Sérodiagnostic d'infection streptococcique par la

recherche d'anticorps anti-streptolysine O

(ASLO)

Elaboré par : YASMERO

2O14

Plan de travail

Introduction

I. Définition

II. La biopathologie

III. Action de la streptolysine sur les hématies

IV. Indication du dosage

V. Recommandations préanalytiques

VI. Techniques d’identification

VII. Interprétation des résultats

VIII. Variations pathologiques

Conclusion

I. Introduction : 1

Lors d'une infection, les bactéries produisent, suivant leur capacité propre, diverses enzymes

renforçant leur pouvoir pathogène. Staphylococcus aureus est probablement le germe le plus

richement doté. Toute fois ce streptocoque béta hémolytique du groupe A (SBHA) est un Cocci Gram

positif responsable de 10 à 40% des angines d’origine bactérienne,

II. Définition : 2

Les anticorps anti-enzymes streptococciques sont des anticorps dirigés contre les enzymes des streptocoques β hémolytiques des groupes A, C et G appartenant à la classification de Lancefield. Ils sont au nombre de 4 : ce sont les anticorps anti-streptolysine O (ASLO), les anticorps anti-streptodornase B (ASD), les anti-streptokinase (ASK) et les anti-streptohyaluronidase (ASH). Dans notre rapport nous nous intéressons aux anticorps anti-streptolysine O.

III. La biopathologie : 2

Les enzymes streptococciques sont des hémolysines ou autres produits extracellulaires sécrétés par Streptococcus pyogenes (groupe A), responsables de la très grande majorité des angines bactériennes, mais aussi par les streptocoques des groupes C et G. La streptolysine O est une toxine cytolytique ou une hémolysine labile en présence d’oxygène, sécrétée par de nombreuses souches de streptocoques du groupe A. Elle est très immunogène, permettant ainsi le dosage des anticorps qu’elle induit : les ASLO. Elle est capable de détruire la membrane du globule rouge ainsi que celle des polynucléaires et des plaquettes.

1 S. Ralandison, African Index Medicus, 2013 2 PRÉCIS DE BIOPATHOLOGIE ANALYSES MÉDICALES SPÉCIALISÉES ; AC ANTI-ENZYMES STREPTOCOCCIQUES,

Biomnis, 2012

IV. Action de la streptolysine sur les hématies

GLOBULE ROUGE

Steptolysine O

1 2

1

3

2

1

4

2

1

5

4

6

6

7

6

V. Indication du dosage : 2

Diagnostics des affections post-streptococciques non suppuratives dues au streptocoque du groupe A, la streptolysine O resposable du rhumatisme articulaire aigu ou RAA,

Ces affections sont issues d’un processus immunologique lié à l’existence d’une communauté antigénique entre des tissus de l’organisme et certains constituants des streptocoques du groupe A. La bactérie n’est jamais retrouvée au niveau des lésions inflammatoires induites à distance de l’infection streptococcique. Les symptômes cliniques ont en commun de se déclarer une à plusieurs semaines après l’infection de départ.

Rhumatisme Articulaire Aigu (RAA) : C’est une complication rare, qui survient deux à trois semaines après une angine streptococcique à Streptocoques du groupe A, non ou mal traitée. Le risque de faire un RAA à la suite d’une angine est de l’ordre de 1 à 3 % ; il concerne plutôt les enfants entre 4 et 15 ans, issus de milieux défavorisés, et les sujets ayant déjà fait un RAA. Elle est encore fréquente dans les pays d’Afrique du Nord et dans les DOM-TOM.

- La maladie de Bouillaud ou forme clinique classique du RAA associe des manifestations articulaires (grosses articulations) et cardiaques (d’autant plus fréquentes que le sujet est jeune). Il semble que l’immunité à médiation cellulaire (lymphocytes T cytotoxiques) joue un rôle majeur dans la pathogénie des troubles cardiaques. Les arthrites seraient dues à la formation de dépôts de complexes immuns circulants au niveau de la synoviale.

- La Chorée aiguë de Sydenham est une autre forme clinique isolée de RAA, qui survient tardivement, 1 à 6 mois après une pharyngite post-streptococcique et plus particulièrement chez les filles entre 5 et 15 ans. Elle est marquée par un début progressif et insidieux avec modification de l’humeur et hypotonie musculaire, suivie par de l’ataxie et des mouvements choréiques anormaux intenses et fréquents. Elle évolue spontanément vers la guérison avec des rechutes possibles à long terme.

- Les manifestations post-streptococciques actuelles sont souvent incomplètes : il peut s’agir

d’une simple monoarthrite ou d’une oligo-arthrite très inflammatoire et douloureuse ou encore de troubles isolés du rythme cardiaque.

VI. Recommandations préanalytiques :

Le prélèvement : Sang prélevé sur tube sec. Sérum non hémolysé, non hyperlipémique et non ictérique.

Les questions à poser au patient : - le patient a-t-il fait une infection à streptocoques A précédemment ? Si oui : date ? - Nature des manifestations cliniques ? - Âge ? - Sujet à risque ?

Conservation et transport : Sérum conservé à + 4 °C puis congelé à – 20 °C pendant 1 an.

VII. Techniques d’identification 3

a. Principe de la détection des anticorps anti-streptolysine O (ASLO)

Le principe repose sur la capacité des ASLO à inhiber l'action de la SLO : c'est une réaction de neutralisation (de la SLO par les ASLO). Finalement la présence d'ASLO sera prouvée par l'inactivité de la streptolysine O alors que l'absence d'ASLO sera montrée par l'activité de la SLO.

- La neutralisation : Dans un premier temps, le sérum décomplémenté du patient est mis en contact avec une préparation fraîchement préparée de SLO (car elle s'inactive rapidement au contact de l'oxygène).

- La révélation : Dans un deuxième temps, et car les immuns complexes ne sont pas visibles directement, des hématies sont rajoutées pour révéler l'activité ou au contraire l'inhibition de la SLO.

Le milieu où la réaction se déroule devient rouge limpide. Celle-ci se fait dans les puits 1 à 8 d’une galerie contenant la streptolysine en quantité croissante, permettant ainsi une quantification des anticorps sériques. Le titre correspond au dernier puits de la galerie ne présentant pas de lyse.

3 Jacques Labescat, Guide des examens complémentaires, 2008

LE PRINCIPE DE L’ASLO - LA NEUTRALISATION

Lorsque le sérum contient des ASLO, ils

forment des immuns complexes en

s'associant à la SLO, la rendant ainsi

inactive.

Lorsque le sérum ne contient pas d'ASLO,

la SLO reste libre et active

LE PRINCIPE DE L’ASLO - LA REVELATION

Si des immuns complexes ont été

formés, la streptolysine est

inactivée. Les hématies baignant

dans un tampon ASO isotonique

restent intactes. Elles sédiment

alors lentement au fond du tube

laissant le surnageant limpide.

Si aucun immun complexe n'a été

formé, par absence d'ASLO, la

streptolysine est active. Les

globules rouges sont alors

hémolysés par la streptolysine O.

L'hémoglobine est libérée et

envahit le milieu lui donnant une

couleur rouge uniforme.

b. Eléments de la réaction :

Sérum frais ou conservé à -20 °

Réactifs et contrôles prêts à l’emploi

Les sérums à tester :

Les réactifs :

C’est un sérum de cheval additionné d’azide de

sodium (inhibiteur des bactéries à Gram négatif) qui

favorise sa conservation.

Il contient des ASLO à un titre connu : 4OO

unités/Ml

On y recherche les ASLO, capables de

neutraliser l’activité héhmolytique de

la streptolysine

Sérums des

patients Sérums de

control positif

SLO

(Réactif 1)

Réducteur

(Réactif 2)

Il constitue l’antigène capable

d’hémolyser les Globules Rouge de

lapin

Il évite l’oxydation donc l’inactivation de la SLO

Tampon

phosphate-

NaCl ph 6,6

(Réactif 3)

GRL (hématies

de lapin)

Il permet la réalisation du réducteur,

puis le mélange sert à diluer les sérums à

titrer.

Son Ph et sa composition favorisent la

réaction Ag-Ac et l’activité de la SLO

Elles constituent la cible spécifique de la SLO

c. Matériel:

Support de barrette

Centrifugeuse

Micropipettes réglables (5-50µL)

Couvercles de microplaques adaptés aux supports

Embouts correspondants

Portoir pour tubes à hémolyse

Etuve ou bain thermostaté à 37°C

Container de déchets contaminés

Eau de Javel

Le support de barrette

d. Mode opératoire : (Selon ASL-Kit de bioMérieux) (biomérieux)

Diluer les sérums à tester au 1/100ème dans le mélange tampon-réducteur : 10µL de sérum+ 990 µL de réactif

Prévoir le nombre de barrettes nécessaires et les placer sur un support Pour chaque sérum, répartir 75 µL de dilution dans chacun des 8 puits d’une barrette à partir

du repère rouge ASL Agiter le support 1 min, par tapotement latéral, pour dissoudre la streptolysine Incuber 15 min à température ambiante (18-25°C) Distribuer 75 µL de suspension à 2% de GRL dans chaque puits des différentes barrettes Agiter doucement le support pour homogénéiser Recouvrir pour éviter la dessiccation, puis incuber:

o Soit 1h15 à 1h30 à température ambiante o Soit 45 min à température ambiante, puis centrifuger 2 min à 2000 tr/min

Effectuer la lecture.

e. La lecture :

Sortir chaque barrette du support et observer latéralement pour noter la présence ou l’absence d’hémolyse dans chacun des puits.

VIII. Interprétation des résultats : 4

Le résultat du patient ne peut être validé que si le résultat du témoin sérum est correct.

o Discussion du témoin sérum (puits N°8)

Composition : GR de lapin + sérum dilué (absence de SLO) Il vérifie la qualité de la suspension de GRL et le comportement du sérum vis-à-vis des GRL, en

l’absence de SLO. Résultat correct attendu : absence d’hémolyse. Les résultats des autres puits peuvent alors

être interprétés. En cas de résultat anormal : il y a hémolyse. Cela peut correspondre à deux éventualités :

o L’anomalie ne concerne qu’une ou quelques barrettes de la série : cela signifie que le sérum correspondant au témoin anormal contient des substances provoquant l’hémolyse des GRL. Tous les puits de la barrette présentent une hémolyse et le résultat obtenu pour ce sérum n’est pas valide.

o L’anomalie concerne toutes les barrettes de la série et tous les puits : cela signifie que les GRL sont hémolysés spontanément, donc non utilisables. Les résultats obtenus avec le sérum de contrôle et les sérums des patients ne sont pas valides. Il faut recommencer toute la série avec une autre suspension de GR.

o Détermination du titre des sérums

A partir du repère "ASL" indiqué sur la barrette, noter le dernier puits de GR entièrement sédimentés donc non hémolysés : il correspond à la plus grande quantité de SLO pouvant être neutralisée par les Ac contenus dans le sérum dilué. Dans ce puits, le nombre d’U.ASLO est ≥ nombre d’U.SLO.

4 Biomérieux

La lecture

- Surnageant incolore

- Colut rouge de GR intacts

= hémolyse nulle (HN)

SLO totalement neutralisée (=intacte)

nbre U.ASLO ≥ nbre U.SLO

- Surnageant rosé, limpide

- Petit culot rouge de GR intacts

= Hémolyse partielle -HP)

SLO partiellement neutralisée (partiellement

active)

nbre U.ASLO < nbre U.SLO

- Surnageant rosé, limpide

- Absence de culot

= Hémolyse totale (HT)

SLO non neutralisée (=active) nbre U.ASLO = 0 ou nbre U.ASLO << nbre U.SLO

Le tableau ci-dessous donne la correspondance entre le numéro du puits (à partir du repère "ASL" indiqué sur la barrette) et le titre du sérum en U.ASLO/mL.

N° du puits 1 2 3 4 5 6 7 8

Titre en U.ASLO/mL ou nature du témoin

1OO 2OO 3OO 4OO 6OO 8OO ≥ 12OO T sérum

Interprétation :

En fonction du contexte clinique, en cas de résultat négatif ou douteux à la fois pour les ASD et les

ASLO, on peut être amené à vérifier la sérologie sur un second prélèvement environ 15 jours plus

tard.

IX. Variations pathologiques 5

Les ASLO apparaissent environ 10 jours après le début d’une infection aiguë, s’élèvent pour atteindre

leur maximum entre la 3e et 4e semaine puis diminuent pour revenir à la normale entre 3 et 6 mois.

Une réinfection entraîne une nouvelle élévation des ASLO selon une cinétique accélérée. Leur dosage

est donc utile au diagnostic des complications post-infectieuses des streptococcies pharyngées. En

revanche, leur augmentation est faible voire nulle après une infection cutanée, car la streptolysine O

est inactivée par le cholestérol de la peau.

Les seuils pathologiques d’anticorps sont variables en fonction des kits, des fabricants et des unités proposées : un titre > ou égal à 200 UI/ml chez l’adulte est considéré comme positif. Il existe des faux

5 Marchou B., Gandois J.M., Bonnet E., Infections à Streptocoques. Encycl Med Chir, Elsevier Paris

l'interprétation

sérodiagnostic positif

si titre › 2OO U.ASLO/mL

Sérodiagnostice négatif

si titre < 2OO U.ASLO/mL

Sérodiagnostic douteux

si titre = 2OO U.ASLO/mL

positifs liés à des réactions croisées avec les streptocoques des groupes C et G, mais aussi dans un certain nombre de circonstances pathologiques : myélomes, lupus, rhumatismes inflammatoires comme la polyarthrite rhumatoïde, certaines atteintes hépatiques avec cholestase, syndromes néphrotiques et quelques hyperlipoprotéinémies. Le sujet sain possède un taux d’anticorps qui varie selon certains facteurs tels que l’âge ou la saison. Par ailleurs, 20 à 30 % des sujets ayant fait une infection à streptocoques A ne produisent pas d’ASLO.

X. Conclusion :

L’interprétation du taux de l’ASLO doit être prudente et doit tenir compte de différents paramètres autres qu’une infection streptococcique. L’élévation du taux d’ASLO doit être toujours associée aux autres critères cliniques et/ou biologiques. Une mauvaise interprétation de l’ASLO est lourde de conséquence car par exemple le diagnostic d’un RAA impose une conduite à tenir rigoureuse, en particulier du point de vue cardiologique