Upload
nguyenkien
View
214
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI MILANO
COSPECT: Comprehensive Substances
characterization via advanced sPECTrometry
Spettrometria di Massa
MALDI Imaging:
principi, metodi ed applicazioni
Enrico Caneva
(23-06-2017)
COSPECT: MALDI Imaging (E. Caneva: 23/6/2017)
MALDI Tof-Tof Autoflex III (Bruker Daltonics):
TargetCID cell(Helium or Argon)
Bruker Daltonics S.r.l.: slide descrittive Autoflex III
REFLECTRON
MALDI source
‘’MALDI Imaging procedure on a tissue slice’’: 1st Experiment
Figure 1: Conceptual representation of the MALDI MS imaging procedure on a tissue slice. The tissue in the example contains two defined areas, A (Anterior) and P (Posterior) containing specific localized proteins A’ and P’, respectively.
From the data array of a raster of laser spots, each containing a complete mass spectrum, selected ion images can be created in which molecules can be localized in the tissue.
Summing all the ions in each spectrum would produce a total ion image.
Richard M. Caprioli at al: Anal. Chem. 1997, 69, 4751-4760.
Imaging Mass Spectrometry applications overview
Animals (rats, mice, …):Organs and whole body sections.
Spatial localization, contribution to disease diagnosis, ….
predictions.
Humans: organs, skin, tumours …
Targets: proteins, peptides, lipids, drugs, xenobiotics,
neuropeptides, drug metabolites, … , clinical biomarkers
Plant Biology
Forensics(latent fingenmarks)
Microbiology(2D & 3D Cell Culture Models)
(1) Sample removal: preservation of integrity and morphology
Long (-80 °C), or medium(-20 °C) time conservation (fresh tissue).Inclusion into a polymer (OCT, Carboxymethylcellulose CMC, …), or with FFPE protocol for medium-long time conservation.
… or direct cutting
Animal sacrifice Hospital (mouse, …) surgery, biopsy
Direct immersion (critical), or indirect immersion (cryovials, floating plastic boats , Al-plates, …):
Dry ice/isopentane (-40 to - 80 °C): several seconds of submersion time (depending on sample type).
Dry ice/hexane (-75 °C): “ “ “ “ “ “
Liquid Nitrogen (-168 °C): few seconds submersion time (slow plunging in, to avoid cracking)
Cooling down
Conservation
(2) Tissues preparation and conservation protocols
Preliminar freezing(vessels, cardiac regions need additional treatments)
Inclusion in polymerresins (OCT, CMC, …) => storing at -80 C.
Formalin Fixation :- Ethanol baths => dehydratation- formalin (Tris-HCL buffer).
(A)
Paraffin Embedding:
FFPE samples => Long time T. ambient storing
Surgical organ removal or biopsy collection => fresh tissues)
Direct cut in the Cryostat:immobilization onto a sample holder using an
embedding medium
Cut in the Cryostat (-15 to -20 °C)
Tissue slice on ITO surface
(thickness from 10 to 25 um)
(B) (C)
(3) Tissue pre-treatment: washing protocols
Tissue slice on ITO surface
(thickness from 10 to 25 um)
EtOH (gently washing): EtOH 70% (30 sec) => EtOH 70% (30 sec)
EtOH (strong washing): 70% (2 min) => fresh EtOH 70% (2 min) => EtOH 100% (2 min)
Acetone: 30 sec => dry at room temperature
Chloroform, H 2O, Xilene, …
Progressive removal of salts, lipids, endogenous peptides, cell debris, blood, … (EtOH); Additional removal of lipids (Chloroform), or OCT residuals (H2O);Fixation of proteins and peptides: superficial (EtOH, Acetone), or structural (formaline, …);Denaturation and precipitation of protein (and peptides) in their original location.
Improvement in sensitivity and resolution in MS Imaging spectra
(4) Matrix deposition: methods overview
Droplet deposition Matrix coating
TLC glass reagent sprayer:acoustic wave ejection.
Artist’s airbrush:Airspray with controlled pressure.
Areosol automated dispenser-Vibrational vaporization under controlled conditions;- medium droplets size = 20 um.
Electrospray apparatus-Classic electrospray horizontal needle;- matrix crystals < 1um .
Chemical Ink-jet Printer-Use of piezoelectric pulsing;- volume of droplets: 87 pl;- printer head: 55um .
Robotic device- acoustic wave ejection;- volume of droplets: 170 pl;- cristal size = 30 up to 5 um.
Low volume automatic pipette- Spot droplets volume = 200 to 500 nl.
Finely pulled capillary glass attached to a Hamilton-type syringe
- Spot droplets volume = 5 to 50 nl;- cristal coverage of 50% area;- crystal diameter = 20 to 200 um;- spot quite precise in x,y coordinates.
Rapid Spotter:- Imaging Resolution up to 100 um.
“ImagePrep”Bruker Daltonics
Bruker “ImagePrep” coating unit technology
Distribuzione media diametro microgocce Sensore ottico (valutazione scattering)
Interno ImagePrep: fase di ventilazione N2 Fase di attivazione dello Spray
Matrix deposition: differentiations
CaratteristicheBassa risoluzione spaziale.
Rapidità di esecuzione.
Maggiore sensibilità.
Confronti tra :
- diversi tessuti;
- regioni ben separate;
- patologico vs normale;
- trattato vs non trattato;
CaratteristicheAlta risoluzione spaziale.
Distribuzione molecolare
accurata di m/z definite.
Sensibilità modulabile.
Analisi di :- aree adiacenti;
- bordi tra le diverse aree
(patologico vs normale, ..);
- biomarker di neoplasie;
- compartimentalizzazioni
di farmaci e altri composti.
MALDI Profiling MALDI Imaging
[Image: S. Francese at al., Comb. Chem. and High Throughput Screening, 2009, 12, 156-174]
Esperimenti in ‘‘Target o Discovery Mode’’
[Immagini tratte da brochure Bruker Daltonics S.r.l.: descrizione sorgente Autoflex III ]
Mix campione-matrice, sulla superfice del campione (o della fettina) in rapporto da
1:1000 a 1:10.000.
Irraggiamento della superficie con una serie di impulsi in
sequenza, della durata dell’ordine del ns.
Produzione di un plasma di ionizzazione
contenente molecole neutre e ioni.
MALDI: Molecular Desorption scheme
‘’Smartbeam Laser Nd: YAG (355 nm)’’: parameter set
SA matrix distribution Laser shots evidence after acquisition
Tissue slides on ITO surface
MALDI MS Imaging applications (I): Proteomic Field
Proteolitic deposition &in situ digestion (Trypsin, …).
Matrix deposition & MALDI Imaging
Acquisition on slices.
Spectra & peak list collection.
“PMF” online search.
Evaluation of PMF results &definition of MS2 experiments.
(A) Fettina trattata con Tripsina
Calibrante “Pepmix” in TA soluz (G9) e miscelato con la matrice HCCA (G14)
D9 D14
G9
E17
F17
E12
F12
G14
(B) Fettina non trattata con Tripsina
Protocolli di taglio, deposizione su vetrino, lavaggio, digestione e deposizione matrice.
Tracciamento delle coordinate sul vetrino per le fasi di acquisizione: - Imaging - High Resolution - MS/MS.
Carotide umana inclusa in OCT
Poster al 6th MS-Pharmaday: G.Beretta, D.Norata, G.Tibolla, E.Caneva, M.Pappini & R.M.Facino (ott ‘10)
MSI tissue preparation: teaching, ROI selection, calibration, …
MSI post processing: distribution of different ions on tissue
m/z = 578.8(contorni fettina)
m/z = 1199.3 (zona E)
m/z = 1792.0 (K)
m/z = 1275.6 (G)
m/z = 1007.8 (B)
m/z = 1227.3 (F)
Raggruppamento peptidi per zone omogenee
Zona “A”:
603,3*817,7* 969,0
1030,11158,01227,3*1302,8*1361,0*1466,01488,61503,31641,21687,31754,51953,5
Zona “B”:
1007.8 1093,0 1289,0 1375,8 1530,5 1552,8 1573,9 1569,0 1589,5 1835,4
Zona “E”:
1199,3*1275,6* 1792,0*
Zona “F”:
1227,3*1302,8*1361,0* 1451,01488,6*1708,7*1725,11776,8* 1953,5 2236,1
Zona “H”:
1857,0* 2082,5*
Zona “G”:
1275,6* 1792,0*
Zona “K”:
1792,0*
Le masse in verde sono quelle caratteristiche della zona indicata;
Le masse in rossosono quelle distribuite in piu’ zone diverse;
L’asterisco “*” indica le masse che sono state frammentate.
Frammentazione MS/MS ione: m/z = 1275,6 (zona “G”)
Individuazione dei punti (pixel) di massima concentrazione dello ione da frammentare
Distribuzione massa 1275,6 ± 1 Da (Zona “G”): “Hemoglobin subunit Beta”
“Coregistrazione” di immagine istologica & MS MALDI Imaging:
immagini a confronto
Coregistrazione immagine istologica & MS MALDI Imaging:
Distribuzione massa 1275,6 ± 1 Da (Zona “G”): “Hemoglobin subunit Beta”
MALDI MS Imaging applications (II): Metabolomic Field
Small molecules (metabolites < 500 Da) => optimizations
1) Sovrapposizione con i segnali provenienti dai cluster della matrice;
2) ampia gamma di matrici proposte in letteratura ;
Individuazione della matrice
ottimale
3) Rischio di delocalizzazione degli analiti:
nella fase preparativa e/o nella fase della
deposizione della matrice);
4) lavaggio dei tessuti sconsigliato=> soppressione ionica elevata;
5) degradazione rapida di alcuni metaboliti.
Ottimizzazione deiprotocolli di
deposizione della matrice
Accelerazione delle procedure =>
riproducibilità
Processo di co-cristallizzazione matrice-campione: valutazione di omogeneità e riproducibilità deposizioni
Metabol. mix con SA (7.5 mg/ml) Metabol. mix con HCCA (19 mg/ml)
Metabol. mix con:7-Mercapto-4-methylcoumarin (10 mg/ml)
Metabol. Mix con:6,7-Dihydroxycoumarin (10 mg/ml)
HCCA 0.1 Mol (19 mg/ml)
HCCA 0.1 Mol + CTAB 0.5 mMol
HCCA 0.1 Mol + CTAB 1 mMol
HCCA 0.1 Mol + CTAB 0.1 mMol
Omogeneità di distribuzione e dimensione dei cristalli ottimale!
[Immagini tratte da brochure Bruker Daltonics S.r.l.: descrizione sorgente Autoflex III ]
MALDI MS Imaging applications (III):
Imageprep spray optimization and delocalization reduction
Fettina di tessuto con distribuzione superficiale
ben definita delle molecole di interesse diagnostico.Deposizione grossolana della matrice
Migrazione molecolare in seguito ad estrazione e solubilizzazione
Perdita della localizzazione originale.
Durata deposizione: 80’; HCCA depositata: 2.0 mg(circa 2,2 ml di soluz. 5 mg/ml)
Imaging di metaboliti in Cervello di topo C57/BL6
Vetrino con 5 fettine da 15 um: teaching & posizioni dei calibranti.
Imaging di metaboliti in Cervello di topo C57/BL6:
distribuzione GABA ([M+H]+ : m/z = 104.07);
evidenzia effetto inerzia dello spray da F1 a F5.
Imaging di metaboliti in Cervello di topo C57/BL6:
distribuzione GABA ([M+H]+ : m/z = 104.07);
evidenzia effetto inerzia spray (dettaglio F1 vs. F5).
Fettina n. 1 Fettina n. 4
D11
Vetrino con fettine “muscolo di ratto”; teaching & posizioni dei calibranti.
“Carn Mix 6 1-2-3”
(333 nMol/ml) - (33 nMol/ml) - (3 nMol/ml)
E7E18
D14
Lavaggio con EtOH
al 100% (45’’)
45’’
lavaggio
“Carn Mix 6 1-2-3”
(3 nMol/ml) - (33 nMol/ml) - (333 nMol/ml)
45’’
lavaggio
Lavaggio con EtOH
al 100% (45’’)
MALDI MS Imaging applications (IV):
small peptides (endogenous):localization and identification
Ottimizzazione della matrice su mix di peptidi:matrice a tre componenti vs. HCCA
Alanine [M+H]+
Carnosinol [M+H]+
Carnosine [M+H]+ Anserine
[M+H]+
N-Acetil-Carnosine
[M+H]+HCCA[M+H]+
HCCA[M+Na]+
Carnosinol [M+Na]+
Matrice ternaria
Conferma attribuzione peptide mediante frammentazione:
ms/ms [M+H]+ Anserina (m/z = 241.1)
[M+H-CO2]+
[M+H-NH3]+
Sovrapposizione distribuzioni di due diversi peptidi:
distribuzione [M+H]+ Anserine (m/z = 241.1) e Isolucine (m/z = 132.1)
Vetrino con fettine di “cervello di ratto”; teaching & posizioni dei calibranti.
45’’
Fettina n. 1
Fettina n. 4
D11
“Pep Mix”
D7
E18
D14
Fettina n. 2
Fettina n. 3
“Pep Mix”
“Pep Mix”
Matrice “Binaria”
(HCCA + DHB + piperidine) Matrice “TRIS”
MALDI MS Imaging applications (V):
lipids distribution in brain
Lipids:A heterogeneous class of naturally occurring organic compounds classified together on the basis of common solubility properties.
Fahy et al 2005, Journal of Lipid Research 46: 839-861
Vetrino con fettine di “cervello di ratto”
Immagine del vetrino prima e dopo la deposizione della “Matrice TRIS”.
Ioni negativi:
distribuzione dello ione
ST ([M-H]- = 888.7)
e confronto con la zona dei
calibranti (Cd_neg)
e della matrice (Md_neg)
Distribuzione ioni:
PI ([M-H]- = 885.7)
ST ([M-H]- = 888.7)
Vetrino con fettine di “cervello di ratto”:
altri risultati analisi in Ioni Negativi
Distribuzione ioni:
ST ([M-H]- = 890.7)
& [M-H]- : 803.1, 887.1,
901.1, 903.3 e 875.1.
Distribuzione ione:
X ([M-H]- = 882.1)
Vetrino con fettine di “cervello di ratto”Immagine del vetrino prima e dopo la deposizione della “Matrice TRIS”.
Ioni positivi:
distribuzione dello ione
PC/PE/PS/Cer ([M+H]+ = 882.1)
e confronto con la zona dei
calibranti (Cd)
e della matrice (Md)
Distribuzione ione [M+H]+ :
882.1 (PC/PE/PS/Cer )
Vetrino con fettine di “cervello di ratto”
Risultato analisi in Ioni Positivi
Distribuzione ione [M+H]+ :
760.6 (PC 34:1 )
Distribuzione ioni [M+H]+ :
734.6 (PC 32:0 ), 734.3 (PC),
782.3 e 724.3 (PE/PC)
Distribuzioni ioni [M+H]+ :
798.2 + 826.3
Vetrino con fettine di “cervello di ratto”
Sovrapposizione risultati in Ioni Positivi
Fettina grezzaFettina
dopo deposizione
della matrice
Imaging Mass Spectrometry: principal Ion Sources
MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization)
� Wide Ion mass range(mass windows needed).
� Easy data interpretation: mainly [M+H]+ ions.
� High sensitivity and spatial resolution (10-50 um).
� Excellent results with large proteins and peptides.
� Use of Matrix (wide selection available).
� High Vacuum Technique
SIMS(Secondary Ion emission Mass
Spectrometry)
� Higher spatial resolution: spot diameter ≤ 1 um (subcellular localization).
� No use of matrix.
� Optimized for small analytes.
� High Vacuum Technique.
� Hard Ionization method: damage of the sample surface and fragmentation.
� Low upper mass limit:(around 12 Kda)
DESI(Desorption Electrosray
Ionisation)
� Ambient conditions.
� No use of matrix.
� Wide range of analytes.
� Different solvent spray combinations.
� Soft Ionization tecnique.
� Lower Spatial Resolution.
� Lower Sensitivity.
Imaging Mass Spectrometry features summary
Advantages
� It is a label-free tecnique(unlikeimmunological techniques, H&E stains in molecular istology).
� Ability to discern the distribution of previously unknown molecular species.
� MS/MS fragmentation can be used to identify unknown biological macromolecules.
� TOF Analyzer: wide mass range (over 100.000 m/z).
� MALDI source: Easy data interpretation (mainly peaksrepresenting [M+H]+ ions.
Critical Points
� Peculiarity of different samples and anatomical areas.
� Conservation/preservationof tissues/analites and preparation of tissue slices.
� Washing up procedure: focusedmethods and execution times.
� Matrix deposition: coatingprotocols and optimal matrixchoice.
� Acquisition times: in case of high spatial resolution needing.
Ringraziamenti !!!
… e tutti voi!!!
DISFARM
Prof.ssa Marina Carini
Prof. Giancarlo Aldini
Prof.ssa Marica Orioli
Dr. Giacomo Beretta
Prof. Roberto Maffei Facino
Dip. Scienze
FARMACOLOGICHE
Dr. Danilo Norata
Dr. Gianpaolo Tibolla
Osp. San Paolo
Prof. Antonio Colombi
Dr. Federico Maria Rubino
Dr. Marco Pitton
CIGA/COSPECT
Prof.ssa Rita Annunziata
Sig. Marco Pappini
Osp. San Raffaele
Dr. Erica Butti
Bruker Daltonics
Dr. Simone Rubini
Dr.ssa Elisa Basso
Sig. Giuseppe De Filippis
Sheffield University (UK)
Prof.ssa Simona Francese
Dip. Scienze Biomediche
Prof.ssa Elena Donetti
Dr.ssa Francesca Arnaboldi
Dr.ssa Laura Cornaghi
Dip. Biotecnologie Mediche
Dr. Giuseppe Rossoni
ISTM CNR
Sig. Pietro Colombo
COSPECT: MALDI Imaging (E. Caneva: 23/6/2017)