y 2,4 veces, cuando las diferentes poblaciones se comparan con RAp35. La relacion de frecuenciade mutacion mınima/maxima, que describe el grado de relacion entre clones, es ligeramente menor

94



No drug p1d =0.50

AZCp1d =0.25

FUp1d =0.50

sin droga p25d =0.75

AZCp25d =2.31

FUp25d =6.75

C-S8c1

A

d =0.0

RAp35d =13.15

(7.85)

RAp45d =6.91

RAp60d =7.62

CAp35d =0.85

MARLS [200-800 M] R

[800 M] R

sin droga

[800-5000 M] R

BRA0p35d =3.62

d =0.0

sin droga(desde el pase30)

[800 M] R

sin droga

[200 g/ml] FU

[10 g/ml] AZC

µ

µ

µ µ

µ µ

Figura 35: Analisis con el software PAQ aplicado a secuencias derivadas de las

poblaciones mutagenizadas de VFA. El clon biologico inicial de cada serie de pasesse representa con un punto negro, al cual se le atribuye arbitrariamente una distanciamedia intrapoblacional con un valor de d=0.0. Las poblaciones analizadas en A y B sonaquellas descritas en las Figuras 32-A y 32-B, respectivamente. Se indica el tratamientomutagenico: FU, 5-fluorouracilo; AZC, azacytidina; R, ribavirina. El valor de d paracada poblacion se calculo sin considerar ninguna particion. Los valores se basan enlas secuencias de nucleotidos de la region que codifica la polimerasa 3D (nucleotidos6609 a 8013 para A, y 6667 a 7997 para B), excepto para la poblaci on RA0p35 enla que se utilizo la zona comprendida entre los nucleotidos 7150 y 7997. Para facilitarlas comparaciones, el valor d de RAp35, medido con los nucle otidos 6667 a 7997, serepresenta como un cırculo de lınea discontinua dentro del cırculo grande, obtenido con

los nucleotidos 6069 a 8013. El diametro de los cırculos es proporcional al valor d, queaparece indicado al lado de cada cırculo. Los procedimientos de secuenciacion y analisisPAQ se describen en Materiales y metodos.

95



0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0A / C

A / G

A / U

C / A

C / G

C / U

G / A

G / C

G / U

U / A

U / C

U / G

FUp1

FUp25

P o r c e n t a j e

d

e m u t a c i o n e s

A / C

A / G

A / U

C / A

C / G

C / U

G / A

G / C

G / U

U / A

U / C

U / G

sin droga-p25(C-S8c1)

CAp35 (MARLS)CBp35 (MARLS)

C-S8c1AZCp1

AZCp25

C-S8c1

A / C

A / G

A / U

C / A

C / G

C / U

G / A

G / C

G / U

U / A

U / C

U / G

MARLS

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,2

0,4

0,6

0,8

1

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

A / C

A / G

A / U

C / A

C / G

C / U

G / A

G / C

G / U

U / A

U / C

U / G

RAp35RAp45RAp60RAp035

Figura 36: Proporcion de los diferentes tipos de mutaciones halladas en losclones de las poblaciones de VFA. Cada tipo de mutacion (eje de abscisas) seconto para las poblaciones indicadas en cada panel, que derivan de MARLS o de C-S8c1 (indicado dentro de cada panel). Las poblaciones analizadas se representan enla Figura 32, y se pueden identificar en funcion de su tratamiento mutagenico (FU,5-fluorouracilo; AZC, azacitidina; R, ribavirina; y las poblaciones denominadas ”sindroga” o denominadas con una ”C” son poblaciones control pasadas en ausencia dedroga. Los tipos de mutacion se han contado comparando la secuencia de nucleotidos de

cada clon molecular individual con su correspondiente secuencia consenso poblacional.Las regiones genomicas y el numero de nucleotidos analizados para cada poblacion sedescriben en la Tabla 8.

(menos diversidad) en la poblacion RA0p35 que en RAp35, aunque esta diferencia no es significa-tiva (one-way ANOVA: F=2.57, gl=1.33, p=0.118). Sorprendentemente, la relacion frecuencia demutacion mınima/maxima es mayor en las poblaciones RAp45 y RAp60 (mayor diversidad) queen la poblacion RAp35 (test post hoc de tukey, p=0,0073 y p=0,013, respectivamente), a pesar dede tener valores de d menores y por tanto menor diversidad intrapoblacional. Estas comparaciones

sugieren que el valor d es un descriptor mas sensible y realista de la diversidad intrapoblacionalque la frecuencia de mutacion.

5.4.3. Analisis mutacional y tasas de fijacion de nucleotidos

El perfil de mutaciones en los componentes del espectro de mutantes de cada poblacion analizada(Figura 36), indico la presencia de un patron especıfico de mutaciones asociado a cada mutageno. Laspoblaciones tratadas con FU acumularon un exceso de transiciones U→C (Agudo y col. 2008; Sierray col. 2000), mientras que las poblaciones tratadas con R fijaron preferencialmente transicionesC→U y G→A (Pariente y col. 2005). El sesgo mutacional asociado a la mutagenesis por AZC enVFA no esta claro (Sierra y col. 2000), y en las poblaciones aquı analizadas la expansion de la

diversidad desde el pase 1 al 25 en presencia de AZC se debio principalmente a transversionesG→C y C→G.

Los arboles NJ construidos con secuencias consenso de genomas completos de VFA de laspoblaciones RA y virus relacionados, mostro una inusual y rapida fijacion de mutaciones en lasecuencia consenso de RAp45 (Figura 37-A). Durante el transcurso de pases citolıticos seriados de C-S8c1 en celulas BHK-21, se acumularon mutaciones con una tasa promedio de 0,20 mutaciones/pase(Escarmıs y col. 2008). El clon MARLS mostro una tasa similar de 0,24 mutaciones/pase. Sinembargo, el linaje RA se desvio de estos valores y presento una tasa de acumulacion de mutacionesde 1,13 mutaciones/pase, sugiriendo que se produce una evolucion extremadamente rapida en losvirus pasados en presencia de R (Figura 37-B).

96



0

20

40

60

80

100

120

100 200 300

Número de pase

M

u t a c i o n e s f i j a d a s

0

Linaje C-S8c1

MARLS

RAp45

p260 p3d

p200

MARLS

RAp35

RAp45

p143

p100

p50

CS8c1C280a

10

FMDV-C-Oberbayern

100100

100

87

97

0.002

A B

Figura 37: Cuantificacion de la divergencia genotıpica de poblaciones de VFApasadas en presencia de ribavirina. Se analizaron las poblaciones de VFA derivadasde C-S8c1 o MARLS que se muestran en la Figura 32-A) Arbol filogenetico basado ensecuencias consenso de genomas completos de las poblaciones vıricas derivadas del clonC-S8c1 (p50, p100, p143, p200, p260p3d) y de MARLS (RAp35, RAp45). C10

280a es unclon de C-S8c1 que fue sometido a 280 pases seriados en cuello de botella (placa a placa;Escarmis y col. 1996; Escarmıs y col. 2008). VFA C-Oberbayern es un aislado natural

(Carrillo y col. 2005) cuya secuencia se utiliza como referencia. El algoritmo utilizado esel de NJ con un valor de remuestreo de 1000 replicas (se indican los nodos con valoressuperiores a 75). B) Numero absoluto de mutaciones (incluyendo reversiones), relativoa la secuencia de C-S8c1 y pases sucesivos (linaje C-S8c1) en funci on del numero depases de cada poblacion. Los valores se han calculado a partir del analisis de secuenciasconsenso de genomas completos. Se muestra una recta de regresion lineal construida conlos puntos del linaje C-S8c1 (y=0.1987x-1.6922; R2=0.9882). La posicion de MARLS yRAp45 se especifica en la grafica.

5.4.4. Evidencia de seleccion purificadora durante la mutagenesis incrementada

Hemos examinado si la elevada acumulacion de mutaciones en los genomas RA era debida auna fijacion al azar de mutaciones a lo largo del genoma, o si, por el contrario, las mutacionesse acumularon de manera preferencial en determinadas zonas del genoma. Se utiliz o el softwareK-estimator (Comeron 1999) (descrito en Materiales y metodos, apartado 4.24) para medir ladistribucion de mutaciones a lo largo del marco de lectura abierto (la region codificante de lapoliproteına) de MARLS, RAp35 y RAp45. Los resultados (Figura 38) indican que en ciertaszonas del genoma, la Ka (mutaciones no sinonimas/nucleotido) y la Ks (mutaciones sinonimas/nucleotido) de RAp35 y RAp45 muestran valores que son significativamente superiores a la media.La distribucion asimetrica de mutaciones sugiere que, a pesar de la elevada presion mutacional

impuesta por el tratamiento con R, algun tipo de seleccion sigue actuando durante la replicaciondel virus con baja fidelidad de copia.

Para distinguir si la distribucion asimetrica de mutaciones a lo largo del genoma se debio prin-cipalmente a seleccion positiva o negativa (purificadora), se calculo para las distintas poblacionesla tasa de mutaciones no sinonimas corregidas por sitios no sinonimos (dn) dividida por el numerode mutaciones sinonimas corregidas por el numero de sitios sinonimos (ds) (Tabla 9). El linaje RApresenta un exceso de entre 6 y 15 veces de mutaciones sinonimas sobre no sinonimas, tanto al ana-lizar secuencias consenso como clones moleculares. Este resultado sugiere que la estirpe RA estuvosometida a una fuerte seleccion purificadora. Contrariamente, poblaciones que han evolucionadosin restricciones de tamano poblacional ni fueron sometidas a tratamiento mutagenico en los pases

97



L

VP4

VP2 VP3 VP1 2B 2C 3A 3C

2A

3D5’ UTR 3’

UTR

00.010.020.030.04

0.050.060.07

K

s

L

VP4

VP2 VP3 VP1 2B 2C 3A 3C3B2A

3D 3’UTR

5’ UTR

0.002

0.006

0.01

0.014

0.018

0

K a MARLS

RAp35RAp45

LVP4

VP2 VP3 VP1 2B 2C 3A 3C

3B2A3D

5’ UTR

Ks RAp45

Ka RAp45

00.01

0.020.03

0.040.05

0.060.07

Genoma VFA

K a ,

K s

3’UTR

3B

A

C

BMARLS

RAp35

RAp45

Figura 38: Distribucion de los valores para Ka y Ks a lo largo de la secuenciaconsenso de la region codificante en los genomas VFA MARLS, RAp35 yRAp45. El origen de estas poblaciones se muestra en la Figura 32. Para los calculosse compararon las secuencias con respecto a C-S8c1. El calculo de Ka (mutaciones nosinonimas por nucleotido) y Ks (mutaciones sinonimas por nucleotido) se realizo me-

diante el software K-estimator (Comeron 1999). Los genomas se analizaron en ventanasde 200 nucleotidos, desplazandose 100 nucleotidos en cada paso. El eje de abscisas seha substituido por un esquema a escala de la region codificante de C-S8c1 (Sobrino yDomingo 2004). La lınea discontinua horizontal que cruza las graficas marca el lımitesuperior del intervalo de confianza segun la distribucion de Poisson. A) Relacion Ka. B)Relacion Ks. C) Comparacion de las relaciones Ka y Ks de la poblacion RAp45.

98



dn/ds dn/dsPoblacion virala (clones moleculares)b (secuencias consenso)c

RAp35 0.16 N.D

RAp45 0.08 0.09 (MALRS)RAp60 0.07 0.08 (MARLS)

RA0p35 0.12 N.D.C-S8c1 pases 1→ 263 ND 0.63 (C-S8c1)

MARLS 1.21d 0.65 (C-S8c1)

Tabla 9: Tasa corregida de mutaciones no sinonimas por mutaciones sinonimas enpoblaciones y clones moleculares de VFA con diferente historia evolutiva.a El origen de las distintas poblaciones de VFA se detalla en Materiales y metodos, y se representanesquematicamente en la Figura 32.b dn/ds es la relacion de mutaciones no sinonimas (corregidas por sitio no sinonimo) respecto amutaciones sinonimas (corregidas por sitio sinonimo), calculado como se describe en Materiales ymetodos (Nei, 1986; Korber, 2001). Los valores corresponden a los calculos utilizando secuencias

de nucleotidos de clones moleculares (como se describe en la Tabla 8). N.D, no determinado.c dn/ds, calculado como en b, aplicado a secuencias consenso de genomas completos, comparadascon el clon parental correspondiente (en parentesis).d Este valor se calculo con clones biologicos derivados de MARLS, usando la region que codifica laproteasa L y la capsida.

citolıticos (ver MARLS y linaje C-S8c1 (Garcıa-Arriaza y col. 2006) en la Tabla 9), presentaron unarelacion dn/ds entre 17 y 7,5 veces mayor que las poblaciones RA al comparar clones moleculares,y entre 7 y 8 veces mayor al comparar secuencias consenso. Ello sugiere un efecto mucho mas debilo ausente de la seleccion purificadora en los virus que replicaron en ausencia de mutageno.

Los resultados de la determinacion de la relacion dn/ds, junto con la observacion de la distri-bucion asimetrica de mutaciones, sugiere que la seleccion purificadora actua durante la evolucionde poblaciones virales sometidas a tratamiento mutagenico.

5.4.5. Extincion viral sin un exceso aparente de mutaciones

Pases en cultivos celulares del VFA en presencia de bases mutagenicas o analogos de nucleosidospuede ocasionar la extincion viral, en una proceso denominado mutagenesis letal (Anderson y col.2004; Domingo 2005; Eigen 2002; Graci y Cameron 2002) (ver Introduccion, apartado 2.3). Parainvestigar si la extincion de VFA por mutagenesis letal se asocio a un aumento inusual de ladivergencia intrapoblacional, se realizo un analisis PAQ de poblaciones derivadas de C-S8c1 tras 3

pases citolıticos seriados en presencia de una combinacion de FU y el inhibidor de la replicacion depicornavirus clorhidrato de guanidinio (G) (Pincus y Wimmer 1986) (Figura 39). La combinacionde FU y G dio lugar a una extincion muy eficiente del VFA (Pariente y col. 2001). C-S8p3-FUG esla ultima poblacion de la serie de pases mostrada en la Figura 39-A, que todavıa produjo materialgenetico amplificable por RT-PCR (Gonzalez-Lopez y col. 2004). La poblacion preextincion C-S8p3-FUG mostro un incremento modesto en la complejidad de su espectro de mutantes con respectoa la poblacion control C-S8p3. Ademas, la complejidad de C-S8p3-FUG fue mucho menor que lacorrespondiente a RAp35, tanto segun el analisis por PAQ (comparacion de las distancias medias:T-student, t=12.19, p<0.001) como segun la topologıa general de los arboles filogeneticos (Figura39-B,C). Por tanto, la extincion viral se puede conseguir sin un incremento muy evidente de las

99



M A R L

S

C S 8 c 1

C 1 0 2 8 0

9891

60

74 0.0010.001

p260p 3d

p 2 0 0

d =12.38

RAp35

d =0.60

C-S8p3-FUGd =0.37

C-S8p3

A

C-S8c1

[4mM] G

sin droga

[200 g/ml] FU,

*

B

C

C-S8p3-FUG

C-S8p3

P

P

µ

Figura 39: Analisis filogenetico y PAQ de poblaciones vıricas preextincion. A) Esquemade pases del clon de VFA C-S8c1 en ausencia de droga o en presencia de 5-fluorouracilo (FU) yclorhidrato de guanidinio (G). B) Distancia media d y cırculos correspondientes al analisis PAQ delas poblaciones RAp35, C-S8p3-FUG y C-S8p3. El diametro de las esferas es proporcional al valord. C) Analisis filogenetico de clones moleculares individuales de una poblacion MARLS pasada en

presencia de ribavirina (RAp35, ver Figura 34), y clones del linaje C-S8c1 pasado en presenciao ausencia de FU y G. Los puntos negros del arbol representan clones moleculares individualesde la poblacion RAp35. Los clones pertenecientes a las poblaciones derivadas de C-S8c1 tras trespases en presencia de FU mas G o ausencia de droga estan representados por estrellas verdes ypuntos rojos, respectivamente. Las secuencias centrales segun PAQ se indican con una flecha. Elorigen de las poblaciones virales se explica en Materiales y metodos y se representa en la Figura32. Para construir el arbol se utilizo la region comprendida entre los nucleotidos 6670 a 7871,correspondientes a la zona que codifica la polimerasa 3D en el genoma de VFA. Se utiliz o el metodode NJ y el algoritmo de Kimura 2 parametros con un bootstrap de 1000 muestreos.

100



p260p3d

C-S8c1 p200 p260

..

p219

... …

p225

....

p240

....

p240p3dp225p3dp219p3dp200p3d

p200p5d

…..

p50 p100

… … … …

a b c d

…

a 200G1, 200G2…

b 219G1, 219G2 …

c 225G1, 225G2 …

d 240G1, 240G2 …

Figura 40: Esquema de pases del clon C-S8c1 en infecciones citolıticas en celu-las BHK-21. Las poblaciones sin clonar se representan como cırculos vacıos, los clonesbiologicos se representan como cuadrados negros. Las flechas grandes grises indican pa-ses a alta MDI (de 1 a 5 PFU/celula); las series de flechas delgadas indican infeccionesa baja MDI; a baja MDI el sobrenadante de una infeccion se diluye 1000 veces y se usapara establecer la nueva infeccion; las flechas delgadas y largas representan el aislamien-to de clones biologicos con genoma de tamano estandar (sin deleciones internas). C-S8c1

es el clon biologico inicial y los pases sucesivos se denominan con una ”p” delante delnumero de pase: p50 a p260. Las poblaciones que recibieron tres o 5 pases diluidos sedenominan con el nombre de la poblacion seguido de ”p3d” o ”p5d”, respectivamente.Los clones biologicos se designan con el mismo nombre que la poblacion de donde serecuperaron seguidos de ”G” y el numero de pase: 219G1, 240G4, etc.

distancias geneticas medias entre los componentes de la cuasiespecie.En resumen, los analisis filogeneticos y de diversidad intrapoblacional de los espectros de mu-

tantes sometidos a mutagenesis letal, han revelado notables expansiones y posteriores compresionesde la diversidad interna de las cusaiespecies. El analisis estadıstico de las mutaciones, tanto sunumero, tipo, como su distribucion sugieren la accion de la seleccion purificadora en la evolucionde poblaciones virales sometidas a mutagenesis. Estos resultados tienen implicaciones para enten-der las bases moleculares y los procesos evolutivos que modulan la seleccion de virus sometidos amutagenesis incrementada, como se comenta en el apartado 6.4 de la Discusion.

5.5. Diversificacion de un clon de VFA en dos poblaciones con diferentes estra-tegias evolutivas: colonizadores y competidores

El clon de VFA C-S8c1 se paso en cultivos de celulas BHK-21, en infecciones citolıticas seriadas.El virus resultante de cada infeccion se utilizo directamente (sin diluir) para establecer la siguiente

infeccion (MDI 1-10 PFU/celula, Figura 40). Este proceso se repitio 260 veces (Garcia-Arriaza ycol. 2005). En los pases p200, p219, p225 y p240 se aislaron clones biologicos ST tal como se describeen la seccion 4.3.4 (Materiales y metodos). Los clones aislados fueron analizados por RT-PCR paraverificar la ausencia de genomas con deleciones internas (Tabla 10). El genoma de los clones ST sesecuencio desde la zona codificante de la proteasa L hasta el nucleotido 3853 (mitad de la proteına2A). Con las secuencias obtenidas se reconstruyo la filogenia del clon C-S8c1 desde el pase 1 al 260mediante el metodo de NJ (Figura 41-A). Los arboles muestran que el clon C-S8c1 y su progenieen pases sucesivos siguen una evolucion coherente: el pase 200 deriva del pase 100, este del 50 yel 50 deriva del p1 (C-S8c1), validando la topologıa del arbol. Al analizar clones biologicos de las

101



Virusa RT-PCRb Composicionc

200G1-G5 17, 10 ST219G1-G5 17, 10 ST225G6-G9 17, LJ ST240G1-G3 17, 10, 29 ST240G4-G5 17, 10, 29 ST, ∆417, ∆999

240G6-G13 17, 10 STC-S8p260P1-P2 17, 10 ∆417, ∆999/∆1017

C-S8p260p3dG1-G2 17, 10 STC-S8p260 10, 17, 21, 29, 37, 38, L2 ∆417, ∆999, ∆1017

C-S8p260p3d 10, 17, 21, 29, 37, 38, L2 ST

Tabla 10: Analisis genomico de placas de lisis de tamano grande en diferentes poblacionesa Clones biologicos analizados individualmente. El origen de las poblaciones virales d onde fueron aisladosse describe en el apartado 4.2 de Materiales y metodos. Los clones que producen placas de lisis de tamanogrande o pequeno se indican con ”G” o ”P”, respectivamente, despues del nombre de la poblacion.b Amplificaciones mediante RT-PCR utilizando las parejas de iniciadores indicadas en la Tabla 2 y Figura14.c ST, genoma de tamano estandar; ∆417, ∆999, ∆1017, genomas delecionados, indicados en la Figura 14

poblaciones pase 219, 225 y 240, sorprendentemente, se agruparon en dos grupos estadısticamentediferentes, como indica el remuestreo mediante bootstrap. Uno de los conjuntos se agrupa con elvirus de referencia MARLS (en rojo, Figura 42-B) y el otro se agrupa con el virus de referenciaC-S8p200 (en azul). Por tanto, a estas dos subpoblaciones las hemos denominado ”tipo-MARLS”y ”tipo-p200”. Todas las poblaciones analizadas desde el pase 219 incluyeron como mınimo unrepresentante de cada tipo, sugiriendo que los dos tipos han coexistido a lo largo de los pases.

5.5.1. Deteccion de clones recombinantes en la poblacion C-S8p200

Al incluir los clones biologicos ST de la poblacion C-S8p200 en un arbol filogenetico, los clonesno se agruparon ni en la subpoblacion tipo-MARLS y ni en la tipo-p200, sino que se situaron enmedio de las dos, desestructurando el arbol filogenetico (Figura 42-D). Esta sintomatologıa es tıpi-ca de secuencias recombinantes. Para verificar que los clones podıan ser realmente recombinantesy no contaminacion entre clones con genomas de secuencia distinta, los clones fueron diluidos yreplaqueados en cultivos celulares. El genoma de los clones aislados y replaqueados se secuencio yse dividio la zona secuenciada en una parte 5’ y otra 3’. Cuando se construy o la filogenia con lazona 5’ del genoma de los clones procedentes de C-S8p200, los clones se agruparon con la subpo-blacion tipo-MARLS (Figura 41-E). Cuando se construyo la filogenia con la zona 3’ del genoma,los mismos clones se agruparon con la subpoblacion tipo-p200 (Figura 41-F). Estos resultados su-gieren fuertemente que en la poblacion C-S8p200 existen clones individuales que son recombinantes

entre representantes de la subpoblacion tipo-MARLS y genomas representantes de la subpoblaciontipo-p200.

5.5.2. Origen de la subpoblacion MARLS

El virus MARLS posee un patron de mutaciones divergente con respecto a la secuencia consensomayoritaria en la poblacion C-S8p200 (Tabla 11). Para identificar el origen de la divergencia dela poblacion tipo-MARLS, se obtuvo un arbol filogenetico por el metodo de MV. Se utilizaron losvirus de referencia de la serie evolutiva originada en C-S8c1 de los que se conoce la secuencia denucleotidos completa de su genoma. En el arbol obtenido, la secuencia de MARLS se agrupo con

102



C-Oberbayern

p1

p50

p100

p143

MARLS

p200p200

100

93

100

98

100

p260

p1

225G6225G6219G2219G2

240G13240G13240G1240G110099

98

97

219G5219G4219G3240G15225G8MARLS240G6240G7240G10240G11

91

240G8240G12240G2

91

96

C-Oberbayernp1

p50p100

p143 MARLS

p260

94

8188

100

p1

p100MARLS

200G2-c1200G2-C2200G2-C3200G2-C4200G3-C2200G3-C3200G3-C1p200p260

p50

100

98

93

89

100

100

100

p1p200200G2-c1200G2-C2200G2-C3200G2-C4MARLS200G3-C1200G3-C3200G3-C2

100

100

100

100

p1MARLSp200p200

199G2-c1199G2-c1

199G2-C2199G2-C2

199G2-C3199G2-C3

199G2-C4199G2-C4

199G3-C2199G3-C2

199G3-C3199G3-C3

199G3-C1199G3-C1

95

A B C

D E F

p200p200

p200p200

Tipo-p200

Tipo-MARLS

Figura 41: Diversificacion del clon C-S8c1 en dos subpoblaciones. Evidencia de recombi-nacion entre las subpoblaciones. A) Reconstruccion filogenetica de la evolucion del clon C-S8c1y los pases sucesivos utilizando la secuencia completa del genoma. El arbol se construyo mediante elmetodo de NJ, usando el modelo de Kimura-2 parametros. Los valores de remuestreo por la tecnicade bootstrap mayores de 70 se indican en los nodos correspondientes. FMDV-C-Oberbayern, es unaislado natural que se utilizo como referencia externa (outgroup) (Carrillo y col. 2005). El origende las poblaciones virales se describe en la Figura 40 y en Materiales y metodos. B) Analisis filo-genetico que diferencia clones tipo-p200 (azul) de clones tipo-MALRS (rojo). Los clones biologicosaislados a partir de las poblaciones C-S8p200, C-S8p219, C-S8p225 y C-S8p240 se denominan conel numero de pase de la poblacion seguido de ”G” y el numero de clon: 240G1, 225G2, etc. Elarbol se construyo mediante la tecnica de MV. Se utilizo la region del genoma de VFA que abarcalos residuos 1033-3853 (numeracion segun Escarmis y col. 1996). Esta region comprende la zonacodificante de las proteınas L, VP4, VP2, VP3, VP1 y parcialmente 2A. C) Origen de las pobla-ciones tipo-MARLS. Arbol filogenetico construido por el metodo de MV con los virus de referenciaderivados de pases masivos del clon C-S8c1. Los valores de remuestreo por la tecnica de bootstrapmayores de 70 se indican en los nodos correspondientes. D) Reconstruccion filogenetica (MV) dela evolucion de los distintos pases derivados de C-S8c1 junto con los clones biologicos del pase 200.Los clones no se agrupan junto a ninguna poblacion. E) reconstruccion filogenetica (MV) de la zona5´ del genoma (nucleotidos 1044 al 2622) de los clones biologicos del pase 200. Los clones se agrupan

junto a MARLS. F) Reconstruccion filogenetica (MV) de la zona 3´ del genoma (nucleotidos 2623hasta el 3853) de los clones del pase 200. Los clones se agrupan junto al pase 200.

103



Ap1p200

219∆999

225∆999

240∆999

219p3d200p3d

MARLS

225p3d

240p3d

100

100

100

100

p1

p200

219∆417

225∆417

240∆417

200p3dMARLS

219p3d

225p3d

240p3d

100

100

100

100

B

Figura 42: Las poblaciones tipo-MARLS estan suprimidas por la cuasiespeciedominante. Reconstruccion filogenetica por el metodo de MV empleando la secuenciaconsenso de las poblaciones C-S8p200, C-S8p219, C-S8p225, C-S8p240, antes y despuesde tres infecciones a baja MDI. Se utilizo la region del genoma de VFA que abarcalos residuos 1033-3853 (numeracion segun Escarmis y col. 1996). Las poblaciones que

fueron sometidas a tres pases diluidos se indican con ”p3d” despues del nombre de lapoblacion. Los virus tipo-MARLS se indican en rojo y los virus tipo-p200 en azul. Laspoblaciones virales antes de los pases con virus diluido incluyen: A) la delecion ∆999(que afecta a los residuos 2794-3792 y a las proteınas VP3 y VP1), y B) la delecion∆417 (que afecta a los residuos 1154-1570 y a la proteasa L).

las secuencias de los virus situados entre los pases 143 y 200 (Figura 41-C). Por tanto, MARLScoexistio con los virus tipo-p200 en un rango de 97 pases (p240 es el ultimo pase en el que serescataron clones tipo-MARLS).

5.5.3. Las poblaciones tipo-MARLS estan suprimidas por la cuasiespecie

Datos previos en el laboratorio sugieren que el clon MARLS originalmente aislado de la po-blacion C-S8p213, es el de mas alta fitness de entre todos los mutantes de VFA a los que se lesha medido la fitness en el laboratorio (Garcia-Arriaza y col. 2005; Sierra y col. 2000). Los valo-res oscilaron entre 25 y 110 respecto a C-S8c1. Las diferencias entre las distintas determinacionesprobablemente se deben a que las medidas se realizaron a distintas MDI (ver aparatado Selecci ondependiente de densidad en las poblaciones Tipo-MARLS y Tipo-p200, en 5.5.4). A pesar de queMARLS posee una eficacia biologica elevada, su patron de mutaciones tıpico no aparecio en lasecuencia consenso de ninguna poblacion derivada de C-S8c1, sugiriendo que no se llego a imponer

en las poblaciones donde se genero. Una posible interpretacion de la ausencia de dominancia es quela poblacion tipo-MARLS pudiera ser una poblacion de alta fitness suprimida por la cuasiespecie,tal como fue descrito para un mutante de alta fitness del virus de la estomatitis vesicular (VSV) (dela Torre y Holland 1990). En ese estudio con VSV, un clon de alta fitness se impuso en competicionfrente a la poblacion donde se origino, solo en condiciones de baja MDI. Este dato llevo a los autoresa proponer el concepto de supresion de mutantes de alta fitness por el espectro de mutantes de lacuasiespecie (de la Torre y Holland 1990). La supresion de virus por espectros de mutantes ha sidodescrita en otros casos (ver capıtulo 6.5.3 de Discusion).

104



Regiona C-S8p200 MARLSb Cambioc Estructura Regiona C-aa secundariad

Fragmento S C247U C247U ZNC VP1 A

(368579) C338U C338U ZNC (3208-3828) A3Pseudonudos G476A G476A ZNC U3U518C ZNC

UIRES ZNC

Proteasa L G1066G/U V10L A

(1039-1641) G1091U R18I

C1105U P23S 2B A4A1154A/U K39M (3883-4344)C1158C/A = 2C GC1180C/U H48Y (4345-5298) A

A1532G E165G GA

VP4 3A A(1642-1896) (5299-5757) U5

VP2 G2285A G130D Bucle EF A5(1897-2550) U2622C = 3C

VP3 C2624U C2624U A25V N terminal (5971-6609)(2551-3207) C2826U = 3D

C3064G/C H172D (6610-8022)G3067A G3067A E173K Bucle GH

U3082A C178S Bucle GHC3202A C3202A Q218K C terminal

Tabla 11: Mutaciones secuenciadas respecto a C-S8c1 en las poblaciones C-S8naron respecto a la secuencia de C-S8c1 siguiendo la numeracion en (Escarmıs y col 2006a Zonas reguladoras y proteınas codificadas en el genoma de VFA. Se indican las posicionb En rojo aparecen indicadas las mutaciones exclusivas de MARLS, que no se han descritC-S8c1.c ZNC, zona no codificante; =, mutacion sinonima.d Estructuras secundarias asociadas con virulencia de VFA para celulas BHK-21 (Baranoe Sitios antigenicos segun (Mateu y col. 1994)

1 0 5



Para comprobar si la poblacion tipo-MARLS estaba efectivamente suprimida por la cuasiespeciedominante tipo-p200, se realizaron infecciones a baja MDI para minimizar la coinfeccion e interac-cion entre los individuos del espectro de mutantes. Las poblaciones C-S8p200, C-S8p219, C-S8p225y C-S8p240 fueron sometidas a tres pases a baja MDI (diluyendo 1000 veces el sobrenadante de cadainfeccion para realizar la siguiente; Figura 42-A). El RNA del virus resultante de los tres pases y del

preparado inicial se secuencio y se reconstruyo la filogenia (Figura 42). Los arboles muestran quelas secuencias consenso de las poblaciones C-S8p200, C-S8p219, C-S8p225 y C-S8p240 se agrupan

juntas, formando la subpoblacion tipo-p200. Sin embargo, las secuencias consenso de las poblacio-nes que han sufrido tres pases a baja MDI pasan a agruparse con el clon MARLS, formando ası lasubpoblacion tipo-MARLS. Estos resultados sugieren fuertemente que las poblaciones tipo-MARLSestan efectivamente suprimidas por la cuasiespecie dominante, de tipo-p200, y que la supresi on seelimino o mitigo con los pases a baja MDI.

5.5.4. Seleccion dependiente de densidad en las poblaciones tipo-MARLS y tipo-p200

Los resultados de las infecciones diluyendo virus sugieren fuertemente que la eficacia biol ogica

de las poblaciones estudiadas pueda variar en funcion de la MDI. Por este motivo se realizaron 4ensayos de competicion entre clones biologicos y poblaciones representativas de las subpoblacionestipo-MARLS y tipo-p200. Se escogieron los clones 240G2 y 240G12, representativos de la poblaci ontipo-MARLS, y los clones 240G1 y 240G13 representativos de la poblaci on tipo-p200 (Figura 41).Los virus C-S8p200p5d y C-S8p200 se utilizaron como poblaciones representativas de las subpo-blacioens tipo-MARLS y tipo-p200, respectivamente. Los ensayos cubrieron un rango de MDI deentre 0,005 y 9,4 PFU/celula. Los resultados muestran que tanto las poblaciones como las mezclasde clones tipo-MARLS tienen mayor eficacia biologica cuanto menor es la MDI, con una diferenciade aproximadamente 5 veces entre una MDI de 0,005 y 9,4 PFU/celula (Figura 43). Dado que laMDI hace referencia a la densidad de virus sobre un numero de celulas en cultivo, estos resultadosdemuestran la accion de seleccion dependiente de densidad sobre las poblaciones estudiadas. La

modulacion que ejerce la densidad sobre la fitness resulto ser drastica ya que ocasiono un cam-bio cualitativo en el sistema, puesto que, independientemente del grado de variacion de eficaciabiologica, una subpoblacion paso de ganar la competicion a perderla.

5.5.5. Las poblaciones tipo-MARLS son mas virulentas que las poblaciones tipo-p200

Para investigar si las diferencias genotıpicas que presentan las poblaciones tipo-MARLS respec-to a las tipo-p200 se correlacionan con alguna diferencia fenotıpica, se comparo la capacidad dematar celulas BHK-21 de ambas poblaciones, mediante ensayos de virulencia. Resultados previosdemostraron que el virus MARLS presentaba uno de los registros de virulencia mas altos entre losdiferentes mutantes ensayados en el laboratorio (Herrera y col. 2007). Como control del ensayo, semidio la virulencia de dos virus anteriormente catalogados como de alta virulencia (Herrera y col.2007): el clon MARLS y la poblacion viral C-S8p260p3d. La virulencia calculada para estos viruscoincidıa con la obtenida anteriormente (Herrera y col. 2007). Los resultados (Figura 44) demues-tran que tanto los clones como las poblaciones tipo-MARLS presentan una mayor virulencia paralas celulas BHK-21 que los clones y poblaciones tipo-p200.

5.5.6. Posible compromiso entre la produccion de progenie y la virulencia

Una hipotesis clasica en ecologıa afirma que explotar muy rapido un recurso puede ir en detri-mento del rendimiento que se le pueda sacar a ese recurso (Maynard Smith 1998). Ello favoreceun compromiso (o trade off ) en la explotacion. En virologıa se ha propuesto que hay virus que

106



M o l é c u l a s R N A t i p o

- M A R L S / t i p o - p 2 0 0

y = 0,3716e 0,7305x

R2= 0,857MDI = 0,1

y = 3,1324e -0,5349x

R2 = 0,6496MDI = 9,4

100

101

0 1 2 3 4

10-1

0 1 2 3 4100

101

10-1

y = 0,9727e-0,2208x

R2= 0,7937MDI = 2,0

0 1 2 3 4100

101

10-1

A

B

Número de pase

y = 0,176e1,0528x

R2= 0,9935MDI = 0.005

0 1 2 3 4100

101

10-1

Figura 43: Experimentos de competicion entre las poblaciones y clones tipo-MARLS y tipo-p200, a distinta MDI. Las competiciones se realizaron tal y comose indica en el apartado 4.17 de Materiales y metodos. La multiplicidad de infeccion(MDI) empleada en cada experimento se indica en cada grafico. Cada punto representael numero de moleculas de RNA de los virus tipo-MARLS dividido por el numero demoleculas de RNA de los virus tipo-p200, en el numero de pase indicado en abscisas.En cada grafico se representa la ecuacion de la recta de regresion junto con la R2.A) Competicion entre las poblaciones virales p200 y p200p5d (tipo-MARLS). B) Dosclones representativos de la poblacion tipo-MARLS del pase 240 (240G2 y 240G12) semezclaron y se compitieron contra dos clones, previamente mezclados con igual PFUs,representativos de la poblacion tipo-p200 (240G1 y 240G13) (ver arbol en la Figura 41).

107



Tiem o (horas)

P F

U / m l

5 15 25 35 45100

101

102

103

104

105

106

240G1

240G2

240G12

240G13

CA

5 10 15 20 25 30 3 5 10 15 20 25 30 35 40

p200

p200p5d

101

102

103

104

105

106

B

5

240G12

240G1

p3d

MARLS

103

10410

5

106

107

108

Figura 44: Virulencia de las poblaciones tipo-MARLS y tipo-p200 para celu-las BHK-21. PFUs necesarias para matar 104 celulas BHK-21 en funcion del tiempo.Los valores para virus tipo-MARLS y tipo-p200 se indican en rojo y azul, respectiva-mente. A) Virulencia de los clones virales 240G12 (tipo-MARLS), 240G1 (tipo-p200)

comparado con las poblaciones virales C-S8p260p3d y MARLS. Cada punto representala media de dos determinaciones independientes. B) Virulencia de las poblaciones viralesC-S8p200 y C-S8p200p5d. C-S8p200 es la poblacion tipo-p200 original. C-S8p200p5des la poblacion tipo-MARLS obtenida a partir de C-S8p200 despues de 5 pases citolıti-cos a baja MDI en celulas BHK-21. Cada punto representa la media de tres determi-naciones independientes; se muestran las barras de error. C) Virulencia de los clones240G1 y 240G13 (filogeneticamente relacionados con MARLS), y 240G2 y 240G12 (fi-logeneticamente relacionados con C-S8p200). Cada punto representa la media de dosdeterminaciones independientes.

108



Virusa PFU/mlb

240G1 2,95·107± 9,84·106

240G13 3,43·107± 4,41·106

240G2 3,74

·107

±5,49

·106

240G12 6,90·107± 2,78·107

Tabla 12: Tıtulos virales de clones procedentes de poblaciones tipo-MARLS y tipo-p200.a El origen de los clones virales se describe en la figura 40 y en Materiales y metodos.b Resultado de 2 titulaciones independientes realizadas con dos preparados virales independientes.

han optimizado el momento en el que matan a la celula hospedadora, en funcion del rendimientoobtenido de la celula, y de la capacidad de transmitirse, dependiendo de una salida temprana otardıa de la celula (Messenger y col. 1999). Segun este modelo, virus menos virulentos se podrıan

transmitir ms lentamente, pero sin embargo lo harıan en mayor numero (Nowak y May 2000). Paracomprobar si existıan diferencias en la produccion viral, se crecieron preparados virales de los clo-nes tipo-p200 (240G1, 13) y tipo-MARLS (240G2, 240G12), en identicas condiciones, y partiendodel mismo numero inicial de PFUs y celulas (4.3.1. Materiales y metodos). Al observarse efectocitopatico total se procedio a la titulacion de los sobrenadantes de los cultivos infectados. Los resul-tados (Tabla 12) demuestran que no existen diferencias significativas en cuanto a produccion viralentre las poblaciones ensayadas.

5.5.7. Las poblaciones tipo-p200 interfieren con las poblaciones tipo-MARLS, modu-lando la virulencia

Se aplico el ensayo de interferencia en la virulencia tal como se describe detalladamente enel apartado 4.7 de Materiales y metodos. Brevemente, este ensayo detecta si dos poblaciones quecoinfectan celulas son capaces de ejercer una influencia mutua en su nivel de virulencia. Se infectaroncelulas BHK-21 a muy alta MDI, separadamente con poblaciones o clones tipo-MARLS por un lado,o tipo-p200 por otro lado. Paralelamente se infectaron celulas con mezclas de los dos tipos de virus.Las infecciones con clones muestran que el clon tipo-MARLS 240G12 presenta mayor virulencia queel clon tipo-p200 240G1 (Figura 45). Identico resultado se observo al comparar las poblaciones p200y p200p5d. Sin embargo, al realizar infecciones con mezclas de los clones 240G1 y 240G12, o delas poblaciones p200 y p2005d, la virulencia disminuyo hasta valores muy similares a los obtenidospara el clon tipo-p200 y para la poblacion p200 individualmente. Este resultado no es un efecto dela dosis de virus inoculada (el doble en las mezclas), puesto que al utilizar el doble de la dosis de los

virus virulentos, se obtuvo un resultado identico al obtenido con la dosis simple. Esta interferenciaen la virulencia es especıfica de los virus menos virulentos hacia los mas virulentos, ya que cuando seinfectaron celulas con mezclas de poblaciones muy virulentas (p200p5d con p260p3d), no se obtuvoninguna disminucion en la virulencia (Figura 45).

5.5.8. Modelo matematico de replicacion y competicion de virus en celulas en cultivo

Hemos aplicado el modelo basico de dinamica viral (Bonhoeffer y col. 1997; Nowak y May 2000;Perelson y col. 1996), que describe un proceso de infeccion in vivo, a una infeccion en cultivoscelulares (ver Apendice matematico). El modelo es similar al descrito por Perelson y col.(Wu y col.

109



102

103

104

105

C e n t r o s i n f e c c i o s o s

103

104

105

102

103

104

2 4 0 G

1 2

2 4 0 G

1 / G 1

2

2 4 0 G

1 2

2 4 0 G

1 2 ( 2 X )

p 2 0 0 p 5 d

p 2 0 0 /

p 2 0 0 p 5 d

p 2 0 0

p 2 0 0 p 5 d ( 2 X )

p 2 0 0 p 5

d

p 2 6 0 p 3

d

p 2 0 0 p 5 d /

p 2 6 0 p 3 d

Figura 45: Ensayo de interferencia en la virulencia para celulas BHK-21. Eleje de ordenadas representa el numero de centros infecciosos necesarios para matar 104

celulas BHK-21 en 12h (los centro infecciosos son celulas infectadas en suspension, quese utilizan para establecer una infeccion en un nuevo cultivo, tal y como se indica en

Materiales y metodos, 4.3.5 y 4.7). En el eje de abscisas se indican los virus o mezclas devirus utilizadas en el experimento. Cada barra representa la media de cuatro determi-naciones independientes. Se muestran las desviaciones estandar. En azul se representanvirus tipo-p200 y en rojo los virus tipo-MARLS. C-S8p260p3d es una poblacion de altavirulencia, similar a la de las poblaciones MARLS (Herrera y col. 2007), pero filogeneti-camente relacionado con C-S8p200. En los virus cuyo nombre aparece seguido de (2X),las celulas fueron inoculadas con el doble de la dosis habitual con la que se inocula unvirus individual.

110



2006) pero en nuestro caso las celulas se pueden coinfectar por dos variantes virales en competicion.Los diferentes parametros del modelo matematico se han estimado a partir de las observacionesexperimentales. La prediccion principal del modelo, esto es, que la fitness es dependiente de den-sidad, se ha podido corroborar con los experimentos (Figura 46). Los virus tipo-MARLS pierdeneficacia biologica a medida que aumenta la MDI. Existe una MDI crıtica a partir de la cual los

virus tipo-MARLS son desplazados en la competicion por los tipo-p200.

l

l

l

l

l

1e- 03 1e- 02 1e- 01 1e+00 1e+01

0 .

5

1 .

0

2 .

0

5 .

0

MDI

f i t n e s s

r e l a t i v a

l prediccion del modelodatos experimentales

Figura 46: Seleccion dependiente de densidad en las poblaciones tipo-MARLSy tipo-p200. Ajuste del modelo matematico a los resultados experimentales.Representacion de la eficacia biologica de las poblaciones y clones tipo-MARLS, enfuncion de la MDI, tras competiciones con las poblaciones y clones tipo-p200. Los datosexperimentales de eficacia biologica son los obtenidos en los experimentos representadosen la Figura 43. Los valores de eficacia biologica se calcularon como se indica en elapartado 4.17 de Materiales y metodos. Las predicciones del modelo se obtuvieronde las simulaciones numericas realizadas con los parametros descritos en el apendicematematico.

111



6. Discusion

6.1. Origen y evolucion de la segmentacion genomica: el VFA como modelo

Los genomas defectivos que surgen durante la replicacion de virus RNA, comunmente requie-ren la participacion de un virus ST para mantenerse como una entidad replicativa (Huang 1973;

Kirkwood y Bangham 1994a; Perrault 1981a; Roux y col. 1991b; Simon y col. 2004; Vogt y Jackson1999). Inesperadamente, el sistema de genomas delecionados de VFA consiguio replicar autonoma-mente sin la participacion de virus ST. En esta Tesis Doctoral se han investigado los mecanismosmoleculares que dieron lugar a la aparicion del sistema segmentado y la ventaja selectiva del sistemade replicacion segmentado sobre el virus ST.

6.1.1. Descripcion de una cuasiespecie de virus defectivos en el transcurso de laevolucion hacia un virus segmentado

El tıpico espectro de mutantes de las cuasiespecies de un genoma ST se ha ampliado a ladescripcion de un espectro de genomas con deleciones internas. El espectro incluyo deleciones

internas en fase que afectaron desde 402 a 1017 residuos en las regiones que codifican para laproteasa L y la capsida (4.9 % al 12.5 % respectivamente, del genoma de VFA C-S8c1, excluyendo lostractos homopolimericos). Durante los pases intermedios 219 y 225, pero no en el pase 260 (Garcia-Arriaza y col. 2004), se identificaron una serie de genomas defectivos en la region que codificapara la capsida, que coexistıan con el RNA ∆417. Posteriormente, en el pase 260, la constelacionde deleciones observadas incluyo unicamente las tres formas de RNA: ∆417, ∆1017, ∆999. Estascomparaciones sugieren que el sistema segmentado de VFA, a pesar de replicar en un ambienteconstante, es muy dinamico en cuanto a la generacion y competicion de formas delecionadas y ensu sistema de complementacion.

6.1.2. Recombinacion exuberante

Dado que el linaje evolutivo en el que los ∆RNAs se generaron se inicio a partir del clon C-S8c1con un genoma ST unico (Sobrino y col. 1983), los ∆RNAs deben haber surgido por eventos derecombinacion intramolecular o intermolecular, dentro de celulas infectadas. En los virus de RNA sepueden distinguir varios tipos de recombinacion: homologa, no homologa, replicativa y no replicativa(revision en Agol 2006). La comparacion de las secuencias de nucleotido alrededor de los extremosde la delecion no permitio identificar ningun requerimiento obvio asociado a la recombinacion.Ademas, la prediccion de las estructuras secundarias energeticamente mas favorables en los RNAs∆402, ∆417, ∆519, y ∆540, usando M-fold (Zuker 2003), no revel o ninguna estructura secundarialocal obvia (no se muestran los datos), que en otros sistemas se ha asociado a recombinacion(Figlerowicz y Bibillo 2000; Havelda y col. 1997). Por tanto, el an alisis molecular no ha permitido

precisar un mecanismo por el que se pudieron generar los ∆RNAs (Agol 2006). De hecho, nopodemos descartar que los diferentes ∆RNAs se hayan generado por mecanismos diferentes. Ası, los∆RNAs que muestran una identidad de secuencia significativa en los extremos de la deleci on puedenhaberse generado mediante el mecanismo de salto de hebra (copy choice) entre la misma o diferentesmoleculas (Figura 6) (Agol 2002). En los casos en los que no se hallo identidad de secuencia entrelos extremos de la delecion, esta se pudo generar mediante recombinacion no homologa replicativao no replicativa. La generacion del virus ST C-S8p260p3d a partir de los ∆RNAs se puede explicarpor recombinacion homologa (Garcia-Arriaza y col. 2004; Garcıa-Arriaza y col. 2006).

Las observaciones sobre recombinacion descritas anteriormente para VFA y otros picornavirus(King 1988; Agol 2002; Agol 2006; Beard y Mason 2000; Escarmıs y col. 1992; Giraudo y col. 1990;

112



Kim y col. 2005; King 1988; Knowles y Palmenberg 1998), sugieren que la recombinaci on puedeser un proceso frecuente durante la replicacion de los picornavirus. Es posible que muchos recombi-nantes no se detecten debido a su baja capacidad replicativa o debido a la ausencia de marcadoresque identifiquen a los genomas como recombinantes. La interpretacion de la recombinacion comoun importante mecanismo de la genetica del RNA ha sido recientemente subrayadao por Bujarski

y colegas, basado en su trabajo de recombinacion promiscua con el virus del mosaico del bromo(Urbanowicz y col. 2005).

6.1.3. El modelo de la delecion maestra

Dado que la generacion de genomas recombinantes no parece ser una limitacion en el sistemade VFA, resulto interesante investigar por que la transicion hacia la dominancia de ∆RNAs y lareplicacion independiente de virus ST, necesito entre 143 y 219 pases. Una hipotesis es que solo unnumero limitado de los muchos genomas con deleciones internas que se generan espontaneamentesea neutral, o moderadamente ventajoso, para su mantenimiento en la poblaci on. Para que los∆RNAs puedan llevar a cabo una replicacion independiente del ST, es necesario que, al menos,

se mantenga balanceado el aporte de proteınas para la trans-complementacion y que se procesencorrectamente las poliproteınas expresadas por los dos ∆RNAs. Esto incluye el mantenimiento delsitio autocatalıtico de la proteasa L, y el mantenimiento de los sitios de procesamiento de la proteasa3C (Ryan y col. 2004; Ypma-Wong y col. 1988). El genoma ∆1017 presenta la substitucion K201Ren la posicion -1 del sitio de corte L-VP4, aunque el aa R en la posicion 201 se halla en varios tipoO y SAT3 (Ryan y col. 2004). El cambio Q218K afecta a la posicion -1 del sitio de corte VP3-VP1en el genoma de todos los ∆RNAs en los que el sitio de corte est a presente, aunque tambien seencuentran cambios en esta posicion en el resto de serotipos.

El factor que provoco la dominancia de los ∆RNAs pudo ser una delecion que ocurrio al azary que no comprometio la capacidad replicativa del virus. La delecion probablemente confirio alsistema una ventaja selectiva sobre la replicacion del genoma ST individualmente. Esa delecion

pudo ser el genoma ∆417 ya que fue el primero en aparecer en la lınea evolutiva de C-S8c1 (juntocon el ∆402; Charpentier y col. 1996a), y estaba presente en todas las placas analizadas en los pases219 y 225. Por tanto, proponemos el modelo de deleci on maestra, mediante el cual, una delecioninicial se genera aleatoriamente, y puede coexistir con el virus ST. Una vez se produce ese ∆RNA,el sistema posee los requerimientos moleculares basicos para que un nuevo ∆RNA se seleccione yle complemente, desplazando ası al genoma ST.

El concepto basico en virologıa de las cuasiespecies, con la presencia de una secuencia maestra,se extiende a genomas delecionados, que replican como un complejo espectro dinamico de mutantesdiferentes, pero relacionados entre sı (en cuanto a longitud y posicion de las deleciones)(Biebrichery Eigen 2006; Domingo 2006; Domingo y col. 2001b)

6.1.4. Analisis de la estabilidad de la delecion ∆417

Mediante ingenierıa genetica se introdujo el mınimo cambio en fase posible en el clon infecciosopMT260∆417ns que contenıa la delecion ∆417 en el contexto de secuencia del pase 260. La deleci on∆417 se desplazo 3 nucleotidos hacia el 5’ y hacia el 3’ del RNA (pMT260∆417+3ns y pMT260∆417-3ns, respectivamente). RNAs transcritos de ambas construcciones fueron capaces de replicar yexpresarse eficientemente, segun el analisis electroforetico de la expresion de proteınas. Los nivelesde proteınas expresadas a partir de ambos RNAs fueron indistinguibles de los del RNA transcritode pMT260∆417ns. Sin embargo, tras coelectroporacion de los ∆RNAs junto con el RNA transcritode pMT260∆999ns, se rescato menos virus infeccioso del sobrenadante de celulas electroporadas

113



con los RNAs que tenıan la delecion desplazada del sitio original.Los RNAs ∆417+3 y ∆417-3 presentan 1 y 3 sustituciones de nucleotidos, respectivamente,

respecto al RNA ∆417, en la zona del RNA que codifica la proteasa L. Estas sustituciones co-rresponden a los cambios de aminoacidos M39K en ∆417+3 y K38I, M29L en ∆417-3. Por tanto,cambios muy sutiles en la secuencia de la delecion ∆417 implico efectos fenotıpicos muy evidentes.

Cabe destacar que la proteasa L en estos virus esta delecionada en un 70 % (con perdida del sitiocatalıtico), por lo que probablemente no sea funcional. Esos resultados confirman la idea propuestaen el modelo de la delecion maestra, que sugerıa que la delecion de los nucleotidos ausentes en ∆417es clave, ya que mınimas variaciones en la zona delecionada implicaron una perdida sustancial deinfectividad.

6.1.5. Importancia del contexto de secuencia

La posible importancia del contexto de secuencia en la replicacion de los ∆RNAs se inves-tigo comparando los plasmidos que contenıan la secuencia del p260, bien en la zona estructural(pMT∆999, pMT∆417), bien en todo el genoma (pMT260∆999ns, pMT260∆417ns). La incorpo-

racion de las mutaciones presentes en las proteınas de replicacion en el pase 260 incremento sen-siblemente la capacidad de replicar de los ∆RNAs. Los ensayos de expresion de proteınas porWestern-blot y marcaje metabolico revelaron niveles altos de proteınas de replicacion virales y deparada de la sıntesis de proteınas celulares a las 4h post-electroporacion en celulas electroporadascon pMT260∆999ns, pMT260∆417ns o con la mezcla de ambos. En ese tiempo se pudo detectarefecto citopatico y tıtulo viral. Esto supone un avance de mas de 8 horas en el ciclo infectivo respectoa los transcritos de plasmidos sin las mutaciones en la zona estructural.

Los resultados indican que la delecion ∆417ns requiere un contexto de secuencia adecuadopara poder replicar eficientemente, lo cual probablemente explique por que se necesitaron entre143 y 219 pases a alta MDI para aislar ∆RNAs de VFA. Las mutaciones adquiridas durante los260 pases en cultivos celulares incrementaron sustancialmente la capacidad de replicaci on de los

∆RNAs. La eliminacion de esas mutaciones reduce la capacidad replicativa de los ∆RNAs. Sinembargo, los RNAs transcritos de pMT28, que contienen la secuencia completa de C-S8c1, replicaroneficientemente y produjeron un elevado tıtulo viral, lo que demuestra la viabilidad de los viruscon el contexto de secuencia de C-S8c1. El papel de las mutaciones puntuales en la evoluci onde virus (Domingo 2007), ası como el papel de la recombinacion ha sido ampliamente abordadotanto experimentalmente como teoricamente (Agol 2006; Boerlijst y col. 1996; Holland y col. 1982;Kouyos y col. 2007). En esta Tesis se presenta una nueva relacion directa entre la mutacion puntualy la recombinacion. Los resultados obtenidos sugieren que durante la evolucion del VFA los eventosde mutacion puntual propiciaron la seleccion de genomas con cambios geneticos mas drasticos,como son genomas con deleciones internas generadas por recombinacion. Tanto la mutacion comola recombinacion favorecieron una primera fase de una transicion hacia la segmentacion viral.

6.2. Ventaja selectiva del sistema segmentado de VFA C-S8p260

6.2.1. La presencia de deleciones es un determinante de fitness.

Al competir los virus C-S8p260 y C-S8p260p3d en paralelo contra virus de mayor o menor fitness, el virus defectivo siempre mostro una eficacia biologica 2 veces superior a su ST homologo.Esa diferencia se corresponde con la eficacia biologica relativa de C-S8p260 respecto a C-S8p260p3d,determinada mediante competicion directa entre ellos. Inesperadamente, el virus defectivo fue capazde desplazar a un virus con 200 pases mas en cultivos celulares. La pendiente de las curvas de todoslos ensayos de fitness fue constante en escala logarıtmica, lo que indica que la ventaja selectiva

114



de estos virus fue constante durante cada ensayo. Dado que el virus defectivo y ST comparten elcontexto de secuencia, los resultados indican que el sistema de segmentacion confiere per se unaventaja selectiva de 2 veces independiente de la capacidad replicativa del virus competidor.

No podemos descartar, sin embargo, que entre los diferentes mecanismos moleculares que ope-ran durante las competiciones entre virus ST y defectivo, el virus ST pueda complementar con

sus productos genicos a la replicacion del virus defectivo. Esta complementacion ocurrirıa indepen-dientemente de la propia complementacion existente entre los distintos genomas delecionados quecomponen la poblacion C-S8p260.

6.2.2. Las tasas de replicacion del RNA y de expresion de proteınas son constantesen el virus ST y en el defectivo

Una hipotesis extendida en virologıa es que los virus defectivos se enriquecen en la poblacionya que al tener el genoma mas corto, pueden replicar mas rapido (Holland 1990) (Perrault 1981a).Mediante cuantificacion por RT-PCR a tiempo real se quiso investigar esta posibilidad en el sistemasegmentado de VFA, midiendo la cantidad de RNA de los virus C-S8p260 y C-S8p260p3d durante

la entrada del virus en la celula, la replicacion intracelular y la salida al medio extracelular.Cuando los dos virus se analizaron en infecciones paralelas se observo que presentaban la mismacinetica de acumulacion intracelular de RNA. Los resultados mostraron que los dos virus entranen las celulas, tambien, con la misma cinetica, la entrada se satura en los dos virus en el mismomomento y comienzan paralelamente la replicacion exponencial. A su vez, la replicacion exponencialdel RNA es paralela en los dos virus durante todo el proceso, ası como la salida del virus al medioextracelular.

Los sobrenadantes de infecciones con los virus ST y defectivo se trataron con RNAasa paraeliminar la presencia de RNAs no encapsidados en el medio extracelular. La comparacion de losniveles extracelulares de RNA, en muestras tratadas y sin tratar con RNAasa, no mostro ningunadiferencia en las porporciones de virus defectivo y ST. Por tanto, la relacion de RNA encapsidado

de los dos tipos virales en el medio extracelular no sufrio tampco ninguna variacion, respecto a larelacion de RNA total intra y extracelular (Barclay y col. 1998a; Holland y col. 1989; Valcarcel yOrtin 1989).

Los resultados de la expresion de proteınas especıficas de virus mostraron de nuevo cineticasmuy similares para los dos virus. Se observo una mayor expresion total de proteınas estructura-les en el virus ST. Estos resultados pueden ser debidos a que el 100 % de los RNAs ST puedenproducir proteınas estructurales, mientras que en los ∆RNAs solo lo hace el RNA transcrito depMT260∆417ns. Las cineticas de replicacion del RNA y de expresion de proteınas demuestran quelas diferencias en fitness entre los virus ST y defectivo no se deben a diferencias en la tasa de repli-cacion, como ya se describio previamente para las DIs del PV (Cole y Baltimore 1973a; Lundquisty col. 1979).

6.2.3. El virus segmentado posee mayor infectividad especıfica que el virus ST.

En la descripcion original del sistema defectivo de VFA, se observo que el virus ST producıael doble de RNA vırico y de partıculas vıricas durante su ciclo de infeccion (Garcia-Arriaza y col.2004). Las diferencias en la cantidad de RNA se han podido corroborar estadısticamente mediante 7determinaciones independientes. Inesperadamente, gracias a la correccion del tıtulo viral aplicada enesta Tesis Doctoral, se ha podido determinar que no existen diferencias significativas entre el tıtulode los virus C-S8p260 y C-S8p260p3d. Por tanto, la infectividad especıfica de C-S8p260 (medidacomo la relacion entre RNA vırico y partıculas infecciosas) es el doble que la de C-S8p260p3d. Para

115



corroborar experimentalmente este resultado, basado en una correccion matematica, se diseno unexperimento alternativo que mide la cantidad de RNA en un preparado viral que es capaz de entraren las celulas (Barclay y col. 1998b). Los resultados muestran que el RNA de C-S8p260 entraen las celulas con el doble de eficiencia que el virus ST, una diferencia que esta de acuerdo losdatos de infectividad especıfica. La relacion entre los dos virus al principio y final de la replicacion

exponencial se mantuvo constante, como se ha descrito durante las cineticas de replicacion delRNA. Estos resultados fueron consistentes en varios experimentos independientes, y demuestranque el incremento en infectividad especıfica del virus C-S8p260, le confiere un aumento en fitness

del mismo orden de magnitud que el determinado en los ensayos de competicion.

6.2.4. El virus defectivo es mas estable que el virus ST

El RNA del VFA se encuentra compactado dentro de una capsida icosaedrica dividida enpentameros proteicos (Acharya y col. 1989). Esta partıcula es muy inestable como se ha demostradomediante ensayos de inactivacion por calor (Mateo y col. 2003; Mateo y col. 2007). El tıtulo viral,tanto de C-S8p260 como C-S8p260p3d, decayo rapidamente al incubar preparados virales a 37oC.

Sin embargo, la vida media del virus defectivo fue significativamente mayor que la del virus ST(p<0,001).Dada la rapida inactivacion del VFA a 37oC, y la importancia que tiene este parametro en la

dinamica de la infeccion viral (Ho y col. 1995; Nowak y May 2000; Wei y col. 1995), el incrementoobservado en la estabilidad de la partıcula viral que contiene ∆RNAs puede conferir una granventaja selectiva a un virus. Al medir la infectividad de preparados virales con mezclas de virus,se observo un aumento de la infectividad relativa del virus defectivo respecto al ST, cuando lospreparados se incubaron a 37oC.

En conclusion, el virus de VFA con genoma segmentado ha demostrado tener mayor eficaciabiologica que el virus ST. Esta ventaja selectiva se ha atribuido a la presencia de deleciones,dado que los dos virus comparten el mismo contexto genetico. Esta ventaja resulto ser constante

e independiente de la fitness del virus competidor lo que esta de acuerdo con que no se hayanobservado diferencias en la capacidad replicativa de los dos virus. Los resultados indican que lapresencia de deleciones ejerce una influencia estabilizando la partıcula viral. Probablemente, unRNA mas corto pudo relajar el alto grado de compactacion de la capsida del VFA (Acharya ycol. 1989). El sistema de complementacion ∆417-∆999 mantuvo la informacion genetica completaacortando la longitud del RNA, generando un sistema de replicacion mas eficiente que el virus ST.

6.2.5. Origen polifiletico de la segmentacion viral: conclusiones a partir de la evolu-cion de las DIs

Existe una serie de evidencias, tanto en virus RNA como en virus DNA, de eventos geneticossimilares a la segmentacion. En unos casos se ha observado complementacion entre particulas de-fectivas naturales que rescatan virus infeccioso. Es el caso del coronavirus de la hepatitis murina(+RNA, cadena simple)(Kim et al. 1997), o de SV40 (DNA bicatenario)(O’Neill y col. 1982). Enotros casos, mediante ingenierıa genetica se ha conseguido rescatar infectividad de virus con elgenoma divido en dos partes, de nuevo con SV40 (Geigenmuller-Gnirke y col. 1991), encapsidadoen partıculas diferentes. Mediante ingenierıa genetica, tambien, se consiguio dividir en tres partesel genoma del virus del sarampion (Takeda y col. 2006). Los tres segmentos se encapsidaron dentrode la misma partıcula.

Como se ha comentado en la Itroduccion (apartado 2.6.4), el termino interferencia es ambiguoen muchas descripciones de DIs. Dado que las DIs no se detectan en un ensayo de plaqueo con

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agarosa, es difıcil distingir cuando una partıcula DI es realmente intereferente, de cuando hacebajar el tıtulo a su competidor. Existen pocas decripciones moleculares del proceso de interferencia.Las evidencias, sin embargo, apuntan a que los mecanismos de interferencia y enriquecimiento sondiferentes en virus RNA de cadena positiva o negativa, y de los virus DNA. En DIs de virus DNA sehan descrito duplicaciones del origen de replicacion del genoma que provocarıan su enriquecimiento

respecto al virus ST. En virus RNA de cadena negativa se han descrito DIs que replican sin realizarel proceso de transcripcion y posterior traduccion, que aprovecharıan del virus ST (Holland 1990).En esta Tesis doctoral se ha descrito un aumento preferencial de virus con deleciones internas enel VFA (RNA cadena positiva), debido a su aumento en la estabilidad.

Por estos motivos proponemos un modelo polifiletico para el origen de la segmentacion viral.Segun nuestro modelo las partıculas defectivas podrıan ser precursoras de la segmentacion viral.

6.3. Desarrollo de una vacuna atenuada basada en la poblacion C-S8p260

Historicamente las vacunas para prevenir la FA fueron de las primeras que se prepararon yaplicaron al control de una enfermedad animal (Valee y col. 1925). A pesar de ello y a sucesivas

mejoras en los metodos industriales de preparacion (Bahnemann 1972), hasta el dia de hoy no sedsipone de una vacuna efectiva y segura para prevenir la FA, enfermedad zoonotica en muchospaıses del mundo.

Entre otras dificultades tecnicas, la inactivacion del VFA ha sido un problema durante muchosanos en la busqueda de una vacuna efectiva contra el VFA. El PV se atenuo mediante pases seriadosen cultivos celulares, y proporciono una vacuna muy efectiva contra la poliomelitis (Murdin y col.1996; Sabin 1960). Esta tecnica no ha resultado efectiva para el VFA bien porque el virus noperdıa su virulencia in vivo, bien porque cambiaba sus propiedades antigenicas (Barteling 2004).Actualmente existen varios paıses que poseen el estatus de libres de FA sin vacunacion, graciasa las campanas de vacunacion con la vacuna comercial inactivada. Sin embargo la potencia, laduracion de la inmunidad, y la capacidad de conferir proteccion frente a variantes de VFA de la

vacuna inactivada son muy limitadas. La vacuna debe suministrarse con varias dosis de recuerdo yformulada con un adyuvante. Estos inconvenientes suelen mejorarse, en parte, con el uso de vacunasvivas atenuadas que presentan los epıtopos con la conformacion del virus natural, y que con unabaja replicacion activan una respuesta mas amplia y potente del sistema inmune (Bloom y Lambert2003; Graham y Crowe Jr. 2007).

El virus defectivo con el que se ha trabajado en esta Tesis Doctoral se adapt o a la replicacionen cultivos celulares durante 260 pases citolıticos en celulas BHK-21. Ninguno de los 25 cambiosde aminoacido acumulados en la secuencia consenso afecto a residuos directamente implicados enlas propiedades antigenicas del virus (Mateu y Verdaguer 2004). Por este motivo se investigo lacapacidad inmunogena de la poblacion dominada por ∆RNAs, como posible vacuna atenuada contrael VFA, en el modelo de ratones C-54/BL-6, susceptibles a la infeccion por C-S8c1 (Salguero y col.

2005).

6.3.1. La vacunacion con la poblacion viral C-S8p260 proporciona una proteccionesteril al desafıo de ratones C57BL/6 con el clon de VFA C-S8c1

Todos los ratones sobrevivieron a la vacunacion con el virus vivo y posterior desafıo con una dosisletal del clon de VFA C-S8c1. No presentaron ninguno de los sıntomas de la enfermedad inducidapor el VFA en estos ratones durante todo el proceso de vacunaci on (Salguero y col. 2005). Estosresultados demuestran el caracter atenuado de la poblacion C-S8p260 para ratones C57BL/6. No sedetecto replicacion en sueros de los animales desafiados ni del virus vacunal C-S8p260. Por tanto la

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vacunacion con diferentes dosis de la poblacion de VFA C-S8p260 confirio proteccion esteril frentea la infeccion con VFA en el 100 % de los animales desafiados. Asimismo, el 100 % de los ratonessobrevivio a la inoculacion con dosis altas del virus ST recombinante C-S8p260p3d y al posteriordesafıo con dosis letales de C-S8c1. Esto demuestra que el virus ST C-S8p260p3d (inoculado enexceso) esta atenuado y confiere proteccion frente a la infeccion con VFA, confirmando la seguridad

de la vacunacion con C-S8p260.

6.3.2. La vacunacion con la poblacion viral C-S8p260 proporciona niveles altos deanticuerpos neutralizantes

El nivel de anticuerpos neutralizantes ha sido relacionado con la proteccion in vivo a la infeccioncontra VFA (Barteling 2004; McCullough y col. 1992; McCullough y Sobrino 2004). La vacunaci oncon diferentes dosis de C-S8p260 produjo niveles altos de anticuerpos IgG comparables a los nivelesinducidos por la vacuna comercial inactivada (Salguero y col. 2005). Adem as, el suero de los ratonesinmunizados fue capaz de neutralizar la infeccion de C-S8c1 en celulas BHK-21.

En conclusion, la vacuna atenuada de VFA, basada en la poblacion dominada por ∆RNAs

C-S8p260, ha resultado ser efectiva en un modelo de raton. La vacunacion de ratones con virusvivo necesito una unica dosis, y no requirio adyuvante. Resultados no publicados obtenidos por elgrupo de la Dra. N.Sevilla han demostrado que la vacuna basada en C-S8p260 confiere tambienproteccion en cerdo, uno de los hospedadores naturales mas importantes del VFA (manuscritoen preparacion y solicitud de patente no P200801583). Una de las ventajas de este nuevo tipode vacunacion es que incluye dos niveles de seguridad: (i) la baja capacidad replicativa del virussegementado in vivo debido a la continua necesidad de complementacion y (ii) la atenuacion tras260 pases en cultivos celulares, tanto del virus segmentado como de su hom ologo ST recombinante,en caso de que este se generara in vivo. Por tanto, la evolucion del VFA hacia formas genomicassegmentadas ha proporcionado un nuevo diseno de vacuna atenuada, aplicable a otros serotipos deVFA y probablemente a otros virus RNA.

6.4. El estudio de la topologıa filogenetica y de particion de cuasiespecies reve-lan los patrones evolutivos de poblaciones virales sometidas a mutagenesisincrementada

Cuando las poblaciones virales replican en presencia de agentes mutagenicos, tales como analo-gos de bases, ocurren cambios notables en el espectro de mutantes de las cuasiespecies. Los ex-perimentos iniciales de J.J.Holland y colegas documentaron incrementos muy modestos (de 1,1 a2,8 veces) de la frecuencia de mutaciones puntuales de PV y VSV, asociados con una severa dis-minucion de la infectividad, como consecuencia de la mutagenesis incrementada con una variedadde agentes mutagenicos (Holland y col. 1990). Trabajos posteriores mostraron que la replicacionde virus en presencia de bases mutagenicas o analogos de nucleosido puede llevar al virus a laextincion, acompanada de incrementos muy modestos (desde apenas cuantificable hasta 6,4 veces)en la frecuencia de mutacion, (Loeb y col. 1999; Sierra y col. 2000; Tapia y col. 2005; revisiones enAnderson y col. 2004; Domingo 2005; Graci y Cameron 2002).

En nuestros estudios previos con el VFA y el virus de la coriomeningitis linfocitaria de raton(LCMV) hemos observado que en el curso de la transici on hacia la extincion viral: (i) existe unacaıda de 102 a 103 veces en la infectividad especıfica (numero de partıculas infecciosas dividido porel numero total de cantidad de RNA); (ii) una carga viral baja y una baja capacidad replicativa( fitness ) favorecen la extincion; y (iii) interacciones interferentes entre los virus de una mismacuasiespecie sometida a mutagenesis juegan un papel principal en la extincion viral (Gonzalez-

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Lopez y col. 2004; Gonzalez-Lopez y col. 2005; Grande-Perez y col. 2005a; Grande-Perez y col.2005b; Grande-Perez y col. 2002; Pariente y col. 2003; Perales y col. 2007; Sierra y col. 2000).La crıtica participacion del espectro de mutantes en la extincion viral propicio la propuesta de ladefeccion letal como modelo de extincion de virus debido a la mutagenesis incrementada (Grande-Perez y col. 2005b; Perales y col. 2007). Por estos motivos, resultaba interesante analizar mediante

filogenia y PAQ, espectros de mutantes procedentes de poblaciones virales sometidas a mutagenesis.

6.4.1. Analisis PAQ y filogenetico revelan cambios drasticos y rapidos en la estructurapoblacional

Los resultados observados concuerdan con nuestras conclusiones previas sobre el aumento en lacomplejidad del espectro de mutantes de poblaciones mutagenizadas, documentados en esta TesisDoctoral como un aumento de la dispersion media de los arboles filogeneticos y cuantificacion delparametro d. Ademas se han descrito nuevas caracterısticas poblacionales asociadas a la mutagenesisincrementada.

El arbol de NJ de una poblacion que ha evolucionado sometida a mutagenesis incrementada

consta de una secuencia consenso situada en la base y los componentes individuales de la poblaci onradiando a partir de ella. Cuanto mas mutada esta una poblacion mayor es la radiacion de lasramas. En la topologıa de este tipo de arboles no se aprecia una organizacion evidente ni robustaque indique la presencia de subgrupos o subdivisiones. Los arboles construidos con las poblacionesde VFA cuya polimerasa 3D incluıa una mutacion que disminuye la sensibilidad de R (RAp45 yRAp60) (Sierra y col. 2007), mostro una ligera reduccion en la longitud de las ramas, pero mantuvola misma topologıa general. Este resultado contrasta con la topologıa del arbol derivado de lapoblacion RA0p35, el cual, tras solo 5 pases en ausencia de R, presento una estructura internacompletamente reorganizada. La topologıa del arbol realizado mediante NJ se confirmo con losmetodos de MP y MV.

El parametro d del PAQ refleja el detalle fino de la estructura intrapoblacional mejor que

otros estimadores usados tradicionalmente, tales como la frecuencia de mutaci on o la entropıa deShannon. La frecuencia de mutacion no es sensible a la distribucion que siguen las mutaciones enlos componentes individuales de un espectro de mutantes. La entropıa de Shannon se satura alalcanzar el valor de 1, cuando todas las secuencias comparadas son diferentes, independientementede la carga mutacional. PAQ puede solventar esta falta de resolucion mediante una comparacionclon a clon respecto a una secuencia que el propio analisis determina como central. En este sentido,cualquier variacion, por sutil que sea, en la distribucion espacial de la frecuencia de mutacion puedeamplificarse. De este modo, se obtiene una descripcion mas sensible y no saturable de la estructurainterna de una poblacion. El presente analisis ha documentado expansiones muy notables en ladistancia genetica media intrapoblacional asociadas a los tratamientos mutagenicos. El analisisrevelo que, tras una expansion inicial de la diversidad intrapoblacional, ocurrio una contraccion

de la distancia media, en dos situaciones. Primero, cuando se elimino el tratamiento mutagenicoa la poblacion. Segundo, en las poblaciones de VFA con la sustitucion en la polimerasa 3D, quedisminuye la sensibilidad a R (Sierra y col. 2007). Los resultados mostraron que las frecuencias demutacion (ambas, la mınima, la maxima y su relacion) y la entropıa de Shannon, son sensiblementemenos descriptivas que el PAQ para caracterizar la diversidad genetica interna de las poblacionesvirales mutagenizadas.

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6.4.2. Las poblaciones mutagenizadas estan sometidas a seleccion purificadora

Las poblaciones derivadas de MARLS que replicaron en presencia de R, mostraron una altae inesperada resistencia a la extincion en el pase 35 y pases sucesivos, asociada a la mutaci onde resistencia a R (Sierra y col. 2007). A pesar de presentar dicha mutaci on, el numero total demutaciones fijadas en la secuencia consenso de la poblacion fue muy alto. El patron especıfico demutaciones de la poblaciones tratadas con mutagenos, y el incremento en frecuencia de mutacioncon respecto a las poblaciones control, esta de acuerdo con los resultados de ensayos in vitro conla polimerasa de VFA (Agudo y col. 2008; Sierra y col. 2007).

A pesar de las altas frecuencias de mutacion inducidas por los mutagenos, las mutaciones nose acumularon al azar, sino que lo hicieron en zonas preferenciales del genoma. La acumulaci on noaleatoria de mutaciones ası como el exceso de mutaciones sinonimas corregidas, son consistentes conla accion de seleccion purificadora (o negativa; eliminacion de genomas no aptos en replicacion) enla evolucion de las poblaciones mutagenizadas. Los virus que poseıan menos mutaciones deletereasdebieron tener una ventaja selectiva en un entorno de virus altamente perjudicados. Bajo estepunto de vista, la cuasiespecie ejercio una actividad de tamponamiento de mutaciones, aceptandoaquellas mutaciones menos detrimentales. Esta dinamica es paralela a la observada en el transcursode los pases tipo cuello de botella llevados a cabo con el mismo clon C-S8c1 de VFA (Escarmis ycol. 1996; Escarmis y col. 1999; Escarmis y col. 2002; Escarmıs y col. 2008; Manrubia y col. 2005);revision en (Escarmıs y col. 2006). En las transferencias tipo cuello de botella se acentua la acciondel trinquete de Muller y se seleccionan clones individuales que son capaces de replicar. En losclones que han resistido a la extincion se describio un exceso de mutaciones sinonimas (Escarmis ycol. 2002; Escarmıs y col. 2008) y una distribucion no aleatoria de mutaciones a lo largo del genoma(Escarmis y col. 2002).

El presente estudio poblacional apoya el modelo de defecci on letal para la extincion viral dadoque se ha observado que un numero bajo de mutaciones puede ser suficiente para llevar a un virus ala extincion (Grande-Perez y col. 2005b; Loeb y col. 1999; Tapia y col. 2005). La comparacion con

clones de VFA sometidos a multiples transferencias placa a placa (tipo cuello de botella) resulta muysignificativa ya que estos clones resistieron a la extincion a pesar de que sus genomas presentaronunas frecuencias de mutacion entre 5 y 37 veces superiores a las asociadas con la extinci on viralmediante mutagenesis letal (Escarmıs y col. 2008; Gonzalez-Lopez y col. 2005; Pariente y col.2001; Sierra y col. 2000). Se ha propuesto que en las transferencias placa a placa, la cineticade acumulacion de mutaciones permite la fijacion de mutaciones beneficiosas compensatorias quecontrarrestan el efecto del trinquete de Muller (Escarmis y col. 1999; Escarmis y col. 2002; Escarmısy col. 2006; Manrubia y col. 2005).

A la luz de estos datos, proponemos que la cinetica o tasa a la que se acumulan las mutacionespueda ser mas importante que la cantidad total de mutaciones acumuladas. La extinci on viral seconseguirıa, junto con la accion de la defeccion letal, forzando al virus a acumular mutaciones rapi-

damente, no necesariamente como resultado de la acumulacion de un gran numero de mutaciones.Una cinetica rapida de acumulacion de mutaciones, que sobrepase la capacidad del virus para gene-rar mutantes viables en una poblacion, puede llevarla a la extincion. Una tasa baja de acumulacionde mutaciones, por el contrario, permite la seleccion de clones que han acumulado mutaciones me-nos deletereas, amplificandolos secuencialmente, y aumentando su frecuencia de mutacion. Comose extrae de los pases placa a placa, la secuencia de VFA es robusta y capaz de tolerar gran n umerode mutaciones. Por este motivo predecimos que el exito en el tratamiento de infecciones virales seaaquel que ejerza un efecto mas rapido a pesar de durar menos tiempo, en lugar de un tratamientoleve que haga que el virus acumule mutaciones secuencialmente.

Los analisis filogeneticos y de PAQ, para investigar la organizacion intrapoblacional de los

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espectros de mutantes, puede ser de gran ayuda para entender la evolucion de los virus RNA,sobre todo en aquellas poblaciones que han sido sometidas a mutagenesis incrementada. La crıticaparticipacion del conjunto de individuos de la cuasiespecie hace necesario el empleo de nuevastecnicas que permitan su monitorizacion y cuantificacion.

6.5. Estrategias de fitness virales: la hipotesis de los dos nichos ecologicos

Cuando el espacio donde interactuan especies ecologicas se encuentra estructurado, se puedenseleccionar individuos especialistas que aprovechen los recursos de manera diferencial. En este sen-tido pueden existir individuos que puedan ser mas rapidos colonizando los recursos, los llamadoscolonizadores, e individuos que sean mas eficientes cuando se compite por un mismo recurso, losllamados competidores. Cuando un competidor se encuentra con un colonizador para optar a unmismo recurso, el competidor es capaz de desplazar al colonizador (Tilman 2007). La evolucion dela virulencia en poblaciones virales que infectan y superinfectan un mismo huesped se ha estudiadodesde este punto de vista ecologico (May y Nowak 1994; Nowak y May 1994). Las celulas, organiza-das en tejidos, organos o cultivos en monocapa, se pueden considerar como un recurso parcheado,

discreto, en el que la unidad funcional, cada recurso discreto, es la celula.

6.5.1. Colonizadores y competidores

En esta Tesis doctoral se ha descrito un sistema experimental en el que una poblaci on clonalse ha diversificado en una subpoblacion colonizadora y otra competidora. Los virus tipo-MARLSpresentan una cinetica de muerte celular y de replicacion viral mas rapida que los virus tipo-p200.Estos resultados fueron consistentes al estudiar tanto poblaciones como clones biologicos indivi-duales. Los virus tipo-MARLS son, por tanto, mas virulentos que los tipo-p200 y constituyen elequivalente viral a un colonizador, ya que son mas rapidos compitiendo por el recurso global, inde-pendientemente del rendimiento que produzcan en cada celula individualmente, o de la capacidadcompetitiva dentro de ellas.

Las celulas coinfectadas con igual cantidad de los dos tipos de virus, producen mas cantidadde virus tipo-p200. Los virus tipo-p200 fueron capaces de retrasar la cinetica de muerte celularprovocada por los virus tipo-MARLS. Sin embargo, cuando se estudio la productividad de cadavirus de manera separada, los dos tipos virales produjeron tıtulos muy similares, sugiriendo que noexiste un compromiso entre produccion y virulencia, al menos en el rango de valores estudiado. Portanto, las poblaciones tipo-p200 son competidores, pues son capaces de desplazar (parcialmente) aun colonizador cuando interactuan dentro de un mismo recurso.

6.5.2. Diversificacion genetica con un origen clonal comun

Las estrategias de competicion y colonizacion se han originado y seleccionado espontaneamente

en cultivos celulares, puesto que las poblaciones tipo-p200 y tipo-MARLS tienen un origen clonalcomun (el clon C-S8c1, clonado dos veces en cultivos celulares para asegurar su pureza (Sobrinoy col. 1983)). La evolucion de este clon en cultivos celulares a lo largo de los pases di o lugara dos subpoblaciones, geneticamente distinguibles mediante metodos filogeneticos, apoyadas porvalores estadısticos altos. Estas dos poblaciones muestran un patron de mutaciones muy diferente ycaracterıstico y convivieron durante un gran numero de pases. Estos resultados sugieren fuertementeque las estrategias de competicion y colonizacion ocupan dos nichos ecologicos muy definidos, puestoque el virus se adapta a ellos con cambios geneticos sostenidos en el tiempo.

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6.5.3. Seleccion dependiente de densidad

La evolucion de las estrategias de colonizacion y competicion, enfrentadas en ensayos de fitness,mostro una dependencia sensible a las condiciones iniciales de densidad. En condiciones de bajadensidad evoluciono la estrategia de colonizacion, y en condiciones de alta densidad evoluciono laestrategia de competicion. Estos resultados se deducen de una serie de competiciones con pobla-ciones o clones derivados de cada tipo viral, en los que se vari o la MDI inicial, el equivalente a ladensidad de individuos. A este tipo de seleccion se le denomina seleccion dependiente de densidad(SDD).

Se ha desarrollado un modelo matematico para investigar la SDD entre las poblaciones que ex-plotan la estrategia de colonizacion (tipo-MARLS) y la de competicion (tipo-p200). Es un modeloepidemiologico SIR (del ingles, susceptible, infectado y curado) adaptado de los modelos que descri-ben la dinamica viral de HIV en pacientes infectados (Nowak y Bangham 1996; Nowak y May 2000;Perelson y col. 1996). Consiste en un sistema de ecuaciones diferenciales que adapta la din amica deuna epidemia modelizando los parametros basicos para definir una infeccion en cultivos celulares.Se han realizado cuantificaciones a partir de los experimentos (descritas en el apendice matematico)y se ha determinado que: (i) los virus colonizadores (tipo-MARLS) matan m as rapido a las celulasque los competidores. Sin embargo los dos producen la misma cantidad total de virus tras mataruna celula (tamano de progenie). (ii) Las celulas infectadas por los dos tipos virales mueren con lamisma tasa que lo hacen las infectadas por los competidores, que son la variante lenta (tipo-p200).(iii) El virus competidor es capaz de desplazar parcialmente al colonizador cuando ambos coinfectanla misma celula.

Introduciendo las relaciones entre parametros en el modelo matematico junto con los valoresabsolutos estimados (ver apendice matematico), se ha podido reproducir la SDD entre dos especiesvirales en competicion. Tras reescalar el modelo, se observo que la dinamica de competicion entre dosvirus, sujetos a las reglas anteriormente expuestas, es sensible unicamente a dos parametros nuevos:(i) las diferencias relativas en virulencia de los dos tipos virales (a); (ii) la diferencia relativa de la

capacidad competitiva de cada tipo viral en celulas coinfectadas (c). Estos dos nuevos parametrosdefinen de manera precisa las dos estrategias evolutivas: por un lado los virus colonizadores, queson aquellos virus mas virulentos, son estrategas de la ”a”. Por otro lado, los virus competidoresque son menos virulentos, pero capaces de desplazar al virus colonizador en celulas coinfectadas,son estrategas de la ”c”.

La SDD se puede explicar basandonos en los parametros a y c, y en su significado biologico.En un escenario de competicion en el que hay pocos virus pero muchas celulas, el virus que es masrapido completando el ciclo de replicacion (mayor a), saldra antes de la celula que sus competidores,y podra colonizar antes el resto de celulas y dispersarse rapidamente. Esta estrategia de competiciondesplaza al otro virus por agotamiento de recursos. En un escenario en el que la relaci on virus/celulaes alta, se producen muchos eventos de coinfeccion. En estas circunstancias no quedan recursos

disponibles (celulas) para las segundas rondas de infeccion. Por tanto, la poblacion es dominadapor el virus con mayor capacidad competitiva o interferente dentro de la celula (mayor c).Existen evidencias previas de SDD. La primera descripcion se realizo en nuestro laboratorio con

el VFA (Sevilla y col. 1998a). Experimentos en cultivos celulares demostraron que virus adaptadosa replicar a diferentes MDI, desplazaban a sus competidores solo en las condiciones de MDI enlas que se habıan seleccionado. Posteriormente se observaron resultados similares con el fago φ6(Turner y Chao 1998; Turner y Chao 1999). La descripcion mas exhaustiva de SDD en virus seha descrito con el VSV (Novella y col. 2004). En otro estudio con VSV (de la Torre y Holland1990) mutantes de alto fitness se mantuvieron en baja proporcion en las poblaciones originales dedonde se purificaron. Esas poblaciones originales procedıan de un regimen de pases a alta MDI.

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Sin embargo, cuando se realizaron competiciones con los clones usando baja MDI, los clones erancapaces de imponerse muy eficientemente en las competiciones. Se sugirio que durante los pases aalta MDI, en los que la coinfeccion es frecuente, la poblacion dominante ejercıa un efecto supresorsobre los otros mutantes (de la Torre y Holland 1990). El mismo modelo se propuso para explicarlos otros experimentos, anteriormente citados, realizados con VSV y con φ6. Sin embargo, en estos

estudios no se documento interferencia. Las interacciones entre virus que coinfectan celulas hansido ampliamente descritas (Baulcombe 1996; Bull y Molineux 1992; Gonzalez-Lopez y col. 2004;Grande-Perez y col. 2005b; Holland 1990; Holland y col. 1989; Novella y col. 2004; Perales y col.2007; Russel 1992; Sachs y Bull 2005; Valcarcel y Ortin 1989; Wilke y col. 2004b). Tampoco se hapropuesto ningun modelo, basado en resultados experimentales, que describa el comportamiento delos virus que evolucionan en condiciones de baja MDI. Existen trabajos teoricos que demuestran que,en ciertas condiciones, fuera del equilibrio, suceden fenomenos estocasticos que pueden contribuira seleccionar virus de menor fitness (Aguirre y Manrubia 2007; Aguirre y Manrubia 2008).

La observacion de SDD y la supresion de mutantes con un alto fitness potencial en virus muydistintos, sugiere fuertemente que la aparicion de las dos estrategias de replicacion (a y c) quedan lugar a SDD pueda ser una caracterıstica general en virus RNA. Siguiendo las conclusiones de

los trabajos anteriormente citados, los virus competidores, evolucionados a alta MDI, poseen unacapacidad supresora sobre los colonizadores, demostrada en este trabajo tanto mediante analisisgenomico de poblaciones pasadas en infecciones diluidas, como con ensayos de interferencia en lavirulencia. Proponemos que los virus colonizadores son aquellos virus dotados de mayor virulencia,entendida como virus mas rapidos matando celulas o con mayor velocidad de replicacion (Bonhoeffery col. 2002; Maree y col. 2000; Wu y col. 2006).

6.5.4. Evolucion de la virulencia

Trabajos previos en el laboratorio demostraron que mutaciones en diferentes zonas del genomade VFA pueden contibuir a una virulencia incrementada para celulas BHK-21 (Herrera y col. 2007).

De hecho, durante la replicacion de virus RNA y DNA continuamente surgen virus con distintogrado de virulencia (Baranowski y col. 1998; Buenz y Howe 2006; Kim y col. 2005; Lopez-Buenoy col. 2006; Mason y col. 2003; Regoes y Bonhoeffer 2005; Shankarappa y col. 1999; Tracy y col.2006). El destino de estos mutantes, y las condiciones en las que se seleccionan, han sido objetode un extenso abordaje teorico y, sin embargo, no se ha llegado a un consenso general que predigala evolucion de la virulencia (May y Nowak 1994; May y Nowak 1995; Messenger y col. 1999;Nowak y May 1994; Regoes y col. 2000; Saldana y col. 2003). Incluso se ha observado en diferentessistemas virales que la fitness y la virulencia son rasgos que pueden no seguir una correlaci on directa(Carrasco y col. 2007; Herrera y col. 2007; Voronin y col. 2005; Wodarz 2007).

Hasta donde hemos podido comprobar, la asociacion de la virulencia y la SDD, desvelada enla presente Tesis Doctoral, representa la primera descripcion experimental de las condiciones que

determinan la evolucion de mutantes virulentos en una cuasiespecie vırica. En este sentido, nuestromodelo predice que en infecciones in vivo se seleccionaran variantes mas virulentas en los organosdonde se den condiciones de baja MDI. Esto puede suceder en organos muy irrigados, que incluyancelulas susceptibles, en las que el virus pueda dispersarse facilmente e iniciar nuevas infeccionesaisladas. En organos muy estructurados o con baja irrigacion, donde el virus puede dispersarse sololocalmente, tras la primera infeccion se pueden dar condiciones de alta MDI. En un experimentoreciente de infecciones de raton por el VFA, se analizaron virus de diferentes organos. El estudiodemostro que cuanto mas irrigado estaba un organo, mas virulento (medido como capacidad dematar ratones en nuevas infecciones) era el virus obtenido de ese organo. El virus obtenido dela sangre fue el que produjo mayor virulencia (Sanz-Ramos y col. 2008). Aunque, obviamente,

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en infecciones in vivo multiples factores pueden contribuir a la seleccion de virus virulentos, losresultados estan de acuerdo con nuestro modelo de interaccion entre competidores y colonizadores.

En conclusion, durante la replicacion de virus RNA emergen y se seleccionan espontaneamentedos tipos de subpoblaciones con dos tipos basicos de estrategias de fitness : virus colonizadores, conmayor virulencia y virus competidores, con mayor capacidad competitiva intracelular o interferente.

Estas dos estrategias estan sometidas a SDD. La seleccion de estas estrategias se debe a unapropiedad fısica del medio donde replican los virus, ya que las celulas son un recurso parcheado yestructurado en dos nichos ecologicos diferentes. La descripcion de la SDD tiene varias implicacionesen el concepto de fitness viral. El resultado de un ensayo de fitness puede ser radicalmente distinto,en funcion de la MDI con la que se realice, si entre las variantes enfrentadas existen diferenciasen virulencia o velocidad de replicacion, en la capacidad competitiva o interferente, o en ambas.Ademas, la SDD puede ser relevante en el desarrollo de infecciones in vivo.

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7. Conclusiones

1. En el transcurso de la evolucion de una forma segmentada del virus de la fiebre aftosa (VFA)se han identificado multiples formas minoritarias con deleciones internas. Se ha obtenidoevidencia de un estado transitorio de inestabilidad genetica.

2. La capacidad replicativa del segmento de RNA del VFA con la delecion ∆417 disminuyecuando la posicion de la delecion ∆417 se modifica en tres nucleotidos hacia el 5’ o 3’ delRNA. Las mutaciones puntuales acumuladas durante la replicacion del VFA contribuyeron aaumentar la capacidad replicativa de la forma segmentada que se genero.

3. La ventaja selectiva de la forma segmentada del VFA se debe principalmente a la mayor esta-bilidad de las partıculas, respecto al virus estandar. En cambio, no se han podido demostrardiferencias en la entrada del virus en la celula, niveles de RNA intracelular o extracelular,expresion de proteınas o salida del virus de la celula.

4. Las partıculas de virus segmentado de VFA confieren proteccion de ratones C57/BL6 al

desafıo con dosis letales del virus estandar. El sistema es candidato a una vacuna anti-fiebreaftosa.

5. Se ha adoptado el programa PAQ (Partition Analisis of Quasispecies) al analisis de po-blaciones mutagenizadas del VFA. Los resultados han documentado rapidas expansiones ycompresiones de la diversidad intrapoblacional en aquellas poblaciones que sobreviven al tra-tamiento mutagenico. Se ha observado una baja diversidad intrapoblacional en las poblacionespreextincion. La seleccion purificadora actua durante el proceso de la mutagenesis.

6. Se ha descrito la diversificacion genetica y fenotıpica de un clon de VFA durante su multipli-cacion en cultivos celulares, y de formas recombinantes entre las dos subpoblaciones.

7. Las dos subpoblaciones difieren en su capacidad para matar celulas y capacidad interferente.Su comportamiento corresponde a un modelo de colonizacion frente a competicion, comoresultado de la adaptacion a un ambiente parcheado (conjunto de celulas).

125



8. Apendice filogenetico

0.002

2

2 4

2 1

1 3

2 5

8

5 1 2

3

1 0

6

7

2 0

19

1 6 2 2

1 7

1 8

4 2 3

* RA 0 p 3 5

M AR LS

p 2 6 0 p 3 d p

2 0 0 C

S 8 c 1

1 157

98

71

56

59 54

5 4

2 1

2 2 4 1 3 25

8

5

1 2

3

1 0

61 9

7 2 0

162 2

1 7

1 8

1 1

M A R L S

p 2 0 0 C S

8 c 1

p 2 6 0 p 3 d

* R A 0 p 3 5 4

23

0.001

96

E

11

28

* R A p 3 5

M A R L S

p 2 0 0

C S 8 c 1

p 2 6 0

p 3 d

G

525

4B

3

1318

19

0.001

1 3

25

1 1

23

* R A 0 p 3 5

4

8

5

12

956

7 2 0

1916 2 2

1 7 1 89

8 637 2

7 8 212 2 46 3

7 7

3

1 05 4M A R L S

p 2 6 0 p 3

d p2 0 0

C S 8 c 1

95

0.001

* R A p 3 5

G

5

2 5

9 5 8 4

9

1 9

1 1

28

1 8

6

E7 2

5 2

66

3

1 3

6 8

4

B

6 65 7

M A R L S

p 2 6 0 p 3 d p 2 0 0

C S 8 c

1

9 1

0.001

9 8

7 6

5 4

C S 8 c 1

p 3 d p 2 0 0

MA R L

S

* R A p 3 5

G

5 2 5

3 1 3

4

B

11

2 8

1 9

1 8 9

6

E

7 8 7 3

5 7

7 6

0.002

A B C

D E F

0.002

2

2 4

2 1

1 3

2 5

8

5 1 2

3

1 0

6

7

2 0

19

1 6 2 2

1 7

1 8

4 2 3

* RA 0 p 3 5

M AR LS

p 2 6 0 p 3 d p

2 0 0 C

S 8 c 1

1 157

98

71

56

59 54

5 4

0.0020.002

2

2 4

2 1

1 3

2 5

8

5 1 2

3

1 0

6

7

2 0

19

1 6 2 2

1 7

1 8

4 2 3

* RA 0 p 3 5

M AR LS

p 2 6 0 p 3 d p

2 0 0 C

S 8 c 1

1 157

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71

56

59 54

5 4

2

2 4

2 1

1 3

2 5

8

5 1 2

3

1 0

6

7

2 0

19

1 6 2 2

1 7

1 8

4 2 3

* RA 0 p 3 5

M AR LS

p 2 6 0 p 3 d p

2 0 0 C

S 8 c 1

1 157

98

71

56

59 54

5 4

2 1

2 2 4 1 3 25

8

5

1 2

3

1 0

61 9

7 2 0

162 2

1 7

1 8

1 1

M A R L S

p 2 0 0 C S

8 c 1

p 2 6 0 p 3 d

* R A 0 p 3 5 4

23

0.001

2 1

2 2 4

1 3 25

8

5

1 2

3

1 0

61 9

7 2 0

162 2

1 7

1 8

1 1

M A R L S

p 2 0 0 C S

8 c 1

p 2 6 0 p 3 d

* R A 0 p 3 5 4

23

2 1

2 2 4

1 3 25

8

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1 2

3

1 0

61 9

7 2 0

162 2

1 7

1 8

1 1

M A R L S

p 2 0 0 C S

8 c 1

p 2 6 0 p 3 d

* R A 0 p 3 5 4

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0.0010.001

96

E

11

28

* R A p 3 5

M A R L S

p 2 0 0

C S 8 c 1

p 2 6 0

p 3 d

G

525

4B

3

1318

19

0.001

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E

11

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* R A p 3 5

M A R L S

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525

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3

1318

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E

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* R A p 3 5

M A R L S

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C S 8 c 1

p 2 6 0

p 3 d

G

525

4B

3

1318

19

0.0010.001

1 3

25

1 1

23

* R A 0 p 3 5

4

8

5

12

956

7 2 0

1916 2 2

1 7 1 89

8 637 2

7 8 212 2 46 3

7 7

3

1 05 4M A R L S

p 2 6 0 p 3

d p2 0 0

C S 8 c 1

95

0.001

1 3

25

1 123

* R A 0 p 3 5

4

8

5

12

956

7 2 0

1916 2 2

1 7 1 89

8 637 2

7 8 212 2 46 3

7 7

3

1 05 4M A R L S

p 2 6 0 p 3

d p2 0 0

C S 8 c 1

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1 3

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1 123

* R A 0 p 3 5

4

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5

12

956

7 2 0

1916 2 2

1 7 1 89

8 637 2

7 8 212 2 46 3

7 7

3

1 05 4M A R L S

p 2 6 0 p 3

d p2 0 0

C S 8 c 1

95

0.0010.001

* R A p 3 5

G

5

2 5

9 5 8 4

9

1 9

1 1

28

1 8

6

E7 2

5 2

66

3

1 3

6 8

4

B

6 65 7

M A R L S

p 2 6 0 p 3 d p 2 0 0

C S 8 c

1

9 1

0.001

* R A p 3 5

G

5

2 5

9 5

8 4

9

1 9

1 1

28

1 8

6

E7 2

5 2

66

3

1 3

6 8

4

B

6 65 7

M A R L S

p 2 6 0 p 3 d p 2 0 0

C S 8 c

1

9 1

* R A p 3 5

G

5

2 5

9 5

8 4

9

1 9

1 1

28

1 8

6

E7 2

5 2

66

3

1 3

6 8

4

B

6 65 7

M A R L S

p 2 6 0 p 3 d p 2 0 0

C S 8 c

1

9 1

0.0010.001

9 8

7 6

5 4

C S 8 c 1

p 3 d p 2 0 0

MA R L

S

* R A p 3 5

G

5 2 5

3 1 3

4

B

11

2 8

1 9

1 8 9

6

E

7 8 7 3

5 7

7 6

0.002

9 8

7 6

5 4

C S 8 c 1

p 3 d p 2 0 0

MA R L

S

* R A p 3 5

G

5 2 5

3 1 3

4

B

11

2 8

1 9

1 8 9

6

E

7 8 7 3

5 7

7 6 9 8

7 6

5 4

C S 8 c 1

p 3 d p 2 0 0

MA R L

S

* R A p 3 5

G

5 2 5

3 1 3

4

B

11

2 8

1 9

1 8 9

6

E

7 8 7 3

5 7

7 6

0.0020.002

A B C

D E F

Figura 47: Reconstruccion filogenetica de las poblaciones RAp35 y RAp035 mediante

los metodos de Neighbour-joining, maxima verosimilitud y maxima parsimonia. Lasecuencia consenso de cada poblacion se marca con un asterisco. Los clones se indican enumerados.La barra debajo de los arboles indica la distancia. A) y D) Metodo Neighbor-joining, modelos deKimura-2 parametros. Los valores de remuestro por bootstrap (1000 replicas) mayores de 50 seindican en rojo en el arbol. B) y E) Metodo de maxima verosimilitud, modelo de substitucionde Tamura-Nei y tasas gamma de distribucion de mutaciones con ocho parametros (TN-8) comomodelo de hetereogeneidad. C) y F) Metodo de maxima parsimonia. Se muestran en rojo los valoresde confianza mayores de 50.

126



R

A p p 4 5 - 1

9

R A p p 4 5 - 1

7 R A

p p 4 5

- 2

R A p p 4 5

- 1 0

R A p p

4 5 - 4 RA p p

4 5 - 2 2

R Ap p 4 5 - c o ns

R A p p 4 5 - 3

R A p p 4 5 - 1 1

R A p p 4 5 - 1 2

R A

p p

4 5 - 9

R A

p p 4 5

- 1 4

R A p p 4 5

- 7

M A R L

S

p200

p 3 d

C S

8 c1

0.002

R A p 6 0 - 9 B

R A p 6 0 - 9

R A

p 6 0

- 8 B

R A p 6

0 - C o

n s

R A p 6 0

- 7 B

RA p 6 0-1 B

R Ap 6 0 - 1 4

R A p 6 0 - 1 0

R A p 6 0 - 7

R A p 6 0 - 1 6

R A

p 6 0 - 1

R A p 6 0 - 1 0 B

R A p 6 0 - 1 5

R A p 6 0 - 2

R A p 6

0 - 1 1 B

M A R L

S

p2 0 0

p 3 d

C S 8 c1

0.002

R

A p p 4 5 - 1

9

R A p p 4 5 - 1

7 R A

p p 4 5

- 2

R A p p 4 5

- 1 0

R A p p

4 5 - 4 RA p p

4 5 - 2 2

R Ap p 4 5 - c o ns

R A p p 4 5 - 3

R A p p 4 5 - 1 1

R A p p 4 5 - 1 2

R A

p p

4 5 - 9

R A

p p 4 5

- 1 4

R A p p 4 5

- 7

M A R L

S

p200

p 3 d

C S

8 c1

0.002

R A p 6 0 - 9 B

R A p 6 0 - 9

R A

p 6 0

- 8 B

R A p 6

0 - C o

n s

R A p 6 0

- 7 B

RA p 6 0-1 B

R Ap 6 0 - 1 4

R A p 6 0 - 1 0

R A p 6 0 - 7

R A p 6 0 - 1 6

R A

p 6 0 - 1

R A p 6 0 - 1 0 B

R A p 6 0 - 1 5

R A p 6 0 - 2

R A p 6

0 - 1 1 B

M A R L

S

p2 0 0

p 3 d

C S 8 c1

0.002

Figura 48: Analisis filogenetico de poblaciones de VFA mediante el metodo de maximaverosimilitud, modelo GTR. Los clones individuales en el arbol se indican con su nombre. Lasecuencia consenso se inidica con el nombre de la poblacion seguido de -cons. Como medida derobustez de cada nodo se utilizo el test de tasa aproximada de verosimilitud.

127



9. Apendice matematico: modelo basico de dinamica viral en cul-tivos celulares

El modelo basico de la dinamica viral en cultivos celulares describe la abundancia de celulas noinfectadas, x, celulas infectadas, y, virus libre, v, en funcion del tiempo, como

x = −βxv

y = βxv − ay

v = ky − uv

con las condiciones iniciales x(0) = x0, y(0) = 0, y v(0) = v0.Este sistema de ecuaciones diferenciales ordinarias (EDO) describe la infeccion de celulas no

infectadas con una eficiencia β . Las celulas infectadas mueren y liberan la progenie con una tasaa. El virus libre se produce con una tasa k y se inactiva con una tasa u. Los valores tıpicos de losparametros se dan en la Tabla 13.

Notese que, contrariamente a lo que sucede en el modelo basico de dinamica viral in vivo

(Nowak y May 2000), en cultivos celulares, no existe un suministro externo de celulas no infectadas.Definimos λ = v0/x0 como la multiplicidad de infeccion (MDI), esto es, la densidad inicial de viruspor celula.

1 2 5 10 2 0 50 100

1 e + 0 0

1 e + 0 2

1 e + 0 4

1 e + 0 6

1 e + 0 8

u = 0

tiempo en horas

c u e n

t a

x, celulas sin infectary, celulas infectadasv, virus libre

1 2 5 10 20 50 100

1 e + 0 0

1 e + 0 2

1 e + 0 4

1 e + 0 6

1 e + 0 8

u > 0

tiempo en horas

c u e n

t a

Figura 49: Cinetica del modelo basico de dinamica de infeccion viral.

La dinamica de este modelo se muestra en la Figura 49. Con par ametros genericos, las celulasno infectadas se convierten en infectadas y producen nuevos virus durante la lisis. Este proceso,con una tasa de inactivacion de virus libre mayor que cero, lleva a la eventual extincion de los virusy de las celulas. Si despreciamos la inactivacion del virus libre y establecemos u = 0, la dinamicade las celulas son casi identicas, mientras que el numero de virus libre se satura al alcanzar unaabundancia maxima de v∗ = v0 + (k/a)x0. La produccion final de virus incrementa con la MDI sino eliminamos el virus inicial

v∗ =

λ +

k

a

x0. (7)

128



Parametro Descripcion Virus 1 Virus 2(competidores) (colonizadores)

a tasa de mortalidad de celulas infectadas 0.14 0.25β tasa de infeccion 7,8 · 10−8 7,8 · 10−8

c prob. de tipo 1 en la progenie viral 0.62 0.38

k tasa de produccion de virus libre 34.6 62.5K = k/a tamano de progenie 250 250r0 tasa inicial de crecimiento viral 1.43 1.94R0 tasa reproductora bascia 69.5 69.5u tasa de inactivacion de virus libre 0.28 0.28

Tabla 13: Parametros del modelo basico de la dinamica viral en cultivos celulares.

9.1. Competicion de dos virus en cultivos celulares

Consideremos ahora dos virus diferentes v1 y v2 que compiten por el conjunto de celulas x.

Tenemos celulas infectadas-simple y1 e y2, y celulas superinfectadas y12. Los parametros del modeloestan indexados coherentemente. Asumimos que no existen diferencias en las eficiencias de infeccion,β 1 = β 2 = β 12 = β 21 = β ; las tasas de inactivacion viral tambien se asume que son igualesu1 = u2 = u; sabemos (experimentalmente) que el tamano de progenie es igual

K =k1

a1=

k2

a2=

k12

a12,

lo cual implica k12 = k1, and a12 = a1. Para el sistema de dos virus obtenemos las ecuaciones

x = −βxv1 − βxv2

y1 = βxv1 − βy1v2 − a1y1

y12 = βy1v2 + βy2v1 − a1y12

y2 = βxv2 − βy2v1 − a2y2

v1 = k1y1 + ck1y12 − uv1

v2 = k2y2 + (1 − c)k1y12 − uv2

El parametro adicional c denota la probabilidad de que un virus producido por una celula superin-fectada sea del tipo 1. Se define 0 ≥ c ≥ 1. Estamos interesados en la situacion en la que el primervirus es mas efectivo en las celulas superinfectadas y el segundo es mas rapido matando celulas ylibernado nuevas partıculas virales.

c1 > 0,5 and a1 < a2.

En esta situacion, nos referimos al primer virus como el competidor y al segundo virus como elcolonizador . Los competidores producen una mayor descendencia cuando compiten por los recursosdentro de las celulas, mientras que los colonizadores son mas eficientes dispersando la infeccion.La dinamica del modelo de dos virus se muestra en la Figura 50; el competidor y el colonizador sedefinen por los parametros en la Tabla 13.

9.2. Dinamica in silico frente dinamica in vitro

Queremos estudiar el efecto de la MDI en el resultado de los experimentos de competici on.Antes de comparar las predicciones del modelo a los resultados experimentales, debemos realizar

129



0.1 0.5 1.0 5.0 10.0 50.0

1 e + 0 0

1 e + 0 2

1 e + 0 4

1 e + 0 6

1 e + 0 8

MOI baja

tiempo en horas

c u e n t a

total v1

total v2

v1

v2

y1

y12

y2

0.1 0.5 1.0 5.0 10.0 50.0

1 e + 0 0

1 e + 0 2

1 e + 0 4

1 e + 0 6

1 e + 0 8

MOI alta

tiempo en horas

c u e n t a

célula

infectada-simple

a1

a2

a12

k1

k2

c· k12

(1-c) k12·

+

célula

susceptible

virus

libre

β

β

β

célula

infectada-simple

célula

infectada-doble

A

B

Figura 50: Dinamica de dos virus en competicion en cultivos celulares. A) Esquema de ladinamica de celulas susceptibles, infectadas y virus libre durante una infeccion con dos variantesvirales. B) Dinamica de dos virus en competicion en cultivos celulares con baja (izquierda) y alta(derecha) MDI.

130



pequenos ajustes al modelo basico presentado arriba.

9.2.1. Condiciones iniciales

Para poder controlar la cantidad de virus que se anade a un cultivo celular, los primeros pasos

de la infeccion se llevan a cabo del mismo modo que un ensayo de titulacion. Se anade un volumencon cantidad conocida de virus al cultivo. Al cabo de una hora se retira el inoculo viral, eliminandoası el virus libre no adsorbido a las celulas. Posteriormente se anade medio fresco a las celulas. Deeste modo, durante la primera infeccion, debemos tratar con celulas infectadas pero sin virus libre.Para ello, calculamos el numero de celulas infectadas en la primera ronda de infeccion y usamosesos valores, en lugar de utilizar el numero inicial de virus, como solucion inicial del sistema deEDOs

Consideremos primero un unico virus con MDI inicial λ = v/x0. La probabilidad de encontrarcelulas k veces infectadas, indicado como X = k, tras una ronda de infeccion sigue una distribucionde Poisson.

Prob(X = k) =λke−λ

k!.

Por tanto, la probabilidad de que una celula este infectada por al menos una partıcula viral es

Prob(X ≥ 1) = 1 − Prob(X = 0) = 1 − e−λ.

Para dos virus con λ1 = v1/x0 y λ2 = v2/x0, sea X i = k que indica una infeccion de k vecescon el virus i, i = 1, 2. Si asumimos que las infecciones son independientes, obtenemos

p00 = Prob(X 1 = 0, X 2 = 0) = e−(λ1+λ2)

p01 = Prob(X 1 = 0, X 2 ≥ 1) = e−λ1

1− e−λ2

p10 = Prob(X 1 ≥ 1, X 2 = 0) =

1− e−λ1

e−λ2

p11 = Prob(X 1 ≥ 1, X 2 ≥ 1) =

1− e−λ1

1− e−λ2

usamos las siguientes condiciones iniciales para el sistema de EDOs

x(0) = p00x0

y1(0) = p10x0

y2(0) = p01x0

y12(0) = p11x0

v1(0) = 0

v2(0) = 0

9.2.2. Determinacion de la cantidad de virus

Como medida comparativa del exito de dos virus en competicion en cultivos celulares, cuan-tificamos sus abundancias al final del experimento de infeccion. Dado que la lectura de virus enlos procedimientos experimentales no permite distinguir las partıculas virales infecciosas de las noinfecciosas, en el modelo matematicao, tambien se cuentan los virus inactivados. Las abundanciasde los virus inactivados, w1 y w2, siguen las ecuaciones,

w1 = uv1

w2 = uv2.

131



Definimos t∗ como el primer tiempo en el que el numero de celulas infectadas es menor de uno,

t∗ = ınf {t ≥ 0 | y1(t) < 1, y2(t) < 1, y12(t) < 1},

y escribimos v(t∗) = v∗, etc. La medida computacional es la fitness relativa del virus 2, el coloniza-

dor, sobre el virus 1, el competidor,f =

v∗2 + w∗2v∗1 + w∗1

.

Notese que f 0 = v∗2/v∗1 es una aproximacion a f para valores de u y f = f 0, cuando u = 0.

9.2.3. Predicciones del modelo y resultados experimentales

La Figura 50 ilustra que, de acuerdo con el modelo, el ganador de la competici on puede ser tantoel competidor como el colonizador, dependiendo de la MDI inicial. En condiciones de baja MDI,los colonizadores tienen ventaja. Sin embargo, en condiciones de alta MDI, los competidores sonmas eficaces. Por ete motivo, el modelo predice la accion de la seleccion dependiente de densidad

en el resultado de la competicion.Hemos investigado experimentalmente la abundancia final total de ambos virus, para diferentesdensidades iniciales. Los valores observados se comparan con las predicciones de los valores de fitness realizadas con el modelo, f , para diferentes MDI.

λ =v0,1 + v0,2

x0.

La Figura 51 muestra las prediciones del modelo y los datos experimentales observados, ambosajustados a un modelo lineal. Las predicciones se ajustan a las observaciones coherentemente. Losdatos experimentales confirman la prediccion principal del modelo, esto es, la fitness es dependientede densidad, y con los parametros dados en la Tabla 13, ambos resultados (v1 o v2 ganador) sonposibles. La ventaja del colonizador decrece con la densidad inicial de virus, hasta el punto en elque el competidor puede desplazar al colonizador, en condiciones de muy alta densidad.

9.3. Parametros del modelo

Hemos realizado varios experimentos y empleado ciertas consideraciones teoricas para obtenerlos valores de los parametros mostrados en la Tabla 13.

Tamano de progenie, k/a. El tamano de progenie (cantidad de partıculas virales producidaspor una celula infectada) k1/a1 = k2/a2 = k12/a12 se ha determinado mediante titulacion delsobrenadante de cultivos de celulas infectadas (por v1, v2 o v1 +v2) a alta MDI. En estas condiciones,solo se produce una ronda de infeccion y el resultado de toda la infeccion es la media de los eventos(produccion de progenie) en cada celula infectada.

Tasa de inactivacion del virus libre, u. La infectividad de VFA decae exponencialmente conel tiempo (Mateo, R. et al, JGV 06), con un valor medio de u = 0,28h−1 (Davila, M., and Domingo,E., resultados no publicados).

Tasa de mortalidad de celulas infectadas por el virus 2, a2. El valor de a2 se calculo porobservacion directa al microscopio de muerte celular mediante la tecnica de exclusion de azultripano.

132



l

l

l

l

l

1e- 03 1e- 02 1e- 01 1e+00 1e+01

0 . 5

1 .

0

2 .

0

5 .

0

MDI

f i t n e s s

r e l a t i v a

l prediccion del modelodatos experimentales

Figura 51: fitness vs. MDI. Los datos experimentales son los obtenidos de las competicionesrepresentados en la Figura 43

Tasa reproductora basica, R0. La tasa reproductora basica de un virus se define como elnumero de infecciones secundarias, esto es, el numero de infecciones que resultan a partir de unacelula individual, cuando todas las celulas permanecen sin infectar. Si R0 > 1, cada celula infectadainfecta de media a mas de una nueva celula, y la poblacion viral crecera inicialmente de maneraexponencial segun v(t) ∝ er0t. La tasa de crecimiento, r0, es la raız cuadarada mayor de la ecuacion

r20 + (a + u)r0 + au(1−R0) = 0. (8)

A partir de esta ecuacion, podemos despejar la tasa reproductora basica (Nowak y May 2000).La tasa de crecimiento de cada virus, r0,i, se ha determinado experimentalmente promediando

la pendiente de varias curvas de crecimiento viral (Figura 52).

0 2 4 6 8

y = 0,74e0,5x 2; R = 0,94

y = 1,03e0,61x 2; R = 0,99

G1:

G2:10

10

10

10

10

3

2

1

0

-1

y = 1,22e0,82x 2; R = 0,98

y = 1,09e 0,26x 2; R = 0,97

G1:

G2:10

10

10

10

10

3

2

1

0

-1

0 2 4 6 8

y = 0,95e0,31x 2; R = 0,96

y = 1,33e0,56x 2; R = 0,92

G1:

G2:10

10

10

10

10

3

2

1

0

-1

0 2 4 6 8

0 2 4 6 80 2 4 6 8

y = 0,74e0,5x 2; R = 0,94y = 0,74e0,5x 2; R = 0,94

y = 1,03e0,61x 2; R = 0,99

G1:

G2:10

10

10

10

10

3

2

1

0

-1

10

10

10

10

10

3

2

1

0

-1

y = 1,22e0,82x 2; R = 0,98y = 1,22e0,82x 2; R = 0,98

y = 1,09e 0,26x 2; R = 0,97

G1:

G2:10

10

10

10

10

3

2

1

0

-1

10

10

10

10

10

3

2

1

0

-1

0 2 4 6 8

y = 0,95e0,31x 2; R = 0,96y = 0,95e0,31x 2; R = 0,96

y = 1,33e0,56x 2; R = 0,92

G1:

G2:10

10

10

10

10

3

2

1

0

-1

0 2 4 6 8

Figura 52: Curvas de crecimiento viral. La tasa de crecimiento exponencial (r0) se deter-mino mediante titulacion de sobrenadante de infecciones tal y como se especifica en Materiales ymetodos, 4.4. Cada panel representa un experimento diferente.

133



Eficiencia de infeccion, β . La tasa reproductra basica se puede escribir como R0 = βkx0/au(Nowak y May 2000), a partir de la cual se obtiene β .

Tasa de mortalidad de celulas infectadas por el virus 1, a1. Una vez se conocen el restode parametros del virus 1, ası como su crecimiento exponencial r0, se puede despejar de manera

precisa a1 a partir de la ecuacion 8

Probabilidad de producir virus 1 en la descendencia, c. Como se ha descrito para el calculodel tamano de progenie, el resultado de la produccion viral en una infeccion a alta MDI representauna media de la produccion en cada celula. Los ensayos de fitness a la mayor MDI ensayada, dondela gran mayorıa de las celulas estan coinfectadas, permiten distinguir la produccion de progenieviral perteneciente a v1 o a v2 en celulas que estan coinfectadas por ambas variantes virales.

9.4. Analisis matematico

Para el analisis matematico del sistema de EDOs para la competicion de dos virus, asumimos

u = 0 y reescribimos las ecuaciones usando K = k/a,

x = −βxv1 − βxv2

y1 = βxv1 − βy1v2 − a1y1

y12 = βy1v2 − βy2v1 − a1y12

y2 = βxv2 − βy2v1 − a2y2

v1 = Ka1y1 + cka1y12

v2 = Ka2y2 + (1 − c)ka1y12.

Con las condiciones iniciales x(0) = x0, y1(0) = y2(0) = y12(0) = 0, y vi(0) = vi,0, i = 1, 2.

9.4.1. Ley de conservacion

Abusando ligeramente de la anotacion, establecemos, para i = 1, 2,

v∗i = vi(∞) = lımt→∞

vi(t).

La sumaφ = x + y1 + y12 + y2 +

v1

K +

v2

K

es una cantidad conservada del sistema, por ejemplo, φ = 0. Desde φ(0) = φ(∞) se deduce que

v∗

1 − v1,0 + v∗

2 − v2,0 = Kx0.

Esta ecuacion no determina la cantidad final de ambos virus, pero define una restriccion a esacantidad. Esta restriccion no depende de β (incluso si no hubiesemos asumido que todas las tasasde infeccion son iguales). Usando λ = (v1,0 + v2,0)/x0 obtenemos una ecuacion similar a la ec. 7,

v∗1 + v∗2 = (K + λ)x0.

134



a

c

0 20 40 60 80 100

0 .

2

0 . 4

0 .

6

0 .

8

MDI = 1e- 06

a

c

0 20 40 60 80 100

0 .

2

0 . 4

0 .

6

0 .

8

MDI = 1e- 04

a

c

0 20 40 60 80 100

0 .

2

0 . 4

0 .

6

0 .

8

MDI = 0.01

Figura 53: Resultado de la competicion viral. Cada panel indica el ganador del experimentode competicion (rojo: gana el colonizador; azul: gana el competidor) a lo largo del espacio deparametros completo (el plano a-c). Las tres subfiguras corresponden, de izquierda a derecha, aMDI crecientes.

9.4.2. Espacio de parametros

Hemos introducido el siguiente cambio linear a las coordenadas,

t = a1t, x =β

a1x, y1 =

β

a1y1, y12 =

β

a1y12, y2 =

β

a1y2, v1 =

β

Ka1v1, v2 =

β

Ka1v2,

para obtener el sistema de EDOs simplificado

x = −xv1 − xv2

y1 = xv1 − y1v2 − y1y12 = y1v2 − y2v1 − y12

y2 = xv2 − y2v1 − ay2

v1 = y1 + cy12

v2 = ay2 + (1− c)y12

donde a = a2/a1. El nuevo sistema tiene solo dos parametros, a saber a y c. Hemos eliminado lasdependencias indirectas en β , K , y a1. Notese que el competidor y el colonizador descritos en laTabla 13 difieren unicamente en esos dos restantes parametros, precisamente.

Para poder explorar el espacio de parametros del modelo es suficiente considerar el caso en elβ = 1, K = 1, y a1 = 1. Estamos interesados en si la fitness

f 0 =v∗2v∗1

=(1 + λ)x0

v∗1− 1

es mayor o menor que 1 para cualquier valor dado de a y c. La Figura 53 explora esta cantidadmostrando su logaritmo en el plano a-c para tres MDI diferentes. Para valores de c < 0,5, loscolonizadores ganaran siempre, mientras que para valores de c > 0,5 y valores pequenos de a, loscompetidores desplazaran siempre a los colonizadores. Para c > 0,5 y a ≫ 1, el resultado de lacompeticion depende de la MDI inicial de la infeccion: los colonizadores ganaran en condiciones debaja densidad, mientras que los competidores lo haran en las condiciones de alta MDI inicial.

135



10. Apendice informatico

Se ha desarrollado una simulacion en C sobre la dinamica basica de replicacion de virus encultivos celulares. La simulacion consta de una gradilla de celulas, adyacentes unas a otras, suscep-tibles de ser infectadas. Al ejecutar el programa, el usuario decide el numero inicial de celulas y de

virus con el que comienza la infeccion. Los virus iniciales son distibuidos al azar a lo largo de lagradilla, estableciendo ası la primera ronda de infeccion. Las celulas infectadas liberan nuevo virus(de todos los tipos por los que han sido infectadas). El virus liberado se desplaza en dos dimensionessegun una simulacion fısica de difusion de partıculas. Las nuevas partıculas tienen la posibilidad deinfectar celulas susceptibles. Las nuevas partıculas se van inactivando a lo largo del tiempo.

Granularidad. El tiempo en la simulacion se mide como granularidad. La granularidad es pro-porcional a las veces que el programa ejecuta un loop. Ası, un tiempo de 100 equivale a 100 loops

del programa.

Celulas. Las celulas estan ubicadas en una matriz hexagonal. Es decir, cada celula tiene 6 veci-

nos. La vecindad de 6 establece que, respecto a una celula central, cualquier celula adyacente esequidistante. Las celulas, en ausencia de infeccion, son inmortales.

Virus. El progarama tiene la capacidad de definir tantos tipos virales como se desee. Cada tipoviral esta definido por ciertos parametros:

Capacidad de carga, K i. La capacidad de carga, que tecnicamente es una propiedad de lacelula, depende del tipo viral por el que la celula esta infectada. Equivale al tamano de progenie,definido en el texto principal y en el apendice matematico.

Tasa de crecimiento, ri. Equivale a la tasa de crecimiento inicial r

0(apendice matematico).

Es la cantidad de virus producido por unidad de tiempo.

Tasa de inactivacion, u. Equivale a la tasa del mismo nombre del apendice matematico. Esla proporcion de virus inactivado por unidad de tiempo.

Factor de competicion, c. Una celula que esta infectada por dos variantes virales distintas,produce una proporcion ci de cada tipo. Siendo

ni=0 ci = 1

Velocidad de difusion. Las partıculas virales, una vez son liberadas fuera de la celula,difunden por la matriz. Se mide como la granularidad necesaria para atravesar una celula.

Las partıculas virales son liberadas de las celulas siguiendo una funcion logıstica:

N (t) =K ert

K + N t (erT − 1)(9)

Donde T es el tiempo que tarda la celula en producir las K partıculas.Las partıculas se distibuyen en dos dimensiones siguiendo los gradientes de concentracion de

partıculas. Las partıculas se desplazan en la direccion inversamente propocrcional a la cantidad devecinos. Es decir, las zonas con menos partıculas atraen con mayor fuerza a las nuevas partıculas,y viceversa. Esta difusion sigue la regla:

136



xi =

1 +

N

6− ni

N

(10)

Donde X i es el numero de partıculas que pasa de un area a la adyacente i. Cada area se definecomo el espacio ocupado por una celula. 6 es el numero de areas vecinas. N es el numero departıculas en un area determinada. ni es el numero de partıculas en el area vecina i.

Se ha generado un video con el resultado de las simulaciones (Figura 54). El video transforma demanera proporcional la matriz hexagonal en pıxeles. Las celulas vivas se representan como puntosblancos. Aparece un espacio intercelular, por motivos visuales unicamente, en negro. La celula sevuelve de color verde o rojo en funcion de la variante viral que la infecta. La celula actua como focode dispersion de virus, que se representan como pıxeles rojos o verdes. La intensidad del color esproporcional a la cantidad de virus. Las celulas amarillas estan coinfectadas por las dos variantes.

137



Figura 54: Simulacion de virus. De izquierda a derecha y de arriba a abajo, serie temporal de lasimulacion de una infeccion con dos variantes virales (en rojo y verde).

138



10.1. Codigo fuente

/* Albert Cardona and Samuel Ojosnegros

* Simulating viral populations of competitor and colonizer viruses.

* 2008 at INI Zurich.

*

* With much help from Stephan Saalfeld regarding C++ aspects.

*

* Compile with:

* g++ -O2 -Wall -o sim-sin.o sim-sin.c 2>&1 | less

*/

#include <math.h>

#include <time.h>

#include <stdlib.h>

#include <stdio.h>

#include "utilities.cpp"

#define E 2.718281828459

/* A very large number to use as initalizer when looping to find a minimal number.*

#define MAX_VALUE 99999999

/* VIRUS TYPE */

typedef struct {

int rep_cyc_len; /* replication_cycle_length */

int delay;

float half_life;

float K; /* Carrying capacity of the virus. */float R; /* Growth rate or replication rate. */

float IR; /* Infectivity rate. */

} VirusType; /*Not a virion particle, but a virus type. */

/* Longest life length of an infected cell, from infection point to death: */

const int infected_cell_lifespan = 100;

/* Time granularity: relative to the longest cycle of all viruses. */

const int granularity = infected_cell_lifespan * 1;

/* VirusType constructor. */VirusType* make_virus(const int rep_cyc_len, const int delay, const float

half_life, const float K, const float R, const float IR) {

VirusType* virus = static_cast< VirusType* >( malloc(sizeof(VirusType)) );

virus->rep_cyc_len = rep_cyc_len;

virus->delay = delay;

virus->half_life = half_life;

virus->K = K;

virus->R = R;

virus->IR = IR;

139



return virus;

}

/* Types of viruses */

#define NUM_VIRUS_TYPES 2

/*Slow virus: competitor */

VirusType* competitor;

/*Fast virus: */

VirusType* colonizer;

/* All virus types into an array. */

VirusType* virus_types[NUM_VIRUS_TYPES];

void initVirusTypes(float K1, float R1, float HL1, float IR1, float K2, float

R2, float HL2, float IR2) {

competitor = make_virus(1 * infected_cell_lifespan, 20, HL1, K1, R1, IR1);

colonizer = make_virus((int)(0.7 * infected_cell_lifespan), 15, HL2, K2, R2, IR2);

virus_types[0] = competitor;

virus_types[1] = colonizer;

printf("Initialized competitor with K=%f, R=%f, HL=%f\n", K1, R1, HL1);

printf("Initialized colonizer with K=%f, R=%f, HL=%f\n", K2, R2, HL2);

}

/* Forward declaration for Cell so it can refer to itself. */typedef struct Cell_ Cell;

/* CELL */

struct Cell_ {

//int index; /* The index of this cell in the array. */

VirusType** virus_type; /* Array of virus types infecting this cell, of size

NUM_VIRUS_TYPES. An entry is null when not in use, and means that virus (same

order as in global virus_types array) is not infecting this cell. */

bool succeptible; /* Whether the infection by a new virus has any effect. */

int infection_start_time; /* -1 by default, meaning not infected yet. */

bool alive; /* true by default. */

Cell** neighbors;

int n_neighbors;

float n_virions[NUM_VIRUS_TYPES]; /* Of length NUM_VIRUS_TYPES, counts the

n_virions for each type floating on top of this cell. It’s a floating point

so it accumulates the values after the coma. Same ordering as in global

virus_types and Cell->virus_type. */

};

140



/* CELLS lie on a hexagonal grid. */

// Commented out to disable: does not even get compiled when disabled!

// #define DEBUG_NEIGHBORS 1

/* Find all neighbors for cell ’i’ in the hexagonal grid of length n_cells and

row length ’side’*/

void find_neighbors(Cell** cells, const int n_cells, const int i, const int side) {

const int x = i % side;

const int y = i / side;

Cell** neighbors = static_cast< Cell** >(malloc(sizeof(Cell*) * 6)); // array

const int rem = y % 2; // reminder: 0 means even, 1 means odd

int next = 0; // from 0 to 6, indicates the number of neighbors found

// tops: only when y > 0if (y > 0) {

if (0 == x) {

if (0 == rem) {

// EVEN Y

// ADD top-left

const int p = (y-1) * side + x;

neighbors[next++] = cells[p];

#ifdef DEBUG_NEIGHBORS

printf("Adding to %i top-left %i\n", i, p);

#endif

}// else NO top-left


else {

printf("NOT Adding top-left to %i\n", i);

}

#endif

// ADD top-right

const int p = (y-1) * side + x + (0 == rem ? 1 : 0);



printf("EX Adding to %i top-right %i\n", i, p);#endif

} else if (x == side-1) {

if (0 != rem) {

// ODD

// ADD top-right

const int p = (y-1) * side + x;



printf("Adding to %i top-right %i\n", i, p);

141



#endif

}

// else NO top-right


else {

printf("NOT Adding top-right to %i\n", i);}

#endif

// ADD top-left

const int p = (y-1) * side + x - rem;



printf("EX Adding to %i top-left %i\n", i, p);

#endif

} else {

// top-left

const int pl = (y-1) * side + x - rem;neighbors[next++] = cells[pl];


printf("Adding to %i top-left %i\n", i, pl);

#endif

// top-right

const int pr = (y-1) * side + x + (0 == rem ? 1 : 0);

neighbors[next++] = cells[pr];


printf("Adding to %i top-right %i\n", i, pr);

#endif

}}

// left

if (x > 0) {

// ADD left

neighbors[next++] = cells[i-1]; // same: [y * side + x -1];


printf("Adding to %i left %i\n", i, i-1);

#endif

}

// rightif (x < side-1) {

// ADD right

neighbors[next++] = cells[i+1]; // same: [y * side + x +1];


printf("Adding to %i right %i\n", i, i+1);

#endif

}

// bottoms: only when y < side-1

142



if (y < side-1) {

// bottom-left

if (0 == x) {

if (0 == rem) {

// EVEN

// ADD bottom-leftconst int p = (y+1) * side;



printf("Adding to %i bottom-left %i\n", i, p);

#endif

}

// else NO bottom left


else {

printf("NOT Adding bottom-left to %i\n", i);

}#endif

// ADD bottom-right

const int p = (y+1) * side + x + (0 == rem ? 1 : 0);



printf("EX Adding to %i bottom-right %i\n", i, p);

#endif

} else if (x == side -1) {

if (0 != rem) {

// ODD

// ADD bottom-rightconst int p = (y+1) * side + x;



printf("Adding to %i bottom-right %i\n", i, p);

#endif

}

// else NO bottom-right


else {

printf("NOT Adding bottom-right to %i\n", i);

}#endif

// ADD bottom-left

const int p = (y+1) * side + x - rem;



printf("EX Adding to %i bottom-left %i\n", i, p);

#endif

} else {

// ADD both

143



// bottom-left

const int pl = (y+1) * side + x - rem;

neighbors[next++] = cells[pl];


printf("Adding to %i bottom-left %i\n", i, pl);

#endif// bottom-right

const int pr = (y+1) * side + x + (0 == rem ? 1 : 0);

neighbors[next++] = cells[pr];


printf("Adding to %i bottom-right %i\n", i, pr);

#endif

}

}

cells[i]->neighbors = neighbors;

cells[i]->n_neighbors = next; /* Next now acts as a length. */

/* // debug: test if any neighbor is the same cell

int j;

for (j=0; j<next; j++) {

if (cells[i] == neighbors[j]) printf("WARNING cell[%i] is self-assigned

to neighbor[%i]\n", i, j);

}

*/

/*// debug: test if any neighbor is repeated

int g;

for (j=0; j<n_neighbors; j++) {for (g=j+1; g<n_neighbors; g++) {

if (neighbors[j] == neighbors[g]) printf("WARNING: cell[%i] has

repeated neighbor %i,%i\n", i, j, g);

}

}

*/

}

Cell** create_cells(const int side) {

const int n_cells = side * side;

Cell** cells = static_cast< Cell** >(malloc(sizeof(Cell*) * n_cells));/* square grid */

int x, y;

int i;

for (y=0; y<side; y++) {

for (x=0; x<side; x++) {

Cell* cell = static_cast< Cell* >(malloc(sizeof(Cell)));

cell->virus_type = NULL;

cell->succeptible = true;

cell->infection_start_time = -1;

144



cell->alive = true;

for (i=0; i<NUM_VIRUS_TYPES; i++) {

cell->n_virions[i] = 0; // init to zero

}

/* Store into array: */

cells[y * side + x] = cell;

// DEBUG

// cell->index = y * side + x;

}

}

/* Now find the neighbors of each cell, and its number too. */

for (i=0; i<n_cells; i++) {

find_neighbors(cells, n_cells, i, side);

}

return cells;

}

void inactivate_virions(Cell* cell) {

/* e^-(granularity * time) */

/* x(t) = x * e^(1/virion_half_life * (current_time - start_time) */

int k;

for (k=0; k<NUM_VIRUS_TYPES; k++) {

/* recalculate the number of viral particles of each type: *///printf("before: n_virions[%i] = %i -- ", k, cell->n_virions[k]);

cell->n_virions[k] = cell->n_virions[k] * virus_types[k]->half_life;

//printf("after: n_virions[%i] = %f\n", k, cell->n_virions[k]);

}

}

void infect(Cell* cell, const int k_virus_type, const int time_tick) {

if (! cell->succeptible) return;

/*Add the virus type to the cell */

int i;

/*If the cell has not yet been infected: */

if (NULL == cell->virus_type) {

cell->virus_type = static_cast< VirusType** >(malloc(sizeof(VirusType*)

* NUM_VIRUS_TYPES)); /* MUST BE increased if there are any more virus

types than just 2 !*/


if (k_virus_type == i) cell->virus_type[i] = virus_types[k_virus_type];

145



else cell->virus_type[i] = NULL;

}

cell->infection_start_time = time_tick;

return;

}

/* If the cell was already infected by any virus: */

/* Search the infecting_types if the cell has it already */

if (NULL != cell->virus_type[k_virus_type]) {

/* The cell is already infected by virus type k */

return;

}

/* Else, the cell was not infected by k_virus_type yet: */

cell->virus_type[k_virus_type] = virus_types[k_virus_type];

/* ... BUT, for sure, was infected by another type! Find out if it’s infected

by all possible types already. */


if (NULL == cell->virus_type[i]) return; /* At least one type is NOT

infecting it, so the cell is still succeptible if it hasn’t passed yet

its infecting viruses delay period. */

}

/* Else, all possible virus types are already infecting the cell: */

cell->succeptible = false; /* This is an optimization to avoid scanning cells

when a cell contains all possible types of viruses: accepting more is

disabled in this simulation (has no effect). */}

/* Add all viruses from temporary hash maps to the neighbor cells, and subtract

them from the self. */

void send_viruses_to_neighbors(Cell* cell, float** send)

{ //float send[NUM_VIRUS_TYPES][6]) {

Cell** neighbors = cell->neighbors;

const int n_neighbors = cell->n_neighbors;

int j,k;

// for each virus type


// for each neighbor

for (j=0; j<n_neighbors; j++) {

/*

if (cell->index == 12) { // DEBUG

printf("Cell %i sends to neighbor %i the amount %f\n",

146



cell->index, neighbors[j]->index, send[k][j]);

}

*/

neighbors[j]->n_virions[k] += send[k][j];

/* Add to the neighbor */

cell->n_virions[k] -= send[k][j];/* Subtract from the source cell */

}

}

//printf("\n");

}

#define NORMAL 11

#define INFECTED 22

#define DEAD 33

/* Returns the largest delay of all virus types infecting a cell, if any.Otherwise returns zero. */

int find_max_delay(const Cell* cell) {

int k;

int max = 0;


if (NULL == cell->virus_type[k]) return max;

const int delay = cell->virus_type[k]->delay;

if (delay > max) max = delay;

}

return max;

}

/* Returns true if the cell is not infected, or when infected, if the delay

is not over. */

bool is_infectable(Cell* cell, const int time_tick) {

if (! cell->alive) return false;

/* Dead! */

if (-1 == cell->infection_start_time) return true;

/* Not infected yet */

if (cell->infection_start_time + time_tick > find_max_delay(cell)) return true;

/* Infected, but still within delay. */

/* Else already infected and beyond delay window: not infectable. */return false;

}

/* Attempt to infect the cell with its current load. Returns the cell state:

DEAD or INFECTED or NORMAL. */

unsigned char attempt_to_infect(Cell* cell, const int time_tick) {

if (! cell->alive) return DEAD;

unsigned char state = NORMAL;

147



if (-1 != cell->infection_start_time) {

if (! is_infectable(cell, time_tick)) {

return INFECTED; /* Cannot be infected by any more viruses. */

}

state = INFECTED;// else attempt to infect with another virus

}

// DEBUG: observing the spread of a single virus

// if (true) return state;

// else attempt to infect, from the pool of floating virions on top of the cell

// for each virus type:int k, i;


const int n_virions = (int)(cell->n_virions[k] + 0.5f); /* rounding */

// Now apply infectivity rate to each of the n_virions

for (i=0; i<n_virions; i++) {

// attempt to infect at random: drand48 returns a value from zero

(inclusive) to 1 (not-inclusive)

if (drand48() < virus_types[k]->IR) { // INFECTIVITY_RATE is from 0 to 1

// virus enters cell

infect(cell, k, time_tick); /* Infect with virus_types[k] virus. */

// virus is removed from pool of viruses floating over the cellcell->n_virions[k] -= 1;

// new cell state:

state = INFECTED;

}

}

}

return state;

}

/* Find the longest replication cycle length of all viruses infecting the cell. */

int find_max_rep_cycle_len(const Cell* cell) {int max = 0;

int k;


if (NULL == cell->virus_type[k]) continue;

const int rep_cyc_len = cell->virus_type[k]->rep_cyc_len;

if (rep_cyc_len > max) max = rep_cyc_len;

}

return max;

}

148



/* Kill the cell when infected and the time of infection plus the longest

replication cycle of all the viruses that infect it is the same or larger

than the current time. */

bool attempt_to_kill(Cell* cell, const int time_tick) {

if (-1 == cell->infection_start_time) return false; /* Not infected, and alive. */

/* Try if cell can die. */

if (time_tick - cell->infection_start_time >= find_max_rep_cycle_len(cell)) {

cell->alive = false;

cell->succeptible = false;

//printf("Killed cell ");

return true; // dead

}

/* Try if cell can stop being succeptible. */

if (time_tick - cell->infection_start_time >= find_max_delay(cell)) {

cell->succeptible = false;}

return false; // alive

}

/* At each time tick, the proportion of floating virions that move from one

cell onto all its neighbors. */

#define MOVING_PROPORTION 0.25f

/* Move viruses from one cell to the ’send’ (which will be later passed on to

neighbors). */

void move_viruses(Cell* cell, float** send /*, const int cell_index, const inttime_tick*/ ) { // float send[NUM_VIRUS_TYPES][6]) {

int k, i;

/* Check if the cell (as a location) has any viruses to send to its

neighbors. */

float n_virions = 0;


n_virions += cell->n_virions[k];

}

const int n_neighbors = cell->n_neighbors;

if (n_virions <= 0) {

// reset to zeros


for (i=0; i<n_neighbors; i++) {

send[k][i] = 0;

}

}

149



// ... and finish

return;

}

Cell** neighbors = cell->neighbors;

/* Compute amount to transfer to each neighbor, following this equation:

* Xi = (1/n_neighbors) * ( 1 + ( (N/n_neighbors - ni) / N ) )

* where Xi is the proportion of virions to send to each neighbor

* where N is the total amount of virions in the neighborhood of 6 cells,

not including the self

* where ni is the amount of virions of type k in a neighbor i

*/

float N = 0; // Total amount of virions of all types in the neighbor cells.



N += neighbors[i]->n_virions[k];}

}


if (0 == N) {

/* The neighbors don’t have any viruses at all. */

/* Send 1/n_neighbors * MOVING_PROPORTION to each. */


send[k][i] = cell->n_virions[k] * MOVING_PROPORTION / n_neighbors;

//printf("NONE at all: send[%i][%i] = %f -- n_neighbors=%i,

cell_index=%i\n", k, i, send[k][i], n_neighbors, cell_index);

}} else {


const float Xi = ( 1 + ( (N / n_neighbors) - neighbors[i]->

n_virions[k]) / N ) / n_neighbors;

//printf("N=%f, ni=%f, n_neighbors=%i, Xi=%f\n", N, ni,

n_neighbors, Xi);

/* Weighted by the moving proportion, which simulates the

time that it takes a virion particle to move across the

span of one cell */

send[k][i] = cell->n_virions[k] * MOVING_PROPORTION * Xi;

//printf("send[%i][%i]=%f\n", k, i, send[k][i]);//printf("neighbors[%i]->n_virions[%i] = %f and send[%i][%i] =

%f\n", i, k, neighbors[i]->n_virions[k], k, i, send[k][i]);

/*

if (time_tick == 30) {

printf("neigh %i/%i gets sent %f\n", i, n_neighbors,

send[k][i]);

}

*/

}

150



}

}

}

/* // Not in use

float find_min_R(Cell* cell) {int k;

float min_R = MAX_VALUE;


if (NULL == cell->virus_type[k]) continue; // Means: k virus type is not

infecting this cell.

if (cell->virus_type[k]->R < min_R) min_R = cell->virus_type[k]->R;

}

return min_R;

}

*/

/* // Not in use

float find_min_K(Cell* cell) {

int k;

float min_K = MAX_VALUE;


if (NULL == cell->virus_type[k]) continue; // Means: k virus type is not

infecting this cell.

if (cell->virus_type[k]->K < min_K) min_K = cell->virus_type[k]->K;

}

return min_K;

}*/

/* Logistic equation. */

float leq(const float K, const float R, const int time_tick) {

return (float)(( K * pow(E, R * time_tick) ) / (K + -1 + pow(E, R *

time_tick)));

}

void attempt_emit_virions(Cell* cell, const int time_tick, const float prop) {

if (-1 == cell->infection_start_time) return; // not infected

int k;

/* No matter how many virus types infect, the R will be that of the slowest

one,

which also has the longest delay.*/

float min_R = 0;

float min_K = 0;

int max_delay = 0;

151



int i_slow = 0; // the index of the slowest one

int n_infecting_viruses = 0;


if (NULL == cell->virus_type[k]) continue; /* Means: k virus type is notinfecting this cell. */

n_infecting_viruses++;

/* Look for the longest delay. */

const VirusType* vt = cell->virus_type[k];

if (vt->delay > max_delay) {

max_delay = vt->delay;

min_K = vt->K;

min_R = vt->R;

i_slow = k;

}

}

//printf("max_delay=%i\n", max_delay);

/* If delay time is not over, can’t emit. */

if (time_tick - cell->infection_start_time < max_delay) {

return;

}

/* The K is proportional to the number of virus types infecting. */

min_K /= n_infecting_viruses;


if (NULL == cell->virus_type[k]) continue; /* Means: k virus type is not

infecting this cell. */

/* Add new virions of type k to the column above the cell: */

float K = min_K;

/* When more than one virus is infecting, scale down the K of all viruses

except the slowest one. */

if (n_infecting_viruses > 1 && i_slow != k) {

K *= prop;

}

/** Add to the free virions floating on top of the cell: */const int rel_tick = time_tick - cell->infection_start_time - max_delay;

/* Elapsed time relative to end of delay. */

const float n_last = leq(K, min_R, rel_tick-1);

const float n_now = leq(K, min_R, rel_tick);

//printf("TYPE=%i, n_now=%f, n_last=%f, adding %f\n", k, n_now, n_last,

(float)(n_now - n_last));

cell->n_virions[k] += (float)(n_now - n_last); /* Adding the difference! */

}

}

152



int MYround(const double value) { // 89.7787

const int v = (int)value; // 89

if ( (value - v) > 0.5) {

return v + 1;

} else {return v;

}

}

int randint(const int min, const int max) {

return min + MYround( (max-min) * drand48() );

}

void debug(Cell** cells, const int i, const char label, float prev[][2]) {

int k;for (k=0; k<NUM_VIRUS_TYPES; k++) {

if (0 == (int)cells[i]->n_virions[k] && 0 != (int)prev[i][k]) {

printf("%c - CHANGE from non-zero to zero for cell %i, at k=%i\n",

label, i, k);

}

/*

if (i > 69) {

printf("%c - i=%i\n", label, i);

}

*/

// set current prevprev[i][k] = cells[i]->n_virions[k];

}

}

// Activate reporting of sum of virions

//#define DEBUG

#ifdef DEBUG

void sum_n_virions(Cell** cells, int n_cells, int time_tick, char label) {float n[NUM_VIRUS_TYPES];

int i, k;


n[k] = 0;

}



n[k] += cells[i]->n_virions[k];

}

153



}


printf("%i -- %c -- k=%i type has n=%f\n", time_tick, label, k, n[k]);

}

}

#endif

int binarize(const int val, const int n_bins, const int max) {

/*

const int bin = max / n_bins;

int b = 0;

do {

if (val < b) return b;

b += bin;

} while (val < max);

return max;*/

if (val < 1) return 0;



return 220;

}

#define LOG10_2 0.3010299956639812

/* Reuses the pixel array to paint the current state of dead cells and virion

load. */

void paint_frame(Cell** cells, const int n_cells, const int side, const int

time_tick, unsigned int* pixels, const bool BINARIZE) {

/*

* Cells are defined as an hexagonal grid within a square grid, like this:

* _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _

* | | | | | | |

* | | C | | C | | C |

* |_ _ _|_ _ _|_ _ _|_ _ _|_ _ _|_ _ _|

* | | | | | | |* | | 1 | 1 | | | |

* |_ _ _|_ _ _|_ _ _|_ _ _|_ _ _|_ _ _|

* | | | | | | |

* | C | 1 | C1 | | C | |

* |_ _ _|_ _ _|_ _ _|_ _ _|_ _ _|_ _ _|

* | | | | | | |

* | | | | | | |

* |_ _ _|_ _ _|_ _ _|_ _ _|_ _ _|_ _ _|

* | | | | | | |

154



* | | C | | C | | C |

* |_ _ _|_ _ _|_ _ _|_ _ _|_ _ _|_ _ _|

*

* A cell C1 owns its own pixel (where it paints black when dead)

* and the left, top-left and top pixels (where it paints the number

of free floating virions).*

*

* RGB:

*

* Green channel: competitor, virus_types[0]

Gradient of green 0, 0-200, 0

* Red channel: colonizer, virus_types[1],

Gradient of red 0-200, 0, 0

*

* Non-infected cell: White 255, 255, 255

* Infected cell with colonizer: Red 255, 0, 0* Infected cell with competitor: Green 0, 255, 0

* Doubly infected: Yellow 255, 255, 0

* Dead cell: Black 0, 0, 0

*

*

*/

int y, x, i;

int offset = 1;

const int width = side * 2;

const int height = width -1;

/* Ratio to scale n_virions to fit within 0-200 pixel intensity range: */

const float prop1 = 220.0f / virus_types[0]->K;

const float prop2 = 220.0f / virus_types[1]->K;

// writing in byte order: ARGB (as ImageJ expects them in "Import -> Raw...")

/* For every other row, starting at row 0: */

for (y=0; y<height; y+=2) {

/* For every other column, starting at column 0 or 1 (the offset): */

for (x=offset; x<width; x+=2) {

// The index in the cells array:i = (y / 2) * side + (x-offset)/2;

// The index in the pixels array where the cell state is painted:

const int i_pix = y * width + x;

// Now just read cells[i] and paint its state at pixel i_pix

if (! cells[i]->alive) pixels[i_pix] = 0xff000000; // dead cell

// Pure black

else if (NULL != cells[i]->virus_type) { // at least one virus

is infecting

unsigned short state = 0;

155



if (NULL != cells[i]->virus_type[0]) state += 1;

if (NULL != cells[i]->virus_type[1]) state += 2;

// same as += (1 << 1);

switch (state) {

case 1: // infected only by virus_type[0], the competitor

pixels[i_pix] = 0x0000ff00; // Pure greenbreak;

case 2: // infected only by virus_type[1], the colonizer

pixels[i_pix] = 0xffff0000; // Pure red

break;

case 3: // infected by both

pixels[i_pix] = 0xffffff00; // Pure yellow

break;

}

} else {

// not infected

pixels[i_pix] = 0xffffffff; // = 255 + (255<<8) + (255<<16)// Pure white

}

// Compute pixel intensity for number of free virions on top of

each cell

int pix_competitor = (int)(cells[i]->n_virions[0] * prop1 + 0.5f);

//if (pix_competitor > 220) pix_competitor = 220;

//else if (pix_competitor < 0) pix_competitor = 0;

// floating-point errors ...

int pix_colonizer = (int)(cells[i]->n_virions[1] * prop2 + 0.5f);//if (pix_colonizer > 220) pix_colonizer = 220;

//else if (pix_colonizer < 0) pix_colonizer = 0;

// floating-point errors ...

// exagerate color

if (BINARIZE) {

pix_competitor = binarize(pix_competitor, 3, 220);

pix_colonizer = binarize(pix_colonizer, 3, 220);

}

// Compound RGB value of free virions:

const unsigned int intensity = 0xff000000 + (pix_competitor << 8)

+ (pix_colonizer<<16); // red + green

// Now paint the virus density on the left, top and bottom pixels

if (x > 0) { // Paint left pixel

pixels[i_pix-1] = intensity;

/*

if (y > 0) { // Paint top-left pixel

156



pixels[i_pix - width - 1] = intensity;

}

*/

}

if (y > 0) { // Paint top pixel

pixels[i_pix - width] = intensity;}

if (y < height-1) { // Paint bottom pixel

pixels[i_pix + width] = intensity;

}

}

// flip: if 0, then 1. If 1, then 0. See drawing above to understand why.

offset ^= 1;

}

/* Write pixels to file: */

FILE* frame = fopen(concatenate(getZeroPaddedNumber(time_tick, 8), ".raw"),"w");

if (NULL == frame) {

printf("Saving frame image: could not open file for writing.");

return;

}

// write in one step

fwrite(pixels, width * height * sizeof(unsigned int), 1, frame);

/*

for (i=0; i<width*height; i++) {

fprintf(frame, "%c%c%c%c", ((pixels[i]&0xff000000)>>24),

((pixels[i]&0x00ff0000)>>16),((pixels[i]&0x0000ff00)>>8),

((pixels[i]&0x000000ff)));

}*/

fclose(frame);

}

int main(const int n_args, const char* argv[]) {

if (n_args < 14) {

printf("\nUsage: ./sim.o <n_start_competitor> <n_start_colonizer>

<grid side> <K1> <R1> <HL1> <infectivity_rate_1> <K2> <R2> <HL2>

<infectivity_rate_2> <prop_K> <binarize_color>\n\n");

printf("For example:\n./sim-sin.o 10 10 10 500 0.16 0.995 0.0001

500 0.13 0.995 0.0001 0.8 0\n\n");

return 0;

}

157



printf("OK reading %i args\n", n_args);

const int n_start_competitor = strtol(argv[1],NULL, 10);

const int n_start_colonizer = strtol(argv[2],NULL, 10);

const int side = strtol(argv[3],NULL, 10);const float K1 = (float)strtod(argv[4], NULL);

const float R1 = (float)strtod(argv[5], NULL);

const float HL1 = (float)strtod(argv[6], NULL); // half_life

const float IR1 = (float)strtod(argv[7], NULL);

const float K2 = (float)strtod(argv[8], NULL);

const float R2 = (float)strtod(argv[9], NULL);

const float HL2 = (float)strtod(argv[10], NULL); // half_life

const float IR2 = (float)strtod(argv[11], NULL);

const float PROP = (float)strtod(argv[12], NULL); /* The slow virus make

the fast virus emit virions slower. */

const bool BINARIZE = (1 == strtol(argv[13], NULL, 10)); /* Whether topaint n_virions in 3 bins 0-73, 74-146 and 1467-220, or in a continuous

palette 0-220. */

printf("Read args ...\n");

const int n_cells = side * side;

printf("Going to create %i cells...\n", n_cells);

Cell** cells = create_cells(side);

printf("Created %i cells.\n", n_cells);

/* Create the VirusType instances. */

initVirusTypes(K1, R1, HL1, IR1, K2, R2, HL2, IR2);

/* Seed with time */

int now = difftime(time(NULL), 0);

//printf("\nTime now: %i\n", now);

srand48(now);

printf("Initalized random seed with time %i\n", now);

int i, j, k;

/* Starting at time 1 and not 0, to avoid potential problems in hash

tables regarding NULL == 0. */

int time_tick = 1;

/* Use the initial viruses to directly infect random cells. */

printf("... infecting cells with competitor:");

158



for (i=0; i<n_start_competitor; i++) {

int ri = randint(0, n_cells-1);

printf(" %i", ri);

infect(cells[ri], /*competitor*/ 0, time_tick);

}

printf("\n... infecting cells with colonizer:");for (i=0; i<n_start_colonizer; i++) {

int ri = randint(0, n_cells-1);

printf(" %i", ri);

infect(cells[ri], /*colonizer*/ 1, time_tick);

}

printf("\n");

// DEBUG: observing the spread of one single virus

// infect(cells[12], 0, time_tick);

/* Pre-build an array of arrays of int to use as temporary placeholders

for the viruses to send to neighbors. */

//float send[n_cells][NUM_VIRUS_TYPES][6];

float*** send = static_cast< float*** >(malloc(sizeof(float***) * n_cells));


send[i] = static_cast< float** >(malloc(sizeof(float**)

* NUM_VIRUS_TYPES));


send[i][k] = static_cast< float* >(malloc(sizeof(float*) * 6));

for (j=0; j<6; j++) {send[i][k][j] = 0;

}

}

}

/* Reuse pixels array for each frame to paint. */

const unsigned int width = side*2;

const unsigned int height = side*2 -1;

printf("Frame width=%i, height=%i\n", width, height);

unsigned int* pixels = static_cast< unsigned int* >(malloc(sizeof(unsigned int)

* width * height));

/* Paint first frame. */

paint_frame(cells, n_cells, side, 1, pixels, BINARIZE);

//printf("Initialized ’send’ array.");

int n_dead_cells = 0;

float n_total_virions[NUM_VIRUS_TYPES]; /* Reset at each time tick. */

159



bool any_infected = false;

bool any_viruses = false;

/* Time tick 1 */

printf("Tic-Tac\tN-competitor\tN-colonizer\tdead\n1\t%i\t%i\t0\n",

n_start_competitor, n_start_colonizer);

/* Advance time ticks */

while (true) {

time_tick++;

/* Reset */

any_infected = false;

any_viruses = false;

/* First loop: inactivate virions. Must be done separately than

the move_viruses, otherwise it would bias the difussion simulationtowards movement to the left! */


inactivate_virions(cells[i]);

}

/* Second loop: compute and store number of viruses to move, and update

cell state. */


/* Store in the temporary array ’send’ the number of virions that

would be sent to each neighbor.* Later, when it’s done for all cells, the value of ’send’ will

cbe added to the cell’s n_virions[NUM_VIRUS_TYPES], and subtracted

from the sending cell’s n_virions. */

move_viruses(cells[i], send[i] /*, i, time_tick*/ ); /* Will

empty and refill temporary ’send’ array */

const unsigned char cell_state = attempt_to_infect(cells[i],

time_tick);

//printf("%i ", cell_state);

if (!any_infected) {switch (cell_state) {

case DEAD:

break;

case INFECTED:

any_infected = true;

break;

default:

break;

}

160



}

}

//printf("\n");

/* Third loop: send viruses that left the space over any cell to

the neighbor cell spaces. *//* This can be done now that all cells can be updated safely. */


send_viruses_to_neighbors(cells[i], send[i]);

}

/* Reset counters of virions */


n_total_virions[k] = 0;

}

/* Emit new viruses from each cell, if possible. And kill the cellwhen over time. */


if (cells[i]->alive) {

/* If the cell is infected: */

if (cells[i]->infection_start_time > 0) {

/* Check if it’s time for the cell to die: */

const bool killed = attempt_to_kill(cells[i], time_tick);

if (killed) {

n_dead_cells++;

} else {

/* Else, emit virions if beyond the delay time: */attempt_emit_virions(cells[i], time_tick, PROP);

}

}

}

/* Cells are also places in space, which contain free virions

in them: */

/* Count virions */


n_total_virions[k] += cells[i]->n_virions[k];

//printf("Counting: %i ", cells[i]->n_virions[k]);

}//printf("\n");

}

/* finish if possible */


if (n_total_virions[k] > 0.99) any_viruses = true;

}

/* Print data */

161



printf("%i\t", time_tick);


printf("%f\t", n_total_virions[k]);

}

printf("%i", n_dead_cells);

printf("\n");

if (0 == (time_tick-1) % 10) {

paint_frame(cells, n_cells, side, time_tick, pixels, BINARIZE);

}

if (n_dead_cells == n_cells || ( !any_viruses && !any_infected) ) {

// FINISH

printf("\nAny cells infected? %c ", (any_infected ? ’t’:’f’));

printf("\nAny virions floating? %c ", (any_viruses ? ’t’:’f’));

printf("\nDone at time tick %i.\n", time_tick);

break; /* Breaks the while(true) infinite loop */}

}

return 0;

}

162



11. Bibliografıa

HCV sequence database. http://hcv.lanl.gov/content/sequence/SNAP/SNAP.htmlAcharya, R., E. Fry, D. Stuart, G. Fox, D. Rowlands, and F. Brown. 1989. The three-dimensional structure of

foot-and-mouth disease virus at 2.9 A resolution. Nature 337:709-716.Agol, V. I. 2002. Picornavirus genetics: an overview, Pages 269-284 in B. L. Semler, and E. Wimmer, eds

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178



12. Artıculos publicados

179



Dynamics of Mutation and Recombination in aReplicating Population of Complementing,Defective Viral Genomes

Juan García-Arriaza, Samuel Ojosnegros, Mercedes DávilaEsteban Domingo⁎ and Cristina Escarmís

Centro de Biología Molecular‘‘“

Severo Ochoa’’”

(CSIC-UAM),Cantoblanco, E-28049 Madrid,Spain

In a previous study, we documented that serial passage of a biological clone

of foot-and-mouth disease virus (FMDV) at high multiplicity of infection(moi) in cell culture resulted in viral populations dominated by defectivegenomes that included internal in-frame deletions, affecting the L andcapsid-coding regions, and were infectious by complementation. In thepresent study, analyses of the defective genomes present in individual viralplaques, and of consensus nucleotide sequences determined for the entiregenomes of sequential samples, have revealed a continuous dynamics of mutation and recombination. At some points of high genetic instability,multiple minority genomes with different internal deletions co-existed in thepopulation. At later passages, a new defective RNA arose and displaced arelated, previously dominant RNA. Nucleotide sequences of the differentgenomic forms found in sequential isolates have revealed an accumulationof mutations at an average rate of 0.12 substitutions pergenome per passage.At the regions around the deletion sites, substantial, minor or no nucleotide

sequence identity is found, suggesting relaxed sequence requirements forthe occurrence of internal deletions. Competition experiments indicate aselective advantage of late phase defective genomes over their precursorforms. The defective genome-based FMDV retained an expansion of host celltropism, undergone by the standard virus at a previous stage of the sameevolutionary lineage. Thus, despite a complex dynamics of mutation andrecombination, and phases of high genetic instability, a biologically relevantphenotypic trait was stably maintained after the evolutionary transitiontowards a primitive genome segmentation. The results extend the concept of a complex spectrum of mutant genomes to a complex spectrum of defectivegenomes in some evolutionary transitions of RNA viruses.

© 2006 Elsevier Ltd. All rights reserved.

* Corresponding author

Keywords: genome segmentation; defective genomes; virus evolution;

recombination cross-over sites; foot-and-mouth disease virus

Introduction

Passage of biological clone C-S8c1 of foot-and-mouth disease virus (FMDV) in serial cytolyticinfections of BHK-21 cells at high multiplicity of

infection (moi) resulted in an unusual evolutionarytransition towards a population dominated bydefective genomes that were infectious by comple-mentation.1 The transition occurred gradually andits first manifestation was the identification atpassage 143 of two FMDV RNAs with internaldeletions of 402 and 417 nucleotides (Δ402 andΔ417 RNAs, respectively), affecting the L protease.2

These RNAs co-existed and replicated with wild-

type, standard (st) FMDV RNA (Figure 1), and didnot interfere with st virus replication.2 Then, atpassage 260 the population was dominated byΔ417

A h h Δ d Δ A h

Abbreviations used: FMDV, foot-and-mouth disease

virus; moi, multiplicity of infection; st, standard; NJ,neighbor-joining; CHO, Chinese hamster ovary; pfu,plaque-forming unit(s).

E-mail address of the corresponding author:

doi:10.1016/j.jmb.2006.05.027 J. Mol. Biol. (2006) 360, 558–572

http://dx.doi.org/10.1016/j.jmb.2006.05.027

http://dx.doi.org/10.1016/j.jmb.2006.05.027



RNA t th ith Δ999 d Δ1017 RNA hg

d i @ b

deletions affected the capsid-coding region. All thedeletions identified maintained the open readingframe of the viral genome, encoding a shortenedversion of the polyprotein. Δ417 and Δ999 RNAswere infectious by complementation in the absenceof st FMDV RNA, as shown by: (i) ‘‘two-hit’’ kineticsfor cell killing; (ii) the presence of defective genomes,and undetectable st RNA, within individual, isolatedviral plaquesformed on cell monolayers; and (iii) cell

killing achieved after co-electroporation of cells withΔ417 and Δ999 RNAs synthesized in vitro, but notafter electroporation with a single ΔRNA. Further-

f h f ΔRNA d

the number of viral particles indicated that eachΔRNA was packaged into a single viral particle of standard size.1

The population at passage 260 interfered withreplication of the cognate st virus.3 Such interfer-ence could contribute to the selective advantage of complementing, defective genomes over st RNA.The evolution of FMDV towards populations of defective genomes can be regarded as an initial

evolutionary step towards genome segmentation.Although deleted forms of viral RNA genomes capa- ble of complementation have been engineered,4–6

h FMDV i i d d f i

Figure 1. FMDV genome and position of internal deletions identified upon passage of biological clone C-S8c1 in BHK-21 cells. (a) The FMDV genome with indication of the regulatory regions (5′ UTR, 3′ UTR) and coding region (L, P1, P2,P3). Individual proteins are depicted as boxes. VPg is the protein (3B) covalently linked to the 5′ end of the RNA; poly(C)is the internal polycytidylate tract, and poly(A) the 3′ terminal polyadenylate; the two in-frame AUG codons that initiatethe two forms of L (Lab, Lb) are indicated. Below the genome, the position of the deletions found in several defectivegenomes is indicated; the number following Δ indicates the size of the deletion in nucleotides, determined by nucleotidesequencing. Colored rectangles depict deletions found in consensus sequences of several populations, as described inTable 1. Black rectangles depict deletions found in the analysis of individual plaques, obtained by plating populations C-S8p219 and C-S8p225. Below, the thin horizontal lines describe the RT-PCR amplifications covering the entire FMDVgenome, used to map the different deletions. (b) Scheme of the serial passages of clone C-S8c1 and genomes identifie d indifferent populations. The genome composition of C-S8c1, C-S8p143, C-S8p260, and C-S8p260p3d was described; 1 allother populations and clones are described here for the first time. Biological clones are depicted as filled squares andpopulations as open circles; large grey arrows indicate high moi passages; thin arrows indicate low moi passages; thenumber following p indicates passage number; st, standard FMDV genome. The position of the deletion is shown as acolored portion in the scheme of the genome; the parenthesis in theΔ999 genome indicates its low proportion in C-S8p360

(compare with Table 1). Populations identified as p3d and p5d correspond to those derived by three or five low moi(dilute) passages, which resulted in loss of ΔRNAs, and with st as the sole genome detected. At the bottom left, deletionscharacterized in a clonal (individual plaque) analysis of populations C-S8p219 and C-S8p225 are indicated. Procedures aredescribed in Materials and Methods.

559Mutation and Recombination in Defective Virus

mailto:[email protected]

mailto:[email protected]



t f th t f ΔRNA d th FMDV t iti t d d f ti

occurred in the course of replication within a hostcell, without external intervention. Furthermore,low moi passage of the complementing defectiveforms resulted in rapid dominance of st virus, withno detectable defective genomes in the population.1

Thus, this FMDV system allows comparison of anevolved segmented population with its unsegment-ed counterpart, thus providing an experimentalapproach to investigate in a controlled fashion, theadvantages of segmentation (a primitive form of sex) in a genetic system. This is a fundamentalquestion, extensively addressed in evolutionary andtheoretical biology.7–10

A prerequisite for genetic studies is a detailedmolecular characterization of the system, includingthe molecular basis of the evolutionary transitiontowards deleted sub-genomic FMDV RNAs. Here,we have pursued serial high moi infections of C-

S8p260 up to passage 460, and have compared theclonal composition in defective genomes of thepopulations at passage 219, 225 and 260 (Figure 1).These analyses have revealed points of high geneticinstability, and a continuous dynamics of mutationand recombination. Nucleotide sequences aroundthe deletion sites suggest relaxed sequence con-straints for internal deletions to occur, probablylimited by functional constraints to ensure efficientcomplementation between ΔRNAs. Evolution of infectivity titers, viral RNA levels, and analysis of mixtures of populations from different passagessubjected to growth-competition experiments, indi-cate an increasing selective advantage of latedefective genomes over preceding forms. An expan-sion of host cell tropism acquired when theevolutionary lineage was dominated by st viruswas maintained after the transition towards genomesegmentation.

Results

Evolution through multiple FMDV genomes withinternal deletions

To study the evolution of the defective FMDV

system, FMDV C-S8p260, a population dominated by defective RNAs (Δ417, Δ999 and Δ1017),1 wassubjected to 200 additional high moi passages(Figure 1). The genomic composition was exam-ined from passage 199 to passage 460, using eightdifferent RT-PCR reactions to sample the L andcapsid-coding regions. The results (Table 1) showthat Δ417 RNA was present at all passagesexamined, and that Δ999 RNA was first detectedat passage 209, and rapidly became dominant. Incontrast, at late passages, Δ999 RNA was dis-placed very slowly, over at least a 109 passageinterval, by Δ951 RNA, which included an in-frame deletion spanning residues 2038 to 2988,

affecting the VP2 and VP3-coding region (residuenumbering as by Escarmís et al.11). None of the RT-PCR amplifications with RNA from passage 260 to

d d f ll l h A (l h

one st genome per 104 ΔRNA molecules1). Thus, adefective genome-based FMDV replication systemwas maintained with no detectable st RNA at leastup to passage 460, with the constant presence of Δ417 RNA and a dynamics of change of otherΔRNAs.

Highly heterogeneous populations of defectivegenomes: evidence of evolutionary instability

A previous analysis of the genomes present inindividual viral plaques derived from C-S8p260showed that the virus in 61 out of 62 plaquesanalyzed contained Δ417 RNA and either Δ999 orΔ1017 RNA, and no detectable st RNA (one plaquecontained only standard RNA).1 The clonal compo-sition found is in agreement with the genomecomposition determined for the average (uncloned)

C-S8p260 population, and no other deletions wereidentified using the standard set of amplificationreactions (Figure 1(a) and Table 1). To test whether asimilar level of homogeneity with regard to internaldeletions occurred prior to the dominance of Δ417,Δ999 and Δ1017 RNAs, we analyzed the genomecomposition in virus from individual plaques of populations C-S8p219 and C-S8p225. Contrary tothe results with C-S8p260, the genomic compositionof virus from four out of ten plaques from C-S8p219,and from three out of ten plaques from C-S8p225differed from the average composition of thecorresponding parental populations. This differencein heterogeneity between C-S8p260 and C-S8p219 orC-S8p225 is statistically significant ( p <0.001, χ2

test). The results (Table 2 and Figure 1) revealedseven additional types of internal, in-frame dele-tions located between genomic residues 1813 (at theVP4-coding region) and 3658 (at the VP1-codingregion), and the presence of Δ417 RNA in virus fromeach of the plaques analyzed. Thus, during somepassages in evolution towards segmentation, theFMDV system showed extreme evolutionary instability with swarms of genomes with deletions thatnever attained dominance at least up to passage 460(compare Tables 1 and 2).

Continuous dynamics of mutation andrecombination

To investigate the molecular basis of defectivegenome evolution, entire genomic nucleotidesequences for the major ΔRNAs were determinedat passages 260, 360 and 460 using sets of oligonu-cleotide primers whose amplification productscovered the complete genome and discriminatedamong different sub-genomic forms (Materials andMethods). In addition, virus with st genome wasrescued by three to five low moi passages of populations C-S8p260, C-S8p360 and C-S8p460,yielding populations C-S8p260p3d, C-S8p360p5d,

and C-S8p460p5d, respectively (Figure 1(b)). Thesepopulations contained st RNA and no detectableΔRNAs (see the legend to Table 1); the entire st RNA

l d l d d h

560 Mutation and Recombination in Defective Virus



460 d t t d f ll l th t FMDV RNA (l th l tid l d t i d Th

alignment of nucleotide sequences (Figure 2) indi-cates a sequential accumulation of mutations rela-tive to the parental C-S8c1 RNA, and multiple pointsof heterogeneity (two nucleotides at the sameposition). The average rate of accumulation of mutations derived from comparing st RNAsequences was of 0.13 mutation per genome perpassage, and for the ΔRNAs the value was 0.05–0.11

mutation per genome per passage. The average ratioof transition to transversion mutations was verysimilar for st RNA (4.2±1.2) than for ΔRNAs (4.2 ±1.5) (Table 3). Mutations were unevenly distributed,with a twofold lower frequency in the 3B, 3C and3D-coding regions than in the rest of the genome( p <0.005; χ2 test). (A more complete description of the mutations, their distribution along the genomes,

Table 1. Genomic deletions detected by RT-PCR amplification of RNA from viral populations derived from C-S8p199upon passage athigh moi in BHK-21 cells

a Different RT-PCR amplification reactions used to map internal deletions in the FMDV C-S8c1 lineage;1 the regions amplified aredepicted in Figure 1(a).b Each column includes the types of genomes identified in the corresponding population given at the top, determined using the amQ

plification reactions indicated in the first column, and confirmed by nucleotide sequencing (Figure 2). A parenthesis means that a verysmall amount of the PCR product was produced in the amplification reaction. Color code corresponds to that depicted in Figures 1 to 5.No Δ indicates the absence of a genomic deletion. No st means undetectable st FMDV RNA. NA indicates absence of amplification,and ND, not done. As controls, none of the amplifications detected any ΔRNA when C-S8p260p3d, C-S8p360p5d and C-S8p460p5d(origin of these genomes given in Figure 1(b)) RNAs were used as template. Procedures are detailed in Materials and Methods.c Virus from one individual plaque, isolated from C-S8p225 contained st RNA in addition toΔRNAs (see Table 2). Occasionally, analyQ

sis of RNA from C-S8p220 to C-S8p228 detected st RNA.

Table 2. Genomic deletions detected by RT-PCR amplification of RNA from virus in individual plaques of populationsC-S8p219 and C-S8p225

a Amplification procedures are as for Table 1.b Designation of the deletions and symbols are as for Table 1. Individual plaques from C-S8p219 and C-S8p225 are numbered.

Deletions not detected in the consensus population (see Table 1) and identified only in individual plaques are depicted in bold.c Plaques number 4 and 6 from C-S8p219 have one additional deletion. They were confirmed by RT-PCRs 21 and 29 (in plaque 4),

and 21 and 17 (in plaque 6). These deletions were not sequenced due to technical problems.d RT-PCR amplification designed with one primer located inside Δ519 or Δ885 RNAs did not amplify these new defective genomes




RT PCR amplification designed with one primer located inside Δ519 or Δ885 RNAs did not amplify these new defective genomes.

and resulting amino acid replacements will bepresented elsewhere.)

A comparison of each nucleotide sequence withthat of the parental C-S8c1 genome shows mutationfrequencies of 9.8×10-4 to 7.1 ×10-3 substitutions pernucleotide, the latter attained with C-S8p460p5d;these values correspond to eight and up to 58mutations per genome (Table 3). Counting repeatedmutations only once (and excluding as mutationsthose nucleotides in mixtures whose proportion

was lower than 50%), transitions amounted to 80%of all mutations, A→G being the most representedmutation type (32% of all transitions, and 26% of allmutations); transversion U→G was not repre-sented. The average dn/ds ratio for the entiregenome, calculated relative to the C-S8c1 RNAsequence was in the range of 0.5 to 1.5 (Table 3); apairwise comparison of all genomic nucleotidesequences with respect to C-S8c1 RNA gives anaverage dn/ds =1.0±0.4. Prior to the dominance of ΔRNAs there were a total of 12 reversions, and infour of them the initial nucleotide was regained at alater passage. Because of quasi-species dynamics, itis not possible to know whether they are true

reversions or apparent reversions resulting fromalternate dominance of genome sub-populations.Interestingly, eight out of the 12 reversions ob-

d d b 100 d 143

resulting in an transient decrease in the accumula-tion of mutations (Figure 3); these were thepassages in which two ΔRNAs affecting the Lprotease were found (compare Figures 1(b) and 3).

A phylogenetic analysis of entire genomes usingneighbor-joining (NJ), confirmed the relationshipssuggested by the sequence alignment, and thegradual increase in genetic distance of the differentΔRNAs and their st derivatives, with 45% of the branching points being supported by significant

bootstrap values (>75%) (Figure 4(a)). Only minoralterations were seen in the trees when consideringor not as mutations nucleotides present in a 50%mixture at any given position (indicated in Figure 2and Table 3), or when the trees included orexcluded the regions corresponding to the deletionin the ΔRNAs. When the 5′-region and the rest of the genome were analyzed separately, the trees(Figure 4(b) and (c)) suggested a region for thelocation of a recombination cross -over point thatcould lead to the generation of C-S8p260p3d, C-S8p360p5d and C-S8p460p5d. The 5′ region of C-S8p260p3d, C-S8p360p5d and C-S8p460p5dgrouped with C-S8p260Δ999, C-S8p360Δ951 and

C-S8p460Δ951, respectively. The rest of the genomeof C-S8p260p3d, C-S8p360p5d and C-S8p460p5dgrouped with C-S8p260Δ417, C-S8p360Δ417 andC S8 460Δ417 i l ( h bi

Figure 2. Location of mutations in st and Δ FMDV genomes, observed upon passage of FMDV C-S8c1 in BHK-21cells. The scheme of the FMDV genome, and position of the deletions in the different ΔRNAs are as for Figure 1(a). Theorigin of the different RNA populations analyzed (identified on the right of each genome depicted as a horizontal line) isdescribed in the legend to Figure 1(b). Mutations are represented by vertical lines on the genome; in red are the positionsthat show a mixture of about equal amounts of two nucleotides, due to genetic heterogeneity in the genome population(see Materials and Methods). The incomplete horizontal line for C-S8p260 Δ1017 indicates that only a partial nucleotidesequence was determined. For residues 1 to 367 (preceding the poly(C) tract) sequences for the differentΔRNAs could not

be distinguished (see Materials and Methods). The vertical dotted lines linking two ΔRNAs delimit putativerecombination cross-over sites when st RNA was rescued by low moi passage (1629 to 1809 in C-S8p260, and 1624 to

1627 in C-S8p360 and C-S8p460). A summary of the types of mutations found is given in Table 3. Procedures are describedin Materials and Methods.




d d b t 100 d 143 C S8 460Δ417 ti l ( th bi

nation cross-over points proposed on the basis of the sequence alignments (Figure 2) with thegroupings derived from the NJ trees (Figure 4(b)and (c))).

Recombination to rescue st RNA

The nucleotide sequence alignments (Figure 2),supported by the phylogenetic analyses (Figure 4),suggest that the st genomes rescued by low moipassage of C-S8p260, C-S8p360 and C-S8p460(Figure 1(b)) are the result of recombination betweenthe dominant defective genomes in the respectivepopulations. A possible alternative is that st RNApre-existed in the populations at low levels (as amemory of the genomes that dominated thepopulation before the appearance of ΔRNAs12),and that it rose to dominance during infections at

low moi because of suppression of infectivity of the bipartite defective system, without the involvementof recombination. This alternative is renderedunlikely by the phylogenetic relationship of each stRNA with the defective genomes of equivalentpassage number (Figure 4(b) and (c)), and theincompatibility of the nucleotide sequences of therescued st RNAs with the sequences of the st RNApresent at earlier evolutionary phases of the samelineage. Additional evidence that defective genomescan readily recombine to produce st genome camefrom an analysis of the progeny of co-electropora-tion of BHK-21 cells by Δ417 RNA and Δ999 RNA,produced independently by transcription of twoseparate plasmids.1 In the initial progeny of the co-electroporation only Δ417 RNA and Δ999 RNAwere detected. However, upon further low moiinfection, st RNA with a constellation of mutationsthat identified it as a mosaic of Δ417 RNA and Δ999RNA was present (sequencing results not shown,and the experiment described by García-Arriaza etal.1). Also, dilute passage of virus from individualplaques, which contained ΔRNAs and undetectablest RNA, yielded st RNA (data not shown). Thus,several independent observations support the viewthat st RNA was generated by recombination of ΔRNAs.

Nucleotide sequence at the deletion sites:evidence of promiscuous recombination

Since genomes with internal deletions are derivedfrom biological clone C-S8c1, containing a single stgenome (Figure 1(b)), intramolecular or intermolec-ular recombination events must have generated theΔRNAs as progeny of C-S8c1 RNA. To gain insightinto the molecular mechanisms that generatedΔRNAs, the nucleotide sequences around thedeletion site of the 12 ΔRNAs characterized inuncloned populations and in individual biologicalclones were compared (Figure 5). Continuous or

interrupted nucleotide sequence identities of four to18 nucleotides occurred in seven out of the 12deletions analyzed. In one case (Δ999 RNA) thef l d d b l d

a b l e

3 . T y p e o f m u t a t i o n s p r e s e n t i n F M D V p

o p u l a t i o n s p a s s a g e d a t h i g h m o i i n B

H K - 2 1 c e l l s

C - S 8 p 5 0

C - S 8 p 1 0 0

C - S 8 p 1 4 3

C - S 8 p 2 0 0

C - S 8 p 2 6 0

C - S 8 p 2 6 0 p 3 d

C - S 8 p 3 6 0

C - S 8 p 3 6 0 p 5 d

C - S 8 p 4 6 0

C - S 8 p 4 6 0 p 5 d

Δ 4 1 7

Δ 9 9 9

Δ 1 0 1 7

Δ 4 1 7

Δ 9 5 1

Δ 4 1 7

Δ 9 5 1

M u t a t i o n f r

e q u e n c y a

9 . 8 × 1 0 − 4

2 . 3 × 1 0 − 3

1 . 8 × 1

0 − 3

2 . 4 × 1 0 − 3

3 . 2 × 1 0 − 3

3 . 0 × 1 0 − 3

6 . 6 × 1 0 − 3

3 . 9 × 1 0 − 3

5 . 5 × 1 0 − 3

4 . 6 ×

1 0 − 3

5 . 4 × 1 0 − 3

5 . 7 × 1 0 − 3

5 . 1 × 1 0 − 3

7 . 1 × 1 0 − 3

M u t a t i o n

f r e q u e n c y /

p a s s a g e

1 . 9 × 1 0 − 5

2 . 3 × 1 0 − 5

1 . 2 × 1

0 − 5

1 . 2 × 1 0 − 5

1 . 2 × 1 0 − 5

1 . 1 × 1 0 − 5

2 . 5 × 1 0 − 5

1 . 4 × 1 0 − 5

1 . 5 × 1 0 − 5

1 . 2 ×

1 0 − 5

1 . 4 × 1 0 − 5

1 . 2 × 1 0 − 5

1 . 1 × 1 0 − 5

1 . 5 × 1 0 − 5

u m b e r o f

m u t a t i o n s

b

8 . ( 1 )

1 9 .

1 5 . ( 2 )

2 0 . ( 4 )

2 5 . ( 3 )

2 2 . ( 2 )

1 4 .

3 2 .

4 3 . ( 1 7 )

3 3 . ( 2 )

4 4 . ( 1 4 )

4 4 . ( 8 )

3 7 . ( 1 )

5 8 .

r a n s i t i o n s c

6 . ( 7 5 % )

1 6 . ( 8 4 % )

1 2 . ( 8 0 % )

1 7 . ( 8 5 % )

2 2 . ( 8 8 % )

1 8 . ( 8 2 % )

1 0 . ( 7 1 % )

2 7 . ( 8 4 % )

3 3 . ( 7 7 % )

2 6 . ( 7 9 % )

3 1 . ( 7 0 % )

3 6 . ( 8 2 % )

2 9 . ( 7 8 % )

4 7 . ( 8 1 % )

r a n s v e r s i o

n s c

2 . ( 2 5 % )

3 . ( 1 6 % )

3 . ( 2 0 % )

3 . ( 1 5 % )

3 . ( 1 2 % )

4 . ( 1 8 % )

4 . ( 2 9 % )

5 . ( 1 6 % )

1 0 . ( 2 3 % )

7 . ( 2 1 % )

1 3 . ( 3 0 % )

8 . ( 1 8 % )

8 . ( 2 2 % )

1 1 . ( 1 9 % )

y n o n y m o u

s c

1 . ( 1 7 % )

5 . ( 3 3 % )

2 . ( 1 8 % )

3 . ( 1 9 % )

5 . ( 2 5 % )

3 . ( 1 8 % )

2 . ( 1 7 % )

9 . ( 3 5 % )

1 0 . ( 3 0 % )

5 . ( 1 9 % )

1 2 . ( 3 2 % )

1 0 . ( 3 0 % )

6 . ( 2 1 % )

1 7 . ( 3 5 % )

o n - s y n o n y m o u s c

5 . ( 8 3 % )

1 0 . ( 6 7 % )

9 . ( 8 2 % )

1 3 . ( 8 1 % )

1 5 . ( 7 5 % )

1 4 . ( 8 2 % )

1 0 . ( 8 3 % )

1 7 . ( 6 5 % )

2 4 . ( 7 0 % )

2 2 . ( 8 1 % )

2 6 . ( 6 8 % )

2 4 . ( 7 0 % )

2 3 . ( 7 9 % )

3 1 . ( 6 5 % )

n / d s

d

1 . 5

0 . 6

1 . 3

1 . 3

0 . 9

1 . 4

N D

0 . 6

0 . 7

1 . 3

0 . 6

0 . 7

1 . 1

0 . 5

e s u l t s a r e

b a s e d o n c o m p l e t e n u c l e o t i d e s e q u e n c e s , e x c e p t f o r Δ 1 0 1 7 R N A f o r w h i c h o n l y r e s i d u e s 1 – 3 6 7 a n d 1 0 3 1 – 3 7 9 7 w e r e s e q u e n c e d . T h e o r i g i n o f t h e v i r a l p o p u l a t i o n s i s d e s c r i b e d i n M a t e r i a l s

n d M e t h o d s a n d t h e l e g e n d t o F i g u r e 1 ( b ) , a n d t h e d

i s t r i b u t i o n o f m u t a t i o n s a l o n g t h e g e n o m e

s i s d e p i c t e d i n F i g u r e 2 . A l l m u t a t i o n s a r e c o u n t e d r e l a t i v e t o t h e p a r e n t a l F M D V C

- S 8 c 1 .

a

M u t a t i o n f r e q u e n c y i s c a l c u l a t e d b y d i v i d i n g t h e

n u m b e r o f d i f f e r e n t m u t a t i o n s f o u n d b y t h

e t o t a l n u m b e r o f n u c l e o t i d e s s e q u e n c e d .

b

T o t a l n u m b e r o f m u t a t i o n s r e l a t i v e t o C - S 8 c 1 R N A

. W h e n a m i x t u r e o f n u c l e o t i d e s i s p r e s e n t a

t a g i v e n p o s i t i o n , t h e m i x t u r e i s c o u n t e d a s m u t a t i o n w h e n t h e m u t a t e d n u c l e o t i d e a m

o u n t s a t l e a s t t o

0 % o f t h e t o t a l ; t h e i r n u m b e r i s g i v e n i n p a r e n t h e s i s .

c

T h e p r o

p o r t i o n o f t h e d i f f e r e n t t y p e s o f m u t a t i o n s i s g i v e n i n p a r e n t h e s i s .

d

R a t i o o

f n o n - s y n o n y m o u s m u t a t i o n s p e r n o n - s y n o n y m o u s s i t e t o s y n o n y m o u s m u t a t i o n s p e r s y n o n y m o u s s i t e , c a l c u l a t e d a s d e s c r i b e d i n M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . N D , n o t d o n e .




f l tid id tit b t l tid tTa

MM N u r r y

N o n e n 0

the 5′ side and the 3′ side of the deleted part, and inanother case (Δ744-3′ RNA) the four nucleotideidentity is found outside of the deleted part. Todetermine the frequency with which the sequencesrepeated at the deletion boundaries are found in theFMDV genome, the different sequences weresearched for in the FMDV C-S8p100 and C-S8p200RNA sequences. The search revealed that the twosequences flanking Δ951 and one of the twosequences that flank Δ417 and Δ645 were notrepresented in the entire C-S8p100 or C-S8p200RNAs. All other sequences were found once and upto 44 times; in particular, the tetra- and pentanucleo-tides (either interrupted or not interrupted), wererepresented from 15 to 44 times. Furthermore, thesites around the deletions in RNAs Δ744-5′, Δ885,and Δ603 did not show continuous or interruptedrepetitions of more than three nucleotides. Theresults suggest that there are no stringent require-ments at the nucleotide sequence level for therecombination events leading toΔRNAs.

Complexity of the evolutionary pattern, andincreased replicative capacity of the FMDVdefective genome system

The different complexity inΔRNA composition atdifferent passages (Figure 1(b) and Table 1), therapid increase of Δ999 in only three passages (Table1), and the much slower displacement of Δ999 byΔ951 at later passages (Table 1) suggested a com-plex, irregular dynamics of competition involvingmultiple ΔRNA species. To investigate populationdynamics between passages 260 and 460, virustiters, and total amount of viral RNA released from

cells were examined (Figure 6). Neither viral titersnor total viral RNA molecules increased linearlywith time, with maximum values detected at

( ( ))

These results prompted us to examine whether a basic observation of viral population dynamics, thatis that large population passages result in fitnessgain,13,14 applied also to the ΔRNA FMDV lineage.However, standard fitness determinations to obtainrelative fitness values are complicated in a comple-menting defective genome system due to a bias inrelative progeny production when a differentparticle to cell ratio is attained by the twocompetitors.3 For this reason, we carried out aqualitative direct experiment of competing equalamounts of C-S8p260 and either C-S8p360 or C-S8p460 for four passages, without interveningdilution of the virus. In both competition series thefate of the competing ΔRNAs was followed byestimating the proportion of nucleotides at posi-tions 1091 (G for Δ999 of C-S8p260 and U for Δ951of C-S8p360 and C-S8p460), 1105 (C, U, U,respectively) and 1180 (U, C, C, respectively). Theresults (Figure 6(b)) show a selective advantage of the population at passage 460 over that at passage

260, and of the population at passage 360 over thatat passage 260. Thus, the tenet of quasi-speciesdynamics, that is, increased replicative capacitywith large population passages,13,14 is maintainedin the complementing, defective RNA, FMDVsystem.

An expansion of host cell tropism is maintainedin the defective FMDV genome system

Passage of FMDV C-S8c1 at high moi resultedin an expansion of host cell tropism that includedacquisition of capacity of the virus to replicate inChinese hamster ovary (CHO) cells and in a

number of primate and human cell lines that werehighly restrictive for the parental C-S8c1.15–17 Totest whether the FMDV populations dominatedb d f d h d d

Figure 3. Normalized accumulated number of mutations relative to the C-S8c1 RNA sequence as a function of passage number. Data are from Table 3. The different populations analyzed and the mutations included are those depictedin Figure 2. Deletions are not considered. The black line indicates mutations in the st genome (p3d at passage 260, and p5d

at passages 360 and 460; compare with Figure 1(b)); mutations in Δ417 (■), Δ951 (●), and Δ999 (▴) are also indicated.Positions at which a mixture of nucleotides was documented (see Figure 2 and Material and Methods) are counted asmutation when the nucleotide that differs from that in C-S8c1 RNA amounts to 50% (or higher) in the mixture. Proceduresare described in Materials and Methods.




360 (Fi 6( )) b d f ti i t i d th d d

cell tropism, the capacity of populations C-S8p260, C-S8p360, C-S8p460 and of their stgenome derivatives to infect CHO and Jurkat(human lymphoid) cells was tested. The progeny

genomes were titrated and analyzed by RT-PCRamplification (Table 4). In both CHO and Jurkatcells, all viruses showed a progeny production

bl MARLS ( i f FMDV

showing the expanded host cell tropism17) and103 to 105 times higher than C-S8c1. In all cases,the genomic composition of the infecting viruswas conserved in the progeny (Table 4). We

conclude that an expanded host cell tropism,that was acquired upon passage of C-S8c1 inBHK-21 cells at a stage in which the population

d i d b FMDV i h

Figure 4. Phylogenetic relationships among st and ΔRNAs in the evolutionary lineage of FMDV C-S8c1 provideevidence of generation of st RNA through recombination. The origin of the genomes analyzed is depicted in Figure 1(b).Each tree has been derived by the neighbor-joining (NJ) method, and the significance of each node estimated by bootstrapre-sampling (1000 replicas).58 Numbers at the nodes represent the bootstrap re-sampling values. Trees exclude the regionsdeleted in ΔRNAs. Positions at which a mixture of nucleotides was documented (see Figure 2, Table 3 and Materials andMethods) are counted as mutation in the derivation of the tree when the nucleotide that differs from that in C-S8c1amounts to 50% (or higher) of the mixture. (a) NJ tree of the entire genomic sequences. (b) NJ trees of the 5′ region of thegenome (residues 1 to 1623 or 1 to 1628). (c) NJ trees of the remaining genomic residues (1624 to 8115 or 1629 to 8115; C-S8c1 RNA residue numbering11). Groupings of st andΔRNAs are indicated by boxes. Procedures are detailed in Materialsand Methods.




bl t MARLS ( t ti f FMDV d i t d b FMDV ith t

maintained following evolution of FMDV towardsdefective genomic forms.

Discussion

An unusual and complex defective RNA system

Most commonly, the defective viral genomes that

arise during virus replication require a helper, st virusfor continued maintenance as a replicative entity.18–23

Unexpectedly, the defective FMDV system achievedautonomous replication without participation of stFMDV genomes. The typical mutant spectrum of a stgenome quasi-species was extended to defectivegenomes, each including an internal deletion affectingfrom 402 up to 1017 residues at the L and capsid-coding regions (representing 4.9% to 12.5%, respec-tively, of the FMDV C-S8c1 genome, excludinghomopolymeric tracts).1 Here, we have compared thegenome composition, infectivity, and RNA levels of sequential populations dominated by defective gen-omes (ΔRNAs), as well as the entire nucleotide

sequences of nine genomes, including ΔRNAs, andtheir st RNA derivatives. The analyses have identifieddiscontinuities in the evolutionary process, as revealedb l f d l A

levels, despite an overall increase of replicativecapacity as the infection proceeds (Figure 6).

At the intermediate passages 219 and 225, but notat passage 260, the population consisted of aheterogeneous array of genomes harboring differentinternal deletions in the capsid-coding region, andeach of them invariably coexisted with Δ417 RNA(Figures 1, 5 and Table 2). At late passages, a newΔ951 RNA, that was not represented among the

ΔRNAs characterized in previous passages, gradu-ally displaced Δ999 and Δ1017 from the population(Table 1). Thus, the defective genome-dominatedFMDV population replicating in the relativelyconstant biological environment of a clonal BHK-21 population in culture, is highly dynamic regard-ing the generation of deleted forms, and competitionamong them. The complex mutant spectra of different but related (in location and length) dele-tions extend to defective genomes what is wellestablished as spectra of point mutations in st RNAof FMDV populations in cell culture and in vivo.24,25

Exuberant recombination

Since the evolutionary lineage in which ΔRNAswere generated was initiated by a single C-S8c1

26 ( (b)) Δ A h b

Figure 5. Nucleotide sequences flanking the deletion sites of FMDV ΔRNAs show no obvious requirement for theoccurrence of deletions. The location of the different deletions, and their identification during the evolution of FMDV C-S8c1 are summarized in Figure 1, Table 1 and Table 2. Deletions are indicated by boxes. Nucleotide sequences around thedeletion sites are shown with capital letters where nucleotide sequence identity around the cross-over points has beenidentified; identical nucleotides are indicated in red, that are interrupted sometimes by heterologous nuc leotides whichare depicted in blue; in the sequences, the deleted regions are bracketed; genomic residues are numbered.11 (a) Deletions

that belong to consensus genomes that were dominant in some of the populations analyzed. (b) Deletions found in theclones from passages 219 (first column) and 225 (second column). ForΔ402,Δ540,Δ603 andΔ1017 two alternative 5′ and3′ deletion sites are compatible with the sequence data. Procedures are described in Materials and Methods.




b li i i i f ti it d i l RNA 26 (Fi 1(b)) ΔRNA t h i b

intramolecular or intermolecular recombinationevents inside the infected cells. Several types of

recombination have been distinguished in RNAviruses: homologous, non-homologous, replicativeand non-replicative.27 Comparison of nucleotidesequences around the deletion sites did not revealany obvious shared requirement for recombinationto occur. Also, prediction of the energetically mostfavorable secondary structures in Δ402, Δ417,Δ519,and Δ540 RNAs using M-fold,28 did not reveal anyobvious local secondary structures (data not shown)that in other systems have been associated withrecombination.29,30 Therefore, the molecular analy-ses did not allow a distinction among a number of alternative mechanisms to generate ΔRNAs.27 Infact, we cannot exclude that different ΔRNAs were

generated by different mechanisms (ΔRNAs whichshow significant nucleotide sequence identityaround the cross-over points (Figure 5) may haveb d d b h l bi i

involving polymerase switching from a templatesite to another site either of the same template

molecule (intramolecular switching) or of a diff erenttemplate molecule (intermolecular switching);31 incases with no discernible sequence identity at thedeletion sites, replicative non-homologous or non-replicative recombination could be involved). Sev-eral results, including phylogenetic analyses (Figure4) indicate that recombination events were involvedalso in the generation of st RNAs from theirdefective counterparts.

In mixed infections in cell culture, with FMDVmutants of the same parental genome, underconditions that restrict the growth of the individualmutants, it was estimated that 10% to 20% of genomes undergo recombination in a single growth

cycle.32 The recombination frequency droppedsharply when the two parental genomes belongedto a different FMDV subtype, and even more whenh f diff 32 Thi d h

Figure 6. Selective advantage of the RNAs with internal deletions at late passages. (a) Evolution of the production of infectious units (pfu/ml) (■), corrected for the bipartite nature of the infectious agent (see Materials and Methods), and of the number of viral RNA molecules (♦), determined by quantitative RT-PCR. Data are the average of at least twoindependent experiments, each carried out in triplicate; standard deviations are shown. (b) Competition betweenpopulations C-S8p260 and either C-S8p360 (left) or C-S8p460 (right), estimated from the proportion of discriminatingnucleotides (position 1091: G in C-S8p260, U in C-S8p360 and C-S8p460; position 1105: C in C-S8p260, U in C-S8p360 andC-S8p460; position 1180: U in C-S8p260, C in C-S8p360 and C-S8p460) in the sequencing peaks. Bars indicate theproportion of the nucleotide indicated at the bottom in the initial mixture (po) and in passages one to four. Procedures aredescribed in Materials and Methods.




b d d b h l bi ti th f diff t t 32 Thi d th

infrequent occurrence of double infections in vivo bydistinguishable FMDVs, may explain the verylimited role that recombination appears to play inthe natural evolution of FMDV.33,34 Nevertheless,point, short, and block deletions have been identi-fied in FMDV, and sometimes they have beenassociated with major biological alterations. Natu-rally occurring deletions in the 3A-coding region canaffect virulence and host range.35,36 Sequence align-ments of divergent isolates (that belong to differentFMDV serotypes) suggest the occurrence of shortdeletions at the genomic regions encoding exposedcapsid loops, and point deletions and block dele-tions at the 5′ and 3′- untranslated regions†.37 Inplaque-to-plaque transfers of FMDV, three pointdeletions have been observed in homopolymerictracts; the mechanism probably being slippagemutagenesis.38 A deletion of 69 nucleotides (span-ning genomic residues 1052 to 1120) occurred in anumber of FMDV subclones, in the course of fitnessrecovery of an FMDV clone with an internaloligoadenylate tract;14 in this case a selective forcein favor of the deletion was probably the need toeliminate the highly deleterious internal oligoade-

nylate insertion.11,14

Recom bination is frequent in other picorna-viruses.31 A case in point is the identification of internal deletions within the 5′-untranslated regionof coxsackievirus B3 replicating in cardiac tissue of mice.39 Frequent intertypic and intratypic poliovirusrecombinants (often involving vaccine and wild-type strains) have been described in vivo.27 Takentogether, the observations on recombination of FMDVand other picornaviruses suggest that recombination may be very frequent during picornavirusreplication but that many recombinants are neverrecorded either because of their low fitness or

because of absence of markers to identify genomesas recombinants. Recombination to generate st RNAfrom genomes with internal deletions has beendescribed for plant viruses.40 The view of recombi-nation as an important mechanism of RNA geneticshas been recently emphasized by Bujarski andcolleagues, based on their work on promiscuousrecombination of brome mosaic bromovirus.41 In theview that the occurrence of recombination is not alimitation in FMDV, the key question is what could be the elements that triggered the transition towardsdominance of ΔRNAs and replicative independenceof st RNA, between passage 143 and 219.

The master deletion model

One of our hypotheses is that only a limitednumber of the many spontaneously arising internaldeletions are neutral or very slightly advantageouswith respect to its maintenance, together with stvirus, in the replication system. A balanced supplyof proteins for trans-complementation may requirean effective co-translational processing of twoversions of a shortened polyprotein encoded by

two ΔRNAs, including the autocatalytic cleavage of L, and maintenance of cleavage sites and theiradequate context.42 Some amino acid substitutionsaffect residues around polyprotein cleavage sites insome ΔRNAs. Replacement K201R is located atposition -1 of the L-VP4 cleavage site in Δ1017,although R201 is found in several type O and SAT3FMDVs.43 Also, A85S affects position -1 of the VP4-VP2 cleavage site in C-S8p360Δ417, and Q218Kaffects position -2 of the VP3-VP1 cleavage site in allΔRNAs in which the cleavage site is present. Othersubstitutions affect residues located at positions -5 to-19 and position +12 of various cleavage sites of anumber of genomes with deletions (cleavage site

sequences are based on Ryan et al.43). Additional biochemical studies are needed to elucidate whetheramino acid replacements around polyprotein pro-

ld d l d

Table 4. Expansion of cell tropism by defective FMDV populations and their standard recombinant derivatives

Virus

Cell type

CHO Jurkat

c.p.e.a Titer (pfu/ml) b Composition of the progeny c c.p.e.a Titer (pfu/ml) b Composition of the progeny c

C-S8p260 + 4.1 ± 3.1 × 109 Δ417, Δ999 or Δ1017 + 4.3 ± 2.7 × 106 Δ417, Δ999 or Δ1017C-S8p360 + 5.8 ± 5.4 × 109 Δ417, Δ951 + 1.5 × 107 Δ417, Δ951C-S8p460 + 1.2 × 108 Δ417, Δ951 + 1.3 × 107 Δ417, Δ951C-S8p260p3d + 8.7 ± 3.1 × 107 st + 6.5 ± 2.1 × 105 stC-S8p360p5d + 4. × 108 st + 3. × 106 stC-S8p460p5d + 1.5 ± 1.4 × 108 st + 1.5 ± 0.6 × 106 stMARLS + 1.2 ± 0.7 × 108 st + 1. × 106 stC-S8c1 − 7.6×103

− − 1.6×102−

a Cytopathology of cells in culture.b In C-S8p260, C-S8p360, and C-S8p460 the titer is corrected for the effect of the dilution1 (Manrubia et al. unpublished results).

Titrations were carried out on BHK-21 cell monolayers in triplicate, and standard deviations are indicated. In CHO cells the titration wascarried out after complete cytophatic effect. In Jurkat cells, the titration was made after 5 h post-infection. Procedures are detailed inMaterials and Methods.c RT-PCR amplification number 21 (see Figure 1(a) and Table 1) was used to detect the composition in defective or st genomes. -,

undetectable RNA. Other symbols are as for Table 1.

† Knowles, N.J. & Palmenberg, A. (1998). Picornavirus.Sequence alignments and phylogenetic trees. www.iah.

bbsrc.ac.uk/virus/picornaviridae/sequencedatabase/


http://www.iah.bbsrc.ac.uk/virus/picornaviridae/sequencedatabase/alignments/alignmts%20hts






i it ld d l t t i i dli / li h

contribute to the stability of the ΔRNA-basedsystem.

The triggering factor towards dominance of ΔRNAs could be the stochastic occurrence of adeletion event that did not compromise fitness andperhaps conferred the system with a minimalselective advantage over replication of st RNAalone. Δ417 RNA is a candidate to fulfill such arequirement, since Δ402 was the first ΔRNAidentified in the C-S8c1 lineage2 (Figure 1(b)), andit is present in each of the populations examinedthroughout passage 460, including virus fromindividual plaques from passages 219 and 225(Figure 1(b) and Table 2). We propose a model thatwe term the master deletion model, according towhich an initial deletion (in the present systemΔ417) of essentially a neutral character is stochasti-cally generated, and it can co-exist with st RNA.

Once such a triggering ΔRNA is produced, thesystem has the basic biochemical requirements toexplore the ‘‘space’’ of deleted forms for fitnessincrease, following typical quasispecies dynamics.25,44

Once ΔRNAs with increased fitness appear, theydisplace the st RNA. Competitions between ΔRNAsfrom different passages (Figure 6(b)) indicate theoccurrence of positive selection. Thedn/ds ratios (Table3) suggest that either a few non-synonymous (or acombination of non-synonymous and synonymous)mutations mediated selection. Further experimentsare required to explore the impact of mutation in thestability of the FMDV ΔRNA system.

A total of 53 amino acid replacements have beenidentified in the C-S8c1 lineage up to passage 460(Figure 2 and Table 3). Seven of those affect residuesthat are invariant in an alignment of 103 FMDVgenome sequences†33. The amino acid substitutionsthat in the capsid of passaged FMDV were respon-sible for the expanded host cell tropism of the virus(replacements E-173-K, in VP3; Q-218-K, in VP3, andH-197-R, in VP1) were maintained throughout theevolutionary transition towards defectiveness andits maintenance (Figure 2). Thus, despite a continu-ous dynamics of genetic variation some salientphenotypic traits acquired by the st genome may be exploited by the defective counterparts.

The ΔRNA-based complementation systemremained stable for at least 200 passages, despite acomplex set of recombination and mutation events,and evidence of evolutionary discontinuities. The basic concept in virology that replicating virusesevolve as dynamic mutant spectra rather thandefined genetic entities, in agreement with quasi-species theory,25,44,45 has been extended to spectra of ΔRNAs occurring at late evolutionary stages of themultiply passaged C-S8c1 lineage. Complementa-tion or interference among components of a mutantspectrum can influence the behaviour of the quasi-species as a whole,46–51 emphasizing that an ensem- ble rather than an individual is the unit of selection.

Furthermore, defective viral genomes can be trans-mitted in vivo.52 The FMDV defective system offersan extreme case of evolution towards completed d l f l

Materials and Methods

Cells, viruses and infections

The origin of BHK-21 and CHO cells, and procedures forcell growth, infection of cell monolayers with FMDV inliquid medium, for plaque assays in semi-solid agarmedium, and for infections of Jurkat cells growing insuspension have been described.15,17,26,53 FMDV C-S8c1 is aplaque-purified virus of the European serotype C, derivedfromnaturalisolate C1 Santa-Pau Spain 70.26 Serial passagesof C-S8c1 were carried out by infecting BHK-21 cellmonolayers with the corresponding supernatants of theprevious infection. The p following C-S8 indicates passagenumber. FMDVs C-S8p219, C-S8p225, C-S8p260, C-S8p360and C-S8p460 are viral populations obtained after 219, 225,260, 360 and 460serial cytolytic passages,respectively, of C-S8c1 at high moi in BHK-21 cells (2×106 BHK-21 cellsinfected with the virus contained in 200 μl o f t h e

supernatant from the previous infection, estimated tocontain 1×107 to 5×107 corrected plaque-forming unit(s)(pfu)) (corrected refers to the application of a correctionfactor to account for the effect of dilution on the titration of the multi-partite FMDV, as described1 (Manrubia et al.,unpublished results). FMDV C-S8p260p3d, C-S8p360p5dand C-S8p460p5d are viral populations obtained after threeor five serial cytolytic passages of C-S8p260, C-S8p360 andC-S8p460 at low moi in BHK-21 cells (2×106 BHK-21 cellsinfected with 200 μl of a 10-3 dilution of the supernatantfrom the previous infection, or about 1× 104 to 5×104

corrected pfus) (see also Figure 1(b)). FMDV MARLS is amonoclonal antibody escape mutant obtained from FMDVC-S8c1 passaged 213 times in BHK-21 cells.2 In all infectionexperiments, mock-infected BHK-21 or CHO cell mono-

layers and Jurkat cells growing in suspension wereincubated in parallel to ascertain the absence of contamina-tion. Also, during the serial passages of defective FMDVpopulations in BHK-21 cells, serial infections with super-natants of mock-infected cells weremaintained in parallel tocontrol for the absence of viral contamination. No evidenceof contamination was seen at any time.

Virus competition assays

Growth competition experiments were carried out asdescribed,11,14 with some modifications. About 106 BHK-21 cells were infected with mixtures of C-S8p260 and C-S8p360 or C-S8p260 and C-S8p460 at a ratio of about 1:1 in

viral particles. When the cytopathic effect was complete,the progeny virus was recovered and used to infect a freshcell monolayer. A total of four serial infections were carriedout, without dilution of virus prior to infection. RNA fromthe virus produced in each passage was extracted,amplified by RT-PCR and sequenced. The proportion of the two competing genomes (Δ999 in C-S8p260 or Δ951 inC-S8p360 and C-S8p460) at the different passages wasestimated by measuring the proportion of specific dis-criminating nucleotides (Figure 6(b)).

RNA extraction, RNA quantification,cDNA synthesis and PCR amplification

Viral RNA was extracted from supernatants of infectedcells or from individual viral plaques by treatment withTrizol (Invitrogen) as described.54 Total FMDV RNA quan-tification was performed by real-time (RT) PCR with the






d d l t ti f i l Li h C l I (R h ) i h Li h C l RNA

Master SYBR Green I Kit (Roche). The primers used toquantify total FMDV RNA in viral populations between C-S8p260 andC-S8p460 were 5′ GGATGCCATCTGGCTGT 3′(5′ end at genomic position 7493) and 5′ AGGAGATCATG-GTGTAGGTGTC 3′ (5′ end at genomic position 7615). Re-

verse transcription was carried out using either avianmyeloblastosis virus (Promega) or Transcriptor (Roche)reverse transcriptase, as specified by the manufacturers.PCR amplification was performed using either the Ampli-Taq polymerase (Perkin-Elmer) or Expand High FidelityDNA polymerase system (EHF) (Roche), as specified by themanufacturers. Amplification products were analyzed by1%(w/v) agarose gel electrophoresis and ethidiumbromidestaining. Negative controls (amplifications in the absence of RNA) were included in parallel to ascertain absence of con-tamination by templatenucleicacids. Buffers, templates andDNA products were handled in separate locations, and noevidence of contamination was seen in the experimentsreported here.

Sequence analysis

Full-length FMDV genome sequences were obtained byreverse transcription of the viral genomic RNA, followed byPCR amplification using primers specific for each type of ΔRNA or the st genome, and sequencing of overlappingcDNA fragments spanning the entire viral genome. Specificprimers were used to amplify differentially ΔRNAs and stRNAs; their sequence, positionin thegenome, amplificationnumber for identification, have been described.1,47 Briefly,the amplified overlapping cDNA fragments used to se-quence the different Δ417 RNAs were, amplifications 11(FMDV positions 368 to 1835),1 13 (FMDV positions 1002 to2926),1 and an amplification covering FMDV positions 2767to 8115. For Δ999 RNA they were, amplification 22 (FMDVpositions 368 to 4189),1 and an amplification coveringFMDV positions 2767 to 8115. ForΔ951RNAs they were, anamplification covering FMDV positions 368 to 1267, or 368to 3333, amplification 21 (FMDV positions 1002 to 4189),1

and an amplification covering FMDV positions 1692 to8115. For C-S8p260p3d theywere, amplifications 22 (FMDVpositions 368 to 4189),1 6 (FMDV positions 3573 to 5699),1 7(FMDV positions 5344 to 6609),1 and 8 (FMDV positions5971 to 8115).1 For C-S8p360p5d they were, amplifications11 (FMDV positions 368 to 1835),1 13 (FMDV positions 1002to 2926),1 19 (FMDV positions 1692 to 4189),1 and anamplification covering FMDV positions 2767 to 8115. For C-S8p460p5d they were, amplifications 11 (FMDV positions368 to 1835),1 21 (FMDV positions 1002 to 4189),1 and anamplification covering FMDV positions 2767 to 8115. Thefragments corresponding to the different defective RNAs(Δ417, Δ999, and Δ951) were purified by agarose gel elec-trophoresis. Only the nucleotide sequence of residues 1 to367 (preceding the internalpoly(C) tract; Figure 1) could not

be discriminated among the different ΔRNAs forms. Nodeletions in the P2, P3 and UTR genomic regions were de-tected in populations at passages 260, 360 and 460. Nu-cleotide sequencing was carried out as described,11,54,55

using an ABI 373 automated DNA sequencer (Applied Bio-systems). Most nucleotide sequences (and all of thoseshowing nucleotide mixtures) were determined two ormore times using different sense and antisense primers.Further details of the primers used, their position in theFMDV genome, and the amplification and sequencing

strategies will be provided upon request. The entire FMDVgenome was sequenced for defective viral genomes C-S8p260Δ4 1 7 , C- S8 p2 6 0Δ9 9 9 , C- S8 p36 0Δ4 1 7, C -S8p360Δ951, C-S8p460Δ417, C-S8p460Δ951, as well as for

and C-S8p460p5d. Due to the quasi-species nature of FMDVpopulations, mixtures of nucleotides were detected at somenucleotide positions; in all cases they were confirmed withindependent sequencing reactions. Nucleotide sequenceswere aligned and compared using BioEdit.56 Multiple

alignments were performed with CLUSTAL W.57

Phyloge-netic trees were derived for genomic and sub-genomic re-gions of st and ΔRNAs using the neighbor-joiningmethod,58 contained in MEGA 2‡. Analyses of non-synony-mous/synonymous substitutions ratios were calculated byusing SNAP§.59,60

Nucleotide sequence accession numbers

The Genbank accession numbers for the completegenome sequences of FMDV used for this study areAJ133357 for C-S8c1,61 and DQ409183 to DQ409191 for thedefective genomes and their st derivatives.

Acknowledgements

We thank Eric Baranowski and Armando Arias forvaluable information. Work was supported bygrants BMC 2001-1823-C02-01 and BFU 2005-00863from MEC and QLRT-2001-00825 from the EU, and by Fundación Ramón Areces. S.O. was supported bya predoctoral fellowship from MEC.

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Edited by J. Karn

(Received 26 February 2006; received in revised form 5 May 2006; accepted 10 May 2006 )Available online 24 May 2006




BioMed Cen

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BMC Evolutionary Biology

Open AccResearch article

Topology of evolving, mutagenized viral populations: quasispeciesexpansion, compression, and operation of negative selection

Samuel Ojosnegros1

, Rubén Agudo1

, Macarena Sierra1

, Carlos Briones2,3

,Saleta Sierra1,4, Claudia González- López1,5, Esteban Domingo*1,2,3 andJuan Cristina1,6

Address: 1Centro de Biología Molecular "Severo Ochoa", UAM-CSIC. Campus de Cantoblanco, 28049, Madrid, Spain, 2Laboratorio de EvoluciónMolecular, Centro de Astrobiología (CSIC/INTA), Instituto Nacional de Técnica Aeroespacial, Ctra de Torrejón a Ajalvir, km 4, 28850 Torrejón de Ardoz, Madrid, Spain, 3Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Hepáticas y Digestivas (CIBERehd), Spain, 4Institute of Virology, University of Cologne, Fuerst-Pueckler Str. 56, D-50935 Cologne, Germany, 5MRC Laboratory for Molecular Cell Biology & Cell Biology Unit, University College London, Gower Street, London, WC1E 6BT, UK and 6Laboratorio de Virología Molecular, Centro de InvestigacionesNucleares, Facultad de Ciencias, Universidad de la República, Iguá 4225, 11400 Montevideo, Uruguay

Email: Samuel Ojosnegros - [email protected]; Rubén Agudo - [email protected]; Macarena Sierra - [email protected];Carlos Briones - [email protected]; Saleta Sierra - [email protected]; Claudia González- López - [email protected];Esteban Domingo* - [email protected]; Juan Cristina - [email protected]

* Corresponding author

AbstractBackground: The molecular events and evolutionary forces underlying lethal mutagenesis of virus

(or virus extinction through an excess of mutations) are not well understood. Here we apply for

the first time phylogenetic methods and Partition Analysis of Quasispecies (PAQ) to monitor

genetic distances and intra-population structures of mutant spectra of foot-and-mouth disease

virus (FMDV) quasispecies subjected to mutagenesis by base and nucleoside analogues.

Results: Phylogenetic and PAQ analyses have revealed a highly dynamic variation of

intrapopulation diversity of FMDV quasispecies. The population diversity first suffers striking

expansions in the presence of mutagens and then compressions either when the presence of the

mutagenic analogue was discontinued or when a mutation that decreased sensitivity to a mutagen

was selected. The pattern of mutations found in the populations was in agreement with the

behavior of the corresponding nucleotide analogues with FMDV in vitro. Mutations accumulated at

preferred genomic sites, and dn/ds ratios indicate the operation of negative (or purifying) selectionin populations subjected to mutagenesis. No evidence of unusually elevated genetic distances has

been obtained for FMDV populations approaching extinction.

Conclusion: Phylogenetic and PAQ analysis provide adequate procedures to describe the

evolution of viral sequences subjected to lethal mutagenesis. These methods define the changes of

intra-population structure more precisely than mutation frequencies and Shannon entropies. PAQ

is very sensitive to variations of intrapopulation genetic distances. Strong negative (or purifying)

selection operates in FMDV populations subjected to enhanced mutagenesis. The quantifications

provide evidence that extinction does not imply unusual increases of intrapopulation complexity,

in support of the lethal defection model of virus extinction.

Published: 17 July 2008

BMC Evolutionary Biology 2008, 8:207 doi:10.1186/1471-2148-8-207

Received: 29 February 2008Accepted: 17 July 2008

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© 2008 Ojosnegros et al; licensee BioMed Central Ltd.This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0),which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

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BackgroundRNA viruses replicate as mutant distributions termed viralquasispecies. This is a consequence of high mutation ratesoperating during RNA genome copying, due to theabsence of proofreading-repair activities in the relevant

RNA-dependent RNA polymerases and RNA-dependent DNA polymerases [1,2]. Most phylogenetic relationshipsamong RNA viruses have been established using the con-sensus (or population) genomic sequences that represent a weighted average of multiple, closely related sequencespresent at each time point, in each virus sample obtainedfor analysis [3]. Phylogenetic relationships established

with consensus viral sequences have been instrumental toclassify viruses and to determine origin of emergent

viruses and rates of virus evolution [1,4,5]. For many pur-poses it is important to analyze phylogenetically the rela-tionship among different genomes from the same mutant spectrum of a viral quasispecies. This type of analysis may

reveal the existence of genome subpopulations withinmutant spectra that might encode different phenotypic traits. Also, it allows the calculation of average genetic dis-tances among individual components of the mutant spec-trum, a parameter that can be a predictor of biologicalbehaviour [1]. As an example, a study with a poliovirusmutant which displays a -3-to 5-fold higher template-cop-

ying fidelity than the wild type documented that a narrowmutant spectrum impeded the virus to reach the brain of susceptible mice and produce neuropathology [6,7]. Anearly study documented that complexity of the coronavi-rus murine hepatitis virus quasispecies influenced thepathogenic potential of this virus for mice [8]. A broad

hepatitis C (HCV) virus mutant spectrum was associated with poor response to treatment by ribavirin and inter-feron α [9], and rapid early evolution of the virus led to achronic infection [10]. Some studies have found an asso-ciation between a reduction of mutant spectrum complex-ity of HCV at early stages of treatment and viral clearance([11]; reviewed in [12]). Recently, the role of the mutant spectrum in adaptation of West Nile virus has been docu-mented [13,14]. Therefore, there is a need to developmethods to describe the relationship among componentsof mutant spectra in viral populations.

An estimate of the complexity and internal relationships

among genomes within a mutant spectrum can beobtained through application of distance-based phyloge-netic methods, such as neighbour-joining (NJ) [15] or maximum likelihood [16] procedures. However, the reli-ability of the derived genome clusters may be questiona-ble when the number of mutations distinguishing different components of a mutant spectrum is small.Small genetic distances among genomes of a mutant spec-trum are found when a viral clone (single genome) hasundergone a limited number of passages in cell culture[17]. Despite this limitation, the general topology of a NJ

tree may be robust enough to provide information about the evolutionary pattern undergone by the viral popula-tion.

An alternative method developed to group closely related

sequences is Partition Analysis of Quasispecies (PAQ), which is considered a non-hierarchical clustering method[18]. PAQ groups together the viral sequences separatedby the shortest genetic distances. For this purpose a centregenotype that nucleates a group of sequences within a cir-cle (cluster) with a previously set radius is selected. Highcompactness of a group is defined by having a larger number of variants near the centre of the circle than at itsboundary. In this fashion, multiple, overlapping or non-overlapping groups can be defined within mutant spectraof viral quasispecies. PAQ has been successfully used toanalyze subpopulations of equine infectious anemia virus[19], Ty1-copia retrotransposon sequences [20], regula-

tory sequences of bovine viral diarrhoea virus [21], andsequential isolates of hepatitis A virus [22]. PAQ shouldfind increasing application to describe viral quasispeciesin view of its power to quantify relationships among related sequences, and of the critical role of mutant spec-tra in virus behaviour.

Our laboratory has studied quasispecies dynamics andevolution of foot-and-mouth disease virus (FMDV), a

widespread picornavirus pathogen that causes the eco-nomically most important animal viral disease (reviews in[23,24]). The molecular epidemiology of FMDV has beenanalyzed in detail by establishing an extensive database of

genomic nucleotide sequences, as well as by defining phy-logenetic relationships among and within serotypes andsubtypes of the virus [25-27]. FMDV has been used as amodel system to investigate lethal mutagenesis, a termcoined to describe virus extinction through an increase of

viral mutation rate during replication ([28]; reviews in[29-31]). Studies on the interference that mutated FMDV and lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) popula-tions exert on the infectivity of the corresponding stand-ard genomes [32-35] led to the proposal of the lethaldefection model of virus extinction [34]. According to thismodel, extinction can occur with a modest averagenumber of mutations per genome that generates a class of

genomes termed defectors, that can replicate but interfere with replication of the standard genomes [34,36]. Defec-tor genomes differ from defective-interfering (DI) parti-cles described for many viruses [37] in that DI particles aredependent on helper virus for replication while defectorsare replication-competent [34,35].

In the course of the studies on lethal mutagenesis of FMDV, biological clones of the virus were subjected toserial cytolytic passages in cell culture in the absence or presence of the mutagenic bases or nucleoside analogues

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5-fluorouracil (FU), ribavirin (1-β-D ribofuranosyl-1, 2,3- triazole- 3 carboxamide) (R), or 5-azacytidine (AZC)[32,38-41]. These treatments have provided a number of

viral populations differing in their mutant spectrum com-plexity, as measured by the average mutation frequency

and Shannon entropy within mutant spectra [38-42].However, possible alterations of phylogenetic relation-ships among components of the mutant spectra of muta-genized quasispecies have not been studied. Tocharacterize possible changes among components of FMDV mutant spectra as a result of the mutagenic treat-ments, here we compare phylogenetic and PAQ analysesof several multiply-passaged FMDV populations, andtheir mutagenized counterparts. The results show that phylogenetic and clustering methods can provide a quan-tification of the mutagenic activity exerted on viral popu-lations by reflecting changes in genetic distances among components of the mutant spectra of the viral quasispe-

cies. PAQ analysis describes mutant distributions asspheres with size which is proportional to the genetic diversity, which varies as a result of enhanced mutagene-sis. This type of representation has revealed that viral pop-ulations can respond rapidly to environmental changes,

with striking switches between relaxation and compact-ness of the population diversity, that were not apparent from the comparison of mutation frequencies or Shannonentropies. Evidence is presented that identical or closely related consensus sequences may hide different subpopu-lations of genomes bearing distinct relationships among them.

MethodsCells, viruses, and infections

The origin of BHK-21 cells, and procedures for cellgrowth, and infection of cell monolayers with foot-and-mouth disease virus (FMDV) have been previously described [39-41,43,44]. The following FMDV clonalpopulations have been used in the studies on lethal muta-genesis: i) FMDV C-S8c1, a plaque-purified derivative of the natural isolate C1 Santa-Pau Spain 70 [44], a represent-ative of European serotype C FMDV [23], GenBank acces-sion number NC_002554

; ii) C-S8c1 multiply passaged at high multiplicity of infection (m.o.i.) in BHK-21 cells; the

viral populations derived from each passage are indicated

with a "p" before the passage number (i.e. C-S8p50 meansC-S8c1 passaged 50 times in BHK-21 cells). iii) FMDV MARLS, a monoclonal antibody (mAb)-escape mutant,selected from population C-S8c1p213 [45], GeneBank accession number AF274010. iv) C-S8c1p260p3d, the

viral population resulting from three diluted serial infec-tions (mo.i. = 0.1) of C-S8c1p260 in BHK-21 cells [46];gene bank accession number DQ409185

; v) C10280, a

clone derived from subjecting C-S8c1 to 280 plaque-to-plaque transfers in BHK-21 cells [47,48].

Extraction of RNA, cDNA synthesis, PCR amplification

and nucleotide sequencing

Procedures for extraction of RNA from the supernatants of infected cell cultures, reverse transcription (RT) of FMDV RNA and PCR amplification with high fidelity Pfu DNA

polymerase have been previously described[32,39,40,48]. Molecular cloning in plasmids pET-28a3Dpol or pMT-28, as well as controls to ensure that molecular clones reflect accurately the composition of thequasispecies under analysis, were described in the primary publications that produced the genomic sequences ana-lyzed here [46,49-52]. Nucleotide sequencing was per-formed using the Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (Abi Prism; Applied Biosystems) and the automatedsequencer ABI 373 and ABI 3730; all sequences weredetermined at least in duplicate, from independent sequencing reactions.

Mutagenic agents and treatments The procedures used for the mutagenic treatment havebeen described in detail in the primary references[30,33,38-40]. Here we provide a summary.

Treatment with ribavirin

A 100 mM solution of R (kindly provided by JC de la Torre) was prepared in PBS, sterilized by filtration, andstored at -20°C. Prior to use, the stock solution wasdiluted in DMEM (Dulbecco's modification of Eagle'smedium) to reach the desired working concentrations(generally 200 μM to 5000 μM). Cell monolayers werepreincubated with R for 7 h prior to infection. Infections

in the absence of R, and mock-infected cells were main-tained in parallel. FMDV MARLS was serially passaged inthe presence and absence of increasing concentrations(200 μM to 800 μM) of R (Figure. 1). For each passage, 4× 106 BHK-21 cells were infected with 1–4 × 106 PFU of

virus from the previous passage until cytopathology wascomplete (about 30 h in the presence of R, and 16 h in theabsence of R) [40,53].

Treatment with fluorouracil, azacytidine and guanidine hydrochloride

5-fluorouracil (FU) and azacytidine (AZC) were used asmutagenic base analogues (Figure 1), while guanidinehydrochloride (G) was used as inhibitor of FMDV replica-

tion, as previously described [38,39,41]. FU medium con-tained 200 μg/ml FU, and FUG medium contained 200μg/ml FU and 4 mM G. Solutions were sterilized by filtra-tion and stored at 4°C for a maximum of 15 days beforeuse. Infections in the presence of FUG were performed aspreviously described [38,39,41].

The sources of all reagents for molecular studies are givenin the corresponding references that describe the nucle-otide sequences used in the present analyses[32,33,39,40].

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http://www.ncbi.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide&cmd=search&term=NC_002554

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Phylogenetic analysis

Multiple alignments of consensus sequences and molecu-lar clones were carried out with the program CLUSTAL W [54], inserted into Bioedit package [55], using FMDV C-

S8c1 and/or FMDV MARLS (GenBank accession numbers AJ133357 and AF274010

, respectively) as the referencesequences. Pairwise distances matrix was generated by theprogram MEGA3.1 [56], using the Kimura-2 parameter model [57]. Tree topology was inferred by three phyloge-netic methods: (i) Neighbor-Joining (NJ) [15] using alsothe MEGA3.1 package [56]; bootstrap re-sampling (1000data sets) of the multiple alignments was used to test thestatistical robustness of the trees obtained by NJ [58]. (ii)Maximum Parsimony (MP) (using the program DNA-PARS from PHYLIP v3.5 package) [59]. (iii) Maximum

Likelihood (ML) trees were generated by the programPUZZLE [16] using the Tamura-Nei substitution model[60], and the Gamma distributed rates with eight param-eters (TN-8Γ) as heterogeneity model (see additional file

1). Additionally, for the additional file 2, a ML analysis of mutagenized populations of FMDV was performed by means of the program Modelgenerator [61], useful toidentify the optimal evolutionary model (Akaike Informa-tion Criteria and Hierarchical Likelihood Ratio Test indi-cated that the GTR model best fit the sequence data).Using this model, ML trees were constructed using soft-

ware from the PhyML program [62], available at [63]. Asa measure of the robustness of each node, we used anapproximate Likelihood Ratio Test (aLRT), which assessesthat the branch being studied provides a significant likeli-

scheme of passages of biological clone C-S8c1 in BHK-21 cells, in the presence or absence of mutagenic base and nucleotideanaloguesFigure 1scheme of passages of biological clone C-S8c1 in BHK-21 cells, in the presence or absence of mutagenic baseand nucleotide analogues. Biological clones are depicted as filled squares and uncloned populations as empty circles. Thick arrows indicate high m.o.i. passages (1 to 5 PFU/cell). Drug concentrations during the infections are indicated on the corre-

sponding arrows. A) The initial biological clone C-S8c1 [44] was subjected to three parallel series of cytolytic infections, eitherin the presence of 5-fluorouracil (FU) or 5-azacytidine (AZC) or with no drug. B) C-S8c1 was subjected to 213 passages, andthen MARLS clone was isolated as a mAb SD6 resistant mutant [45] (thin arrow). RA populations originated from serial cyto-lytic infections of MARLS in the presence of the indicated concentrations of ribavirin (R). The concentration of R was increasedfrom 200 μM to 800 μM in the first 30 passages and from 800 μM to 5000 μM between passages 45 and 60. A bifurcation wasestablished at passage 30 and the populations were subjected to 5 additional passages in the absence of R to yield the popula-tion RA0p35. CAp35 is the population obtained after 35 parallel passages of MARLS in the absence of drug.

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hood gain, in comparison with the null hypothesis that involves collapsing the branch under study but leaving therest of the tree topology unaffected [64].

Characterization of mutant spectra

The complexity of mutant spectra was quantified by min-imum and maximum mutation frequencies. Minimummutation frequency is the number of different mutationspresent in the molecular clones divided by the totalnumber of nucleotides sequenced, and maximum muta-tion frequency is expressed as the total number of muta-tions present in the molecular clones divided by the totalnumber of nucleotides sequenced. The normalized Shan-non entropy (H), which is a measure of the proportion of identical sequences in a distribution [65], was also calcu-lated. It is given by the formula:

in which pi is the proportion of each sequence of themutant spectrum, and N is the total number of sequencescompared.

For the Partition Analysis of Quasispecies (PAQ) [18], theclones of each viral population were grouped together under the minimum possible radius, considering no par-tition. Within each cluster, the average distance (AD)

value, with respect to the central sequence reported by PAQ, was calculated as a measure of the intrapopulationdiversity, given by the formula:

in which n is the number of neighbors within the group with centre variant c, and Dic is the genetic distance (Ham-ming) between variants i and c. The populations are rep-resented as spheres with the diameter proportional to the

AD value. Standard errors have also been calculated (seeadditional file 3: Standard errors).

The nonsynonymous mutations corrected per nonsynonymous site (dn) and the synonymous mutations correctedper synonymous site (ds) were calculated using SNAP[66,67]. Kn and Ks are the ratio of nonsynonymous and

synonymous mutations respectively, per nucleotide(without any correction). The sliding-window software K-Estimator [68] was used to infer the Ks and Kn in theFMDV genome using 200 nucleotide windows and a shift of 100 nucleotides per step, to cover all the polyprotein-coding region. The software calculates the confidenceinterval using Monte Carlo simulations.

Software for phylogenetic and sequence analyses wereretrieved from the corresponding references listed in thedifferent sections of Methods.

Statistical analysis

One Way ANOVA, Tukey post hoc tests for non equal n,and standard errors were calculated using Statistica 6.0software package (StatSoft 2001).

ResultsPhylogenetic evaluation of the mutagenesis-induced

diversification of viral populations

The present study was aimed at analyzing retrospectively sets of consensus and clonal nucleotide sequences deter-mined in our laboratory from FMDV populations sub-jected to serial cytolytic infections in BHK-21 cells, in theabsence or presence of the mutagenic nucleotide ana-logues FU, R or AZC [32,33,39,40] – (Figure 1).

A representation of the quasispecies was obtained by determining the nucleotide sequences of 5 to 21 cDNA clones from each population, and scoring mutation types,

mutation frequencies, and Shannon entropies. The FMDV genomic region analyzed was the 3D (polymerase)-cod-ing region (Table 1). Phylogenetic trees were derived fromthe nucleotide clonal and consensus sequences from eachpopulation. Sequences from some reference viruses werealso introduced as outgroups to establish minimal andpreviously known relationships, as well as to define a gen-eral structure of the tree. The distance-based NJ method[15], under Kimura two parameter model [57], was ini-tially used for phylogenetic reconstructions, as describedin Methods. In some cases the populations were analyzedusing ML and MP algorithms [69] (see additional files 1and 2). The general topology of these trees was consistent

with that derived from the NJ analysis: the major cladesand the relationships among clonal and consensussequences were maintained.

Comparison of the phylogenetic trees derived from nucle-otide sequences of the different FMDV clonal populationspassaged 1 and 25 times in the absence or the presence of

AZC or FU shows an expansion of genetic distancesamong components of the mutant spectrum of themutated populations compared to the respective controlpopulations passaged in the absence of drug. The presenceof FU led to a higher expansion of the genetic distancesthan the presence of AZC (Figure 2). This expansion was

not observed at passage 1 either with or without AZC or FU. Tree branches radiate from the corresponding consen-sus sequence with no discernible subclusters within eachpopulation.

A more complex pattern of intrapopulation genetic dis-tances was observed with FMDV passaged in the presenceof R (Figure 3). These populations originated from thehigh fitness FMDV clone MARLS [45]. The overall topol-ogy of the populations subjected to continuous muta-genic treatment (RAp35, RAp45 and RAp60; passage

H p p N i N

i i= − ⋅[ ( ln )] / lnΣ (1)

AD average distance= ==

( / ) ( )1 1n Din

icΣ (2)

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history depicted in Figure 1) shows the absence of signifi-cant subclusters. In turn, in all cases, a set of clones cen-trifugally diverge from the consensus sequence located at the basis of the group. As the number of passages in thepresence of R increases, the genetic distance between theconsensus sequence of each population and its parental

MARLS clone increases substantially (about 11-fold frompassage 35 to passage 60; Figure 3 A).

Interestingly, the population that underwent 30 passagesin the presence of R and then 5 passages in the absence of R, showed a more compact topology, and subclusters of clones were distinguished (RA0p35* in Figure 3B). It must be noted that, due to the close relatedness among the nucleotide sequences analyzed (see Background andMethods), the bootstrap values associated with thederived NJ trees suggest limited robustness of the derivedclusterings. Nevertheless, the same general topologicalfeatures are also observed when MP and ML were used

(see additional file 1: neighbour-joining, maximum like-lihood and maximum parsimony analysis of populationsRAp35 and RA0p35) (see also statistical evaluation of PAQ, below).

The control population CAp35, obtained after 35 serialcytolytic infections of clone MARLS in cell culture in theabsence of mutagen, shows a characteristic tree with evi-dent lower diversity than the populations treated withmutagen (Figure 3), as documented by the very low muta-tion frequency value (12-fold smaller than population

RAp35, see Table 1), and the average shortness of all thebranches.

Partition analysis of quasispecies (PAQ) applied to the

clonal analysis of mutagenized FMDV populations

To further characterize the clonal structure of muta-

genized FMDV populations, PAQ was applied to the sameFMDV populations (Figure 1) studied by phylogeny. Thesequences determined from the set of molecular clonesderived from each viral population were treated as sepa-rate populations. A radius that grouped all sequences waschosen, and then the AD value was calculated (see Meth-ods), as a measure of intrapopulation diversity (Figure 4).

We considered the absence of intrapopulation partition asa priori realistic assumption because each viral populationderives from a well defined ancestor and evolution took place under controlled conditions, supported also by phy-logenetic data (Figure 3 A).

PAQ analysis of the populations derived from clone C-S8c1 subjected to 25 passages either in the presence of FUor AZC or in the absence of mutagen, showed a 1.5-foldexpansion of intrapopulation diversity as a result of viruspropagation in the absence of mutagen, and 13.50-foldand 9.24-fold expansions as a result of passages in thepresence of FU or AZC, respectively (Figure 4 A). These val-ues illustrate again the higher mutagenic potential of FUthan AZC (Tukey post hoc test, p = 0.004) on FMDV rep-licating in BHK-21 cells [39].

Table 1: Number and type of mutations scored, and resulting mutation frequencies, calculated for the mutant spectra of the FMDV

populations analyzed in the present study

Populationa Genomicresiduesb

Numberof clones

Total nt.sequenced

Drugtreatmentc

Mutationsd Transitionse Transversionse Minimummutationfrequency

(×10-3)f

Maximummutationfrequency

(×10-3)g

Min/maxratio

Hh ADi

No Drug p1 6609–8013 5 7025 None 2/2 0.50 0.50 0.28 0.28 1 0.58 0.50

AZCp1 6609–8013 5 7025 [10 μg/ml]AZC

1/1 0 1 0.14 0.14 1 0.31 0.25

FUp1 6609–8013 5 7025 [200 μg/ml]FU

2/2 1 0 0.28 0.28 1 0.58 0.50

No drug p25 6609–8013 5 7025 None 1/3 1 0 0.14 0.42 0.33 0.61 0.75

AZCp25 6609–8013 18 25290 [10 μg/ml]AZC

13/19 0.21 0.79 0.51 0.75 0.68 0.73 2.31

FUp25 6609–8013 5 7025 [200 μg/ml]FU

14/19 1 0 1.99 2.7 0.74 1 6.75

CAp35 6667–7997 21 27951 None 17/17 0.88 0.12 0.61 0.61 1 0.69 0.85

RA0p35 7150–8020 21 18291 [800 μM] R,No drug

17/68 0.75 0.25 0.93 3.71 0.25 1 3.62

RAp35 6667–7997 14 18634 [500–800μM] R

55/139 0.91 0.09 2.95 7.46 0.39 1 13.15(7.85)

RAp45 6667–7997 12 15972 [800 μM] R 31/49 0.76 0.24 1.96 3.07 0.64 1 6.91

RAp60 6667–7997 14 18634 [800–5000μM] R

55/80 0.97 0.02 2.95 4.29 0.69 1 7.62

aThe origin of the FMDV populations is detailed in Methods and depicted schematically in Figure 1.bThe genomic residues analyzed correspond to the 3D-coding region of t he FMDV genome; residue numbering is according to [47].cDrug treatment (AZC, azacytidine; FU, 5-fluorouracil; R, ribavirin), and concentrations are as described in Figure 1.dThe first number indicates the total amount of different mutations found in all the clones analyzed; when repeated mutations were found the second number refers to the total number of mutations.eExpressed per 1 in each population.f Minimum mutation frequency is the number of different mutations divided by the total number of nucleotides sequenced.gMaximum mutation frequency is the total number of mutations (including repeated mutations) divided by the total number of nucleotides sequenced.hH is the normalized Shannon entropy [65].iAD is the average genetic distance, calculated as detailed in Methods. The value in brackets was calculated with residues 7150–8020 (to compare with population RA0p35) of the FMDV genome.

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A dramatic effect of R treatment was unveiled by PAQthrough the comparison of MARLS populations passagedin the presence or absence of R (Figure 4B). Remarkably,multiple passages in the presence of up to 800 μM R,

resulted in populations with significant differences in AD values by means of analysis of variance (One-way ANOVA: F = 85.5, df = 65, p < 0.001). RAp35 showed a15.47-fold larger AD value (Tukey post hoc test, p <

phylogenetic analysis of individual molecular clones of FMDV populations passaged in the absence or presence of mutagensFigure 2phylogenetic analysis of individual molecular clones of FMDV populations passaged in the absence or presenceof mutagens. The trees were constructed with sequences from the 3D (polymerase)-coding region (nucleotide residues 6609to 8013; numbering of residues as in [47]) of molecular clones obtained from populations at passage 1 (left) or passage 25(right) of FMDV C-S8c1in BHK-21 cells. The populations analyzed correspond to those depicted in Figure 1A. Each dot repre-sents the sequence of an individual clone as follows: red, clones from the populations passaged in the absence of drug (no

drug); green, clones from the populations passaged in the presence of 5-fluorouracil (FU); blue, clones from the populationspassaged in the presence of 5-azacytidine (AZC). The central Sequence according to PAQ is indicated by an arrow. The NJmethod, with the Kimura 2 parameter algorithm, and 1000 bootstrap resamplings were used. Bootstrap values were below 75,and values higher than 60 are indicated in parenthesis. The position of the consensus sequence of the corresponding popula-tions is indicated with an asterisk. MARLS was included as an outgroup of the tree. The origin of the viruses, and proceduresfor clonal analysis and nucleotide sequence determination are detailed in Methods.

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phylogenetic analysis of individual molecular clones of MARLS populations passaged in the absence or presence of ribavirinFigure 3phylogenetic analysis of individual molecular clones of MARLS populations passaged in the absence or pres-ence of ribavirin. Trees were constructed using the NJ method under Kimura 2-parameter model, with 1000 bootstrap resa-mplings. Bootstrap values higher than 75 are indicated with numbers; values between 60 and 74 are indicated in parenthesis.Each tree represents the analysis of one individual population from the MARLS lineage depicted in Figure 1B. Each populationcan be identified by the name of the corresponding consensus sequence indicated with an asterisk. Each dot represents thesequence of an individual molecular clone; red indicates absence of drug and black presence of ribavirin. The central Sequenceaccording to PAQ is indicated by an arrow. A) Trees constructed with sequences from the 3D (polymerase)-coding region,residues 6667–7997, of FMDV. B) Comparison of the phylogenetic position of clones derived from populations RAp35 andRA0p35 (depicted in Figure 1); residues 7150–7997 from the 3D (polymerase)-coding were used. Procedures for clonal analy-sis and nucleotide sequencing are detailed in Methods.





0.001) than the population CAp35, the parallel control inthe absence of the drug (Figure 4B).

The 3D of RAp35 and its derived populations harboursthe substitution M296I which decreases its sensitivity to R

[40]. Further passages in the presence of 800 μM R led toa reduction of diversity of population RAp45 (1.90-foldreduction in AD value, Tukey post hoc test, p < 0.001;

Table 1). Once the diversity decreased in RAp45, it did not further increase significantly after 15 additional passagesunder higher (up to 5000 μM) concentrations of R (RAp60) (1.10 fold, Tukey post hoc test, p = 0.9).

Population RAp30 (depicted in Figure 1B) was subjectedin parallel to 5 further passages either in the absence(RA0p35) or the presence (RAp35) of R. The intrapopula-

tion diversity in RA0p35 was 2.15-fold smaller thanRAp35 (Tukey post hoc test, p < 0.001) (see Discussion).

The modification of the relationship among componentsof the mutant spectrum is not reflected in Shannon

entropy (which is saturated in the highest value, 1, for allthe populations from the RA lineage tested) (see Table 1).

Also maximum mutation frequency varies within a nar-row range of 1.7-fold to 2.4-fold when the different pop-ulations are compared with RAp35 (table 1). There are nostatistically significant differences in the minimum/maxi-mum mutation frequency of population RAp35 andRA0p35 (one-way ANOVA: F = 2.57, df = 1.33, p = 0.118).

This ratio is larger (higher diversity) in populationsRAp45 and RAp60, than in population RAp35 (Tukey post-hoc test, p = 0.0073 and p = 0.013, respectively),despite having lower AD values and, therefore lower intra-

partition analysis of quasispecies (PAQ) applied to sequences derived from mutagenized FMDV populationsFigure 4partition analysis of quasispecies (PAQ) applied to sequences derived from mutagenized FMDV populations.The initial biological clone of each passage series is depicted as a dot, with an initial intrapopulation average distance given arbi-trarily the value AD = 0.0. The populations analyzed in A and B are those described in Figure 1A and Figure 1B, respectively.For simplicity, only the drug treatment (FU, 5-fluorouracil, green; AZC, azacytidine, blue; R, ribavirin, black; no drug, red), andthe populations analyzed are depicted. The AD value was measured for each population considering no partition. Values arebased on nucleotide sequences of the 3D(polymerase)-coding region, genomic residues 6609 to 8013 for A), and 6667 to 7997for B), except for population RA0p35 for which residues 7150–7997 were used. For comparison, population RAp35 was alsoanalyzed using residues 7150–7997; in that case the sphere is represented with a dotted line inside the large sphere. The diam-eter of each sphere is proportional to the AD value which is indicated next to each sphere. Procedures for nucleotidesequencing and PAQ analysis are described in Methods.

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population diversity. These comparisons support that the AD values derived from PAQ are a more sensitive and real-istic descriptor of intrapopulation diversity than mutationfrequencies.

Mutational bias and rate of fixation of mutations The mutation profile in the components of the mutant spectrum of each population analyzed indicated that aspecific pattern of mutations was associated with eachmutagen (Figure 5). FU-treated populations accumulatedan excess of U → C transitions [39], while -RA popula-

tions preferentially fixed transitions C → U and G → A [42]. The mutational bias associated with AZC was mainly due to transversions G → C, C → G.

The NJ tree derived from consensus nucleotide sequences

of the entire FMDV genome of R treated populations dis-closed an unusually rapid fixation of mutations in theconsensus sequence of RAp45 (Figure 6 A). In the courseof serial cytolytic passages of C-S8c1, mutations accumu-lated at a rate of approximately 0.20 mutations per pas-sage [48], with MARLS displaying a similar rate of 0.24

proportion of the different mutation types scored among molecular clones of FMDV populationsFigure 5proportion of the different mutation types scored among molecular clones of FMDV populations. Each mutationtype (abscissa) was counted for the indicated populations by comparing the nucleotide sequence from each individual molecu-lar clone with the consensus sequence of the corresponding population. The populations analyzed are those derived fromFMDV MARLS (top left panel), from populations passaged in the absence of drug and derived either from C-S8c1 or MARLS(top right panel), or from FMDV C-S8c1 (bottom panels). The populations correspond to those depicted in Figure 1, and canbe identified according to the drug treatment (AZC, azacytidine; FU, 5-fluorouracil; R, ribavirin; no drug and C populations,control populations passaged in the absence of drug). Note the difference scale in ordinate of the top versus bottom panels.The genomic regions and number of nucleotides analyzed for each population are described in Table 1. Procedures for nucle-otide sequence determination and bioinformatic analysis of sequences are detailed in Methods.

M u t a t i o n p e r c e n t a g e

MARLS RAp35

RAp45

RAp60

RAp035

No Drugp25 (C-S8c1)

CAp35 (MARLS)

A / C

A / G

A / U

C / A

C / G

C / U

G / A

G / C

G / U

U / A

U / C

U / G

C-S8c1

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

FUp1FUp25

C-S8c1

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

A / C

A / G

A / U

C / A

C / G

C / U

G / A

G / C

G / U

U / A

U / C

U / G

AZCp1

AZCp25

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

A / C

A / G

A / U

C / A

C / G

C / U

G / A

G / C

G / U

U / A

U / C

U / G

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

A / C

A / G

A / U

C / A

C / G

C / U

G / A

G / C

G / U

U / A

U / C

U / G

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quantification of the genotypic divergence of FMDV MARLS populations passaged in the presence of ribavirinFigure 6quantification of the genotypic divergence of FMDV MARLS populations passaged in the presence of ribavirin.The FMDV populations analyzed are those derived from C-S8c1 or MARLS, as displayed in Figure 1B. A) Phylogenetic treebased on consensus nucleotide sequences of populations derived from biological clone C-S8c1 (p50, p100, p143, p200) andfrom MARLS (RAp35, RAp45); p260p3d derives from C-S8c1 after 260 passages at high m.o.i. in BHK-21 cells, followed by 3low m.o.i. infections, as described in [46]. C10

280a is a clone of C-S8c1 subjected to 280 serial bottleneck (plaque-to-plaque)transfers in BHK-21 cells [47,48]. FMDV C-Oberbayern is a natural isolate whose sequence [26] has been used as outgroup.The tree is based on the nucleotide sequence of entire genomes, using the NJ method with 1000 bootstrap resamplings (nodesscoring values higher than 75 per 100 are indicated in the tree), following the procedures described in Methods. B) Absolutenumber of mutations including reversions, relative to the sequence of C-S8c1, as a function of passage number in the C-S8c1lineage (depicted in Figure 1B). Values are based on the nucleotide sequence of entire genomes. A linear regression con-structed with C-S8c1 and successive passages (C-S8c1 lineage) is shown (y = 0.1987x-1.6922; R2 = 0.9882). The position of MARLS and RAp45 is indicated. Procedures are detailed in Methods.

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mutations per passage. In contrast, RA deviated to 1.13mutations per passage, suggesting a very fast evolutionassociated with the presence of R (Figure 6B).

Evidence of purifying selection during enhanced

mutagenesis We have examined whether the highly mutated RA genomes resulted from random fixation of mutationsalong the genome, or from their preferential accumula-tion at specific genomic sites. Using the sliding-window-based software K-estimator [68] (described in Methods)

we measured the distribution of mutations (Ka, Ks, non-synonymous and synonymous mutations per nucleotide,respectively) along the open-reading frame (polyprotein-coding region) of MARLS, RAp35 and RAp45 popula-tions. At certain genome regions, Ka and Ks for RAp35 andRAp45 displayed values that were statistically significantly higher than the average (Figure 7). The asymmetric distri-

bution of mutations suggests that despite the high muta-tional pressure imposed by R treatment, some kind of selection is still acting during the -passaging of the virus

with error-prone replication.

To distinguish whether the asymmetric distribution of mutations along the genome was mainly due to positiveor negative (or purifying) selection, the dn/ds ratios werecalculated (see Methods and Table 2). -RA populationsincluded 6- to 14- fold excess of synonymous mutations,both in the analysis of the mutant spectrum and the con-sensus sequence. In contrast, the dn/ds ratio of the con-sensus sequence of C-S8c1 at passage 263 (C-S8p260p3d)

was 0.62, that is, 6-to 8-fold higher than the value for -RA populations. Also, a set of MARLS-derived clones scored adn/ds ratio of 1.21, 7- to 17-fold higher value thanobtained in the clonal analysis of -RA populations (Table2). These data, together with the non-random accumula-tion of mutations along the viral genome (Figure 7),strongly suggest that purifying selection operates on

FMDV in the course of replication under enhanced muta-genesis.

Virus extinction without a large excess of mutations

To investigate whether FMDV extinction by enhanced

mutagenesis was associated with unusual intrapopulationdivergence [29,30,70,71], a PAQ analysis was performedon populations FMDV C-S8p3, C-S8p3-FUG and RAp35[72] (Figure 8 A). Preextinction population C-S8p3-FUGmanifested a very modest increase in mutant spectrumcomplexity relative to the control population C-S8p3 (Fig-ure 8C). Furthermore, the complexity of C-S8p3-FUG wasmuch lower than the complexity of RAp35 (AD valuecomparison: T student, t = 12.19, p < 0.001), included inthe phylogenetic and PAQ analyses (Figure 8B and 8C).

Therefore, viral extinction can be achieved without any salient increase of the average genetic distances among components of the quasispecies (see Discussion).

DiscussionSeveral remarkable modifications in the mutant spec-trum occur when viral populations replicate in the pres-ence of mutagenic agents such as base or nucleosideanalogues. The initial experiments by J.J. Holland andcolleagues documented very modest (1.1- to 2.8-fold)increases of mutation frequency at single base sites of poliovirus and vesicular stomatitis virus, associated withsevere decrease of infectivity, as a consequence of enhanced mutagenesis by a variety of mutagenic agents[73]. Subsequent work showed that replication of differ-ent viruses in the presence of mutagenic base or nucleo-

side analogues could lead to virus extinctionaccompanied of very modest (from barely measurable upto 6.4-fold) increases of mutation frequency and mutant spectrum complexity ([28,39,74]; reviews in [29,30,71]).In our previous studies with FMDV and lymphocytic cho-riomeningitis virus we have observed that in the course of the transition of the viruses towards extinction: i) there isa 102- to 103-fold decrease in specific infectivity (number

Table 2: Corrected ratio of nonsynonymous to synonymous substitution in several FMDV populations

Viral populationa dn/ds (Molecular clones)b dn/ds (Consensus sequences)c

RAp35 0.16 N.D

RAp45 0.08 0.09 (MALRS)

RAp60 0.07 0.08 (MARLS)

RA0p35 0.12 N.D.

C-S8p260p3d N.D. 0.63 (C-S8c1)

MARLS 1.21d 0.65 (C-S8c1)

N.D. not determined.aThe viral populations analyzed are those described in Figure 1 and Methods.bdn/ds is the ratio of nonsynonymous mutations (corrected per nonsynonymous site) to synonymous mutation (corrected per synonymous site),calculated as described in Methods [85,86]. Values correspond to calculations using nucleotide sequences from molecular clones (as described inTable 1).cdn/ds calculated as in b, applied to consensus nucleotide sequences, compared with the corresponding parental clone (given in parenthesis).dThis value was calculated with biological clones derived from MARLS, using the L (leader) protease-and capsid-coding regions.

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distribution of Ka and Ks ratio (non-synonymous mutations per nucleotide, and synonymous mutations per nucleotide, respec-tively) along the consensus sequence of the protein-coding region of the genomes of FMDV MARLS, RAp35 and RAp45Figure 7distribution of Ka and Ks ratio (non-synonymous mutations per nucleotide, and synonymous mutations pernucleotide, respectively) along the consensus sequence of the protein-coding region of the genomes of FMDVMARLS, RAp35 and RAp45. The origin of the populations analyzed is depicted in Figure 1B. The sequences have been com-pared with that of C-S8c1. Ka and Ks were calculated with the software K-estimator [68]. The genomes were analyzed in win-dows of 200 nt and a shift of the window of 100 nt in each step. The scaled protein-coding region of the FMDV genome isindicated in the abscissa [23,24]. The confidence intervals (dotted horizontal line) were calculated by k-estimator using MonteCarlo simulations [68]. A) Ka ratios. B) Ks ratios. C) Comparison of Ka and Ks ratios for RAp45.

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preextinction FMDV population, and phylogenetic and PAQ analysis of mutagenized populationsFigure 8preextinction FMDV population, and phylogenetic and PAQ analysis of mutagenized populations. A) Biologicalclones are depicted as filled squares and uncloned populations as empty circles. Thick arrows indicate high m.o.i. passages (1 to5 PFU/cell). Drug concentrations during the infections are indicated on the corresponding arrows). The circle with a cross rep-resents an extinct population. * This is the last infectious population recovered. B) Phylogenetic analysis of individual molecularclones from a MARLS population passaged in the presence of R, and clones from the C-S8c1 lineage passaged in the presenceor absence of FU and G. Black dots in the tree represent sequences of individual molecular clones from population RAp35. Thetree includes also clones derived from the population obtained after 3 passages of C-S8c1 in the presence of FU and G (greenasterisks), or in the absence of drugs (red dots). The central Sequence according to PAQ is indicated by an arrow. Populationsp200, p260p3d and clone C10

280, are derived from C-S8c1, as described in Figure 6. The tree is based on residues 6670 to 7871of the 3D (polymerase)-coding region, using the neighbor-joining method (1000 bootstrap resamplings; values higher than 75are indicated with numbers; values between 60 and 74 are indicated in parenthesis), as detailed in Figure 2 and Methods. C) ADvalues and spheres corresponding to the PAQ analysis of populations RAp35, C-S8p3-FUG and C-S8p3. Procedures aredetailed in Methods.





of infectious units divided by the total amount of viralRNA); ii) low viral loads and low replication capacity (fit-ness) favour extinction; and iii) internal, interfering inter-actions among mutagenized components of the mutant spectra play an important role in the extinction [32-

36,38,39,75].

The critical participation of the mutant spectrum in viralextinction led to the proposal of "lethal defection" as amodel of virus extinction by lethal mutagenesis [34,35],and motivated the phylogenetic and partition analyses of mutant spectra reported in the present study. The resultssupport our previous conclusions on the general increaseof mutant spectrum complexity -here documented by average genetic distances in phylogenetic trees and quan-tified by the AD parameter in PAQ- as a result of the var-ious mutagenic treatments. Moreover, new insights intothe events associated with enhanced mutagenesis have

been unveiled by the comparison of phylogenetic andPAQ analyses. The NJ tree topology of a populationevolved under enhanced mutagenesis conditions consistsof a basal consensus sequence, with the individual com-ponents of the population radiating from it (the moremutated the population the bigger the radiation of thebranches) and with no apparent population structure inthe form of subclusters. Trees constructed with FMDV populations whose 3D (polymerase) included a substitu-tion that decreased the sensitivity to R (RAp45 andRAp60) [40] displayed a slight reduction of branchlength, but maintained the same general topology. This isin sharp contrast with population RA0p35, which, after

only 5 passages in the absence of R, presents an internalstructure completely rearranged, as shown by the NJ tree,and confirmed with ML and MP methods (Figure 3B, andadditional file 1: neighbour-joining, maximum likeli-hood and maximum parsimony analysis of populationsRAp35 and RA0p35).

The average distance parameter AD of PAQ reflects thefine detail of the intra population structure of diversity better than the other estimators traditionally used, suchas mutation frequencies or Shannon entropy. Mutationfrequency does not capture the distribution of mutationsamong the individual components of a mutant spectrum,

and the Shannon entropy reaches the maximum possible value of 1 when all the sequences under study are differ-ent, independently of the mutational load. This lack of resolution is circumvented by PAQ due to the pairwisecomparison of all the clones with respect to the centralsequence. In this sense, any subtle variation in the spatialdistribution of mutation frequency may be amplified

yielding a more sensitive, accurate and non-saturating description of the internal structure of the population.

The present analysis has documented striking expansionsof the average intrapopulation genetic distance associ-

ated with mutagenic treatments (Figure 4). Interestingly the analysis of the RA lineage revealed that, after an initialexpansion of intrapopulation diversity, a remarkably fast contraction of the average distance occurred in two situa-tions. First, a 2.15-fold reduction in AD value was

observed when the drug treatment was discontinued for only 5 passages. Second, populations with FMDV includ-ing in its 3D (polymerase) replacement M296I -that decreases the sensitivity to R [40] – displayed a 1.90-foldreduction in AD value (RAp45 and RAp60 populations,Figure 4). The ratio of minimum over maximum muta-tion frequency yielded higher values (indicative of higher diversity), in populations RAp45 and RAp60 than in pop-ulation RAp35 which is the most diverse. Therefore muta-tion frequencies (both maximum, minimum or their ratio) and Shannon entropy, are less definitory than PAQ(when analyzing AD) to characterize the internal genetic diversity of mutagenized viral populations.

A possible interpretation of intrapopulation contractionsis that in the course of the mutagenic treatment subsets of genomes with better than average replication efficiency are produced. However, their potential replicative advan-tage can not be expressed due to the continuous muta-tional input due to the presence of R. When R pressure isremoved, specific subsets of genomes showing higher than average replication capacity, replenish the popula-tion. A similar, albeit less pronounced, contraction

would occur as a consequence of the dominance of viralmutants with decreased sensitivity to R.

The MARLS-derived populations that replicated in thepresence of R (the RA lineage, Figure 1B), showed unex-pected high resistance to extinction at passage 35 andsubsequent passages, associated with a mutation that decreased the sensitivity to R [40]. Despite such muta-tion, the number of total mutations fixed in the consen-sus sequence of population RAp35 was very high (1.13mutations/passage, Figure 6) when compared with itsancestor (0.2 mutation/passage). Also the molecular clones derived from RAp35 presented a 12-fold increasein mutation frequency with respect to the control popu-lation, CAp35 (Table 1). The specific pattern of muta-tions of FU-treated, AZC-treated and R-treated

populations (Figure 5), and the increase in mutant fre-quency with respect control populations (Table 1) sug-gest that the increase in mutation frequencies waseffectively produced by the action of mutagens, in agree-ment with the mutational bias induced in the course of polymerization assays in the presence of R-triphosphateor FU-triphosphate using purified FMDV 3D (polymer-ase) ([40], Agudo et al submitted for publication).

Despite the high error frequencies induced by mutagen,mutations did not accumulate at random along the viral

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genome, but rather they accumulated at preferredgenomic regions (Figure 7). The non-random accumula-tion of mutations and the excess of corrected synony-mous mutations (Table 1) are consistent with purifying selection operating in the evolution of mutagenized pop-

ulations. Viruses harbouring less deleterious mutationsmight have a selective advantage in a landscape of highly damaged viruses. In this view, the quasispecies woulddisplay a mutagenesis buffering activity, accepting thosemutations that affect the more permissive regions of the

viral genome. This dynamics is strikingly parallel to that observed in the course of bottleneck transfers carried out

with the same FMDV clones C-S8c1 ([47,48,76-78]reviewed in [79]). In bottleneck transfers individualclones are selected for replication. In this situation Müller ratchet effect operates on the clones [80]. In clones that resisted extinction, mutations accumulated preferentially at some genomic regions and, again, an excess of synon-

ymous mutations was found [48,77].

The present study supports the "lethal defection" modelof viral extinction in that a limited number of mutationsper genome can be sufficient to drive a virus to extinction[28,34,74]. Again, the comparison with FMDV clonessubjected up to 409 bottleneck transfers is highly signifi-cant. In such clones extinction was not achieved despitethe genomes reaching average mutation frequencies

which are 5- to 37-fold higher than those associated with viral extinction by lethal mutagenesis [32,39,41,48]. It has been proposed that in successive bottleneck transfers,the kinetics of mutation accumulation allows the fixation

of compensatory beneficial mutations that counteract theMüller Ratchet effect [76-79].

Several theoretical models of lethal mutagenesis of viruses have been proposed, either as a direct conse-quence of quasispecies dynamics and its corollary con-cept of error catastrophe, or independently of error catastrophe [70,81-84]. All models converge in that lethalmutagenesis is a feasible strategy to achieve virus extinc-tion by mutagenic nucleotide analogues. What the mod-els did not take into consideration is the key influence onextinction of internal interactions exerted among compo-nents of the mutant spectra. Lethal and interfering muta-

tions impede a substantial "evaporation" (or "diffusion")of genomic sequences in sequence space [84], as it couldnot be otherwise, considering that we are dealing withloss of multiple biological functions compactly inte-grated in a viral genome [70]. The phylogenetic and PAQapproaches used here should be extremely helpful tomonitor in a quantitative fashion the evolution of muta-genized viral populations both in cell culture and in vivo,as they increase their mutational load and either suc-cumb or escape extinction.

ConclusionPhylogenetic and PAQ analyses have unveiled changes inthe internal population structure of FMDV viral quasispe-cies subjected to mutagenesis by base and nucleoside ana-logues. Expansions and compressions of mutant spectra

have been quantitated by comparing average genetic dis-tances among components of mutant spectra. Compari-sons of the types and distribution of mutations along the

viral genomes have shown that negative (or purifying selection) acts in the course of enhanced mutagenesis.

Virus extinction can be achieved with modest increases of population complexity. The average distance parameter (AD) reflects the intrapopulation structure better than theother estimators traditionally used, such as mutation fre-quencies or Shannon entropy.

Authors' contributionsRA, MS, SS and CG-L determined nucleotide sequences.

SO, CB and JC applied phylogenetic and PAQ methods.SO made the calculations. ED conceived the study, andSO and ED wrote the manuscript. All authors reviewedand approved the final manuscript.

Additional material

Additional file 1

Neighbour-joining, maximum likelihood and maximum parsimony

analysis of populations RAp35 and RA0p35. Strains in the tree are

shown by name. Consensus sequence of each population is indicated with

an asterisk. Bar at the bottom of the trees denote distance A) and D)

Neighbour joining trees with Kimura 2-parameter. Bootstrap resampling

values (1000 replicas) higher than 50 are shown in red in the tree. B)and E) Maximum likelihood trees constructed with the Tamura-Nei sub-

stitution model and the Gamma distributed rates with eight parameters

(TN-8Γ ) as heterogeneity model. C) and F) Maximum parsimony trees,

confidence values higher than 50 are shown in red in the tree.

Click here for file

[http://www.biomedcentral.com/content/supplementary/1471-

2148-8-207-S1.tiff]

Additional file 2

Maximum likelihood phylogenetic analysis of mutagenized popula-

tions of FMDV . Strains in the tree are shown by name. Bar at the bottom

of the trees denote distance. Consensus sequence indicated by *. The

model used was GTR [61]. As a measure of the robustness of each node

an approximate Likelihood Ratio Test was used.

Click here for file[http://www.biomedcentral.com/content/supplementary/1471-

2148-8-207-S2.tiff]

Additional file 3

Standard errors. Average Hamming distance of the components of each

population (with respect to the central sequence selected by PAQ). Stand-

ard errors are plotted with boxes around the mean, as depicted in the leg-

end.

Click here for file

[http://www.biomedcentral.com/content/supplementary/1471-

2148-8-207-S3.tiff]

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http://www.biomedcentral.com/content/supplementary/1471-2148-8-207-S1.tiff


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AcknowledgementsThe authors wish to thank O.Gordo for critical review of the manuscript,

and C Escarmís for important contributions to this project. Work at Cen-

tro de Biología Molecular "Severo Ochoa" was supported by grants

BFU2006-00863 from MEC, 36558/06 from FIPSE, and Fundación R.Areces.

Work at Centro de Astrobiología was supported by INTA, MEC, CAM and

UE. CIBERehd is funded by Instituto de Salud Carlos III. S.O. was supportedby a predoctoral fellowship from the Ministerio de Educacion y Ciencia.

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