Sol Endoglin Contributes to PE.docx

1Soluble Endoglin Contributes to Preeclampsia

Judul : Soluble Endoglin Contributes to Preeclampsia

Penulis : Shivalingappa Venkatesha1, Mourad Toporsian, Chun Lam, Jun-ichi Hanai, Tadanori Mammoto, Yeon M Kim, Yuval Bdolah, Kee-Hak Lim, Hai-Tao Yuan, Towia A Libermann, Isaac E Stillman, Drucilla Roberts, Patricia A D’Amore, Franklin H Epstein, Frank W Sellke1, Roberto Romero, Vikas P Sukhatme, Michelle Letarte & S Ananth Karumanchi

Publikasi : Nature Medicine, Vol. 12, No. 6 (June)

Tahun : 2006

KONTRIBUSI ENDOGLIN BENTUK LARUT DALAM MENYEBABKAN

PRAEKLAMSIA

Praeklamsia merupakan sindrom hipertensif yang spesifik terjadi pada saat

kehamilan, yang secara signifikan menyebabkan morbiditas serta mortalitas ibu

dan janin. Disfungsi endotel maternal yang diperantarai oleh ekses reseptor VEGF

1 berbentuk larut yang berasal dari plasenta (sVEGFR1 atau sFlt1) muncul

sebagai komponen penting dalam patogenesis penyakit ini. Studi kami

melaporkan bahwa ko-reseptor TGF-β bentuk larut baru yang dihasilkan plasenta,

endoglin (sEng), yang mengalami peningkatan di dalam sera individu penderita

praeklamsia, berkorelasi dengan tingkat keparahan penyakit dan mengalami

penurunan setelah kelahiran. sEng menghambat formasi tabung-tabung kapiler

secara in vitro dan memicu permeabilitas vaskular serta hipertensi secara in vivo.

Efeknya terhadap tikus yang hamil semakin diperbesar oleh pemberian sFlt1 di

saat yang sama, yang menyebabkan praeklamsia berat termasuk sindrom HELLP

dan restriksi pertumbuhan janin. sEng merusak pengikatan TGF-β1 terhadap

reseptor-reseptornya dan pensinyalan hilir (downstream) termasuk dampak

terhadap aktivasi eNOS dan vasolidasi, yang menunjukkan bahwa sEng

mengakibatkan terdisregulasinya pensinyalan TGF-β di vaskulatur. Hasil yang

kami temukan menunjukkan bahwa sEng bekerja secara bersamaan dengan sFlt1

untuk memicu praeklamsia berat.


Praeklamsia menimbulkan komplikasi pada 5% dari kehamilan di seluruh

dunia dan merupakan penyebab utama mortalitas ibu, janin dan neonatus,

khususnya di negara-negara berkembang. Kondisi ini dicirikan oleh onset

hipertensi dan proteinuria di trimester ketiga kehamilan. Praeklamsia berat dapat

menyebabkan munculnya sindrom HELLP, kejang-kejang (eklamsia), dan/atau

restriksi pertumbuhan janin. Plasenta memiliki peran sentral dalam praeklamsia,

seperti yang dibuktikan oleh menghilangnya gejala-gejala penyakit dengan cepat

setelah kelahiran. Manifestasi klinis praeklamsia merefleksikan disfungsi endotel

yang luas, yang menyebabkan vasokonstrisi, iskemia organ akhir, dan

meningkatnya permeabilitas vaskular. Oleh karena itu, telah terdapat dugaan

bahwa faktor-faktor dalam sirkulasi yang berasal dari plasenta dapat memicu

defek-defek endotel yang membawa pada praeklamsia.

Studi kami dan studi lainnya baru-baru ini menunjukkan bahwa kadar sFlt1

dalam sirkulasi yang tinggi (tirosin kinase berbentuk larut yang menyerupai fms,

juga dikenal sebagai reseptor VEGF 1 bentuk larut) yang berasal dari plasenta

dapat berkontribusi terhadap patogenesis praeklamsia. sFlt1 mengikatkan diri

pada VEG fan faktor pertumbuhan plasental (PlGF) serta menetralisir kerja

proangiogeniknya. Konsentrasi sFlt bersirkulasi yang tinggi, bersamaan dengan

berkurangnya VEGF serta PlGF bebas, tidak hanya terjadi selama praeklamsia,

namun juga sebelum onset gejala-gejala klinisnya. Ekspresi sFlt1 secara berlebih

pada tikus mengakibatkan hipertensi, proteinuria, dan endoteliosis glomerulus,

yang merupakan manifestasi-manifestasi klasik dari praeklamsia. Hal ini

menunjukkan bahwa ekses sFlt1 yang bersirkulasi berpotensi memiliki peran

dalam menyebabkan praeklamsia. Akan tetapi, hewan-hewan yang diberi sFlt1

tidak menunjukkan perkembangan hemolisis dan trombositopenia yang

merupakan tanda-tanda yang terdapat pada sindrom HELLP sebagai sub-jenis

praeklamsia berat. Karenanya, kami menduga bahwa faktor-faktor larut lainnya

dari plasenta bekerja secara bersama-sama dengan sFlt1 dalam menyebabkan

disfungsi endotel yang kemudian mengakibatkan praeklasmia berat.


Endoglin (Eng) atau CD105, suatu ko-reseptor permukaan sel untuk isoform

faktor pertumbuhan transformasi (TGF)-β1 dan TGF-β3, diekspresikan dalam

jumlah besar di sel-sel endotel dan sinsitiotrofoblas dan memodulasi kinerja TGF-

β1 dan TGF-β. Mutasi pada gen yang mengkodekan Eng, yaitu ENG, merupakan

penyebab dasar dari telangiektasia turunan dengan perdarahan tipe 1 (HHT1),

suatu kelainan autosom dominan yang dicirikan oleh malformasi pembuluh arteri

dan kehilangan kapiler secara terpusat. Mencit Eng-/- mengalami kematian di

pertengahan kehamilan karena perkembangan angiogenesis dan kardiovaskular

yang defektif, sedangkan mencit Eng+/- mengalami perkembangan tanda-tanda

HHT. Baru-baru ini, ditemukan bahwa Eng terlokalisir ke caveolae, dimana Eng

dapat berasosiasi dengan nitrik oksida sintase endotel (eNOS) dan meregulasi

aktivitas serta tonus vaskular lokalnya. Data-data ini menunjukkan keterlibatan

Eng tidak hanya dalam perkembangan kardiovaskular, namun juga dalam

homeostasis vaskular.

eNOS merupakan sintase nitrik oksida (NO) yang diregulasi oleh

Ca2+/kalmodulin yang dapat diaktivasi oleh perubahan tekanan cairan dan stimuli

saraf huor. NO yang berasal dari endotelium merupakan vasorelaksan kuat yang

berkontribusi terhadap regulasi tekanan darah sistemik, permeabilitas vaskular,

dan angiogenesis. Memang, efek-efek VEGF terhadap angiogenesis dan tonus

vaskular sebagian diperantarai oleh aktivasi eNOS melalui fosforilasi eNOS

Ser1177 (ref. 20) yang dipengaruhi oleh Akt dan meningkatnya asosiasi eNOS

dengan Hsp90 (ref. 21). Demonstrasi kami yang terbaru dimana sFlt-1 yang

berasal dari plasenta di dalam sera individu penderita praeklamsia dapat

menghambat angiogenesis dan memicu hipertensi pada kenyataannya dapat

merefleksikan terganggunya aktivasi eNOs yang dipengaruhi oleh VEGF.

Regulasi aktivitas eNOS bersifat kompleks, yang melibatkan regulasi dinamik

status fosforilasinya. Meskipun fosforilasi pada Ser1177 mengindikasikan aktivasi

eNOS yang dipicu oleh agonis, namun proses tersebut didahului oleh defosforilasi

pada Thr495. Koordinasi reaksi-reaksi tersebut menentukan aktivitas eNOS di sel-

sel endotel,


Sekarang kami akan melaporkan bentuk larut Eng (sEng) baru 65 kDa yang

berasal dari plasenta yang terdapat di dalam sera wanita hamil, yang mengalami

peningkatan pada individu penderita praeklamsia, dan semakin meningkat seiring

meningkatnya tingkat keparahan penyakit. sEng bekerjasama dengan sFlt1 untuk

memicu disfungsi endotel in vitro dan penyakit yang menyerupai praeklamsia

berat in vivo. Kami menunjukkan bahwa sEng menginterferensi pensinyalan TGF-

β1 dan aktivasi eNOS di sel-sel endotel, sehingga mendisrupsi mekanisme

homeostasis kunci yang penting bagi pemeliharaan kesehatan vaskular.

HASIL

Regulasi naik Eng pada plasenta penderita praeklamsia

Untuk mengidentifikasi faktor-faktor baru dari plasenta yang terlibat dalam

praeklamsia, kami melakukan penyusunan profil ekspresi gen jaringan plasenta

dari wanita hamil normal dan wanita hamil dengan praeklamsia menggunakan

microarray chip Affymetrix U95A. Di samping regulasi naik mRNA yang

mengkodekan sFlt1 dan Flt1 secara mencolok pada plasenta penderita praeklamsia

dibandingkan plasenta dari kehamilan normal (dipasangkan berdasarkan usia

kehamilan), kami mencatat adanya peningkatan empat kali lipat pada mRNA

ENG, yang dikonfirmasi oleh analisis blot utara (northern blot). Akan tetapi, tidak

seperti sFlt1, tidak terdeteksi adanya mRNA ENG yang lebih pendek atau

tersambung. Pewarnaan imun potongan-potongan plasenta mengkonfirmasi

meningkatnya ekspresi Eng, khususnya pada sinsiotrofoblas plasenta penderita

praeklamsia pada minggu ke-25 dan 40 relatif terhadap kehamilan kontrol yang

dipasangkan berdasarkan usia. Analisis blot barat (western blot) terhadap Eng

yang menghasilkan imunopresipitasi plasenta normal dan plasenta praeklamtik

menunjukkan adanya monomer Eng 90 kDa, yang merupakan karakteristik

protein membran plasma integral pada kedua kelompok, namun dengan kadar

yang lebih tinggi pada sampel praeklamtik. Kami juga menemukan adanya pita 65

kDa yang lebih kecil, yang menunjukkan bahwa bentuk Eng larut (sEng)

dihasilkan oleh plasenta. Ekspresi sEng di plasenta penderita praeklamsia empat


kali lipat lebih tinggi dibandingkan kehamilan normal (n=10 per kelompok, P <

0,01). Meskipun baik Eng maupun sEng teregulasi naik pada praeklamsia,

kuantifikasi rasio sEng/Eng pada spesimen-spesimen plasenta ini tidak

menunjukkan adanya perbedaan yang signifikan antara sampel normal dan sampel

praeklamtik, yang menunjukkan bahwa Eng maupun sEng meningkat secara

proporsional pada praeklamsia.

Peningkatan sEng pada serum berkorelasi dengan tingkat keparahan

praeklamsia

Setelah immunoblotting Eng menghasilkan imunopresipitasi Eng dari sera

pasien-pasien praeklamsia, kami menemukan sebuah pita 65 kDa tunggal. Protein

ini terdapat dalam jumlah yang jauh lebih kecil di dalam sera wanita hamil normal

dan hampir tidak terdeteksi pada wanita yang tidak hamil. Purifikasi sera wanita-

wanita penderita praeklamsia dan analisis dengan spektrometri massa

menunjukkan sejumlah peptida spesifik Eng yang berkisar dari Gly27 hingga

Arg393, yang mengindikasikan bentuk Eng larut (sEng) yang merujuk pada

daerah terminal-N pada protein dengan panjang utuh.

Kenaikan konsentrasi sEng yang kami temukan di dalam sera wanita

penderita praeklamsia menunjukkan bahwa hal tersebut dapat berperan sebagai

penanda diagnostik maupun prognostik bagi penyakit ini. Kuantifikasi konsentrasi

sEng serum oleh ELISA menunjukkan masing-masing peningkatan dua dan tiga

kali lipat pada kehamilan preterm dan aterm djbandingkan kondisi non-hamil,

yang menunjukkan peran bagi sEng selama kehamilan normal. Konsentrasi sEng

pada penderita praeklamsia ringan, praeklamsia berat, dan sindrom HELLP

masing-masing adalah tiga, lima, dan sepuluh kali lipat lebih tinggi dibandingkan

kontrol dengan kehamilan preterm yang dipasangkan berdasarkan usia kehamilan.

Karakteristik klinis dari individu-individu ini ditunjukkan pada Tabel Tambahan 1

(online). Konsentrasi sEng pada wanita-wanita hamil berkorelasi dengan

konsentrasi sFlt1 (R2=0,56) kecualli pada kelompok sindrom HELLP, dimana

kadar sEng lebih tinggi dibandingkan kadar sFlt1. Sampel darah dari subset


wanita yang diperoleh 48 jam setelah pengeluaran plasenta menunjukkan

penurunan 70% pada rerata kadar sEng yang bersirkulasi pada wanita dengan

kehamilan praeklamtik dibandingkan wanita dengan kehamilan normal. Meskipun

data-data ini menunjukkan bahwa plasenta merupakan sumber sEng utama selama

kehamilan, sumber-sumber lainnya seperti vaskulatur maternal tidak dapat

diabaikan.

Efek sEng terhadap fungsi endotel

TGF-β dan VEGF merupakan faktor-faktor yang krusial dalam angiogenesis.

sEng rekombinan menghambat pembentukan tabung endotel pada Matrigel in

vitro hingga tahap yang sama seperti sFlt1. Terlebih lagi, sEng memberikan

potensi aksi antiangiogenik sFlt1, sebagaimana terlihat oleh pengurangan yang

lebih banyak dari jumlah struktur yang menyerupai kapiler saat kedua protein

hadir (Gambar 3a). Hal ini memperkirakan bahwa sEng dan sFlt1 menghambat

efek proangiogenik TGF-β1 dan VEGF, secara berurutan, yang hadir pada

Matrigel. Permeabilitas kapiler meningkat dalam praeklamsia22, dan penderita

praeklamsia lebih rentan untuk mengalami edema periferal dan pulmonari. Oleh

karena itu, kami menguji peran sEng dan sFlt1 dalam permeabilitas mikrovaskular

menggunakan assay biru Evans pada tikus BALB/c yang sebelumnya diobati

dengan sFlt1 yang mengekspresikan adenovirus, sEng, sFlt1+sEng atau protein Fc

tikus sebagai kontrol negatif. Permeabilitas kapiler meningkat oleh sEng dan sFlt1

pada paru-paru, hati, dan ginjal (Gambar 3b). Utamanya, kombinasi sEng dan

sFlt1 menunjukkan efek tambahan pada hati, mengindikasikan bahwa reseptor-

reseptor bentuk larut ini dapat bertindak bersamaan untuk mengganggu integritas

endotel dan memicu kebocoran dan kerusakan vaskular yang besar.

Efek in vivo dari sEng dan sFlt1

Untuk memicu ciri-ciri klinis praeklamsia pada tikus hamil, kami menggunakan

ekspresi adenoviral dari sEng dan sFlt1, sendiri-sendiri atau digabungkan. Pada

hari ke 17-18 kehamilan, data hemodinamika dan biokimia mengindikasikan

bahwa sEng memicu perubahan signifikan dalam tekanan arteri rata-rata / mean


arterial pressure (MAP), meskipun lebih rendah dari yang teramati pada sFlt1

(Tabel 1). Proteinuria pada tikus yang diobati sEng bersifat sedang, tetapi bersifat

parah pada kelompok tikus yang diobati sFlt1. Kelompok sFlt1 + sEng

menunjukkan proteinuria rentang nefrotik, hipertensi parah dan bukti biokimia

sindrom HELLP (peningkatan laktat dehidrogenase (LDH) dan aspartate

aminotransferase (AST), dan penurunan jumlah platelet). Kami mengamati

penghambatan pertumbuhan janin pada anak-anak yang lahir dalam kelompok

sFlt1 + sEng, kemungkinan terkait dengan iskemia dan kerusakan plasenta (Tabel

1).

Histologi ginjal oleh mikroskop cahaya dan elektron menunjukkan

endoteliosis fokal dalam kelompok sEng dibandingkan dengan kelompok kontrol.

(Gambar 4a dan Gambar Tambahan 1 online). Endoteliosis glomerular parah

teramati dalam kelompok sFlt1 dan sFlt1 + sEng (Gambar 4a dan Gambar

Tambahan 1). Kami mengamati kerusakan vaskular ekstensif dari plasenta,

meliputi infarksi pada sambungan Ibu-janin pada kelompok sFlt1 + sEng, tetapi

tidak pada tikus kontrol atau pada tikus yang diobati dengan salah satu agen

(Gambar 4b). Kami mencatat peradangan yang tersebar pada lapisan sel raksasa

(berhubungan dengan trofoblas invasif manusia) pada kelompok sFlt1 dan sEng,

dan peningkatan peradangan pada kelompok sFlt1 + sEng dibandingkan dengan

kelompok sFlt1 atau sEng. Histologi hati menunjukkan tanda-tanda iskemia dan

area nekrosis pada kelompok sFlt1 + sEng, sama dengan yang terlihat pada

penderita sindrom HELLP (Gambar 4c). Bukti hemolisis pada kelompok sFlt1 +

sEng dipastikan pada noda darah periferal, yang mana kami temukan skistosit dan

retikulositosis (Gambar 4d). Kami juga melihat tanda-tanda kerusakan vaskular

Ibu yang parah setelah injeksi sFlt1 dan sEng bersamaan pada tikus yang tidak

hamil, memperkirakan bahwa fenotip pada tikus hamil berasal dari efek langsung

pada pembuluh maternal dan tidak membutuhkan plasenta (data tidak

ditunjukkan).


sEng menghambat vasodilasi bergantung NOS yang dimediasi TGF-β

Karena efek yang diketahui dari VEGF dalam mengurangi reaktivitas vaskular

melalui aktivasi eNOS dan demonstrasi terbaru bahwa Eng memodulasi aktivitas

vasomotor yang bergantung eNOS19, kami menilai efek hemodinamik dari isoform

TGF-β dan sEng pada pembuluh mikro ginjal tikus yang diisolasi. TGF-β1 dan

TGF-β3 memicu peningkatan diameter arteri yang tergantung dosis (Gambar 5a),

sedangkan TGF-β2, yang bukan ligan untuk Eng, tidak menghasilkan vasodilasi

yang signifikan (< 2% pada 0,1 dan 1 μg/ml). sEng secara signifikan mengurangi

efek TGF-β1 dan TGF-β3 (Gambar 5a). Efek akut dari isoform TGF-β1 dan TGF-

β3 pada tonus vaskular belum kami ketahui sebelumnya dan juga terlihat pada

pembuluh mesenterik (Gambar Tambahan 2 online). VEGF dan TGF-β1 memiliki

efek tambahan pada vasodilasi, yang dihambat oleh kombinasi sEng dan sFlt1

pada konsentrasi yang tercatat pada penderita praeklamsia (Gambar 5b). L-NAME

menghambat vasodilasi yang dimediasi oleh TGF-β1 dan VEGF,

mengindikasikan respon yang bergantung NOS (Gambar 5b). Data-data ini

memperkirakan bahwa sFlt1 dan sEng yang beredar dapat melawan vasodilatasi

bergantung NO fisiologis yang ditimbulkan oleh faktor-faktor pertumbuhan

angiogenik ini, berperan dalam perkembangan hipertensi yang terlihat pada

praeklamsia.

sEng menghambat pengikatan dan pensinyalan TGF-β1 pada sel endotel

Mengingat bahwa endoglin merupakan koreseptor untuk isoform TGF-β1 dan

TGF-β3, kami memperkirakan bahwa sEng bekerja dengan mengganggu

pengikatan reseptor permukaan sel. Mem-pra-inkubasikan TGF-β1 yang di-

radiolabel dengan rekombinan sEng menurunkan signifikan pengikatannya

terhadap reseptor tipe II TGF-β (TβRII) pada 50 dan 100 pM (Gambar 5c).

Sehingga, sEng beradu untuk pengikatan TGF-β1 terhadap reseptornya pada sel

endotel. Untuk menguji apakah hal ini mengarah pada perusakan pensinyalan,

kami menilai aktivitas konstruksi CAGA-Luc reporter pada sel endotel manusia.


TGF-β1 memicu aktivasi CAGA-Luc reporter yang bergantung pada Smad 2/3,

dan respon ini dibasmi oleh pengobatan dengan sEng (Gambar 5d).

sEng menghambat aktivasi eNOS yang dimediasi TGF-β1

Meskipin studi-studi terdahulu telah menunjukkan bahwa paparan kronis sel

endotel terhadap TGF-β memicu ekspresi gen dan protein eNOS23,24, efek

langsung dari TGF-β1 pada aktivasi eNOS belum dicirikan. Karena penemuan

kami bahwa TGF-β1 memicu vasorelaksasi yang bergantung NOS pada pembuluh

resisten ginjal dan mesenterik, kami menjelajahi efek langsungnya pada aktivasi

eNOS. Meskipun TGF-β1 tidak memiliki efek pada fosforilasi eNOS Ser1177,

TGF-β1 memicu defosforilasi signifikan (P < 0,01 terhadap kontrol baseline) pada

Thr495 (Gambar 5e), memperkirakan bahwa TGF-β meregulasi status fosforilasi

dari residu kunci yang terlibat dalam aktivasi eNOS. Efek ini diturunkan

signifikan oleh sEng (Gambar 5e).

PEMBAHASAN

Disfungsi endotel Maternal yang disebabkan oleh faktor bentuk larut yang berasal

dari plasenta seperti sFlt1 muncul sebagai komponen utama dalam patogenesis

praeklamsia25,26. Kami melaporkan bentuk larut yang asing dari Eng yang berasal

dari plasenta yang hadir dalam sera wanita hamil, yang meningkat pada penderita

praeklamsia dan berkorelasi dengan tingkat keparahan penyakit. Sebagai

tambahan dari potensi penggunaan sebagai biomarker praeklamsia, kami telah

menunjukkan bahwa sEng mengganggu pembentukan tuba endotel in vitro dan

memicu permeabilitas vaskular dan hipertensi in vivo. Utamanya, sEng dapat

bekerja bersamaan dengan sFlt1 untuk meningkatkan disfungsi endotel dan

memicu gejala klinis praeklamsia parah, meliputi perkembangan sindrom HELLP

dan penghambatan pertumbuhan janin. Kami menunjukkan bahwa TGF-β1

memicu vasorelaksasi melalui aktivasi eNOS dengan memicu defosforilasi

Thr495, memberikan mekanisme asing untuk vasoregulasi yang bergantung pada

endotelium. sEng mengganggu pengikatan reseptor TGF-β dan pensinyalan hilir

pada sel endotel, dan mengurangi aktivasi eNOS. Kami mengusulkan bahwa


kontribusi sEng dan sFlt1 pada patogenesis praeklamsia Ibu, setidaknya terhubung

dengan penghambatan stimulasi VEGF dan TGF-β dari aktivasi NO yang

bergantung pada endotel dan efek vasomotor.

Imunoreaktivitas Eng yang meningkat telah dilaporkan dalam plasma

individu penderita tumor angiogenik27, tetapi sifat alaminya masih sulit

dimengerti. Kami telah mencirikan bentuk Eng yang beredar dalam kehamilan

normal dan diregulasi naik dalam praeklamsia. Ketiadaan varian sambungan lain

dalam plasenta dan rangkaian peptida parsial dari sEng yang dimurnikan

memperkirakan bahwa hal itu adalah produk belahan N-terminal dari Eng panjang

penuh. Karena betaglikan, konseptor TGF-β lain dengan rangkaian identitas

parsial terhadap Eng, dapat dilepaskan oleh metaloprotease-1 tipe membran /

membrane-type metalloprotease-1 (MT1-MMP)28, kami menduga bahwa sEng

dapat dihasilkan oleh mekanisme yang serupa.

Kami menunjukkan bahwa sEng mencegah pengikatan TGF-β1 terhadap

TβRII pada sel endotel, berakibat pada penurunan pensinyalan. Karena TGF-β1

yang beredar dirumitkan oleh peptida yang terkait latensi dan protein pengikat

TGF-β1 laten, TGF-β1 yang beredar tidak dapat mengikat reseptornya kecuali

diaktifkan. Oleh karena itu ada kemungkinan bahwa sEng hanya menghambat

efek TGF-β1 secara lokal, di mana TGF-β1 aktif dihasilkan. Karena itulah sEng

tidak akan berakibat pada konsentrasi TGF-β1 yang beredar. Ketika TGF-β1 aktif

yang beredar diukur dalam kohort wanita hamil kami, TGF-β1 tidak dapat

terdeteksi selama kehamilan, memastikan bahwa mayoritas TGF-β1 yang beredar

tidak aktif. Meskipun beberapa studi klinis melaporkan perubahan sedang dalam

TGF-β1 total yang beredar dalam praeklamsia29–31, data kami tidak menunjukkan

perbedaan signifikan antara kehamilan normal dan praeklamtik (35,95 ng/ml

dibandingkan 37,74 ng/ml dalam serum, secara berurutan). Eng juga mampu

untuk mengikat ligan famili TGF-β lain, seperti aktivin dan BMPs32, meskipun

tidak ada peran fungsional Eng dalam memediasi efeknya yang telah dijelaskan.


Dalam studi ini, kami mengidentifikasikan efek langsung dari TGF-β1 dan

TGF-β3 pada reaktivitas vaskular, konsisten dengan kekhususan yang diketahui

dari Eng permukaan sel untuk isoform-isoform ini, sehingga memperkirakan

peran pentingnya dalam vasodilatasi yang bergantung TGF-β. Efek ini bergantung

pada NOS dan mendukung penemuan kami bahwa Eng berinteraksi dengan eNOS

dan menstabilkan aktivasinya19. Bersamaan, data-data ini memperkirakan peran

penting untuk Eng dalam menghubungkan aktivasi reseptor TGF-β terhadap

sintesis NO. Kami telah menemukan bahwa TGF-β1 men-defosforilasi-kan eNOS

pada Thr495, lagkah wajib yang penting untuk meningkatkan sensitivitas Ca2+ dan

aktivitas enzim dan mencegah pelepasan dan produksi superoksida yang berasal

dari eNOS. Meskipun aktivasi eNOS juga melibatkan peningkatan terkoordinasi

dalam fosforilasi Ser1177, hal ini tidak teramati dalam tanggapan terhadap TGF-

β1. TGF-β dapat secara khusus memodulasi defosforilasi Thr495 dan bersinergis

dengan faktor-faktor seperti VEGF, yang dapat mengaktifkan eNOS dengan mem-

fosforilasi Ser1177. Kami mengamati bahwa TGF-β dan VEGF memiliki efek

tambahan pada vasodilatasi bergantung NOS yang secara penuh dibalik oleh sEng

dan sFlt1 pada konsentrasi yang terlihat pada penderita praeklamsia.

Studi fungsional kami memperkirakan bahwa sEng dan sFlt1 bekerja

bersama untuk memicu kerusakan vaskular dan sindrom HELLP dengan

mengganggu pensinyalan TGF-β1 dan VEGF, secara berurutan. Satu molekul

yang mungkin terlibat dalam patogenesis hipertensi33 dan penting pada

pensinyalan VEGF dan TGF-β1 adalah NO. Beberapa studi mendukung hipotesis

bahwa penurunan NO yang tersedia secara biologis penting untuk patogenesis

praeklamsia34 Penghambatan aktivasi eNOS oleh sFlt1 dan sEng memperkirakan

basis molekular untuk peningkatan MAP. Terlebih lanjut, karena TGF-β1 dan

VEGF menstimulasi ekspresi eNOS24,35, ada kemungkinan bahwa sEng dan sFlt1

menghambat ekspresi eNOS secara kronis dan kelebihan konsentrasinya yang

beredar dapat berperan dalam hipertensi yang ada pada praeklamsia. Efeknya

dalam menurunkan aktivasi eNOS juga dapat berperan dalam peningkatan

permeabilitas vaskular yang teramati pada praeklamsia36. Molekul lain yang


mungkin penting pada patogenesis keadaan prokoagulan dan trombositopenia

pada tikus yang diobati sFlt1 + sEng merupakan faktor antitrombotik prostasiklin

(PGI2). VEGF dan TGF-β1 menstimulasi produksi PGI2 bahkan sebelum onset

klinis praeklamsia40. Karena diketahui bahwa TGF-β memicu produksi VEGF

oleh perisit41, juga dimungkinkan bahwa sEng mengganggu fungsi VEGF secara

tidak langsung melalui rusaknya produksi VEGF oleh perisit.

Plasenta wanita penderita praeklamsia parah dicirikan oleh invasi dangkal

sitotrofoblas dan rusaknya peremajaan arteriol spiral. Selama plasentasi normal,

sitotrofoblas menjalani sebuah program pseudovaskulogenesis dengan

memperoleh penanda endotel VE-kaderin dan αvβ3 integrin, sebuah proses yang

rusak dalam praeklamsia42,43. Plasentasi yang rusak ini dan iskemia yang

menyertainya dianggap peristiwa utama yang berakibat pada elaborasi faktor

bentuk larut ke dalam sirkulasi. Pengobatan kultur eksplan vili dengan antisense

ENG oligonukleotid meningkatkan migrasi dan pertumbuhan trofoblas ke arah

luar44, memperkirakan bahwa Eng permukaan sel secara negatif meregulasi proses

ini. Kami menduga bahwa sEng dihasilkan oleh plasenta sebagai mekanisme

kompensasi untuk membatasi efek Eng permukaan sel. Pada praeklamsia,

produksi endoglin permukaan sel yang berlebihan akan berakibat pada

peningkatan sEng dalam sirkulasi Ibu, yang nantinya akan berperan dalam

manifestasi klinis praeklamsia.

Penemuan kami dalam peran sEng pada praeklamsia memiliki implikasi

diagnostik dan terapeutik. Sejalan dengan sFlt1 (referensi 9), sEng yang beredar

mulai meningkat 6–10 minggu sebelum gejala klinis praeklamsia (S.A.K. & R.R.,

pengamatan yang tidak diterbitkan). Kami berasumsi bahwa uji prediktif yang

mengukur sEng, sFlt1, dan PlGF dalam serum akan memiliki peningkatan

sensitivitas dan kekhususan, dan memberikan alat yang berguna dalam mencegah

mortalitas yang disebabkan praeklamsia. Sebagai tambahan, menetralkan antibodi

pada sEng dan sFlt1 dapat menguntungkan dalam pengobatan praeklamsia.

Antibodi monoklonal terapeutik yang menargetkan Eng permukaan sedang

dikembangkan untuk pengobatan kanker metastatik45. Data kami memperkirakan


bahwa sEng mungkin merupakan jalan lain untuk mengganggu tumor yang aktif

secara angiogenik yang mengekspresikan banyak TGF-β. Strategi serupa telah

dilakukan pada rangkaian pensinyalan VEGF menggunakan perangkap VEGF,

sFlt1 yang dimodifikasi yang sedang berada dalam percobaan klinis kanker46.

Singkat kata, kami telah menunjukkan bahwa konsentrasi beredar yang

berlebihan dari sEng dan sFlt1 pada penderita praeklamsia berperan pada

patogenesis hipertensi, proteinuria, endoteliosis glomerular, sindrom HELLP dan

penghambatan pertumbuhan janin – semuanya tanda-tanda praeklamsia parah.

Memahami regulasi produksi sEng dan sFlt1 pada plasenta dan efeknya pada

fungsi vaskular sistemik dan plasenta seharusnya mengarah pada wawasan yang

lebih baik mengenai peran-perannya selama kehamilan normal dan patogenesis,

prediksi, dan pencegahan praeklamsia.

METODE

Reagen. Kami membeli sEng manusia rekombinan (1–587 asam amino,

terhubung dengan daerah ekstrasel Eng permukaan sel), sFlt1 manusia, sEng dan

sFlt1 tikus, TGF-β1 dan TGF-β3 manusia, VEGF-164 tikus dan VEGF-165

manusia dari R&D Systems. Antibodi monoklonal tikus terhadap Eng manusia

(klon P4A4) dan antibodi poliklonal (H-300) terhadap daerah N-terminal Eng

manusia dari Santa Cruz. Peralatan ELISA untuk manusia dan sFlt1 tikus, dan

sEng rekombinan manusia diperoleh dari R&D systems.

Subjek. Seluruh studi klinis disetujui oleh Beth Israel Deaconess Medical Center

Committee dalam investigasi klinis di mana seluruh subjek direkrut dan diberikan

persetujuan terinformasi. Informasi klinis dijelaskan dalam Tabel Tambahan 1.

Praeklamsia didefinisikan oleh kriteria American College of Obstetricians and

Gynecologists47. Penderita sindrom HELLP ditampilkan sebagai kelompok

praeklamsia parah yang terpisah. Sindrom HELLP didiagnosa ketika individu

memiliki trombositopenia (< 100.000 sel/μl) dan peningkatan LDH (4600 IU/L)

dan AST (> 70 IU/L). Wanita hamil sehat dimasukkan sebagai kelompok kontrol;

8 orang dengan persalinan prematur bertindak sebagai kontrol umur gestasi.


Spesimen darah dari 4 wanita sehat yang tidak hamil dalam kelompok usia (30–45

tahun) juga dimasukkan. Sampel plasenta diperoleh segera setelah kelahiran.

Sampel plasenta yang digunakan dalam studi ini dipilih secara acak dari kelompok

praeklamsia (ringan, parah, HELLP) dan kelompok kontrol (kelahiran tepat waktu

dan prematur) yang dijelaskan dalam Tabel Tambahan 1, dan satu-satunya

kriteria yang digunakan untuk seleksi adalah kelompok kontrol cocok dalam umur

gestasi terhadap penderita praeklamsia. Serum dikumpulkan pada saat kelahiran

(0–12 jam sebelum) dan pada 48 jam (±8 jam) sesudah kelahiran.

Blot utara, ELISA, blot barat, imunokimia dan imunopresipitasi. Kami

melakukan blot utara, ELISA, blot barat, imunokimia dan imunopresipitasi

sebagaimana dijelaskan dalam Metode Tambahan online.

Pemurnian sEng dan analisis oleh spektometri massa. Kami secara berurutan

memberikan serum (10 ml) dari penderita praeklamsia ke kolom biru CM Affi-gel

untuk membuang albumin dan Sefarosa A protein (Bio-rad) untuk membuang

imunoglobulin. Kami dengan perlahan memberikan aliran 2,5 ml kolom antibodi

monoklonal 44G4 IgG ke Eng manusia, yang terkonjugasi ke Sefarosa. Kami

mengelusi fraksi ikatan dengan 0,02 M dietilamin (pH 11,4) dan segera

menetralkannya dengan 1 M Tris pH 7,8. Kami mengumpulkan fraksi 4 dan 5

dengan peningkatan penyerapan pada 280 nm, menguranginya dengan 10 mM

DTT selama 1 jam pada 57 0C dan mengalkilasinya dengan 0,055 M

iodoasetomida. Kami kemudian mengolah sampel sepenuhnya dengan tripsin

(1:100). Kami menunda kembali sampel yang telah diliofilisasi pada 0,1% asam

trifluoroasetik dan menginjeksinya ke CapLC (Waters) instrumen kromatografi

cairan performa tinggi. Kami memisahkan peptida menggunakan kolom Nano

Series 75 mm (LC Packings) dan menganalisanya menggunakan sistem Qstar XL

MS/MS. Kami mencari data menggunakan mesin pencari Mascot (Matrix

Science) terhadap basis data protein manusia NCBInr.


Assay tuba endotel dan eksperimen permeabilitias mikrovaskular. Kami

melakukan assay tuba endotel dan permeabilitas vaskular sebagaimana dijelaskan

dalam Metode Tambahan.

Penghasilan adenovirus. Vektor adenovirus yang mengandung sFlt1 dan Fc telah

sebelumnya dijelaskan4,48. Untuk menghasilkan adenovirus sEng, kami

menggunakan Adeasy Kit (Stratagene). Dengan singkat, kami memperkuat sEng

manusia (Thr27–Leu586) yang terhubung dengan daerah ekstrasel penuh dengan

PCR menggunakan cDNA manusia yang menyandi (encoding) klon Eng panjang

penuh (Invitrogen) sebagai contoh dan primer berikut: maju 5’-

ACGAAGCTTGAAACAGTCCATTGTGACCTT-3’ dan mundur,

5-’TTAGATATCTGGCCT TTGCTTGTGCAACC-3’. Kami membuat sub

kloning fragmen PCR yang ditingkatkan ke dalam vektor pShuttle-CMV

(Stratagene) dan memastikan ekspresi oleh blotting barat. Kami memperkuat klon

sEng yang dipastikan dalam sel 293T dan memurnikannya pada gradien ketebalan

CsCl2 (Qbiogene). Ad-CMV (kontrol) diperoleh dari Qbiogene.

Model tikus praeklamsia. Seluruh protokol hewan disetujui oleh Beth Israel

Deaconess Medical Center Institutional Animal Care dan Komite Penggunaan.

Kami menginjeksi tikus Sprague-Dawley hamil dengan 2 x 109 unit Ad-CMV

(kontrol) pembentuk plak, Ad-sFlt1, Ad-sEng atau Ad-sFlt1+Ad sEng secara

intravena. Kami menginjeksikan hewan pada hari 8 atau 9 kehamilan dan

mengukur MAP intrakarotid pada hari 17 – 18 dalam pengaruh anestesia

sebagaimana dijelaskan sebelumnya4. Kami memastikan kadar sFlt-1 dan sEng

yang beredar dengan blotting barat dan mengkuantifikasinya dengan

menggunakan peralatan ELISA yang tersedia untuk umum (R&D Systems). Kami

mengukur albumin urin dengan dipstick standar dan mengkuantifikasinya

menggunakan peralatan ELISA Nephrat (Exocell). Kami mengukur kreatinin urin

menggunakan assay kreatinin Metra (Quidel Corp). Kami mengukur AST dan

LDH menggunakan alat komersil dari Thermo Electron. Kami memperkirakan

jumlah platelet dengan hemositometri (Hemavet 850). Kami mendeteksi skistosit

dengan mewarnai bercak darah periferal dengan warna withWright. Tikus


terbunuh, anak-anaknya dihitung dan janin dan plasenta setiap tikus ditimbang.

Kami menggunakan ginjal dan plasenta yang diambil untuk histopatologi dan

mikroskopi elektron sebagaimana dijelaskan sebelumnya4.

Pengikatan TGF-β1 pada sel endotel. Kami memberi label berdasarkan afinitas

pada lapisan mono sel endotel yang bertemu selama 4 jam pada 40C dengan

peningkatan konsentrasi [I125] TGF-β1 (DuPont NEN) setelah prainkubasi dengan

atau tanpa 2,5 nM sEng rekombinan atau TGF-β1 dingin (kelebihan 40 kali lipat),

membersihkannya dan menghubungkan silang dengan disuccinimidyl suberate

(Pierce). Kami melarutkan sel dalam buffer yang mengandung 1% Triton X-100

dan memisahkan ekstrak dalam kondisi penurunan dengan SDS-PAGE pada 4–

12% gel13. Kami memvisualisasi kadar ikatan [I125]TGF-β1 terhadap TβRII dengan

pencitra fosfor STORM dan mengkuantifikasikannya dengan densitometri

menggunakan piranti lunak Image-Quant.

Aktivasi Smad 2/3 bergantung TGF-β1. Kami mentransfeksikan sel endotel

umbilik manusia (HUVECs, Clonetics; passage 3) dengan (CAGA)12-Luc

plasmid (dari K. Miyazano, University of Tokyo) dalam ketiadaan TGF-β1

dan/atau sEng dan mengukur aktivitas lusiferase sebagaimana dijelaskan

sebelumnya49.

Eksperimen reaktivitas mikrovaskular. Kami melakukan eksperimen

reaktivitas mikrovaskular sebagaimana dijelaskan sebelumnya4 menggunakan

pembuluh mikro ginjal atau mesenterik tikus (diameter internal, 70–150 μm).

Dalam seluruh kelompok percobaan, kami menguji respon relaksasi pembuluh

mikro ginjal setelah prakontraksi dengan U46619 (agonis A2 tromboksan)

terhadap 40–60% diameter baseline pada tekanan 40 mmHg. Ketika nada yang

tetap telah tercapai, kami menguji respon terhadap TGF-β1, TGF-β3 atau VEGF

dalam urutan yang terstandarisasi. Kami memberikan seluruh obat-obatan secara

ekstraluminal. Ketika diperlukan, kami mengobati pembuluh lebih awal dengan

sEng, sFlt1 atau 10–5 M L-NAME selama 30 menit.


Fosforegulasi eNOS bergantung TGF-β1. Kami menginkubasi sel endotel tikus

yang bertemu dalam media tanpa serum selama 2 jam. Kami menstimulasi sel

dengan TGF-β1 dalam hadir dan tidak hadirnya sEng (100 ng/ml) selama 15

menit dan mengekstrak protein dalam 2% buffer SDS yang disuplemen dengan 1

mM Na8VO4, 10mM Na4P2O7, 25 mM NaF dan penghambat protease

(RocheMolecular Biochemicals). Kami mengkuantifikasi protein dan meng-

imunoblot-nya dengan antibodi poliklonal terhadap eNOS Thr495, Ser1177 atau

antibodi monoklonal khusus untuk eNOS total.

Analisis Statistik. Hasil-hasil ditampilkan sebagai mean ± s.e.m. dan

perbandingan antara berbagai kelompok dibuat dengan analisis variansi

menggunakan ANOVA. Perbedaan signifikan ditandai dengan P < 0,05.

Catatan: Informasi tambahan tersedia pada situs Nature Medicine.


Gambar 1. Ekspresi mRNA ENG dan Eng dalam plasenta kehamilan normal dan

praeklamtik. (a) analisis blot utara untuk mRNA ENG dari plasenta normal dan

praeklamtik dengan umur gestasi (GA) yang terkait. Kadar RNA ribosoma 18S

digunakan sebagai kontrol muatan. (b) Pewarnaan immunofluorescence ganda

dari Eng (merah) dan aktin otot polos (hijau) ditunjukkan untuk plasenta

praeklamtik dan plasenta kontrol yang terhubung yang berasal dari individu

dengan persalinan prematur. Pembesaran dari asli, x200. (c) Penggambaran blot

barat imunopresipitasi Eng menunjukkan Eng panjang penuh (90 kDa) dan

fragmen yang lebih kecil (65 kDa), yang lebih terlihat dalam plasenta praeklamtik.

Sampel normal dan praeklamtik mewakilkan wanita individu. Pemuatan seimbang

untuk lysate yang digunakan untuk imunopresipitasi dipastikan oleh blot barat

aktin pada lysate yang sama.


Gambar 2. Kadar sEng yang meningkat dalam sera dari individu praeklamsia. (a)

blot barat representatif dan grafik imunopresipitasi Eng menunjukkan kadar yang

lebih tinggi dari fragmen (sEng) 65kDa bentuk larut dalam sera wanita

praeklamtik (pada minggu 28, 33 dan 32,2) dibandingkan dengan wanita hamil

normal (pada minggu 34,1, 28,2 dan 39,4; **P < 0,01) dan wanita yang tidak

hamil (††P < 0,01; n = 3 / kelompok). Kadar sEng pada wanita hamil normal lebih

tinggi dibanding yang tidak hamil (##P < 0,01). Ekstrak HUVEC (H) dan sEng

rekombinan manusia bekerja sebagai kontrol positif (90 kDa dan 75 kDa, secara

berurutan). Individu yang cocok untuk usia gestasi dipilih secara acak dari

kelompok normal (prematur dan tepat waktu) dan praeklamsia (parah dan

HELLP) yang dijelaskan dalam Tabel Tambahan 1. (b) sEng dimurnikan dari

serum individu praeklamtik. Fraksi 4 dan 5 yang dielusi dari sefarosa 44G4-IgG

(khusus Eng), dijalankan pad SDS-PAGE dalam kondisi menurun dan diuji oleh


blot barat menggunakan antibodi poliklonal terhadap Eng. Fraksi yang dielusi

dipaparkan terhadap analisis spektometri massa (tiga kali), dan peptida yang

diidentifikasi ditebalkan dan digarisbawahi hurufnya dalam rangkaian Eng

manusia. Asam amino 562-586 yang digarisbawahi melambangkan domain

transmembran Eng permukaan sel manusia. Sera dari 10 individu acak dengan

praeklamsia (parah dan HELLP) dalam Tabel Tambahan 1 dikumpulkan. (c)

Hasil ELISA untuk sEng dan sFlt1 dalam sera individu dengan praeklamsia

berbagai taraf, kehamilan kontrol dan 4 relawan sehat yang tidak hamil. *P < 0,05

dibandingkan dengan kontrol prematur, #P < 0,05 dibandingkan dengan

praeklamsia parah. Seluruh individu yang dijelaskan dalam Tabel Tambahan 1

telah dianalisa. (d) Hasil ELISA untuk sEng dalam subset individu hamil (normal,

n=6; praeklamsia, n=11) dijelaskan pada poin c dengan darah yang diambil

sebelum (0–12 jam) atau setelah (48 jam) kelahiran. *P < 0,05 sebagaimana

dibandingkan dengan sampel T=0. Seluruh individu yang dijelaskan dalam Tabel

Tambahan 1 yang dapat kami peroleh spesimen serumnya 48 jam setelah

melahirkan telah dianalisa.


Gambar 3. sEng menghambat pembentukan kapiler dan meningkatkan

permeabilitas vaskular. (a) Assay angiogenesis dilakukan menggunakan sel

endotel vena umbilik manusia / human umbilical vein endothelial cells (HUVECs)

dalam Matrigel yang dikurangi oleh faktor pertumbuhan dan dilakukan dengan

hadirnya 1 mg sEng rekombinan, sFlt1 atau keduanya, dan panjang tuba endotel

dikuantifikasi. Eksperiman representatif (n=4) ditunjukkan, dengan panjang tuba

rata-rata (dalam piksel) diindikasikan di bawah panel. Hasil panjang tuba

dikuantifikasi, menunjukkan 62,2% ± 3,9, 62% ± 4,1 dan 39,7% ± 4,2 penurunan

dalam sEng dan sFlt1+sEng, secara berurutan (P < 0,01 dibanding kontrol). (b)

Permeabilitas mikrovaskular dinilai oleh kebocoran biru Evans pada tikus yang

diinjeksikan adenovirus yang mengandung Fc (kontrol), sEng, sFlt1 atau

sFlt1+sEng. Kebocoran biru Evans dikuantifikasi dalam berbagai organ. Data

menunjukkan rata-rata empat eksperimen independen. *P < 0,05 dibandingkan

terhadap kontrol, #P < 0,05 dibandingkan sFlt1 sendiri.


Tabel 1. Data hemodinamika dan biokimia tikus hamil

Data ditulis sebagai mean ± s.e.m. *P < 0,05 dibandingkan dengan kelompok

kontrol. aMAP = tekanan diastolik + 1/3 tekanan denyut. bBerat badan janin

merupakan berat rata-rata dari anak-anak untuk setiap kelompok. Ekspresi sFlt1

dan sEng dipastikan pertama kali pada plasma tikus oleh blot barat (Gambar

Tambahan 3) dan konsentrasi yang beredar dikuantifikasi menggunakan

peralatan ELISA yang tersedia untuk umum. Konsentrasi plasma rata-rata sFlt1

pada kelompok kontrol, sEng, sFlt1 dan sFlt1+sEng adalah 0,64 ng/ml, 0,66

ng/ml, 249 ng/ml and 204 ng/ml, secara berurutan. Sama halnya, konsentrasi sEng

dalam keempat kelompok ini adalah 0,39 ng/ml, 129 ng/ml, 0,37 ng/ml dan 123

ng/ml, secara berurutan.


Gambar 4 Perubaham histologis ginjal, plasenta, dan hati dan noda darah

periferal pada tikus hamil setelah pengobatan sEng dan sFlt1. (a) Histologi ginjal

(bagian plastik) kelompok kontrol, sEng, sFlt1 dan sFlt1+sEng. Tikus yang

diobati sEng menunjukkan endoteliosis fokal ringan (mata panah, b) tidak terlihat

dalam glomeruli kelompok kontrol. Tikus yang diinjeksisFlt1 menunjukkan

endoteliosis sedang sampai parah dengan oklusi penuh lumen kapiler. Tikus yang

diobati sFlt1+sEng menunjukkan glomeruli yang sangat bengkak dan menandai

endoteliosis dengan butiran resorpsi protein dalam podosit. Skala ukuran, 50 mm.

(b) Histologi plasenta (warna H&E) dari kelompok kontrol, sEng, sFlt1 dan

sFlt1+sEng. Tikus yang diobati sEng dan sFlt1 menunjukkan peradangan

menyebar (mata panah) pada sambungan Ibu-janin yang tidak terlihat dalam

kelompok kontrol. Ada infarksi perdarahan dan nekrosis fibrinoid dengan

obstruksi lumen pembuluh Ibu (panah) dalam desidua plasenta yang diobati

sFlt1+sEng. Skala ukuran, 200 mm. (c) Histologi hati dalam kelompok kontrol,

sEng, sFlt1 dan sFlt1+sEng. Perubahan iskemik dengan nekrosis multifokal (mata

panah) tercatat dalam kelompok sFlt1+sEng. Kelompok kontrol dan tikus yang

diberikan sEng atau sFlt1 tidak menunjukkan perubahan. Skala ukuran, 200 mm.

(d) Noda darah periferal (Wright stain) dari kelompok kontrol, sEng, sFlt1 dan

sFlt1+sEng. Warna representatif dalam kelompok sFlt1+sEng menunjukkan

skistosit aktif (mata panah) dan retikulositosis (panah). Tidak terlihat hemolisis

dalam kelompok lain.


Gambar 5. sEng rekombinan mengurangi pengikatan TGF-β1 dan berpengaruh

pada vasodilasi melalui aktivasi eNOS. (a) Reaktivitas mikrovaskular pembuluh

mikro ginjal tikus diukur dalam hadirnya TGF-β1 atau TGF-β3 dari 200 pg/ml

sampai 200 ng/ml, dan dengan atau tanpa sEng rekombinan pada 1 mg/ml (n = 4

per eksperiman; *P < 0,05 sebagaimana dibandingkan dengan TGF-β1 atau TGF-

β3 sendiri). (b) Respon mikrovaskular pembuluh mikro ginjal terhadap VEGF,

TGF-β1 (1 ng/ml masing-masing) atau kombinasi keduanya. Efek dari 100 ng/ml

setiap sFlt1 dan sEng dalam respon kombinasi ditunjukkan (n = 4 eksperimen).

Juga ditunjukkan efek penghambatan dari L-NAME pada respon yang distimulasi

TGF-β1 dan VEGF. (c) Autoradiogram representatif dan grafik menunjukkan

peningkatan bergantung dosis dalam [I125]TGF-β1 (6–100 pM) terikat pada TβRII

pada sel endotel tikus. Pengobatan dengan 5 nM sEng rekombinan dengan

signifikan menurunkan pengikatan pada 50 pM dan 100 pM (*P < 0,05

dibandingkan dengan kelompok yang tidak diobati). Kompetisi dengan 40x ekses

TGF-β1 dingin dalam sel yang diobati dengan 100 pM [I125]TGF-β1 menghapus

pengikatan reseptor dan bertindak sebagai kontrol latar belakang (C). (d) Grafik

yang menunjukkan aktivasi konstruksi CAGA-Luc reporter yang bergantung pada

Smad 2/3 yang dipicu TGF-β yang ditransfeksikan pada sel endotel vena umbilik

manusia (HUVECs) dan penghambatan oleh pengobatan dengan sEng (n=3

eksperimen, **P < 0,01 dibandingkan dengan kelompok yang tidak diobati sEng).

(e) Blot barat representatif dan grafik (n=4) menunjukkan defosforilasi signifikan

pada Thr495 eNOS setelah pengobatan dengan TGF-β1 dan pengurangan oleh

sEng (*P < 0,05 dibandingkan dengan yang tidak diobati). Fosforilasi tidak

berubah pada Ser1177 dan kadar eNOS total tetap konstan selama eksperimen.

Documents

Sol Endoglin Contributes to PE.docx