SISTEMA T7/Lac

Sequenza della regione di clonaggio del pET21a

Single-stranded sequencing should be performed using the T7 terminator and promoter primers

The T7 tag is an epitope tag composed of an 11-residue peptide Epitope tags are useful for the labeling and detection of proteins using immunoblotting, immunoprecipitation, and immunostaining techniques

His tag for affinity cromatography

mRNA

Rho–independent mechanismThe Rho-Independent termination signals • The intrinsic terminator sequence is an inverted repeat of GC-rich sequence

followed by 4 or more adenines. The transcribed RNA forms stem-loop structure at

inverted repeats via internal base pairing • The formation of this stem-loop structure disrupts hydrogen bonding between RNA

uracils and DNA adenines at site of transcription (weak because only 2 H-bonds

between A and U as compared to 3 between G and C) • As a result, RNA is released from the DNA template

What is an inverted repeat? A sequence of several bases in double-stranded DNA that is repeated in an inverted fashion

Example: 5'.....GCCGCCAG........CTGGCGGC....3' 3'.....CGGCGGTC........GACCGCCG....5' (template strand)

transcribed RNA: 5'.......GCCGCCAG........CTGGCGGC.....3'

Consequently there are internal sequences in the transcribed RNA that are complementary and can therefore base pair to form a stem-loop structure

Specific-sequence mechanismRho-dependent Termination Signals • Some termination sequences lack the series of adenines which are transcribed in to

URACILS on the RNA. The RNA in such situations needs assistance from a specific protein

(termed Rho) which is necessary for termination. • Rho binds at the 5'end of the RNA and scans down the RNA until it catches up with an RNA

polymerase  which is paused at a stem-loop structure. • In Rho dependent termination, the Rho protein forces the RNA to separate from the DNA

template.

SISTEMA pBAD

AraBAD = operone che codifica tre geni A, B, D e convertono arabinosio in xilulosio-5-PAraC proteina regola 1) l’operone araBAD attivandolo o disattivandolo, 2) la propria sintesi legandosi quando c’è alta la sua concentrazione al sito operatore O1 e reprimendo in al modo la sua trascrizione

Geni coinvolti nel metabolismo del’arabinosio

Sistema che attiva la trascrizione di pBAD

Sistema che reprime la trascrizione di pAraC

AraC

-35 -10

SISTEMA pBAD

Sequenza della regione di clonaggio del pBAD/gIII C

Cold shock promoters

The cold shock response is one of the multiple adaptive mechanisms evolved by bacteria to survive stressful situations. In E. coli, rapid transfer of exponentially growing cells from 37 to 15°C leads to the upregulation of cold shock proteins whose task is to restore efficient transcriptional and translational processes in stressed cells. CspA, a protein that is virtually undetectable at 37°C, undergoes the most dramatic increase in accumulation upon temperature downshift, and over 10% of the total protein synthesis is dedicated to its production during the first hour following transfer to 15°C. Thereafter, CspA production is repressed.

CspA functions as an RNA chaperone to prevent the formation of stable secondary structures in RNA molecules at low temperature and thus facilitates translation of cellular mRNAs at low temperatures.

A common feature shared by CspA and other cold-inducible proteins is the presence of a 5' untranslated region (UTR) ranging in length from 155 to 161 nucleotides. This extension destabilizes transcripts to which it is fused at physiological temperatures, while it stabilizes adjoining mRNA and favors their translation following temperature downshift. Because recombinant protein folding is favored at low temperatures while degradation is less efficient under the same conditions, we are exploiting the useful characteristics of the cspA promoter to produce aggregation-prone and/or unstable recombinant proteins at low temperatures.

                                                                           Schematic representation of the cspA promoter region. The 5'UTR includes a cold box that is conserved among cold-inducible proteins and important in regulation. RBS denotes the ribosome binding site, while UP denotes an upstream element responsible for enhanced transcription at low temperatures. DB indicates the location of a downstream box in the cspA coding region.

UP denotes an upstream element responsible for enhanced transcription at low temperatures

The cold shock expression system is repressed at 37 °C and induced by transfer of the bacteria to low temperature. Cellular protein production stops after transfer to the 15 °C labeling medium. NMR spectra obtained from centrifuged (100,000g) lysates after sonication are very similar to those of the purified protein.

The pCold protein production system in E. coli.

pCOLD system In cold conditions E. coli growth is halted and a pool of proteins are expressed

Cold shock promoter based (cspA) – Your gene is downstream

TEE means translation-enhancing element and is a five-codon sequence which has been shown to enhance translation initiation

Nature Biotechnology 22, 877 - 882 (2004)

Stabilità dell’ mRNA

Introdurre modifiche sull’organismo E.

coli

Introdurre modifichesul vettore di espressione

o sul gene stesso

Ottimizzazione della fase traduzionale per esprimere la mia proteina ricombinante

Problemi di basse rese di proteina ricombinante solubile

Problema di folding

Problema di overespressione o crescita cellulare

PROTEINE di fusione

In alcuni vettori di espressione il sito di clonaggio non è immediatamente adiacente alla sequenza di ribosome binding, ma è preceduta da un segmento iniziale di DNA di un gene appartenente a un gene di E. coli

Il prodotto di espressione genica è quindi una proteina ibrida che consiste di un corto peptide codificato dal E.coli reading frame fuso con l’amino terminale della proteina clonata.

The gene fusion

Espressione di proteine native

AGGAAAC AGAAC GATCCGTCGGATAATTAGCTGA TCC TTTG TCTT GGTAC GCAGCCTATTAATCGACT

NcoI BamHIRBSAGGAAAC AGAACCATGGGAGGATCCGTCGGATAATTAGCTGATCC TTTG TCTT GGTACCCT CCTAGGCAGCCTATTAATCGACT

AGGAAAC AGAACCATGG GGATCCGTCGGATAATTAGCTGA TCC TTTG TCTT GGTACC CCTAGGCAGCCTATTAATCGA CTC-DNA

ATG TAA

Met

La maggior parte dei vettori d’espressione per proteine native hanno un sito di restrizione unico per NcoI posizionato a valle del promotore.

Un vettore d’espressione può essere usato per produrre una proteina nativa o una proteina chimerica.

Quando si vuole studiare l’attività biologica di una proteina si preferisce utilizzare un vettore d’espressione nativo.

Espressione di proteine di fusione

Sempre più spesso si preferisce esprimere proteine di fusione, per la loro maggiore stabilità, gli alti livelli di espressione e la relativa facilità con cui si purificano, con queste proteine chimeriche si pone:

AGGAAAC AGAACCATG GGATCCGTCGAAGCTTGATAATTAGCTGA TCC TTTG TCTT GGTAC CCTAGGCAGCTTCGAACTATTAATCGA CT GST

BamHI HindIII

AGGAAAC AGAACCATG G AGCTTGATAATTAGCTGA TCC TTTG TCTT GGTAC CCTAG ACTATTAATCGACT GST

AGGAAAC AGAACCATG

TCC TTTG TCTT GGTAC GST GGATCC

CCTAGG cDNA IgG AAGCTTTTCGAA

MetGST IgG

MetGST IgG

AGGAAAC AGAACCATG

TCC TTTG TCTT GGTAC GST GGATCC

CCTAGG cDNA IgG AAGCTTTTCGAA

Gly SerGlu Ala Cys TyrVal Ala

MetGST ?

AGGAAAC AGAACCATG

TCC TTTG TCTT GGTAC GST GGATCCAAA

CCTAGGTTT cDNA IgG AAGCTT TTCGAA

Gly SerGlu Ala Met AspLys Phe

I vantaggi della gene fusion• Una efficiente traslazione dell’mRNA dipende non solo dalla presenza del ribosome binding site ma è anche influenzata dalla sequenza di nucleotidi all’inizio della regione codificante.

Questo effetto è impedito se questa regione è fatta interamente da naturale E. coli sequenza.

• La presenza di un peptide batterico all’inizio della proteina fusa stabilizza la molecola proteica contro la degradazione.• Il segmento peptidico può costituire un “signal peptide”, responsabile per dirigere le naturali proteine del E.coli nella posizione corretta all’interno della cellula. L’esportazione della proteina è particolarmente utile perché semplifica il problema di purificazione della proteina ricombinante dalla cultura • Il segmento batterico può anche aiutare nella purificazione proteica

E’ importante che la sequenza nucleotidica tra la SD e il codone d’inizio non sia disturbatada strutture secondarie ( es. hairpin loops ) che possono interferire drasticamente con illegame al ribosoma e la conseguente traduzione.

Affinity cromatography

La fusione “dell’ospite” con la proteina glutatione-S-transferasi (GST) del E.coli permette di purificare la proteina ospite attraverso colonne contententi agarose beads che portano legato glutatione:

Affinity cromatographyNecessità di rimuovere la proteina fusa altrimenti le proprietà della proteina ricombinante possono essere alterate

In genere, enzimi come trombina che taglia accanto a residui Arg oppure Factor Xa che taglia dopo Gly-Arg si usano per rimuovere proteine fuse al proteina ricombinante a meno che la sequenza di riconoscimento non sia presente all’interno della proteina ricombinante

Problemi generali con la produzione di proteine ricombinanti in E. coli

1. Problemi causati dalla sequenza del gene ricombinante

a. Il gene contiene introni e E. coli non possiede la necessaria organizzazione per rimuovere gli introni dai geni trascritti

Problemi generali con la produzione di proteine ricombinanti in E. coli

1. Problemi causati dalla sequenza del gene ricombinante

b. Il gene contiene sequenze di basi che sono riconosciute nel E. coli come segnali di terminazione della proteina e quindi si ottiene una terminazione prematura e perdita del gene di espressione

Problemi generali con la produzione di proteine ricombinanti in E. coli

1. Problemi causati dalla sequenza del gene ricombinantec. L’utilizzo dei codoni del gene può non essere ideale per la traslazione in E. coli. Tutti gli organismi usano lo stesso codice genetico, ma ciascun organismo ha un bias verso preferenziali codoni. Se un gene clonato contiene un alta proporzione di codoni sfavorevoli, allora il tRNA può incontrare difficoltà nella traslazione del gene, riducendo la quantità di proteina sintetizzata

OTTIMIZZAZIONE DELLA STABILITA’

Utilizzo di codoni alternativi

Poiché organismi diversi possono utilizzare preferenzialmente codoni sinonimi per specificare uno stesso amminoacido e poiché è nota la percentuale di utilizzazione media dei codoni sinonimi in molti organismi è possibile aumentare i livelli di espressione modificando i codoni del gene di interesse senza alterarne il prodotto di espressione.

Problemi generali con la produzione di proteine ricombinanti in E. coli

2. Problemi causati dalle limitazioni del E. coli come ospite per la sintesi di proteine ricombinanti

a. E. coli può non “produrre” correttamente la proteina ricombinante, cioè proteine di molti organismi dopo la traslazione subiscono modificazioni chimiche di amminoacidi che sono essenziali per una corretta attività biologica, oppure subiscono glicosilazione.

E. coli non glicosila le proteine.

Questi problemi non si risolvono si ricorre ad sistemi di espressioni eucariotici quali lieviti, funghi, baculovirus.

Problemi generali con la produzione di proteine ricombinanti in E. coli

2. Problemi causati dalle limitazioni del E.coli come ospite per la sintesi di proteine ricombinanti

b. E. coli può non foldare correttamente la proteina, la quale in genere risulta insolubile e forma i cosiddetti inclusion body all’interno del batterio.

Questi problemi possono essere risolti facendo uno screening su diversi tipi di E. coli strain o re-folding.

Corpi di inclusione:

Cause probabili

• Precipitazioni non specifiche dovute ad un contenuto elevato di proteina• Presenza insufficiente di chaperones/folding enzymes con conseguente

aggregazione di intermedi parzialmente foldati• Mancanza di modificazioni post-trasduzionali (proteine eucariote) portano

a prodotti meno stabili• Proteina tossica per il batterio

• Aggregati insolubili che accumulano prodotti di scarto del batterio• Opachi al microscopio• Diametro 1µm• Composti per lo più di proteina eterologa

Problemi generali con la produzione di proteine ricombinanti in E. coli

2. Problemi causati dalle limitazioni del E.coli come ospite per la sintesi di proteine ricombinanti

c. E. coli può degradare la proteina ricombinante perché non la riconosce come propria. Come il riconoscimento avviene non è tuttora noto.

I problemi del punto 2c possono essere risolti utilizzando E. coli strain mutanti cioè mancanti di una o più protesi responsabili per la

degradazione proteica.

L’utilizzo di ceppi carenti in proteasi

Un altro modo per ottimizzare la stabilità dei prodotti di espressione, consiste nel minimizzare la degradazione proteolitica a carico delle proteine espresse

A causa della presenza in E. coli di più venti proteasi, solo alcune delle quali risultano essere caratterizzate, questo obbiettivo è difficile da ottenere.

Sono tuttavia disponibili ceppi di coli mutanti che risultano difettiva in una o più di queste proteasi, come ad esempio omp

Strain Company Main feature

BL21(DE3) Novagen protease deficient

BL21(DE3) pLysS Novagen produce lysozyme

BL21(DE3) pLysE Novagen produce more lysozyme than S

OrigamiB(DE3)pLysS Novagen trx, glutathione reductase mut (disulfide bridges)

Rosetta(DE3)pLysS Novagen supply tRNA for 6 rare codons

BL21(DE3)codon plus Stratagene supply tRNA for rare codons

C41(DE3) Avidis SA more tolerant than 21 to toxic proteins

C43(DE3) Avidis SA idem for one specific protein

B834(DE3) Novagen met auxotroph Se-met labelling

Electron micrographs of thin sections of E. coli C43(DE3) cells over-producing subunit b of E. coli ATP synthase, 3 and 18 h after induction at 37 or 25°C, respectively.

Ceppi di E. coli