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ESCUELA SUPERIOR DE INGENIERÍA MECÁNICA Y ELÉCTRICA UNIDAD AZCAPOTZALCO
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
SISTEMA AUXILIAR PARA EL DIAGNOSTICO DEL CARCINOMA EPIDERMOIDE INVASOR EN TEJIDO
CERVIX EMPLEANDO TECNOLOGIA LÁSER.
• Ávila Salazar Carlos Alberto • Calderón Hernández Laura Lourdes • Espinoza de los Monteros Aguilar Erick
Directora del proyecto: M. en C. Aurora Aparicio Castillo
México, D.F. Diciembre de 2008
REPORTE FINAL
Clave SIP 20080425
1
Abstract
Laser Induced Fluorescence Spectroscopy (LIFS) is a technique that has been recently used to detect in vivo or in vitro cancer. The LIFS system has been used to analyze cervical tissue samples for histological evaluation. Because the fluorescence spectra are position and inter‐probe dependent (albeit they were equally classified by histological evaluation) the relationship that exists in the data is complex. So, a back‐propagation Artificial Neural Network is used to detect the relationships contained within them. The validation of the system was done with 5 different proves and a 100% classification coincidence between the neural network classification and a normal histological one was obtained. The LIFS‐System works with a N2 laser of 5 μJ pulse energy (tFWHM = 3.8 ns at 337.1 nm wavelength) and spectra from 350 to 650 nm were processed and evaluated in a PC. Keywords. Laser Induced Fluorescence, Cervical Cancer and Neural Network.
Resumen
La espectroscopia de inducción de fluorescencia con láser (LIFS) es una técnica recientemente usada para detectar cáncer in vivo o in vitro. En este trabajo se usa esta técnica para analizar y diagnosticar muestras de tejido cervical preparadas para su evaluación histológica. Debido a que los espectros de fluorescencia son muestra a muestra y punto a punto diferentes (a pesar de ser clasificados como iguales por medio de su evaluación histológica) no resulta simple determinar las relaciones básicas de los datos medidos. Por lo cual se usa una red neuronal artificial del tipo “back‐propagation” para detectar estas relaciones. La validación del sistema se realizó con 5 diferentes muestras y se obtuvo una coincidencia del 100 % entre la clasificación realizada por esta y la realizada por el proceso histológico normal. El sistema LIFS trabaja con pulsos de 5 μJ (
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y evaluados en una computadora personal. Palabras claves: Fluorescencia inducida con luz láser, cáncer cervicouterino y redes neuronales.
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Figura 2. Sistema elemental de clasificación de características de patrones espectrales. Por otro lado, el sistema de Hardware encargado de adquirir los espectros de fluorescencia fue basado en el fenómeno que ocurre cuando una muestra de materia es irradiada con luz ultravioleta, produciendo la excitación de sus estados electrónicos y la posterior emisión de luz visible desde dichos estados. Concretamente, la excitación lleva a la molécula a una serie de subniveles vibracionales asociados con el estado electrónico excitado. Y puesto que en el caso de excitación con láser la energía se absorbe en paquetes de luz de la misma energía, denominados cuantos. Toda molécula puede ser excitada por diferentes tipos de láser, cada uno con una longitud de onda característica. En este proyecto se utilizó un láser de N2 que emite a una longitud de onda de 337.1nm El fenómeno de fluorescencia fue inducido en el tejido de cérvix con la luz de un láser de N2. La fluorescencia fue analizada, tanto temporalmente como en su contenido de longitudes de onda. La figura 3 muestra el sistema de fluorescencia empleado.
Figura 3 Sistema básico para la medición de fluorescencia
3. Módulos de Hardware
Los espectros de fluorescencia son obtenidos midiendo la emisión de luz de la muestra de tejido cervical bajo estudio cuando se le excita con una fuente que emite una longitud de onda específica. Como fuente de excitación se utilizó un láser de N2 cuyo haz es alineado hacia el sistema divisor de haz por medio de dos espejos, el divisor de haz se utilizó para reflejar una parte de esa luz hacia un fotodetector de referencia que sirve para medir la potencia del láser y sincroniza la operación del osciloscopio. La luz que no se refleja llega a una lente biconvexa que la enfoca sobre la muestra que se está analizando, la fluorescencia emitida por ésta se colecta, utilizando un par de esferas de vidrio, en una fibra óptica que le lleva al espectrómetro para realizar su análisis espectral. El fotomultiplicador convierte las intensidades ruinosas en forma de voltaje para poder ser monitoreada en el osciloscopio.
4
Éste último envía las formas de onda, por medio de una interfaz GPIB, a una PC que se encarga de registrarlas e ir extrayendo la información para generar el espectro de fluorescencia. El espectrómetro es controlado desde la PC por medio de un puerto serie (RS‐232). El software fue desarrollado en LabView 6 de National Instruments.
4. Fuente de Excitación (Láser de Nitrógeno)
La fuente de excitación es un láser de nitrógeno, que emite pulsos de luz con una longitud de onda de 337.1nm (UV) y tienen una duración de 4ns.El diagrama eléctrico del láser de nitrógeno se muestra en la Figura 4.
5. Sistema óptico
El sistema óptico es el encargado de adecuar la luz del láser para dividirla en el haz que servirá como referencia y el haz que será concentrado y enfocado en la muestra que se esté estudiando. También consta de lentes que se encargan de concentrar la mayor cantidad de luz emitida por fluorescencia de la muestra y dirigirla a una fibra óptica. El sistema óptico consta de los siguientes elementos (figura 5):
• Divisor de haz (vidrio portaobjeto).‐ Permite desviar 18.2% de la luz del haz láser incidente hacia el fotodetector de referencia.
• Lente biconvexo (BK7) concentran el haz de luz en una sola zona de 1.7 mm x 0.9 mm. • Fotodetector MRD500.‐ El cual esta aislado dentro de un tubo de aluminio, y cuenta con una salida hacia
el osciloscopio. • Fibra óptica (cuarzo).‐ Para conducir la fluorescencia hacia el espectrómetro.
Figura 5. Arreglo Óptico
-15KV
Spark gap
Cámara de descarga
Figura 4 Diagrama eléctrico del láser de nitrógeno.
5
6. Sistema espectrométrico
Esta parte la componen la fibra óptica, el espectrómetro, el tubo Fotomultiplicador y el fotodetector de referencia. El trabajo principal del sistema espectrométrico es tomar la muestra de fluorescencia y obtener la intensidad de la variación en función de la longitud de onda. Este sistema está constituido por los siguientes elementos: • Fibra óptica.‐ La fibra óptica se encarga de conducir la fluorescencia inducida por el láser hacia el
espectrómetro, mismo que la descompondrá en sus componentes, la intensidad de cada componente será convertida por el fotomultiplicador a señal eléctrica y observada en un osciloscopio.
• Espectrómetro.‐ Su función es la de realizar el análisis espectral de la luz fluorescente, la intensidad de cada componente espectral es convertida por el fotomultiplicador a señal eléctrica y observada en un osciloscopio. En las figuras 3.8 y 3.9, el espectrómetro es controlado por la PC por medio de la interfaz serial (RS‐232).
• Fotomultiplicador.‐ Como se menciono anteriormente este dispositivo convierte la irradiancia luminosa en voltajes, los cuales son capturados por el osciloscopio para después ser enviados a la tarjeta GPIB.
Figura 6. Espectrómetro
7. Adquisición de radiación láser y fluorescencia
Las señales de la radiación láser y la fluorescencia proporcionadas por los fotodetectores son registradas en un osciloscopio digital Tektronix®2440. El osciloscopio utilizado no tiene la capacidad de registrar estas señales en un disco, sin embargo cuenta con una interfase de comunicación GPIB con el estándar IEEE 488 que le permitirá comunicarse con una PC para transferir todas las señales que se requieran en un tiempo considerablemente corto.
8. Red Nuronal
Como se mencionó anteriormente, cada material tiene como característica su espectro de fluorescencia. En el caso del tejido cervical uterino su estado sano y cada una de las diferentes patologías también presentan espectros de fluorescencias diferentes, no sólo en intensidad sino en su forma. Así, el reconocimiento de los patrones de fluorescencia es la propuesta que aquí se maneja para hacer un sistema de diagnóstico del estado patológico del tejido. Dicho reconocimiento podría hacerse por medio de un sistema experto que podría ser una
6
persona, o por medio de un sistema de cómputo a través de una red neuronal artificial. En este proyecto se diseñó una red neuronal “backpropagation”, la cual permite en forma adecuada el reconocimiento y diagnóstico de las biopsias analizadas por medio de su fluorescencia inducida. Una red neuronal artificial genérica puede definirse como un sistema computacional que consiste de un conjunto de unidades procesadoras altamente interconectadas, denominados como neuronas, los cuales procesan información en respuesta a un estímulo externo. Una neurona artificial es una representación simplista que simula la conducta de integración de señales y umbral de disparo de las neuronas biológicas por medio de ecuaciones matemáticas. En analogía a su contraparte biológica, las neuronas artificiales están enlazadas entre sí a través de conexiones que determinan el flujo de información entre pares de ellas. Los estímulos son trasmitidos vía sinopsis o interconexiones desde una unidad procesadora a otra. Estos estímulos pueden ser excitadores o inhibidores. Las redes neuronales son típicamente arreglos de diferentes capas de unidades procesadoras. La información fluye a través de cada unidad en la forma de un esquema entrada–salida. En otras palabras cada elemento recibe una señal de entrada la manipula y genera una señal de salida que alimenta a otras unidades en la capa adyacente. La única tarea de la capa de entrada es recibir el estímulo externo y transportarlo a la siguiente capa. La capa oculta recibe la suma ponderada de las señales de entrada y la procesa por medio de una función de activación.
Figura 8. Red neuronal
Para que la red neuronal artificial haga un trabajo similar al del cerebro humano está también tiene que ser entrenada, para esto se le alimenta con una serie de datos de entrenamiento, en los cuales los datos de entrada producen un conjunto conocido de salidas o conclusiones. Así la red aprende a dar respuestas correctas por medio del ejemplo. Conforme la red es alimentada con nuevos datos, cada caso es comparado con los ya antes procesados. Si hay diferencias entre el caso nuevo y los ya existentes, se calcula un factor de corrección y se aplica a los nodos en la capa oculta. Esta etapa se repite hasta que la corrección es menor a un valor pre‐determinado
9. Redes Backpropagation
El término backpropagation se refiere al proceso por el cual pueden calcularse las derivadas de error de la red, con respecto a sus pesos y bases. Este proceso puede usarse con varias estrategias de optimización diferentes. Debido a la naturaleza general del proceso de aprendizaje, algunos de los campos generales de aplicación son:
7
• Codificación de Información. • Traducción de texto a lenguaje hablado. • Reconocimiento de lenguaje hablado. • Reconocimiento óptico de caracteres (OCR).
La importancia de la red backpropagation consiste en su capacidad de autoadaptar los pesos de las neuronas de las capas intermedias para aprender la relación que existe ente un conjunto de patrones de entrada y sus salidas correspondientes. Es importante la capacidad de generalización, facilidad de dar salidas satisfactorias a entradas que el sistema no ha visto nunca en su fase de entrenamiento. La red debe encontrar una representación interna que le permita generar las salidas deseadas cuando se le dan entradas de entrenamiento, y que pueda aplicar, además, a entradas no presentadas durante la etapa de aprendizaje para clasificarlas. Para los propósitos de este trabajo se opto por la red backpropagation ya que este tipo de red respecto a las demás es fácil de implementar, tiene la flexibilidad de adaptarse para aproximar cualquier función y la velocidad de procesamiento de los datos es menor; sin embargo es importante mencionar que actualmente existen redes backpropagation modificadas (con momentum) las cuales podrían ser analizadas en un siguiente trabajo para determinar sus beneficios. La red neuronal para la clasificación de los espectros de fluorescencia de biopsia de tejido de cérvix uterino es una red backpropagation con 65 neuronas en la capa de entrada, 9 en la capa intermedia y 1 en la capa de salida.
10. Arreglo empleado para obtener las señales de fluorescencia
En la Figura 9 se muestra el diagrama a bloques del sistema de medición implementado:
Los pasos que se siguen para obtener las mediciones de fluorescencia de las muestras tisulares fijadas en el vidrio porta y cubre objetos, son los que se describen a continuación:
• Mediante una bomba de vacío se genera el vació adecuado en la cámara de descarga del láser de N2, abrir la llave del tanque de Nitrógeno, verificar que la presión sea la adecuada (60mbar) y aplicar alto voltaje hasta observar la descarga del láser.
• Verificar que los elementos ópticos estén perfectamente alineados con respecto al haz láser, es decir que al pasar por el divisor de haz efectivamente una parte del láser se desvié hacia el fotodiodo (referencia), para verificar dicho efecto es recomendable conectar la salida del fotodiodo a un canal del osciloscopio y
observar la señal desplegada en la pantalla del instrumento, lo que nos asegura el correcto funcionamiento del láser (≈3%). La señal observada se muestra en la figura 10:
Figura 9. Arreglo empleado para obtener las señales de Fluorescencia
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€ Iniciando (d) Iniciando
€Osciloscopio Capturando el pulso láser
Figura 10. Pulso láser observado en el fotodiodo
• Verificar que la otra parte del haz láser (≈81.2%) llega al sistema óptico e incide en la parte central del punto donde quedará la muestra, de ser así se apaga el láser y se coloca la muestra bajo medición y se fija, como se ilustra en la figura 5.3.
(a) Colocando la muestra en el pulso láser (b) Cubriéndola con la pieza
Figura 11 Colocación de la Muestra
• En la PC en la barra de INICIO seleccione y elija LabView • Una vez en LabView pulse la pestaña ABRIR y elija el programa que tiene la siguiente ruta:
C:\WINDOWS\Escritorio\flu\Tek2440\Graphed12a.vi, y se elige la aplicación que controla el sistema, ver la siguiente figura.
9
• Posicione el control de acción en inicializar espectrómetro, encienda el espectrómetro, al tiempo que aparece en el espectrómetro el mensaje de inicializando debe dar clic al botón de correr continuamente en la barra de ejecutar en la PC.
“correr continuamente”
Figura 12 Espectrómetro inicializándose
• Verifique que aparece el mensaje de: COMPUTER CONTROL en el espectrómetro y en la PC debe mostrarse el mismo mensaje, en caso contrario repita el proceso
• Se establecen las longitudes de onda para el barrido que realizará el espectrómetro, en este caso los controles de posición del espectrómetro se colocan de tal forma que inicien en 330nm hasta 650nm con incrementos de 5.
• Indique una ruta para guardar el archivo de Excel que se generara al término de este proceso. • Indique una ruta para guardar el archivo de texto que se generara al término de este proceso. • Ahora posicione el control de acción a realizar en posición inicial.
Figura 13 Control de Acción a realizar en la posición inicial.
• Dar clic al botón de correr continuamente en la barra de ejecutar. • Verifique que el espectrómetro se posicione en 330nm, si es así detenga el programa haciendo clic en el
botón STOP de la barra ejecutar
10
Figura 14 Espectrómetro situado a 330nm.
• Encienda la fuente de alimentación del fotomultiplicador.
Figura 15 Fuente de alimentación
• Debe fijarse a un voltaje de 15V ±1. • Una vez colocada la muestra posicione el control de acción a realizar en barrido. • De clic al botón de correr continuamente en la barra de ejecutar.
Figura 16 Control de acción a realizar en posición de barrido.
• Una vez que el espectrómetro llegue a la posición final (650nm) debe dar clic en el botón Stop de la barra
ejecutar.
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• Una vez que ha terminado todos los barridos el espectro de fluorescencia resultante se muestra como sigue:
11. Señales de Fluorescencia obtenidas de muestras de tejido cervical
Las muestras de tejido cervical después de ser tomada del paciente fueron puestos en formaldehido al 10% durante 24 horas en un cuarto a temperatura constante, posteriormente son incrustados en parafina para su corte. Secciones de 4 μm fueron cortadas para ser analizadas empleando un microscopio. Se tiñeron las muestras con hematoxilina y eosina. En este estudio se utilizaron 15 muestras de 15 diferentes pacientes. El diagnóstico histopatológico fue tomado como el diagnostico correcto con el cual posteriormente se comparara el resultado entregado por el sistema LIF. 10 de las muestras fueron empleadas para entrenar la red neuronal, la cual posteriormente se empleo para clasificar
las restantes 5 muestras de tejido y así validar la red neuronal. Todas las muestras de tejido tenían una antigüedad promedio de 3.5 años. La Figura 17 muestra la intensidad de fluorescencia promedio contra la longitud de onda obtenida en 10 diferentes puntos de cada una las muestras. La fluorescencia de las muestras de tejido saludable es mayor que la fluorescencia de otras en las bandas de 350 a 540nm y de 575 a 650nm, y este podría ser un criterio para separar muestras malignas y no malignas. Para una excitación de 320nm algunos autores han propuesto usar solo la relación de la intensidad de la fluorescencia a 383 y 460nm para clasificar muestras malignas y no malignas de biopsias cervicales in‐vitro obteniendo un 33% en los diagnósticos falso‐negativo. Para comparar todos los valores de las intensidades de los espectros de fluorescencia obtenidos para cada muestra, es necesario que los espectros de la figura 5.9 sean normalizados. Para normalizar se toma el valor máximo de la fluorescencia y se dividen todos los valores entre dicho valor, de tal manera que los valores de las señales oscilaran entre “0” y “1”, ver figura 18. En la figura 18 ahora es clara la diferencia entre todos los patrones de fluorescencia. Por ejemplo, los máximos de los espectros de infección con HPV, cáncer invasivo y carcinoma in‐situ tienen lugar alrededor de 560nm, y toman diferentes valores entre 350nm y 500nm. También se observa que el máximo del espectro de tejido sano y cervicitis crónica tiene lugar a 350nm, y toman diferentes valores entre 550nm y 600nm.
Figura 17. Espectros de fluorescencia para diferentes tejidos de cérvix.
(HPV‐Human Papillomavirus)
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Figura 18 Normalización a 1 de los espectros de la Figura 5.9.
14. Entrenamiento de la Red neuronal para reconocimiento de las muestras de tejido La opción optima para el tratamiento de la señal, fue la elección de un intervalo apropiada para el barrido de la señal. El primer intervalo propuesto fue de una longitud de onda de 330 a 650 nm, un total de 64 puntos, sin embargo como se menciono antes se ha observado que la información que nos interesa esta en un intervalo de 420 a 660nm, con lo que se redujeron los puntos a 49. De la misma forma se trataron todas las muestras analizadas, por lo que para cada muestra se formaron 50 vectores de entrenamiento, 10 vectores por cada padecimiento que se desea analizar, así que el diseño de la red neuronal propuesto para resolver el problema es el siguiente: La red neuronal estará constituida de dos capas, una intermedia y una de salida. Para el caso de la capa intermedia va muy ligada con el número de características que contendrán los patrones de entrenamiento de la red y que posteriormente serán los patrones de reconocimiento y esto es debido al modelo de variante de la red backpropagation que se eligió. Así, de la red neuronal diseñada en el capítulo 4, se utilizaron 49 neuronas en la capa de entrada y 5 neuronas en la capa de salida, con lo cual el patrón de entrada tiene 49 características, con funciones de transferencia tansig y logsig. El entrenamiento de la red neuronal se realizó en matlab, y se obtuvo un buen resultado a partir de 7000 épocas a 50000 épocas, sin tener el problema de generalización de patrones (apéndice A). 15. Señales de Fluorescencia obtenidas de muestras de líneas celulares Como un experimento adicional se investigaron los patrones de fluorescencia de las líneas celulares C‐33, CaLo y HeLa, preparadas en el Laboratorio de la Dra. Eva Ramón Gallegos de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas. Las células epiteliales y las tumorales se mantienen de forma más prolongada en sus medios de cultivo. Espontáneamente, por clonación o por inducción mediante substancias químicas o virus, algunas células pueden transformarse y mantenerse indefinidamente en su medio de cultivo y dar lugar a líneas celulares permanentes. En la figura 19 se observan las graficas de fluorescencia de las líneas celulares C‐33, Calo y Hela,
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Figura 19 Graficas de Fluorescencia de las líneas celulares
Para hacer más claras las diferencias existentes entre las graficas correspondientes a las tres líneas celulares empleadas, mostradas en la figura 19, es necesario realizar la normalización, para lo cual se establece el máximo valor de amplitud de cada línea celular y se dividen todos los valores entre este, por lo que los valores que se obtienen fluctúan entre “0” y “1”. En la figura 20 aparece el valor máximo para las tres líneas celulares alrededor de 405 nm otra diferencia notable es la forma en que después del pico correspondiente al pulso láser las señales de fluorescencia alcanzan su mayor valor.
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
330 380 430 480 530 580 630
VOLT
AJE
(V)
LONGITUD DE ONDA (nm)
LINEAS CELULARES
C-33
CALO
HELA
14
Figura 20 Gráficas de Fluorescencia de las líneas celulares normalizadas a “1”.
En este estudio se tomaron 9 muestras de línea celular C‐33, 9 de Calo y 9 de Hela, de las graficas de fluorescencia obtenidas para cada línea celular se obtuvieron la mayor cantidad de rasgos característicos de cada línea para posteriormente entrenar la red neuronal.
16. Entrenamiento de la red neuronal para reconocimiento de las líneas celulares
Las graficas empleadas para el entrenamiento de la red neuronal se muestran en las figuras 21 a 23 las cuales corresponden a las 9 muestras de la línea celular C‐33, 9 de Calo y 9 de Hela, respectivamente.
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
330 380 430 480 530 580 630
VOLT
AJE
(V)
LONGITUD DE ONDA (nm)
LINEAS CELULARES NORMALIZADAS
C-33
CALO
HELA
15
Figura 21. Graficas de Fluorescencia de las 9 muestras de C‐33 empleadas para entrenar la Red Neuronal
Figura 22 Graficas de Fluorescencia de las 9 muestras de Calo empleadas para entrenar la Red Neuronal
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
330 380 430 480 530 580 630
VOLT
AJE
(V)
LONGITUD DE ONDA (nm)
LINEA CELULAR C-33 SIN NORMALIZAR
Muestra 1
Muestra 2
Muestra 3
Muestra 4
Muestra 5
Muestra 6
Muestra 7
Muestra 8
Muestra 9
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
330 380 430 480 530 580 630
VOLT
AJE
(V)
LONGITUD DE ONDA(nm)
LINEA CELULAR CALO SIN NORMALIZAR
Muestra 1
Muestra 2
Muestra 3
Muestra 4
Muestra 5
Muestra 6
Muestra 7
Muestra 8
Muestra 9
16
Figura. 23 Graficas de Fluorescencia de las 9 muestras de la Hela empleadas para entrenar la Red Neuronal Las graficas anteriores se obtienen graficando los datos que se adquieren a través de la tarjeta de LabView, los cuales son guardados en dos tipos de archivos .xls y .txt, los datos del archivos .txt posteriormente se introducen al software WinNN para establecer las reglas de aprendizaje y los valores de entrenamiento para la red tipo Backpropagation. Una vez entrenada la red neuronal se procedió a realizar mediciones sobre muestras de líneas celulares no empleadas para el entrenamiento, obteniéndose en la pantalla de la PC la etiqueta que indica el tipo de muestra identificada, esto se realizo con 3 muestras de C‐33, 3 de Calo y 3 de Hela, sin ningún error en las clasificaciones.
Figura 24. Resultado de la red neuronal
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
330 380 430 480 530 580 630LONGITUD DE ONDA (nm)
LINEA CELULAR HELA SIN NORMALIZAR
Muestra 1
Muestra 2
Muestra 3
Muestra 4
Muestra 5
Muestra 6
Muestra 7
Muestra 8
Muestra 9
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Conclusiones
La prueba de papanicolau, en la cual una pequeña muestra de células colectadas desde el epitelio cervical son diagnosticadas bajo el microscopio por un experto, es en el presente un método muy extendido para detectar cáncer cervical. Si bien esta prueba ha sido efectiva en la reducción de la mortalidad debida al cáncer cervical (1), (2), esta es altamente dependiente de la habilidad y experiencia del patólogo. La sensitividad y especificidad usando la prueba de Papanicolau son 73% y 63% respectivamente. Una prueba de Papanicolaou anormal es seguida por una colposcopia, donde se usa un montaje de lentes amplificadoras para ver el cérvix. La sensitividad de la colposcopia es excelente (96%) pero su especificidad es pobre (48%) (4). El cervix es cubierto por dos tipos de tejido epitelial: el ectocervix tiene un epitelio escamoso estratificado y; el endocervix tiene un epitelio columnar. La unión entre estos dos es conocida como la zona de transformación y puede ser reconocida basándose en su apariencia colposcopica característica. La espectroscopia de fluorescencia ha sido investigada como un método efectivo y no invasivo para chequeo y detección de cáncer cervical. La espectroscopia de fluorescencia del tejido es afectada por diferentes causas, entre estas el cambio en el índice de refracción en el tejido y el esparcimiento en las células nucleoides son los más importantes. Las moléculas de hemoglobina absorben significativamente a ciertas longitudes de onda. La luz es también absorbida por fluoroporos, los cuales entonces emiten luz fluorescente. Fluoroporos biológicos tales como el NADH y las flavinas están directamente relacionadas al metabolismo humano. Así, el esparcimiento, la absorción y la fluorescencia producidos por la interacción de radiación con tejido generan una gran cantidad de información morfológica, citológica e histopatológica del tejido bajo investigación. Los espectros de fluorescencia obtenidos con las biopsias de cérvix muestran que la interacción de la luz laser UV con los tejidos producen diferentes espectros de intensidades de fluorescencia y diferentes tiempos de vida de fluorescencia, en la figura 5.9 se puede ver que, para una excitación UV a 337nm, existe una emisión máxima a diferentes longitudes de onda para cada tipo de tejido analizado; de tal manera que la máxima emisión para la muestra con tejido con VPH, la de cáncer invasivo y la de carcinoma in‐situ se obtiene en 560nm; para la muestra de tejido con cervicitis crónica; el máximo pico de emisión se encuentra a 580nm.Conforme el tejido pasa de normal a pre cáncer, la intensidad de fluorescencia disminuye. La fluorescencia de estas muestras ginecológicas se atribuye a la combinación de colágeno, elastina y NADH (Nicotinamide Adenina Dinucleotide). La red neuronal utilizada este trabajo de tesis es del tipo back‐propagation. Esta emplea todas las mediciones de las intensidades a las diferentes longitudes de onda (49 por espectro). Para las biopsias utilizadas, la red permite clasificar los cinco casos de tejido bajo estudio. La red neuronal ha sido suficiente para discriminar estados precanceroso o cancerosos te tejido sano. La red neuronal es una buena opción para representar una relación compleja entre cualquier numero de parámetros de entrada (como los mostrados en las figuras 4.1 y 4.2) y un resultado de interés. La realidad es que una red neuronal es en gran parte independiente de suposiciones respecto a la distribución estadística que relaciona a los datos que son más relevantes, cuando se tienen grandes cantidades de datos. Siguiendo la teoría de las Redes Neuronales se propusieron dos capas (con funciones de transferencia tansing y logsig para las capas ocultas de entrada y de salida) de pesos adaptivos en un diagrama de realimentación, ver la figura 4.4. Consideramos 49 entradas, 1 por cada (Iλ , λ) mediciones (espectro desde 420 a 660nm), 49 capas ocultas y 5 salidas (una para cada clasificación de los tejidos en la figura).
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En la red empleada, cada sitio de entrada está conectado a una sola unidad oculta a través de un peso asociado ωi,j (donde i = 1,……,49 es el número de puntos de entrada y de las unidades ocultas). Todas las unidades ocultas están conectadas a las unidades de salida a través de lo pesos asociados ωi,j (donde j = 1,….,5 es el numero de las unidades de salida). Los pesos de los umbrales son propuestos aleatoriamente. Cuando un espectro de entrada (Iλ , λ) proveniente de una biopsia es ingresado a la red esta produce un diagnostico, arrojado por el algoritmo de aprendizaje backpropagation, obteniéndose un 100% de coincidencia en la clasificación de los datos. Esto es, la red neuronal utilizada en este trabajo de tesis emplea todas las mediciones de las intensidades a las diferentes longitudes de onda (49 por espectro) y, para las biopsias de prueba utilizadas, la red permite clasificarles dentro de los cinco casos de tejido bajo estudio con toda precisión. Con lo cual se puede además concluir que ésta ha sido suficiente para discriminar estados precancerosos o cancerosos te tejido sano. De igual forma, los experimentos que se llevaron a cabo con líneas celulares ofrecen resultados similares. Debido a que tanto las células epiteliales como las tumorales se mantienen prolongadamente en medios de cultivo con características previamente establecidas, Una vez normalizados los patrones de fluorescencia, es posible observar las diferencias existentes entre ellos. Con los datos obtenidos se entreno la red neuronal para llevar a cabo el análisis de estas células partiendo de sus rasgos característicos. Una vez entrenada la red neuronal se realizaron las mediciones de líneas celulares de prueba clasificándolas sin error. El método de clasificación a través de la red neuronal y sólo resta para establecer su completa validez la realización de pruebas sobre una mayor cantidad de muestras, por ejemplo en la mayoría de los reportes médicos es costumbre reportar estudios consistentes en más de 100 muestras.
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