Smart DetectTM SARS-CoV-2 rRT-PCR Kiti8sit3w4v3z1h99oi1gmrx61-wpengine.netdna-ssl.com/wp... · 2020. 8. 3. · ensayo de diagnóstico molecular in vitro que ayuda en la detección

EUA Smart DetectTM SARS-CoV-2 rRT-PCR Kit (Spanish) Insert Part No. 900260-01 Effective Date: 07/29/2020 Page 1 of 31

Smart DetectTM SARS-CoV-2 rRT-PCR Kit

Instrucciones de uso Solo con autorización de uso de

emergencia (EUA) Para uso en diagnóstico in vitro (IVD)

Solo con receta USO PREVISTO

El Smart DetectTM SARS-CoV-2 rRT-PCR Kit es una prueba de RT-PCR en tiempo real prevista para la detección cualitativa del ácido nucleico del coronavirus 2 relacionado con el síndrome respiratorio agudo grave (SARS-CoV-2) en muestras humanas obtenidas mediante hisopado nasofaríngeo, hisopado nasal anterior e hisopado del cornete nasal medio de personas cuyo proveedor de atención médica sospecha que pueden estar afectadas por la COVID-19. Las pruebas se limitan a los laboratorios certificados conforme las Enmiendas para la Mejora de los Laboratorios Clínicos (CLIA) de 1988, 42 USC §263a, para realizar pruebas de alta complejidad.

Los resultados identifican el ARN del SARS-CoV-2. El ARN del SARS-CoV-2 generalmente se puede detectar en muestras de las vías respiratorias durante la fase aguda de la infección. Los resultados positivos indican la presencia de ARN del SARS-CoV-2. Se debe establecer la correlación clínica con el historial del paciente y otra información de diagnóstico para determinar el estado de infección del paciente. Los resultados positivos no descartan una infección bacteriana o coinfección con otros virus. El agente detectado puede no ser la causa definitiva de la enfermedad. Los laboratorios dentro de Estados Unidos y sus territorios deben informar todos los resultados positivos a las autoridades de salud pública correspondientes.

Los resultados negativos no excluyen la infección por SARS-CoV-2 y no deben usarse como el único fundamento para las decisiones de atención del paciente. Los resultados negativos deben combinarse con observaciones clínicas, antecedentes del paciente e información epidemiológica.

El Smart DetectTM SARS-CoV-2 rRT-PCR Kit está diseñado para ser utilizado por personal de laboratorio clínico calificado y específicamente capacitado en las técnicas de RT-PCR en tiempo real y procedimientos de diagnóstico in vitro. El Smart DetectTM SARS-CoV rRT-PCR Kit solo se debe utilizar con la autorización de uso de emergencia (EUA) de la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA).

RESUMEN Y EXPLICACIÓN

El Smart DetectTM SARS-CoV-2 rRT-PCR Kit es un ensayo de diagnóstico molecular in vitro que ayuda en la detección y diagnóstico de la COVID-19. El ensayo se basa en una tecnología de reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa en tiempo real (rRT-PCR) ampliamente utilizada, que emplea cebadores y sondas de oligonucleótidos marcados con colorantes indicadores fluorescentes y extintores. Primero, se extrae el ARN vírico de las muestras de los pacientes y luego, en el proceso de rRT-PCR de un solo paso, el ARN se convierte en ADNc. A continuación, las sondas se combinan con secuencias diana específicas en el ADNc ubicado entre los cebadores directo e inverso. Durante la fase de extensión del ciclo de PCR, la actividad nucleasa 5' de la ADN polimerasa degrada las sondas, lo que hace que el colorante indicador se separe del colorante extintor y se genere una señal fluorescente. Con cada ciclo, las moléculas de colorante indicador adicionales se escinden de sus sondas, lo que aumenta la intensidad de la fluorescencia. El Smart DetectTM SARS-CoV-2 rRT-PCR Kit utiliza cuatro juegos de cebadores y sondas. Se asignan diferentes colorantes indicadores fluorescentes y canales de detección a cada conjunto de cebadores y sondas. La intensidad de la fluorescencia se controla en cada ciclo de PCR mediante el instrumento 7500 Fast Dx Real-Time PCR (Applied Biosystems) con el software Sequence Detection System (SDS), versión 1.4, (Applied Biosystems) o el sistema de detección de PCR en tiempo real CFX96 Touch (Bio-Rad) con el CFX Maestro Software (Bio-Rad). Para determinar los resultados, se utiliza el ciclo de PCR en el que la intensidad de la fluorescencia supera un valor umbral definido.

PRINCIPIOS DE LA PRUEBA

El Smart DetectTM SARS-CoV-2 rRT-PCR Kit es un ensayo de reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa en tiempo real (rRT-PCR) diseñado para detectar cualitativamente el ARN del SARS-CoV-2 en muestras de las vías respiratorias de personas con signos y síntomas de infección sospechosos de COVID-19[1]. Smart DetectTM SARS-CoV-2 rRT-PCR se puede utilizar con muestras de las vías respiratorias superiores, como muestras obtenidas mediante hisopado nasofaríngeo, hisopado nasal anterior e hisopado del cornete nasal medio. Esta prueba es un ensayo de rRT-PCR múltiple en un solo paso y un solo pocillo para detectar tres dianas del ARN del SARS-CoV-2: el gen de la envoltura (E), el gen de la nucleocápside (N) y una región del marco abierto de lectura (ORF1b) del gen de la ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRp) de la cepa vírica aislada Wuhan-Hu-1 del SARS-CoV-2 (GenBank MN908947). El kit incluye un control de extracción (EC), y cebadores y sondas diseñados para detectar ribonucleasa P (RNasa P), un gen de mantenimiento humano, en el control de extracción y otras muestras clínicas extraídas. Otros materiales de control que se suministran en el kit incluyen un control positivo (PC) que consta de una secuencia de ARN con las tres secuencias diana del SARS-CoV-2 y un control (negativo) sin templado (NTC) que consta de agua sin nucleasas. El Smart DetectTM SARS-CoV-2 rRT-PCR


Kit se debe utilizar con el instrumento 7500 Fast Dx Real-Time PCR (Applied Biosystems) o el sistema de detección de PCR en tiempo real CFX96 Touch (Bio-Rad).

MATERIALES PROPORCIONADOS

El Smart DetectTM SARS-CoV-2 rRT-PCR Kit contiene los siguientes componentes, que son suficientes para realizar hasta 48 reacciones de rRT-PCR.

1. Control positivo (PC) (2 x 200 µL): ARN del SARS-CoV-2 transcrito in vitro en agua sin nucleasas. Almacenar a -20 °C o menos.

2. Control sin templado (NTC) (1 x 1 mL): agua sin nucleasas. Almacenar a -20 °C o menos.

3. Control de extracción (EC) (2 x 1.2 ml): células HEK293 cultivadas en amortiguador DPBS. Almacenar a -20 °C o menos. Suficiente material para realizar 16 extracciones.

4. Mezcla de cebadores y sondas (100 µM): vial que contiene todos los cebadores y sondas en agua sin nucleasas (concentración del material de trabajo 100 µM). Almacenar a -20 °C o menos en la oscuridad. Material suficiente para realizar 48 reacciones.

Nota: Se pueden obtener copias adicionales de este prospecto del Kit Smart DetectTM SARS-CoV-2 rRT-PCR en línea en www.bit.ly/smartdetectpcrkitsp. Las copias en papel están disponibles por pedido en [email protected].

MATERIALES REQUERIDOS, PERO NO PROPORCIONADOS

Kit de extracción de ARN

Artículo Proveedor, n.º de catálogo

QIAamp Viral RNA Mini Kit QIAGEN, 52904 o 52906

Mezcla maestra para rRT-PCR

Artículo Proveedor, n.º de catálogo

Opción 1

Componente A de la mezcla maestra InBios, 500763

Componente B de la mezcla maestra InBios, 201012

Componente C de la mezcla maestra InBios, 201013

Componente A de la mezcla maestra InBios, 500763

Opción 2 Mezcla para sonda con reacción en un paso Luna® (sin ROX) (2X)

New England BioLabs, E3007E Mezcla para enzimas RT Luna® WarmStart® (20X)

Opción 3 Mezcla maestra TaqPath™ 1-Step RT-qPCR, CG Life Technologies, A15299 o A15300

http://www.bit.ly/smartdetectpcrkit


EQUIPO Y CONSUMIBLES REQUERIDOS, PERO NO PROVISTOS

Agitadora vorticial

Microcentrífuga (con rotor para tubos de 1.5-2 ml)

Centrífuga de laboratorio (con rotor y adaptador para placas de 96 pocillos)

Tubos de microcentrífuga sin DNasa/RNasa (1.5-2 ml)

Pipetas calibradas sin DNasa/RNasa de diferentes tamaños (2 o 10 µL, 200 µL, 1000 µL)

Puntas de pipeta con barrera para aerosoles sin DNasa/RNasa de diferentes tamaños

Bloques fríos o hielo

Agua sin nucleasas

Etanol (96-100 %)

Etanol (70 %)

Cloro al 10 %

Soluciones de degradación de ADN para PCR DNAZapTM (Ambion, n.º de catálogo AM9890) o equivalente

Reactivo de descontaminación RNase AWAYTM (Invitrogen, n.º de catálogo 10328011) o equivalente

Guantes desechables sin talco

Y

Instrumento 7500 Fast Dx Real-Time PCR (Applied Biosystems)

Software Sequence Detection System (SDS), versión 1.4 (Applied Biosystems)

Placa de reacción óptica de 96 pocillos con código de barras MicroAmp™, 0.1 ml (Applied Biosystems, n.º de catálogo 4346906 o 4366932)*

Película adhesiva óptica MicroAmp™ (Applied Biosystems, n.º de catálogo 4360954 o 4311971)*

Tiras de 8 tubos de reacción rápida MicroAmp™, 0.1 ml (Applied Biosystems, n.º de catálogo 4358293)*

Tiras de 8 tapas ópticas MicroAmp™ (Applied Biosystems, n.º de catálogo 4323032)*


O

Sistema de detección de PCR en tiempo real CFX96 Touch (Bio-Rad)

CFX Maestro Software (Bio-Rad)

Placas de PCR de 96 pocillos Hard-Shell®, perfil bajo, pared delgada, con faldón (Bio-Rad, n.º de catálogo HSP9601, HSP9611, HSP9621, HSP9631 o HSP9641)*

Sellos adhesivos Microseal® 'B' (Bio-Rad, n.º de catálogo MSB1001)*

Tiras de 8 tubos de PCR de 0.2 ml sin tapa, perfil bajo, transparentes (Bio-Rad, n.º de catálogo TLS0801)*

Tiras de 8 tapas para tubos planos de PCR de 0.2 ml, ópticas, ultratransparentes (Bio-Rad, n.º de catálogo TCS0803)*

* Se pueden utilizar tiras de 8 tubos de PCR o placas de PCR de 96 pocillos.


ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES

• Para uso en diagnóstico in vitro (IVD) con autorización de uso de emergencia (EUA) solamente.

• Los resultados positivos son indicativos de la presencia de ARN del SARS-CoV-2.

• Los laboratorios dentro de Estados Unidos y sus territorios deben informar todos los resultados positivos a las autoridades de salud pública correspondientes.

• Siga las precauciones estándares. Todas las muestras de pacientes y controles positivos deben considerarse potencialmente infecciosos y manejarse de acuerdo con un buen procedimiento de laboratorio.

• Para uso exclusivo de personal capacitado en las técnicas de rRT-PCR y procedimientos de diagnóstico in vitro. Para utilizar de manera correcta este producto, se debe tener una comprensión cabal de las instrucciones de uso. Solo se obtendrán resultados confiables utilizando técnicas de laboratorio precisas y siguiendo con precisión estas instrucciones de uso.

• El procesamiento de las muestras se debe realizar de acuerdo con las normas nacionales de seguridad biológica.

• Si se sospecha infección con COVID-19, las muestras se deben obtener con las precauciones de control de infección apropiadas.

• Para uso exclusivo en laboratorios específicos por personal de laboratorio clínico capacitado en el instrumento para rRT-PCR autorizado.

Precauciones de seguridad

• Maneje todas las muestras como si fueran infecciosas utilizando procedimientos de laboratorio seguros. Deben realizarse evaluaciones de riesgo específicas del sitio y de la actividad para determinar si se justifica tomar precauciones mejoradas de bioseguridad en función de las necesidades situacionales. Consulte las siguientes pautas de los CDC: Interim Guidelines for Collecting, Handling, and Testing Clinical Specimens from Persons Under Investigation for Coronavirus Disease 2019 (Pautas provisionales para obtener, manejar y analizar muestras clínicas de personas en investigación a causa de la enfermedad por coronavirus del 2019) (https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-nCoV/lab/guidelines-clinical-specimens.html).

• No coma, beba, fume, se aplique cosméticos ni manipule lentes de contacto donde se manipulan reactivos o muestras humanas.

• No pipetear absorbiendo con la boca. • Las hojas de datos de seguridad están

disponibles a pedido. • La manipulación de muestras potencialmente

infectadas debe realizarse en un BSC clase II certificado en una instalación BSL-2 o superior. Esto incluye dividir o diluir muestras, y realizar

procedimientos de extracción de ácido nucleico de muestras potencialmente infectadas.

• Use equipo de protección personal adecuado, incluidos, entre otros, guantes desechables, bata de laboratorio y protección para los ojos al manipular muestras, reactivos, pipetas y otros equipos.

Precauciones técnicas

• Use solo los reactivos descritos en las instrucciones de uso. No utilice reactivos de otros fabricantes.

• No utilice reactivos caducados. • Evite la contaminación de muestras clínicas o

reactivos con productos de PCR previamente amplificados. El flujo de trabajo del ensayo debe incluir áreas de trabajo separadas para la preparación de muestras, la configuración de la reacción y la amplificación/detección. Use guantes desechables y cámbielos antes de ingresar a un área de trabajo separada.

• Tenga suministros y equipos dedicados para cada una de las áreas de trabajo separadas.

• Use una bata de laboratorio limpia y guantes desechables limpios para la preparación de la reacción.

• Cambie los guantes entre muestras y siempre que se sospeche contaminación.

• Siempre utilice puntas de pipetas con barrera para aerosoles sin DNasa/RNasa. Use una punta de pipeta nueva con barrera para aerosoles sin DNasa/RNasa para cada transferencia de reactivo o muestra.

• Evite la contaminación de las muestras con DNasa/RNasa. Descontamine las superficies de trabajo, las pipetas y las centrífugas con cloro al 10 %, soluciones de degradación de ADN para PCR DNAZapTM o un reactivo de descontaminación RNase AWAYTM. Elimine el cloro residual con etanol al 70 %.

• Evite la contaminación manteniendo los reactivos y los tubos de reacción tapados o cubiertos tanto como sea posible.

• No abra las placas de PCR ni los tubos de PCR sellados después de la amplificación para evitar la contaminación con productos de PCR amplificados.

• Mantenga el ARN extraído en un bloque frío o en hielo durante la preparación de la reacción.

OBTENCIÓN, MANIPULACIÓN, ALMACENAMIENTO DE MUESTRAS

• Si desea información sobre la obtención de muestras, consulte el documento del CLSI MM13-A Collection, Transport, Preparation, and Storage of Specimens for Molecular Methods (MM13-A Obtención, transporte, preparación y almacenamiento de muestras para métodos moleculares), primera edición.

• Si desea información sobre la obtención de muestras para la COVID-19, consulte las siguientes pautas de los CDC: Interim Guidelines for Collecting, Handling, and Testing Clinical


Specimens from Persons Under Investigation for Coronavirus Disease 2019 (Pautas provisionales para obtener, manejar y analizar muestras clínicas de personas en investigación a causa de la enfermedad por coronavirus del 2019). (https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-nCoV/lab/guidelines-clinical-specimens.html).

• Las muestras clínicas se pueden almacenar a una temperatura de 2 ºC a 8 °C hasta 72 horas después de la obtención.

• Si se espera un retraso en la extracción de ARN, almacene las muestras a -70 °C o menos.

PROCEDIMIENTO DE PRUEBA

Preparación del control positivo (PC)

1. Almacene los tubos de control positivo (PC) no utilizados provistos en el kit a -20 °C o menos. Evite los ciclos de congelación y descongelación.

2. Antes de usar, descongele un solo tubo de PC. Mezcle suavemente con una agitadora vorticial a baja velocidad durante 30 segundos y después centrifugue a 750 g durante 10 segundos.

3. Realice preparados de un solo uso vertiendo 25 μl de control positivo en 8 tubos de microcentrífuga sin DNasa/RNasa.

4. Guarde una preparación de un solo uso en un bloque frío o hielo hasta que se la agregue a la reacción de PCR. Después de la adición a la reacción de PCR, deseche el sobrante.

5. Guarde los 7 tubos preparados para un solo uso restantes a -20 °C o menos hasta su uso. Evite los ciclos de congelación y descongelación.

6. Si se utilizan los 7 tubos preparados para un solo uso, repita los pasos 2 a 5 con un tubo de control positivo no utilizado.

Preparación del control de extracción (EC)

1. Almacene los tubos de EC no utilizados provistos en el kit a -20 °C o menos. Evite los ciclos de congelación y descongelación.

2. Antes de usar, descongele un solo tubo de EC. Mezcle suavemente con una agitadora vorticial a baja velocidad durante 30 segundos y después centrifugue a 750 g durante 10 segundos.

3. Realice preparados de un solo uso vertiendo 150 μl de EC en 8 tubos de microcentrífuga sin DNasa/RNasa. 4. Guarde una preparación de un solo uso en un bloque frío o hielo hasta la extracción de ARN. Después de la

extracción de ARN, deseche el sobrante. 5. Guarde los 7 tubos preparados para un solo uso restantes a -20 °C o menos hasta su uso. Evite los ciclos de

congelación y descongelación. 6. Si se utilizan los 7 tubos preparados para un solo uso, repita los pasos 2 a 5 con un tubo de EC no utilizado.

Preparación del control sin templado (NTC)

1. Descongele el tubo de control sin templado (agua sin nucleasas) antes de usarlo. 2. Divídalo en pequeños volúmenes. Nota: Se recomienda realizar preparados de un solo uso vertiendo 25 μl del

control sin templado en tubos de microcentrífuga sin DNasa/RNasa. 3. Guarde los tubos preparados para un solo uso de NTC a -20 °C o menos hasta su uso.

Procedimiento de extracción de ARN

El Smart DetectTM SARS-CoV-2 rRT-PCR Kit solo se debe usar con ARN extraído mediante el QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN, n.º de catálogo 52904 o 52906). Otros kits de extracción de ARN no han sido calificados ni validados.

En cada lote de extracciones de muestras, se debe realizar una extracción de EC para utilizarla como control de extracción.

Para cada lote de extracción:

1. Deje que las muestras tomen temperatura ambiente (de 15 °C a 25 °C). 2. Deje que un preparado de un solo uso del EC tome temperatura ambiente (de 15 °C a 25 °C). 3. Nota: No filtre ni centrifugue las muestras clínicas antes de la extracción de ARN. No filtre el EC antes de la

extracción de ARN. 4. Realice la extracción de ARN de las muestras y el EC siguiendo las instrucciones de uso del fabricante

(QIAGEN). El volumen inicial recomendado de las muestras y el EC es 140 µL. El volumen de elución recomendado de las muestras y el EC es 60 µL.

5. Mantenga las muestras extraídas y el EC en un bloque frío o hielo hasta su adición a la reacción de PCR. 6. Después de agregar las muestras extraídas a la reacción de PCR, almacénelas de acuerdo con las

instrucciones del fabricante para el ARN vírico (Qiagen).

Opción 1 u Opción 2 de mezcla maestra para rRT-PCR: Preparación de la mezcla de reacción


1. Descongele los componentes A, B y C de la mezcla maestra o el componente A de la mezcla maestra, la mezcla Luna® para sonda con reacción en un paso (sin ROX) (2X), y la mezcla Luna® WarmStart® para enzimas RT (20X) a temperatura ambiente, y luego coloque en hielo. Después de descongelar, mezcle levemente cada componente, ya sea por inversión, con pipeta o con una leve agitación vorticial.

2. Descongele la mezcla de cebadores y sondas (100 μM) que está en un bloque frío o hielo. Agite brevemente la mezcla de cebadores y sondas con una agitadora vorticial; luego centrifugue para que el contenido se asiente en el fondo del tubo.

3. Calcule el volumen total requerido de cada componente de reacción multiplicando el volumen por reacción que se muestra en la tabla 1 por el número total de reacciones. Nota: Incluya al menos un 10 % de exceso de volumen de cada componente para compensar la pérdida de volumen durante el pipeteo.

Tabla 1. Volumen de cada componente por reacción Componente Volumen por reacción Componente A de la mezcla maestra 1 μL Componente B de la mezcla maestra o mezcla para sonda con reacción en un paso Luna® (sin ROX) (2X) 10 μL

Componente C de la mezcla maestra o mezcla para enzimas RT Luna® WarmStart® (20X) 1 μL

Mezcla de cebadores y sondas (100 μM) 1 μL Agua sin nucleasas 2 μL Volumen total por reacción 15 μl

4. Combine el volumen requerido de cada componente de reacción en un tubo de microcentrífuga sin DNasa/RNasa para crear la mezcla de reacción.

5. Comience a preparar la placa.

Opción 1 u Opción 2 de mezcla maestra para rRT-PCR: Preparación de la placa

Mantenga la placa de PCR de 96 pocillos o las tiras de 8 tubos de PCR cubiertas tanto como sea posible durante la adición de la mezcla de reacción, los controles y los muestreos. Cambie los guantes con frecuencia y cuando sea necesario para evitar la contaminación.

Mezcla de reacción y NTC 1. Mezcle bien la mezcla de reacción con un cuidadoso pipeteo una suave agitación vorticial. Centrifugue

brevemente para que el contenido se asiente en el fondo del tubo. 2. Agregue 15 μl de la mezcla de reacción a la cantidad apropiada de pocillos. El pipeteo debe ser uniforme y

preciso, y las burbujas deben mantenerse al mínimo. 3. Agregue 5 μl del NTC en el pocillo de NTC. Cada ciclo de PCR debe incluir un control sin templado. 4. Cubra la placa de PCR de 96 pocillos o las tiras de 8 tubos de PCR, y vaya al área de manejo de ácido nucleico

de las muestras para continuar con la preparación de la placa. Muestras, EC y PC

1. Mezcle las muestras, el EC y el PC invirtiéndolos o agitándolos suavemente de 3 a 5 veces; luego centrifugue brevemente para que el contenido se asiente en el fondo del tubo.

2. Agregue 5 μl de cada muestra y EC en los pocillos de PCR apropiados. La figura 1 muestra un ejemplo de un esquema de una placa de PCR de 96 pocillos. La figura 2 muestra un ejemplo de un esquema de una tira de 8 tubos de PCR.

3. Por último, agregue 5 μl del PC en el pocillo de PC. Cada ciclo de PCR debe incluir un PC. 4. Si usa una placa de PCR de 96 pocillos, cubra y selle la placa con una película adhesiva óptica. Centrifugue

levemente la placa a 1000 x g durante 1 minuto para que el contenido que se asiente en el fondo de los pocillos y para eliminar las burbujas de aire.

5. Si usa una tira de 8 tubos de PCR, tape las tiras con una tira de 8 tapas ópticas. Etiquete las pestañas en el extremo de la tira para indicar la posición de la muestra. Nota: No etiquete la parte superior de los tubos de reacción. Centrifugue la tira a 1000 x g durante 1 minuto para que el contenido se asiente en el fondo de los pocillos y para eliminar las burbujas de aire.

6. Mantenga la placa de PCR de 96 pocillos o las tiras de 8 tubos de PCR en la oscuridad hasta el momento de cargarlas en el instrumento de PCR.

Opción 3 de mezcla maestra para rRT-PCR: Preparación de la mezcla

1. Descongele la mezcla maestra TaqPathTM 1-Step RT-qPCR que está en un bloque frío o hielo. Mezcle brevemente la mezcla maestra TaqPathTM 1-Step RT-qPCR con una agitadora vorticial; luego centrifugue para que el contenido se asiente en el fondo del tubo.

2. Descongele la mezcla de cebadores y sondas (100 μM) que está en un bloque frío o hielo. Agite brevemente la mezcla de cebadores y sondas con una agitadora vorticial; luego centrifugue para que el contenido se asiente en el fondo del tubo.


3. Calcule el volumen total requerido de cada componente de reacción al multiplicar el volumen por reacción que se muestra en la Tabla 2 por el número total de reacciones. Nota: Incluya al menos un 10 % de exceso de volumen de cada componente para compensar la pérdida de volumen durante el pipeteo.

Tabla 2. Volumen de cada componente por reacción Componente Volumen por reacción TaqPathTM 1-Step RT-qPCR Master Mix, 4X 5 μl Agua sin nucleasas 9 μl Mezcla de cebadores y sondas (100 μM) 1 μl Volumen total por reacción 15 μl

4. Combine el volumen requerido de cada componente de reacción en un tubo de microcentrífuga sin DNasa/RNasa para crear la mezcla de reacción.

5. Mantenga el tubo de microcentrífuga que contiene la mezcla de reacción en un bloque frío o hielo, y proceda a la preparación de la placa.

Opción 3 de mezcla maestra para rRT-PCR: Preparación de la placa

Mantenga la placa de PCR de 96 pocillos o las tiras de 8 tubos de PCR en un bloque frío o hielo durante la preparación de la placa. Mantenga la placa cubierta tanto como sea posible durante la adición de la mezcla de reacción, los controles y las muestras. Cambie los guantes con frecuencia y cuando sea necesario para evitar la contaminación.

Mezcla de reacción y NTC 1. Agite la mezcla de reacción suavemente con una agitadora vorticial a baja velocidad durante 30 segundos. 2. Agregue 15 μl de la mezcla de reacción a la cantidad apropiada de pocillos. El pipeteo debe ser uniforme y

preciso, y las burbujas deben mantenerse al mínimo. 3. Agregue 5 μl del NTC en el pocillo de NTC. Se debe incluir un NTC en cada placa de PCR de 96 pocillos o en

cada conjunto de tiras de 8 tubos de PCR. 4. Cubra la placa de PCR de 96 pocillos o las tiras de 8 tubos de PCR, y vaya al área de manejo de ácido nucleico

de las muestras para continuar con la preparación de la placa. Muestras, EC y PC

1. Mezcle las muestras, el EC y el PC invirtiéndolos o agitándolos suavemente de 3 a 5 veces; luego centrifugue brevemente para que el contenido se asiente en el fondo del tubo.

2. Agregue 5 μl de cada muestra y EC en los pocillos de PCR apropiados. La figura 1 muestra un ejemplo de un esquema de una placa de PCR de 96 pocillos. La figura 2 muestra un ejemplo de un esquema de una tira de 8 tubos de PCR.

3. Por último, agregue 5 μl del PC en el pocillo de PC. Se debe incluir un PC en cada placa de PCR de 96 pocillos o en cada conjunto de tiras de 8 tubos de PCR.

4. Si usa una placa de PCR de 96 pocillos, cubra y selle la placa con una película adhesiva óptica. Agite la placa con una agitadora vorticial o inviértala de 3 a 5 veces para mezclar el contenido de los pocillos, y luego centrifugue a 150 g durante 1 minuto para que el contenido se asiente en el fondo de los pocillos y para eliminar las burbujas de aire.

5. Si usa una tira de 8 tubos de PCR, tape las tiras con una tira de 8 tapas ópticas. Etiquete las pestañas en el extremo de la tira para indicar la posición de la muestra. Nota: No etiquete la parte superior de los tubos de reacción. Agite la tira con una agitadora vorticial o invirtiéndola de 3 a 5 veces para mezclar el contenido de los pocillos, y luego centrifugue a 150 g durante 1 minuto para que el contenido se asiente en el fondo de los pocillos y para eliminar las burbujas de aire.

6. Mantenga la placa de PCR de 96 pocillos o las tiras de 8 tubos de PCR en un bloque frío o hielo y en la oscuridad hasta el momento de cargarlas en el instrumento de PCR.


Figura 1

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A NTC EC S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10

B S11 S12 S13 S14 S15 S16 S17 S18 S19 S20 S21 S22

C S23 S24 S25 S26 S27 S28 S29 S30 S31 S32 S33 S34

D S35 S36 S37 S38 S39 S40 S41 S42 S43 S44 S45 PC

E

F

G

H

Figura 1. Ejemplo de esquema de una placa de PCR de 96 pocillos para la colocación de 45 muestras, 1 EC, 1 PC y 1 NTC. S1, muestra 1; EC, control de extracción; PC, control positivo; NTC, control sin templado

Figura 2

1 2 3 4 5 6 7 8

NTC EC S1 S2 S3 S4 S5 PC

Figura 2. Ejemplo de esquema de una tira de 8 tubos de PCR para la colocación de 5 muestras, 1 EC, 1 PC y 1 NTC. S1, muestra 1; EC, control de extracción; PC, control positivo; NTC, control sin templado

Programación del instrumento 7500 Fast Dx Real-time PCR

1. Encienda el instrumento 7500 Fast Dx Real-time PCR. 2. Inicie el software SDS, versión 1.4. 3. Después de que aparezca una nueva ventana, seleccione “Create New Document” (Crear nuevo documento)

en el menú. 4. Se abrirá la pantalla “New Document Wizard” (Asistente de nuevo documento). Seleccione los siguientes

parámetros: a. Assay: Standard Curve (Ensayo: curva estándar) (cuantificación absoluta) b. Container: 96-well Clear (Contenedor: 96 pocillos, transparente) c. Template: Blank Document (Plantilla: documento en blanco) d. Run Mode: Standard 7500 (Modo de ejecución: estándar 7500) e. Operator: [Nombre del operador] f. Comments: [Comentarios del operador] g. Plate name: [Nombre de la placa]

5. Después de seleccionar los parámetros y asignar un nombre a la placa, haga clic en “Next” (Siguiente). 6. Se abrirá la pantalla “Select Detectors” (Seleccionar detectores). 7. Los cuatro detectores fluorescentes (dianas del ensayo) se deben ingresar individualmente. 8. Haga clic en el botón “New Detector” (Nuevo detector). 9. Se abrirá la ventana “New Detector” (Nuevo detector). 10. Cree el detector N de la siguiente manera:

a. Name: N (Nombre: N) b. Description (Descripción): [Descripción opcional (por ej., Diana N del SARS-CoV-2)] c. Reporter Dye: Cy5 (Colorante indicador: Cy5)

Nota: Los colorantes que aparecen en la lista de colorantes indicadores son aquellos que se ingresaron previamente con el Dye Manager (Administrador de colorantes). Si un colorante no aparece en la lista, use el Dye Manager (Administrador de colorantes) para agregarlo y luego regrese a este paso en este procedimiento. Para obtener más información, consulte el soporte técnico o la ayuda en línea del instrumento 7500 Fast Dx Real-Time PCR de Applied Biosystems.

d. Quencher: (none) (Extintor: [ninguno]) e. Color (Color): seleccione un color único para el detector de la siguiente manera:

i. Haga clic en el rectángulo de color para ver las opciones de color.


ii. Seleccione un color haciendo clic en uno de los rectángulos de color. iii. Haga clic en “Ok” (Aceptar) para volver a la ventana “New Detector” (Nuevo detector).

f. Haga clic en “Ok” (Aceptar) en la ventana “New Detector” (Nuevo detector) para volver a la pantalla “Select Detectors” (Seleccionar detectores).

11. Repita los pasos 8 a 10 por cada detector (diana del ensayo). El nombre del detector, el colorante indicador y el extintor para cada diana del ensayo se muestran en la Tabla 3.

Tabla 3. Lista de detectores del instrumento 7500 Fast Dx Real-Time PCR Nombre del detector Colorante indicador Colorante extintor N Cy5 (none) (ninguno) E Texas Red (Rojo Texas) (none) (ninguno) ORF1b FAM (none) (ninguno) RNase P (RNasa P) VIC (none) (ninguno)

12. Después de ingresar los cuatro detectores, los campos “Detector Name” (Nombre del detector), “Description”

(Descripción), “Reporter” (Indicador) y “Quencher” (Extintor) aparecerán en la pantalla “Select Detectors” (Seleccionar detectores) en el lado izquierdo de la pantalla.

13. Los cuatro detectores deben agregarse a los “Detectors in Document” (Detectores en el documento) en el lado derecho de la pantalla haciendo clic en “Add >>” (Agregar >>). Después de agregar los cuatro detectores al documento, el nombre de cada detector debe aparecer en el lado derecho de la pantalla.

14. Una vez que se hayan agregado todos los detectores al documento, seleccione “(none)” (ninguno) para el colorante de referencia pasiva en el menú desplegable en la parte superior derecha de la pantalla “Select Detectors” (Seleccionar detectores).

15. Haga clic en “Next” (Siguiente) en la parte inferior de la ventana “Select Detectors” (Seleccionar detectores) para pasar a la ventana “Set Up Sample Plate” (Preparación de la placa de muestras).

16. En la ventana “Set Up Sample Plate” (Preparación de la placa de muestras), los cuatro detectores se asignarán a cada pocillo que se analizará en el ensayo.

17. Seleccione todos los pocillos que se analizarán en el ensayo arrastrando el cursor a través de los pocillos apropiados en el mapa de la placa en la mitad inferior de la pantalla.

18. En la mitad superior de la pantalla, seleccione los cuatro detectores colocando una marca de verificación en la columna “Use” (Usar). Un icono de color con una “U” que representa cada detector llenará los pocillos.

19. Seleccione “Finish” (Finalizar) después de que se hayan asignado los cuatro detectores a todos los pocillos. 20. Después de hacer clic en “Finish” (Finalizar), se iniciará el instrumento 7500 Fast Dx Real-Time PCR.

Después del inicio, se escuchará un clic. Nota: El instrumento debe estar encendido para iniciarse. 21. Después del inicio, se abrirá la pestaña “Plate” (Placa). 22. Cada pocillo de la placa que se analizará debe llenarse con un ícono de color con una “U” correspondiente a

los detectores seleccionados. Para verificar las asignaciones de los detectores, seleccione “Tools” (Herramientas) en el menú “File” (Archivo) y luego seleccione “Detection Manager” (Administrador de detección).

23. Se abrirá la ventana “Detection Manager” (Administrador de detección). Asegúrese de que cada detector figure con el indicador, extintor y color apropiados seleccionados.

24. Si están todos los detectores, seleccione “Done” (Listo). 25. Después de crear y asignar detectores, seleccione la pestaña “Instrument” (Instrumento). 26. Si utiliza la Opción 1 o la Opción 2 de mezcla maestra para rRT-PCR, programe las condiciones del ciclo

térmico como se muestra en la Tabla 4 y siga los pasos 27 a 31 para completar la programación del instrumento.

27. En “Settings” (Configuración), ingrese 20 μl para “Sample Volume” (Volumen de muestra). 28. En “Settings” (Configuración), seleccione “Standard 7500” (Estándar 7500) para “Run Mode” (Modo de

ejecución). 29. En “Data Collection” (Recopilación de datos), seleccione Stage 3 (Etapa 3), Step 2 (Paso 2) (60 °C durante

0:60). 30. Después de programar las condiciones y los ajustes del ciclo térmico en la pestaña “Instrument” (Instrumento),

se puede guardar el archivo de plantilla. Para guardar el archivo de plantilla, seleccione “File” (Archivo) en el menú y luego seleccione “Save As” (Guardar como).

31. Guarde el archivo de plantilla (.sdt) con el nombre de archivo deseado (por ej., Smart Detect SARS-CoV-2.sdt) en la ubicación de archivo deseada.

Tabla 4. Condiciones del ciclo térmico para el instrumento 7500 Fast Dx Real-Time PCR utilizando la Opción 1 o la Opción 2 de mezcla maestra para rRT-PCR Etapa Step (Paso) Número de ciclos Temperatura Hora


1 Transcripción inversa 1 55 °C 10 minutos 2 Desnaturalización inicial 1 95 °C 1 minuto 3 (Paso 1) Desnaturalización

45 95 °C 10 segundos

3 (Paso 2) Extensión 60 °C 60 segundos

32. Si utiliza la Opción 3 de mezcla maestra para rRT-PCR, programe las condiciones del ciclo térmico como se muestra en la Tabla 5 y siga los pasos 33 a 37 para completar la programación del instrumento.

33. En “Settings” (Configuración), ingrese 20 μl para “Sample Volume” (Volumen de muestra). 34. En “Settings” (Configuración), seleccione “Standard 7500” (Estándar 7500) para “Run Mode” (Modo de

ejecución). 35. En “Data Collection” (Recopilación de datos), seleccione la etapa 4 (paso 2) (58 °C durante 0:30). 36. Después de programar las condiciones y los ajustes del ciclo térmico en la pestaña “Instrument” (Instrumento),

se puede guardar el archivo de plantilla. Para guardar el archivo de plantilla, seleccione “File” (Archivo) en el menú y luego seleccione “Save As” (Guardar como).

37. Guarde el archivo de plantilla (.sdt) con el nombre de archivo deseado (por ej., Smart Detect SARS-CoV-2.sdt) en la ubicación de archivo deseada.

Tabla 5. Condiciones del ciclo térmico para el instrumento 7500 Fast Dx Real-Time PCR utilizando la Opción 3 de mezcla maestra para rRT-PCR

Etapa Step (Paso) Número de ciclos Temperatura Hora 1 Incubación de UNG 1 25 °C 2 minutos 2 Incubación de RT 1 50 °C 15 minutos 3 Activación enzimática 1 95 °C 2 minutos 4 (paso 1) Amplificación 45 95 °C 3 segundos 4 (paso 2) 58 °C 30 segundos

Puesta en marcha del instrumento 7500 Fast Dx Real-Time PCR

1. Encienda el instrumento 7500 Fast Dx Real-time PCR. 2. Inicie el software SDS, versión 1.4. 3. Después de que aparezca la nueva ventana, seleccione “Open Existing Document” (Abrir documento existente)

en el menú. 4. Navegue a la ubicación donde se guardó el archivo de plantilla creado en la sección anterior (por ej., Smart

Detect SARS-CoV-2.sdt). 5. Haga doble clic en el archivo de plantilla para abrirlo. 6. Esta acción iniciará el instrumento 7500 Fast Dx Real-Time PCR. 7. Después del inicio, aparecerá el mapa de la placa. 8. Haga clic en el ícono “Well Inspector” (Inspector de pocillos) en los menús superiores. 9. Escriba los identificadores de la muestra para cada pocillo (Id. de muestra, EC, PC, NTC) en el cuadro “Sample

Name” (Nombre de muestra) en la ventana “Well Inspector” (Inspector de pocillos). 10. Una vez que se hayan agregado todos los identificadores de las muestras y controles, haga clic en el botón

“Close” (Cerrar) en la ventana “Well Inspector” (Inspector de pocillos) y regrese al mapa de la placa. 11. Haga clic en la pestaña “Instrument” (Instrumento) en el extremo superior izquierdo. 12. Las condiciones de reacción, los volúmenes y el tipo de reacción ya estarán cargados en función del archivo

de plantilla. Asegúrese de que las configuraciones sean correctas. Para ello, consulte la sección “Programming the 7500 Fast Dx Real-Time PCR Instrument” (“Programación del instrumento 7500 Fast Dx Real-Time PCR”).

13. Antes de comenzar la ejecución, se debe guardar el archivo de ejecución (.sds). Desde el menú principal, seleccione “File” (Archivo) y luego “Save As” (Guardar como). Designe un nombre para el archivo y guárdelo en una ubicación adecuada.

14. Si utiliza una placa de PCR de 96 pocillos, cargue la placa en el soporte para placas del instrumento 7500 Fast Dx Real-Time PCR. Asegúrese de que la placa esté correctamente orientada con el pocillo A1 en la parte superior izquierda.

15. Si usa tiras de 8 tubos de PCR, cargue las tiras verticalmente. Si se usan <12 tiras, centre las tiras en el medio del soporte para placas e incluya tiras "falsas" en las columnas 1 y 12 para asegurar el sellado adecuado del bloque.

16. Una vez guardado el archivo de ejecución y cargada la placa, haga clic en el botón “Start” (Inicio).

Análisis de datos del instrumento 7500 Fast Dx Real-Time PCR

1. Una vez completada la ejecución, seleccione la pestaña “Results” (Resultados) en el extremo superior izquierdo del software.


2. Para ver los datos sin procesar, seleccione la pestaña “Amplification Plot” (Gráfica de amplificación). 3. Seleccione todas las muestras incluidas en la ejecución del ensayo. Esto se puede lograr haciendo clic en el

cuadro pequeño en el extremo superior izquierdo de cada uno de los pocillos de muestras. Las curvas de amplificación deben aparecer en el gráfico.

4. En el extremo superior derecho de la pantalla en el menú desplegable “Data” (Datos), seleccione la vista “Delta Rn vs. Cycle” (Delta Rn frente a ciclo).

5. La configuración de análisis para cada detector se debe seleccionar individualmente. 6. Seleccione “N” en el menú desplegable “Detector” (Detector). 7. En “Analysis Settings” (Configuración de análisis), seleccione “Manual Ct” (Ct manual) y “Manual Baseline”

(Línea de referencia manual) haciendo clic en los botones de opción.Configure la línea de referencia manual de la siguiente manera: Start (cycle): 5 (Inicio [ciclo]: 5); End (cycle): 15 (Fin [ciclo]: 15).

8. El umbral se debe establecer manualmente arrastrando la línea roja del umbral en el gráfico. El umbral se debe ajustar para que esté dentro de la fase exponencial de las curvas de fluorescencia y por encima de cualquier señal de fondo. El procedimiento para establecer el umbral debe usarse de manera uniforme. Nota: Para obtener ayuda, consulte la sección “Troubleshooting” (Solución de problemas).

9. Haga clic en el botón “Analyze” (Analizar). La línea de umbral roja se volverá verde después del análisis. 10. Repita los pasos 6 a 9 por cada detector (diana del ensayo). 11. Guarde el archivo de análisis seleccionando “File” (Archivo) y luego “Save As” (Guardar como). Designe un

nombre para el archivo y guárdelo en una ubicación adecuada. 12. Seleccione la pestaña “Report” (Informe) para mostrar los valores del umbral del ciclo (Ct). 13. Inspeccione manualmente las curvas de amplificación de todas las muestras con un valor de Ct para verificar

la amplificación positiva. 14. Para obtener información sobre cómo interpretar los valores del Ct, consulte la sección “Interpretation of

Results” (Interpretación de los resultados).

Programación del sistema de detección de PCR en tiempo real CFX96 Touch

1. Encienda el sistema de detección CFX96 Touch Real-Time PCR. 2. Abra el software CFX Maestro. El software se abre en la ventana de inicio y muestra el cuadro de diálogo

Startup Wizard (Asistente de inicio). 3. En la pestaña Run setup (Ejecutar configuración) del Startup Wizard (Asistente de inicio), seleccione el

instrumento (CFX96) en el menú desplegable y haga clic en User-defined (Definido por el usuario) como el tipo de ejecución.

4. El cuadro de diálogo Run Setup (Ejecutar configuración) se abre en la pestaña Protocol (Protocolo) y muestra el archivo de protocolo predeterminado. Haga clic en Create New (Crear nuevo) en el extremo superior izquierdo, y se abrirá el Protocol Editor (Editor de protocolos).

5. Use el Protocol Editor (Editor de protocolos) para editar el protocolo predeterminado. Nota: El panel izquierdo de la ventana Protocol Editor (Editor de protocolos) tiene los controles para editar protocolos.

6. Si utiliza las opciones 1 o 2 de mezcla maestra para rRT-PCR, programe las condiciones del ciclo térmico y el paso de lectura de la placa como se muestra en la Tabla 6, y siga los pasos 8 a 23 para completar la programación del instrumento.

Tabla 6. Condiciones del ciclo térmico y pasos de la lectura de la placa para el sistema de detección CFX96 Touch Real-Time PCR utilizando las opciones 1 o 2 de mezcla maestra para rRT-PCR

Step (Paso) Description (Descripción) Número de ciclos Temperatura Hora 1 Transcripción inversa 1 55 °C 10 minutos 2 Desnaturalización inicial 1 95 °C 1 minuto 3 Desnaturalización 1 95 °C 10 segundos 4 Extensión

+ placa leída 1 60 °C 30 segundos 5 Avance al paso 3 y repita

44 veces más 44 N/C N/C

7. Si utiliza la Opción 3 de mezcla maestra para rRT-PCR, programe las condiciones del ciclo térmico y el paso de lectura de la placa como se muestra en la Tabla 7, y siga los pasos 8 a 23 para completar la programación del instrumento.

Tabla 7. Condiciones del ciclo térmico y pasos de la lectura de la placa para el sistema de detección CFX96 Touch Real-Time PCR utilizando la Opción 3 de mezcla maestra para rRT-PCR

Step (Paso) Description (Descripción) Número de ciclos Temperatura Hora 1 Incubación de UNG 1 25 °C 2 minutos 2 Incubación de RT 1 50 °C 15 minutos 3 Activación enzimática 1 95 °C 2 minutos


4 Amplificación 1 95 °C 3 segundos 5 Amplificación

+ placa leída 1 58 °C 30 segundos 6 Avance al paso 4 y repita

44 veces más 44 N/C N/C

8. Ajuste Sample Volume (Volumen de muestra) a 20 μl. 9. Haga clic en OK (Aceptar) para guardar el protocolo y volver a la pestaña Protocol (Protocolo) en Run Setup

(Ejecutar configuración). 10. Revise los detalles del protocolo. Si es correcto, haga clic en Next (Siguiente) para pasar a la pestaña Plate

(Placa). 11. En la pestaña Plate (Placa), haga clic en Create New (Crear nueva) y se abrirá el Plate Editor (Editor de placas). 12. Use el Plate Editor (Editor de placas) para crear una nueva placa. 13. Para garantizar la correcta selección del tamaño de la placa, vaya a Settings > Plate Size (Configuración >

Tamaño de la placa) y verifique que 96-well (96 pocillos) esté seleccionado en el menú desplegable. 14. Para configurar el tipo de placa, seleccione Settings > Plate Type > BR Clear (Configuración > Tipo de placa >

BR transparente) en el menú desplegable. 15. Para configurar el modo de exploración, seleccione el modo de exploración All Channels (Todos los canales)

de la lista desplegable Scan Mode (Modo de exploración) en la barra de herramientas del Plate Editor (Editor de placas).

16. Las dianas del ensayo y los fluoróforos correspondientes para el CFX96 Touch se muestran en la Tabla 8.

Tabla 8. Dianas del ensayo y fluoróforos correspondientes para el sistema de detección CFX96 Touch Real-Time PCR

Diana del ensayo Colorante indicador N Cy5 E Tex 615 ORF1b FAM RNase P (RNasa P) HEX

17. Para seleccionar fluoróforos, haga clic en Select Fluorophores (Seleccionar fluoróforos) en el panel derecho. Seleccione los siguientes fluoróforos haciendo clic en la casilla correspondiente: • Canal 1: FAM • Canal 2: HEX • Canal 3: Tex 615 • Canal 4: Cy5 • Canal 5: ninguno seleccionado

Nota: Para cambiar el color de visualización del fluoróforo, haga clic en su cuadro color. El color representará el fluoróforo en la ventana del Plate Editor (Editor de placas) y en los cuadros de Data Analysis (Análisis de datos).

18. Haga clic en OK (Aceptar) para guardar los cambios y cierre el cuadro de diálogo Select Fluorophores (Seleccionar fluoróforos). Cuando se le solicite, especifique un nombre para el protocolo y una ubicación para guardar.

19. El panel de la placa muestra el mapa de la placa. Cargue el tipo de muestra apropiado en cada pocillo seleccionando el pocillo y el tipo de muestra apropiado (Unknown, NTC, Positive Control [Desconocido, NTC, Control positivo]) en el menú desplegable. Para cargar el tipo de muestra, se pueden seleccionar múltiples pocillos a la vez. Nota: El control de extracción (EC) se puede enumerar como una muestra desconocida.

20. En la sección Target Names (Nombres de destino) en el panel derecho, asigne los cuatro fluoróforos (FAM, HEX, Tex 615 y Cy5) a cada pocillo seleccionando la casilla de verificación Load (Cargar) para cada fluoróforo. Para cargar los fluoróforos, se pueden seleccionar todos los pocillos de una vez.

21. Designe el nombre deseado para cada pocillo escribiendo en el nombre de la muestra y presionando Intro en la lista desplegable Sample Names (Nombres de muestras) en el panel derecho.

22. Haga clic en OK (Aceptar) para guardar la placa y volver a la pestaña Plate (Placa) en Run Setup (Ejecutar configuración). Cuando se le solicite, especifique un nombre para la placa y una ubicación para guardar.

23. Revise los detalles de la placa. Si es correcto, vaya a la pestaña Start Run (Iniciar ejecución).

Ejecución del sistema de detección de PCR en tiempo real CFX96 Touch

1. En la pestaña Start Run (Iniciar ejecución), revise los detalles del protocolo y la placa en la sección Run Information (Información de ejecución).

2. Seleccione la casilla de verificación para el bloque apropiado (CFX96) en el cual realizar la ejecución. 3. Para insertar la placa o las tiras de 8 tubos en el bloque, haga clic en Open Lid (Abrir tapa).


4. Inserte la placa o las tiras de 8 tubos en el bloque. Asegúrese de que la placa de 8 tubos esté orientada correctamente.

5. Haga clic en Close Lid (Cerrar tapa). 6. Haga clic en Start Run (Iniciar ejecución) en la parte inferior derecha de la pantalla. 7. Cuando se le solicite, guarde el archivo de datos (.pcrd).

Análisis de datos del sistema de detección de PCR en tiempo real CFX96 Touch

1. Una vez completada la ejecución, abra el archivo de datos (.pcrd); para ello, vaya a Select File > Open >

Data File (Seleccionar archivo> Abrir > Archivo de datos) en la ventana de inicio y localice el archivo de datos deseado. Ajuste la siguiente configuración, como se describe a continuación.

2. Seleccione Settings > Cq Determination mode > Single Threshold (Configuración > Modo de determinación Cq > Umbral único). En el modo de umbral único, ajuste el umbral para cada fluoróforo haciendo clic en la línea de umbral en la tabla de amplificación y moviendo la línea para que se encuentre dentro de la fase exponencial de las curvas de fluorescencia y por encima de cualquier señal de fondo. El procedimiento para establecer el umbral debe usarse de manera uniforme. Nota: Para obtener ayuda, consulte la sección “Troubleshooting” (Solución de problemas).

3. Seleccione Settings > Baseline Setting > Baseline Subtracted (Configuración > Configuración de referencia > Línea de referencia restada).

4. Seleccione Settings > Analysis Mode > Analysis by fluorophore (Configuración > Modo de análisis > Análisis por fluoróforo).

5. Seleccione Settings > Cycles to Analyze (Configuración > Ciclos para analizar), y se abrirá el cuadro de diálogo Cycles to Analyze (Ciclos para analizar). Ingrese 6 para el ciclo inicial y 45 para el ciclo final, para todas las dianas, y haga clic en OK (Aceptar).

6. Los valores de Cq de cada pocillo se muestran en la pestaña Quantification Data (Datos de cuantificación). 7. Inspeccione manualmente las curvas de amplificación de todas las muestras con un valor de Cq para verificar

la amplificación positiva. Las curvas de amplificación se muestran en la pestaña Quantification (Cuantificación). 8. Vaya a la sección “Interpretation of Results” (Interpretación de los resultados) para obtener información sobre

cómo interpretar los valores del Cq. Nota: En la sección “Interpretation of Results” (Interpretación de los resultados), los valores del Cq equivalen a los valores de Ct.

Disposición

1. No abra las placas de PCR ni los tubos de PCR sellados después de la amplificación para evitar la

contaminación con productos de PCR amplificados. 2. Deseche los materiales peligrosos o biológicamente contaminados de acuerdo con las prácticas institucionales.


CRITERIOS DE CONTROL DE CALIDAD

• Los requisitos de control de calidad deben cumplimentarse de acuerdo con las regulaciones locales, estatales y federales.

• Siempre incluya un NTC y un PC en cada ejecución de rRT-PCR. • Incluya siempre un EC en cada lote de extracción de muestras y en ejecuciones posteriores de rRT-PCR.

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS

Controles

1. El NTC debe dar negativo y no demostrar ninguna amplificación por encima del umbral (es decir, no debe exceder los niveles de fondo) en ningún canal de detección.

2. El PC debe dar positivo y demostrar una amplificación por debajo del límite del Ct designado (<40) en los mismos canales de detección que el cebador/sonda diana.

3. El EC debe dar positivo (es decir, amplificación por debajo del límite del Ct designado [<40]) en el canal de detección de RNasa P.

4. La Tabla 9 muestra el rendimiento esperado de los controles en el Smart DetectTM SARS-CoV-2 rRT-PCR Kit. 5. Los resultados de los controles del ensayo (PC, NTC y EC) se deben examinar antes de la interpretación de

los resultados de las muestras clínicas. Si los controles no son válidos, los resultados de las muestras no se pueden interpretar, y el ensayo debe repetirse.

Tabla 9. Rendimiento esperado de los controles en el Smart DetectTM SARS-CoV-2 rRT-PCR Kit Control N E ORF1b RNasa P Valores esperados del Ct

Control positivo (PC)* + + + - <40

Control sin templado (NTC)* - - - - Ninguno detectado

Control de extracción (EC)** - - - + <40

*Si el PC o el NTC se desvían de estos valores del Ct esperados, los resultados del ensayo no son válidos, y el procedimiento de reacción de la rRT-PCR debe repetirse. **Si el EC se desvía de estos valores del Ct esperados, los resultados del ensayo no son válidos, y el procedimiento de extracción y la reacción de la rRT-PCR deben repetirse.

Interpretación de resultados de muestras clínicas

1. La evaluación de los resultados de las pruebas de muestras clínicas se debe realizar después de analizar el

PC, el NTC y el EC, y de determinar que son válidos y aceptables. Si los controles no son válidos, los resultados de las muestras clínicas no se pueden interpretar.

2. Para interpretar los resultados de las muestras clínicas, el valor de corte del Ct es 40. Un valor de Ct <40 indica que la muestra contiene la secuencia de ácido nucleico diana o la secuencia RNasa P y es positiva (+). Un valor de Ct ≥40 indica que la muestra no contiene la secuencia de ácido nucleico diana ni la secuencia RNasa P y es negativa (-). La interpretación de los resultados de las muestras clínicas basados en las tres dianas y en la RNasa P se muestra en la Tabla 10.


Tabla 10. Interpretación de resultados de muestras clínicas

Gen/región diana

Ct <40 = positivo (+) Valor de Ct ≥40 = negativo (-)

Interpretación final de

resultados de muestras clínicas

N E ORF1b RNasa P

- - - + SARS-CoV-2 negativo

+ + + + SARS-CoV-2 positivo

+ + - + SARS-CoV-2 positivo

+ - + + SARS-CoV-2 positivo

- + + + SARS-CoV-2 positivo

+ - - + SARS-CoV-2 presunto positivo; volver a analizar la muestra*

- - + + SARS-CoV-2 presunto positivo; volver a analizar la muestra*

- + - + SARS-CoV-2 presunto positivo; volver a analizar la muestra*

+ + + - SARS-CoV-2 positivo

+ + - - SARS-CoV-2 positivo

+ - + - SARS-CoV-2 positivo

- + + - SARS-CoV-2 positivo

+ - - - SARS-CoV-2 presunto positivo; volver a analizar la muestra*

- + - - SARS-CoV-2 presunto positivo; volver a analizar la muestra*

- - + - SARS-CoV-2 presunto positivo; volver a analizar la muestra*

- - - - Inválido; volver a analizar la muestra**

*El resultado del ARN del SARS-CoV-2 es presuntamente positivo. La muestra se debe analizar nuevamente extrayendo ARN de la misma muestra. Para muestras con un resultado presuntamente positivo repetido, se pueden realizar pruebas confirmatorias adicionales si es necesario diferenciar entre el SARS-CoV-2 y el SARS-CoV-1, u otro sarbecovirus que actualmente se desconozca que infecta humanos, con fines epidemiológicos o manejo clínico. ** Primero realice la prueba de repetición reextrayendo ARN de la misma muestra. Si la prueba vuelve a fallar, obtenga una nueva muestra del paciente y repita la prueba.


SOLUCIÓN DE PROBLEMAS

Control positivo (PC)

Problema Posibles causas y soluciones

PC negativo para N, E y/o ORF1b*

*Si el PC se desvía de estos valores de rendimiento esperados (Tabla 9), los resultados del ensayo no son válidos, y el procedimiento de reacción de la rRT-PCR debe repetirse.

Almacenamiento incorrecto del PC • Almacenar a -20 °C o menos. • Realizar y utilizar preparados para un solo uso. • Evite los ciclos de congelación y descongelación.

Error de pipeteo durante la preparación de la placa (pocillo incorrecto o volumen incorrecto)

• Asegúrese de agregar 5 μL de PC a 15 μL de la mezcla de reacción.

Mezcla inadecuada de los reactivos de la PCR • Asegúrese de que el contenido de los pocillos esté mezclado

correctamente y según las instrucciones para la preparación de la placa.

Reactivos vencidos y/o contaminados • Verifique la fecha de vencimiento del PC, la mezcla de sondas y

cebadores, la mezcla maestra y el agua sin nucleasas.

Configuración incorrecta del instrumento PCR • Asegúrese de que se asignen los fluoróforos correctos a las dianas

correctas (consulte la Tabla 3 para el instrumento 7500 Fast Dx Real-Time PCR y la Tabla 8 para el sistema de detección CFX96 Touch Real-Time).

Control de extracción (EC)


EC negativo para RNasa P*

*Si el EC se desvía de estos valores de rendimiento esperados (Tabla 9), los resultados del ensayo no son válidos, y el procedimiento de extracción y de reacción de la rRT-PCR deben repetirse.

Almacenamiento incorrecto del EC • Almacenar a -20 °C o menos. • Realizar y utilizar preparados para un solo uso. • Evite los ciclos de congelación y descongelación.

Error de extracción • Asegúrese de que se utilicen 140 μL de EC en la extracción. • Para utilizar el kit de extracción (Qiagen, n.º de catálogo 52904 o

52906), siga las instrucciones del fabricante.

Filtración del EC antes de la extracción • No filtre el EC antes de la extracción, ya que, si lo hace, se reduce

la cantidad de material celular existente para la extracción.


• Asegúrese de que 5 μL del EC extraído se agreguen a 15 μL de la mezcla de reacción.

Mezcla inadecuada de los reactivos de la PCR • Asegúrese de que el contenido de los pocillos esté mezclado

correctamente y según las instrucciones para la preparación de la placa.

Reactivos vencidos y/o contaminados • Verifique la fecha de vencimiento del EC, la mezcla de cebadores y

sondas, la mezcla maestra y el agua sin nucleasas.

Configuración incorrecta del instrumento PCR • Asegúrese de que se asignen los fluoróforos correctos a la RNasa P

(VIC en el instrumento 7500 Fast Dx Real-Time PCR y HEX en el sistema de detección CFX96 Touch Real-Time PCR).


Control sin templado (NTC)


Amplificación en el NTC*

*Si el NTC se desvía de estos valores de rendimiento esperados (Tabla 9), los resultados del ensayo no son válidos, y el procedimiento de reacción de la rRT-PCR debe repetirse.

Contaminación

• Asegúrese de que todas las superficies de trabajo estén debidamente descontaminadas.

• Use una bata de laboratorio limpia y guantes desechables limpios para la preparación de la reacción.

• Utilice puntas de pipeta con barrera para aerosoles. • Realizar y utilizar preparados para un solo uso. • Mantenga los contenidos de los pocillos placa cubiertos tanto como

sea posible durante y después de la preparación de las placas. • Asegúrese de que las placas y tiras de PCR estén completamente

selladas antes de colocarlas en el instrumento de PCR.


• Asegúrese de agregar 5 μL de NTC a 15 μL de la mezcla de reacción.

RNasa P


La muestra clínica es negativa para la RNasa P (gen de mantenimiento humano/control interno)*

*Consulte la Tabla 10. Si una muestra clínica es negativa para todas las dianas de SARS-CoV-2 y RNasa P, el resultado será “invalid; retest specimen” (“no válido; repetir prueba a la muestra”). Primero realice la prueba de repetición volviendo a extraer ARN de la misma muestra. Si la prueba vuelve a fallar, obtenga una nueva muestra del paciente y repita la prueba.

Calidad deficiente de la muestra (células huésped/material genético insuficiente)

• Vuelva a obtener una muestra clínica.

Almacenamiento incorrecto de la muestra clínica/degradación del ARN

• Almacene a 2-8 °C hasta 72 horas después de obtenida la muestra. • Si se espera un retraso en la extracción del ARN, almacene a -70 °C

o menos.

Error de extracción

• Asegúrese de que se utilicen 140 μL de muestra clínica en la extracción.

• Para utilizar el kit de extracción (Qiagen, n.º de catálogo 52904 o 52906), siga las instrucciones del fabricante.

Filtración de la muestra clínica antes de la extracción

• No filtre la muestra antes de la extracción, ya que, si lo hace, se reduce la cantidad de células huésped/material genético existente para la extracción.


• Asegúrese de agregar 5 μL de cada muestra clínica extraída a 15 μL de la mezcla de reacción.

Mezcla inadecuada de los reactivos de la PCR

• Asegúrese de que el contenido de los pocillos esté mezclado correctamente y según las instrucciones para la preparación de la placa.

Configuración incorrecta del instrumento PCR

• Asegúrese de que se asigne el fluoróforo correcto a la RNasa P (VIC en el instrumento 7500 Fast Dx Real-Time PCR, y HEX en el sistema de detección CFX96 Touch Real-Time PCR).


Instrumento 7500 Fast Dx Real-Time PCR


Dificultad para establecer la línea de umbral para N, E, ORF1b, y/o la RNasa P

Curvas de amplificación anómalas

• Asegúrese de que se haya seleccionado la “Analysis Settings” (Configuración de análisis) correcta.

• Para cada detector (diana del ensayo), la línea de umbral se debe ajustar para que esté dentro de la fase exponencial de las curvas de fluorescencia y por encima de cualquier señal de fondo. Consulte la Figura 3A-3D para ver ejemplos de la configuración de los umbrales de cada una de las dianas del ensayo.

• Después de configurar la línea de umbral, inspeccione todas las muestras a las que se asignó un valor de Ct para verificar la amplificación positiva (por ej., una curva de amplificación sigmoide) y ajuste los umbrales según sea necesario. Las curvas de amplificación irregulares o melladas podrían indicar que el ARN vírico presente en la muestra está cerca del LoD del ensayo. Consulte la Figura 4 para ver un ejemplo.

Los valores de Ct obtenidos en un pocillo (por ej., <5) para una sola diana del ensayo son muy bajos

Fondo muy alto

• Asegúrese de que la línea de umbral esté por encima de cualquier señal de fondo y dentro de la fase exponencial de las curvas de fluorescencia. Consulte la Figura 5 para ver un ejemplo de la fluorescencia de fondo que se podría observar en los NTC.

• Después de configurar la línea de umbral, inspeccione todas las muestras a las que se asignó un valor de Ct para verificar la amplificación positiva (por ej., una curva de amplificación sigmoide) y ajuste los umbrales según sea necesario.

Sistema de detección CFX96 Touch Real-Time PCR


Dificultad para establecer la línea de umbral para N, E, ORF1b, y/o la RNasa P

Curvas de amplificación anómalas

• Asegúrese de que Baseline Settings (Línea de referencia manual), Analysis Mode (Modo de análisis) y los Cycles to Analyze (Ciclos para analizar) estén correctamente configurados.

• Para cada diana del ensayo, la línea de umbral se debe ajustar para que esté por encima de cualquier señal de fondo y dentro de la fase exponencial de las curvas de fluorescencia. Consulte la Figura 6A-6D para ver ejemplos de la configuración de los umbrales de cada una de las dianas del ensayo.

• Después de configurar la línea de umbral, inspeccione todas las muestras a las que se asignó un valor de Ct para verificar la amplificación positiva (por ej., una curva de amplificación sigmoide). Las curvas de amplificación irregulares o melladas podrían indicar que el ARN vírico presente en la muestra está cerca del LoD del ensayo.


Figura 3A

Figura 3B

Figura 3C


Figura 3D

Figura 3A-3D. Gráficos de amplificación para las dianas del ensayo N (3A), E (3B), ORF1b (3C) y RNasa P (3D) para las muestras clínicas que se corren en el instrumento 7500 Fast Dx Real-Time PCR. Para N, E y ORF1b, la línea de umbral se debe ajustar para que esté por encima de cualquier señal de fondo (eso incluye un NTC válido y señales de EC válidas) y dentro de la fase exponencial de las curvas de fluorescencia. Para la RNasa P, la línea de umbral se debe ajustar para que esté por encima de cualquier señal de fondo (eso incluye una señal de NTC válida) y dentro de la fase exponencial de las curvas de fluorescencia. EC, control de extracción; NTC, control sin templado; PC, control positivo


Figura 4

Figura 4. Gráfico de amplificación para las dianas del ensayo N para las muestras clínicas que se corren en el instrumento 7500 Fast Dx Real-Time PCR. La curva A es una curva de amplificación lisa, sigmoide y con una intensa señal fluorescente. La curva B es una curva de amplificación lisa y sigmoide con una señal fluorescente más débil que la curva A. La región C muestra varias curvas de amplificación irregulares/melladas, que no se parecen a las curvas de amplificación positivas A y B. La línea de umbral debe colocarse por encima de la señal de fondo (eso incluye un NTC válido y señales de EC válidas) y dentro de la fase exponencial de las curvas de amplificación con curvas lisas y sigmoides. EC, control de extracción; NTC, control sin templado

Figura 5

Figura 5. Gráfico de amplificación para las dianas del ensayo para 20 NTC que se han corrido en el instrumento 7500 Fast Dx Real-Time PCR, que ilustra el rango típico de señal de fondo resultante de los NTC. NTC, Control sin templado


Figura 6A

Figura 6B


Figura 6C

Figura 6D

Figura 6A-6D. Gráficos de amplificación para las dianas del ensayo N (6A), E (6B), ORF1b (6C) y RNasa P (6D) para las muestras clínicas que se corrieron en el sistema de detección CFX96 Touch Real-Time PCR. Para N, E y ORF1b, la línea de umbral se debe ajustar para que esté por encima de cualquier señal de fondo (eso incluye un NTC válido y señales de EC válidas) y dentro de la fase exponencial de las curvas de fluorescencia. Para la RNasa P, la línea de umbral se debe ajustar para que esté por encima de cualquier señal de fondo (eso incluye una señal de NTC válida) y dentro de la fase exponencial de las curvas de fluorescencia. EC, control de extracción; NTC, control sin templado; PC, control positivo


LIMITACIONES

• Para uso exclusivo de personal capacitado en las técnicas de rRT-PCR y procedimientos de diagnóstico in vitro. Para utilizar de manera correcta este producto, se debe tener una comprensión cabal de las instrucciones de uso. Solo se obtendrán resultados confiables utilizando técnicas de laboratorio precisas y siguiendo con precisión estas instrucciones de uso.

• El rendimiento del Smart DetectTM SARS-CoV-2 rRT-PCR Kit se estableció utilizando muestras obtenidas mediante hisopado nasofaríngeo. Las muestras de los hisopados nasales anteriores y de los hisopados del cornete nasal medio también se consideran tipos de muestras aceptables para usar con el Smart DetectTM SARS-CoV-2 rRT-PCR Kit, pero no se ha establecido el rendimiento. El análisis de las muestras de los hisopados nasales y del cornete nasal medio (realizados por el paciente o por un proveedor de atención médica) se limitan a pacientes con síntomas de COVID-19. Para obtener información adicional, consulte las preguntas frecuentes de la FDA sobre pruebas de diagnóstico de SARS-CoV-2.

• Según el análisis in silico, el SARS-CoV-1 y otros coronavirus similares al SARS en el mismo subgénero (sarbecovirus) que el SARS-CoV-2 pueden reaccionar de forma cruzada con el Smart DetectTM SARS-CoV-2 rRT-PCR Kit. Se desconoce que el SARS-CoV-1 circule actualmente en la población humana, por lo tanto, es muy poco probable que esté presente en muestras de pacientes.

• El SARS-CoV-2 puede mutar en una, dos o tres de las regiones diana del ensayo con el Smart DetectTM SARS-CoV-2 rRT-PCR Kit. Si esto ocurre, puede que no se detecte el SARS-CoV-2.

• El rendimiento de la prueba se ve afectado por la calidad de la muestra clínica obtenida originalmente por el clínico.

• Los resultados falsos negativos pueden surgir del manejo inadecuado de la muestra y la degradación del ARN vírico durante el envío o el almacenamiento.

• Pueden producirse resultados falsos positivos por la contaminación cruzada entre muestras de pacientes, la mezcla de muestras y la contaminación por ARN durante la manipulación del producto.

• La detección del ARN del SARS-CoV-2 indica la presencia de ARN vírico; sin embargo, esto no confirma que el SARS-CoV-2 sea el agente causal de los síntomas clínicos.

• El Smart DetectTM SARS-CoV-2 rRT-PCR Kit no descarta enfermedades causadas por otros patógenos bacterianos o víricos.


CONDICIONES DE AUTORIZACIÓN PARA EL LABORATORIO

La carta de autorización del Smart DetectTM SARS-CoV-2 rRT-PCR Kit, la hoja de datos para proveedores de atención médica autorizada, la hoja de datos para pacientes autorizada y el etiquetado autorizado están disponibles en el sitio web de la FDA: https://www.fda.gov/MedicalDevices/Safety/ EmergencySituations/ucm161496.htm.

Sin embargo, para ayudar a los laboratorios clínicos a usar el Smart DetectTM SARS-CoV-2 rRT-PCR Kit (“su producto” conforme a las siguientes condiciones), a continuación se enumeran las condiciones de autorización relevantes:

A. Los laboratorios autorizados1 que usen el Smart DetectTM SARS-CoV-2 rRT-PCR Kit incluirán en los informes de resultados de su producto todas las hojas de datos autorizadas. En circunstancias apremiantes, se pueden utilizar otros métodos apropiados para difundir estas hojas de datos, que pueden incluir los medios masivos de comunicación.

B. Los laboratorios autorizados utilizarán el Smart DetectTM SARS-CoV-2 rRT-PCR Kit como se describe en las instrucciones de uso. No se permiten desviaciones de los procedimientos autorizados, incluidos los instrumentos autorizados, los métodos de extracción autorizados, los tipos de muestras clínicas autorizados, los materiales de control autorizados, otros reactivos auxiliares autorizados y los materiales autorizados necesarios para usar el Smart DetectTM SARS-CoV-2 rRT-PCR Kit.

C. Los laboratorios autorizados que reciban el Smart DetectTM SARS-CoV-2 rRT-PCR Kit notificarán a las autoridades de salud pública pertinentes su intención de ejecutar el Smart DetectTM SARS-CoV-2 rRT-PCR Kit antes de iniciar las pruebas.

D. Los laboratorios autorizados que utilicen el Smart DetectTM SARS-CoV-2 rRT-PCR Kit tendrán un proceso para informar los resultados de las pruebas a los proveedores de atención médica y las autoridades de salud pública pertinentes, según corresponda.

E. Los laboratorios autorizados recopilarán información sobre el rendimiento del Smart DetectTM SARS-CoV-2 rRT-PCR Kit e informarán a la DMD/OHT7-OIR/OPEQ/CDRH (por correo electrónico: [email protected]) e InBios International, Inc. ([email protected]) cualquier sospecha de resultados falsos positivos o falsos negativos y desviaciones significativas de las características de rendimiento establecidas del Smart DetectTM SARS-CoV-2 rRT-PCR Kit que noten.

F. Todo el personal de laboratorio que utilice el Smart DetectTM SARS-CoV-2 rRT-PCR Kit debe estar debidamente capacitado en técnicas de RT-PCR, y utilizar el equipo de laboratorio y de protección personal adecuados al manipular este kit y utilizar el Smart DetectTM SARS-CoV-2 rRT-PCR Kit de acuerdo con la documentación autorizada.

G. InBios International, Inc., los distribuidores autorizados y los laboratorios autorizados que utilicen el Smart DetectTM SARS-CoV-2 rRT-PCR Kit se asegurarán de que todos los registros asociados con esta EUA se conserven hasta que la FDA notifique lo contrario. Dichos registros se pondrán a disposición de la FDA para su inspección previa solicitud.

1 La carta de autorización se refiere a los "los laboratorios certificados conforme las Enmiendas para la Mejora de los Laboratorios Clínicos (CLIA) de 1988, 42 USC §263a, para realizar pruebas de alta complejidad" como "laboratorios autorizados".

CARACTERÍSTICAS DE RENDIMIENTO

El rendimiento del Smart DetectTM SARS-CoV-2 rRT-PCR Kit se evaluó mediante los siguientes estudios analíticos: SENSIBILIDAD ANALÍTICA (LÍMITE DE DETECCIÓN) Los estudios del límite de detección (LoD) determinan la concentración más baja detectable de ARN del SARS-CoV-2 en la cual el 95 % o más de todas las réplicas dan positivo.

A fin de determinar el LoD para el Smart DetectTM SARS-CoV-2 rRT-PCR Kit, se prepararon diluciones en serie de ARN genómico vírico completo del SARS-CoV-2 agregando una matriz de muestras nasofaríngeas mezcladas. El ARN genómico vírico completo del SARS-CoV-2 utilizado en este estudio se obtuvo del BEI (n.º de catálogo NR-52285, lote 70033320), y el sistema Bio-Rad QX200 Droplet Digital PCR determinó que contenía 4.8E+07 equivalentes de genoma (GE)/ml.

El LoD inicial se determinó probando diluciones en serie con un factor de dilución 1:3 por triplicado. Cada réplica se extrajo con el QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN, n.º de catálogo 52904 o 52906) y se analizó en el instrumento 7500 Fast Dx Real-time PCR (Applied Biosystems). La concentración más baja a la que las tres réplicas dieron positivo se consideró el LoD inicial.

Para establecer el LoD final, se analizaron 20 réplicas enriquecidas con ARN genómico vírico completo del SARS-CoV-2 a la concentración del LoD inicial. La prueba de 20 repeticiones se reiteró a concentraciones crecientes hasta que se logró, como mínimo, una tasa de positividad del 95 %. Tanto 6.9 GE/reacción (6.0E+02 GE/ml) como 10 GE/reacción (8.6E+02 GE/ml) resultaron en una tasa de positividad de <95 %. Se logró una tasa de positividad del 95 % con 12.5

mailto:[email protected]




GE/reacción (1.1E+03 GE/ml); por lo tanto, se determinó que el LoD final para el Smart DetectTM SARS-CoV-2 rRT-PCR Kit era 12.5 GE/reacción o 1.1E+03 GE/ml en el instrumento 7500 Fast Dx Real-time PCR (Tabla 11).

Tabla 11. Determinación del LoD final para el instrumento 7500 Fast Dx Real-time PCR de Applied Biosystems LoD (GE del SARS-

CoV-2/ml) LoD (GE del SARS-

CoV-2/reacción) N.º de positivos (Ct

<40)/ n.º de réplicas

analizadas

N.º de positivos (por interpretación de

resultados finales)/n.º de réplicas analizadas

Tasa de positividad

(%)

N E ORF1b

6.0E+02 6.9 13/20 19/20 0/20 13/20 65 %

8.6E+02 10 17/20 20/20 0/20 17/20 85 %

1.1E+03 12.5 19/20 20/20 0/20 19/20 95 %

Prueba de instrumentos alternativos Se realizó un estudio abreviado del LoD a fin de determinar el LoD para el Smart DetectTM rRT-PCR Kit utilizando el sistema de detección de PCR en tiempo real CFX96 Touch (Bio-Rad).

El LoD para el sistema de detección de PCR en tiempo real CFX96 Touch se evaluó analizando 20 réplicas de la matriz de muestras nasofaríngeas mezcladas enriquecidas con ARN genómico vírico completo del SARS-CoV-2 obtenido del BEI a la concentración del LoD inicial determinada en el estudio del LoD para el instrumento 7500 Fast Dx Real-Time PCR. Cada réplica se extrajo con el QIAamp Viral RNA Mini Kit y se analizó en el sistema de detección de PCR en tiempo real CFX96 Touch. La prueba de 20 repeticiones se reiteró a concentraciones crecientes hasta que se logró, como mínimo, una tasa de positividad del 95 %. 6.9 GE/reacción (6.0E+02 GE/ml) resultó en una tasa de positividad de <95 %. Se logró una tasa de positividad del 95 % con 10 GE/reacción (8.6E+02 GE/ml). Se determinó que el LoD final para el Smart DetectTM SARS-CoV-2 rRT-PCR Kit era 10 GE/reacción u 8.6E+02 GE/ml en el sistema de detección de PCR en tiempo real CFX96 Touch (Tabla 12).

Tabla 12. Determinación del LoD final para el sistema de detección de PCR en tiempo real CFX96 Touch LoD (GE del SARS-CoV-

2/ml)

LoD (GE del SARS-CoV-2/reacción)

N.º de positivos (Ct <40)/

n.º de réplicas analizadas

N.º de positivos (por interpretación de resultados

finales)/n.º de réplicas analizadas

Tasa de positividad

(%)

N E ORF1b

6.0E+02 6.9 15/20 20/20 0/20 15/20 75 %

8.6E+02 10 19/20 20/20 0/20 19/20 95 %

Prueba con una mezcla maestra alternativa

Se realizó un estudio de equivalencia para evaluar el desempeño de mezclas maestras para rRT-PCR alternativas en el Smart DetectTM SARS-CoV-2 rRT-PCR Kit.

Se evaluaron los componentes InBios A, B y C de la mezcla maestra (Opción 1 de la mezcla maestra para la rRT-PCR) y componente InBios A de la mezcla maestra, mezcla para sonda con reacción en un paso Luna® (sin ROX) (2X) y mezcla para enzimas RT Luna® WarmStart® RT (20X) (Opción 2 de mezcla maestra para rRT-PCR) para obtener una equivalencia respecto a la mezcla maestra TaqPath™ 1-Step RT-qPCR, CG (Opción 3 de mezcla maestra para rRT-PCR), la mezcla maestra utilizada en el estudio de sensibilidad analítica (LoD).

La equivalencia se evaluó utilizando un estudio de LoD abreviado. Veinte réplicas de matriz de muestras nasofaríngeas fueron enriquecidas con ARN genómico vírico completo del SARS-CoV-2 obtenido del BEI a 12.5 GE/reacción (1.1E+03 GE/mL), el LoD final establecido para el instrumento 7500 Fast Dx Real-Time PCR utilizando la Opción 3 de mezcla maestra para la rRT-PCR. Cada réplica se extrajo con el QIAamp Viral RNA Mini Kit. Las réplicas fueron analizadas con el instrumento 7500 Fast Dx Real-Time PCR y el sistema de detección CFX96 Touch Real-Time PCR utilizando las opciones 1 y 2 de mezcla maestra para rRT-PCR. El análisis de las 20 réplicas se reiteró a concentraciones descendentes hasta que se logró, como mínimo, una tasa de positividad del 95 %.

Se determinó que el LoD final para el Smart DetectTM SARS-CoV-2 rRT-PCR Kit utilizando las opciones 1 y 2 de mezcla maestra para la rRT-PCR fue 12.5 GE/reacción (1.1E+03 GE/mL) en el instrumento 7500 Fast Dx Real-Time PCR; por lo tanto, la Opción 1 y la Opción 2 de mezcla maestra para la rRT-PCR demostraron un rendimiento equivalente al de la Opción 3 de mezcla maestra para la rRT-PCR en el instrumento 7500 Fast Dx Real-Time PCR (Tabla 13).


Se determinó que el LoD final para el Smart DetectTM SARS-CoV-2 rRT-PCR Kit utilizando la Opción 1 y la Opción 2 de mezcla maestra para la rRT-PCR fue 8 GE/reacción (6.9E+02 GE/mL) en el sistema de detección CFX96 Touch Real-Time PCR; por lo tanto, la Opción 1 y la Opción 2 de mezcla maestra para la rRT-PCR demostraron un rendimiento mejorado (<1x LoD) respecto al de la Opción 3 de mezcla maestra para la rRT-PCR en el sistema de detección CFX96 Touch Real-Time PCR (Tabla 13).

Tabla 13. Comparación del LoD de las mezclas maestras para cada instrumento para PCR

Instrumento Opción 1 y Opción 2 de mezcla maestra para rRT-PCR

Opción 3 de mezcla maestra para rRT-PCR

LoD GE/reacción (GE/mL) LoD GE/reacción (GE/mL)

Instrumento 7500 Fast Dx Real-Time PCR

12.5 (1.1E+03) 12.5 (1.1E+03)

Sistema de detección CFX96 Touch Real-Time PCR

8 (6.9E+02) 10 (8.6E+02)

REACTIVIDAD ANALÍTICA (INCLUSIVIDAD) La inclusividad del Smart DetectTM SARS-CoV-2 rRT-PCR Kit se evaluó mediante análisis informático. Las secuencias de cebadores y sondas del kit Smart DetectTM se compararon individualmente con 156 secuencias completas del genoma del SARS-CoV-2 almacenadas en la base de datos del NCBI al 26 de marzo de 2020.

Las secuencias de cebadores y sondas N demostraron una identidad del 100 % con todas las secuencias del SARS-CoV-2, excepto una. En esta secuencia (GenBank MT246485.1), se identificó una única falta de coincidencia de nucleótidos en el medio de la región de unión del cebador inverso (alineación de 19/20). No se predice que esta única mutación del SARS-CoV-2 afecte la unión del cebador inverso o el rendimiento del ensayo.

Las secuencias de cebadores y sondas E demostraron una identidad del 100 % con todas las secuencias del SARS-CoV-2, excepto una. Tras un análisis adicional de la secuencia del sujeto, se encontró una única falta de coincidencia de nucleótidos en el extremo 3' de la región de unión de la sonda E, lo que da como resultado una alineación de 25/26 bases. No se anticipa que esta única mutación del SARS-CoV-2 afecte la unión de la sonda o el rendimiento del ensayo.

Las secuencias de cebadores y sondas ORF1b demostraron una identidad del 100 % con todas las secuencias del SARS-CoV-2.

En conclusión, los cebadores y las sondas del Smart DetectTM SARS-CoV-2 rRT-PCR Kit tienen una secuencia muy conservada en relación con las secuencias completas del genoma del SARS-CoV-2 en la base de datos del NCBI al 26 de marzo de 2020. ESPECIFICIDAD ANALÍTICA (REACTIVIDAD CRUZADA) La reactividad cruzada del Smart DetectTM SARS-CoV-2 rRT-PCR Kit se evaluó mediante análisis informático y pruebas húmedas de organismos completos y ácidos nucleicos purificados de patógenos potencialmente encontrados en muestras de las vías respiratorias superiores.

Para el análisis informático, las secuencias de sondas y cebadores del Smart DetectTM SARS-CoV-2 rRT-PCR Kit se compararon individualmente con las secuencias de 30 patógenos potencialmente presentes en muestras de las vías respiratorias superiores o con similitudes genéticas con el SARS-CoV-2. La FDA define la reactividad cruzada informática como una identidad superior al 80 % entre uno de los cebadores o las sondas, y cualquier secuencia presente en el patógeno diana. Los resultados informáticos demuestran la reactividad cruzada potencial de las secuencias de cebadores y sondas N, E y ORF1b con el coronavirus SARS (Tabla 14). No se espera reactividad cruzada con otros coronavirus humanos u otros patógenos.

Tabla 14. Reactividad cruzada prevista de los cebadores y sondas del kit Smart DetectTM con diversos patógenos

Patógeno

Reactividad cruzada prevista -% de identidad

Cebadores/sondas N Cebadores/sondas E Cebadores/sondas

ORF1b

Coronavirus humano 229E Ninguna Ninguna Ninguna

Coronavirus humano OC43 Ninguna Ninguna Ninguna

Coronavirus humano HKU1 Ninguna Ninguna Ninguna


Coronavirus humano NL63 Ninguna Ninguna Ninguna

Coronavirus del SARS ≥95 % 100 % ≥88 %

Coronavirus del MERS Ninguna Ninguna Ninguna

Adenovirus Ninguna Ninguna Ninguna

Metaneumovirus humano (hMPV) Ninguna Ninguna Ninguna

Virus de la parainfluenza humana 1 Ninguna Ninguna Ninguna




Influenza A Ninguna Ninguna Ninguna

Influenza B Ninguna Ninguna Ninguna

Enterovirus 68 Ninguna Ninguna Ninguna

Virus sincitial respiratorio Ninguna Ninguna Ninguna

Rinovirus Ninguna Ninguna Ninguna

Chlamydia pneumoniae Ninguna Ninguna Ninguna

Haemophilus influenzae Ninguna Ninguna Ninguna

Legionella pneumophila Ninguna Ninguna Ninguna

Mycobacterium tuberculosis Ninguna Ninguna Ninguna

Streptococcus pneumoniae Ninguna Ninguna Ninguna

Streptococcus pyogenes Ninguna Ninguna Ninguna

Bordetella pertussis Ninguna Ninguna Ninguna

Mycoplasma pneumoniae Ninguna Ninguna Ninguna

Pneumocystis jirovecii (PJP) Ninguna Ninguna Ninguna

Candida albicans Ninguna Ninguna Ninguna

Pseudomonas aeruginosa Ninguna Ninguna Ninguna

Staphylococcus epidermidis Ninguna Ninguna Ninguna

Staphylococcus salivarius Ninguna Ninguna Ninguna

Para las pruebas húmedas, los patógenos enumerados en la Tabla 15 se agregaron a una matriz de muestras nasofaríngeas mezcladas o muestras nasofaríngeas simuladas. Cada muestra enriquecida se extrajo con el QIAamp Viral RNA Mini Kit y se probó en el instrumento 7500 Fast Dx Real-PCR. Todas las muestras con reactividad cruzada potencial resultaron negativas con el Smart DetectTM SARS-CoV-2 rRT-PCR Kit; por lo tanto, no se observó reactividad cruzada entre los patógenos sometidos a pruebas húmedas.

Tabla 15. Resultados de pruebas húmedas de posibles agentes patógenos de reacción cruzada


Patógeno/cepa Matriz Concentración Interpretación de resultados finales

Adenovirus humano 1 ATCC VR-1 Muestra nasofaríngea simulada 1.0E+05 UFP/ml

Negativo

Virus de la parainfluenza humana 1 ATCC VR-94

Muestra nasofaríngea simulada 1.0E+05 UFP/ml

Negativo

Virus de la parainfluenza humana 2 ATCC VR-92


Negativo

Virus parainfluenza 3 ATCC VR-1782 Muestra nasofaríngea simulada 1.0E+05 UFP/ml

Negativo

Rinovirus humano 64 ATCC VR-1174 Muestra nasofaríngea simulada 1.0E+05 UFP/ml

Negativo

Virus sincitial respiratorio humano ATCC VR-26


Negativo

Virus sincitial respiratorio humano (ARN genómico)

Muestra nasofaríngea mezclada

1.79E+00 ng ARN total/μl

Negativo

Coronavirus del MERS (ARN genómico) Muestra nasofaríngea mezclada

4.30E-02 ng ARN total/μl

Negativo

Influenza A (ARN genómico) Muestra nasofaríngea mezclada


Negativo

Influenza B (ARN genómico) Muestra nasofaríngea mezclada

7.47E+00 ng ARN total/μl

Negativo

Enterovirus D68 (ARN genómico) Muestra nasofaríngea mezclada


Negativo

Mycobacterium tuberculosis (ADN genómico) Muestra nasofaríngea mezclada

1.38E+02 ng ADNg/μl

Negativo

Metaneumovirus humano (ARN genómico) Muestra nasofaríngea mezclada


Negativo

Metaneumovirus humano ATCC® VR-3250SDTM (ARN sintético cuantitativo)

Muestra nasofaríngea simulada

≥ 1.0E+05 copias/µL

Negativo

Bocavirus humano ATCC® VR- 3251SDTM (ADN sintético cuantitativo)

Muestra nasofaríngea simulada

≥ 1.0E+05 copias/µL

Negativo

EVALUACIÓN CLÍNICA El rendimiento clínico del Smart DetectTM SARS-CoV-2 rRT-PCR Kit se determinó analizando 30 muestras positivas artificiales y 30 muestras negativas. Las muestras positivas artificiales se prepararon agregando ARN genómico vírico del SARS-CoV-2 a muestras de hisopados nasofaríngeos clínicos individuales obtenidas de pacientes en Estados Unidos con signos y síntomas de infecciones respiratorias o confirmadas como positivas para infecciones respiratorias no causadas por el SARS-CoV-2. Las muestras negativas fueron las mismas muestras de hisopados nasofaríngeos clínicos individuales sin ninguna adición. El ARN genómico vírico completo del SARS-CoV-2 utilizado en este estudio se obtuvo del BEI (n.º de catálogo NR-52285, lote 70033320). Este estudio se realizó en InBios International, Inc.

Cada muestra se extrajo con el QIAamp Viral RNA Mini Kit. Las muestras artificiales positivas se enriquecieron con ARN viral después de la incubación de la muestra con el amortiguador de lisis del kit de extracción para preservar la integridad del ARN no protegido. Después de la extracción, las muestras se aleatorizaron, enmascararon y codificaron. Todas las muestras enmascaradas se analizaron con el instrumento 7500 Fast Dx Real-time PCR de acuerdo con la documentación del producto.


La coincidencia de porcentaje positivo (PPA) para las muestras del LOD a 1x-2x y del LOD a 3x-5x, y la coincidencia de porcentaje negativo (NPA) para las muestras del LoD a 0x (negativo) se determinaron comparando los resultados obtenidos con los resultados esperados. En la Tabla 16 se presenta un resumen de la PPA y la NPA por concentración. La PPA general para las muestras positivas analizadas con el Smart DetectTM SARS-CoV-2 rRT-PCR Kit fue del 100 % [IC del 95 %: 88.4 %-100 %]. Se obtuvo un resultado falso positivo en 30 muestras negativas analizadas, lo que resultó en una NPA del 96.7 % [IC del 95 %: 82.8 %-99.9 %].

Tabla 16. Porcentaje de coincidencia del Smart DetectTM SARS-CoV-2 rRT-PCR Kit con los resultados esperados por concentración de muestra

Concentración del SARS-CoV-2 (LoD)

Resultados (n.º de positivos/n.º de

analizados)

Ct promedio N diana

Ct promedio E diana

Ct promedio ORF1b diana

% de coincidencia [IC del 95 %]

LoD a 1x-2x 20/20 35.90 32.28 38.24 100 % [83.2 %-100 %]*

LoD a 3x-5x 10/10 32.61 29.57 33.67 100 % [69.2 %-100 %]*

LoD a 0x (negativo)

1**/30 N/C N/C N/C 96.7 % [82.8 %-99.9 %]

*PPA general para 1x-5x LoD: 100 % (30/30) [95 % CI: 88.4 %-100 %] **Una muestra negativa (obtenida en Estados Unidos el 9 de enero de 2020) exhibió valores de Ct <40 para los genes N y E. Tras una inspección más cercana de las curvas de amplificación después del desenmascaramiento, las curvas N y E para esta muestra tienen una forma no sigmoidal y se denominaron incorrectamente positivas.

REFERENCIAS

[1] Evaluating and Reporting Persons Under Investigation (PUI). Coronavirus Disease 2019 (COVID-19). [En línea] CDC, 2020. https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/hcp/clinical-criteria.html.

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Soporte técnico: https://inbios.com/technical-support/

N.º de pieza del prospecto 900260-01 N.º. de catálogo COV2-E

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https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/hcp/clinical-criteria.html

https://inbios.com/technical-support/

http://www.inbios.com/

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Smart DetectTM SARS-CoV-2 rRT-PCR Kiti8sit3w4v3z1h99oi1gmrx61-wpengine.netdna-ssl.com/wp... · 2020. 8. 3. · ensayo de diagnóstico molecular in vitro que ayuda en la detección