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ÉTUDE DE LA SYNERGIE ENTRE LA TOMATIDINE ET LES AMINOSIDES ENVERS
STAPHYLOCOCCUS AUREUS ET MÉCANISMES DE RÉSISTANCE
par
Jean-Philippe Langlois
mémoire présenté au Département de biologie en vue
de l’obtention du grade de maître ès sciences (M.Sc.)
FACULTÉ DES SCIENCES
UNIVERSITÉ DE SHERBROOKE
Sherbrooke, Québec, Canada, juillet 2019
iii
Le 22 juillet 2019
le jury a accepté le mémoire de Monsieur Jean-Philippe Langlois
dans sa version finale.
Membres du jury
Professeur François Malouin
Directeur de recherche
Département de biologie
Professeure Viktor Steimle
Évaluatrice interne
Département de biologie
Professeur Pascale B. Beauregard
Président-rapporteur
Département de biologie
iv
SOMMAIRE
Dans un contexte mondial de résistance aux antibiotiques, il est urgent de poursuivre la
recherche et le développement de nouvelles classes d’antibiotiques. La tomatidine (TO), un
alcaloïde stéroïdien issu de la tomate, est une molécule qui possède une activité antibiotique
contre le phénotype small-colony variant (SCV) des Bacillales. Ces variants sont
principalement caractérisés par la formation de colonies de petite taille, de leur croissance lente,
de leur production de biofilm accrue et par une réduction de la production d’exoenzymes et de
toxines. Toutefois, elle n’a pas d’activité contre les souches protoypes. Il a été montré
précédemment que la TO cible la sous-unité c de l’ATP synthétase et inhibe la production
d’ATP. Une synergie entre TO et la gentamicine (GEN), un aminoside, a également été
démontrée. Il demeure toutefois à déterminer par quel mécanisme TO est en mesure de tuer les
bactéries et la raison derrière la synergie observée.
Mon projet de maîtrise vise la compréhension des mécanismes d’action de ces antibiotiques afin
de permettre la suite des études précliniques. Dans un premier temps, l’hydrophobicité de
surface a révélé que les souches SCV résistantes à la TO sont moins hydrophobes. La TO étant
une molécule hydrophobe avec son corps stéroïdien, il est probable qu’une surface moins
hydrophobe limite les interactions et procure un certain niveau de résistance. Inversement, il a
été observé qu’une augmentation de l’hydrophobicité de la surface accompagne une légère
augmentation de la résistance à la combinaison TO-GEN chez les souches prototypes. Dans ce
dernier cas, comme il s’agit de souches prototypiques, elles sont naturellement résistantes à la
TO et posséder une haute hydrophobicité limiterait les interactions avec GEN qui est hydrophile.
Puisque TO cible l’ATP synthétase, et donc la chaîne de transfert des électrons (CTE), elle a un
impact sur le potentiel membranaire des souches cibles (SCV ou prototype), peu importe leur
niveau de résistance. Toutefois, on observe une inhibition de la croissance lorsque le potentiel
membranaire chute sous la barre des 2% du potentiel membranaire de la souche prototypique.
La combinaison TO-GEN n’affecte pas plus le potentiel membranaire, lorsque comparé à GEN
seulement. Par ailleurs, l’import d’aminoside est augmenté en présence de TO ce qui explique
v
la synergie entre TO et GEN. Finalement, TO et la combinaison TO-GEN induisent la
production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) à 4X la CMI pour les souches sensibles
seulement. Fait intéressant, GEN seule engendre une production significative de plus de ROS
qu’à partir de 8X la CMI. Ces observations ont permis de déterminer que TO agit sur les SCV
en inhibant le potentiel membranaire et en induisant la production de ROS. De plus, il a aussi
été possible d’établir la synergie observée entre TO et GEN est attribuable à une augmentation
de l’import des aminosides et une production importante de ROS.
Mots clés : Tomatidine, SCV, antibiotiques, Chaîne de transport des électrons, S. aureus,
aminoside, Espèces réactives de l’oxygène.
vi
REMERCIEMENTS
Je voudrais tout d’abord remercier mon directeur de recherche, François Malouin pour son
accueil dans son laboratoire lors de mes stages puis ma maîtrise. Il a toujours été de bon conseil
et m’a permis de me développer professionnellement.
Je voudrais aussi remercier mes conseillers, Pascale Beauregard et Viktor Steimle pour leur
implication dans le projet par leurs conseils et leur temps. Merci pour leurs protocoles et leur
savoir-faire technique.
Je remercie aussi Maxime Lamontagne-Boulet qui a été mon mentor durant mes stages et qui
m’a introduit au projet « tomatidine » au cours de sa maîtrise. Un gros merci aussi à tous les
membres du laboratoire, autant passé que présent, avec qui j’ai pu discuter des problèmes et
défis rencontrés. Ils m’ont été d’une grande aide autant technique que théorique. Je remercie
aussi Isabelle Guay qui m’a fourni les souches nécessaires à mon projet.
Ce projet n’aurait pu se dérouler sans le support financier de Fibrose Kystique Canada et du
CRSNG et l’implication de l’Université de Sherbrooke.
Finalement, je remercie ma famille qui a toujours cru en moi et pour leur support et
encouragement. Un merci particulier à ma conjointe pour sa compréhension et pour qui j’aurais
voulu être plus disponible.
vii
TABLE DES MATIÈRES
Sommaire .................................................................................................................................... iv
Remerciements ........................................................................................................................... vi
Liste des abréviations .................................................................................................................. x
Liste des tableaux ..................................................................................................................... xii
Liste des figures ....................................................................................................................... xiii
Chapitre 1 Introduction générale ................................................................................................. 1
1.1 Problématique de la résistance aux antibiotiques et l’importance de Staphylococcus aureus
................................................................................................................................................. 1
1.1.1 Présentation de la problématique ................................................................................ 1
1.1.2 Importance clinique de Staphylococcus aureus .......................................................... 1
1.2 Phénotypes de S. aureus et susceptibilité aux antibiotiques .............................................. 2
1.2.1 Particularités des small-colony variant ....................................................................... 2
1.2.2 Chaîne respiratoire ...................................................................................................... 4
1.2.3 Structure de l’ATP synthétase ..................................................................................... 5
1.2.3.2 Potentiel membranaire et génération de celui-ci .................................................. 8
1.2.4 Impacts de l’anaérobiose sur S. aureus ....................................................................... 9
1.3 Antibiotiques .................................................................................................................... 11
1.3.1 Les Aminosides ......................................................................................................... 11
1.3.1.1 L’utilisation clinique des aminosides ................................................................. 11
1.3.1.2 Mécanismes d’entrée des aminosides ................................................................. 13
1.3.2 Inhibiteurs de l’ATP synthétase ................................................................................ 16
1.3.3 La tomatidine............................................................................................................. 17
1.3.4 Mécanisme universel de bactéricidie ........................................................................ 18
viii
1.3.5 Hypothèses et objectifs de la recherche .................................................................... 23
Chapitre 2 .................................................................................................................................. 25
Mise en contexte .................................................................................................................... 25
Bactericidal activity of the combination of tomatidine and aminoglycoside against virulent
and persistent Staphylococcus aureus. ................................................................................... 27
Abstract .............................................................................................................................. 28
Introduction ........................................................................................................................ 29
Methods .............................................................................................................................. 31
Strains and growth conditions ........................................................................................ 31
Generation of S. aureus WT mutants resistant to the TO-gentamicin (TO-GEN)
combination .................................................................................................................... 33
Whole-genome sequencing, assembly, and annotation. ................................................. 33
Antibiotic susceptibility testing ...................................................................................... 34
Cell surface Hydrophobicity ........................................................................................... 34
Membrane potential measurement ................................................................................. 35
Reactive oxygen species (ROS) quantification .............................................................. 35
GEN uptake assay ........................................................................................................... 35
Time-kill kinetics ............................................................................................................ 36
Statistical analyses .......................................................................................................... 36
Results ................................................................................................................................ 36
Antibiotic susceptibility profiles .................................................................................... 36
TO and TO-GEN combination resistant strains exhibit a modified cell surface
hydrophobicity ................................................................................................................ 37
Membrane potential is reduced in presence of TO ......................................................... 39
ix
TO does not influence the membrane potential when combined with GEN .................. 40
TO increases GEN uptake .............................................................................................. 44
TO and the TO-GEN combination are bacteriostatic under anaerobic conditions ......... 45
Discussion .......................................................................................................................... 46
Conclusion .......................................................................................................................... 49
Funding............................................................................................................................... 50
Acknowledgements ............................................................................................................ 50
Transparency declarations .................................................................................................. 50
References .......................................................................................................................... 51
Chapitre 3 .................................................................................................................................. 57
Chapitre 4 .................................................................................................................................. 61
Conclusion générale .................................................................................................................. 61
Contributions supplémentaires .................................................................................................. 62
Annexe 1 : Article scientifique publié dans « Antimicrobiol Agents and Chemotherapy ».. 62
Bibliographie ............................................................................................................................. 64
x
LISTE DES ABRÉVIATIONS
GEN : gentamicine
TO : tomatidine
Cipro : ciprofloxacine
ROS : « reactive oxygen species », espèce réactive de l’oxygène
µg : microgramme
µl : microlitre
ml : millilitre
S. aureus : Staphylococcus aureus
SCV : Small-colony variant
UFC : Unité formatrice de colonies
CMI : concentration minimale inhibitrice
SARM : Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline
CTE : Chaîne de transport des électrons
Pi : Phosphate inorganique
ATP : Adénosine triphosphate
xi
ADP : Adénosine diphosphate
DCCD : N,N′-Dicyclohexylcarbodiimide
CCCP : Carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone
EDP : Energy-dependant phase
xii
LISTE DES TABLEAUX
Chapitre 2
Table 1. Strains used in this study and their antibiotic susceptibility profiles p.46
xiii
LISTE DES FIGURES
Chapitre 1
Figure 1 Différences entre S. aureus prototypique et SCV p. 17
Figure 2 Cytochrome, voies alternatives et inhibiteurs de la chaîne de
transport des électrons de S. aureus
p. 19
Figure 3 Structure et sous-unité de l’ATP synthétase bactérienne p. 21
Figure 4 La morphologie de S. aureus dépend entre autres de la disponibilité
de l’oxygène
p. 24
Figure 5 Structure de la gentamicine p. 26
Figure 6 Structure de l’ATP synthétase et site de liaison des inhibiteurs p. 30
Figure 7 Structure de la tomatidine p. 32
Figure 8 Schématisation de la production de ROS induite par les
antibiotiques et le mécanisme par lequel ils endommagent les
bactéries
p. 34
Chapitre 2
Figure 9 Surface hydrophobicity of S. aureus grown under anaerobic
conditions (C) in relation to TO or TO-GEN MICs
p.53
xiv
Figure 10 Membrane potential of (A) S. aureus Newbould and non-target
species in presence of TO. (B) S. aureus in presence of TO under
anaerobic conditions, (C) S. aureus ATCC 29213 and the
combination-resistant mutant membrane potential and (D) S. aureus
ATCC 29213 membrane potential in presence of GEN alone or in
combination with TO 8µg/ml.
p.56
Figure 11 ROS production in S. aureus induced by (A) tomatidine or (B) the
TO(8µg/ml)-GEN combination.
p.58
Figure 12 (A) GEN uptake by S. aureus ATCC 29213 and TO-GEN resistant
mutants over a 2h-period and (B) relative GEN uptake in presence
of TO 8µg/ml.
p.60
Figure 13 Kill kinetics of (A) S. aureus Newbould ΔhemB in presence of the
TO, and of (B) S. aureus Newbould in presence of TO-GEN
combination, under aerobic (colored lines) and anaerobic (black
lines) conditions.
p.62
1
CHAPITRE 1
INTRODUCTION GÉNÉRALE
1.1 Problématique de la résistance aux antibiotiques et l’importance de Staphylococcus
aureus
1.1.1 Présentation de la problématique
La résistance aux antibiotiques représentera une menace plus grande que le cancer d’ici 2050 et
sera responsable de la mort de millions de personnes. L’Organisation Mondiale de la Santé a
d’ailleurs identifié six pathogènes comme dangers immédiats, nommées ESKAPE, pour
Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter
baumannii, Pseudomonas aeruginosa, et Enterobacter spp, sont les principaux agents causals
des infections nosocomiales (Rice 2008; Santajit and Indrawattana 2016). Ces bactéries peuvent
acquérir des résistances aux antibiotiques de diverses façons. La première est directement liée
au traitement antibiotique. En effet, durant le traitement, il peut survenir des mutations
spontanées qui modifient la cible de l’antibiotique utilisé et ainsi rendent la bactérie plus
résistante. Cette bactérie est alors en mesure de croître dans un milieu autrement hostile et rend
le traitement inefficace. La seconde méthode de développement de la résistance aux
antibiotiques est par la transmission horizontale de gènes de résistance. Cette transmission peut
se faire par l’entremise de plasmides contenant les gènes ou par l’incorporation dans le génome
d’îlots de pathogénicité (Santajit and Indrawattana 2016; Lowy 2003).
1.1.2 Importance clinique de Staphylococcus aureus
S. aureus est un pathogène opportuniste qui affecte particulièrement les personnes avec une
immunité compromise. Il est aussi responsable de nombreuses infections nosocomiales. S.
aureus peut causer diverses pathologies dont des infections de la peau, des intoxications
alimentaires, des syndromes de chocs toxiques ainsi que des infections pulmonaires pour ne
2
nommer que celles-là (Tong et al. 2015). Il est d’ailleurs devenu le pathogène le plus prévalent
parmi les patients atteints de fibrose kystique, une maladie affectant la densité du mucus dans
les poumons et conséquemment l’efficacité du système immunitaire (“Cystic Fibrosis - 2015
Registry Annual Report”). Toutefois, une forme résistante de S. aureus a émergé et est
maintenant capable d’infecter des individus sains, S. aureus résistant à la méthicilline (SARM)
(Liu 2009). Cette souche est résistante aux β-lactames grâce à une mutation dans le gène mecA
qui est responsable de la synthèse de la penicillin binding protein 2a (Ubukata et al. 1989). De
plus, cette souche de S. aureus peut posséder de multiple résistance et devient donc un pathogène
très difficile à traiter et peut entraîner la mort des patients (David and Daum 2010; Kaur and
Chate 2015).
1.2 Phénotypes de S. aureus et susceptibilité aux antibiotiques
1.2.1 Particularités des small-colony variant
S. aureus peut aussi adopter deux phénotypes distincts lors d’une infection. Le premier
phénotype est dit prototypique et est associé avec la virulence normale de la bactérie. Le second
est le phénotype petite colonie, ou SCV (small-colony variant), qui est un phénotype de
persistance (Proctor et al. 2006). Ces SCV sont entre autres retrouvés chez les patients souffrant
d’infection chronique à S. aureus, comme c’est le cas chez les personnes atteintes de fibrose
kystique. Le premier phénotype est le prototype. C’est un phénotype standard au niveau de la
croissance. Il produira normalement ses facteurs de virulence, telle l’hémolysine-α, et ne
formera que peu de biofilm et n’aura pas tendance à vivre de façon intracellulaire (Novick 2003).
Les SCV sont tout le contraire des prototypes au niveau de leur phénotype. En effet, ils ne
produisent que peu d’exoenzymes et de toxines, ont une croissance plus lente, forment du
biofilm et ont tendance à s’internaliser dans les cellules de l’hôte (Fig. 1) (Mitchell et al. 2010;
Sendi and Proctor 2009; Proctor et al. 2006).
3
Figure 1. Différences entre S. aureus prototypique et SCV (modifié de Mitchell G. et Malouin
F., 2012)
Ce qui cause ces différences majeures est généralement une mutation dans un gène responsable
dans la biosynthèse de l’hémine ou de la ménadione. Ces gènes sont impliqués ultimement dans
la formation du cytochrome c ou des ménaquinones respectivement (von Eiff et al. 1997;
Clements et al. 1999). Certaines souches SCV récupérées sont aussi déficientes dans la synthèse
de la thymidine (Proctor et al. 2006). Dans le cas présent, les mutations ayant un impact sur la
CTE, sur la biosynthèse de l’hémine ou sur celle de la ménadione, sont les plus pertinentes.
Comme l’intégrité de la CTE, les SCV verront aussi leur potentiel membranaire diminué
grandement par rapport à la souche prototypique (Baumert et al. 2002; Miller et al. 1980). Il a
aussi été montré que ces souches produisent moins d’ATP (Lamontagne Boulet et al. 2018).
Pour ce qui est des impacts au niveau de la résistance aux antibiotiques, les SCV sont résistants
aux aminosides (Mitchell et al. 2011a). Finalement, en clinique, ce phénotype est souvent
retrouvé chez les patients fibrose kystique et est associé à la persistance de la bactérie dans les
poumons, même après un traitement antibiotique. De plus, comme ces patients sont traités en
4
prophylaxie avec la tobramycine, un aminoside, il y a sélection des SCV et donc persistance de
l’infection (Kahl et al. 2003; Cystic Fibrosis - 2015 Registry Annual Report).
1.2.2 Chaîne respiratoire
La CTE chez S. aureus est composée de complexes, variables selon les conditions
environnementales, qui ont comme fonction de générer un potentiel membranaire par
l’exclusion de cations ou de transférer des électrons (Hammer et al. 2013; Voggu et al. 2006).
L’accepteur final d’électron sera l’oxygène, lorsqu’il est présent. La respiration aérobie sera
préférée par S. aureus puisqu’elle est plus rentable énergétiquement que la fermentation, utilisée
en anaérobiose (Hammer et al. 2013). Les premiers et deuxièmes complexes sont composés de
déshydrogénases. Le premier est la NADH déshydrogénase de type II couplé avec la protéine
MpsABC, qui est une pompe à proton. Chez S. aureus, la NADH déshydrogénase ne possède
pas la partie transmembranaire qui permet normalement à la NADH déshydrogénase de type I
d’oxyder le NADH et de pomper le proton résiduel à la fois (Sena et al. 2015). Le complexe II
est une succinate déshydrogénase. Elle permet de transformer le succinate en fumarate et de
léguer un électron à une ménaquinone (Cook et al. 2014). D’ailleurs, chez S. aureus, tout comme
pour les autres bactéries à Gram positif, les seules quinones retrouvées sont des ménaquinones.
Chez les bactéries à Gram négatif, on retrouve à la fois des ménaquinones et des ubiquinones
(Somerville and Proctor 2009; Shibata and Kobayashi 2001). Les ménaquinones sont des
transporteurs d’électrons mobiles qui permettent le transit entre les déshydrogénases, les
cytochromes et finalement à l’oxygène lors de la synthèse de l’ATP (Zamboni and Sauer 2003).
Le complexe III n’est pas le cytochrome oxydase c comme c’est le cas chez les bactéries n’ayant
pas de chaîne de transport branché comme S. aureus. Le complexe III est plutôt composé
d’autres cytochromes et transporteurs d’électrons qui sont parfois associés à des molécules plus
grosses et moins mobiles. Il existerait un cytochrome o (à confirmer) qui constituerait le
complexe IV dans la CTE. Toutefois, il y aurait deux voies de contournement. La première est
constituée du cytochrome oxydase aa3 (QoxABCD). Cette voie contourne le cytochrome o et
permet d’oxyder l’oxygène directement. La seconde voie débute avec les ménaquinones et
contourne le cytochrome c pour oxyder directement l’oxygène. Le cytochrome oxydase bd
5
(cydAB) est le principal constituant de cette voie. Finalement, la CTE se termine par l’ATP
synthétase qui permet de faire entrer les protons précédemment expulsés pour former une
molécule d’ATP et de réduire l’oxygène en eau (Fig. 2) (Voggu et al. 2006; Götz, Bannerman,
and Schleifer 2006; Taber and Morrison 1964; Thöny-Meyer 1997).
Figure 2. Cytochrome, voies alternatives et inhibiteurs de la chaîne de transport des
électrons de S. aureus (modifié de Mayer et al. 2015)
1.2.3 Structure de l’ATP synthétase
La structure de l’ATP synthétase bactérienne est composée de 2 fractions majeures. La fraction
soluble dans l’eau, F1, et la fraction qui s’ancre dans la membrane, Fo. La partie F1 est composée
des sous-unités α3β3γδε et la partie Fo des sous-unités ab2c10 (Gupta et al. 2014). Une autre
distinction possible à faire dans l’ATP synthétase est la partie du stator et la partie du rotor. Le
stator est responsable d’éviter la co-rotation du rotor et du site catalytique. Il est composé des
sous-unités α3β3δab2 (Ahmad and Laughlin 2010; Weber 2006; Senior, Nadanaciva, and Weber
2002). Le rotor permet un changement conformationnel de la sous-unité F1 et du site catalytique
ce qui permet la formation d’ATP et est composé des autres sous-unités, soit γεc10 (Fig. 3)
(Yoshida, Muneyuki, and Hisabori 2001). De façon plus précise, dans le stator, la sous-unité α
est une sous-unité de régulation en arrangement successif avec la sous-unité β. Cette structure
hexagonale est composée de 3 sous-unités α et 3 β successives et forme 3 sites catalytiques de
Complexe I Complexe II Complexe III
6
liaison d’un nucléotide. Les trois sites sont nommés βTP, βDP, βE et sont responsables
respectivement de la liaison à l’ATP, à l’ADP et au Pi (Leslie and Walker 2000). Les sous-
unités δ et b2 s’assemblent pour former la tige périphérique et maintenir la structure formée par
les sous-unités α3β3 avec la sous-unité a (Weber 2006). La dernière partie du stator est composé
de la sous-unité a qui est la portion statique de la machinerie de translocation du proton au
travers la membrane (Rastogi and Girvin 1999).
Le rotor est composé de la sous-unité γ. Cette partie mobile change de conformation lors du
passage d’un proton et permet le changement dans l’angle de la sous-unité β (Ahmad and
Laughlin 2010). Cela permet séquentiellement d’exposer le Pi, puis de mettre l’ADP et le Pi en
contact. Finalement dans le la partie βTP l’ATP est relarguée. Chaque changement de
conformation requiert un proton et un tour complet est fait à l’aide de 4 protons (Kustos et al.
2003)ku. La sous-unité ε est essentielle à l’assemblage de la partie Fo avec la partie F1 (Feniouk,
Suzuki, and Yoshida 2006). La sous-unité c est la partie formant le rotor de l’enzyme. La
rotation commence par cette structure composée de 12 sous-unités c pour former un baril. Le
résidu Asp 61 de la sous-unité c est en contact avec la sous-unité a et perd alors son proton.
Cette forme déprotonée de l’Asp 61 subira un changement conformationnel qui permettra
d’attacher un proton provenant de l’extérieur de la cellule. Le proton pourra entrer en contact
avec l’Asp61 grâce au gradient de proton de part et d’autre de la membrane cytoplasmique. Une
fois l’Asp 61 protoné, il y aura un autre changement conformationnel qui produira une rotation
de cette sous-unité, et par conséquent l’assemblage du rotor. La nouvelle sous-unité c qui entrera
en contact avec la sous-unité a sera déprotonée et ainsi de suite (Rastogi and Girvin 1999).
Pour récapituler, un proton entrera en contact avec le résidu déprotoné Asp 61 de la sous-unité
c. Cela entraînera un changement de conformation et une rotation de celle-ci. Une nouvelle sous-
unité c entrera en contact avec la sous-unité a et le résidu Asp 61 de la première sous-unité sera
déprotonée. Ce proton sera ensuite transloqué vers la sous-unité γ. Cette dernière fera une
rotation partielle et entraînera l’ouverture de la section βP de l’hexamère α3β3. Un second proton
fera encore tourner la sous-unité γ et refermera partiellement la section βP et ouvrira
partiellement la section βDP. Cela permettra le contact entre le Pi et l’ADP. Un troisième proton
7
transloquera le Pi et l’ADP dans la troisième section βTP où l’ATP sera formée. Finalement un
quatrième proton expulsera l’ATP et restaurera l’état initial de l’hexamère α3β3. Avec les
protons entrés dans la cellule, une molécule d’eau sera formée grâce à la molécule d’O2 oxydé
avec 2 électrons issus de la CTE (Fig. 3).
Figure 3. Structure et sous-unité de l’ATP synthétase bactérienne (modifié de Yoshida,
Muneyuki, and Hisabori 2001)
Par contre, il reste beaucoup à apprendre sur la chaîne respiratoire particulière de S. aureus.
L’ATP synthétase décrite est celle d’Escherichia coli et il est assumé qu’elle représente un bon
modèle pour l’ATP synthétase bactérienne. Au moment d’écrire ce mémoire, il n’y avait pas
encore de structure cristal disponible de l’ATP synthétase pour S. aureus. Il nous reste aussi à
découvrir comment S. aureus est en mesure de générer et conserver l’activité de sa CTE, et par
conséquent son potentiel membranaire, en condition anaérobie. La structure et l’organisation de
la CTE restent aussi mystérieuses, en particulier en ce qui a trait aux cytochromes et à ses voies
alternatives. Par exemple, il reste encore à déterminer s’il y a ou non un cytochrome oxydase o
comme oxydase terminale.
H2O ← O2 + 4
8
1.2.3.2 Potentiel membranaire et génération de celui-ci
Afin de générer de l’ATP, la bactérie a besoin d’une force proton motrice qui permettra l’entrée
de protons dans la cellule via l’ATP synthétase. La force proton motrice (Δp) peut être disséquée
en deux parties, soit le gradient de proton (ΔpH) et le potentiel membranaire (ΔΨ). La force
proton motrice peut être calculée selon la formule suivant : 𝛥𝑝 = 𝛥𝛹 + 2.3𝑅𝑇/𝐹𝛥𝑝𝐻; Où R
est la constante des gaz, T la température absolue et F la constante de Faraday. Chez les
bactéries, le pH intracellulaire est hautement contrôlé. Cela leur permet de prospérer sur une
vaste gamme de pH environnementaux. Aussi, en l’absence d’un potentiel membranaire, il n’y
a pas de génération d’ATP par l’ATP synthétase. C’est pourquoi, le gradient de proton est
généralement ignoré lorsque l’on parle de la force proton motrice. Pour cette raison, la section
suivante traitera du potentiel membranaire en assimilant la notion de force proton motrice
(Dimroth, Kaim, and Matthey 2000).
Les rôles du potentiel membranaire sont multiples chez les bactéries. Par exemple, un groupe a
démontré que le potentiel membranaire influe directement sur la division cellulaire en modulant
la distribution cellulaire de protéines comme minD et ftsA (Strahl and Hamoen 2010). Comme
S. aureus possède un NADH déshydrogénase de type II, il lui faut deux protéines distinctes pour
oxyder le NADH, en provenance du cycle de Krebs, et exporter le proton produit de la bactérie.
La protéine qui sert à l’exclusion du proton est le complexe MpsABC. La partie MpsA est la
partie transmembranaire qui transloque le proton vers l’extérieur. MpsB est la partie
cytoplasmique et possède un domaine de liaison aux métaux. La dernière partie MpsC est encore
de fonction inconnue. Ce domaine protéique est aussi en mesure de transporter d’autres cations,
tel Na+, vers l’extérieur de la cellule. Cela permet entre autres de maintenir et de contrôler à la
fois le potentiel membranaire et le gradient de proton de part et d’autre de la membrane
cytoplasmique. Le groupe ayant décrit ce complexe a prouvé l’importance de ce domaine en
faisant la mesure du potentiel membranaire de mutant de MpsABC. Ils ont découvert qu’en
l’absence de celui-ci, le potentiel membranaire était réduit de plus de la moitié. Plus en aval de
la CTE, ils ont constaté que la consommation d’oxygène était grandement diminuée, ce qui
indiquerait un ralentissement de l’activité de l’ATP synthétase et que, par conséquent, l’absence
9
de ce complexe induit un phénotype ressemblant à celui d’un SCV (Mayer et al. 2015). S. aureus
est aussi en mesure d’expulser des protons avec la réduction d’une ménaquinone en ménaquinol.
Lors de la réoxydation du ménaquinol, les deux protons impliqués dans sa réduction seront
envoyés vers l’extérieur de la cellule.
Finalement, les cytochromes jouent aussi un rôle dans la translocation de certains cations, aidant
ainsi à conserver et générer un potentiel membranaire adéquat (Thöny-Meyer 1997). Bref, le
potentiel membranaire est essentiel chez les bactéries afin de produire l’ATP étant donné que le
gradient de proton est strictement contrôlé pour survivre à des variations de pH. C’est pourquoi
S. aureus possède plusieurs voies pour réguler à la fois le gradient de proton et le potentiel
membranaire via l’expulsion de proton ou de divers cations.
1.2.4 Impacts de l’anaérobiose sur S. aureus
Comme S. aureus est une bactérie anaérobie facultative, elle est en mesure d’adapter son
métabolisme à l’absence d’oxygène. Cela vient au coût d’une certaine efficacité puisque la
bactérie ne pourra plus se fier à son système le plus efficace pour régénérer de l’énergie, soit la
CTE avec l’oxygène comme accepteur final d’électrons (Hammer et al. 2013). Cela aura donc
pour effet qu’une souche au phénotype prototypique adoptera un phénotype semblable au SCV
(Fig. 4).
10
Figure 4. La morphologie de S. aureus dépend entre autres de la disponibilité de l’oxygène.
Phénotypes de S. aureus NewbouldΔhemB (A) et S. aureus Newbould (B) en aérobie et de S.
aureus NewbouldΔhemB (C) et S. aureus Newbould (D) en anaérobie
Un groupe a étudié la transcriptomique de S. aureus en absence d’oxygène (Fuchs et al. 2007).
Ils se sont principalement intéressés aux gènes liés à la génération d’énergie. Les gènes du
métabolisme en présence d’oxygène, comme la pyruvate déshydrogénase, ont été, sans surprise,
moins exprimés puisque ces réactions sont dépendantes de la présence d’oxygène. Ils ont
également observé la surexpression des gènes liés à la fermentation, comme la lactate
déshydrogénase ou les importés d’acides aminés et de peptides (Nakano, Zuber, and Sonenshein
1998; Proctor et al. 2014).
11
1.3 Antibiotiques
1.3.1 Les Aminosides
1.3.1.1 L’utilisation clinique des aminosides
Les aminosides, que l'on appelle également des aminoglycosides, sont des antibiotiques à large
spectre (“Aminoglycosides - Infectious Diseases - Merck Manuals Professional Edition”). Le
premier antibiotique de cette classe à être découvert a été la streptomycine. En effet, suite à la
découverte de la pénicilline et sa production de masse lors de la Seconde Guerre mondiale, il y
a eu un grand intérêt pour le développement de nouveaux antibiotiques afin de répondre au
besoin grandissant (Renneberg et al. 2008; Torok, Moran, and Cooke 2009). Les
microorganismes du sol en furent la principale source. L'équipe de Waksman (Waksman and
Woodruff 1941) qui étudiait les actinomycètes a isolé une souche ayant la capacité de produire
un composé qui inhibait la croissance des bactéries en empêchant la synthèse protéique (Murray,
Schraufnagel, and Hopewell 2015). De façon plus générale, les aminosides sont composés d’un
sucre avec des groupements amines (-NH2) liés à un glycoside et sont chargés positivement (Fig.
5) (Mingeot-Leclercq, Glupczynski, and Tulkens 1999).
12
Figure 5. Structure de la gentamicine (PubChem -https://pubchem.ncbi.nlm.nih.go )
Les aminoglycosides sont utilisés en clinique pour plusieurs types d’infections. Ils sont utilisés
dans les cas de pneumonie, septicémie, infections urinaires graves et d’infections de la peau, par
exemple. En bref, il est indiqué de les administrer dans les cas d’infections par des bactéries
aérobies. Ils peuvent être appliqués de façon topique ou injecté intra musculairement ou par voie
intraveineuse. De plus, comme ces antibiotiques ne sont pas absorbés par les intestins, ils
peuvent être utilisés dans les cas d’infections du tractus digestif. Dans les cas d’infections plus
sévères, ils peuvent être combinés à un antibiotique fragilisant la synthèse de la paroi cellulaire,
comme les β-lactames, ces derniers facilitant l’accès à la membrane cytoplasmique pour les
aminosides (Krause et al. 2016). Les aminosides ne sont toutefois pas sans effets secondaires.
L’effet le plus fréquent est la néphrotoxicité qui découle directement de la charge positive de
l’antibiotique. Il y a une liaison entre les membranes, chargées négativement, des cellules des
tubules proximaux dans les reins. Les aminosides sont alors en mesure d’entrer dans les cellules
et de s’accumuler dans le cytoplasme. Cela cause ultimement une production de radicaux libres
et une dysfonction des mitochondries (Oliveira, Cipullo, and Burdmann 2006). Afin de suivre
l’évolution de l’atteinte rénale, des échantillons de sang sont pris régulièrement au cours du
traitement afin de vérifier le taux de filtration glomérulaire via le dosage de la créatine et l’urée.
13
La présence de plus de protéine dans les urines est un indicateur de la néphrotoxicité (Gerlach
et al. 2011). Le deuxième effet secondaire d’importance est l’ototoxicité des aminosides.
L’atteinte vestibulaire est réversible, mais l’atteinte auditive ne l’est pas. Les aminosides
persistent dans le sérum pour 2 à 3 heures, mais dans les muscles, il peut y avoir persistance
pour des semaines, voire des mois. Tout comme dans le cas de la néphrotoxicité, les cellules
foliaires sont sujettes à la destruction par les aminosides et les radicaux libres qu’ils engendrent.
La perte de l’audition permanente est causée par un dérangement de la liaison entre les poils
cochléaires et les neurones afférents via une stimulation du récepteur NMDA. Ces récepteurs
sont situés sur les poils cochléaires et sont responsables de la mémoire et de la plasticité
synaptique (Leis, Rutka, and Gold 2015; Hiel et al. 1992). De façon plus rare, il peut y avoir un
blocus musculaire. Toutefois, cet effet secondaire n’est fréquent que chez les patients atteints
de myasthénie, une maladie auto-immunitaire neuromusculaire. Les premières manifestations
sont une faiblesse musculaire et respiratoire. Les aminosides bloquent les canaux calciques
voltage-dépendant des neurones moteurs. Cet effet peut être remédié avec des injections IV de
calcium (Prayle et al. 2010; Paradelis et al. 1988; Parsons, Obaid, and Salzberg 1992).
1.3.1.2 Mécanismes d’entrée des aminosides
La cible des aminosides, le ribosome 30S, se situe à l’intérieur de la cellule bactérienne. Les
aminosides causent des défauts dans la transcription des protéines, bloquent leur synthèse ou
brisent les polysomes (Chang and Flaks 1972). De façon intéressante, les aminosides possèdent
un fort effet post-antibiotique, c’est-à-dire qu’ils conservent leur action antibactérienne malgré
des taux sériques sous les concentrations minimales inhibitrices grâce à leur fort lien avec le
ribosome (Isaksson et al. 1993, 1988). Mais tout d’abord, il faut donc que l’antibiotique pénètre
les défenses physiques qui protègent la bactérie de son environnement. La structure des couches
de la surface de la bactérie est à l’origine de la résistance et susceptibilité naturelle aux
aminosides. Chez les bactéries à Gram positif, il faudra donc passer le peptidoglycane, plus
épais que chez les bactéries à Gram négatif, et la membrane interne. Pour les bactéries à Gram
négatif, il y aura 2 membranes, externe et cytoplasmique, séparées par une couche de
peptidoglycane, plus mince que chez les bactéries à Gram positif. Pour les bactéries à Gram
14
négatif, la membrane externe est poreuse face aux molécules chargées (Hancock et al. 1991).
Les aminosides, molécules chargées positivement, sont alors en mesure de pénétrer cette
première barrière à l’aide d’une voie dite hydrophile par l’intermédiaire de pores d’eau chargés
(Taber et al. 1987). Ces porines laissent passer les molécules de petite taille. Par exemple, des
molécules qui sont plus petites que 600-650g/mol pour les Entorobacteriacea (Nikaidos 1994;
Hancock et al. 1991). La GEN fait 477g/mol et la streptomycine, 581g/mol. Il est donc possible,
pour ces deux aminosides, de pénétrer la membrane externe grâce à ces porines. Elles font le
lien et permettent le passage de molécules entre la membrane externe et le peptidoglycane en
étant associé à des lipoprotéines de Braun, qui sont ancrés dans le peptidoglycane, ou des
complexes protéiques liés au peptidoglycane. De plus, cette voie d’entrée de la première barrière
est indépendante de la structure du LPS. Le peptidoglycane ne procure pas de défense efficace
contre les aminosides, mais un affaiblissement de ce dernier par des β-lactames, par exemple,
peut accroître l’efficacité des aminosides. Pour les bactéries à Gram positif, la charge positive
des aminosides déplace les ions Mg2+ associés à l’acide téichoïque et permet un accès au
peptidoglycane. L’hypothèse selon laquelle le rôle moins prépondérant du peptidoglycane dans
l’entrée des aminosides dans les bactéries est renforcé par le fait que les bactéries à Gram négatif
ne sont généralement qu’un peu plus sensibles aux aminosides que les bactéries à Gram positif
(“Practical Antimicrobial Therapeutics” 2017). Finalement, la dernière défense, commune aux
bactéries à Gram négatif et positif, est la membrane cytoplasmique. L’antibiotique est en mesure
de traverser cette membrane grâce au gradient de proton généré par la CTE (Dianne, And, and
Epstein 1981).
L’entrée des aminosides dans les cellules bactériennes se fait en trois étapes. La première phase,
décrite en partie dans la section précédente, est la phase ionique. C’est une phase qui est
indépendante de l’énergie. Cette phase se produit presque instantanément suite à l’ajout de
l’antibiotique. Chez les bactéries à Gram négatif, la liaison se fait grâce aux lipopolysaccharides,
l’extrémité polaire des phospholipides et des protéines de la membrane externe. Par la suite,
pour son entrée dans le périplasme l’antibiotique suivra la voie hydrophile, décrite dans la
section précédente. Dans le cas des bactéries à Gram positif, c’est plutôt les extrémités polaires
des phospholipides et l’acide téichoïque qui servent d’attache initiale aux aminosides. La liaison
15
à l’acide téichoïque se fait en déplaçant les ions magnésium (Davis 1987; Ramirez and
Tolmasky 2010; Taber et al. 1987; Krause et al. 2016).
La deuxième partie de l’entrée des aminosides est dépendante de l’énergie, nommée « energy-
dependant phase I, EDPI ». Cette phase nécessite une CTE fonctionnelle ainsi que les processus
associés à la phosphorylation oxydative. Les bactéries deviennent résistantes à cette phase
lorsqu’elles sont en présence d’un inhibiteur de ces voies (Krause et al. 2016). C’est d’ailleurs
le cas chez les SCV de S. aureus. Comme celle-ci sera inhibée, cela causera une résistance aux
aminosides. L’EDPI représente donc le passage initial des aminosides au travers de la membrane
cytoplasmique. Cette entrée est en lien avec le potentiel membranaire et se fait par
l’intermédiaire de canaux membranaires non spécifiques et possiblement grâce aux quinones
membranaires. Une autre voie d’entrée serait via les imperfections membranaires créées lors de
la division cellulaire. Par contre, cette voie ne permet qu’à une quantité limitée d’aminosides de
franchir la membrane cytoplasmique (Taber et al. 1987; Davis 1987).
La dernière phase d’entrée des aminosides est la phase « energy-dependant phase II, EDPII ».
C’est une phase où l’entrée des aminosides est accélérée par rapport à la phase I. Plus
précisément, cette phase requiert l’hydrolyse de l’ATP, mais une certaine quantité d’aminosides
est tout de même en mesure de franchir la membrane cytoplasmique en suivant un gradient de
concentration. Plusieurs modèles ont été proposés pour expliquer la hausse d’entrée
d’aminosides, mais un modèle est le plus probable. Selon ce modèle, lors de la phase I, les
aminosides se lient aux ribosomes et causent des défauts dans la traduction des protéines. Parmi
ces protéines mal traduites ou tronquées, certaines se retrouvent à la membrane. Cela causera
une augmentation de la perméabilité membranaire progressive et facilitera l’import des
aminosides. Les protéines mal traduites agiront à titre de canaux non spécifiques. Ainsi,
l’importation d’aminosides sera augmentée au fur et à mesure que les défauts de traduction
auront lieu. L’accumulation des défauts conduira ultimement à la perte de l’intégrité
membranaire et à la mort de la bactérie (Taber et al. 1987).
16
1.3.2 Inhibiteurs de l’ATP synthétase
Comme l’ATP synthétase est la source d’énergie la plus commune parmi les organismes vivants,
les inhibiteurs de cette enzyme seront donc très délétères pour ceux-ci. Les cinq principales
cibles de ces inhibiteurs sont les sous-unité c, a, α et β (Fig. 6).
Figure 6. Structure de l’ATP synthétase et site de liaison des inhibiteurs. (Hong and
Pedersen 2008)
La sous-unité β peut être inhibée par la citréoviridine. Cette molécule est produite par les
moisissures du genre Penicillium et Aspergillus. La citréoviridine est un inhibiteur non
compétitif pour la synthèse d’ATP et l’hydrolyse de l’ATP, dans le cas où l’organisme cherche
à générer un potentiel membranaire plus grand (Gauses, Buck, and Douglas8 1981; Satre, Bof,
17
and Vignais 1980). Cependant, le mécanisme d’action exact n’est pas encore décrit. Tout près,
à l’interface des sous-unité α et β se situe le site de liaison de l’efrapeptine. C’est un inhibiteur
compétitif de la synthèse d’ATP qui se lie au site de liaison de l’ADP. La liaison entre l’ATP
synthétase et l’inhibiteur est stabilisé avec la formation de deux ponts hydrogène. Cela empêche
donc l’adhésion et la phosphorylation de l’ADP (Gene et al. 1984; W Leslie et al. 1999; Arakaki
et al. 2003).
La sous-unité a, elle, est inhibée par les composés organostanniques. Ce sont des inhibiteurs
compétitifs qui se lient au site de liaison des cations Na+ et H+ (von Ballmoos, Brunner, and
Dimroth 2004; Yagi and Hatefi 1984).
Finalement, la sous-unité c est inhibée par le DCCD, l’oligomycine et le nouvel antibiotique
ciblant Mycobacterium tuberculosis, la bedaquiline. Le DCCD se lie de façon covalente au
résidu carboxyle à la position 61 d’une des 10 sous-unités c assemblées qui forment le rotor. La
molécule bloque le passage des protons en empêchant le mouvement rotatoire des sous-unités.
Le rotor bloque après une rotation seulement. Le mouvement ainsi arrêté, inhibera le transfert
des protons au travers le complexe et la synthèse d’ATP et augmentera le potentiel membranaire
(Toei and Noji 2013; Miller et al. 1980). Un autre inhibiteur, l’oligomycine, est synthétisé par
Nocardiopsis spp. et quelques espèces de Streptomyces. Il bloque le transit de proton en se liant
à la partie Fo de l’ATP synthétase (Hong and Pedersen 2008). Finalement, un antibiotique
ciblant spécifiquement l’ATP synthétase de Mycobacterium tuberculosis a été développé (Hards
and Cook 2018). Bref, cette liste n’est pas exhaustive, mais elle montre qu’il existe plusieurs
sites pour l’inhibition de l’ATP synthétase et qu’il existe un potentiel pour le développement
d’antibiotiques sélectifs pour cette cible.
1.3.3 La tomatidine
La TO est un alcaloïde stéroïdien (Fig. 7) dont l’activité antimicrobienne a été mise en lumière
par les laboratoires des professeurs Malouin, Bouarab et Marsault à l’Université de Sherbrooke
(Malouin et al. 2014).
18
Figure 7. Structure de la tomatidine (Lamontagne Boulet et al. 2018)
Cette molécule est le dérivé aglycone de l’α-tomatine, un antifongique produit naturellement
par les tomates. Plusieurs espèces de champignons, dont Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici,
clivent l’α-tomatine en un tétrapeptide et en TO, inefficace contre les champignons. La TO est,
quant à elle, seulement efficace contre la forme SCV des bactéries de l’ordre des Bacillales,
dont fait partie S. aureus et Bacillus subtilis, sans avoir d’impact sur la croissance des bactéries
possédant un phénotype prototypique. Plus spécifiquement, la TO se lie à la sous-unité c de
l’ATP synthétase. Le gène codant pour la sous-unité c de l’ATP synthétase des Bacillales est
très conservé parmi ceux-ci, mais des différences notables sont présentes lorsque l’on compare
ce gène avec d’autres bactéries à Gram positif ou négatif. Les différences sont aussi très grandes
lorsque l’on compare avec l’ATP synthétase mitochondriale. Une étude précédente a permis
d’élucider une partie du mode d’action de la TO. Il a été démontré que la liaison à la sous-unité
c de l’ATP synthétase réduisait la production d’ATP. Le manque d’énergie dans la bactérie
pourrait expliquer la baisse observée dans la synthèse des protéines et autres macromolécules.
Toutefois, S. aureus est en mesure de fermenter différentes sources de carbone et ne devrait pas
dépendre de la production d’ATP par la CTE. De plus, une synergie a été observée entre la TO
et les aminosides. Le mécanisme par lequel cette synergie opère demeure un mystère (Mitchell
et al. 2011b; Lamontagne Boulet et al. 2018; Boulanger et al. 2015; Guay et al. 2018).
1.3.4 Mécanisme universel de bactéricidie
Les espèces réactives de l’oxygène (ROS) sont des métabolites normalement formés par
l’activité de la CTE, autant chez les procaryotes que les eucaryotes (Devasagayam et al. 2004).
19
Les trois principales molécules considérées pour les dommages oxydatifs causés par un
traitement antibiotique chez les bactéries sont le superoxyde (O2-), le peroxyde (H2O2) et les
radicaux hydroxyles (OH•) (Hayyan, Hashim, and AlNashef 2016). Ces molécules sont
particulièrement importantes à gérer pour tous les organismes vivants exposés à l’oxygène
puisqu’elles ont la capacité d’oxyder les structures cellulaires et les macromolécules essentielles
à la survie de l’organisme (Devasagayam et al. 2004; Sosa Torres, Saucedo-Vázquez, and
Kroneck 2015). Chez les bactéries aérobies utilisant leur CTE, les ROS sont principalement
produits à deux endroits (Vinogradov and Grivennikova 2016). Le premier est l’ATP synthétase
qui réduit l’oxygène en eau tout en formant une molécule d’ATP. Toutefois, il arrive qu’un
électron seul passe la membrane et oxyde une molécule d’oxygène en doublet (O2) pour former
le superoxyde. La probabilité que cet évènement survienne n’est pas connue précisément, mais
il est estimé qu’environ 0,2-2% des électrons traversent la membrane chez les mitochondries,
dans un modèle in vitro. Le superoxyde est d’ailleurs le précurseur des autres ROS, et le moins
réactif (McBee et al. 2017). Le deuxième complexe où les ROS sont produits est le complexe I.
Plusieurs bactéries possèdent une NADH déshydrogénase de type I qui combine l’action
d’oxydation du NADH en NAD + H+ et pompe le proton à l’extérieur de la cellule (Vinogradov
and Grivennikova 2016). D’autres bactéries, comme S. aureus, doivent utiliser deux protéines
distinctes pour faire cette tâche. La première est une NADH déshydrogénase de type II et la
seconde est une pompe à proton, MpsA (Mayer et al. 2015). Avec les protons libres et le
superoxyde formé par la fuite d’électrons, il peut y avoir formation de peroxyde (2 O2- + 2H+
→ H2O2+ O2). Toutefois, en présence de fer, une troisième réaction peut se produire. Le
peroxyde nouvellement produit réagit avec un ion ferrique (Fe2+). La réaction produit alors un
ion hydroxyle, qui est particulièrement délétère pour les bactéries, avec les réactions suivantes :
Fe2+ + H2O2 →Fe3+ + OH• + OH- (Turrens 2003; Vinogradov and Grivennikova 2016; Van
Acker et al. 2016).
Les ROS sont dangereux pour les bactéries de par leur nature hautement réactive. Ils peuvent
causer d’importants dommages aux lipides membranaires, à l’ADN et aux protéines (Belenky
et al. 2015).
20
Figure 8 : Schématisation de la production de ROS induite par les antibiotiques et le
mécanisme par lequel ils endommagent les bactéries (Van Acker and Coenye 2017)
Les lipides peuvent être endommagés par peroxydation, c’est-à-dire le remplacement d’un
groupement méthyle par un groupement aldéhyde réactif. Ces dommages se font en trois étapes
principales, soit l’initiation, la propagation et la terminaison. Tout d’abord, un radical hydroxyle
donne son électron de surplus à un acide gras polyinsaturé de la membrane pour former un acide
gras radical. Par la suite, l’acide gras radical réagit avec l’oxygène et peut propager son état aux
21
acides gras adjacent. Si ce n’est pas pris en charge par la cellule, toute la membrane sera à risque.
Enfin, l’étape de terminaison a lieu lorsque deux lipides radicaux entrent en contact et se
stabilisent en formant un aldéhyde réactif comme le malondialdéhyde ou l’hydroxynonenal. Ces
aldéhydes réagissent avec la désoxyadénosine et la désoxyguanosine et causent des dommages
potentiellement létaux à la bactérie. De plus, les lipides peroxydés ont tendance à diminuer
l’étanchéité de la membrane (Ayala, Muñoz, and Argüelles 2014; Marnett 1999). Les
dommages causés à l’ADN et à l’ARN par les ROS sont principalement dus à l’oxydation des
guanines en 8-oxo-dGTP. Les dommages à l’ADN sont réparés rapidement par la cellule, mais
si trop de guanines sont oxydées, des mutations peuvent alors se produire. Une autre
conséquence possible de la présence de 8-oxo-dGTP dans l’ADN est la mauvaise transcription
des gènes ce qui causera des défauts dans la traduction des protéines. L’ADN est composé de 2
brins et la réparation des lésions peut se faire en se basant sur le modèle du brin non endommagé.
Cependant, lors de dommages oxydatifs sur l’ARN, il n’y a pas de modèle sur lequel la
réparation peut se faire. De ce fait, les dommages à l’ARN sont plus délétères dans l’immédiat
pour les cellules puisque les protéines sont à risque d’être mal traduites (Foti et al. 2012; Hofer
et al. 2006; Z. Li, Wu, and DeLeo 2006; Burrows and Muller 1998). Les protéines peuvent aussi
être affectées par les ROS. Elles peuvent être carbonylées ou elles peuvent tout simplement être
inactivées par l’oxydation de certains cofacteurs. La carbonylation est une réaction où il y a
formation de cétone ou aldéhyde réactifs sur les chaînes latérales des protéines avec des résidus
de cystéines, lysine et histidine plus particulièrement. Ces modifications sont irréversibles et
sont très nocives pour la cellule bactérienne qui ne pourra plus effectuer l’ensemble de ses
fonctions métaboliques correctement, dont la réparation des autres dommages causés par les
ROS. Le taux de carbonylation des protéines est aussi utilisé pour déterminer l’ampleur des
dommages oxydatifs subis par une bactérie à la suite d’un stress ou d’un traitement antibiotique
(Fedorova, Bollineni, and Hoffmann 2014).
Les bactéries aérobies, ou du moins habituées à la présence de l’oxygène, sont toutefois bien
adaptées à gérer ces déchets toxiques, produits secondaires de la respiration. La première
enzyme est la superoxyde dismutase qui sert à détoxifier le superoxyde. Le principe général de
la réaction implique la réduction du superoxyde par un métal. Les trois métaux utilisés chez les
22
bactéries sont le fer, le cuivre et le manganèse. La réaction générale est la suivante : M(n+1)+-
SOD + O2- → Mn+-SOD + O2 où M représente un des métaux mentionnés plus haut, n le nombre
de charge positive que possède ce métal et SOD représente la superoxyde dismutase. Toutefois,
en présence de proton et pour régénérer le nombre d’électron initial du métal, la réaction
suivante pourrait avoir lieu : Mn+-SOD + O2- + 2H+ →M(n+1)+-SOD +H2O2. Cela permettra de
régénérer le nombre d’électrons initial du métal, mais produira une molécule de peroxyde qui
devra être détoxifiée à son tour (Steinman 1988; Tainer et al. 1983). Ici entre en jeux la
deuxième enzyme de détoxification des ROS, la catalase. Cette enzyme transforme le peroxyde
en eau et en oxygène (O2) (Chelikani, Fita, and Loewen 2004). Ces deux enzymes sont
primordiales pour la survie des bactéries qui sont en contact avec l’oxygène, mais s’il y a trop
de ROS produits, la bactérie doit se tourner vers des mécanismes de secours pour réparer les
dommages aux lipides, aux acides nucléiques et aux protéines. Pour la peroxydation des lipides,
la bactérie peut se fier aux résidus d’histidine et au mannitol qui sont des piégeurs de radicaux
libres (Agents Chemother Alexander Fridman et al. 2011). La protection contre les protéines
carbonylées est l’action des protéases qui reconnaissent les protéines non spécifiques (Fedorova,
Bollineni, and Hoffmann 2014). Finalement, les dommages à l’ADN sont réparables par
excision de base endommagée (Cadet and Wagner 2013). Bien que le peroxyde et le superoxyde
puissent être détoxifiés par des enzymes spécialisées, les radicaux hydroxyles ne le sont pas et
causeront rapidement des dommages à la bactérie (Reiter et al. 1995).
Plus récemment, les ROS ont été associés à un mécanisme d’action secondaire pour tous les
antibiotiques bactéricides (Fig. 8) (Kohanski et al. 2007). Le stress induit par la présence de ces
antibiotiques sera perçu par le système de réponse au stress à deux composantes CpxA. Ce
système activera le régulateur de transcription ArcA (Kohanski et al. 2008). Ce régulateur gère
la transcription des enzymes impliquées dans le cycle de l’acide tricarboxylique (TCA) (Kottur
and Nair 2016). Suite à la suractivation du TCA, la CTE sera fournie en excès de NADH et sera,
par conséquent aussi suractivée. Comme expliqué précédemment, l’oxydation du NADH en
NAD+ produira une certaine quantité de ROS (Dwyer et al. 2007; Kohanski et al. 2007). La
réaction du peroxyde avec le fer des protéines avec un complexe fer-souffre causera la réaction
de Fenton qui sera la plus délétère pour les bactéries et pourra causer en partie leur mort
23
(Belenky et al. 2015). L’implication des ROS dans le cas d’un traitement des aminosides est
assez claire dans le sens où la mauvaise traduction des protéines causera des protéines
défectueuses qui pourront se retrouver dans la membrane et activer le système CpxA situé à cet
endroit. Même chose avec les β-lactames qui ciblent la membrane. Cependant, il reste encore à
trouver la raison pour laquelle les quinolones causent une perturbation de la membrane et ainsi
la production de ROS (Kohanski et al. 2008). Dans le cas des antibiotiques bactériostatiques, il
n’y a pas de production de ROS observée (Kohanski et al. 2007).
Ce mécanisme n’est toutefois pas sans avantages pour les bactéries. Si les concentrations
d’antibiotiques demeurent sous la dose minimale inhibitrice, il y aura production de ROS sans
toutefois avoir de mortalité cellulaire notable (i.e. lors d’une courbe de bactéricidie). Il pourra
donc y avoir dommage à l’ADN et activation du système SOS. Ce système est plus prompt à
faire des erreurs lors de la réparation et cela peut donc entraîner une mutation de résistance à
l’antibiotique utilisé (G. Li et al. 2015). C’est d’autant plus important qu’en clinique, il arrive
parfois que des patients n’adhèrent pas au traitement antibiotique et se retrouvent avec des
concentrations sous-inhibitrices d’antibiotique dans leur sang.
Il est donc important de connaître les impacts des antibiotiques sur les bactéries au-delà de leur
cible et de leur mode d’action principal. En effet, la production de ROS, quoique naturel, peut
devenir un casse-tête de plus dans le traitement des infections en clinique et explique, du moins
en partie, le mécanisme par lequel des mutants résistants, voire multirésistants, peuvent
apparaître au cours du traitement.
1.3.5 Hypothèses et objectifs de la recherche
L’objectif de ma maîtrise était de déterminer le mode d’action de TO et d’élucider la synergie
entre TO et les aminosides contre la forme SCV et prototypique de S. aureus. Ces connaissances
sont essentielles au développement de cette nouvelle classe d’antibiotique et aidera à combattre
efficacement les infections à S. aureus. Nos connaissances actuelles sur la tomatidine nous ont
permis de poser trois hypothèses centrales à l’origine de ma recherche. La première étant que
24
l’effet bactéricide de la tomatidine et de la combinaison TO-aminoside est associé à l’inhibition
de l’ATP synthétase, mais aussi à un changement dans le potentiel membranaire et/ou à la
production de ROS. La seconde hypothèse est que l’étude des phénotypes associés à la
résistance dévoilera l’ensemble des phénomènes cellulaires reliés au mode d’action des
antibiotiques. Finalement, la troisième hypothèse est que les mutations conférant la résistance
sont transférables à un autre Bacillales. Pour ce faire, il fallait dans un premier temps établir la
méthodologie et les protocoles à suivre pour mesurer le potentiel membranaire, la production
de ROS et dans un deuxième temps étudier des phénotypes tel que l’hydrophobicité de la
surface, pouvant influencer l’action des antibiotiques. Ensuite, en utilisant ces protocoles, ces
phénotypes pourront être mesurés en présence de TO et de la combinaison TO-aminoside afin
d’y observer les impacts au niveau cellulaire. Enfin, certaines mutations de résistance à TO ont
été transférées à Bacillus subtilis et pour les mutations de résistance à la combinaison,
l’utilisation de la collection NEBRASKA qui contient déjà des mutants pour les gènes ndh2 et
qoxC.
25
CHAPITRE 2
Bactericidal activity of the combination of tomatidine and aminoglycoside against
virulent and persistent Staphylococcus aureus
Mise en contexte:
La cible cellulaire de la TO a été identifiée dans une étude précédente au laboratoire comme
étant la sous-unité c de l’ATP synthétase et que la tomatidine inhibait la production d’ATP
(Lamontagne Boulet et al. 2018). Cet article vise à déterminer le mécanisme d’action de la TO
et de la combinaison TO-aminoside. La bedaquiline, un inhibiteur de la sous-unité c de l’ATP
synthétase spécifique à Mycobacterium, est très étudié présentement et nous offre des avenues
à vérifier pour découvrir le mécanisme d’action qui est spécifique à TO. D’autres études tendent
à démontrer que les antibiotiques bactéricides induisent la production de ROS. Il serait aussi
possible que TO facilite l’import d’aminoside dans la cellule, ce qui expliquerait l’effet
synergique. Bref, dans ce contexte, il y a plusieurs opportunités de recherche qui permettront de
découvrir le mécanisme d’action de TO et de la combinaison TO-aminoside et faciliteront le
développement de cette nouvelle classe d’antibiotique.
Titre: Bactericidal activity of the combination of tomatidine and aminoglycoside against virulent
and persistent Staphylococcus aureus.
Auteurs et contribution :
Jean-Philippe Langlois1 : Expériences biologiques avec la tomatidine et la combinaison de la
tomatidine avec la gentamicine pour déterminer leur mode d’action
Pierre-Étienne Jacques1 : Analyse du génome des souches résistantes aux antibiotiques
Sébastien Rodrigue1 : Préparation des ADN pour séquençage et analyse des souches résistantes
aux antibiotiques
26
Kamal Bouarab1 : Initiateur du projet grâce à l’isolement du produit naturel tomatidine.
Éric Marsault2 : Collaborateur et codécouvreur de la tomatidine
François Malouin1# : Directeur de recherche de Jean-Philippe Langlois et d’Isabelle Guay et
auteur de correspondance.
1Département de Biologie, Faculté des Sciences, Université de Sherbrooke, Sherbrooke,
Québec, Canada, J1K 2R1
2Département de pharmacologie et physiologie, Faculté de médecine et des sciences de la santé;
Université de Sherbrooke, Sherbrooke (QC), Canada.
# Corresponding author. Mailing address: Université de Sherbrooke,Département de Biologie,
Faculté des Sciences, 2500 Boul. Université, Sherbrooke, Quebec, Canada, J1K2R1. Phone:
(819) 821-8000, ext. 61202. Fax: (819) 821-8049. E-mail: [email protected].
27
Bactericidal activity of the combination of tomatidine and aminoglycoside against virulent
and persistent Staphylococcus aureus.
Langlois, J.-P.1, Jacques, P.-É.1, Rodrigue, S.1, Bouarab, K.1, Marsault, E.2, Malouin, F.1*
1Département de biologie, Faculté des sciences; Université de Sherbrooke, Sherbrooke (QC),
Canada.
2Département de pharmacologie et physiologie, Faculté de médecine et des sciences de la santé;
Université de Sherbrooke, Sherbrooke (QC), Canada.
* Corresponding author. Tel: +1-819-821-8000, ext. 61202; Fax: +1-819-821-8049; E-mail:
Short running title: Tomatidine-aminoglycoside combination mechanism of action
28
Abstract
Objectives: Tomatidine (TO), a phytomolecule extracted from tomatoes, exerts a strong
bactericidal activity on the infection-persistent phenotype of Staphylococcus aureus, the small-
colony variant (SCV), with a minimal inhibitory concentration (MIC) of 0.06 μg/mL. Moreover,
when TO is combined to an aminoglycoside (AMG), the combination shows a strong synergistic
activity against prototypical (WT) S. aureus (MIC of 0.06 μg/mL), which are otherwise
unaffected by TO alone (MIC of >128 μg/mL). We recently determined that the molecular target
of TO was the ATP synthase subunit c (AtpE) and that TO reduced ATP production in S. aureus.
The aim of this study was to uncover the mechanism of action of TO and that of the combination
of TO-AMG against S. aureus WT and SCV.
Methods: The impact of TO and TO-AMG combination on the membrane potential and
generation of reactive oxygen species (ROS) were determined using florescent probes.
Gentamicin uptake was assessed in the presence of TO. Time-kill experiments were performed
under aerobic and anaerobic conditions.
Results: TO is able to reduce membrane potential of both WT and SCV, but significant ROS
are only produced in SCVs. Similarly, only the TO-AMG combination generated significant
ROS production in the WT, which explains the strong synergy with AMG. Besides, there was
no difference in membrane potential of WT when comparing the effect of AMG to that of TO-
AMG. However, the combination TO-AMG generated 2.5 times more ROS and increased AMG
uptake, compared to that caused by AMG alone. Both antibiotics and the combination became
bacteriostatic under anaerobic conditions demonstrating the importance of ROS in the
bactericidal activity.
Conclusions: These results shed light on the mechanism of action of TO and its synergy with
AMGs against S. aureus WT. TO bactericidal activity against SCVs is attributable to both a
critical drop in the membrane potential and is accompanied by an important ROS production.
29
Introduction
The World Health Organization identified antibiotic resistance as a threat to humanity (1, 2).
Thus, developing new classes of antibiotics is an urgent need. Among the bacteria which
represent the highest risk can be found Staphylococcus aureus. S. aureus is an opportunistic
pathogen and recently became the most prevalent pathogen in cystic fibrosis patients (3). It
chronically infects these patients, resists antibiotherapies, evades the immune system by forming
biofilm and by living within nonphagocytic cells (4). The emergence of methicillin-resistant S.
aureus (MRSA) that are often resistant to multiple classes of antibiotics, complicates
antibiotherapy even more (5–7). The small-colony variant (SCV) is an alternative phenotype
adopted by S. aureus which trades virulence for persistence traits. SCVs most often have an
impaired electron transport chain, which reduces ATP production and growth rate. Therefore,
they are more resistant to aminoglycosides that need the membrane potential generated by the
electron transport chain to cross the cytoplasmic membrane. Both SCV and prototypical
phenotypes are found in lungs of cystic fibrosis patients chronically infected with S. aureus (8–
11).
Tomatidine (TO) is the aglycone precursor of α-tomatine, an antifungal compound naturally
synthesized by solonaceous plants (12). We previously demonstrated that TO is a potent and
very selective ATP synthase subunit c inhibitor and displays a strong activity against SCV and
targets very selectively the Bacillales (Staphylococcus, Listeria, Bacillus) (13). Also, the
combination of TO and an aminoglycoside was shown to be synergistic and reduced the minimal
inhibitory concentration of that class of antibiotics by 2-16 fold against prototypic S. aureus
(WT), which are otherwise unaffected by TO alone (MIC of >128 μg/mL) (14, 15). Targeting
the energy production or membrane potential has been considered for treatment of persistent
infections (16). Recently, there has been a new antibiotic accessing the clinic, bedaquiline, also
targeting ATP synthase subunit c. This antibiotic also has a specific target range and is
specifically active against Mycobacterium tuberculosis and other mycobacterial species (17).
30
The stimulation of the production of reactive oxygen species (ROS) may be a secondary
mechanism of action common to all bactericidal antibiotics (18). Indeed, antibiotics can
stimulate the production of ROS, and more specifically, peroxide (H2O2), superoxide (O2-•), and
hydroxyl radicals (OH•). While the first two can be detoxified by bacteria with catalase and
superoxide dismutase, respectively, bacteria are generally unable to detoxify the hydroxyl
radical (18, 19). ROS are normal by-products of the aerobic respiration and are generated mainly
by the oxidation of NADH by the electron transport chain (20). The overproduction of ROS
under antibiotic pressure depletes NADH from the cells and creates a generalized oxidative
stress on the bacteria. To confirm the hypothesis that TO bactericidal activity is linked to ROS
production, it is essential to measure ROS production in presence of TO and also measure the
activity of TO in the presence of an anti-oxidant or in the absence of oxygen. For instance, the
bactericidal activity of ciprofloxacin, a fluoroquinolone targeting bacterial topoisomerases, is
decreased in the absence of oxygen (21). Finally, to understand how TO increases
aminoglycoside activity, the uptake of the latter by bacteria must be studied as aminoglycosides
enter bacteria more easily if the membrane integrity is compromised (22).
We report here how TO, with or without AMG, exerts its bactericidal activity against both the
WT and SCV phenotypes of S. aureus.
31
Methods
Strains and growth conditions
Strains used in this study were S. aureus Newbould (ATCC 29740) or S. aureus ATCC 29213.
Strain NewbouldΔhemB (ΔhemB) was used as the SCV counterpart. This stable SCV strain
ΔhemB was constructed by disrupting the hemB gene involved in the biosynthesis of heme in
strain Newbould using the ermA cassette by homologous recombination (23). Also, TO-resistant
strains previously described by Lamontange-Boulet et al (13) and obtained by serial passage on
sub-MICs of TO are also used in this study (Table 1). All strains were grown in trypticase soy
broth (TSB) or on trypticase soy agar (TSA) at 35oC. During anaerobic growth, oxygen did not
exceed 10ppm and hydrogen was under 4%.
32
Table 1: Strains used in this study and their antibiotic susceptibility profiles
Strain S. aureus
Newbould
S. aureus
Newbould
ΔhemB
S. aureus
Newbould
ΔhemB_ccpA
S. aureus
Newbould
ΔhemB_atpE
S. aureus
ATCC
29213
S. aureus
ATCC
29213_ndh2
S. aureus ATCC
29213_ndh2_qoxC
Mutation
- ΔhemB G149V A17S - Del G36 H145N
Phenotypea
WT SCV SCV SCV WT WT WT
Microdilution MICb
(µg/ml)
TO >128 0.03-0.12 0.25 >128 >128 >128 >128
TO+cys >128 0.25 0.5 >128 >128 >128 >128
GEN 0.25-1 8 8 8 0.25-1 2 2-4
TO+GEN 0.06-0.12 - - - 0.06-0.12 0.5-1 2-4
Cip 0.12-0.25 0.12 0.12 0.12 0.25 0.12-0.25 0.25
Cip+cys 0.5 0.25 0.25 0.25 0.5 0.5 0.5
Disk
diffusion
Inhibition
diameter
(mm)
TO
anaerobic 0 25 - - - - -
TO
anaerobic 23 28 - - - - -
Name in reference
S. aureus
Newbould
S. aureus
Newbould
ΔhemB
P07intR SaR1 - - -
Reference
12 12 12 12 This study This study This study
b WT, wild type phenotype; SCV, small-colony variant c TO, tomatidine; cys, cysteine 20mM; GEN, gentamicin. For the MIC, the ">" sign denotes the highest concentration tested.
33
Generation of S. aureus WT mutants resistant to the TO-gentamicin (TO-GEN) combination
The generation of mutants resistant to the TO-GEN combination was elicited by serial passage
of S. aureus ATCC 29213 (30 passages of 48 h each) in a series of 2-fold dilutions of GEN
(range, 0.06 to 64 µg/ml) in the presence of a fixed concentration of TO (8µg/ml) in brain heart
infusion (BHI) broth in 96-well plates. At each passage, the MIC was determined as the minimal
concentration of the antibiotic combination inhibiting visual growth, and the well representing
0.5MIC was diluted in fresh broth and used to inoculate (~106 CFU/ml) a new series of TO(8
µg/ml)-GEN dilutions for the next passage. At each passage, an aliquot of the 0.5MIC well was
also spread on BHI agar (BHIA), and the next day, three individual colonies were collected and
frozen. Similar passages and isolate selection were also performed in parallel using GEN alone
as the selective pressure. Isolates showing an increased resistance to the TO-GEN combination
or to GEN alone (three per passage of interest) were prepared for whole-genome sequencing.
Whole-genome sequencing, assembly, and annotation.
Whole-genome shotgun libraries were prepared and sequenced using Illumina technology.
Briefly, genomic DNA was extracted using a Qiagen QIAamp DNA minikit and fragmented to
a size of ~200 to 400 bp by treatment with the double-stranded DNA (dsDNA) Shearase enzyme
(Zymo Research) according to the manufacturer’s instructions. Libraries were then prepared
according to Rodrigue et al. (24). Illumina sequencing was performed on an Illumina HiSeq
2000 sequencing system at the Plateau de Biologie Moléculaire et Génomique Fonctionnelle of
the Institut de Recherche Cliniques de Montréal (Montreal, QC, Canada). Samples were
multiplexed in a single sequencing lane, and approximately 1 to 2 million paired-end reads of
50 bp were obtained for each library. The resulting reads were de novo assembled using a Roche
gsAssembler, version 2.6. Contig sequences were aligned and annotated using the reference
genome of S. aureus strain Newman with ABACAS (25) and RATT (26). Four independently
sequenced S. aureus ATCC 29213 genomes were first compared to the reference S. aureus
Newman genome to identify and eliminate inherent single nucleotide variants (SNVs) from the
subsequent comparison of S. aureus ATCC 29213 to resistant isolates. TO-GEN resistant S.
34
aureus ATCC 29123 sequences were then compared against the parental strain S. aureus ATCC
29213 to identify SNVs uniquely associated with the resistance to the drug combination and that
were thus not present in the isolates selected on GEN alone. Only the SNVs that were present
in each of the three isolates and maintained in their genomes once they occurred were
considered.
Antibiotic susceptibility testing
Antibiotic MICs were determined by a broth microdilution technique according to the
recommendations of the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) (27), except that the
medium used was TSB instead of Mueller Hinton broth to better sustain the growth of SCV
strains. Microtiter plates were incubated for 20-24 h or 48 h for the prototypic and SCV
phenotypes, respectively, under aerobic conditions at 35oC. TO susceptibility was also
determined using a disc diffusion method under aerobic and anaerobic conditions. A 4-mm disc
containing 50 µg of TO was deposited on pre-inoculated TSA plates and inhibition zones were
measured after 48h. During anaerobic growth, oxygen did not exceed 10ppm and hydrogen was
under 4%.
Cell surface Hydrophobicity
This assay was performed according to that described by Lye et al (28) with a few modifications.
The hydrocarbon to PBS ratio was 1:9 for S. aureus Newbould and 1:8 for S. aureus ATCC
29213. Briefly, bacteria were incubated 18h, washed and suspended in PBS. The A600nm was
adjusted to 1.0 (A0), mixed with xylene, vortexed 1 min and let to rest 30 min to allow the
separation of the two phases. The aqueous (bottom) phase was recovered and the A600nm was
again measured (A). The hydrophobicity percentage was calculated as follow: A0- A
A0 x 100.
35
Membrane potential measurement
The relative membrane potential was estimated using the fluorescent dye indicator DiOC2
(ThermoFisher), according to the manufacturer’s protocol. Briefly, bacteria were incubated 18h
on TSA plates containing various concentrations of TO. Alternatively, bacteria were incubated
in TSB for 1h to test the effect of the TO-GEN combination on the membrane potential.
Bacterial cells were then harvested, washed and suspended in PBS. DiOC2 (3mM) is added and
incubated 30 min at 35oC. Using a FACScalibur with a 488nm laser, cells were analyzed with
the green and red channels. A higher red vs green ratio represents a higher membrane potential.
Data were analysed using FCS Express program. Results are expressed as a percentage the
median fluorescence of DiOC2 in the channels FL3-H divided by the fluorescence in the channel
FL1-H of S. aureus measured in the absence of antibiotic.
Reactive oxygen species (ROS) quantification
Bacteria were incubated overnight on TSA. A few colonies were suspended in 10 ml TSB and
incubated 2 hours. Afterward, A600nm was adjusted to 0.1, 10µM H2DCFDA was added and
incubated 1 h. Bacteria were then washed and suspended in fresh TSB. Finally, bacteria were
added to a black, flat-bottom 96-well plate, in triplicate. Strains were exposed to 4×MIC, or 8
µg/ml if bacteria were inherently not susceptible to the drug (e.g., prototypic S. aureus vs TO).
Using a TECAN genios fluorescence plate reader, the plate was read using fluorescein settings.
Each well were read at 9 positions per well every 15 minutes, over a period of 13 hours. During
data analysis, the highest fluorescence value that was reached was considered and bacterial
autofluorescence was subtracted. Data are relative to the a control without antibiotic (29).
GEN uptake assay
The aminoglycoside uptake assay was done according to Loughman et al (30). GEN was tagged
using the Texas Red-X succinimidyl ester (ThermoFisher) at a molar ratio of 300:1 and
incubated overnight at 4oC with agitation. To remove unbound Texas Red, the dye remover
36
column (Thermo Fisher) was used according to the manufacturer’s protocol. GEN concentration
was verified by determining the MIC. Bacteria were adjusted to an A600nm of 0.1 and incubated
2 h at 35oC with agitation in the presence of 128µg/ml of the Texas Red-GEN conjugate. When
TO was added during the uptake assay, it was used at 8µg/ml. Plates were read with a TECAN
genios fluorescence plate reader with the 535/595 nm filters.
Time-kill kinetics
Time-kill kinetics were performed under aerobic and anaerobic conditions. Bacteria were
inoculated at ~105-106 CFU/ml in 7 ml TSB and grown at 35oC with agitation, with or without
antibiotics at the following concentrations: TO 16µg/ml and GEN 1 µg/ml. At several time
points, bacteria were sampled, serially diluted and 10 µl were plated on TSA for CFU count. If
the CFU count was under the detection threshold, a value of 1.5log CFU/ml was assigned.
Statistical analyses
Statistical analyses were carried out with the GraphPad Prism Software (v.8.00). Statistical tests
used for each experiment are specified in the legends of associated figures.
Results
Antibiotic susceptibility profiles
The antibiotic susceptibility profiles of the strains and mutants used in this study are reported in
Table 1. As expected, prototypic S. aureus (Newbould or ATCC 29213) are inherently resistant
to TO (MIC >128 µg/ml) and susceptible to aminoglycosides (here GEN). Conversely, the SCV
phenotype is hypersusceptible to TO (MIC 0.03-0.12 µg/ml) but more resistant to GEN (MIC 8
µg/ml) due to its defect in the hemB gene and electron transport chain (9). Besides, the mutants
derived from NewbouldhemB show increasing resistance upon serial passage on TO. As
previously reported (12), a ccpA mutation was associated with an intermediate level of
37
resistance (TO MIC of 0.25-1 µg/ml) and a full resistance to TO (MIC >128 µg/ml) was
associated to a mutation in the drug target (atpE). On the other hand, the present study shows
that resistance of the prototypic strain S. aureus ATCC 29213 toward the TO-GEN combination
only increased from 0.06-0.12 to 2-4 µg/ml upon 30 passages in the presence of the combination.
Again, the higher level of resistance was achieved by a stepwise process; first a mutation in the
ndh2 gene coding for the NADH dehydrogenase for an intermediate level of resistance (GEN
MIC of 0.5-1 µg/ml in the presence of 8 µg/ml TO) and a second mutation in qoxC coding for
quinol oxidase subunit 3 for the highest, although modest, level of achievable resistance (GEN
MIC of 2-4 µg/ml in the presence of 8 µg/ml TO). Also note that in these TO-GEN mutants,
the MIC of GEN alone increased from 0.25-1 µg/ml to a maximum of 2-4 µg/ml, whereas when
GEN is used alone in serial passage, the MIC of GEN can reach ≥8 µg/ml after 30 passages
(data not shown).
TO and TO-GEN combination resistant strains exhibit a modified cell surface hydrophobicity
Surface hydrophobicity is a phenotype which could limit the interaction with either hydrophilic
or hydrophobic molecules. In our results, surface hydrophobicity patterns were found to be
indeed generally correlated, or invertly correlated, with MICs, depending on the hydrophobicity
of the antibiotic (Fig. 9). The inherently TO-resistant prototypic S. aureus Newbould as well as
the SCV NewbouldΔhemB_atpE mutant highly resistant to TO were significantly less
hydrophobic than the TO-susceptible S. aureus NewbouldΔhemB strain (Fig. 9A). Also seen in
Fig 9A, the mutation G149V in ccpA conferring low-level resistance to TO did not influence
cell surface hydrophobicity compared to the parental strain S. aureus NewbouldΔhemB.
Interestingly, strains resistant to the TO-GEN combination demonstrated the opposite
hydrophobicity patterns than that observed for the TO-resistant strains (Fig 9B). A mutation in
ndh2 in the prototypical strain ATCC 29213 shifted the cell surface hydrophobicity from low to
high while the additional qoxC mutation did not contribute further to the already high cell
surface hydrophobicity.
38
Besides, hydrophobicity tests were also performed under anaerobic conditions (Fig. 9A).
Notably, in the absence of oxygen, the prototypical strain S. aureus Newbould becomes highly
susceptible to TO (Table 1, TO inhibition zone of 23 mm) similarly to that seen in either
aerobic or anaerobic conditions for the SCV strain NewbouldΔhemB (Table 1, TO inhibition
zone of 25 and 28 mm, respectively for the two growth conditions). Accordingly,
susceptibility to TO is again correlated to a high cell surface hydrophobicity (Fig. 9A). Thus, a
low hydrophobicity is associated to a high-level of resistance to TO (MIC >128 µg/ml),
whereas a high hydrophobicity is associated with resistance to the combination TO-GEN
albeit the latter is a relatively low-level of resistance (GEN MIC in combination 2-4 µg/ml).
As such, since a high hydrophobicity is also associated to high TO susceptibility, it appears
that exposure of bacteria to the TO-GEN combination prevents development of high-level
resistance. Besides, a modification of cell surface hydrophobicity may be linked to a change of
surface charge and the membrane potential was thus studied next.
39
0.06 0.06 0.12 0.5 >128 >1280
20
40
60
80
100
Tomatidine MIC (g/ml)
% H
yd
rop
ho
bic
ity
aa
b
b
NewbouldhemBNewbouldhemB_ccpA
NewbouldNewbouldhemB_atpE A17S
Newbould anaerobicNewbouldhemB anaerobica
a
0.06 0.5-1 2-40
20
40
60
80
100
Gentamicin MIC (g/ml)
a
b
b
ATCC 29213ATCC 29213_ndh2ATCC 29213_ndh2_qoxC
A B
Figure 9. Surface hydrophobicity of S. aureus strains including those resistant to TO (A),
resistant to the TO-GEN combination (B) in relation to TO or TO-GEN MICs.
All strains were tested 4 to 9 times independently and the median is represented as an horizontal
line. Statistical analysis was performed using a one-way ANOVA. Different letters represent
statistical difference of at least p<0.05.
Membrane potential is reduced in presence of TO
TO targets the ATP synthase subunit c and we therefore investigated its effect on membrane
potential. The first observation was that, as expected, the deletion of hemB in strain Newbould
and the consequent impairment of its electron transport chain had a strong effect on the
membrane potential (Fig. 10A Newbould vs NewbouldhemB). Furthermore, there was no
difference in the membrane potentials of S. aureus NewbouldΔhemB, S. aureus
NewbouldΔhemB_ccpA and NewbouldΔhemB_atpE, which were all very low compared to that
of the prototypical strain Newbould. Surprisingly, despite the very high MIC of TO for strain
Newbould (MIC >128 µg/ml), there was a dose-dependant reduction of membrane potential in
that strain when exposed to TO. The highest TO concentration tested was 8 µg/ml and even at
40
this relatively low concentration compared to the MIC, the membrane potential of strain
Newbould was reduced by more than 65%. The reduction of membrane potential observed with
S. aureus Newbould seems to stabilize around 35%. Since S. aureus Newbould had a reduced
membrane potential in the presence of TO, the specificity of the assay was tested with Gram
positive and Gram negative bacterial species that were not part of the Bacillales and for which
the ATP synthase subunit c amino acid sequence diverge (Fig 10A). Both Enterococcus faecalis
and Acinetobater baumannii membrane potentials were not affected by TO, confirming that the
observed effects of TO were specific to S. aureus.
When TO was added to SCV strains, the membrane potential was significantly reduced further
in both S. aureus NewbouldΔhemB, S. aureus NewbouldΔhemB_ccpA and
NewbouldΔhemB_atpE although the reduction in the atpE mutant did not fall below 2% of the
membrane potential relative to that of strain Newbould (dotted line, Fig 10A).
To verify if there was a minimal membrane potential needed for viability, S. aureus Newbould
was grown anaerobically. This strain adopts a SCV-like phenotype in absence of oxygen (Fig.
10B) and becomes susceptible to TO (Table 1). Under such conditions, the membrane potential
of S. aureus Newbould was as low as that observed for S. aureus NewbouldΔhemB (Fig. 10B).
A significant reduction in membrane potential was further observed for both strains when in
presence of very low TO concentrations. There seems to be a critical membrane potential
threshold below which no growth can occur. These results suggest that at a relatively low
concentration, TO depolarizes the membrane of susceptible SCV strains or of anaerobically
grown S. aureus to a point where the membrane potential falls below a critical level.
TO does not influence the membrane potential when combined with GEN
Since we observed that TO reduces the membrane potential (Fig. 10A and 10B), it was
hypothesized that the combination with GEN could accentuate this effect. However, when
comparing the effect of GEN alone on the membrane potential to the effect of the TO-GEN
combination, no reduction of the membrane potential was observed (Fig. 10D). On the contrary,
41
the membrane potential increased slightly with increasing concentration of GEN either in the
absence or presence of TO (Fig 10D). This is probably due to the destabilization of the
membrane which becomes more permeable to ions. A depolarization of the membrane is thus
not responsible for the synergistic effect observed between these antibiotics. The membrane
potential of TO-GEN resistant mutants (ndh2 or ndh2_qoxC mutants) was however lower than
that of the parental strain ATCC 29213 (Fig. 10C). This could account for the decreased
susceptibility of these mutants to either GEN alone or the TO-GEN combination (Table 1) since
GEN entry into cells depends on the membrane potential (31). Besides, the membrane potential
of either ndh2 or ndh2_qoxC mutant was still higher than that of a ATCC 29213 hemB mutant
(Fig. 10C), which could explain why the former mutants are not susceptible to TO compared to
strains of the SCV phenotype (Table 1).
42
00.
12 0.5 2 8 0
0.00
7
0.01
50.
030.
06 0
0.01
50.
030.
060.
12 00.
12 0.5 2 8 0
0.12 0.
5 2 8 00.
12 0.5 2 8
0
5
10
15
20
30
60
90
120
150
Tomatidine concentration (g/ml)
% M
FI
ba
bb
b
a
NewbouldhemB_ccpA
Newbould
NewbouldhemB
NewbouldhemB_atpE
E. faecalis
A. baumanii
c
0
0.00
35
0.00
7
0.00
150.
030.
06 0
0.00
35
0.00
7
0.00
150.
030.
06
0
4
8
12
16
20
Tomatidine concentration (g/ml)
% M
FI
Newbould
NewbouldhemB
0
20
40
60
80
100a
b
c
c
00.
030.
12 0.5 2 8 0
0.03
0.12 0.
5 2 8
0
100
200
300
400
500
Gentamicin concentration (g/ml)
a
a
b
ATCC 29213; TO-GEN
ATCC 29123ATCC 29213hemB
ATCC 29213_ndh2
ATCC 29213_ndh2_qoxC
A
B C D
Figure 10. Membrane potential of (A) S. aureus Newbould and non-target species in
presence of TO. (B) S. aureus in presence of TO under anaerobic conditions, (C) S. aureus
ATCC 29213 and the combination-resistant mutant membrane potential and (D) S. aureus
ATCC 29213 membrane potential in presence of GEN alone or in combination with TO
8µg/ml.
The dotted lines indicate the membrane potential threshold for growth inhibition (between 0.5
and 2%). Statistics were done using a two-way ANOVA. Results are expressed as a percentage
the median fluorescence of DiOC2 in the channels FL3-H divided by the fluorescence in the
channel FL1-H of S. aureus measured in the absence of antibiotic. Different letters represent
statistical difference of at least p<0.05.
43
ROS are produced in susceptible strains exposed to either TO alone or to the TO-GEN combination
ROS production by the TO-susceptible and TO-intermediately resistant SCV strains hemB and
ccpA, respectively, was significantly induced in presence of TO at 4×MIC (Fig. 11A). Also, as
expected, the ROS production induced by TO was attenuated by the antioxidant effect of
cysteine. On the opposite, the intrinsically TO-resistant prototypic S. aureus strain Newbould
or the TO-resistant SCV strain NewbouldΔhemB_atpE did not produce more ROS in the
presence of TO at 8 µg/ml than that observed without any antibiotic added (Fig. 11A).
Therefore, TO only induces ROS production in susceptible strains.
When TO at 8 µg/ml was added to GEN at 4×MIC, S. aureus ATCC 29213 demonstrated a
significant increase in ROS production compared to that induced by GEN alone (Fig. 11B). ROS
production caused by GEN alone did not differ from that of the no antibiotic control. In the TO-
GEN resistant strains, the ndh2 mutation (either alone or combined with the qoxC mutation)
completely suppressed the ROS production induced by the presence of TO. In conclusion, in
the S. aureus prototypic background, ROS are only produced in susceptible strains when TO is
added to GEN, which could explain the observed TO-GEN synergy. Besides, a mutation in ndh2
protects bacteria against the TO-induced ROS production.
44
0
8g/m
l
8ug/m
l + c
yste
ine
cip 4
x M
IC (0
.5g
/ml)
cip 4
x M
IC +
cys
tein
e (0
.5g
/ml) 0
4x M
IC (0
.25
g/ml)
4x M
IC +
cys
tein
e (0
.25
g/ml) 0
4x M
IC (1g
/ml)
4x M
IC +
cys
tein
e (1g
/ml) 0
8g/m
l
8ug/m
l + c
yste
ine
0
1
2
3
Tomatidine concentration
RF
I
Newbould
NewbouldhemB
NewbouldhemB_ccpA
NewbouldhemB_atpE
a
b
a
a a
aaaa a
b
a
c
b
0
4x M
IC
4x M
IC +
cys
tein
e
4x M
IC+ T
O
4x M
IC +
TO +
cys
tein
e
cip 4
X M
IC
cip 4
X M
IC +
cys
tein
e 0
4x M
IC
4x M
IC +
cys
tein
e
4x M
IC+ T
O
4x M
IC +
TO +
cys
tein
e
cip 4
X M
IC
cip 4
X M
IC +
cys
tein
e 0
4x M
IC
4x M
IC +
cys
tein
e
4x M
IC+ T
O
4x M
IC +
TO +
cys
tein
e
cip 4
X M
IC
cip 4
X M
IC +
cys
tein
e
0
1
2
3
Gentamicin concentration
a
a
aa
a
b
b ATCC 29213
ATCC 29213_ndh2ATCC 29213_ndh2_qoxC
a
A B
Figure 11. ROS production in S. aureus induced by (A) tomatidine or (B) the TO(8µg/ml)-
GEN combination.
When specified, cysteine was added at a concentration of 20mM. Results are expressed as
relative fluorescence intensity (RFI) to the fluorescence of the no antibiotic control. Statistical
analysis were performed using a Two-Way ANOVA and each strain is independent for their
statistics. Different letters represent statistical difference of at least p<0.05.
TO increases GEN uptake
The uptake of GEN by S. aureus was measured to assess the impact of the ndh2 and qoxC
mutations and to determine if TO modulates GEN uptake when both are combined. There was
no difference in GEN uptake for S. aureus ATCC 29213 or the ndh2 mutant, however, there
was a significant reduction of the uptake of GEN in the double mutant ndh2_qoxC (Fig. 12A).
When adding TO, there was a 60% increase in GEN uptake for the WT (Fig. 12B). This
statistically significant increase in GEN uptake for the parental strain in the presence of TO was
reduced for the ndh2 mutant but reduction of uptake in presence of TO was only statistically
significant for the double ndh2_qoxC mutant (Fig. 12B). Therefore, TO potentiates the activity
of GEN by increasing its uptake by prototypic S. aureus strains.
45
Figure 12. (A) GEN uptake by S. aureus ATCC 29213 and TO-GEN resistant mutants over
a 2h-period and (B) relative GEN uptake in presence of TO 8µg/ml.
In B, the dotted line represents the GEN uptake level of S. aureus ATCC 29213 in the absence
of TO. Statistical analysis was done using a One-way ANOVA. Different letters represent
statistical difference of at least p<0.05.
TO and the TO-GEN combination are bacteriostatic under anaerobic conditions
Time-kill experiments for S. aureus strain Newbould (Fig. 13A) and NewbouldΔhemB (Fig.
13B) were performed in presence of 16µg/ml TO combined with 1 µg/ml GEN and with
16µg/ml of TO alone, respectively, for a period of 24h under aerobic and anaerobic conditions.
Fig. 13 clearly shows that more killing can be achieved in aerobic conditions. We can conclude
that oxygen, and presumably ROS production, is required to observe a strong bactericidal effect
by either TO or the TO-GEN combination against strain hemB or Newbould, respectively.
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
RF
I
b
a
a
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Gen
tam
icin
up
take r
ati
o
ba
aATCC 29213
ATCC 29213_ndh2
ATCC 29213_ndh2_qoxC
A B
46
Figure 13. Kill kinetics of (A) S. aureus Newbould ΔhemB in presence of the TO, and of (B)
S. aureus Newbould in presence of TO-GEN combination, under aerobic (colored lines)
and anaerobic (black lines) conditions.
The CFU count indicated at each time point represents the average of three independent
experiments.
Discussion
TO is an efficient antibiotic against the SCV phenotype of Bacillales such as S. aureus, L.
monocytogenese and B. subtilis. Although it lacks activity against WT phenotype, when in
combination with an aminoglycoside it reduces GEN, tobramycin or kanamycin MICs by up to
16-fold (13). It was previously shown that TO targets the ATP synthase subunit c, reduces ATP
production (13), and could consequently reduce synthesis of macromolecules (32). As
0 4 8 12 16 20 240
4
6
8
10
Time (hours)
Lo
g1
0C
FU
/ml
NewbouldhemB aerobic; TO
NewbouldhemB anaerobic
NewbouldhemB anaerobic; TO
NewbouldhemB aerobic
< 2
0 4 8 12 16 20 240
4
6
8
10
Time (hours)
Newbould aerobic
Newbould aerobic; TO-GEN
Newbould anaerobic
Newbould anaerobi`; TO-GEN
< 2
A B
47
aminoglycosides lead to erroneous or aborted protein translation, both TO and GEN can thus
reduce the ability of bacteria to thrive and maintain their cellular integrity.
Laboratory-selected TO-resistant S. aureus SCVs mutated in the atpE gene coding for the ATP
synthase subunit c were shown to have a lower ATP production than the parental SCV strain
NewbouldΔhemB, which already produced much lower ATP amounts than the prototypical
strain Newbould in an inverted membrane vesicle ATP synthase assay (13). Gaddy et al (33),
reported that a restriction in nutrients, and thus a lower energy production, can induce a
modification in lipid composition and phosphorylation of the membrane. Cell surface
hydrophobicity is dependent, among other factors, on membrane lipid composition. Other ways
S. aureus can modify cell surface hydrophocity include attachment of teichoic acids and its level
of D-alanylation in cell wall peptidoglycan. Since TO is a highly hydrophobic molecule, a less
hydrophobic surface might limit the physical interactions between the antibiotic and bacteria.
We showed here that S. aureus prototypic cells that produce large amounts of ATP, a high
membrane potential and a low cell surface hydrophobicity are “naturally” resistant to TO.
Whether or not the low surface hydrophobicity is a result of the membrane potential or the high
energy production allowing adequate membrane phospholipids and teichoic acids biosynthesis
is still unknown. On the other hand, TO-GEN combination-resistant strains saw their surface
hydrophobicity increased despite the presence of TO. In this case, the consequence for the
bacteria of carrying a ndh2 mutation would decrease the membrane potential and limit the
interaction and uptake of the hydrophilic GEN at the expense of an increased affinity for TO.
As such, only low-level resistance to the TO-GEN combination could be achieved through serial
passage.
The first mutation selected in the prototypical strain ATCC 29213 that resulted in resistance to
the TO-GEN combination was indeed found in type-II NADH dehydrogenase (ndh2 gene). In
S. aureus, this protein is responsible for the oxidation of NADH into NAD with production of
ROS as by-products. This protein is associated with a proton transporter, MpsABC (34). Both
proteins form the complex I of the electron transport chain. Inhibiting the dehydrogenase
activity reduces the proton gradient and the generation of ROS (18, 34). The second mutation
48
we found in mutants resistant to the TO-GEN combination, qoxC, is in a gene coding for the
enzyme responsible for the transfer of the electrons with quinols between the first and the third
complex of the electron transport chain. Further reducing the activity and the capability of the
electron transport chain decreases GEN uptake (Fig. 12).
Membrane potential is essential for the production of ATP by the electron transport chain and
it represents an interesting and underexploited target for the development of new antibiotic
classes. For example, although a slow grower, M. tuberculosis has to maintain its membrane
potential in order to survive. This raises the question of whether it exists or not a minimal
membrane potential at which bacteria can survive. For S. aureus, we found that there was a
critical membrane potential threshold necessary for cell viability (Fig. 10). We could thus
hypothesize that TO acts as a membrane potential uncoupler which leads to bacterial death for
the S. aureus SCV strains.
Antibiotic-induced ROS production may represent the ultimate bactericidal step in antibiotic
action, but this view is currently under debate. The main argument against this point of view is
the fact that a large number of bacteria are still killed by antibiotics under anaerobic conditions
and that some of past studies used the fluorescence probe hydroxyphenyl fluorescein (HPF),
which tends to self-oxidize (35). On the other hand, ROS advocates maintain that ROS
production is common to all bactericidal antibiotics and that measuring ROS production with
the more stable probe, H2DCFDA, is reliable (19, 21). Other support for the latter school of
thought come from studies that have shown that the presence of antioxidant greatly reduces
bacteria susceptibility to bactericidal antibiotics (18, 29). We further supported this view here
by showing a correlation between the ability to generate ROS and the inhibitory activity of TO
or of the TO-GEN combination against various strains of S. aureus. When TO is applied alone,
ROS are generated in TO-susceptible SCV strains and are not produced in resistant strains.
Furthermore, this ROS production is abolished by the presence of the antioxidant cysteine
concomitant with a loss of antibiotic activity (higher MICs in presence of cysteine). Similarly,
we showed that only the synergistic combination TO-GEN was able to produce ROS in
prototypical S. aureus strains when compared to that seen with either TO or GEN used alone.
49
Finally, in time-kill experiments performed with and without oxygen, we observed that the
bactericidal activity of TO or of the TO-GEN combination was much higher against susceptible
strains grown aerobically.
Other extensively studied ATP synthase subunit c inhibitors may also provide additional
insights on the mechanism by which GEN is potentiated by TO. For example, it is known that
DCCD blocks the proton flow across ATP synthase (36). Also, the mycobacterial-specific ATP
synthase inhibitor, bedaquiline, was recently shown to act as a H+/K+ antiporter and that it
gradually acidifies the cytoplasm (37). However, such a study did not provide evidence for an
impact of bedaquiline on the membrane potential like we have observed with TO. Another
interesting observation from the study of the mode of action of the combination TO-GEN was
the increased uptake of GEN by more than 1.6-fold in prototypic S. aureus in presence of TO.
Conclusion
In conclusion, TO affects membrane potential by binding to the subunit c of the ATP synthase
of both prototypic and SCV phenotypes of S. aureus. TO reduces the membrane potential of
SCV strains below an apparent critical level and ROS are only produced in such TO-susceptible
SCV strains. The TO-GEN combination does not further impact the membrane potential of
prototypic S. aureus but greatly increases ROS production. This ROS production combined to
an increased cell uptake of GEN in the presence of TO may explain the synergy of the TO-GEN
combination against prototypic S. aureus.
50
Funding
This research was funded by the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada
(NSERC grant No. 2015-05916 to F. Malouin).
Acknowledgements
We are grateful to Calcul Québec, Compute Canada and the Centre de Calcul Scientifique of
the Université de Sherbrooke for access and technical support while using the Mammouth-mp2
supercomputer.
Transparency declarations
None to declare.
51
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56
57
CHAPITRE 3
DISCUSSION
L’ATP synthétase est une enzyme ubiquitaire. Malgré cela, la TO est sélective pour les
Bacillales et n’a pas d’activité contre les autres bactéries ou même les eucaryotes. Lamontagne
Boulet et al (2018) a montré que la séquence en acides aminés de l’ATP synthétase des
Bacillales est conservée parmi ses membres et que de grandes différences existent avec les
autres ordres bactériens. Bien que son activité soit limitée aux SCV, l’ajout d’un aminoside
permet de cibler à la fois le phénotype SCV et le prototype. Un autre objectif du projet était de
confirmer le rôle et l’importance des mutation retrouvées dans les mutants résistants. Dans le
but de confirmer le rôle du gène atpE, tel que retrouvé précédemment dans les SCV résistants à
la TO obtenus au laboratoire (Lamontagne Boulet et al. 2018), une copie de ce gène portant une
mutation a été incorporée dans Bacillus subtilis. Le gène original a été substitué grâce à la
facilité que possède Bacillus subtilis à faire de la recombinaison homologue. Les CMI ont été
réalisés en présence d’un inhibiteur de la CTE, le 2-Heptyl-4-hydroxyquinoline n-oxide
(HQNO), qui rend les bactéries semblables à des SCV. Dans ces conditions, il a donc été
possible d’établir la sensibilité du gène WT et la résistance conférée par la mutation dans le gène
atpE. Une approche un peu différente a été utilisée pour démontrer le rôle les gènes de résistance
à la combinaison. Il existe une collection de souches, la collection Nebraska, de S. aureus
USA300, une souche MRSA, qui contient des transposons dans plusieurs gènes non essentiels.
À l’instar des mutations retrouvées dans nos mutants prototypique résistants à la combinaison
TO-GEN qui contiennent une petite délétion ou un SNP avec des gènes encore transcrits et
actifs, ces mutants de S. aureus USA300 voient leurs gènes inactivés par l’insertion d’un
transposon. Aussi, nous n’avions pas la combinaison des gènes ndh2 et qoxC. Malgré ces
différences, les souches de S. aureus USA300 demeurent un proxy valable puisque la souche
parentale possède la même CMI contre la combinaison. Tel qu’attendu, les CMI ne sont pas
exactement les mêmes pour les mutants de S. aureus USA300 versus les mutants résistants à la
combinaison obtenus en laboratoire. Cependant, il a été possible de confirmer le rôle des gènes
ndh2 et qoxC dans la résistance à la combinaison TO-GEN. La confirmation de l’implication
58
des gènes de résistance identifiés a permis d’orienter les tests effectués et d’élucider le
mécanisme d’action de la TO et de découvrir la nature de la synergie observée entre les
aminosides et la TO.
Un projet parallèle au laboratoire, nous tentons d’étendre le spectre d’activité et augmenter
l’efficacité de la TO contre les souches prototypiques, des dérivés ont été synthétisés dans le
laboratoire du Pr. Éric Marsault (Université de Sherbrooke, FMSS). Un dérivé a
particulièrement attiré l’attention grâce à son activité à la fois contre S. aureus prototype et SCV,
ainsi que contre Escherichia coli. La molécule a reçu le nom de FC04-100 (ou FcMajeur) et est
modifiée dans la chaîne latérale de la TO (Chagnon et al. 2014; Guay et al. 2018). Le mécanisme
d’inhibition du potentiel membranaire par FcMajeur est similaire à la TO contre la souche
prototypique de S. aureus. Les deux antibiotiques sont en effet en mesure de réduire le potentiel
membranaire de S. aureus, mais FcMajeur peut le réduire davantage. Cela est explicable par le
fait qu’il possède une CMI contre la souche prototypique et la souche SCV.
Dans le but de compléter l’article présenté au chapitre 2, l’analyse du fitness de mutants SCV
résistants à la TO et de mutant prototype résistants à la combinaison a été fait dans un modèle
murin. Une baisse du fitness serait intéressante puisque ça indiquerait que les mutants sont moins
adaptés à la survie in vivo. Ce type d’expérience serait rassurant pour le développement clinique
de la TO et de ses analogues. Pour ce faire, la survie des mutants sera comparée à leur souche
parentale dans un modèle d’infection chez la souris. Les résultats préliminaires obtenus
démontrent que les souches mutantes, SCV et prototypiques, ont un retard de croissance par
rapport à leur souche parentale. Il y aurait donc un coup phénotypique important à la résistance
à TO ou à la combinaison TO-GEN.
De façon plus générale, l’étude de la stimulation de la production de ROS a émergé du besoin
de comprendre la cascade d’évènement qui suit l’interaction de l’antibiotique avec sa cible
(Kohanski, Dwyer, and Collins 2010; Kohanski et al. 2007). Dans un contexte de
développement rapide de résistance chez les bactéries, il est d’autant plus important de
comprendre l’ensemble du mécanisme d’action des antibiotiques (Hoeksema, Brul, and ter
59
Kuile 2018; G. Li et al. 2015; Hards et al. 2015). Il a été observé que les antibiotiques
bactéricides sont en mesure d’accélérer le rythme de consommation d’oxygène et donc le
métabolisme des bactéries (Adolfsen and Brynildsen 2015). Cependant, cet effet n’a pas été
observé chez les antibiotiques bactériostatiques (Van Acker and Coenye 2017). L’accélération
du métabolisme cause une augmentation des produits du cycle de Krebs, et donc le NADH, qui
ira à la CTE pour être oxydé. L’accumulation rapide de protons en présence d’électrons produira
des ROS. De cette hypothèse ont donc découlé les essais avec la TO et avec la combinaison.
Toutefois, mesurer les ROS n’est pas aisé et est très critiqué. Les principaux points des
détracteurs sont la capacité des antibiotiques à conserver leur propriété bactéricide en absence
d’oxygène. Un autre problème avec la mesure des ROS est l’oxydation du fluorophore par
l’oxygène ambiant. Le dernier problème est que les protocoles utilisés au travers la littérature
ne sont pas constants. Puisqu’autant les partisans que les détracteurs amènent de bons arguments
quant à l’implication des ROS dans l’activité des antibiotiques bactéricide, il faudrait qu’un
protocole standard puisse être mis sur pied et qu’il y ait consensus sur les contrôles utilisés.
(Fang 2013). À la lumière des résultats que nous avons accumulés, il semblerait que les ROS
soient une partie importante de l’action bactéricide des antibiotiques à l’étude. Effectivement,
en conditions anaérobies, GEN et TO devenaient bactériostatiques. Ceci indique que l’activité
des antibiotiques possède plusieurs facettes et ne se limitent pas à seulement l’interaction entre
la cible et l’antibiotique.
La CTE est une cible de choix pour le développement de nouveaux antibiotiques. Chez
Mycobacterium, la CTE est essentielle pour le maintien du gradient de proton et les fonctions
vitales à la bactérie. Mycobacterium tuberculosis est aérobie stricte, mais est en mesure de
survivre en l’absence d’oxygène. La bactérie survit grâce à la phosphorylation oxydative. Par
contre, cette voie produit du succinate qui doit être géré. De plus, comme la CTE de cette
bactérie n’utilise que l’oxygène comme accepteur final d’électron, elle doit générer son potentiel
membranaire d’une façon alternative lors de la survie en anaérobie. L’excès de succinate est
oxydé par la succinate déshydrogénase dans une réaction qui n’est pas favorable
énergétiquement. L’enzyme peut donc pomper un proton à l’extérieur de la cellule et le potentiel
membranaire est ainsi conservé, mais l’électron généré n’est pas utile pour la formation
60
d’énergie. Toutefois, l’électron est envoyé aux ménaquinones et un accepteur d’électron qui
reste à identifier peut aussi contribuer à la conservation du potentiel membranaire. De plus, il a
été rapporté qu’une inhibition de la CTE en condition anaérobie est rapidement bactéricide et
qu’inhiber cette chaîne à deux endroits cause aussi rapidement la mort en condition aérobie. De
ce fait, cibler la CTE serait une avenue des plus intéressante pour le contrôle d’importants
pathogènes chez l’humain (Berube and Parish 2018).
61
CHAPITRE 4
CONCLUSION générale
Mon projet de maîtrise a donc permis de mettre en lumière le mécanisme d’action de la TO et
de la combinaison de la TO avec les aminosides et plus particulièrement la GEN. On a donc pu
voir que l’hydrophobicité de la surface des bactéries avait un lien avec la CMI et que cette
propriété pourrait jouer un rôle dans l’interaction entre l’antibiotique et la bactérie. Il a aussi été
possible de démontrer que la TO avait un effet dépolarisant sur les souches cibles, peu importe
leur niveau de résistance à l’antibiotique. Finalement, j’ai déterminé que les ROS jouaient un
rôle primordial dans l’activité bactéricide de la TO et de la combinaison.
La TO ne possède qu’un spectre d’activité limité. Dans le but de l’amener à la clinique, il
faudrait que l’antibiotique montre une activité contre un spectre élargi de pathogènes bactériens.
Avec la collaboration du laboratoire du Pr. Éric Marsault (Université de Sherbrooke, FMSS),
un analogue de la TO a été développé. Le composé FcMajeur (FC04-100) qui possède le corps
de la TO et une chaîne latérale différente est un exemple d’une molécule aux propriétés
améliorées (Lamontagne Boulet et al, 2018). Cela lui permet d’avoir une activité à la fois contre
les deux phénotypes de S. aureus, SCV et prototype, ainsi que contre E. coli, quoique l’activité
inhibitrice contre ce dernier reste modeste pour l’instant. Il est aussi à noter que la résistance à
FC04-100 ne se développe pas en conditions de laboratoire et que l’optimisation de cette classe
d’antibiotique est bel et bien possible.
Finalement, le manque développement de nouvelles classes d’antibiotique complique la gestion
des bactéries multirésistantes. Toutefois, les inhibiteurs de l’ATP synthétase seraient une avenue
intéressante qui pourrait faciliter la tâche des cliniciens dans le traitement des infections
résistantes.
62
CONTRIBUTIONS SUPPLÉMENTAIRES
Annexe 1 : Article scientifique publié dans « Antimicrobiol Agents and Chemotherapy »
Titre : Tomatidine Is a Lead Antibiotic Molecule That Targets Staphylococcus aureus ATP
Synthase Subunit C
Résumé : Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) is a leading cause of deadly
hospital-acquired infections. The discovery of anti-Staphylococcus antibiotics and new classes
of drugs not susceptible to the mechanisms of resistance shared among bacteria is imperative.
We recently showed that tomatidine (TO), a steroidal alkaloid from solanaceous plants,
possesses potent antibacterial activity against S. aureus small-colony variants (SCVs), the
notoriously persistent form of this bacterium that has been associated with recurrence of
infections. Here, using genomic analysis of in vitro-generated TO-resistant S. aureus strains to
identify mutations in genes involved in resistance, we identified the bacterial ATP synthase as
the cellular target. Sequence alignments were performed to highlight the modified sequences,
and the structural consequences of the mutations were evaluated in structural models. Over-
expression of the atpE gene in S. aureus SCVs or introducing the mutation found in the atpE
gene of one of the high-level TO-resistant S. aureus mutants into the Bacillus subtilis atpE gene
provided resistance to TO and further validated the identity of the cellular target. FC04-100, a
TO derivative which also possesses activity against non-SCV strains, prevents high-level
resistance development in prototypic strains and limits the level of resistance observed in SCVs.
An ATP synthesis assay allowed the observation of a correlation between antibiotic potency and
ATP synthase inhibition. The selectivity index (inhibition of ATP production by mitochondria
versus that of bacterial ATP synthase) is estimated to be >105-fold for FC04-100.
Auteurs : Maxime Lamontagne Bouleta, Charles Isabellea, Isabelle Guay a, Eric Brouillettea,
Jean-Philippe Langloisa, Pierre-Étienne Jacquesa, Sébastien Rodriguea, Ryszard Brzezinskia,
63
Pascale B. Beauregarda, Kamal Bouaraba, Kumaraswamy Boyapellyb, Pierre-Luc Boudreaultb,
Éric Marsaultb, François Malouina
aCentre d'Étude et de Valorisation de la Diversité Microbienne, Département de Biologie,
Faculté des Sciences, Université de Sherbrooke, Sherbrooke, Quebec, Canada
bDépartement de Pharmacologie, Faculté de Médecine et des Sciences de la Santé, Université
de Sherbrooke, Quebec, Canada
Ma contribution : J’étais responsable de l’introduction du plasmide de surexpression du gène
atpE dans S. aureusΔhemB, des mutations chez Bacillus subtilis et une partie des tests de
susceptibilité.
64
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