Polymerase Chain Reaction (PCR)

Nama Kelompok :Kelompok B1 :Nur Fatjria S.122210101004Yayan Ika R.122210101024Mas'uliatin Nasucha122210101038Ika Nur Masruroh122210101040Siti Rohmatillah122210101060Rani Firda 122210101066Elok Dea O.122210101070Dwi Citra U.122210101072

Polymerase Chain Reacton (PCR) teknik sintesis dan amplifikasi DNA secara in vitroPrinsip :Dua oligonukleutida pendek (primer) terlebih dahulu harus berhibridisasi pada molekul DNA dan sintesis diperpanjang dg menambahkan deoksinukleotida ke ujung 3-OH oleh DNA polymerase

Teknik PCR didasarkan pada amplifikasi fragmen DNA spesifik di mana terjadi penggandaan jumlah molekul DNA pada setiap siklusnya secara eksponensial dalam waktu yang relatif singkatProses PCR :denaturasi templatannealing (penempelan) pasangan primer pada untai DNA targetextension (pemanjangan atau polimerisasi)

>> di peroleh amplifikasi DNA antara 108 109 kali

Kriteria pemilihan primerPanjang primer 18-24 nukleotida, jika < 15 akan menurunkan spesifisitas hibridisasi dg DNA target, jika > 40 akan menurunkan aktivitas DNA polymerase Suhu leleh (Tm) primer 50-60oC dg selisih Tm antara primer < 5oCUrutan nukleotida yg sama tidak boleh >4 krn akan menurunkan spesifisitasKandungan GC sebaiknya 40-50oCUjung 3 kedua primer saling berkomplemen

Mencari CDS gen DA target dari situs http://www.ncbi.nlm.nih.gov

Membuka program primer 3Plus

Pada kotak yang tersedia, masukan sekuen CDS gen targetMemilih jenis primer, sense primer (left primer), antisense (right primer) dan probe untuk hibridisasi (internal oligo)

Menambahkan opsi lain pada tab seperti General Setting, advance Setting, Internal Oligo, Penalty Weights, dan Sequence Quality

Menentukan beberapa paremeter lain jika diperlukan seperti excluded region, targets, dan included regionMenekan tombol Pick Primers untuk memulai pencarian primer terbaikHasil pencarian akan muncul dihalaman selanjutnya

Primer3Plus akan memberikan bebrapa alternatif pasangan primer yang dapat kita pilih

Nama Left primer dan Right primer, Sekuen kedua primer,Posisi primer pada sekuen referensi, panjang primer, Titik leleh , % GC dan beberapa parameter terkait struktur sekunder yang mungkin terjadiUkuran produk PCRPrimer yang diperoleh diuji spesifitasnya dengan menggunakan Blast di NCBI

Buka laman BLASTNMengatur beberapa parameter yang belum sesuaiMemasukan sekuen primer pada kotak yang berjudul Entery Query SequenceKlik tombol BLAST Akan muncul hasil uji spesifitas

Hasil&Pembahasan

software perlprimer VI.121untuk menentukan primerSebelumnya pada situs ncbi.nlm.nih.gov dipilih CDS nya diprogram software perlprimer pada kotak sequencePada pemilihan primer praktikum kali ini dipilih kondisi sebagai berikut:Primer Tm : 55-60 derajat celciusPrimer length : 20-24 baseAmplified range : 510-150,31000-1100Kemudian dipilih find primer,maka akan muncul pasangan-pasangan primer pada kotak result.

Dipilih tiga pasangan primer

Uji Spesifitas Primer

Uji Spesifitas Primer

Uji Spesifitas Primer

kegunaan dari penetuan spesifitasmengetahui terjadinya kesalahan penempelan primer ditempat yang tidak seharusnya

Thank You

**Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan salah satu metode untuk mengidentifikasi penyakit infeksi. Metode ini dikembangkan untuk mengatasi kelemahan metode diagnosis konvensional seperti imunologi dan mikrobiologi.

*******************