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SELDI-TOF Function and Reproducability Von Gerrit Erdmann Betreuer: Benedict Brors 15.06 2005

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SELDI-TOF SELDI-TOF Function and ReproducabilityFunction and Reproducability

Von Gerrit Erdmann

Betreuer: Benedict Brors

15.06 200515.06 2005

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Was ist SELDI-TOF ?

• SLEDI-TOF: S urface E nhanced L aser D esorption/I onisation T ime o f F ilght

– Form der Massenspektroskopie

– Weiterentwicklung von MALDI-TOF

– Patent bei Ciphergen®

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Wie Funktioniert SELDI-TOF

• In NO-Laser gibt einen kurzen Laserpuls auf den Chip ab

• Proteine desorbiert und wird ionisiert während Matrix die Energie absorbiert

• Beschleunigung über E-Feld und Auftrennung nach Masse/Ladung (m/z) Quotient

Abb.1

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Wie Funktioniert SELDI-TOF

• Proteinchips mit verschiedenen vorbehandelten Oberflächen– Ermöglicht es bestimmt Proteine anzureichern

Abb.3 Abb.4

Abb.2

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Einsatzgebiete von SELDI-TOF

Abb.5

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Einsatzgebiete von SELDI-TOF

• Biomarker Discovery• Expression Difference Mapping TM

• Interaction Difference Mapping TM

• Antibody-Antigen Interaction• DNA Protein Interaction• Protein Purification• Glycosylation Analyses• uvm.

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Beispiel eines SELDI-TOF Experiments

• Untersuchung von Eierstockkrebs durchgeführt 2002 von Petricoin et al.

• „black box aproach“• 3 Messreihen insgesamt, 2 aber später

1. 216 Serum Proben: 50 normal , 50 Krebs als Trainingsdaten. 116 verdeckte Proben (50 normal , 50 Krebs, 16 benigne) mit Ciphergen H4 Proteinchip, baseline-subtraction“

2. Die Proben von 1. aber mit einem WCX2 Proteinchip, baseline-subtraction

3. Neue Proben. 91 normal 162 Krebs. Auftrennung in Trainingsdaten nicht angegeben

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Die Durchführung

• Massen Auflösung ständig überprüft– Genauigkeit 0,1%

• 0-20000 Da als Zielgröße• Positiv und Kontrollproben gleichzeitig,

vermischt auf einem und mehreren Chips• Serum von einer Normalprobe auf 100

verschieden Chips – 9 davon zufällig für „Coefficient of Variance“

(CV) benutzt ( 8 Proteinpeaks)

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Die Auswertung

• Normalisierung der Daten [0,1]• 15 200 M/Z Werte mit einem Genetischen

Algorithmus und Cluster Analyse untersucht– Fitness Test ergibt Satz an „features“ der

Trainigsdaten am besten trennt

• Anwendung auf die Verdeckten Daten mit 3 Kategorien

• „baseline-subtraction“ vermutlich erst nach Auswertung

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Das Ergebnis für Messreihe 1

• CV < 10%

• 63/66 der verdeckten Kontrollen (95%) richtig als nicht Krebs– 16/16 benigne erkannt

• 50/50 als Krebs erkannt (auch Stage I)100 % Sensitivität und 95 % Spezifität

„positiv predictiv value“ 94 %

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Überprüfung duch Baggerly 2004

• Rohdaten nur für Messreihe 3 verfügbar, Messreihe 1 und 2 nur „baseline-substracted“ ( irreversibel, nichtlinear)– Resultate nur für Messreihe 3

reproduzierbar

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Ein Wechsel im Protokoll ?

• In Messreihe 1, Erkennung aller 16 benignen wegen deutlicher Unterschiede

• In Messreihe 2 kein deutlichen Unterschiede wegen Ähnlichkeit der zwischen 1 u. 2 vermutlich

Protokollwechsel

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Daten „offset“ und Übertragung auf Messreihe 3

• Abweichung bei M/Z Value von ca. 1% zwischen 2 und 3

• Versuch der Korrektur

• „feature“ Sätze von 2 funktionierten nicht für 3

• Ungekehrt sehr schwierig ; Hinweise auf Signalsättigung

Abb.6

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Fazit

• Perfekte Seperation von 3 möglich , aber im „Noise-bereich“, z.T. auch bei 1 und 2

• sehr seltsam da kein biologischer Hintergrund Unterscheide in Vorbereitung der Proben

• Keine Generalisierung der „feature“ Sets• z.T. Set nicht stabil genug für „baseline-substraction“

• Massenkalibrierung unzureichend bei 3• Werkseinstellungen

• Protokollwechsel in Messreihe 1 Struktur Erkennung theoretisch möglich,

Ergebnisse aber vermutlich nicht Verwertbar, gewisse „baseline-subtraction“ sinnvoll

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Ausblick

• Verbesserung der Vergleichbarkeit auch zischen verschiedenen Studien

• vollautomatische, robotisierte Flüssigkeitshandhabung

– Verbesserung der des CV von ca. 45 % auf ca. 27%

• Einführung von „replicates“ • Auswahl der Peaks

– SNR ≥ 1,25: CV 53,3 %– SNR ≥ 2 : CV 26,4 %

• Einführung und kontinuierliche Überprüfung von standardisierten Versuchparametern

– Z.B.Trocknungszeitunterschiede von mehr als 25 min vor der Zugabe der Matrixmoleküle kann zu CVs von bis 67 % führen

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Abbildungs- und Literaturverzeichnis

AbbildungensverzeihnisAbb.1: http://arthritis-research.com/content/figures/ar1723-1.jpg

Abb.2: http://www.proteomicsnijmegen.nl/Seldi_pages/possibilities.htm

Abb.3: http://www.genetics.med.ed.ac.uk/cysfib/seldipix/pipette.jpgAbb.4: http://www.mrlaser.com/Reduced%20Size%20Photos/Ciphergen%20Array.JPG

Abb.5: K. Baggerly et al. (2004) Reproducibility of SELDI-TOF protein patterns in serum: comparing datasets from different experiments Bioinformatics, 20, 777-785

Literaturverzeichnis1. K. Baggerly et al. (2004) Reproducibility of SELDI-TOF protein patterns in serum:

comparing datasets from different experiments Bioinformatics, 20, 777-7852. E. Petricoin et al. (2002) Use of Proteomic patterns in serum to identify ovarian

cancer The Lancet, 359, 572-5773. M. Aviado et al. (2005) Optimization and evaluation of surface-enhanced laser

desorption/ionisation time-of-flight mass spectrometry (SELDI-TOF MS) with reversed-phase protein arrays for protein profiling Clin Chem Med 43(2) 133-140

4. http://www.ciphergen.com/