Síntesis de cumarinas 3-azometino- la detección de iones

Síntesis de cumarinas 3-azometino-sustituidas como quimiosensores para

la detección de iones Pb2+ y Hg2+ en medio acuoso

(Synthesis of 3-azometin-substituted coumarin as a chemosensor for the detection of Pb2+ and Hg2+ ions

in aqueous medium)

Astrid Yhuleidy Díaz Núñez

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias, Escuela de Química

Medellín, Colombia

2021

Síntesis de cumarinas 3-azometino-sustituidas como quimiosensores para

la detección de iones Pb2+ y Hg2+ en medio acuoso

Astrid Yhuleidy Díaz Núñez

Tesis o trabajo de investigación presentada(o) como requisito parcial para optar al título de:

Magíster en Ciencias – Química

Director (a):

Ph.D., Diego Luis Durango Restrepo

Codirector (a):

Ph.D., Olimpo José García Beltrán

Línea de Investigación:

Sensores Moleculares Fluorescentes

Grupo de Investigación:

Química de los Productos Naturales y los Alimentos

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de ciencias, Escuela de Química

Medellín, Colombia

2021

Dedicatoria

A mis padres Israel Díaz España y Norby Stella

Núñez Castillo, por enseñarme a nunca rendirme por

alcanzar mis sueños y por ser siempre mi apoyo en

mi formación académica. Mis principios, mis valores

y mis conocimientos se lo debo a ustedes.

A mis hermanos Carlos Manuel y Élver Julián, que

han sido mi ejemplo y mi lucha para alcanzar las

metas. En especial a Élver quien siempre me motiva

a seguir en la lucha.

Muchas gracias

Agradecimientos

Agradezco a:

La Facultad de Ciencias de la Universidad Nacional de Colombia, sede Medellín y su programa

de Maestría en Ciencias Química, por la oportunidad de realizar mis estudios de Maestría.

La Facultad de Ciencias Naturales y Matemáticas de la Universidad de Ibagué, por permitir llevar

a cabo la ejecución del trabajo de tesis presentado.

Al Ministerio de Ciencia, Tecnología e Innovación (Minciencias), por la financiación de este

trabajo a través del proyecto titulado “Desarrollo de quimiosensores para la detección de iones

de mercúricos en agua mediante técnicas espectrofotométricas” Código 130774559056.

A mis directores Diego Luis Durango y Olimpo García Beltrán, por la oportunidad de trabajar en

este proyecto a su lado, por sus enseñanzas y por confiar en mis capacidades y conocimientos.

Agradezco a mis compañeros de maestría, por ayudarme, gritarme, guiarme, aconsejarme y

sobre todo por enriquecerme en conocimiento. A cada uno de ustedes les agradezco, a Santiago

Monje, Karen Gómez, Leidy Orozco, Dayana Botero. En especial a Santiago por ser ese amigo

fiel que me destruye con críticas destructivas pero constructivas a la vez y ser mi amigo de

aventuras académicas.

Agradezco a mis compañeros de la Universidad de Ibagué, por acompañarme en la parte

experimental de mi tesis. Agradezco a Juan Borja y Marcial Fuentes, que me facilitaron el

desarrollo efectivo de mi tesis. Pero, principalmente a Juan por prestarme su computador para

terminar la tesis y por siempre contar con él en cualquier momento.

Agradezco también a los profesores Edison Osorio y Natalie Cortés, por enseñarme quien soy y

para donde voy, y recordarme siempre cuales son mis cualidades y capacidades. Y agradezco a

cada profesor y compañero que me ayudaron en el enriquecimiento de mis conocimientos.

Agradezco enormemente a la señora Milena Ramírez, por acogerme en su casa, por brindarme

cariño, confianza, por darme amor, levantarme en mis caídas y sobre todo hacerme sentir que

estoy en casa. Siempre estaré agradecida con la vida por presentármela en el camino y

apoyarme cada día.

VIII Síntesis de cumarinas 3-azometino-sutituidas como quimiosensores para la detección

de iones Pb2+ y Hg2+ en medio acuoso

Finalmente agradezco a mi familia por su comprensión, su apoyo incondicional y su amor. En

especial a mis padres Israel Díaz España y Norby Stella Núñez Castillo y a mis hermanos Carlos

Manuel y Élver Julián, quienes han sufrido mis berrinches, mis angustias, mis alegrías, mis

rabietas, pero sé que siempre cuento con ellos, porque sé que su amor calma cualquier

turbulencia en mi vida y porque su amor es infinito.

Resumen y Abstract IX

Resumen

Metales como el plomo y mercurio no se le conoce función fisiológica beneficiosa en el cuerpo

humano, su acumulación hace que resulte tóxico, debido a la afinidad que presenta al grupo

sulfhidrilo (-SH) provocando la inhibición de procesos biológicos, generando así daños en la salud

humana, incluyendo problemas principalmente en el sistema nervioso. Estos metales son

generados por la contaminación industrial, y eventos naturales, lo que permite que sean

incorporados en el suelo, cuerpos de agua lóticos y lénticos, organismos vegetales y animales,

y se incorporan a la cadena alimenticia alterando la sostenibilidad de la cadena trófica y

generando riesgo para la salud humana y animal. Por lo tanto, durante las últimas dos décadas

se viene desarrollando una serie de compuesto denominados sondas fluorescentes o

quimiosensores, que pueden detectar iones de forma sensible y selectiva. Dentro de los núcleos

químicos para el diseño de señores moleculares encontramos las cumarinas que poseen

propiedades fotofísicas como cambios de intensidad y desplazamiento de banda fluorescente,

desplazamientos de Stokes y, altos rendimientos cuánticos. Todas estas propiedades fotofísicas

se debe a la optimización sistemática de su estructura electrónica mediante la introducción o

adición de grupos funcionales en la posición C-3 y C-7 (electrón-atractor y electrón-donador),

logrando una mayor sensibilidad y selectividad, hacia la traza de iones metálicos.

En este trabajo se desarrolló la síntesis de derivados cumarínicos 3-azometino- sustituidos y una

tiocumarina, los compuestos obtenidos fueron usados para estudiar su afinidad frente a

diferentes metales en medio acuoso. Estos fueron caracterizados y evaluados por

espectroscopia 1H y 13C RMN, UV-Vis y fluorescencia. La afinidad de los ligandos cumarínicos

3-azometino-sustituidos (H1imina, H2imina y De1imina) mostraron selectividad y sensibilidad por

Pb2+/Fe3+/Fe2+, mientras De2imina mostró interacción por Pb2+/Hg2+/Fe3+/Fe2+ y el compuesto

Cum-S mostró una reacción desulfurización presentada por Hg2+. Los resultados obtenidos

involucraron que los quimiosensores cumarínicos 3-azometino-sustituidos presentaron un

mecanismo de fluorescencia de APAGADO–ENCENDIDO donde podría deberse al efecto de

fluorescencia potenciado por quelación (CHEF–siglas en inglés) inhibiendo el proceso de

isomerización del grupo azometino, mientras la tiocumarina presentó un desplazamiento

hipsocrómico de la banda de emisión. Además, los compuestos cumarínicos mostraron

propiedades colorimétricas tras la interacción ligando-metal. Estos resultados muestran la

utilidad de nuevos compuestos basados en la plantilla estructural cumarínica con ligandos

X Síntesis de cumarinas 3-azometino-sutituidas como quimiosensores para la detección


imínicos y con tiocarbonilo para la detección directa de plomo y mercurio de interés biológico y

ambiental. Además, podrían ser útiles para el desarrollo de nuevas metodologías que permitan

diagnosticar la presencia de metales pesados en recursos hidrológicos y así mitigar el impacto

ambiental generado por los iones Pb2+ y Hg2+.

Palabras clave: Selectividad, sensibilidad, cumarínicos 3-azometino-sustituidos,

isomerización, desulfurización.

Contenido XI

Abstract Metals such as lead and mercury have no known beneficial physiological function in the human

body; their accumulation makes them toxic due to their affinity to the sulfhydryl group (-SH),

causing the inhibition of biological processes, thus causing damage to human health, including

problems mainly in the nervous system. These metals are generated by industrial pollution and

natural events, which allow them to be incorporated into the soil, lotic and lentic water bodies,

plant, and animal organisms, and are incorporated into the food chain, altering the sustainability

of the trophic chain, and generating risk to human and animal health. Therefore, during the last

two decades a series of compounds called fluorescent probes or chemosensors, which can

detections sensitively and selectively, have been developed. Among the chemical cores for the

design of molecular decoys, we find coumarins that possess photophysical properties such as

intensity changes and fluorescent band shifts, Stokes shifts, and high quantum yields. All these

photophysical properties are due to the systematic optimization of its electronic structure by the

introduction or addition of functional groups in the C-3 and C-7 position (electron-attractor and

electron-donor), achieving greater sensitivity and selectivity towards trace metal ions.

In this work the synthesis of 3-substituted coumarin 3-azomethine derivatives and a thiocoumarin

was developed, the compounds obtained were used to study their affinity towards different metals

in aqueous media. These were characterized and evaluated by 1H and 13C NMR, UV-Vis, and

fluorescence spectroscopy. The affinity of the 3-azomethine-substituted coumarin ligands

(H1imine, H2imine, and De1imine) showed selectivity and sensitivity for Pb2+/Fe3+/Fe2+, while

De2imine showed interaction for Pb2+/Hg2+/Fe3+/Fe2+ and the Cum-S compound showed a

desulfurization presented by Hg2+. The results obtained involved that the 3-azomethine-

substituted coumarin coumarin chemosensors presented an OFF-ON fluorescence mechanism

where it could be due to the chelation-enhanced fluorescence (CHEF) inhibiting the isomerization

process of the azomethine group, while thiocoumarin presented a hypsochromic shift of the

emission band. In addition, coumarin compounds showed colorimetric properties upon ligand-

metal interaction. These results show the usefulness of new compounds based on the coumarin

structural template with iminic and thiocarbonyl ligands for the direct detection of lead and mercury

of biological and environmental interest. Furthermore, they could be useful for the development

of new methodologies to diagnose the presence of heavy metals in hydrological resources and

thus mitigate the environmental impact generated by Pb2+ and Hg2+ ions.

XII Síntesis de cumarinas 3-azometino-sutituidas como quimiosensores para la detección


Keywords: Selectivity, sensitivity, 3-azomethine-substituted coumarins, isomerization,

desulfurization.

Contenido XIII

Contenido

Introducción ..................................................................................................................... 1

OBJETIVOS ...................................................................................................................... 3 General .................................................................................................................................. 3 Específicos ............................................................................................................................. 3

1. MARCO TEÓRICO Y ANTECEDENTES ....................................................................... 5 1.1 Metales pesados .......................................................................................................... 5

1.1.1 Plomo .............................................................................................................. 5 1.1.2 Mercurio .......................................................................................................... 7

1.2 Quimiosensores ........................................................................................................... 8 1.2.1 Fluorescencia .................................................................................................. 8 1.2.2 Fluoróforos o fluorocromos .............................................................................10 1.2.3 Cumarinas como Fluoróforos .........................................................................11

2. MATERIALES Y MÉTODOS ....................................................................................... 19 2.1 Preparación de plantillas cumarínicas .............................................................................20

2.1.1 N-(2-oxo-2H-cromen-3-il)acetamida (1) ............................................................20 2.1.2 3-amino-2H-cromen-2-ona (2) ..........................................................................20 2.1.3 7-dietilamino-3-nitro-2H-cromen-2-ona (3) .......................................................21 2.1.4 3-amino-7-dietilamino-2H-cromen-2-ona (4) .....................................................22

2.2 Preparación de cumarina 3-azometino-sustituidas ..........................................................22 2.2.13-((tiofen-2-il-metileno)-amino)-2H-cromen-2-ona (H1imina)..............................22 2.2.2 3-(([2,2'-bitiofeno]-5-ilmetileno) amino)-2H-cromen-2-ona (H2imina) .................23 2.2.3 7-(dietilamino)-3-((tiofen-2-ilmetileno) amino)-2H-cromen-2-ona (De1imina) ....24 2.2.4 3-(([2,2'-bitiofeno]-5-ilmetilen)amino)-7-(dietilamino)-2H-cromen-2-ona (De2imina) 24

2.3 Preparación de tiocumarina .............................................................................................25 2.3.1 Preparación de tiocumarina (2) ........................................................................25

2.3.2 7-(dietilamino)-2H-cromen-2-tiona (Cum-S) ..................................................................26 2.4 Constantes fotofísicas .....................................................................................................26 2.4.1 Preparación de soluciones............................................................................................27

2.4.2 Determinación la longitud de onda de excitación (λex) y la longitud de emisión (λem) 27

2.4.3 Coeficiente de extinción molar (ε) .................................................................................27 2.4.4 Cálculo del rendimiento cuántico (Φ) ............................................................................28 2.5 Estudio de absorbancia, fluorescencia y afinidad por diversos iones metálicos ...............28 2.5.1 Estudio del efecto de distintas concentraciones de Pb2+ sobre la emisión del sensor molecular ...............................................................................................................................28 2.5.2 Determinación de las constantes de asociación ...........................................................29 2.5.3 Determinación de la estequiometría de asociación .......................................................29 2.5.4 Estudio cinético de la reacción entre ligando y metal ....................................................30 2.6 Límite de detección .........................................................................................................30

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .................................................................................... 31 3.1. Síntesis .......................................................................................................................31 3.1.1. Caracterización espectroscopía de 1H y 13C RMN ...................................................33 3.2 Constantes fotofísicas .....................................................................................................36

3.2.1 Longitud de excitación (λex) y coeficiente de extinción molar (ε) .......................36

XIV Síntesis de cumarinas 3-azometino-sutituidas como quimiosensores para la

detección de iones Pb2+ y Hg2+ en medio acuoso

3.2.2 Longitud de emisión (λem), desplazamientos de Stokes y rendimiento cuántico (Ф) 42

3.3 Estudio del compuesto H1imina .......................................................................................46 3.4 Estudio del compuesto H2imina .......................................................................................52 3.5 Estudio del compuesto De1imina .....................................................................................59 3.6 Estudio del compuesto De2imina .....................................................................................66 3.6 Estudio del compuesto Cum-S ........................................................................................77

4. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ............................................................... 87 4.1 Conclusiones ...................................................................................................................87 4.2 Recomendaciones ...........................................................................................................88

ANEXOS ......................................................................................................................... 89

Bibliografía ................................................................................................................... 116

Contenido XV

Lista de figuras

Figura 1. Ciclo del plomo. .......................................................................................................... 6

Figura 2. Ciclo del mercurio ....................................................................................................... 7

Figura 3. Funcionamiento de un quimiosensor. .......................................................................... 8

Figura 4. Diagrama de Jablonski . .............................................................................................. 9

Figura 5. 2H-benzopiran-2-ona o 2H-cromen-2-ona (cumarina). ...............................................11

Figura 6. Sensor (1) “encendido-apagado"................................................................................12

Figura 7. Indicador fluorescente (1) ...........................................................................................12

Figura 8. Quimiosensor basado en rodamina TQ1. ...................................................................13

Figura 9. Quimiosensor HL. . ....................................................................................................13

Figura 10. Sensor molecular 3. ................................................................................................14

Figura 11. Quimiosensor sensible y selectivo para iones de Hg2+ (CBH).. ................................14

Figura 12. Sensor fluorescente y colorimétrico L1.. ...................................................................15

Figura 13. Sensor cumarínico ABG.. .........................................................................................15

Figura 14. Quimiosensor Probe 3..............................................................................................16

Figura 15. Quimiosensor basado en Rodamina B. ....................................................................17

Figura 16. Reacción de condensación de Knoevenagel. ...........................................................20

Figura 17. Reacción de hidrólisis. .............................................................................................20

Figura 18. Reacción de nitración. ..............................................................................................21

Figura 19. Reacción de reducción del grupo nitro. ....................................................................22

Figura 20. Reacción de azometino-sustituido. ...........................................................................22

Figura 21. Formación de iminas. ...............................................................................................23

Figura 22. Reacción de iminas ..................................................................................................24

Figura 23. Formación del compuesto cumarínico azometino-sustituido.....................................24

Figura 24. Reacción de ciclación...............................................................................................25

Figura 25. Reacción de Lawesson. ...........................................................................................26

Figura 26. 3-amino-2H-cromen-2-ona. ......................................................................................31

Figura 27. 3-amino-7-dietilamino-2H-cromen-2-ona. .................................................................32

Figura 28. Cumarinas 3-azometino-sustituidas. ........................................................................32

Figura 29. Compuesto Cum-S. ..................................................................................................33

Figura 30. Espectro de absorbancia UV – Vis; A) H1imina; B) H2imina; C) De1imina; D)

De2imina; E) Cum-S. .................................................................................................................38

Figura 31. Espectro de absorción y determinación del coeficiente de extinción molar; A)

H1imina; B) H2imina; C) De1imina; D) De2imina; E) Cum-S. ......................................................41

Figura 32. Espectro de emisión de fluorescencia; A) H1imina; B) H2imina; C) De1imina; D)

De2imina; E) Compuesto Cum-S. ..............................................................................................44

Figura 33. Espectro de absorbancia de H1imina en presencia de diferentes iones (Hg2+, Cd2+,

Cu2+, Zn2+, Al3+, Ca2+, Mg2+, K1+, Ba2+, Cu1+, Na1+, Fe2+, Fe3+, Pb2+). ..........................................46

Figura 34. Propiedades colorimétricas del compuesto H1imina ante iones metálicos. ...............47

Figura 35. Espectro de fluorescencia de H1imina en presencia de diferentes iones (Hg2+, Cd2+,


XVI Síntesis de cumarinas 3-azometino-sutituidas como quimiosensores para la


Figura 36. Espectro fluorescente de sensibilidad del compuesto H1imina-Pb2+. ........................49

Figura 37. Diagrama de Job de cambios en la intensidad de fluorescencia variando la relación

molar H1imina–Pb2+. ..................................................................................................................50

Figura 38. Gráfico de Benesi-Hildebrand para H1imina en presencia de iones Pb2+. .................51

Figura 39. Cinética de la reacción H1imina–Pb2+. ......................................................................52

Figura 40. Espectro de absorbancia de H2imina en presencia de diferentes iones (Hg2+, Cd2+,


Figura 41. Propiedades colorimétricas del compuesto H2imina ante iones metálicos. ...............54

Figura 42. Espectro de fluorescencia de H2imina en presencia de diferentes iones (Hg2+, Cd2+,


Figura 43. Espectro fluorescente de sensibilidad del compuesto H2imina-Pb2+. ........................56


molar H2imina–Pb2+. ..................................................................................................................57

Figura 45. Gráfico de Benesi-Hildebrand para H2imina en presencia de iones Pb2+. .................58

Figura 46. Cinética de la reacción H2imina–Pb2+. ......................................................................59

Figura 47. Espectro de absorbancia de De1imina en presencia de diferentes iones (Hg2+, Cd2+,


Figura48. Espectro de fluorescencia de De1imina en presencia de diferentes iones (Hg2+, Cd2+,


Figura 49. Propiedades colorimétricas del compuesto De1imina ante iones metálicos. .............62

Figura 50. Espectro fluorescente de sensibilidad del compuesto De1imina-Pb2+. ......................63


molar De1imina–Pb2+. ................................................................................................................64

Figura 52.Gráfico de Benesi-Hildebrand para De1imina en presencia de iones Pb2+. ................65

Figura 53. Cinética de la reacción De1imina–Pb2+. ....................................................................66

Figura 54. Espectro de absorbancia de De2imina en presencia de diferentes iones (Hg2+, Cd2+,


Figura 55. Espectro de fluorescencia de De2imina en presencia de diferentes iones (Hg2+, Cd2+,


Figura 56. Propiedades colorimétricas del compuesto De2imina ante iones metálicos. .............69

Figura 57. Espectro fluorescente de sensibilidad del compuesto De2imina; A) De2imina-Pb2+; B)

De2imina–Hg2+. .........................................................................................................................69


molar L–M; A) De2imina–Pb2+; B) De2imina–Hg2+. .....................................................................70

Figura 59. Gráfico de Benesi-Hildebrand para De2imina en presencia de iones; A) Pb2+; B) Hg2+.

.................................................................................................................................................71

Figura 60. Cinética de la reacción del compuesto De2imina-Pb2+ ..............................................72

Figura 61. Mecanismo de interacción de los compuestos cumarínicos 3-azometino-sustituidos y

Pb2+, Hg2+. .................................................................................................................................73

Figura 62. Espectro de UV-Vis del compuesto Cum-S en presencia de diferentes iones (Cu2+,

Al3+, Hg2+, Cd2+, Ca2+, Fe2+, Fe3+, Co2+, Mg2+). ...........................................................................77

Figura 63. Espectro de fluorescencia del compuesto Cum-S en presencia de diferentes iones.

.................................................................................................................................................78

Contenido XVII

Figura 64. Propiedades colorimétricas del compuesto Cum-S (10 µM) en presencia del Hg2+

(200 µM). ..................................................................................................................................79

Figura 65. Espectro de absorbancia de sensibilidad del compuesto Cum-S–Hg2+. ...................80

Figura 66. Espectro fluorescente de sensibilidad del compuesto Cum-S–Hg2+. ........................81

Figura 67. Evolución de la absorbancia del compuesto Cum-S–Hg2+ en relación con el tiempo.

.................................................................................................................................................82

Figura 68. A) Espectro UV - Vis de Cum-S; B) Espectro de UV - Vis de Cum-S-Hg2+; C)

Espectro de UV-Vis de 2. ..........................................................................................................83

Figura69. Espectro de 13C RMN del compuesto Cum-S (A); y en presencia de iones mercúricos

(B). ............................................................................................................................................84

Figura 70. Mecanismo de desulfurización. ................................................................................84

Figura 71. Mecanismo de la emisión de fluorescencia de encendido – apagado - encendido. ..85

Figura 72. Espectro de 1H RMN (DMSO-d6) del compuesto (1).................................................89

Figura 73. Espectro de 13C RMN (DMSO-d6) del compuesto (1). ..............................................90






Figura 79.Espectro de 13C RMN (DMSO-d6) del compuesto (4). ...............................................93

Figura 80. Espectro de 1H RMN (CDCl3) del compuesto (H1imina). ...........................................93

Figura 81. Espectro de 13C RMN (CDCl3) del compuesto (H1imina). ........................................94

Figura 82. Espectro de 1H RMN (CDCl3) del compuesto (H2imina). ...........................................95

Figura 83. Espectro de 13C RMN (CDCl3) del compuesto (H2imina). .........................................95

Figura 84. Espectro de 1H RMN (MeOH-d4) del compuesto (De1imina). ....................................96

Figura 85. Espectro de 13C RMN (MeOH-d4) del compuesto (De1imina). ..................................96

Figura 86. Espectro de 1H RMN (MeOH-d4) del compuesto (De2imina). ....................................97

Figura 87. Espectro de 13C RMN (MeOH-d4) del compuesto (De2imina). ..................................97

Figura 88. Espectro de 1H RMN (CDCl3) del compuesto (2). .....................................................98

Figura 89. Espectro de 13C RMN (CDCl3) del compuesto (2). ....................................................98

Figura 90. Espectro de 1H RMN (CDCl3) del compuesto (Cum-S) .............................................99

Figura 91. Espectro de 13C RMN (CDCl3) del compuesto (Cum-S)............................................99

Figura 92. HRMS del compuesto (Cum-S) .............................................................................. 100

Figura 93. Espectro fluorescente de sensibilidad del compuesto H1imina-Fe3+. ...................... 101



molar de H1imina–Fe3+. ........................................................................................................... 102


molar de H1imina–Fe2+. ........................................................................................................... 102

Figura 97. Gráfico de Benesi-Hildebrand para H1imina en presencia de iones Fe3+. .............. 103

Figura 98. Gráfico de Benesi-Hildebrand para H1imina en presencia de iones Fe2+. .............. 104


Figura 100. Espectro fluorescente de sensibilidad del compuesto H2imina-Fe2+. .................... 105

XVIII Síntesis de cumarinas 3-azometino-sutituidas como quimiosensores para la



molar H2imina–Fe3+. ................................................................................................................ 105


molar H2imina–Fe2+. ................................................................................................................ 106

Figura 103. Gráfico de Benesi-Hildebrand para H2imina en presencia de iones H2imina-Fe3+. 106

Figura 104. Gráfico de Benesi-Hildebrand para H2imina en presencia de iones H2imina-Fe2+. 107

Figura 105. Espectro fluorescente de sensibilidad del compuesto De1imina–Fe3+................... 108

Figura 106. Espectro fluorescente de sensibilidad del compuesto De1imina–Fe2+................... 108


molar De1imina–Fe3+. .............................................................................................................. 109


molar De1imina – Fe2+. ............................................................................................................ 109

Figura 109. Gráfico de Benesi-Hildebrand para De1imina en presencia de iones Fe3+. ........... 110


Figura 111. Figura112. Espectro fluorescente de sensibilidad del compuesto De2imina-Fe3+.. 112

Figura 113. Espectro fluorescente de sensibilidad del compuesto De2imina-Fe2+. .................. 112


molar De2imina–Fe3+. .............................................................................................................. 113


molar De2imina – Fe2+. ............................................................................................................ 113



Contenido XIX

Lista de tablas

Pág.

Tabla 1. Asignación de las señales de 1H-RMN de los compuestos cumarínicos 3-azometino-

sustituidos y Cum-S ..................................................................................................................35

Tabla 2. Constantes fotofísicas de los compuestos cumarínicos 3-azometino y tiocumarina. ...36

Contenido XX

Lista de Símbolos y abreviaturas

g Gramos

µg Microgramos

µL Microlitros

mL Mililitros

nm Nanómetros

v/v Volumen/volumen

µM Micromolar

M Molar

ppm Partes por millón

µg/m3 Microgramos/ metro cúbico

µg/g Microgramo/ gramo

Hg2+ Ion mercúrico

Cd2+ Ion cadmio

Cu2+ Ion cúprico

Zn2+ Ion zinc

Al3+ Ion aluminio

Ca2+ Ion calcio

Mg2+ Ion magnesio

K1+ Ion potasio

Ba2+ Ion bario

Cu1+ Ion cuproso

Na1+ Ion sodio

Fe2+ Ion ferroso

Fe3+ Ion férrico

Pb2+ Ion plomo

λ longitud de onda

a.u. Unidades de absorbancia

CCF Cromatografía de capa fina

AcOEt Acetato de etilo

DCM Diclorometano

UV-Vis Espectroscopía Ultravioleta Visible

Contenido XXI

CC Cromatografía en columna

AcOH Ácido acético

H2SO4 Ácido sulfúrico

H2O Agua

SiO2 Óxido de silicio

HCl Ácido clorhídrico

MeOH Metanol

EtOH Etanol

13C RMN Resonancia Magnética Nuclear de Carbono 13

1H RMN Resonancia Magnética Nuclear de Protón

Hz Hertz

MHz Megahertz

J Constante de Acoplamiento

δ Desplazamiento Químico en ppm

CDCl3 Cloroformo deuterado

Metanol-d4 Metanol deuterado

m/z Relación Masa a Carga en Espectrometría de Masas

Na2SO4 Sulfato de sodio

DMSO-d6 Dimelsulfóxido deuterado

VR Relajación vibracional

IC Conversión interna

SnCl2* 2H20 Cloruro de estaño dihidrato

CHEF Chelation-enhanced fluorescence

PET Transferencia electrónica fotoinducida

ICT Transferencia de carga fotoinducida

HSADB Principio ácido-base duro-blando

Ф Rendimiento cuántico

NaOH Hidróxido de sodio

Th Tiofeno

H Hidrógeno

HRMS Espectrometría de masas de alta resolución

XXII Síntesis de cumarinas 3-azometino-sutituidas como quimiosensores para la


Introducción

El plomo y el mercurio son considerados como metales tóxicos y letales para el ambiente y el ser

vivo, incluso en concentraciones muy bajas (Nolan et al., 2008; Zhang et al., 2017). Pueden ser

identificados en diferentes especies químicas en la naturaleza como metálica (Hg0; Pb0),

inorgánico (carbonatos, fosfatos, cloruro, sulfuros) y orgánicas (metil-mercurio), todas son

liberadas principalmente por fuentes naturales y fuentes antropogénicas. De tal manera, estos

metales se desaminan a través del aire, agua y suelo permitiendo la incorporación en

organismos, ingresando a la cadena trófica y acumulándose en humanos (Zhuang et al., 2009).

Generando daños en la salud como neurológicos, en el sistema nervioso (Zhang et al.,2017;

Costa-Malaquias et al., 2014), en el estómago, los riñones (Gajoli et al., 2012), y trastornos

cognitivos (Tchounwou et al., 2003).

Actualmente, uno de los mayores problemas a los que se enfrenta la química la actualidad surge

del crecimiento continuo y diario de la contaminación ambiental, especialmente por los iones Pb

y Hg, debido a que ninguno de estos metales es biodegradable y su acumulación provoca

contaminación de agua, suelos, y en última instancia, de los alimentos, siendo consumidos por

el ser vivo causando así bioacumulación en el cuerpo humano. Dado así, existen diferentes

métodos analíticos para la detección, determinación y cuantificación de iones Pb2+ y Hg2+, como

espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente (Matarazzo et al.,2015), la

espectroscopía de absorción atómica (Zhuang et al., 2009), voltamperometría de separación

anódica (Abollino et al. 2008), cromatografía de gases (Zhang et al., 2019), cromatografía liquida

de alto rendimiento (Chen et al., 2020), entre otras (Nolan et al., 2008; Rani et al., 2018; Ding et

al., 2014; Ozdemir et al., 2016). Estas técnicas presentan una alta selectividad y sensibilidad. Sin

embargo, son técnicas costosas y, necesitan una infraestructura adecuada y generalmente

sofisticada que dificultan la medición en tiempo real (Christus et al., 2018; Zhang et al., 2015).

2 I

Durante los últimos años, los quimiosensores han despertado un amplio interés científico en el

campo de la biología, química, medicina y ciencias ambientales, debido a su versatilidad de uso,

alta selectividad, sensibilidad, bajo costo y mediciones en tiempo real (Li et al., 2017; Whang et

al., 2018). Además, los sensores fluorescentes tienen la capacidad de cambiar sus propiedades

espectrales por interacción con un anillito en particular, como los iones de Pb y Hg, incluso a

concentraciones bajas. Por esta razón, es importante el diseño de nuevas moléculas orgánicas

con la capacidad de detectar iones metálicos utilizando técnicas fluorescentes de medición. En

la actualidad existen distintos núcleos químicos usados para la detección de diversos iones. En

este trabajo usamos como plantilla estructural fluorescente el núcleo de cumarina debido a sus

propiedades fotofísicas y su facilidad de ser sintetizadas. Este grupo de compuesto son de

naturaleza heterocíclica a los que puede modularse su actividad fluorescente y conservando

propiedades de transporte de carga (Gu et al., 2019; Wnag et a., 2018). Los derivados de

cumarinas son etiquetados como fluoróforo por su ventaja de exhibir emisión fluorescente, debido

a la optimización sistemática de su estructura electrónica mediante la introducción o adición de

grupos funcionales en la posición C-3 y C-7 (electrón-atractor y electrón-donador) permitiendo

modular sus propiedades fotofísicas (Wang et al., 2018; Warrier et al., 2018).

Por lo anterior, el presente trabajo se diseñó y sintetizó quimiosensores a partir del fluoróforos

químico 2H-cromen-2-ona (cumarina), modificando su estructura química con grupos funcionales

que tengan la capacidad de interactuar con iones de Pb2+ y Hg2+, para su detección a través de

métodos colorimétrico, espectrofométrico y fluorimétrico. Además, basado en la literatura los

ligando a base de azometino constituyen una clase importante de compuestos electroactivos

debido a su enlace imina (R-C=N-R) que facilita la formación de complejos estables.

Adicionalmente, un grupo imino en el C-3 de una cumarina presenta la capacidad quelante

debido a su isomerización geométrica E o Z y por su par de electrones del grupo imínico facilita

la formación del compuesto de coordinación a través de interacción no covalente.

I 3

OBJETIVOS

General

Diseñar, sintetizar y evaluar la afinidad y sensibilidad de quimiosensores tipo cumarina 3-

azometino-sustituidas, como posibles quelantes de iones Pb2+ y Hg2+ en medio acuoso.

Específicos

Sintetizar, purificar y caracterizar una serie de cumarinas sustituidas en C-3 (azometino) y C-7.

Determinar las constantes fotofísicas para cada una de las cumarinas 3-azometino-sustituidas

sintetizadas en medio acuoso.

Evaluar la afinidad y sensibilidad de las cumarinas 3-azometino-sustituidas hacia los iones Pb2+

y Hg2+ en medio acuoso.

Estudiar la cinética de la reacción de las cumarinas 3-azometino-sustituidas e iones Pb2+ y Hg2+

en medio acuoso.

1. MARCO TEÓRICO Y ANTECEDENTES

1.1 Metales pesados

La contaminación por metales pesados se ha convertido en un tema de gran interés para la

investigación científica por sus implicaciones a nivel ambiental, biológico y toxicológico; los

metales pesados ocasionan daños en la salud de los seres vivos y en la naturaleza, por ser

tóxicos o de difícil degradación (Ali et al., 2018). Estos metales, al no tener ninguna actividad

biológica definida, son considerados tóxicos para el organismo en una mínima concentración (Pb

15 ppb; Hg 2.0 ppb) (Hammerl et al., 2008; Qin et al., 2018), como ocurre con el plomo (Pb2+) y

el mercurio (Hg2+). Son generados por la contaminación industrial, la minería, el uso de biocidas

y fertilizantes, y por fenómenos naturales de la corteza terrestre y atmosférica, lo que

posteriormente permite que sean incorporados en el suelo, ríos, vegetales, animales y alimentos,

alterando la sostenibilidad de la cadena trófica y generando riesgo para la salud humana y animal

(Ali et al., 2019; Martin et al., 2009).

1.1.1 Plomo

El plomo incluido en el grupo de los metales pesados presenta riesgo en la salud humana y en

el ambiente incluso en bajas concentraciones. En la corteza terrestre está en una concentración

de 13 ppm y se encuentra en forma de galena (sulfuro de plomo (II)), de cerositas (carbonato de

plomo (II)) y de anglesita (sulfato de plomo (II)) (O’neill, 1998), pero estos niveles de plomo no

son estables debido a que varía según la producción industrial, la urbanización, cambios

climáticos y otros factores que alteren la concentración del metal (Beklova et al., 2012).

6 Síntesis de cumarinas 3-azometino-sutituidas como quimiosensores para la


Figura 1. Ciclo del plomo.

Como se observa en la Figura 1, la adsorción del plomo empieza por el suelo y en los sedimentos

siendo retenidos como compuestos insolubles carbonatos, sulfatos, fosfatos, donde estas

especies químicas se hallan principalmente en forma de partículas en la atmósfera, que es

probablemente que se reciba durante la tormenta de polvo (Esteban-Gómez, 2012). De tal

manera, que la concentración del plomo depende de la deposición en la atmósfera y de la

composición del suelo. La concentración en suelos se encuentra entre 10 y 30 µg/g (Seiler et al.,

1988; Esteban-Gómez, 2002). Además, está presente en las fuentes hídricas (1 a 3 mg/L), donde

se recoge en las vías fluviales ríos y lagos siendo un medio de transporte de metales pesados a

escala nacional y regional (Beklova et al., 2012). En el medio acuático la concentración está

influenciada por muchos factores como el pH, salinidad y biotransformación. Por lo general, se

encuentra en sulfato de plomo, cloruro de plomo (IV), hidróxido de plomo, por medio de estos

compuestos se llega a la acumulación de este metal (Beklova et al., 2012). También, se acumula

en los mares por su alto contenido de cloruros siendo predominante la especie química PbCl+

donde puede reaccionar con compuestos orgánicos como ácidos húmicos y fúlvicos, siendo

quelado (Gómez-Aguirre, 2009). De forma que, las corrientes oceánicas globales transportan

enormes masas de aguas, siendo responsable del movimiento de grandes cantidades de metales

pesado en el medio marino. Por lo tanto, su bioacumulación en los seres humanos surge

Capítulo 1 7

principalmente de su acción imitadora de ocupar los sitios de unión del calcio y zinc inhibiendo

así varias funciones fisiológicas (Huang, 2014; Arshad et al., 2020). Además, la toxicidad en el

organismo se debe a la gran afinidad que posee por los grupos tiol o sulfhidrilo (-SH) y fosfato

(PO43-) (Osweiler et al., 1978; Ellenhorn & Barceloux, 1997) de numerosas enzimas, proteínas y

membranas celulares lo que provoca la pérdida de su función biológica (Beklova et al., 2012;

Dapul et al., 2014).

1.1.2 Mercurio

El mercurio es un elemento químico altamente tóxico que se encuentra distribuido en el ambiente,

entrando en contacto hacia el ser vivo a través de la cadena trófica. Este metal es emitido hacia

la atmosfera donde ocurre proceso de óxido-reducción transformándose en especie químicas

solubles, como el Hg2+, el cual regresa a la tierra por la lluvia y se deposita en el suelo y agua

(OMS, 1990).

Figura 2. Ciclo del mercurio (OMS, 1990)

Como se describe en la Figura 2, el mercurio puede ser transportado de forma natural por medio

de fuentes hídricas evaporándose a la atmósfera en Hg0. Así, por medio de la lluvia se genera la

deposición Hg2+, en los suelos y en el agua se halla principalmente en forma inorgánica, el cual

son trasformadas en compuestos orgánicos como metilmercurio (CH3Hg+) por medio de

microrganismos presente en los sedimentos, siendo el primer paso del proceso de

bioacumulación. Este mecanismo de metilación ocurre en ausencia de oxígeno, cuando los

microorganismos anaeróbicos utilizan un análogo de la vitamina B12, que se produce a partir de



síntesis bacteriana (Baird, 2001; Suzuki et al., 2013). Una vez liberado el metilmercurio, entra a

formar parte de la cadena alimenticia y por proceso de bioconcentración se puede incrementar

los niveles de mercurio en diversos organismos hasta llegar al hombre (Kehring et al., 2009;

Gaoiali Amoedo et al., 2009). De modo que, la bioacumulación de metilmercurio (CH3Hg+) es la

principal vía de exposición oral de Hg. Una vez absorbido se une directamente a sustancias

orgánicas por medio de los grupos sulfhídrico (-SH) provocando bioacumulación en el organismo

y así alterando procesos bioquímicos, como en el sistema nervioso central (Armas et al., 2016;

Eisler, 2006).

1.2 Quimiosensores

Los quimiosensores son moléculas receptoras con capacidad de interactuar de forma selectiva

a un analito, generando así un cambio en sus propiedades del sistema (químicas o físicas) dado

por la interacción ligando-analito que se ha producido. Por lo tanto, para el reconocimiento del

analito existen dos tipos de procesos: el reconocimiento molecular (unidad de reconocimiento) y

la traducción de la señal (unidad de señalización). Dado así, el sensor molecular tiene la

capacidad de transformar una información química en una señal analítica, dado por la interacción

ligando-metal, lo cual, el cambio en sus propiedades puede ser medio en potencial redox,

espectros de absorción o fluorescencia, entre otras (Tárraga, 2012) (Ver Figura 3).

Figura 3. Funcionamiento de un quimiosensor. (Tárraga, 2012).

1.2.1 Fluorescencia

Para explicar los fenómenos luminiscentes (fluorescencia y fosforescencia) a nivel atómico se

hace uso del diagrama de Jablonski (Figura 4). En el diagrama de Jablonski representa los

Capítulo 1 9

niveles de energía (S0, S1, S2 …), transiciones radiativas con flechas y línea recta, transiciones

no radiativas con flechas onduladas y los niveles vibracionales asociados a cada estado esta

representados con líneas horizontales (Méndez-Delgado, 2018).

Figura 4. Diagrama de Jablonski (Méndez-Delgado, 2018).

Cuando se produce la absorción de un fotón desde el estado singulete S0, se promueve un

electrón a un orbital de mayor energía. Si no existe cambio de multiplicidad, se alcanza un estado

electrónico S1. En caso contrario el estado electrónico alcanzado será triplete T1. Este último

estado posee menor energía que el estado excitado S1. En general, las transiciones del tipo S0

a S1 poseen bandas de absorción intensas. En el caso de transiciones S0 → T1 están prohibidas

por espín, y por consiguiente son transiciones débiles ya que tiene poca probabilidad de ocurrir

(Méndez-Delgado, 2018).

Después de la excitación la molécula puede decaer a través de una transición no radiativa al

nivel vibracional más bajo del estado excitado en el que se encuentre, y desde allí puede volver

al estado fundamental (S0) por emisión, en el caso del estado excitado S1, esta emisión se

denomina fluorescencia, la cual es una transición permitida y rápida. En el caso que la transición



radiativa sea desde T1 se denomina fosforescencia, lo cual puede ocurrir en menor intensidad y

más lenta que la fosforescencia. Adicionalmente, la fosforescencia es debido al cambio de

multiplicidad, es decir, que cuando ocurre la cruce entre intersistemas se presenta una inversión

de espín, lo cual resulta en un estado de menor de energía (transición triplete, T1). El tiempo de

vida de la fluorescencia es siempre muy corto (10-4 – 10-10 s), aunque menor que el tiempo de

emisión de radiación de la fosforescencia (10-2 s) (Méndez-Delgado, 2018; Matarazzo et al.,

2015; Leray, et al., 2001).

Por otra parte, las transiciones no radiativas involucran conversiones de un estado a otro, sin

cambio de energía en la molécula. Estas conversiones pueden ser entre estados de igual

multiplicidad, denominándose conversión interna (IC), o de distinta multiplicidad, la cual

denominamos cruces intersistemas (ISC). Estas transiciones dejan a la molécula con un exceso

de energía vibracional, la cual se desvanece rápidamente por colisiones del solvente, este

proceso es denomino relajación vibracional (VR) (Leray, et al., 2001).

1.2.2 Fluoróforos o fluorocromos

Ciertas moléculas, llamadas fluoróforos ó fluorocromos, son capaces de absorber fotones de una

cierta longitud de onda. Como se mencionó, esta absorción provoca que un electrón de la

molécula sea promovido del estado fundamental (S0) al estado excitado de mayor energía (S1).

Cuando dicho electrón vuelve al estado fundamental, esa pérdida de energía se traduce en la

emisión de un fotón de cierta longitud de onda, característico de un fluoróforo. Diversos sensores

se han basado en diferentes fluoróforos, tales como naftalimidas (Xu et al., 2017) , pirenos (Liang

et al., 2019), rodaminas (Abebe et al., 2020), antraquinonas (Mondal et al., 2017) y cumarinas

(Patil et al., 2018). Todos estos fluoróforos posee propiedades fotofísicas y fotoquímicas que

facilitan la emisión de la fluorescencia, lo que permite detectarlos, localizarlos e incluso seguirles

la trayectoria con alta resolución espacial y temporal, incluso en entonces complejos como una

célula (Tárraga, 2012; Jiao et al., 2017).

Cabe resaltar que las propiedades de fluorescencia de un sistema se rigen por las longitudes de

onda de excitación y emisión, el rendimiento cuántico, el tiempo de vida del estado de excitación,

desplazamiento de Stokes y la duración de fluorescencia (Matarazzo et al., 2015). El rendimiento

cuántico hace referencia a la relación entre los fotones que emiten, respecto al número total de

fotones excitadas; es decir, la relación de fotones emitidos a fotones absorbidos. Por otro lado,

Capítulo 1 11

el desplazamiento de Stokes es la rápida relajación vibracional en el estado excitado,

evidenciando que la energía de emisión es menor que la energía de absorción. La duración de

fluorescencia es la porción responsable de emitir un fotón y está relacionada con el rendimiento

cuántico del fluoróforo (Matarazzo et al., 2015).

1.2.3 Cumarinas como Fluoróforos

Las cumarinas son un grupo de compuestos heterocíclicos de origen natural o sintético,

constituida por un anillo de benceno condensando a un anillo de α-pirona (Figura 5) y

estructuralmente posee un sistema π-π conjugado rico de electrones, conservando propiedades

de transporte de carga (Joao et al., 2012; Vilar et al., 2006). Durante los últimos años, diversos

fluoróforos derivados de cumarina han sido desarrollados para la detección de iones metálicos.

Por tanto, los derivados de cumarinas son notificados como sensores fluorescentes, lo que las

hace interesantes como receptores artificiales de iones, sondas y marcadores biológicos (Delogu

et al., 2011).

Figura 5. 2H-benzopiran-2-ona o 2H-cromen-2-ona (cumarina).

El núcleo estructural de la cumarina ha despertado interés en su uso para el reconocimiento de

iones puesto que la adición de sustituyentes hace que posean una unidad de reconocimiento y

otra de señalización, donde se basan en los cambios de fluorescencia tras la interacción a un

analito. Cabe resaltar que dichos compuestos son encontrados en la naturaleza especialmente

en plantas y algunos microrganismos, lo que las hace más amigables para el ambiente que otros

fluoróforos (Jiao et al., 2017; Warrier et al., 2018).

A continuación, se describen algunos ejemplos de sensores moleculares que muestran

selectividad y sensibilidad para los iones Pb2+ y Hg2+:

• Un sensor fluorescente basado en el núcleo cumarínico para el reconocimiento de iones de

plomo fue descrito por Meng, X. et al., 2018. Este compuesto, se basa en una base Schiff y

quinolina, donde mostró en los espectros de fluorescencia la extinción de la emisión en presencia

de Pb2+. En los espectros de absorción mostró un desplazamiento batocrómico tras la adición de

iones Pb2+, y también presentó un cambio de color de amarrillo brillante a naranja (Ver Figura 6).



Figura 6. Sensor (1) “encendido-apagado". (Meng, X. et al., (2018).

• Se diseñó y sintetizó un quimiosensor simple que exhibe aumento de la fluorescencia en

presencia de la adición Pb2+. También, en los espectros de absorción mostraron

desplazamiento hacia el rojo tras la adición Pb2+. El sensor (1) presentó afinidad hacia Pb2+

presumiblemente resulta de los comportamientos de unión de los grupos dicarbonilo y del éter

de corona. De tal manera, que puede atribuirse a la fuerte estabilización del estado de

transferencia de carga interna (ICT) por la complejación de ion Pb2+ (Chen et al., 2002) (Ver

Figura 7).

Figura 7. Indicador fluorescente (1) (Chen et al., 2002)

• Un sensor molecular basado en rodamina B se sintetizó para la detección selectiva de iones de

Pb2+ y Al3+. Los espectros de fluorescencia mostraron cambios notables tras la adición de Pb2+

y Al3+. Inicialmente el sensor exhibió un pico de emisión de 461 nm, pero tras el reconocimiento

del Pb2+ indujo un desplazamiento batocrómico de 55 nm en la emisión, mientras la adición de

Al3+ experimentó un desplazamiento hacia el rojo más notable de 124 nm. Para el quimiosensor

TQ1 se observaron propiedades colorimétricas indicando un cambio en la emisión de violeta

azulado a amarillo verdoso (Pb2+) y de fluorescencia roja en adición de Al3+. Además, mostró

una estequiometría de complejación de 1:1 para Pb2+ y Al3+. También, se determinó el límite de

Capítulo 1 13

detección del sensor TQ1 hacia Pb2+ y Al3+ fue de 8.3590 *10-7 M y 1.0568*10-8 M,

respectivamente. (Liu, et al., 2018) (Ver Figura 8).

Figura 8. Quimiosensor basado en rodamina TQ1. (Liu, et al., 2018).

• El quimiosensor fluorescente 3,5-dicloro-2-hidroxibenzaldehído-O-(2-(aminooxi)-etil) oxima

fue desarrollado para la detección de Pb2+. El sensor mostró resultados espectrales cuando

se adicionaba iones Pb2+, la intensidad fluorescente del complejo ligando-metal cambio

significativamente, observándose una banda de absorción de 528 nm, causado por la

transición π- π* en la molécula. Los experimentos mostraron un aumento gradual de la

intensidad de la fluorescencia a medida que se adicionada iones de Pb2+. La estequiometría

del sensor HL-Pb2+ es de 2:1. La formación del complejo HL-Pb2+ se utilizó como nuevo

quimiosensor para el reconocimiento de cisteína, mostrando un apagamiento de la intensidad

fluorescente y exhibiendo una estequiometría 1:2 metal-ligando (M-L). También, se calculó el

límite de detección HL-Pb2+ y L-Pb2+ mostrando valores de 5.65*10-8 M y 3.80*10-7 M,

respectivamente. (Wang, et al., 2020) (Ver Figura 9).

Figura 9. Quimiosensor HL. (Wang, et al., 2020).

• Una nueva piridina-2,6-dicarboxamida (3) que contiene fluoreno se sintetizó como

quimiosensor fluorescente. Los espectros UV-Vis del quimiosensor mostraron dos señales

de absorción a 268 nm y 316 nm que pueden asignarse a transiciones a π- π* de anillos



aromáticos y n- π*. La capacidad de unión del quimiosensor se llevaron a cabo por métodos

espectrofotométricos y los resultados mostraron selectividad y sensibilidad significativa por

la detección de iones de Pb2+ y Cu2+. También, adición de Pb2+ y Cu2+ se observó un cambio

batocrómico e hipocrómico en los espectros de absorción. Esta interacción condujo un

cambio de colorimétrico de incoloro a amarillo. Por otra parte, la adición de estos metales

presentó una disminución significativa en la intensidad de fluorescencia. Además, el

rendimiento cuántico del sensor es Ф 0,214 mientras con la adición del Pb2+ y Cu2+ es de Ф

0,138 y 0,109, respectivamente. Asimismo, se determinó la estequiometría dando lugar a

relaciones de 1:1 y 1:2 para Cu2+ y Pb2+ respectivamente. Las constantes de asociación para

los complejos 3-Cu2+ y 3-Pb2+ se determinó que eran 8.89*103 M-1 y 5.65*108 M-2,

respectivamente. Los valores de límite de detección obtenidos 1.49*10-6 M para Cu2+ y

2.31*10-6 M para Pb2+. (Rahimi, et al., 2021) (Ver Figura 10).

Figura 10. Sensor molecular 3. (Rahimi, et al., 2021)

• Un compuesto (Ver Figura 11) basado en el núcleo cumarina para el reconocimiento de iones

de mercurio fue descrito por Jiao et al., (2017). Este compuesto, una base de Schiff, mostró

una mejora de la fluorescencia y absorbancia hacia el ion de Hg2+, mostrando en los

resultados espectrofométrico que el reconocimiento de los iones de Hg2+ por CBH no pudo

ser perturbado por la presencia de otros iones metálicos, lo que revelo selectividad y

sensibilidad hacia iones de Hg2+ (Jiao, et al., 2017).

Figura 11. Quimiosensor sensible y selectivo para iones de Hg2+ (CBH). (Jiao, et al., 2017).

Capítulo 1 15

• Recientemente se ha sintetizado una sonda fluorescente basada en un derivado de cumarina

simple (L1) para la detección de Hg2+ e iones F-. Este derivado de cumarina (Ver Figura 12)

mostró una alta selectividad para estos iones, con un aumento en la intensidad de la

fluorescencia que permitió observarlo cualitativamente por su cambio de color (Gu et al.,

2019). La adición de los iones Hg2+ y F- en la sonda L1 presentó reacciones de

desulfurización y desililación respectivamente, provocando cambios fotométricos y

colorimétricos (Gu, et al., 2019).

Figura 12. Sensor fluorescente y colorimétrico L1. (Gu, et al., 2019).

• Se desarrolló una sonda fluorescente para la detección de mercurio a partir de un derivado

de cumarina 3-azometino (ABG) (Ver Figura4). En los espectros de absorción la sonda

presentó dos máximos de 240 y 350 nm, tras la adición de iones mercúricos, la banda de

absorción de 350 nm sufre un cambio hipsocrómico (∼ 15 nm) y en los espectros de

fluorescencia se observó un aumento de la intensidad de fluorescencia. Estos cambios

espectrales están asociados con la formación de una especie entre la interacción de Hg2+-

ABG. Para asegurar el tipo de reacción, se llevaron a cabo experimentos por análisis de 1H

RMN, donde se mostró cambio de señales tras la adición de iones mercúricos, es decir, que

la señal protónica de imina δ = 8,95 ppm, desaparece y surge una señal típica de aldehído

δ = 9.95 ppm. Por lo tanto, esta señal podría estar asociadas con la presencia de

aminohidroxicumarina y un derivado de aldehído. En consecuencia, ocurre una

descomposición de AGB que corresponde una reacción de hidrólisis. (García-Beltrán, et al.,

2015) (Ver Figura 13).

Figura 13. Sensor cumarínico ABG. (García-Beltrán, et al., 2015).



• Se sintetizó una sonda colorimétrica y fluorométrica a base de fenotiazina. El sensor mostró

selectividad y sensibilidad hacia los iones Hg2+ y Cu2+, y se debe principalmente a las

interacciones de blando-blando, teoría de Pearson. Los espectros de fluorescencia mostraron

extinción de la emisión en presencia de los iones metálicos Hg2+ y Cu2+. En los espectros de

absorción se mostró un desplazamiento batocrómico para estos iones. La sonda sintetizada

puede usarse como sensor óptico de estado sólido (papel de prueba, placas, TLC) para la

detección selectiva de Hg2+ y Cu2+, donde se confirmó por la absorción UV-Vis, fluorescencia,

IR, 1H RMN y espectrometría de masas (Kaur et al., 2016) (Ver Figura 14).

Figura 14. Quimiosensor Probe 3. (Kaur et al., 2016)

• Se sintetizaron dos sondas fluorométricas y colorimétricas basadas en rodamina B y pireno

(B-PyRbS - PyRbO). Los sensores moleculares mostraron sensibilidad y selectividad hacia

los iones de Hg2+ exhibiendo propiedades colorimétricas y fluorimétricas. En el caso del sensor

molecular PyRbs, este presentó afinidad por el átomo de azufre (tiofílica) y también el resto

del grupo pireno sirvió como una fuente de cambio radiométrico. Además, mostró una baja

citotoxicidad y penetrabilidad en la membrana celular (Rui et al., 2016) (Ver Figura 15).

Capítulo 1 17

Figura 15. Quimiosensor basado en Rodamina B. (Rui et al., 2016).

Por otro lado, la presencia de heteroátomos en un quimiosensor mejora la detección de iones,

es debido a que la presencia de oxígeno o nitrógeno en la estructura cumarínica mejora la

afinidad del fluoróforo hacia los iones metálicos, de acuerdo con la teoría de Pearson (ácido-base

dura-blanca) (Warrier et al., 2018). Adicionalmente, el grupo azometino (C=N), conocido como

base de Schiff, también exhibe una fuerte afinidad por los iones de metales de transición; la base

de Schiff es un buen ligando de iones debido a que el carbono actúa como electrofílico y el

nitrógeno como nucleofílico por la presencia de sus pares de electrones libres, lo que hace que

tengo el efecto quelante hacia el ion (Kolcu et al., 2021). También, es importante destacar que la

presencia de grupo azufrados en la cumarina o tiocumarina eleva los valores de constante de

asociación y mejora la selectividad hacia los iones de Hg2+ y Pb2+.

Particularmente, el diseñar y sintetizar quimiosensores a partir de fluoróforos derivados del

núcleo de la cumarina ha sido atractivo en implicaciones biológicas y medioambientales, así

mismo, durante su síntesis las modificaciones en su estructura pueden ser bastante ventajosa

para el diseño de sensores moleculares fluorescentes. De tal manera, las cumarinas presentan

baja solubilidad en agua y afinidad por el metal. Estos inconvenientes son superados mediante

modificaciones estructurales. Así la incorporación de grupos funcionales azufrado y azometino

aumenta la afinidad hacia los iones Pb y Hg. Además, la adición de sustituyentes polares mejora

las propiedades hidrofílicas de la sonda y su solubilidad en agua. Por tanto, se propuso sintetizar

derivados de cumarinas 3-azometino-sustituidas en C-3 siendo un grupo electrón-atrayente y

azufrado (contenido de tioles), y con grupo polares electrón-donadores. Además, esta



característica estructural de contener grupo donadores en la posición C-7 aumenta las

propiedades ópticas.

Por lo anterior, durante esta investigación se propuso sintetizar derivados cumarínicos 3-

azometino sustituidos y tiocumarina como quimiosensores fluorescentes capaces de detectar

manera selectividad hacia los iones Pb2+ y Hg2+, con el fin de contribuir al descubrimiento de

nuevas sondas específicas, que puedan ser utilizadas para detectar dichos iones en el ambiente

acuoso y celular.

2. MATERIALES Y MÉTODOS

Los espectros de UV-Vis fueron registrados en un equipo Agilent Techonologies Cary® 60, los

de fluorescencia en Agilent Technologies Cary eclipse. Para la obtención de los espectros de

RMN de 1H y de 13C se registraron en un equipo Bruker multidimensional operando a 400 MHz

(1H) y 100 MHz (13C); también, se utilizó un espectrómetro Bruker AMX 300 MHz (1H RMN, 300.12

MHz; 13C RMN, 75.42 MHz) Los compuestos se disolvieron en cloroformo, metanol, DMSO

deuterado (CDCl3, metanol-d4, DMSO-d6), utilizando TMS o la señal residual de 1H o de 13C del

solvente de referencia interna. Los desplazamientos químicos son reportados en δ (ppm) y las

constantes de acoplamiento (J) en Hz.

Las reacciones fueron monitoreadas por cromatografía en capa fina (CCF) se realizaron en

cromatoplacas Merck Kiesegel 60 F254 con 0.25 mm de espesor. Como fase móvil se usaron

mezclas n-hexano: acetato de etilo (AcOEt), 80:20, diclorometano (DCM), acetato de etilo: n-

hexano (60:40). Los compuestos sintetizados se visualizaron bajo radiación UV a 254 y 365 nm.

La eliminación de disolventes orgánicos se realizó a presión reducida en un rotavapor rotatorio

marca Heidolph Hei-VAP acoplado a un sistema de vacío Vacuubrand. Los solventes y los

reactivos utilizados eran de calidad para la síntesis. Los disolventes empleados en las

extracciones y cromatografía eran grado absoluto.

La purificación y separación de los productos de compuestos sintetizados se realizó mediante

cromatografía en columna (CC) se llevó a cabo usando como fase estacionaria sílica gel 60

Merck de 230-400 mesh. El eluyente empleado se indica para cada caso, así como las

proporciones de los disolventes.



Título de la tesis o trabajo de investigación

2.1 Preparación de plantillas cumarínicas

2.1.1 N-(2-oxo-2H-cromen-3-il)acetamida (1)

Figura 16. Reacción de condensación de Knoevenagel.

Condiciones: a) N-acetilglicina, anhídrido acético, acetato de sodio, reflujo 6h, atmósfera

inerte.

Una mezcla de 3g (24.6 mmol) de salicilaldehído, 2.88g (24.6 mmol) de N-acetilglicina, 2 mL de

anhídrido acético. La solución restante se mantuvo en agitación durante unos minutos mientras

se garantizaba una atmosfera inerte con nitrógeno. Acto seguido, se adicionó gota a gota 250

µL de piperidina como catalizador. La reacción se sometió a reflujo durante cinco horas. Pasado

el tiempo, se dejó enfriar la reacción y se vertió en vaso de precipitados que contenía agua-

hielo para efectuar la cristalización. La mezcla resultante se extrajo con DCM, se secó con

Na2SO4 anhidro y el solvente se eliminó por presión reducida. La purificación del compuesto se

realizó a través de recristalización en etanol (García-Beltrán et al., 2012). El compuesto

sintetizado se obtuvo un sólido naranja fuerte con un rendimiento de 20% (1g; compuesto 1)

(Ver Figura 16). 1H-RMN (DMSO-d6): δ 1.85 (3H, s), 7.32-7.36, (2H, m) 7.5-7.48 (2H, m), 8.6

(1H, s), 9.72 (1H, s, NH). 13C-RMN (DMSO-d6) 171.89, 170.06, 157.93, 129.95, 128.25, 125.37,

125.01, 123.92, 120.03, 116.23, 22.74 (Ver anexos-Figura 72 y Figura 73).

2.1.2 3-amino-2H-cromen-2-ona (2)

Figura 17. Reacción de hidrólisis.

Condiciones: a) HCl/H2O (1:2; V/V).

Síntesis de cumarinas 3-azometino-sutituidas como quimiosensores para la


21

El compuesto 1 (1 g (8.53 mmol)), se disolvió en una solución HCl: CH3OH (V/V, 1:2). La reacción

se sometió a reflujo durante dos horas. Transcurrido el tiempo, la mezcla del compuesto se dejó

enfriar a temperatura ambiente, se vertió en hielo y se neutralizó con solución acuosa NaOH 1M,

y se hizo extracción con AcOEt. El solvente se eliminó por rotaevaporación y el sólido resultante

se sometió a una recristalización en etanol (García-Beltrán et al., 2012). El rendimiento de esta

reacción es 28%. (sólido amarillo; 0.5g) (Ver Figura 17). 1H-RMN (DMSO-d6): δ = 6.73 (s, 1H),

7.40-7.18 (m, 4H), 5.70 (s, 1H). 13C-RMN (DMSO-d6) δ: 159.10, 148.36, 133.77, 125.78, 125.26,

124.94, 122.25, 115.87, 108.14 (Ver anexos-Figura 74 y Figura 75).

2.1.3 7-dietilamino-3-nitro-2H-cromen-2-ona (3)

Figura 18. Reacción de nitración.

Condiciones: a) Nitroacetato de etilo, BuOH, piperidina, reflujo 12 h.

El 4-dietilaminosalicilaldehído (1.4g; 7.24 mmol) y nitroacetato de etilo (0.80 mL;7.96 mmol) se

disolvió en n-butanol (20 mL) y se adicionó 250 µL de piperidina como catalizador. La solución

restante se sometió a reflujo durante doce horas. Pasado el tiempo, la solución se dejó enfriar a

temperatura ambiente y un sólido precipitó. El sólido se removió por filtración y se lavó con n-

butanol (Ray et al., 2010). Se obtuvo como producto un sólido naranja brillante con un

rendimiento 63% (1.2g; compuesto 3) (Ver Figura 18). 1H-RMN (DMSO-d6): δ = 8.99 (s, 1H), 7.72

(d, J = 9.1 Hz, 1H), 6.78-6.90 (dd, J = 7.7, 2.5 Hz, 1H,), 6.61 (s, 1H,), 3.50 (q, J =7.2 Hz, 4H),

1.16 (t, 7.2 Hz, 6H). 13C-RMN (DMSO-d6) δ: 158.83, 154.97, 153.35, 144.45, 133.80, 126.28,





2.1.4 3-amino-7-dietilamino-2H-cromen-2-ona (4)

Figura 19. Reacción de reducción del grupo nitro.

Condiciones: a) HCl 15% / SnCl2 * 2H2O, 25°C, 10 min.

El compuesto (3) (1g; 3.81 mmol) se disolvió en una mezcla de HCl 15 % con SnCl2* 2H2O (10

mL). La mezcla se mantuvo en agitación durante diez minutos. Posteriormente, se realizó una

neutralización con una solución acuosa de NaOH, y se efectuó una extracción con acetato de

etilo. El solvente se removió por evaporación rotativa a presión reducida (Ray et al., 2010). El

producto de reducción (4) se obtuvo un sólido amarillo verdoso con un rendimiento de 84%

(0.75g) (Ver Figura 19). 1H-RMN (DMSO-d6) δ 7.19 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 6.68 (s, 1H), 6.60 (dd, J

= 8.7, 2.5 Hz, 1H), 6.48 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 5.00 (s, 2H), 3.38 (d, J = 7.0 Hz, 2H), 1.09 (t, J = 7.0

Hz, 6H). 13C-RMN (DMSO-d6) 159.81, 150.95, 146.85, 129.26, 126.20, 111.66, 110.37, 109.74,

97.77, 44.30, 12.81 (Ver anexos-Figura 78 y Figura 79).

2.2 Preparación de cumarina 3-azometino-sustituidas

2.2.13-((tiofen-2-il-metileno)-amino)-2H-cromen-2-ona

(H1imina)

Figura 20. Reacción de azometino-sustituido.

Condiciones: a) Tiofeno-2-carbaldehído, MeOH, atmosfera inerte, agitación constante.



23

El compuesto (2) (0.1 g, 0.62 mmol) se disolvió en metanol y se adicionó 0.07g (0.62 mmol) de

tiofeno-2-carbaldehído. La reacción se llevó a cabo a temperatura ambiente y en agitación

constante bajo una atmosfera inerte con nitrógeno. La reacción se mantuvo durante veinticuatro

horas. Después del tiempo transcurrido la mezcla se filtró por gravedad y consecuentemente el

disolvente se evaporó por rotavapor (García-Beltrán et al., 2012). El crudo de la reacción se

purificó por recristalización en una mezcla etanol:metanol (1:1; V/V). El rendimiento de la reacción

del compuesto H1imina fue 85% (0.084 g) (Ver Figura 20). 1H-RMN (CDCl3) 9.54 (s,1H), 7.59(s,

1H),), 7,91–7.55 (m,3H) 7.41–7.21 (m,4H). 13C-RMN (CDCl3): 183.11, 159.48, 149.06, 144.07,

136.42, 135.21, 132.01, 128.37, 126.67, 125.13, 124.67, 121.21, 116.37, 116.20, 110.94 (Ver

anexos-Figura 80 y Figura 81).

2.2.2 3-(([2,2'-bitiofeno]-5-ilmetileno) amino)-2H-cromen-2-ona

(H2imina)

Figura 21. Formación de iminas.

Condiciones: a) [2,2'-bitiofeno] -5-carbaldehído, MeOH, agitación constante.

El compuesto (2) (0.12g, 0.62 mmol) se disolvió en metanol y se adicionó (0.1g, 0.62 mmol) de

[2,2'-bitiofeno]-5-carbaldehído. La reacción se llevó a cabo a temperatura ambiente y en agitación

constante. La reacción se mantuvo durante veinticuatro horas. El solvente restante se eliminó

por rotaevaporación. El crudo de la reacción se purificó por recristalización en una mezcla etanol:

metanol (1:1; V/V) (García-Beltrán et al., 2012). El rendimiento de la reacción del compuesto

H2imina fue 57% (0.056 g) (Ver Figura 21). H2imina: 1H-RMN (CDCl3): 9.53 (s, 1H), 7.83 (s, 1H),

7,60–7-53 (m, 3H), 7.41–7.35 (m, 3H), 7.29–7.26 (m, 1H), 7.13–7,10 (m, 2H).13C-RMN

(CDCl3):182.66, 149.07, 141.71, 137.43, 136.07, 132.00, 128.42, 127.17, 126.68, 126.22, 125.13,

124.30, 121.20, 116.21, 110.94 (Ver anexos-Figura 82 y Figura 83).




2.2.3 7-(dietilamino)-3-((tiofen-2-ilmetileno) amino)-2H-cromen-2-ona

(De1imina)

Figura 22. Reacción de iminas

Condiciones: a) Tiofeno-2-carbaldehído, MeOH, atmosfera inerte, agitación constante.

El Compuesto (4) (0.3g, 1.29 mmol) se disolvió en MeOH y se adicionó 0.14g (1.29 mmol) de

tiofeno-2-carbaldehído. La solución resultante se llevó a temperatura ambiente con agitación

constante garantizando una atmosfera inerte con nitrógeno. La reacción se mantuvo durante

veinticuatro horas. Pasado este tiempo, la mezcla se filtró por gravedad y posteriormente el

disolvente se evaporó por rotavapor. El crudo de la reacción se purificó por recristalización en

una mezcla etanol: metanol (1:1; V/V) (García-Beltrán et al., 2012). El rendimiento de la reacción

del compuesto De1imina fue 93% (0.28 g) (Ver Figura 22). 1H-RMN (MeOH-d4) δ 9.37 (s,1H),

7.79 (s, 1H), 7.54 – 7.61 (m, 3H), 7.4 (d, J= 7 Hz,3H), 7.16 (t, J= 3.9 Hz,1H), 6.73 (d, J= 6.3

Hz,1H), 6.53 (d, J= 2.1 Hz,1H), 3.47 (q, J= 7.2 Hz,4H), 1.22 (t, J= 7.2 Hz,6H) .13C-RMN (MeOH-

d4): 159.96, 154.79, 154.34, 150.74, 143.21, 135.85, 132.59, 130.42,129.20, 127.72, 127.56,


2.2.4 3-(([2,2'-bitiofeno]-5-ilmetilen)amino)-7-(dietilamino)-2H-cromen-

2-ona (De2imina)

Figura 23. Formación del compuesto cumarínico azometino-sustituido.



25

Condiciones: a) [2,2'-bitiofeno] -5-carbaldehído, MeOH, agitación constante.

El compuesto (2) (0.2 g, 0.86 mmol) se disolvió en metanol y se adicionó 0.16 g (0.86 mmol) de

[2,2'-bitiofeno] -5-carbaldehído. La reacción se llevó a cabo a temperatura ambiente y en

agitación constante. La reacción se mantuvo durante veinticuatro horas. Después del tiempo

transcurrido la mezcla se filtró por gravedad y consecuentemente el disolvente se evaporó por

rotavapor. El crudo de la reacción se purificó por recristalización en una mezcla etanol:metanol

(1:1; V/V) (García-Beltrán et al., 2012). El rendimiento de la reacción del compuesto De2imina fue

67% (0.11 g) (Ver Figura 23). 1H-RMN (MeOH-d4): 9.37 (s, 1H), 7,69 (d, J= 7.2 Hz, 1H), 7.41 (t,

J=3,6 Hz, 1H), 7.37–7.32 (m, 3H), 7.22 (d, J= 3,9 Hz,1H), 7.06 (t, J= 1.2 Hz,1H), 6.70 (dd, J= 8.7–

2.4 Hz,1H), 6.52 (d, J= 2,9 Hz,1H) , 3,51 (q, J= 7.2 Hz,4H), 1.23 (t, J=7.2 Hz,1H).13C-RMN

(MeOH-d4): 154.77, 153.77, 150.75, 142.15, 141.78, 136.50, 133.29, 129.25, 127.94, 127.26,

125.65, 124.76, 124.01, 109.71, 108.93, 96.50, 44.61, 11.86 (Ver anexos-Figura 86 y Figura 87).

2.3 Preparación de tiocumarina

2.3.1 Preparación de tiocumarina (2)

Figura 24. Reacción de ciclación.

Condiciones: a) Malonato de dietilo, piperidina, EtOH, reflujo 6h; b) HCl, AcOH, reflujo 24 horas.

El compuesto 4-dietilaminosalicilaldehido (10g; 51.74 mmol) y malonato de dietilo (15.72 mL;

103,5 mmol) se disolvieron en etanol. La solución restante se mantuvo en agitación constante.

Posteriormente se agregó gota a gota piperidina (3.5 mL) y acidó acético (258.7 µL). La reacción

se sometió a reflujo durante seis horas. Terminada la reacción se concentró a presión reducida

en un rotavapor. Posteriormente, obtenido el concentrado anterior, se disolvió en una mezcla de

ácido clorhídrico: ácido acético (1:1; V/V). La reacción se sometió a reflujo durante veinticuatro

horas. Transcurrido el tiempo la mezcla se dejó enfriar a temperatura ambiente y se vertió en

vaso precipitados que contenía agua-hielo y se neutralizó con una solución acuosa de NaOH




40% dejando a un pH 5 y así observándose la formación de un precipitado. Seguidamente, el

sólido se filtró, se lavó con agua fría y se recristalizó en etanol obteniéndose un rendimiento de

87.84% (9.86 g) (Ver Figura 24) (González-Morales et al., 2020). 1H-RMN (DMSO-d6) δ 7.50 (d,

J=8.0 Hz, 1H), 7.21 (d, J=8.0 Hz, 1H), 6.53 (dd, J=12.0Hz, J=2.0 Hz, 1H), 6.44 (d, J=2.0 Hz, 1H);

5.99 (d, J=8.0 Hz. 1H), 3.42 (q, J=8.0 Hz, 4H), 1.17 (t, J=8.0 Hz, 6H). 13C-RMN (DMSO-d6):

162.65, 157.12, 151.08, 144.13, 129.18, 109.47, 109.07, 108.46, 97.85, 45.17, 12.82 (Ver


2.3.2 7-(dietilamino)-2H-cromen-2-tiona (Cum-S)

Figura 25. Reacción de Lawesson.

Condiciones: a) Reactivo de Lawesson, tolueno, reflujo 3h.

El compuesto (2) (2.72 g; 10 mmol), reactivo de Lawesson (4.85g; 12 mmol) se disolvieron en

tolueno seco. La mezcla restante se mantuvo en agitación bajo atmosfera inerte. La reacción se

sometió a reflujo durante tres horas. Después, la solución restante se evaporó a presión reducida,

obteniéndose un sólido. Posteriormente, el sólido obtenido fue recristalizado en metanol. Una

vez recristalizado fue pesado y purificado por medio de una columna cromatográfica de gel de

sílice, usando como fase móvil diclorometano y obteniéndose como rendimiento 62.47% (1,45 g)

(Ver Figura 25) (González-Morales et al., 2020). 1H RMN (DMSO-d6) δ 7.31-7.29 (m, 2H), 6.96

(d,J= 12 Hz, 1H), 6.66-6.64 (m, 2H), 3,5 (q, J=7.2 Hz, 4H), 1.23 (t, J= 7.2 Hz, 6H).13C-RMN

(DMSO-d6): 197,8, 159,6, 151,3 136,1, 128,9, 123,3, 110,8, 110,0, 97,3, 45,0, 12,4 (Ver anexos-

Figura 90 y Figura 91).

2.4 Constantes fotofísicas

Para la determinación de las constantes fotofísicas (Longitud de excitación (λex), longitud de

emisión (λem), rendimiento cuántico (Φ), coeficiente de extinción molar (ε) y desplazamiento de

Stokes) se usaron métodos de espectrofotometría UV-Vis y fluorescencia usando como



27

instrumentación equipos Agilent Technologies Cary 60 UV-Vis y el espectrofluorímetro Cary

Eclipse respectivamente.

2.4.1 Preparación de soluciones

Para la caracterizar los compuestos sintetizados, se preparó soluciones madres de los iones

metálicos y de derivados cumarínicos; estas soluciones fueron preparadas utilizando como

solvente agua tipo I en el caso de los metales, en etanol los compuestos H2imina, De1imina,

De2imina, Cum-S y en metanol H1imina.

2.4.2 Determinación la longitud de onda de excitación (λex) y

la longitud de emisión (λem)

Los espectros de absorción y emisión fueron registrados en una solución buffers HEPES 20 mM

a un pH de 7.4 (H1imina, H2imina, De1imina y De2imina) y en una solución H2O/EtOH (8:2, V/V)

Cum-S. Las mediciones se realizaron un espectrofotómetro UV-Vis y un espectrofotómetro de

fluorescencia. Cabe resaltar que este estudio se realizó en base a lo reportado a la literatura

García-Beltrán et al., (2012) y experimentalmente. Los espectros de las moléculas se registraron

a una concentración de 10 µM.

2.4.3 Coeficiente de extinción molar (ε)

El coeficiente de extinción molar se determinó registrando UV-Vis utilizando 10 concentraciones

conocidas (3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27 y 30 µM) de la molécula, utilizando como medio en una

solución buffers HEPES 20 mM a un pH de 7.4. Las muestras fueron medidas en un

espectrofotómetro UV-Vis.




2.4.4 Cálculo del rendimiento cuántico (Φ)

El rendimiento cuántico fue determinado usando como patrón sulfato de quinina en una solución

de H2SO4 0.5 M (Фr = 0.546) y fue calculado utilizando la ecuación 1 como se reporta (Mondal et

al., 2017; Xu et al., 2017; García-Beltrán et al., 2012):

Ф𝑠 = Ф𝑟(𝐴𝑟𝐹𝑠/𝐴𝑠𝐹𝑟)(դ𝑠2/դ𝑟2) (Ec. 1)

Donde, s y r denotan muestra y referencia, A es absorbancia, F es la relación integrada de la

intensidad fluorescente y դ es el índice de refracción del solvente.

2.5 Estudio de absorbancia, fluorescencia y afinidad por

diversos iones metálicos

Los compuestos H1imina, H2imina, De1imina y De2imina se realizaron mediciones espectrales a

temperatura ambiente en una solución de Buffer HEPES 20 mM a un pH de 7.4 y Cum-S en una

solución H2O/EtOH (8:2, V/V). La concentración de los sensores para la medición en el UV-Vis y

fluorescencia fue de 10 µM. Se prepararon soluciones de iones metálicos en agua tipo 1; los

iones metálicos utilizados en el estudio fueron Hg2+, Cd2+, Cu2+, Zn2+, Al3+, Ca2+, Mg2+, K1+, Ba2+,

Cu1+, Na1+, Fe2+, Fe3+, Pb2+ a 200 µM. Los espectros de absorción fueron registrados utilizando

el espectrofotómetro UV-Vis y los espectros de emisión se registraron en el espectrofotómetro

de fluorescencia, excitando la muestra a diferentes longitudes de onda.

2.5.1 Estudio del efecto de distintas concentraciones de Pb2+

sobre la emisión del sensor molecular

La sensibilidad de los compuestos H1imina, H2imina, De1imina y De2imina se determinó con el

ion Pb2+, el cual se obtuvo en el ensayo anterior de selectividad. Para ello, se realizó un estudio

con distintas concentraciones de los metales sobre una concentración fija de los sensores

sintetizados. La concentración del quimiosensor fue 10 µM, mientras la concentración de los

iones se varió desde 1 a 8 µM. Para el sensor Cum-S, la concentración final de la sonda fue de



29

5 µM, mientras que la concentración final de Hg2+ varió desde 0.25 a 250 µM. Los espectros de

emisión se registraron utilizando el espectrofotómetro de fluorescencia, excitando la muestra

diferentes longitudes de onda.

2.5.2 Determinación de las constantes de asociación

La constante de asociación (Ka) de los compuestos H1imina, H2imina, De1imina y De2imina fue

determinada mediante la ecuación de Benesi- Hildebrand (García-Beltrán et al., 2012) (ecuación

2):

1/(𝐹 − 𝐹0 ) = 1/(𝐹𝑚𝑎𝑥 − 𝐹0 ) + 1/(𝐹𝑚𝑎𝑥 − 𝐹0) ∗ 1/𝐾𝑎 [𝑀𝑒𝑡𝑎𝑙] (Ec. 2)

Donde F es la intensidad de la fluorescencia a la longitud de onda de emisión (nm) de

los compuestos dado cualquier concentración del metal, F0 es la intensidad de

fluorescencia en ausencia del metal, y Fmax es la máxima intensidad de fluorescencia a la

longitud de onda de emisión (nm) de los compuestos en presencia del metal en solución.

La constante de asociación (Ka) fue determinada gráficamente empleando el gráfico de 1/(F-F0)

contra 1/[M], los datos se ajustaron de forma lineal de acuerdo a la Ec. 1 y los

valores de Ka fueron obtenidos de la pendiente.

2.5.3 Determinación de la estequiometría de asociación

La determinación de la estequiometría de la asociación entre ligando y metal, se utilizó el método

de Job o de variación continua. Este método involucra un equilibrio donde se forma un complejo

entre ligando (L) y el metal (M). La representación gráfica de la concentración del complejo

(MmLn) en función de la fracción molar (X) del ligando da lugar a una curva con un máximo

situado a (1/𝑚)/𝑛 + 1 , siendo X (García-Beltrán et al., 2012):

𝑋 =[𝑀]

[𝐿]+ [𝑀] (Ec. 3)

Para aplicar el sistema se gráfica la variación de la intensidad de fluorescencia del ligando por la

fracción molar del mismo en el eje Y (I- I0) en función de la fracción molar en el eje X. El máximo

de la curva nos indica la estequiometría para el sistema.




2.5.4 Estudio cinético de la reacción entre ligando y metal

El estudio cinético de la reacción entre las cumarina-3-azometino-sustituidas e iones de plomo

(Pb2+) se realizó espectrofotométricamente a 25°C siguiendo el aumento de la absorbancia. En

todos los casos, bajo el exceso de Pb2+ (500–1000 µM) sobre los sensores moleculares (10 µM).

La constante de velocidad de pseudo-primer orden (kobs) para la reacción, se determinó mediante

el ajuste de absorbancia de acuerdo con la ecuación 4 (García-Beltrán et al., 2015; Eren et al.,

2006):

ln(𝐴𝑡 − 𝐴∞) = ln(𝐴0 − 𝐴) − 𝑘𝑜𝑏𝑠 ∗ t (Ec. 4)

Donde A0, At y A∞ corresponden a las intensidades de absorbancia, a tiempo cero, a un tiempo t

y a tiempo infinito, respectivamente y Kobs es la cinética de velocidad observada.

2.6 Límite de detección

El límite de detección (LOD) se calculó a partir de las valoraciones de absorbancia y

fluorescencia. Para determinar la relación señal/ruido, se midió la absorbancia (388 nm) del

compuesto Cum-S con Hg2+ tres veces y se determinó la desviación estándar de la curva de

calibración. El límite de detección se calculó con la ecuación LOD = 3 σb/m, donde σb es la

desviación estándar de la curva de calibración y m es la pendiente del gráfico de la absorbancia

o la intensidad de la fluorescencia frente a la concentración del analito (González-Morales et al.,

2020).

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

A continuación, se muestran los resultados más sobresalientes de este trabajo, enfocado en el

diseño y síntesis de sensores fluorescentes, así como el reconocimiento molecular con metales,

por medio de método fotométricos.

3.1. Síntesis

Las síntesis de los núcleos químicos 3-amino-2H-cromen-2-ona ha sido una reacción de tipo

Knoevenagel, donde consiste en hacer reaccionar un derivado de o-hidroxialdehído con

malonato de etilo, acetato de etilo o cianoacetato (o derivados de el mismo) en presencia de

amoníaco u otra amina (Borges et al., 2005). La reacción se realiza mediante catálisis ácida y

nucleofílica, lo cual se obtiene cumarinas sustituidas en C-3 (Borges et al., 2005).

Figura 26. 3-amino-2H-cromen-2-ona.

El compuesto 3-amino-2H-cromen-2-ona, se obtuvo como se describe en la Figura 17. El

compuesto 2, fue obtenido a través de una reacción de condensación de Knoevenagel entre el

salicilaldehído y N-acetilglicina en anhídrido acético bajo condiciones de reflujo, se utilizó

piperidina como base, por tanto, se obtuvo un intermediario con un rendimiento de 20%.

Posteriormente se efectuaron las reacciones de hidrólisis bajo condiciones ácidas utilizando una

mezcla de HCl/CH3OH a reflujo, eliminando el grupo acetilo (Kadhum et al. 2011) y la producción

del compuesto 2 con un rendimiento de 28% (Figura 26).



Figura 27. 3-amino-7-dietilamino-2H-cromen-2-ona.

La síntesis 3-amino-7-dietilamino-2H-cromen-2-ona se obtuvo a partir de 4-dietilamino-

salicilaldehído y nitroacetato de etilo obteniéndose el compuesto 7-dietilamino-3-nitro-2H-

cromen-2-ona, mediante la condensación de Knoevenagel usando piperidina como catalizador.

Posteriormente se realizó una reducción del grupo nitro a amino utilizando cloruro de estaño

(Ray et al., 2010; Zhou et al., 2013; Ang et al., 2016) , para obtener el compuesto 4 con un

rendimiento de 84% (Figura 23).

La síntesis de 3-amino-2H-cromen-2-ona (Compuesto 4 y 6) como plantilla estructural del

diseño de sensores fluorescentes son de importancia siendo la unidad de señalización, es decir

el fluoróforo. Por tanto, la síntesis de ligandos azometino-sustituidos se comportarán como

unidad de reconocimiento actuando como ligando. Es decir, en la posición C-7 se pretendió

tener un grupo H/Et2N y el C-3 azometino-sustituidos, logrando una mayor sensibilidad y

selectividad, hacia la detección de iones Pb2+ y Hg2+.

Figura 28. Cumarinas 3-azometino-sustituidas.

La preparación de los derivados cumarinas 3-azometina-sustituidos se obtuvo a partir de la

reacción de base de Schiff o azometino, donde consiste en hacer reaccionar derivados de

salicilalhedído con una amina primaria usando solventes orgánicos (Kolcu et al., 2021). Esta



33

condensación, dentro de la química orgánica es de gran interés por la capacidad de formar

complejos estables con diferentes iones. Además, las bases de Schiff actuarían como la esfera

de coordinación para la detección de los iones metálicos. Los ligandos a base de azometino

constituyen una clase importante de compuestos electroactivos debido a su enlace imina que

pueden facilitar la formación de complejos estables con iones (Wang et al., 2015; Tahmasebi et

al., 2015). Además, posee la capacidad quelante hacia iones y se debe a su par de electrones

del grupo imínico facilitando la detección de traza del metal (Zhang et al., 2021). En general, la

síntesis de las cumarinas 3-azometino-sustituidas se llevaron a cabo en. metanol durante horas

de agitación bajo atmósfera inerte, obteniéndose rendimientos del 57-93% (Figura 28).

La tiocumarina (Cum-S) se obtuvo mediante una síntesis convencional de tres pasos (ver Figura

24 y Figura 25). El sensor molecular se preparó a partir de una reacción de Knoevenagel 4-

(dietilamino)-hidroxibenzaldehído donde se condensó con malonato de dietilo, obteniéndose

como producto 7-(dietilamino)2-oxo-2H-cromen-3-carboxilato de etilo. Posteriormente, el

intermediario se cicló y se descarboxiló para proporcionar 7-(dietilamino)-2H-cromen-2-ona y por

último se realizó una tionación con el reactivo de Lawesson, obteniendo el compuesto Cum-S (7-

(dietilamino)-2H-cromen-2-tiona) (Qin et al., 2018; González-Morales et al., 2020). El compuesto

obtenido es de color rojo y con un rendimiento de 62.47 % (Figura 29). Por otro lado, los autores

Qin et al., (2018) sintetizaron esta tiocumarina denominada MS4 y obtuvieron un porcentaje de

rendimiento de 84%, esto se debe al método de purificación, debido a que el producto crudo fue

refinado por cromatografía flash utilizando como efluente éter de petróleo: DCM, además en las

condiciones en que fue realizada la síntesis favorecen el porcentaje del rendimiento.

Figura 29. Compuesto Cum-S.

3.1.1. Caracterización espectroscopía de 1H y 13C RMN

Los espectros 1H y 13C de RMN de los compuestos sintetizados posee patrones químicos

similares. La condensación de Knoevenagel produce compuestos sustituidos en el C-3, por tanto,

los patrones de sustitución modifican los espectros de 1H y 13C de las cumarinas. Las sustituidas



en C-3 presenta la señal de H-4 a cambo bajo debido a desapantallamiento que presenta el

protón. Por otro lado, En la posición C-7 estarán presente los grupos H, Et2N, el cual varía

dependiendo de los sustituyentes en el anillo aromático.

En el caso de los 1H RMN de los derivados cumarínicos 3-azometino-sustituidos, el H que está

presente en el grupo C=N (imina) se encuentra con menos densidad electrónica es claramente

que está cerca de un átomo electronegativo y la presencia de un doble enlace, por tanto, el H

presenta un desplazamiento químico a campo bajo siendo es el más desprotegido con un δ 9–

10 ppm. También, el esqueleto cumarínico posee un H en la posición 4, siendo desprotegido

porque está directamente en el carbono de doble enlace, estos H vinílicos se observan en el

espectro típicamente en δ 5–6.5 ppm. La presencia de anillos aromáticos en los sensores

moleculares (benceno y tiofeno), por poseer un sistema π, los H de los anillos se registran en

desplazamiento químicos altos, es decir, campo bajo. De tal manera, que los H unidos al anillo

aromático se observan en el espectro δ 6.5–8.5 ppm, por eso, la mayoría de los espectros de

los compuestos sintetizados se observa múltiples señales con su respectiva multiplicidad de

cada de hidrogeno. Para el grupo dietilamino N-(CH2-CH3)2, los metilos y metilenos son

químicamente idénticos o equivalentes, sin embargo, existe diferencia entre los hidrogeno de

CH2 y CH3 y son sus intensidades en los picos. La cantidad de CH3 es de 6H, mientras, el CH2

es de 4H. por ende, el de mayor cantidad de hidrogeno va a absorber mayor cantidad de

radiación y asimismo será representada en el espectro de RMN. Cabe resaltar que los

desplazamientos químicos de CH3 son 0.9 ppm y CH2 en 1.3 ppm, pero en los espectros se

observan más desplazados debido a la presencia del átomo de N. La tiocumarina tendrá un

comportamiento similar en el espectro a diferencia de los hidrógenos presente en el C-3 y C-4,

donde se observará en desplazamientos químicos altos.

En los espectros 13C RMN los carbonos unidos a átomos electronegativos como C=O, C=N,

C=S tienen un desplazamiento químico a campo alto entre δ 160 – 190 ppm, así también como

los carbonos de anillos aromáticos y vinílicos (Ver anexos desde Figura 72 hasta Figura 91).

Los espectros de 1H-RMN de las cumarinas sintetizadas se encuentran resumidas en la

siguiente tabla.

Tabla 1. Asignación de las señales de 1H-RMN de los compuestos cumarínicos 3-azometino-sustituidos y Cum-S

H1imina H2imina De1imina De2imina Cum-S

δ (ppm) N°- H δ (ppm) N° - H δ (ppm) N° - H δ (ppm) N°- H δ (ppm) N° - H

9.54 1H-C=N 9.53 1H-C=N 9.37 1H-C=N 9.37 1H-C=N 7.31 - 7.29 1H-C=C

7.59 1H-C=C 7.83 1H-C=C 7.79 1H-C=C 7.69 1H-C=C 6.96 2H-Ar

7.91 - 7.55 3H-Ar 7.60 - 7.56 3H-Ar 7.61 - 7.54 3H-Ar 7.41 1H-Ar 6.66 - 6.64 2H-Ar

7.41-7.21 4H-Ar 7.41 - 7.35 3H-Ar 7.40 3H-Ar 7.37 - 7.32 3H-Ar 3.45 4H-CH2

7.29 - 7.26 1H-Ar 7.16 1H-Ar 7.22 1H-Ar 1.23 6H-CH3

7.13 - 7.10 2H-Ar 6.73 1H-Ar 7.06 1H-Ar

3.47 4H- CH2 6.70 1H-Ar

1.22 6H-CH3 6.52 1H-Ar

3.51 4H-CH2

1.23 6H-CH3

3.2 Constantes fotofísicas

Se determinaron las principales constates fotofísicas de los compuestos H1imina, H2imina,

De1imina, De2imina y Cum-S.

Tabla 2. Constantes fotofísicas de los compuestos cumarínicos 3-azometino y tiocumarina.

Compuesto λex (nm)

λem

(nm) ε (M-1 cm-1) Ф Stokes

(cm-1)

H1imina 347 504 23379 0,002 8977

H2imina 404 489 34632 0,06 4303

De1imina 438 495 20387 0,02 2629

De2imina 448 517 28969 0,07 2979

Cum-S 483 510 15754 0,013 1096

3.2.1 Longitud de excitación (λex) y coeficiente de extinción molar (ε)

Los espectros de absorción para los compuestos H1imina, H2imina, De1imina, De2imina, son

registrados en una solución de Buffer HEPES 20 mM a un pH de 7.4 y para el compuesto Cum-

S H2O/EtOH (8:2, V/V), a temperatura ambiente (25°C) y los datos se recogen en la Tabla 2. Los

espectros fueron registrados a una concentración de 10 µM; realizándose un barrido espectral

desde 250 nm hasta 700 nm, encontrándose la banda de excitación de los compuestos

cumarínicos (Ver Figura 30).



37



Figura 30. Espectro de absorbancia UV – Vis; A) H1imina; B) H2imina; C) De1imina; D) De2imina; E) Cum-S.

Generalmente, los espectros de absorción van relacionado con el sistema π-conjugado, es decir,

que se puede expandir aumentando el número de enlaces conjugados, por lo cual, la

espectrofotometría está basada en la medida directa de la absorción de radiación

electromagnética por parte de la muestra, en función de la longitud de onda. Adicionalmente, las

bandas observadas en el espectro dar una respuesta espectral mejorada, debido a la

deslocalización de carga lo que conduce reducción de la brecha energética (Zhong et al., 2015;

Han et al., 2014).

La introducción de dos anillos tiofenos en las moléculas H2imina y De2imina exhiben una λmax

más larga que con un anillo de tiofeno para H1imina, lo que indica que la introducción de anillos

de tiofenos en las moléculas cumarínicas es beneficiosa para reducir la brecha de energía,

debido a que es más fácil excitar la molécula. Por el contrario, el compuesto De1imina presenta

una λmax superior, y es debido por las longitudes de onda que puede absorber la molécula y

depende principalmente de su estructura y su entorno químico o condiciones del medio como el

pH (Diaz et al., 2000). El Compuesto Cum-S, también presenta una λmax mucho más larga y podría

asignarse a la estabilización de los niveles energéticos a través del efecto del azufre (S), y es

debido que el azufre tiene orbitales d, lo que hace que exista una mayor polarizabilidad y a su

vez permite mejor una separación de carga (Chang et al., 2010); siendo en todos los casos un

corrimiento al azul. Además, longitud de excitación de la Cum-S es similar en comparación con



39

la sonda MS4 para detección de ion mercúrico, obteniéndose una λmax 485 nm (Qin et al., 2018).

Cabe resaltar, que las bandas de absorción de los compuestos cumarínicos se deben a las

transiciones π→π* atribuida a los electrones del núcleo de benceno conjugado y el núcleo pirona,

esta transición se encuentra generalmente en la región UV-cercano (195-400 nm). La transición

electrónica denominada n→π* se suele situar en la región del visible (400-780 nm), y se debe a

la presencia de pares de electrones sin compartir de los átomos de nitrógeno y azufre (Seoane-

Rivero et al., 2020; Lobera et al., 2009).

Por otro lado, el coeficiente de extinción molar se determinó en los compuestos cumarínicos 3-

azometino-sustituidos y el compuesto Cum-S, generando un barrido espectral desde 250 a 700

nm. Se observó en todos los casos una regresión lineal, justificada por el valor estadísticos de

R2. Además, ley de Beer establece que el coeficiente de absorción es proporcional a la

concentración del soluto (Maikala, 2010), en este caso, el sensor molecular (Ver Figura 31).





41

Figura 31. Espectros de absorción y determinación del coeficiente de extinción molar; A) H1imina; B) H2imina; C) De1imina; D) De2imina; E) Cum-S.



Por otra parte, la expansión del sistema- π conjugado no solo puede conducir hacia el

desplazamiento rojo de la absorbancia máxima, sino también beneficia la mejora del coeficiente

de extinción molar. Los compuestos H2imina y De2imina que poseen dos anillos de tiofenos

muestran un coeficiente de absortividad molar más alto ≥ 2*104 M-1 cm-1 que con los compuestos

H1imina, De1imina con un solo anillo de tiofeno y el compuesto Cum-S sin sustituyente en la

posición 3. En otras palabras, la extensión del sistema π conjugado beneficia una mayor longitud

de onda, dado que aumenta la cantidad de deslocalización de cargas y un coeficiente de extinción

molar más alto, lo que indica su capacidad de absorción de luz por los compuestos.

3.2.2 Longitud de emisión (λem), desplazamientos de Stokes y

rendimiento cuántico (Ф)

Los espectros de emisión fueron registrados con ayuda del espectrofluorímetro, todos los

derivados cumarínicos fueron medidos en un barrido espectral entre 400–650 nm. Se observó el

máximo de emisión (Ver Figura 32).



43



Figura 32. Espectro de emisión de fluorescencia; A) H1imina; B) H2imina; C) De1imina; D) De2imina; E) Compuesto Cum-S.

Los espectros de emisión son un registro de la intensidad de la emisión en función de la longitud

de onda y depende de la estructura química de la molécula y del solvente en que disuelve

(Lorente; 2003). De este modo, los derivados de cumarinas son conocidas por su capacidad de

emitir la fluorescencia y la adición de grupos funcionales en la posición C-3 y C-7 (electroatractor

y electrodonador) modulan sus propiedades ópticas (Jiao et al., 2017; Warrier et al., 2018). Los

compuestos sintetizados cumarinas 3-azometino-sustituidas poseen propiedades fluorescentes

y se debe a la conjugación π extendida lo que mejora la movilidad de los electrones aumentando

la intensidad de fluorescencia. Además, sistema de anillos aromáticos como lo tiofenos permite

que haya transiciones ո a π* siendo características de la fluorescencia. Por lo tanto, la emisión

fluorescente de los compuestos cumarínicos se clasifica en el orden (H2imina, De1imina, H1imina,

De2imina). Cabe resaltar, que las cumarinas por sí misma presentan una emisión de

fluorescencia baja, pero la sustitución adecuada en su estructura química conduce a compuestos

fluorescentes (Giri et al., 1988). Sin embargo, es notorio que la sustitución con un dador

electrónico en el C-7 es de importancia para tener un buen compuesto fluorescente. Por el

contrario, el compuesto Cum-S exhibe una fuerte fluorescencia y se debe a su entorno químico

y el medio en que fue disuelto H2O/EtOH (8:2; V/V), puesto que los solventes polares modifican

la fluorescencia (Tasior et al., 2015). Este resultado es similar a la sonda MS4 reportada por Quin

et al., (2018) para la detección de ion Hg2+, donde reportan λem 477 nm, y se debe al medio en

que fue disuelto en una solución tampón a un pH 7.4 contiendo un 1% DMSO. Cabe resaltar que

existen factores que influyen en la fluorescencia, como son el pH, el disolvente, concentración,



45

temperatura, estabilidad del compuesto, estructura molecular. Asimismo, parte de la

fluorescencia se pierde cuando existen colisiones con otras moléculas o por otro tipo de especie,

de modo que se emite menos energía como fluorescencia (Gálvez Buerba, 2004; García Suárez,

2015).

Por otro lado, los derivados cumarínicos presentan un rendimiento cuántico, donde es la relación

de fotones emitidos a fotones absorbidos. De modo que, las moléculas altamente fluorescentes

presentan una eficacia cuántica aproximada a 1 unidad. Por lo tanto, en la Tabla 2 se observan

los rendimientos cuánticos de los compuestos cumarínicos 3-azometino-sutituidos, los cuales

exhiben una fluorescencia débil en razón a la isomerización del grupo C=N y la tiocumarina no

posee sustituyente en la posición tres lo que hace que estos compuestos tengan una emisión de

fluorescencia baja (Chen et al., 2021) Además, el rendimiento cuántico del sensor Cum-S es

mucho menor en comparación con la sonda MS4 teniendo un Ф 0.079 y se debe al medio que

fue disuelto (Qin et al., 2018). Cabe resaltar que existen factores que influyen en el rendimiento

cuántico como el número de anillos presentes en el compuesto, la extensión de la conjugación

(dobles enlaces) y su entorno químico (Matarazzo et al., 2015).

Los compuestos sintetizados tienen desplazamiento de Stokes que se calculó a partir de la

diferencia entre el punto máximo de excitación y el punto máximo de emisión (Castañeda

Briones, 2017), dado así, se obtuvieron los diferentes corrimientos de Stokes. En general, la

extensión del cambio de Stokes depende del fluoróforo y su entorno químico (Castañeda Briones,

2017; García Brieva, 2011). Por esta razón, los solventes más polares suelen producir cambios

de Stokes más grandes como es H1imina que fue disuelta en metanol facilitando la formación de

puentes de hidrógeno. Por el contrario, los compuestos H2imina, De2imina, De1imina y compuesto

Cum-S fueron disueltos en etanol y en ese mismo orden son clasificados debido al sistema π

extendido.

Una vez conocidas las principales características espectroscópicas de excitación y emisión de

los compuestos cumarínicos 3-azometinos-sustituidos y compuesto Cum-S, se procedió evaluar

el efecto de los diferentes iones frente a los compuestos sintetizados.



3.3 Estudio del compuesto H1imina

Para evaluar la selectividad del compuesto H1imina (10 µM) frente a diferentes iones metálicos

(Hg2+, Cd2+, Cu2+, Zn2+, Al3+, Ca2+, Mg2+, K1+, Ba2+, Cu1+, Na1+, Fe2+, Fe3+, Pb2+ a 200 µM). Se

realizó un barrido espectral de 250 a 700 nm. La Figura 33 muestra el espectro de absorción de

la molécula con los distintos cationes.

Figura 33. Espectro de absorbancia de H1imina en presencia de diferentes iones (Hg2+, Cd2+, Cu2+, Zn2+, Al3+, Ca2+, Mg2+, K1+, Ba2+,

Cu1+, Na1+, Fe2+, Fe3+, Pb2+).

En la Figura 33 se observó que el compuesto H1imina mantenía un máximo de absorción de la

longitud de onda 347 nm. Sin embargo, en las mismas condiciones, Pb2+, Fe3+ y Fe2+ mostraron

diferente respuesta de absorción. La adición del Pb2+ dio como resultado el aumento

gradualmente de absorción a 347 nm, observándose un cambio hipercrómico como lo indica la

línea azul. Por otro lado, el reconocimiento de Fe3+ mostró un desplazamiento hacia el azul de

31 nm y con un pico de 316 nm; mientras que la adición de Fe2+ provocó un desplazamiento hacia



47

el azul de 13 nm y con pico de 334 nm. De acuerdo con los cambios espectrales, el color del

sensor molecular H1imina paso de ser incoloro a una coloración de amarillo intenso con la adición

de Fe2+ y un amarillo pálido con Fe3+ respectivamente, lográndose detectar cambios

colorimétricos. Al ser expuesto a la luz UV (365 nm) en presencia de los metales, se observa un

cambio de fluorescencia para Pb2+ y Fe2+ indicando en todos los casos detección colorimétrica y

espectrofotométricas en presencia de trazas de cationes (Figura 34). En general, los cambios

observados indicaron que posiblemente los iones forman complejos con el par de electrones no

enlazantes del grupo azometino (Ding et al.,2021) y la existencia de los anillos tiofeno.

Figura 34. Propiedades colorimétricas del compuesto H1imina ante iones metálicos.

En cuanto a los ensayos de fluorescencia de selectividad para el compuesto H1imina (10 µM)

frente a diferentes iones metálicos (Hg2+, Cd2+, Cu2+, Zn2+, Al3+, Ca2+, Mg2+, K1+, Ba2+, Cu1+, Na1+,

Fe2+, Fe3+, Pb2+ a 200 µM) haciendo un barrido de 350 a 750 nm. La siguiente Figura 35 muestra

el espectro de fluorescencia del sensor H1imina frente a diferentes iones metálicos.



Figura 35. Espectro de fluorescencia de H1imina en presencia de diferentes iones (Hg2+, Cd2+, Cu2+, Zn2+, Al3+, Ca2+, Mg2+, K1+, Ba2+,

Cu1+, Na1+, Fe2+, Fe3+, Pb2+).

La respuesta fluorescente de H1imina hacia varios cationes metálicos se investigó con el fin de

evaluar su capacidad selectiva. La solución acuosa de H1imina no mostró una emisión

fluorescente fuerte. Como se muestra en la Figura 35, solo tras la adición de Pb2+, el sensor

molecular H1imina exhibió una significativa intensidad de fluorescencia a 511 nm, mientras que

la adición de Fe3+ exhibió una intensidad de fluorescencia a 504 nm. Además, la isomerización

del enlace C=N (Vijayakumar et al., 2021) que opera en el sensor H1imina son responsables del

bajo rendimiento cuántico Ф 0.002. Se observó que los iones Pb2+ y Fe3+ mejoran la intensidad

de la fluorescencia con un rendimiento cuántico de Ф 0.11 y 0.019, respectivamente. Estos

resultados indican que el sensor H1imina exhibió una fuerte respuesta de fluorescencia de

encendido hacia el Pb2+ y Fe3+ sobre otros iones catiónicos en el agua, y podría servir como

sensor fluorescente eficaz para la detección de Pb2+.



49

Una vez obtenido los resultados de absorción y fluorescencia de la molécula en presencia de

diversos iones metálicos, se observó que la molécula H1imina presentó afinidad por el ion Pb2+.

Por tanto, se realizó estudio de sensibilidad de Pb2+ sobre el sensor H1imina (Ver Figura 36).

Asimismo, se estudió la sensibilidad de Fe3+ y Fe2+ (Ver anexos- Figura 93 y Figura 94).

Figura 36. Espectro fluorescente de sensibilidad del compuesto H1imina-Pb2+.

Se realizó el experimento de sensibilidad en fluorescencia con el fin de investigar el cambio de

emisión entre H1imina contra Pb2+. Los iones de plomo se añadieron en pequeñas cantidades a

una concentración fija de H1imina (10 µM). Con sucesivas adiciones de Pb2+ (0–8 µM). La

intensidad de la emisión de fluorescencia aumentó con la concentración del ion Pb2+. Los

resultados de titulación fluorescente apoyan el mecanismo de encendido de la fluorescencia tras

interacción H1imina–catión (Pb2+), por lo tanto, la intensidad de fluorescencia de H1imina aumenta

significativamente de una manera dependiente de la concentración del catión.

Se empleó el método de Job o de variación continua para obtener conocimiento sobre la relación

entre ligando y metal, es decir, formación del compuesto de coordinación. Los gráficos de Job se

obtuvieron a partir de la intensidad de emisión en función de la fracción molar entre ligando-



metal. A continuación, se observa el gráfico de Job determinado a partir de los experimentos de

fluorescencia para iones Pb2+ con su fracción molar correspondiente (Ver Figura 37). También,

se determinó para los iones Fe3+ y Fe2+ (Ver anexos- Figura 95 y Figura 96).

Figura 37. Diagrama de Job de cambios en la intensidad de fluorescencia variando la relación molar H1imina–Pb2+.

Como se observa en la Figura 37, reveló que la intensidad de la fluorescencia pasó a través de

un máximo de fracción molar de 0.62, lo que confirmó el complejo entre ligando- catión de

H1imina–Pb2+. Evidenciando que el sensor H1imina-Pb2+ L-M mostró una estequiometría de 2:1.

La Constante de unión (Ka) entre el ligando- catión (H1imina-Pb2+) se determinó utilizando el

gráfico de Benesi-Hildebrand (Ver Figura 38). A partir del estudio de titulación de fluorescencia.



51

Figura 38. Gráfico de Benesi-Hildebrand para H1imina en presencia de iones Pb2+.

Los gráficos de 1/ F-F0 versus 1/ [Pb2+], se observa un comportamiento lineal, justificada por el

valor estadístico de R2. En general se observó un incremento de la intensidad de fluorescencia

tras la interacción de H1imina–catión (Pb2+) y se obtuvo una constante de asociación de 26799

M-1 (H1imina- Pb2+). También, se determinó la constante de unión H1imina-Fe3+ y H1imina-Fe2+

(Ver anexos-Figura 97 y Figura 98). Estos valores indican la formación de los complejos entre el

ligando y el metal, por lo tanto, estos datos confirman la estabilización del complejo de unión.

Con respecto a los estudios cinéticos, los iones de plomo se utilizaron en exceso sobre el sensor

molecular H1imina. Los estudios cinéticos se realizaron en condiciones de reacción de pseudo-

primer orden, en 25°C (Ver Figura 39).



Figura 39. Cinética de la reacción H1imina–Pb2+.

Como se observa en el gráfico kobs versus concentración de iones de plomo tras la interacción

con el sensor H1imina, se encontró que la velocidad de reacción aumenta fuertemente a medida

en que se aumenta la concentración del analito (Pb2+).

3.4 Estudio del compuesto H2imina

Al evaluar la selectividad de H2imina frente a iones, se demostró un cambio en el espectro UV-

Vis en presencia de los iones Pb2+, Fe3+ y Fe2+ (Ver Figura 40).



53

Figura 40. Espectro de absorbancia de H2imina en presencia de diferentes iones (Hg2+, Cd2+, Cu2+, Zn2+, Al3+, Ca2+, Mg2+, K1+, Ba2+,

Cu1+, Na1+, Fe2+, Fe3+, Pb2+).

El sensor H2imina posee heteroátomos N, O, S lo que facilita la coordinación de iones metálicos

debido a la presencia de pares de electrones (Hamisu et al., 2020). Como se observa en el

espectro de UV-Vis en ausencia de iones metálicos, el sensor H2imina muestra un pico de

absorbancia de 404 nm, pero tras la adición de los iones metálicos Hg2+, Cd2+, Cu2+, Zn2+, Al3+,

Ca2+, Mg2+, K1+, Ba2+, Cu1+, Na1+, no mostró cambios significativos en la absorbancia. Mientras,

la adición de Pb2+, Fe2+ y Fe3+ dio como resultado una mejora de la intensidad de la absorbancia

y un cambio hipsocrómico de 404 nm a 350, 396 y 390 nm respectivamente. También, se

mostraron cambios de color a simple vista y bajo lámpara UV. De tal manera, el espectro indicó

que el sensor H2imina interactúa con los iones Pb2, Fe2+, Fe3+ (Ver Figura 41).



Figura 41. Propiedades colorimétricas del compuesto H2imina ante iones metálicos.

En la Figura 41 se observan los cambios de color a simple vista y bajo lámpara UV (365 nm) que

presenta el sensor molecular H2imina en presencia de Fe3+, la sonda cambió de un color amarillo

pálido a uno amarillo intenso. Mientras que en presencia de Pb2+ paso ser un amarillo verdoso

lográndose detectar a simple vista en ambos casos. El compuesto H2imina no presenta

coloración al ser expuesto bajo lámpara UV, pero en presencia de Pb2+ cambio a un color blanco

lechoso. Estos resultados indicaron que el sensor H2imina podría usarse como quimiosensor

potencial de estos cationes.

La interacción entre H2imina–catión fueron monitoreados por espectroscopía de fluorescencia en

medio acuoso en una solución de Buffer HEPES 20 mM a un pH de 7.4 (Ver Figura 42).



55

Figura 42. Espectro de fluorescencia de H2imina en presencia de diferentes iones (Hg2+, Cd2+, Cu2+, Zn2+, Al3+, Ca2+, Mg2+, K1+, Ba2+,

Cu1+, Na1+, Fe2+, Fe3+, Pb2+).

Como se presenta en la Figura 42, la adición de Pb2+ incrementó la intensidad de la fluorescencia

acompañado de un cambio de 31 nm de 484 a 510 nm. Cabe resaltar que el rendimiento cuántico

del sensor H2imina es Ф 0.06 mientras la adición de Pb2+ es de es Ф 0.16. De acuerdo con el

espectro fluorescencia me indica que la interacción H2imina–Pb2+ produjo el cambio de amarillo

pálido a un amarillo verdoso. Además, se sugiere que este tipo de interacción podría atribuirse a

la formación de un sistema rígido unido a Pb2+ indicándonos un sistema de apagado–encendido

potenciado posiblemente por la quelación del metal pesado (Wang et al., 2020).

Después de obtener los resultados de selectividad, se observó que el sensor molecular H2imina

interacciona de manera significativa con los iones Pb2 + frente a otros iones evaluados. Por esta

razón, se realizaron pruebas de sensibilidad para conocer las propiedades de detección del



sensor H2imina (Ver Figura 43). Además, el sensor H2imina presentó afinidad hacia los iones de

Fe3+ y Fe2+ donde se realizaron estudios de sensibilidad (Ver anexos-Figura 99 y Figura 100).

Figura 43. Espectro fluorescente de sensibilidad del compuesto H2imina-Pb2+.

Como se observa en la Figura 43, se valoró la intensidad de fluorescencia tras la adición de Pb2+.

Los cambios en el espectro de fluorescencia de H2imina mostraron que con el aumento de la

concentración de Pb2+ la emisión de la fluorescencia aumento de manera constante. De tal

manera que se notó que la interacción entre ligando-metal ofrece un mecanismo de sensor

molecular apagado-encendido.

Para explorar la estequiometría de la unión de H2imina–Pb2+, se realizó el gráfico de Job o de

variación continua. La grafica de Job se obtuvo graficando la intensidad de emisión en función

de la fracción molar entre ligando-metal (Ver Figura 44).



57

Figura 44. Diagrama de Job de cambios en la intensidad de fluorescencia variando la relación molar H2imina–Pb2+.

La Figura 44 se observa el gráfico del método de Job donde se realizaron mezcla de alícuotas

equimolares manteniendo un volumen constante. De este modo, se mantuvo una concentración

constante del sensor y analito y, así se varió las fracciones molares entre sensor y analito. Por lo

tanto, en la Figura 44 mostró un máximo de 0.5, lo que confirmó la estequiometría 1:1 del

complejo H2imina-Pb2+. Asimismo, se determinó la estequiometría para Fe2+ y Fe3+ (Ver anexos-


La constante de unión (Ka) se determinó utilizando la ecuación Benesi–Hildebrand, donde la

constante de asociación se estableció mediante un ajuste lineal de la curva de valoración de

fluorescencia (Ver Figura 45).



Figura 45. Gráfico de Benesi-Hildebrand para H2imina en presencia de iones Pb2+.

Por lo estudios anteriormente realizado para H2imina, se determinó la constante de estabilidad

entre ligando-catión, donde obtuvo una constante de unión 1983 M-1 para los iones de Pb2+.

Asimismo, fueron determinadas Fe2+ y Fe3+ (Ver anexos-Figura 103 y Figura 104).

Por otro lado, se realizaron un estudio cinético para observar el comportamiento H2imina–Pb2+.

Lo cual, la constante de velocidad se determinó mediante el ajuste de las intensidades de las

absorbancias utilizando la ecuación de pseudo primer orden (Ver Figura 46).



59

Figura 46. Cinética de la reacción H2imina–Pb2+.

En la Figura 46 se observa el estudio cinético, donde se realizó el exceso de iones de plomo

sobre el sensor molecular, asegurando las condiciones de pseudo primer orden. Cabe resaltar,

que la velocidad de reacción nos indica como cambia la velocidad de la reacción a una

temperatura especifica conforme a modificaciones de las concentraciones de analito o reactivo

(Eren et al., 2006). Por lo tanto, el gráfico cinético mostró ser lineal hasta cierto punto, donde se

observa un comportamiento constante indicando que se presenta una saturación cinética.

También, se observa que la constante de velocidad alcanza un máximo de concentración fija del

Pb2+.

3.5 Estudio del compuesto De1imina

Para examinar la propiedad de selectividad del De1imina frente otros iones, se llevó a cabo en

una solución de Buffer HEPES 20 mM a un pH de 7.4 (Ver Figura 47).



Figura 47. Espectro de absorbancia de De1imina en presencia de diferentes iones (Hg2+, Cd2+, Cu2+, Zn2+, Al3+, Ca2+, Mg2+, K1+, Ba2+,

Cu1+, Na1+, Fe2+, Fe3+, Pb2+).

En la Figura 47 se observa el espectro de UV-Vis del sensor molecular De1imina frente a varios

iones, el cual se examinó en medio acuoso. El espectro de absorción De1imina exhibió un

máximo de absorción a 438 nm. Sin embargo, la adición de cada ion metálico afecto

significativamente la banda de absorción. No obstante, cuando se agregaron los iones Pb2+, Fe3+,

Fe2+; la banda de absorción de la sonda aumentó. La aparición de estas bandas de absorción

434, 431 y 428 nm de los iones metálicos confirman la formación de complejo De1imina con los

iones Pb2+, Fe3+ y Fe2+, respectivamente. Además, se observó una nueva banda en 550 nm tras

la adición Pb2+.Por otro lado, la presencia de heteroátomos (N, O, S) en el sensor molecular

presumiblemente se encuentran involucrados con la interacción ligando–metal.

En el espectro de absorción no mostró un gran cambio significativo, tras la adicción de estos

iones Pb2+, Fe3+ y Fe2+, por esta razón, se procedió a investigar las propiedades de detección de

De1imina, en respuesta de la fluorescencia (Ver Figura 48).



61

Figura48. Espectro de fluorescencia de De1imina en presencia de diferentes iones (Hg2+, Cd2+, Cu2+, Zn2+, Al3+, Ca2+, Mg2+, K1+,

Ba2+, Cu1+, Na1+, Fe2+, Fe3+, Pb2+).

En la Figura 48 se observó que De1imina mantenía un máximo de 495 nm. Sin embargo, solo la

presencia de iones Pb2+ mostró un notable aumento de la intensidad de la fluorescencia a 518

nm como lo indica la línea morada. Simultáneamente, se observa la fuerte respuesta de

fluorescencia de “encendido” tras la interacción De1imina–Pb2+ con un rendimiento cuántico de

Ф 0.11. Cabe resaltar, que el sensor molecular De1imina posee un rendimiento cuántico de Ф

0.02, indicando que mostró una mejora de la fluorescencia en presencia del ion plomo. Además,

fue monitoreada bajo lámpara UV y a simple vista (365 nm), lo que presentó cambio de color

para ambos casos (Ver Figura 49).



Figura 49. Propiedades colorimétricas del compuesto De1imina ante iones metálicos.

Por otro lado, se observó que el sensor molecular De1imina mostró selectividad hacia diversos

iones (Pb2+/Fe2+/Fe3+), pero solo en presencia de iones Pb2+ se observaron cambios

colorimétricos, pasando de color amarillo pálido a un amarillo verdoso. También, al ser expuesta

bajo la luz UV (365 nm), se observó cambio de fluorescencia solo en presencia de iones Pb2+,

puesto que los otros iones no presentaron cambios de color detectables.

Para investigar el comportamiento de la concentración de iones sobre el quimiosensor, se tituló

mediante incrementos sucesivos de equivalentes de Pb2+ y se monitoreó el comportamiento de

la emisión (Ver Figura 50). Asimismo, se estudió la sensibilidad para los iones Fe2+ y Fe3+ (Ver




63

Figura 50. Espectro fluorescente de sensibilidad del compuesto De1imina-Pb2+.

En la Figura 50 se observa el comportamiento de la interacción de De1imina–Pb2+, indicando el

aumentó gradualmente de la fluorescencia con el incremento de la concentración (1–8 µM) de

iones Pb2+. Lo que indica que mostró una buena propiedad lineal de la emisión de fluorescencia

frente las concentraciones de Pb2+. Los resultados indicaron que el sensor molecular posee un

mecanismo de fluorescencia de apagado–encendido tras la interacción de los iones Pb2+.

Una vez determinada la sensibilidad y selectividad del sensor De1imina hacia el ion Pb2+, se

verificó el modo de unión entre el compuesto y el ion a partir del método de Job sobre la base de

la emisión de fluorescencia (Ver Figura 51). Asimismo, se estudió la estequiometría para los

iones Fe2+ y Fe3+, puesto que presentaron selectividad con el compuesto De1imina (Ver anexos-




Figura 51. Diagrama de Job de cambios en la intensidad de fluorescencia variando la relación molar De1imina–Pb2+.

Se observa la Figura 51 que la emisión de fluorescencia de Job alcanzó se observó un máximo

de 0.4. Esto sugiere que la estequiometría de unión entre el quimiosensor De1imina y Pb2+ es

2:1. Indicándonos la relación entre el sensor y el metal.

La constante de estabilidad Ka del complejo De1imina–Pb2+ se determinó utilizando el gráfico de

Benesi-Hildebrand basado en la estequiometría 2:1. Como se informa en los siguientes gráficos,

se ajusta la curva lineal de los datos y mediante los valores de las pendientes, intersecciones y

coeficiente de correlación se calcula los valores de la constante de unión (Ver Figura 52). Debido

al que el sensor De1imina presentó afinidad con los iones Fe3+ y Fe2+ se determinó la constante

de unión (Ver anexos-Figura 109 y Figura 110).



65

Figura 52.Gráfico de Benesi-Hildebrand para De1imina en presencia de iones Pb2+.

La constante de asociación entre ligando–catión se encontró como 59558 M-1 para el ion Pb2+.

Por tanto, se mostró que el sensor De1imina mostró alta constante de estabilidad, en

comparación con los iones Fe3+ y Fe2+.

Con el fin de estudiar el comportamiento químico entre ligando–catión, se realizaron estudios

cinéticos, en donde el plomo es agregado en exceso sobre el sensor molecular De1imina para

asegurar las condiciones de pseudo primer orden (Ver Figura 53).



Figura 53. Cinética de la reacción De1imina–Pb2+.

En el estudio cinético, se puede observar que los valores de la constante de velocidad versus

concentración del plomo, posee un comportamiento lineal, por tanto, la velocidad de reacción

aumenta fuertemente a medida en que añade grandes cantidades del plomo sobre el

quimiosensor De1imina.

3.6 Estudio del compuesto De2imina

La selectividad del compuesto De2imina se probó en presencia de una serie diferentes iones

metálicos de interés ambiental. Como Hg2+, Cd2+, Cu2+, Zn2+, Al3+, Ca2+, Mg2+, K1+, Ba2+, Cu1+,

Na1+, Fe2+, Fe3+, Pb2+ a 200 µM (Ver Figura 54).



67

Figura 54. Espectro de absorbancia de De2imina en presencia de diferentes iones (Hg2+, Cd2+, Cu2+, Zn2+, Al3+, Ca2+, Mg2+, K1+, Ba2+,

Cu1+, Na1+, Fe2+, Fe3+, Pb2+).

La respuesta en absorción UV–Vis frente a los cationes nombrados anteriormente, se observa

en la Figura 54. La adición de 200 µM de cada ion metálico no afectó significativamente las

bandas de absorción. Sin embargo, cuando se agregaron los 200 µM de Fe2+, la banda de

absorción centrada aumentó (448 nm), mientras que apareció una banda de absorción a 348 nm

tras la interacción De2imina-Fe2+. También, se observa selectividad con Fe3+ a 448 nm, lo que

contribuyó a la formación de un complejo De2imina con los iones Fe2+ y Fe3+.

Las propiedades de fluorescencia de De2imina se evaluaron frente a varios iones en solución

acuosa (Ver Figura 55).



Figura 55. Espectro de fluorescencia de De2imina en presencia de diferentes iones (Hg2+, Cd2+, Cu2+, Zn2+, Al3+, Ca2+, Mg2+, K1+,

Ba2+, Cu1+, Na1+, Fe2+, Fe3+, Pb2+).

El quimiosensor De2imina exhibió una longitud de emisión a 517 nm con un rendimiento cuántico

Ф 0.07. La adición de varios iones metálicos no afectó significativamente la emisión de

fluorescencia. Sin embargo, la adición de Pb2+ y Hg2+, se observó un aumento significativo en la

intensidad de fluorescencia y con un desplazamiento hacia el rojo de 537 y 523 nm, lo que indica

la selectividad del sensor De2imina. Por tanto, los iones Pb2+ y Hg2+ mejoran la emisión de la

fluorescencia del quimiosensor con un rendimiento cuántico de Ф 0.14 y 0.11, respectivamente.

Se investigó la detección colorimétrica a simple vista y bajo lámpara UV del sensor De2imina en

solución acuosa frente a los iones que presentó selectividad (Ver Figura 56).



69

Figura 56. Propiedades colorimétricas del compuesto De2imina ante iones metálicos.

Como se observa en la Figura 56, no se produjeron cambios colorimétricos a simple vista, pero

cuando fueron expuesto a la luz UV (365 nm) se produjo un cambio de color notable en presencia

del Pb2+ un color blanco lechoso. El cambio de color observado en respuesta de la interacción

de De2imina–Pb2+ indicando lo formación de un compuesto de coordinación.

Para comprender más el mecanismo de activación de la fluorescencia del sensor molecular

De2imina, se realizaron pruebas de sensibilidad, para conocer la mínima concentración de la

sonda De2imina puede detectar los iones de Pb2+, Hg2+(Ver Figura 57). También, se realizaron

los estudios de sensibilidad hacia los iones Fe2+ y Fe3+ (Ver anexos-Figura 111 y Figura 112).

Figura 57. Espectro fluorescente de sensibilidad del compuesto De2imina; A) De2imina-Pb2+; B) De2imina–Hg2+.



Como se observa en la Figura 57, las propiedades de fluorescencia del sensor De2imina frente

hacia los iones Pb2+ y Hg2+mostraron una buena relación lineal contra las diferentes

concentraciones de los iones en estudio, que varían entre 1-8 µM. De tal manera, que la

intensidad de fluorescencia del quimiosensor aumento gradualmente con las concentraciones

de los iones metálico, es decir, sufrió un encendido en la emisión de la fluorescencia.

La interacción de De2imina frente a los iones Pb2+ y Hg2+, se investigó mediante el método de

Job. El quimiosensor se valoró con los iones metálicos y se generó un gráfico de la

concentración de ion/ion+sensor frente a la intensidad de fluorescencia (Ver Figura 58). La

estequiometría de De2imina frente a los iones de Fe2+ y Fe3+ también se determinó (Ver anexos-


Figura 58. Diagrama de Job de cambios en la intensidad de fluorescencia variando la relación molar L–M; A) De2imina–Pb2+; B)

De2imina–Hg2+.

Se observa la emisión de fluorescencia alcanzo un máximo valor con respecto a la fracción molar

del ion metálico/el sensor es de alrededor de 0.4 y 0.5 para los iones metálicos Pb2+, y Hg2+. Esto

sugiere que la estequiometría de unión entre el sensor y el metal es 2:1 para los iones Pb2+,

mientras para el Hg2+ posee una estequiometría de 1:1. Por lo tanto, los gráficos del método de

Job me indican la formación de complejo entre ligando-metal.

Por otro lado, se determinó la constante de unión o asociación para el sensor De2imina utilizando

la ecuación Benesi–Hildebrand (Ver Figura 59).



71

Figura 59. Gráfico de Benesi-Hildebrand para De2imina en presencia de iones; A) Pb2+; B) Hg2+.

Sobre la base de los gráficos de Benesi – Hildebrand, las constantes de unión o estabilidad de

los complejos De2imina-Pb2+ y De2imina-Hg2+ se determinaron como 91361 M-1 y 6798 M-1,

respectivamente. Los gráficos presentaron una buena correlación lineal entre la emisión de la

fluorescencia y las concentraciones de los iones con buenos coeficientes de correlación,

justificada por el valor estadísticos de R2. También, se determinó para los iones Fe2+ y Fe3+ (Ver


Los estudios cinéticos se realizaron bajo condiciones de pseudo primer orden, donde las

soluciones de iones de plomo fueron en exceso sobre el sensor De2imina (Ver Figura 60).



Figura 60. Cinética de la reacción del compuesto De2imina-Pb2+

En la Figura 60 se observa el gráfico de cinética Pb2+ sobre el sensor molecular, de este modo

se observó el comportamiento cinético a través del tiempo. Donde, el gráfico de De2imina-Pb2+

presenta la constante de velocidad respecto a la concentración de plomo, lo cual, mostró un

comportamiento no lineal, indicando saturación en los sitios activos del sensor molecular.

Las características fotofísicas presentadas por los compuestos H1imina, H2imina, De1imina y

De2imina nos indicaron que presentan afinidad hacia Pb2+, Fe2+ y Fe3+ en los espectros de

absorbancia, siendo quimiosensores cromogénicos y colorimétricos. Donde, los derivados

cumarínicos 3-azometino- sustituidos tienen la capacidad de interactuar selectivamente con

estos iones. Además, los sensores moleculares conjugados indicaron que interacción entre

ligando–metal produjeron cambios en las propiedades fotofísicas y se permitió percibir con

facilidad el cambio de color a simple vista indicando la presencia de estos iones en medio acuoso.

En cuanto las propiedades de la emisión de la fluorescencia los compuestos H1imina y De1imina

presentaron afinidad con Pb2+, mientras H2imina mostró selectividad por Pb2+/Fe3+, y por último

el sensor molecular De2imina presentó interacción con Pb2+ y Hg2+, sin embargo, los sensores

derivados de cumarina mostraron una mayor afinidad por este catión Pb2+. Además, se investigó



73

la respuesta de selectividad en presencia de otros iones metálicos, mostrando en todos los

resultados que la interferencia por los otros metales era poco significante. Curiosamente la

interacción de los sensores cumarínicos 3–azometino-sustituidos muestra una respuesta de

activación fluorescente altamente selectiva y sensible para los iones. De este modo, la

interacción de los iones metálicos es desconocido. Sin embargo, basándonos en la literatura

reportada podemos intuir el mecanismo de activación de la fluorescencia tratándose de una

transferencia de carga entre ligando–metal. Por eso, la quelación de los iones metálicos podría

ocurrir a través de la coordinación del grupo azometino, carbonilo y la partición de los anillos de

tiofenos presentes en las moléculas como se describió en la Figura 61.

Figura 61. Mecanismo de interacción de los compuestos cumarínicos 3-azometino-sustituidos y Pb2+, Hg2+.

Como se observa en la Figura 61, los quimiosensores cumarínicos 3-azometino-sustituidos

presentaron un mecanismo de fluorescencia apagado–encendido en presencia de iones, pero a

pesar de que de los resultados de selectividad no se presentó activación de la fluorescencia con

Fe2+; se estudió el comportamiento de la emisión de la fluorescencia mediante el método de

sensibilidad y presentó un mecanismo de activación de la emisión. En este sentido, la afinidad

de los compuestos cumarínicos 3-azometino-sustituidos frente Fe3+ no exhibió una fuerte



fluorescencia respecto a los iones de Pb2+, sin embargo, también presentó un mecanismo

encendido en el sensor.

Los ligandos a base de Schiff son utilizados para la detección de iones metálicos por la existencia

del átomo de nitrógeno de imina que ofrece como sitio de unión o coordinación y mejora la

afinidad hacia la traza del ion metálico (Karachi et al., 2018). Cabe resaltar, que la presencia del

grupo C=N (azometino o imina) permite que los iones metálicos presenten interacción por el

átomo carbono por poseer un carácter electrófilo (acepta electrones) y al nitrógeno por ser

nucleófilo (cede electrones) (Kolcu et al., 2021). Además, se informó que el grupo C=N presenta

un equilibrio de isomerización que predomina la desintegración de la emisión de fluorescencia

(Xu et al., 2021; Kaur et al., 2020), es decir, la extinción de la fluorescencia, dando como

resultados una fluorescencia muy débil o con un rendimiento cuántico bajo. También, la

existencia de anillos de tiofenos en un sensor molecular permite la coordinación y formación de

compuesto quelado (Jeong et al., 2017, Kolcu et al., 2021). Por esta razón, los derivados de

cumarinas son ampliamente utilizadas en diferentes líneas de la ciencia, siendo un fluoróforo que

posee ventajas de exhibir sus propiedades fotofísicas, como grandes desplazamientos de

Stokes, longitudes de onda de excitación y emisión visibles (Wang et al. 2018). Considerando,

los puntos mencionados anteriormente, se diseñaron quimiosensores fluorescentes que contiene

como unidad de señalización derivados cumarínicos y como unidad de reconocimiento los

ligando 3-azometino-sustituidos (tiofeno) para la detección de Pb2+ y Hg2+ presentado

propiedades ópticas.

Basado en los resultados, se observó en los sensores moleculares que la adición de Pb2+ mostró

la mejora de la emisión de la fluorescencia junto con propiedades colorimétricas que podría ser

un potencial para el desarrollo de sensores colorimétricos y espectrofotométricos. Por lo

contrario, no se encontró ninguna mejora en la emisión frente a otros cationes metálicos. Estas

observaciones ilustraron que el sensor H1imina y De1imina exhibían propiedad de detección de

fluorescencia con Pb2+, mientras que H2imina presentó con Pb2+/Fe3+, por último, De2imina

presentó afinidad por Hg2+/Pb2+. Los ligandos cumarínicos 3-azometino-sustituidos no mostraron

una emisión de fluorescencia notable cuando se excitaban a sus respectivas longitudes de onda

y es debido a la isomerización cis o trans del enlace C=N provocando la desintegración de la

baja fluorescencia o rendimientos cuánticos de las moléculas siendo ≤ 0,07 y también por la

transferencia fotoinducida (PET–siglas en inglés) que presenta el enlace C=N (Li et al., 2009;

Ding et al., 2021; Velmurugan et al., 2021). Por otro lado, en presencia de Pb2+/Hg2+/Fe3+/Fe2+



75

mejora la emisión de fluorescencia podría deberse al efecto de fluorescencia potenciado por

quelación (CHEF–siglas en inglés) que inhibió el proceso de isomerización del grupo azometino

y la disminución del proceso de transferencia de electrones en el ligando provocando la

activación de la emisión de la fluorescencia del quimiosensor (Kocul et al., 2021; Ding et al.,

2021; Gharami et al., 2017), es decir, un mecanismo de apagado–encendido. La selectividad y

sensibilidad participaron en la mejora de la fluorescencia cuando los iones metálicos se unieron

al ligando del fluoróforo. De tal manera, que la presencia de un par de electrones solitario en la

imina de los ligandos sintetizados catalizaría la quelación de los cationes, dado así, permite la

coordinación del metal, dando como resultado un mecanismo de apagado-encendido. Además,

el proceso de quelación mejoró la fluorescencia de los derivados cumarínicos 3-azonometino-

sustituidos debido a la presencia de los átomos S, N y O como donantes, favoreciendo la

formación de un complejo de coordinación, lo que permite la inhibición de isomerización del grupo

C=N y la transferencia electrónica fotoinducida (PET-siglas en inglés), es decir, inhibiendo la

isomerización del enlace PET (Sahana et al., 2013; Hua et al., 2020; Shyamal et al., 2016). Cabe

resaltar, que los iones metálicos cuando se unen al quimiosensor y forman el complejo de

coordinación, habrá una alteración de los niveles de energía de los electrones, lo que provocará

un encendido o apagado en la fluorescencia y así mismo se observará los cambios en

absorbancia y emisión (Formica et al., 2012; Naik et al., 2021). Además, el efecto PET depende

en gran medida de la polaridad del disolvente facilitando la transferencia de un par de electrones

solitarios desde el receptor. Por otro lado, los anillos de tiofenos ofrecen propiedades ópticas y

electrónicas, siendo ampliamente utilizado como agente de señalización de fluorescencia hacia

los iones metálicos (Cho et al., 2018; Jeong et al., 2017).

Con base en los resultados investigados anteriormente de las valoraciones de sensibilidad,

colorimetría, el gráfico de Job, los métodos de Benes–Hildebrand, revelan la estequiometría

específica entre el ligando y metal en el complejo. De acuerdo con la teoría ácido-base duro-

blando de Pearson (Brewin et al., 2014), el Pb2+ y Fe2+ se encuentra en el límite de suavidad-

dureza, y pueden mostrar una coordinación eficiente con ligandos que contiene bases duras

como lo es el nitrógeno y oxígeno; o especies blandas como el azufre, por tanto, la presencia de

estos heteroátomos en el sensor molecular puede mejorar la opción para el reconocimiento

selectivo de los iones. Mientras que Fe3+ es un ácido duro, así pues, los átomos de nitrógeno y

oxigeno se comporta como una base dura. Por último, el Hg2+ es un ácido blando y puede

coordinarse con el azufre o al nitrógeno, estando la imina cerca al límite debido a la mayor



polarización impartida por los anillos de tiofenos o por la extensión de conjugación de los doble

enlaces lo que hace que se comporte como una base blanda (Balderas-Hernández et al., 2007;

Hamisu et al., 2020). Además, estos heteroátomos poseen pares de electrones libres, lo cual

permite la coordinación del metal a través de los orbitales moleculares. Por lo tanto, es probable

que los sensores moleculares cumarínicos 3-azometino-sustituidos forme estructura de dímeros

en su mayoría de casos por la estequiometría mediante la quelación de los iones. Por lo anterior,

se sabe que las iminas son pocos fluorescentes, en parte a la isomerización C=N en el estado

excitado y parte al proceso PET. Pero como se observó en todos los casos, presentó inhibición

en el sistema de isomerización por la formación de complejo a través de la presencia de los

heteroátomos en el quimiosensor y, además, por el proceso de quelación entre ligando-metal

indicando la transferencia de carga que es iniciada por la unión del metal al ligando, y condujo

una mejora de la emisión de la fluorescencia y desplazamientos en los espectros de absorbancia.

Por otro lado, la constante de asociación o la constante de unión, es la estabilidad de un complejo

metal-ligando, es decir que la estabilidad de un compuesto de coordinación en solución acuosa

se determina por la magnitud de la constante de equilibrio, dado así, entre más grande sea el

valor Ka, mayor será su estabilidad, dicho de otra manera, el valor numérico significa la formación

completa del ion complejo. Por lo anterior, se determinó la constante de unión de los compuestos

cumarínicos 3-azometino sustituidos H1imina-Pb2+(26799 M-1), H2imina-Pb2+(1933 M-1),

De1imina-Pb2+ (59558 M-1), De2imina-Pb2+ (91361 M-1) y De2imina-Hg2+ (6798 M-1). En este

sentido, la estabilidad y la afinidad entre metal-ligando se debe a una complementaria

geométrica, es decir la cantidad de sitios activos o disponibles en su forma y tamaño (radio-

cavidad), además, tener la capacidad de preorganizarse, en donde, el analito pueda enlazarse

con el ligando y, por último, el efecto del disolvente tiene un rol importante, puesto que tiene

como objetivo favorecer la estabilidad, solubilidad, velocidad de reacción, control cinético y

termodinámico. De este modo, el entorno químico del compuesto de coordinación ayuda la

estabilidad y el reconocimiento molecular entre analito-ligando (Lehn et al., 1995). Por otra parte,

otro compuesto sintetizado a base de Schiff (1) para la detección de ion Pb2+, presentó una

constante de unión de 2041 M-1 y es debido al medio en que fue disuelto el sensor molecular

siendo un tampón CH3CN/HEPES (9:1; V/V) (Meng et al., 2018). Asimismo, Rahimi y sus

colaboradores diseñaron un compuesto a base de fluoreno y se determinó que la constante de

estabilidad fue 5.65*108 M-2 siendo disuelto en un medio orgánico (CH3CN) (Rahimi et al., 2021).



77

En otras palabras, el solvente juega un papel importante debido a que favorece la constante de

estabilidad del complejo o el efecto quelato.

En cuanto el comportamiento cinético de pseudo primer orden, nos permite observar la

interacción entre L-M por unidad de tiempo durante la reacción. La Figura 39 y la Figura 53

muestran un comportamiento lineal de pseudo primer orden, es decir, a mayor concentración del

analito sobre el sensor, mayor va a ser la constante de velocidad. Mientras la Figura 46 y Figura

60, muestran un comportamiento no lineal, es decir una meseta, es debido a que el sensor

molecular está saturado, puesto que todos sus sitios activos están ocupados por el analito.

3.6 Estudio del compuesto Cum-S

Para evaluar la selectividad del compuesto Cum-S frente a diferentes iones metálicos se llevaron

a cabo estudios en el espectrofotómetro UV-Vis. La Figura 62, muestra el espectro de absorción

del compuesto Cum-S con los distintos cationes.

Figura 62. Espectro de UV-Vis del compuesto Cum-S en presencia de diferentes iones (Cu2+, Al3+, Hg2+, Cd2+, Ca2+, Fe2+, Fe3+,

Co2+, Mg2+).



Se observó que se mantenía un máximo de absorbancia a una longitud de onda de 483 nm. Sin

embargo, solo en presencia de Hg2+ hubo un cambio significantemente, observándose una

disminución de la absorbancia y un desplazamiento batocrómico a 520 nm, esto posiblemente

puede indicar la formación de una especie química. En comparación de los demás iones

metálicos que no provocaron ningún cambio en la absorbancia. Por otro lado, otro compuesto

sintetizado para la detección de metales en medio acuoso presento un cambio significativo frente

a iones de mercurio, fue sintetizado por Zareh y sus colaboradores, presentando una absorbancia

de 380 nm frente a la interacción de iones mercúricos. Además, Qin et al., (2018), sintetizaron la

sonda MS4 (tiocumarina) y observaron que cuando se añadida iones de Hg2+ sobre el sensor

presentada un comportamiento hipsocrómico a 386 nm siendo característica del fluoróforo de la

cumarina.

Para evaluar las propiedades de fluorescencia del compuesto Cum-S, se examinó su respuesta

de emisión de fluorescencia frente a varios iones como se ilustra en la Figura 63.

Figura 63. Espectro de fluorescencia del compuesto Cum-S en presencia de diferentes iones.

En la Figura 63, el Cum-S mostró una débil emisión de fluorescencia con un rendimiento cuántico

Ф 0.013, exhibiéndose a una longitud de excitación de 480 nm. Como se observa en el espectro

de fluorescencia, el compuesto Cum-S no mostró cambios al agregar los diversos iones metálicos



79

individualmente. Por el contrario, se observó un apagamiento de la emisión de fluorescencia

después de agregar Hg2+ a la solución del compuesto Cum-S, esto puede explicarse debido a la

formación de complejo de la molécula con el ion mercúrico o a una reacción de desulfurización

(Aliaga et al., 2020; Tang et al., 2019). El rendimiento cuántico de la Cum-S, es bajo en

comparación con otra sonda sintetizada para la detección selectiva de Hg2+, se obtuvo un

rendimiento cuántico de 0.32 (García-Beltrán et al., 2012).

Al probar los metales con el sensor molecular Cum-S, se observa que solo los iones de mercurio

reaccionan de manera rápida y selectiva, mostrando propiedades colorimétricas y fotométricas

(Ver Figura 64).

Figura 64. Propiedades colorimétricas del compuesto Cum-S (10 µM) en presencia del Hg2+ (200 µM).

En la Figura 64, se observan cambios de color a simple vista y en fluorescencia que presenta el

compuesto Cum-S tras la interacción con iones de mercurio. El sensor molecular Cum-S a simple

vista cambio de color rosado a amarillo al agregar Hg2+, siendo el compuesto Cum-S un método

rápido para detección colorimétrica. El quimiosensor Cum-S al ser expuesto bajo lámpara UV en

presencia de Hg2+ se observa un cambio de fluorescencia detectable. Por tanto, el sensor Cum-

S mostró propiedades colorimétricas y selectiva hacia los iones mercúricos.

Se detectó en el sensor Cum-S presenta afinidad con Hg2+ y mostraron cambios en los espectros

de absorción y fluorescencia. Para ellos, se realización pruebas de sensibilidad utilizando

diferentes concentraciones de Hg2+ (Ver Figura 65).



Figura 65. Espectro de absorbancia de sensibilidad del compuesto Cum-S–Hg2+.

Como se observa en la Figura 65, los experimentos mostraron que el Cum-S presenta la misma

característica de absorción, al agregar diferentes concentraciones de iones mercúricos, se

evidencia el comportamiento creciente de una nueva banda de absorción, debido a la formación

de una nueva especie química, es decir, una desulfurización. La reacción Cum-s–Hg2+ se debe

a la afinidad que presenta el metal hacia el azufre tiocarbonilo del sensor (Choi et al., 2009; Cha

et al., 2010).

La emisión de fluorescencia del Cum-S se evaluó frente a diferentes concentraciones de iones

mercúricos (0.25–2.5 µM) (Ver Figura 66).



81

Figura 66. Espectro fluorescente de sensibilidad del compuesto Cum-S–Hg2+.

En la Figura 66, representa el cambio gradual en el espectro de emisión de fluorescencia, tras la

adición de Hg2+. Cuando se agregaron Hg2+, la banda de absorción en 542 nm aumentó

significativamente, mientras que la nueva banda de fluorescencia a 473 nm disminuyó tras la

adición de concentración de Hg2+ y mostró un punto isosbéstico distinto a 418 nm. Además, el

grafico de sensibilidad mostró que la adición Hg2+ mostró una buena relación de emisión de

fluorescencia entre 542 y 473 nm fue linealmente proporcional a la concentración del analito. Por

lo tanto, el quimiosensor Cum-S confirmó que se puede utilizar eficazmente para la detección de

iones de Hg2+. Por otro lado, una sonda fue diseñada por Gyu y colaboradores, en donde se

determinó que la absorbancia aumentaba a medida en que se añadía iones de Hg2+ frente a la

sonda; adicionalmente los autores observaron que la absorbancia disminuía significativamente a

640 y 590 nm, mientras que 503 y 545 nm aparecía una banda y aumentaba gradualmente. De

tal modo, la banda de absorción de 640 nm es casi proporcional a las concentraciones de iones

mercúricos, y se observó una saturación cuando la solución del sensor se expone a 55 µM de

Hg2+ (Gyu et al., 2017). Confirmando de esta manera, un mecanismo de desulfurización. Por otra

parte, Qin et al., (2018), sintetizaron la sonda MS4, se observó que la sonda tenía una coloración

fluorescente-amarillo con una banda de emisión 543 nm, sin embargo, al añadir progresivamente

concentraciones de Hg2+ la banda de emisión disminuyó rápidamente y una nueva banda

apareció en 447 nm con un evidente cambio de color azul lo que se dedujo que se atribuía a la



formación del fluoróforo cumarina dado por la desulfuración del grupo tiocarbonilo.

Por otro lado, se determinó el límite de detección del compuesto Cum-S, siendo 1,1*10−9 M y el

límite de cuantificación 3,7*10−9 M. Por lo tanto, en comparación con Qin et a., (2018) el

compuesto mostró un el límite de detección 9,23*10-9 M; por lo tanto, ambos compuestos

sintetizados están por debajo del umbral de la Agencia de Protección Ambiental (EPA) de EE.

UU. en el agua potable (2,0 ppb).

Para explorar las propiedades espectrales de Cum-S, se evaluó la interacción con los iones

mercúricos en diferente tiempo se observó mediante un análisis espectroscópico de absorción

UV–Vis (Ver Figura 67).

Figura 67. Evolución de la absorbancia del compuesto Cum-S–Hg2+ en relación con el tiempo.

De manera similar, se investigó la detección de Hg2+ por el compuesto Cum-S. En la Figura 67,

se indicó una banda de absorción 500 nm, la cual disminuyó con el tiempo (0 – 6 h), mientras

que una nueva banda de absorción alrededor de 390 nm aumentó. Además, se observó un punto

isosbéstico a 433 nm. La banda de absorción que se presenta en el corrimiento azul de 390 nm

es característica del fluoróforo de la cumarina (2), lo que indica que el compuesto 2 se formó en

presencia de los iones mercúricos. Por tanto, ocurre una reacción de desulfurización ocasionada



83

específicamente por Hg2+ generando nuevamente el carbonilo de la cumarina (Nguyen et al.,

2020; Ma et al., 2010).

Estos resultados del sensor Cum-S, demostraron que presenta afinidad hacia los iones

mercúricos, por tanto, se evaluó su comportamiento de desulfurización mediante técnicas

espectroscópicas (Ver Figura 68).

Figura 68. A) Espectro UV - Vis de Cum-S; B) Espectro de UV - Vis de Cum-S-Hg2+; C) Espectro de UV-Vis de 2.

Se observa en la Figura 68 las propiedades espectroscópicas del compuesto Cum-S donde

exhibe una longitud de excitación de 483 nm. Tras adición de Hg2+ ocurre un desplazamiento

batocrómico a 513 nm en un tiempo 0 h, indicando la interacción de la tiocumarina con los iones

mercúricos, trascurrido el tiempo (8 h) apareció una nueva banda a 390 nm, característica del

fluoróforo cumarínico, es decir, el compuesto 2. Por tanto, se indica que la tiocumarina presento

una reacción de desulfurización en presencia de los iones mercurio.

Seguidamente se hizo un estudio de 13C-RMN en ausencia y presencia del metal para determinar

la reacción de desulfurización del compuesto Cum-S (Ver Figura 69).



Figura69. Espectro de 13C RMN del compuesto Cum-S (A); y en presencia de iones mercúricos (B).

Con los resultados obtenidos se dedujo que al agregar Hg2+, el átomo de carbono C = S (C-2) de

la tiocumarina posee un desplazamiento químico de δ = 194.7, y se observa claramente un

desplazamiento químico δ = 166.0 siendo una señal típica de carbonilo C = O (C-2) de fluoróforo

cumarínico.

Los resultados obtenidos del compuesto Cum-S concuerda con el mecanismo de desulfurización

y como se muestra en los resultados existe la extinción de la emisión de la fluorescencia en

presencia de los iones mercúrico (Ver Figura70).

Figura 70. Mecanismo de desulfurización.

En este esquema, se observa los cambios fotofísicos en presencia de los iones mercúricos,

donde ocurre una reacción de desulfurización oxidativa en el tiocarbonilo del sensor Cum-S, lo

que se confirmado por la aparición de señales en 13C RMN. El primer paso para este mecanismo



85

de reacción es la coordinación del metal Hg2+ en la sonda Cum-S, es decir, la formación de un

complejo estable con el enlace Hg+- S, siendo este complejo resultante de la extinción de la

emisión de la fluorescencia de compuesto Cum-S. Posteriormente, ocurre el proceso de

desulfurización del grupo tiocarbonilo en presencia del agua, es decir, ocurre una solvatación del

medio acuoso actuando como nucleófilo en el sistema y finalmente obteniéndose como resultado

la cumarina 2 (Qin et al., 2018; Nguyen et al., 2020). Cabe resaltar, que el principio de ácido-

base duro-blando (HSDB – siglas en inglés) permite predecir la estabilidad y la reactividad de

una reacción ácido–base generalizada. El principio de HSAB estable que el ácido duro prefiere

reaccionar con una base dura y un ácido blando prefiere con una base blanda. De tal forma, la

fuerza y la estabilidad del ligando y metal depende de la dureza de los ácidos y bases de Lewis.

Por lo tanto, los iones de mercurio al ser un ácido blando y quimiosensor tener una base blanda

en este caso el heteroátomo de S involucra la afinidad de Hg2+ frente a este heteroátomo, de

modo que, el desplazamiento batocrómico se debe a la donación de electrones por parte del

compuesto Cum-S al catión mercúrico. Así, la interacción ligando-metal deben tener

características similares como tener una densidad de carga baja, más polarizables (Balderas-

Hernández et al., 2007; Hamisu et al., 2020; MelniKov et al., 2020).

Como se observó en los resultados anteriores, el sensor Cum-S presentó una interacción con

iones mercúricos mostrando apagamiento de la fluorescencia y un corrimiento batocrómico en

absorbancia (Ver Figura 71).

Figura 71. Mecanismo de la emisión de fluorescencia de encendido – apagado - encendido.

En la Figura 71 se observa que el compuesto Cum-S presentó afinidad con Hg2+, lo que provocó

la extinción de la emisión de la fluorescencia indicando un mecanismo de apagado-encendido



tras la interacción Cum-S-Hg2+. Dado así, se observó en los espectros UV-Vis un desplazamiento

batocrómico, es debido a la afinidad entre ligando y metal que favorece la estabilización del

sistema formación o el compuesto de coordinación, por lo cual, existe una retrodonación a través

de los orbitales moleculares entre ligando-metal. Por lo tanto, esto explica los desplazamientos

en absorbancia y la respuesta colorimétrica (Fabbrizzi et al., 1999; Kim et al., 2007; Bowman-

James, 2005; Antonisse et al.,1998).

4. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

4.1 Conclusiones

Los sensores fluorescentes cumarínicos 3-azometino-sustituidos y tiocumarina ofrecen un

excelente modelo estructural para el desarrollo de sensores colorimétricos, fotométricos y

espectrofométrico, en medio acuoso permitiendo ser más amigable con el ambiente. Los

resultados presentes en el trabajo permiten concluir que los quimiosensores fluorescentes

cumarínicos 3-azometino-sustituidos, (H1imina, H2imina, De1imina), presentaron selectividad y

sensibilidad por Pb2+/Fe2+/Fe3+, mientras De2imina mostró afinidad por Pb2+/Hg2+/Fe2+/Fe3+.

Los quimiosensores fluorescentes cumarínicos 3-azometino-sustituidos mostraron una respuesta

de encendido de la emisión de la fluorescencia altamente selectiva y sensibles hacia los iones

Pb2+, Hg2+, Fe3+ y Fe2+, juntos con cambios colorimétricos y expuesta en la lámpara UV (365 nm).

Además, la estequiometria del compuesto coordinación, es decir, entre el sensor y el metal se

confirmó por el gráfico de Job y por el método de Benesi–Hildebrand. La formación del complejo

provocó la inhibición del proceso PET en el enlace azometino y la isomerización de los sensores

cumarínicos. Además, se llevó a cabo el estudio cinético de la formación de complejo, donde se

mostró que existe saturación del sensor molecular en los compuesto H2imina–Pb2+ y De2imina–

Pb2+, mientras H1imina–Pb2+ y De1imina-Pb2+, mostraron un comportamiento lineal, es decir, con

el aumento de la concentración aumentaba significativamente la constante de velocidad.

Se sintetizó un derivado cumarínico sustituido con azufre para la detección de Hg2+. El compuesto

Cum-S exhibió un apagamiento de la fluorescencia en presencia de iones mercurio y una

disminución y desplazamiento batocrómico de la absorbancia. También, se investigaron los

comportamientos fluorescentes y cromogénicos de la sonda Cum-S hacia varios iones y los

cuales mostraron selectividad y sensibilidad por Hg2+ mediante una reacción de desulfurización

activada por el mercurio. Además, el sensor molecular Cum-S mostró propiedades colorimétricas

en presencia de Hg2+.




4.2 Recomendaciones

Debido a las limitaciones por la contingencia generada a raíz del Covid-19, no fue posible realizar

algunos análisis de los sensores moleculares. Lo cual se recomienda realizar las pruebas

faltantes como:

• Confirmar la formación del complejo de los compuestos cumarínicos 3-azometino-

sustituidos tras la interacción con los iones de plomo y mercurio.

• Determinar el límite de detección de los sensores fluorescentes cumarínicos 3-azometino-

sustituidos.

• Estudiar los quimiosensores a mayor profundidad, para su posible uso en matrices

ambientes y biológicos para la detección de Pb2+ y Hg2+.

• Seguir diseñando y sintetizando quimiosensores fluorescentes con propiedades

colorimétricas, mediante los derivados de cumarina, para aportar a la literatura científica

nuevos quimiosensores para posibles aplicaciones en diferentes líneas de la

investigación.

ANEXOS

A continuación, se presentan los espectros de RMN 1H y 13C de las plantillas estructurales de los

derivados de las cumarinas 3-azometino-sustituidos.

Figura 72. Espectro de 1H RMN (DMSO-d6) del compuesto (1).



Figura 73. Espectro de 13C RMN (DMSO-d6) del compuesto (1).












Figura 79.Espectro de 13C RMN (DMSO-d6) del compuesto (4).

Caracterización de los ligandos cumarínicos 3-azometino-sustituidos basado en espectroscopía

de resonancia magnética nuclear de 1H y 13C.

Figura 80. Espectro de 1H RMN (CDCl3) del compuesto (H1imina).



Figura 81. Espectro de 13C RMN (CDCl3) del compuesto (H1imina).



Figura 82. Espectro de 1H RMN (CDCl3) del compuesto (H2imina).

Figura 83. Espectro de 13C RMN (CDCl3) del compuesto (H2imina).



Figura 84. Espectro de 1H RMN (MeOH-d4) del compuesto (De1imina).

Figura 85. Espectro de 13C RMN (MeOH-d4) del compuesto (De1imina).



Figura 86. Espectro de 1H RMN (MeOH-d4) del compuesto (De2imina).

Figura 87. Espectro de 13C RMN (MeOH-d4) del compuesto (De2imina).



Caracterización de la tiocumarina basado en espectroscopía de resonancia magnética nuclear

de 1H y 13C.

Figura 88. Espectro de 1H RMN (CDCl3) del compuesto (2).

Figura 89. Espectro de 13C RMN (CDCl3) del compuesto (2).



Figura 90. Espectro de 1H RMN (CDCl3) del compuesto (Cum-S)

Figura 91. Espectro de 13C RMN (CDCl3) del compuesto (Cum-S)



Figura 92. HRMS del compuesto (Cum-S)

Como se mostró en los resultados, los sensores cumarínicos 3-azometino-sustituidos

presentaron sensibilidad y selectividad hacia los iones Fe2+ y Fe3+.



Figura 93. Espectro fluorescente de sensibilidad del compuesto H1imina-Fe3+.




El experimento de sensibilidad de fluorescencia para los iones Fe2+ y Fe3+ sobre el sensor

H1imina, mostró aumento de la fluorescencia a medida en que se adicionaba la concentración de

los iones. Los resultados en las Figuras 93 y Figura 94, mostraron el mecanismo de apagado–

encendido.

Figura 95. Diagrama de Job de cambios en la intensidad de fluorescencia variando la relación molar de H1imina–Fe3+.

Figura 96. Diagrama de Job de cambios en la intensidad de fluorescencia variando la relación molar de H1imina–Fe2+.



Como se observa en las Figura 95 y Figura 96, reveló que la intensidad de la fluorescencia pasó

a través de un máximo de fracción molar 0.62 y 0.5 para los iones Fe3+ y Fe2+, respectivamente.

Lo que evidencia que en sensor H1imina-Fe3+ y H1imina-Fe2+ posen una estequiometría de 2:1 y

1:1, respectivamente.

Figura 97. Gráfico de Benesi-Hildebrand para H1imina en presencia de iones Fe3+.



Figura 98. Gráfico de Benesi-Hildebrand para H1imina en presencia de iones Fe2+.

En los gráficos de Benesi – Hildebrand se observa un comportamiento lineal, donde se obtuvo la

constante de estabilidad de los compuestos de coordinación cuyo valor fue de 34769 M-1 para

H1imina-Fe3+ y de 9783 M-1 para H1imina-Fe2+ (Ver Figura 97 y Figura 98).





En los gráficos de sensibilidad (Figura 99 y Figura 100), la adición de los metales Fe2+ y Fe3+

sobre el sensor H2imina, presentaron un mecanismo de activación en la fluorescencia.

Figura 101. Diagrama de Job de cambios en la intensidad de fluorescencia variando la relación molar H2imina–Fe3+.



Figura 102. Diagrama de Job de cambios en la intensidad de fluorescencia variando la relación molar H2imina–Fe2+.

La Figura 101 y Figura 102, muestra los gráficos del método continuo. Como se observa la

emisión de la fluorescencia pasó un máximo en la fracción molar de 0.4 y 0.45 para los iones

Fe3+ y Fe2+, respectivamente. Confirmo la unión del complejo con una estequiometría 2:1 para

ambos casos.

Figura 103. Gráfico de Benesi-Hildebrand para H2imina en presencia de iones H2imina-Fe3+.



Figura 104. Gráfico de Benesi-Hildebrand para H2imina en presencia de iones H2imina-Fe2+.

Basado en los gráficos de sensibilidad se determinó la constante de estabilidad entre ligando-

catión, la cual fue Fe2+es de 82966 M-1, mientras que para la unión de H2imina–Fe3+ fue

determinada en 9491 M-1 (Ver Figura 103 y Figura 104).



Figura 105. Espectro fluorescente de sensibilidad del compuesto De1imina–Fe3+.

Figura 106. Espectro fluorescente de sensibilidad del compuesto De1imina–Fe2+.



La interacción de De1imina-Fe3+ y De1imina-Fe2+, mostraron un aumento gradual de la emisión

con el incremente de la concentración de los iones de Fe3+. Por otra parte, la emisión de

fluorescencia de De1imina – Fe2+ aumentó significativamente y alcanzó un equilibrio con la

adición de Fe2+ hasta una concentración de 5 µM (Ver Figura 105 y Figura 106).

Figura 107. Diagrama de Job de cambios en la intensidad de fluorescencia variando la relación molar De1imina–Fe3+.

Figura 108. Diagrama de Job de cambios en la intensidad de fluorescencia variando la relación molar De1imina – Fe2+.



La Figura 107 y Figura 108, se observa que la emisión de fluorescencia de Job alcanzó un

máximo cuando la fracción molar de ion/ sensor es de 0.4 para los iones Fe3+ y Fe2+. Esto sugiere

que la estequiometría de unión entre el quimiosensor De1imina y los iones metálicos es 2:1.

Figura 109. Gráfico de Benesi-Hildebrand para De1imina en presencia de iones Fe3+.




La constante de asociación entre ligando – catión se encontró 62394 M-1 y 32054 M-1 para Fe3+

y Fe2+, respectivamente (Ver Figura 109 y Figura 110).



Figura 111. Figura112. Espectro fluorescente de sensibilidad del compuesto De2imina-Fe3+.

Figura 113. Espectro fluorescente de sensibilidad del compuesto De2imina-Fe2+.



La Figura 112 y Figura 113, mostraron una buena relación lineal frente a las diferentes

concentraciones de los iones Fe3+ y Fe2+ sobre el sensor De2imina. De tal manera, mostró que la

interacción entre ligando-metal ofrece un mecanismo de sensor molecular apagado-encendido.

Figura 114. Diagrama de Job de cambios en la intensidad de fluorescencia variando la relación molar De2imina–Fe3+.

Figura 115. Diagrama de Job de cambios en la intensidad de fluorescencia variando la relación molar De2imina – Fe2+.



Se observa en la Figura 114 y Figura 115, que la emisión de fluorescencia alcanzó un máximo

valor con respecto a la fracción molar, siendo alrededor de 0.3 y 0.7 para los iones Fe2+ y Fe3+,

respectivamente. Esto sugiere que la estequiometría de unión entre el sensor y el metal es 2:1

para ambos casos.





Sobre la base de los gráficos de Benesi – Hildebrand, las constantes de unión o estabilidad de

los complejos De2imina –Fe2+ y De2imina-Fe3+ se determinaron como 552 M-1 y 3.063 M-1,

respectivamente (Ver Figura 116 y Figura 117).



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Síntesis de cumarinas 3-azometino- la detección de iones