Serologische testen in de routine diagnostiek: een update · populatie 100% positief voor de geteste ziekte Maat voor vals-negatieve resultaten ... Algemeen principe precipitatie

Dierengezondheidszorg Vlaanderen vzw

Serologische testen in de routine

diagnostiek: een update

Dr. Ellen Van Driessche, DVM, MSc, PhD

2

1. Inleiding

2. Serologische testen

1. Agar gel precipitatie test (AGPT)

2. Agglutinatietest (AG)

3. Hemagglutinatie-inhibitietest (HI)

4. ELISA

3. Serum poolen – interpretatie?

4. Conclusies

Serologie in routinediagnostiek: update

3

1. Inleiding





4. ELISA


4. Conclusies


4

• De meeste effectieve antigenen zijn grote, rigide (vaste

vorm), chemisch complexe moleculen en normaal niet-

eigen aan het dier of mens

• Epitoop = het deel van het antigeen dat herkend wordt

door de antistof

• Soorten: bacterie, virus, dierlijke cel ...

Inleiding: antigeen

5

Er bestaan verschillende antistoffenfracties die verschillende

eigenschappen hebben:

IgG 1 monomeer, agglutinerend

IgA 1-2 monomeren, agglutinerend

IgM begin infectie, agglutinerend, 5

monomeren

IgD 1 monomeer

IgE 1 monomeer

Elke serologische test kijkt slechts naar een deel van de

immuunrespons

Inleiding: antistof

6

• Komt tot stand door niet-covalente krachten:

‐ zwakke krachten

‐ talrijk en daardoor zeer sterk

• Evenwichtsreactie: Ag + As Ag-As

Inleiding: antigeen-antilichaambinding

7

• Sterkte van de binding tussen 1 epitoop van het antigeen en 1 antigeen-bindende zijde van het antistof

• Of vermogen van 1 antistofmolecule om aan 1 epitoop te binden

• Beïnvloedende parameters : pH, temp, reactietijd, vaste fase……

• AVIDITEIT : functionele term die de prestatie van een POLYKLONAAL antiserum in een welbepaalde test weergeeft

Polyklonaal antiserum bevat antistoffen gericht tegen verschillende epitopen van een antigeen

Monoklonaal antiserum bevat antistoffen tegen slechts 1 epitoop van een antigeen

Inleiding: affiniteit

8

Testkarakteristieken van specifieke test:

1. Sensitiviteit

Kans (%) dat een test een positief resultaat geeft in een

populatie 100% positief voor de geteste ziekte

Maat voor vals-negatieve resultaten

bv. PRRSv Se = 98,8%

2. Specificiteit

Kans (%) dat een test een negatief resultaat geeft in een

populatie 100% negatief voor de geteste ziekte

Maat voor vals-positieve resultaten

bv. PRRSv Sp = 99,9%

Inleiding: sensitiviteit & specificiteit

9

1. Inleiding





4. ELISA


4. Conclusies


10

Algemeen principe precipitatie

AGPT: agar gel precipitatie test

Conc immuuncomplexen

Afnemende concentratie Ag Afnemende concentratie As

Y Y

Y

Y Y

Y Y

Y Y

Y

Y

Y Y

Equivalentiepunt =

precipitatielijn

As Ag

11

Principe :

antigeen in oplossing en te onderzoeken serum (As)

diffunderen naar elkaar toe doorheen een gel

bij optimale concentratie zal precipitatie optreden

precipitaat wordt vastgehouden door de gel


12

Praktische uitvoering (dubbele immunodiffusie)


As

Ag

13

• Redelijk ongevoelige test : er moeten veel As en Ag

aanwezig zijn zodat de grote complexen ontstaan

• Met dit type test kan zowel Ag als As geïdentificeerd

worden in serum

• Geschikt Ag : 40000-60000 Dalton

• Niet kwantitatief

• pH buffer gel en temperatuur beïnvloeden de

precipitatiereactie

• In labo: pluimveeanalysen zoals Adeno, AI, IB, ILT, Marek,

Reo


14

• Voordelen

‐ Eenvoudige test

‐ Minimum 24h (overnacht incubatie)

‐ Lage kostprijs

• Nadelen

‐ Lage sensitiviteit

‐ Lage specificiteit


15

1. Inleiding





4. ELISA


4. Conclusies


16

• Algemeen principe:

Agglutinatie is een fenomeen gekenmerkt door een massaal samenklitten van partikels in suspensie ten gevolge van een As-Ag binding : er vormen zich aggregaten die met het blote oog of microscopisch zichtbaar zijn

• Partikels : bacteriën, RBC, Ag met diameter van 0.1 - 10 µm (> dan bij precipitatie testen) : hoe meer epitopen, hoe betere agglutinerende capaciteit

• IgM antistoffen beter agglutinerend dan IgG: IgM meer bindingsplaatsen

Agglutinatietesten

17

Agglutinatie testen gevoeliger dan precipitatietest omwille van

een toename in aviditeit en een betere detectie (AG is veel

groter en vooral beter te zien)

Agglutinatie: signaal vlugger optreden - langer waarneembaar

Agglutinatietesten

Conc immuuncompexen

Afnemende concentratie Ag Afnemende concentratie As

Y Y Y

Y Y

Y Y Y Y

Y

Y

Y Y

Equivalentiepunt

= precipitatielijn

18

• Deze test laat toe As aan te tonen tegenover bacteriële Ag

of Ag gecoat op latex partikels

• In labo: Rose-Bengaal test (Brucellose) : aantonen IgG1 -

test met lage aviditeit

Aggl. testen : snelle draagglas-agglutinatie

POS

Ag

Serum

NEG

19

Aggl. testen : snelle draagglas-agglutinatie

POS

NEG

20

• Voordelen

‐ Zeer snelle test (enkele minuten)

‐ Lage kostprijs

• Nadelen

‐ Lagere specificiteit door mogelijke interferentie met

andere agglutinerende elementen in serum

Agglutinatietesten

21

1. Inleiding





4. ELISA


4. Conclusies


22

Algemeen principe:

Hemagglutinatie-inhibitietest

A B C D E F G H

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

• Staaltype: SERUM

• Opeenvolgende tweevoudige

verdunningen van het serumstaal in de

cupjes

• Toevoegen van een constante

hoeveelheid virus (4 HAU) : virus die kan

binden aan receptoren op membraan van

RBC

• Incubatie 1h – 20°C

1/2

23


Y Y

Y Y

Positief serum Negatief serum

Y Y

Y Y

Y Antistof

Virus

Toevoegen RBC

Y Y

Y Y

Incuberen

RBC

24


Interpretatie:

De HI-titer is het omgekeerde

van de serumverdunning die nog

juist inhibitie geeft van de

hemagglutinatie, rekening

houdend met de startverdunning

van serum

25

Well n° SIV - H1N1 SIV – H1N2 / H3N2 Parvovirus

1 2 20 8

2 4 40 16

3 8 80 32

4 16 160 64

5 32 320 128

6 64 640 256

7 128 1280 512

8 256 2560 1024

9 512 5120 2048

10 1024 10240 4096


26

Klinische interpretatie SIV:

• Seroconversie bij gepaarde sera:

‐ Titerstijging x4

‐ bv. H3N2: 40 160 of 160 640


H1N2 / H3N2 interpretatie H1N1

< 20 NEGATIEF < 4

≥ 20 POSITIEF ≥ 4

≥ 320 INFECTIETITER ≥ 64

27

Klinische interpretatie Parvo

• Maternale immuniteit tot 5 mnd

• Negatief, vaccinatie of infectie


titer resultaat interpretatie

< 8 NEGATIEF Niet besmet

≥ 8 POSITIEF Besmet/vaccinatie

> 512 POSITIEF Infectietiter zeug

≥ 256 POSITIEF Infectietiter foeti (>

70 d dracht)

28

• Voordelen

‐ Goedkope test

‐ Duidelijke hoogte titer ~ hoeveelheid antistoffen serum

• Nadelen

‐ Zeer arbeidsintensief

‐ Aflezing vereist ervaring laborant


29

1. Inleiding





4. ELISA


4. Conclusies


30

• Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

• Algemeen principe:

Een Ag-As binding aantonen gebruikmakend van een enzyme als merker en een vaste drager

ELISA detectie mogelijk van:

antigeen

antistoffen

ELISA-varianten:

Direct/indirect

Sandwich/competitieve/blocking

ELISA

31

ELISA – directe antistof-ELISA: PRRSv

Stap 1 Stap 2 Stap 3 Stap 4 Stap 5

Bloed Serum

-

+

- -

+ Wassen +

32


Stap 6 Stap 7

Incubatie

-

NEG POS

-

+

-

+

33


34


35

ELISA – indirecte antistof-ELISA: Auj gE

Stap 1 Stap 2 Stap 3 Stap 4 Stap 5

-

+ +

- -

+ Wassen Serum Bloed

36

ELISA – indirecte antistof-ELISA: Auj gE

Stap 6 Stap 7

-

+ +

-

NEG POS

Stopoplosssing

37

ELISA – antigen-ELISA: rotavirus

Stap 1 Stap 2 Stap 4

Mest

- -

Conjugaat +

-

+ +

Stap 3

-

+ Detectie Ag Wassen

38

ELISA – antigen-ELISA: rotavirus

Stap 5 Stap 6

Incubatie

NEG POS

-

+

-

+

39

• Voordelen

‐ Snelle techniek en werken op vaste drager : grote aviditeit want veel

Ag op kleine oppervlakte : gevoelige testmethode

‐ Men kan richten op welke soort As men wil werken : IgG, IgM…

‐ Gebruik van een enzymatische reactie die een versterking van het

verkregen signaal veroorzaakt : er moet slechts weinig Ag-As

complexen gevormd worden om toch een sterk signaal te krijgen

‐ Standaardisatie (ringtesten)

‐ Automatisatie mogelijk

• Nadelen

‐ Dure commerciële kits

‐ Het coaten van de platen moet met zorg gebeuren : zuiver Ag

noodzakelijk anders daling specificiteit van de test

ELISA

40

1. Inleiding





4. ELISA


4. Conclusies


41

• Objectief

‐ Bekijken of serum poolen een ‘kostenbesparende’ optie

is voor groepsdiagnostiek

‐ Interpretatie bij combinaties van negatieve en positieve

serumstalen

• Materiaal & Methoden

‐ Serumstalen met gekend PRRSv S/P-ratio

‐ Pools van 5 serumstalen

‐ Diverse combinaties van negatieve, zwak, matig en

hoog positieve PRRSv S/P-ratios

Serum poolen – interpretatie?

42

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

0 1 2 3

00001

00011

00002

00111

00012

00003

01111

00112

00022

00013

01112

00122

00113

00023

00222

01122

00123

01113

00033

11122

11112

01222

11113

00223

01132

00133

11123

01322

01133

00233

11232

01332

11233

01333

S/P

-ratio

Codes

Serumpool combinaties


43

• Duidelijk verband tussen aantal positieve dieren

en mate van positiviteit

• Poolen van serumstalen moet toch zeer

omzichtig geïnterpreteerd worden

‐ Slechts bij 5 negatieve stalen of 1 licht positief staal blijft

de pool negatief

‐ Van zodra een sterk positieve of meerdere licht

positieve dieren in de pool = positief!

‐ Indien infectiegraad (% positieve dieren of individuele

titers) van belang is, dan gaat een groot deel van de

informatie verloren!! ALTIJD POSITIEF


44

1. Inleiding





4. ELISA


4. Conclusies


45

Wat hebben we vandaag geleerd?

1. HI-test vereist 4x titerstijging voor seroconversie

2. ELISA ruwe data gewenst: opvragen van S/P,

SN, blocking % en GEEN OD-waarden

3. Serum poolen leidt tot verlies van informatie

Conclusie

Dierengezondheidszorg Vlaanderen vzw

Dank u

46

Documents

Serologische testen in de routine diagnostiek: een update · populatie 100% positief voor de geteste ziekte Maat voor vals-negatieve resultaten ... Algemeen principe precipitatie