scsR (seed correction for siRNA) Package Vignette

Andrea Franceschini

28 October 2014

1 INTRODUCTION

ScsR (Seed Correction for siRNA), is an R package that provides suitable methods to identify, visualizeand correct for off-target effects in genome-wide siRNA screens. As it has been shown in many otherworks (1,2,3,5), siRNAs do have off-target effects (i.e. other genes are targeted apart those for whichthey have been designed for). Off-target effects are still very pronounced even in the newest siRNAlibraries (3) and they are the cause of very high false positive rates in all the genome-wide siRNA screens(3,4,5). Off-target effects are mainly mediated by the seed sequence of the siRNA (2,3), that hence actin a miRNA-like fashion.Both artificial siRNA and natural mature miRNAs are in fact RNA molecules of around 21 nucleotidesand they act in a very similar way, being both incorporated in the RISC complex. To be more precise,the siRNA is double stranded but only one strand (the guide strand) can enter in the RISC and hencedownregulate the transcripts (i.e. most of the companies, including QIAGEN, AMBION and DHAR-MACON introduced in 2005 a chemical modification that prevents the other strand to enter in theRISC. In our work we confirm that this chemical modification works very well (3) and that most of theoff-targets are caused by the guide strand only ).ScsR tries to infer the seed-effect (and correct for it) using the siRNA genome-wide screen data. We willshow in this tutorial real case examples of how scsR can get rid of the seed effect on real genome-widescreens.Besides, scsR provides several innovative visualization and utility methods that can help the screenerin visualizing and mining his data.For example, only recently, certain groups have used information acquired from off-target effects topredict which human miRNAs can be effective on the phenotype under study (5). In this context, scsRoffers several statistics that associate a probability value to each seed (so that the effect of the seed canbe determined more reliably), and it maps the seeds automatically to the latest miRNA libraries.

ScsR works best with QIAGEN and AMBION single oligo (i.e. unpooled) genome-wide siRNAs screensand with continuos scores in z-scored form.

ScsR can also correct pooled siRNA libraries (e.g. DHARMACON), but with lower performancesthan correcting unpooled siRNAs screens.We encourage our users to use our benchmark functions to test the results of the correction (and even-tually detect possible errors or misusage of the package).

> library(scsR)

1

In order to use scsR you need a data frame with 3 columns:

1) GeneID (or Gene Name/identifier)

2) siRNA sequence

3) siRNA score

The name of these columns should be: GeneID, siRNA seq and score. If you want to use differentnames then you need to set the appropriate variables when you call the various functions in this package.

In case you are using a pooled library, you have to add one line for every oligo in the pool (i.e. ifgeneX has 4 oligos pooled, you will put 4 rows in the data frame with the same gene identifier, butdifferent oligo sequence).

If you come from Excel and/or Matlab you can generate a text file with the format specified above.Then you can use the following function in order to import the file in a data frame in R:read.table(file name, header=TRUE, fill=TRUE, quote=””, stringsAsFactors=FALSE)

As an example, we use the analyzed data of two genome-wide siRNA screens on the UUKUNIEMIvirus (5), performed with different siRNA libraries: QIAGEN unpooled and DHARMACON pooled. Inboth the screens Hela Cell Lines have been infected by the UUKUNIEMI virus and the data has beencollected and analyzed using latest technologies. Two phenotypes can be inferred from this screen:- infection inhibition (i.e. when the number of infected cells is reduced)- infection enhancement (i.e. when the number infected cells increses )- cell number reduction (i.e. when cell-death and/or block of cell proliferation occurs)- cell number increase (i.e. when increase in cell proliferation occurs)We added to this package the data for the infection phenotype (that we are going to use in the followingexamples ). However we encrypted the siRNA sequences for copyright issues, in a way that preservesthe relation seed vs sequences (i.e. the groups of sequences that share the same seed remain the same)

> data(uuk_screen)

> data(uuk_screen_dh)

> data(miRBase_20)

> head(uuk_screen)

GeneID siRNA_seq score

1 59286 UCAGUUGAGGCACCUCCAAGG -1.962496

2 59286 UCUGCGGCGGGUACAAGUUCC -1.961901

3 59286 UCUUUACUAGGCAGUACCACC -1.838258

4 9793 UGUCCCGUCGGGACGGGUACU -2.050937

5 9793 UCGAACGCUUGUUGAGACUCU -1.995524

6 9793 UUGGCAGCCUGUCAUGAAACC -1.901085

We also provide a function that checks your input data frame for possible problems/inconsistencies.

> uuk_screen <- check_consistency(uuk_screen)

2

For example, it could also be that the library contains multiple instances of the same oligo sequences(i.e. replicates of the same oligo).We do suggest to condense this information, making the median ofthe score of the instances. For an unpooled library, you can use the following function:

> uuk_screen <- median_replicates(uuk_screen)

IMPORTANT NOTE:If instead of the siRNA sequence, you have the target sequence of the siRNA (pay attention that manysiRNA producers do provide target sequences instead of real siRNA sequences !!! ), you must transcribethe target sequence in order to obtain the guide (antisense) strand of the siRNA sequence. In order todo that you can use the transcribe seqs function in our package (look at the documentation for moredetails).

Then, you need to extract the seed from the sequence:

> uuk_screen <- add_seed(uuk_screen)

> uuk_screen_dh <- add_seed(uuk_screen_dh)

Finally you can analyze the screen and get information about the effective seeds.

> seeds <- seeds_analysis(uuk_screen, miRBase = miRBase_20 )

> head(seeds)

seed7 score count countHits ratiosHitsVsCount pvalue sd

1 CUGGUGC -1.3011 64 50 0.7812 9.820200e-38 0.6470

2 CUGGUGU -1.5642 40 34 0.8500 1.949432e-28 0.2948

3 CUGUUUA -1.7256 27 27 1.0000 9.593171e-28 0.2076

4 CGGUUCA -1.7386 29 28 0.9655 2.506075e-27 0.2546

5 CGUGUGC -1.6916 26 26 1.0000 9.623549e-27 0.1967

6 CAGCAGA -1.5824 31 28 0.9032 3.172958e-25 0.2489

miRNA

1 hsa-miR-548q

2 hsa-miR-7978

3 <NA>

4 <NA>

5 <NA>

6 hsa-miR-922

As result, you get back a table containing one line for every seed that is found in your siRNA se-quences. The number of oligos that share the seed sequence is reported, together with their averagescore and their standard deviation.Besides we do provide two different probability values. These probability values reflect the probabilitythat given a set of scores that refer to oligos that share the same seed, you can obtain such scores bychance.The ”pvalue-ks” uses a Kolmogorov Smirnov statistical test to compute the probability that the vectorof oligo’s score relative to a given seed can be drawned by chance from the big vector of all the possiblescores of the genome-wide screen (tipically 80,000 oligos).Differently, the ”pvalue” column do report the p-value that is obtained using an hypergeometric testthat computes the probability that you can obtain such a number of hits by chance (an ”hit” is an oligo

3

having a score that is below a defined threshold, by default the score that limit the top 10% of thescreen).In case you are looking at the seed effect on the opposite direction (i.e. that causes the oligos to havepositive z-scores instead of negative zscores ) you should remember to set to TRUE the ”enhancer”parameter, in order to get a correct p-value.Finally, we do report in a dedicated column the miRNAs that contain the given seed, if any of thosecan be found in the provided miRBase version.

At this point, we can make use of suitable functions to inspect interesting properties of the screenand of its sequences.We can easily plot the top 100 genes of the screen (sorted via median) and display the seed effect thatshows up in the oligos relative to these genes.In this plot the median score of each gene is represented as a black rhombus, while the seed effect ofeach oligo is represented as a colored circle (of size as big as the number of oligos that share the sameseed).This plot can be easily examined manually and can help the screener to distinguish (by eye) the falsepositive genes with respect to the true positives. Ideally a true positive gene should have all its seed tobe NOT effective (i.e. around zero).

> plot_screen_hits(arrange(add_rank_col(uuk_screen), median))

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−4

−2

0

2

4

9793927691146501052689925770353352742361938535652392968605571873299775971610403258036189372515858661663366288495090925746123517642162056133118788866661551100021971015966348662613261691543440273348810946569046208799921020462345106161281089851337516061314927755729613061357415558149341440138560342587355192151888802158517571761768354033797688888775557029212570711257846761003629359493515035609859 62353061818961565565262299349152125930

gene

scor

e

seed_oligos_count

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0

4

8

12

16

−10

−5

0

5

10seed_log_pval_ks

4

Then we can plot the most effective seeds of the screen, using the plot effective seeds head function.In the histograms you can see two bars, that correspond to the average score of the oligos that sharethe same seed. The bars are sorted by this score (the white bar corresponds to a seed that is obtainedwhen the score column of the screen is randomized, and it corresponds to the intensity of the signalthat you would expect by chance).

> plot_effective_seeds_head(uuk_screen)

UGCAGGU

UAAGGUC

UGAGGGC

AAGGCAC

UAGAGAU

UAAGGGA

UGCAGGA

UAGUGGC

UAGUGAU

AGGUUUC

AAUAUAG

AGGUCUU

UAGUGAC

UCAUCAC

UGCAGGC

UAAGGUU

UGAAGAG

AGUAGUA

AAGGCAU

AGAUGGC

−4 −2 0 2 4−4 −2 0 2 4

seed realseed random

5

Another important information that we may want to look at, is the representation of the seed in thelibrary (i.e. in how many oligos each seed is found).In the following plot, for example, we can see that in this QIAGEN library we have about 2000 seeds(over the 16,384 possible seeds) that are contained in at least 10 different oligos in the screen. Hencewe cannot be sure about the effect of most of the possible seeds, because they are not sufficiently rep-resented in the screen.

> plot_seeds_oligo_count(uuk_screen)

●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●

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0 2000 4000 6000 8000

010

2030

40

seed

num

ber

of o

ligos

If we draw the same plot at the level of the oligos (i.e. for each oligo, how many other oligos share thesame seed), we can see that around 50,000 oligos (over 80,000) have their seed contained in at least 10other oligos. Hence, most of the QIAGEN library is covered by a minor number of seeds, and this factis good for the establishment of a our correction method.

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> plot_screen_seeds_count(uuk_screen)

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0 20000 40000 60000

010

2030

40

oligo

num

ber

of o

ligos

with

the

sam

e se

ed

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2 CORRECTION

In order to correct for the off-target effect that is caused by the seed we do provide two alternativemethods.The first, and probably the most powerful, is the ”seed correction”.This method assumes that the seed effect acts in an ”additive” way to the on-target signal. For exampleif we have an oligo X that has score -2, the method computes the average score of the other oligos inthe libraries that contain the same seed as the oligo X. If for example this average score turns out tobe -1.5, we can just subtract this score to the original oligo score to obtain the new ”corrected” score ((-2) - (-1.5) = -0.5 ).

> screen_corrected <- seed_correction(uuk_screen)

> screen_corrected_dh <- seed_correction_pooled(uuk_screen_dh)

> plot_screen_hits(arrange(add_rank_col(screen_corrected), median))

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gene

scor

e

seed_oligos_count

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0

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10seed_log_pval_ks

However, the method assumes also that the correction factor ( -1.5 in the previous example ) shouldbe multiplied by a coefficient c that reflects ”how confident” we are about the correction ( (-2) - c*(-1.5)).The coefficient c can be a constant (e.g. 0.5 ) or it can vary depending on the behavior of the oligosthat share the seed. In particular, we observed the the last approach to be the most successful. Hencefor our algorithm we set c = 0.4 + s (0 <= c <= 1).S is a factor proportional to the score standard deviation of the group of oligos that share the sameseed. The idea is to correct more the groups of oligos that have a lower standard deviation, because weare more confident on the value we are correcting for.However, we observed that the expected standard deviation of the oligos that share a seed strictlydepends on the average score as it can be seen using our plot seed score sd function.Hence we calibrate the variable S accordingly (i.e. we set S to be proportional to the quantile in whichthe standard deviation is found, given the score range ).

> plot_seed_score_sd(uuk_screen)

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−2 −1 0 1 2 3

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

average score of the seeds' oligos

seed

s' o

ligos

sta

ndar

d de

viat

ion

Pearson correlation = 0.6475Spearman correlation = 0.63173

In order to correct pooled libraries, the user should make use of our seed correction pooled function.This function performs a weightened mean of all the seeds’ scores in the pool, as described in (8). Theuser can also decide to try to correct using only the seed having the highest score in the pool ( settinguse all seeds = FALSE ).

9

A second strategy of correction consists in simply discarding all the oligos that give a strong seedeffect on the phenotype (i.e. having a seed average score over a certain threshold).This strategy has the advantage to be more reliable (because we don’t make any assumption on theadditivity of the effect) but less comprehensive (because we often end up discarding many genes becausethey remain with no, or few, oligos).Hence, after correcting with this method, we do suggest the user to look mainly at the genes that areon the very top of the resulting gene list that is obtained.For this function, we offer a large set of parameters (e.g. thresholds) that the user can customize. Pleaselook at the documentation of the function in order to get more insights on this.

> screen_corrected2 <- seed_removal(uuk_screen)

> plot_screen_hits(arrange(add_rank_col(screen_corrected2), median))

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−2

0

2

4

55234642161696229623323481131551362934310054231956447171122451116475585593313486910763578247991572702214968416255297940563635564311613572683418838536625979998455139976073375852690853544643461572899111222864995382623142491844981593109337936664335354046100171671272229507968956271834015794678553742199564153544383145505563231406891039520124310623549222200429412157035522873266228236444215508657455840333882111976552128472755823553475485680764526516862023710700338942212520654893

gene

scor

e

seed_oligos_count

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●

●

0

4

8

12

16

−10

−5

0

5

10seed_log_pval_ks

10

3 BENCHMARKING

After having used a correction method, we may want to benchmark its performances.The most reliable benchmark system consists in comparing the top n genes of the screen (before andafter correction) with a second independent genome wide screen (if available).The higher the number of shared hits, the better is the correction method.Indeed, in our example data set, we compare the hits of our UUKUNIEMI QIAGEN screen with he hitsof a DHARMACON genome-wide screen that has been performed on the same pathogen (we repeat thecomparison for different n and draw a graph).

> benchmark_shared_hits(

+ glA=list(

+ arrange(add_rank_col(uuk_screen), median)$GeneID,

+ arrange(add_rank_col(uuk_screen), log_pval_rsa)$GeneID,

+ arrange(add_rank_col(screen_corrected), median)$GeneID

+ ),

+ glB=list(arrange(add_rank_col(uuk_screen_dh), median)$GeneID),

+ col=c("black", "blue", "green"),

+ title="UUKUNIEMI Infection Inhibitors"

+ )

0 100 200 300 400

010

2030

4050

UUKUNIEMI Infection Inhibitors

number of best hits compared (A = x , B = 400)

shar

ed h

its

11

As you can see in the graph above, the green line (share best hits of CORRECTED QIAGEN withDHARMACON) is always above the black line (share hits of QIAGEN with DHARMACON) and blueline (share hits of QIAGEN with DHARMACON, but with the QIAGEN sorted via RSA method (9),instead of just using the median ).

Similarly, we can benchmark the pooled library (i.e. share best hits of CORRECTED DHARMA-CON with QIAGEN):

> benchmark_shared_hits(

+ glA=list(

+ arrange(add_rank_col(uuk_screen_dh), median)$GeneID,

+ arrange(add_rank_col(screen_corrected_dh), median)$GeneID

+ ),

+ glB=list(arrange(add_rank_col(uuk_screen), median)$GeneID),

+ col=c("black", "green"),

+ title="UUKUNIEMI Infection Inhibitors (pooled)"

+ )

0 100 200 300 400

010

2030

4050

UUKUNIEMI Infection Inhibitors

number of best hits compared (A = x , B = 400)

shar

ed h

its

12

An alternative benchmarking method, and the only choice in case you don’t have a second genome-wide screen, is to look at the increase in the enrichment of gene annotations after correction, mainlythe Gene Ontology Biological Process and the KEGG pathways.We do provide a function that draws an heat map of the enriched annotations for either KEGG or GO.In the example below, we compare the enriched GO Biological Processes of the best 400 genes for threepossible cases: QIAGEN sorted via median, QIAGEN sorted via RSA method, and QIAGEN correctedwith scsR and then sorted via median.As you can see, there is a strong enrichment in significant pathways after we do apply the seed correctionusing scsR.

> em = enrichment_heatmap( list(arrange(add_rank_col(uuk_screen), median)$GeneID,

+ arrange(add_rank_col(uuk_screen), log_pval_rsa)$GeneID,

+ arrange(add_rank_col(screen_corrected), median)$GeneID

+ ),

+ list("No Correction", "RSA", "scsR"),

+ enrichmentType="Process", output_file=NULL,

+ title="UUKUNIEMI Infection Inhibitors", fdr_threshold=0.01,

+ limit=400

+ )

13

No

Cor

rect

ion

RS

A

scsR

regulation of nucleotide catabolic process

regulation of catabolic process

anatomical structure morphogenesis

immune system process

response to UV

regulation of purine nucleotide catabolic process

positive regulation of interferon−beta production

negative regulation of intracellular steroid hormone receptor signaling pathway

regulation of cardiac muscle cell membrane potential

transcription from RNA polymerase II promoter

regulation of transport

negative regulation of cell cycle process

positive regulation of T cell proliferation

regulation of ubiquitin−protein ligase activity involved in mitotic cell cycle

anaphase−promoting complex−dependent proteasomal ubiquitin−dependent protein catabolic process

S phase

regulation of mitotic cell cycle spindle assembly checkpoint

regulation of lipoprotein metabolic process

regulation of immature T cell proliferation in thymus

regulation of immature T cell proliferation

regulation of chromatin assembly or disassembly

positive regulation of spindle checkpoint

positive regulation of cell cycle checkpoint

iris morphogenesis

CRD−mediated mRNA stabilization

sulfur compound metabolic process

triglyceride homeostasis

regulation of transforming growth factor beta1 production

negative regulation of macromolecule biosynthetic process

regulation of immune system process

positive regulation of protein ubiquitination involved in ubiquitin−dependent protein catabolic process

polyamine biosynthetic process

S phase of mitotic cell cycle

sulfide oxidation, using sulfide:quinone oxidoreductase

sulfide oxidation

regulation of programmed cell death

central nervous system development

intracellular transport of viral material

regulation of Cdc42 GTPase activity

regulation of alternative mRNA splicing, via spliceosome

regulation of apoptotic process

acylglycerol homeostasis

homeostasis of number of cells

positive regulation of hydrolase activity

small molecule metabolic process

negative regulation of protein modification process

cellular developmental process

interphase

negative regulation of ubiquitin−protein ligase activity

negative regulation of ligase activity

regulation of interphase of mitotic cell cycle

interphase of mitotic cell cycle

vacuolar acidification

negative regulation of cellular macromolecule biosynthetic process

protein export from nucleus

nitrogen compound transport

developmental process involved in reproduction

negative regulation of biosynthetic process

regulation of cell communication

positive regulation of mitotic cell cycle spindle assembly checkpoint

cell migration involved in gastrulation

negative regulation of ubiquitin−protein ligase activity involved in mitotic cell cycle

antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I

negative regulation of translation in response to stress

regulation of signaling

progesterone receptor signaling pathway

G1/S transition of mitotic cell cycle

organelle fission

cell cycle process

nucleus organization

regulation of cellular catabolic process

ribonucleoprotein complex subunit organization

vagina development

embryonic retina morphogenesis in camera−type eye

cell cycle

cellular component assembly

regulation of cell death

regulation of cell proliferation

regulation of T cell proliferation

positive regulation of defense response

M phase of mitotic cell cycle

regulation of RNA biosynthetic process

transmission of nerve impulse

regulation of cell cycle

response to temperature stimulus

negative regulation of mitotic cell cycle phase transition

negative regulation of cell cycle phase transition

regulation of response to stress

negative regulation of metabolic process

ribonucleoprotein complex localization

ribonucleoprotein complex assembly

maturation of LSU−rRNA from tricistronic rRNA transcript (SSU−rRNA, 5.8S rRNA, LSU−rRNA)

maturation of LSU−rRNA

negative regulation of protein ubiquitination

regulation of T cell differentiation in thymus

oligodendrocyte differentiation

cell cycle phase

regulation of translational initiation in response to stress

positive regulation of transforming growth factor beta1 production

negative regulation of translational initiation in response to stress

regulation of transcription, DNA−dependent

negative regulation of organelle organization

response to endoplasmic reticulum stress

virus−host interaction

nuclear division

mitosis

regulation of defense response

transcription from RNA polymerase III promoter

maturation of 5.8S rRNA

egress of virus within host cell

regulation of mitotic cell cycle

oligodendrocyte development

positive regulation of cell proliferation

regulation of innate immune response

regulation of mitotic cell cycle phase transition

regulation of cell cycle phase transition

mitotic cell cycle

regulation of nuclear division

regulation of mitosis

system process

positive regulation of molecular function

macromolecule modification

multicellular organismal signaling

negative regulation of cellular component organization

nuclear pore organization

regulation of kinase activity

M/G1 transition of mitotic cell cycle

macromolecular complex assembly

ER−nucleus signaling pathway

positive regulation of chromatin assembly or disassembly

positive regulation of cellular metabolic process

cellular response to stress

positive regulation of metabolic process

negative regulation of macromolecule metabolic process

regulation of transferase activity

regulation of catalytic activity

termination of RNA polymerase II transcription

regulation of phosphorylation

positive regulation of innate immune response

methylation

positive regulation of catalytic activity

regulation of protein kinase activity

response to heat

nuclear−transcribed mRNA poly(A) tail shortening

response to topologically incorrect protein

positive regulation of macromolecule metabolic process

mitotic cell cycle checkpoint

regulation of RNA metabolic process

positive regulation of transferase activity

response to unfolded protein

negative regulation of cellular metabolic process

positive regulation of protein metabolic process

regulation of phosphorus metabolic process

positive regulation of kinase activity

regulation of protein phosphorylation

regulation of macromolecule biosynthetic process

regulation of phosphate metabolic process

response to cytokine stimulus

DNA−dependent transcription, elongation

positive regulation of protein kinase activity

regulation of translation

cytokine−mediated signaling pathway

regulation of mitotic metaphase/anaphase transition

negative regulation of nuclear division

negative regulation of mitosis

positive regulation of phosphorylation

positive regulation of protein phosphorylation

transcription, DNA−dependent

cell cycle checkpoint

cellular response to cytokine stimulus

regulation of translational initiation

positive regulation of phosphorus metabolic process

positive regulation of phosphate metabolic process

ribosomal small subunit biogenesis

mitotic spindle checkpoint

regulation of cellular macromolecule biosynthetic process

negative regulation of mitotic metaphase/anaphase transition

transmembrane transport

nuclear−transcribed mRNA catabolic process, deadenylation−dependent decay

cation homeostasis

cellular response to topologically incorrect protein

mitotic spindle assembly checkpoint

regulation of nuclease activity

endoplasmic reticulum unfolded protein response

transcription elongation from RNA polymerase III promoter

termination of RNA polymerase III transcription

cellular response to oxygen−containing compound

positive regulation of protein modification process

cellular response to unfolded protein

negative regulation of translational initiation

cellular cation homeostasis

RNA 3'−end processing

positive regulation of cellular protein metabolic process

metal ion homeostasis

negative regulation of protein metabolic process

positive regulation of nuclease activity

regulation of protein modification process

ribosomal large subunit biogenesis

cellular response to nitrogen compound

mitotic prometaphase

activation of signaling protein activity involved in unfolded protein response

posttranscriptional regulation of gene expression

negative regulation of cellular protein metabolic process

cellular metal ion homeostasis

mRNA 3'−end processing

cellular homeostasis

cellular response to organic nitrogen

DNA−dependent transcription, termination

protein import

negative regulation of translation

chemical homeostasis

cellular chemical homeostasis

metal ion transport

spindle checkpoint

cellular response to endogenous stimulus

cellular macromolecular complex assembly

ion homeostasis

transmembrane receptor protein tyrosine kinase signaling pathway

enzyme linked receptor protein signaling pathway

cellular ion homeostasis

regulation of glucose transport

cellular response to hormone stimulus

response to oxygen−containing compound

spindle assembly checkpoint

nucleobase−containing compound transport

carbohydrate transport

cellular response to peptide hormone stimulus

cellular response to peptide

mRNA transport

mRNA export from nucleus

monosaccharide transport

protein localization to nucleus

nuclear import

glucose transport

regulation of protein metabolic process

response to organic nitrogen

hexose transport

RNA localization

response to nitrogen compound

response to insulin stimulus

cellular response to insulin stimulus

protein targeting to nucleus

protein import into nucleus

cellular component biogenesis

RNA transport

nucleic acid transport

establishment of RNA localization

organelle organization

ncRNA processing

regulation of biological quality

homeostatic process

regulation of cellular protein metabolic process

RNA export from nucleus

insulin receptor signaling pathway

response to endogenous stimulus

response to hormone stimulus

ncRNA metabolic process

cell surface receptor signaling pathway

cellular response to chemical stimulus

response to peptide

symbiosis, encompassing mutualism through parasitism

interspecies interaction between organisms

response to peptide hormone stimulus

cellular response to organic substance

ribosome biogenesis

transition metal ion transport

biosynthetic process

response to organic substance

cellular biosynthetic process

iron ion homeostasis

ribonucleoprotein complex biogenesis

interaction with host

cellular iron ion homeostasis

organic substance biosynthetic process

nuclear transport

nucleocytoplasmic transport

phagosome maturation

RNA splicing

establishment of localization

transport

nuclear export

RNA splicing, via transesterification reactions

iron ion transport

cellular macromolecule biosynthetic process

RNA splicing, via transesterification reactions with bulged adenosine as nucleophile

mRNA splicing, via spliceosome

macromolecule biosynthetic process

rRNA metabolic process

translation

trivalent inorganic cation transport

transferrin transport

ferric iron transport

mRNA processing

rRNA processing

single−organism transport

cellular macromolecule localization

cellular protein localization

RNA processing

reproduction

macromolecular complex subunit organization

protein complex subunit organization

reproductive process

organic substance catabolic process

cellular localization

catabolic process

cellular catabolic process

organic cyclic compound catabolic process

cellular nitrogen compound catabolic process

aromatic compound catabolic process

heterocycle catabolic process

organic cyclic compound biosynthetic process

cellular process involved in reproduction

cellular component disassembly

cellular nitrogen compound biosynthetic process

nucleobase−containing compound catabolic process

aromatic compound biosynthetic process

nucleobase−containing compound biosynthetic process

establishment of localization in cell

heterocycle biosynthetic process

intracellular protein transport

macromolecule catabolic process

gene expression

multi−organism reproductive process

RNA biosynthetic process

intracellular transport

protein localization

cellular macromolecule catabolic process

protein localization to organelle

establishment of protein localization to organelle

macromolecule localization

protein targeting

cytoplasmic transport

protein targeting to membrane

organic substance transport

macromolecular complex disassembly

protein localization to endoplasmic reticulum

viral reproductive process

multi−organism cellular process

viral reproduction

viral infectious cycle

establishment of protein localization to endoplasmic reticulum

protein targeting to ER

SRP−dependent cotranslational protein targeting to membrane

cotranslational protein targeting to membrane

translational elongation

nucleobase−containing compound metabolic process

protein complex disassembly

cellular protein complex disassembly

RNA catabolic process

translational termination

viral transcription

viral genome expression

mRNA catabolic process

establishment of protein localization

nuclear−transcribed mRNA catabolic process

protein transport

nucleic acid metabolic process

multi−organism process

nuclear−transcribed mRNA catabolic process, nonsense−mediated decay

RNA metabolic process

mRNA metabolic process

translational initiation

UUKUNIEMI Infection Inhibitors

20 40 60 80 100

Value

Color Key

14

We can use the same function to benchmark the correction of the DHARMACON pooled genome-wide screen:

> em_dh = enrichment_heatmap( list(arrange(add_rank_col(uuk_screen_dh), median)$GeneID,

+ arrange(add_rank_col(screen_corrected_dh), median)$GeneID

+ ),

+ list("No Correction", "scsR"), enrichmentType="Process", fdr_threshold=0.01,

+ title="UUKUNIEMI Infection Inhibitors (pooled)",

+ )

No

Cor

rect

ion

scsR

cellular response to oxygen levels

regulation of hydrolase activity

negative regulation of macromolecule metabolic process

cellular response to hypoxia

cellular response to decreased oxygen levels

cellular amino acid metabolic process

cytoplasmic transport

oligodendrocyte differentiation

positive regulation of apoptotic signaling pathway

rRNA metabolic process

positive regulation of metabolic process

uterus morphogenesis

proline metabolic process

viral infectious cycle

translational termination

small molecule metabolic process

single−organism transport

oligodendrocyte development

negative regulation of cellular metabolic process

pattern specification process

negative regulation of translational initiation

positive regulation of macromolecule metabolic process

negative regulation of metabolic process

heart development

establishment of localization in cell

cell differentiation

positive regulation of cellular metabolic process

ER−nucleus signaling pathway

organ development

response to endoplasmic reticulum stress

nicotinamide metabolic process

RNA splicing, via transesterification reactions with bulged adenosine as nucleophile

mRNA splicing, via spliceosome

system development

single−organism developmental process

regulation of transcription, DNA−dependent

RNA splicing

RNA biosynthetic process

tissue development

regulation of RNA biosynthetic process

posttranscriptional regulation of gene expression

nucleobase−containing compound biosynthetic process

regulation of RNA metabolic process

cellular nitrogen compound biosynthetic process

aromatic compound biosynthetic process

regulation of biological quality

central nervous system development

nucleobase−containing compound catabolic process

intracellular transport

regulation of protein metabolic process

heterocycle biosynthetic process

RNA splicing, via transesterification reactions

cell surface receptor signaling pathway

cellular developmental process

anatomical structure development

multicellular organismal development

organonitrogen compound metabolic process

RNA catabolic process

organic cyclic compound catabolic process

regulation of cellular protein metabolic process

translational initiation

cellular response to stress

macromolecule catabolic process

cellular macromolecule catabolic process

nuclear−transcribed mRNA catabolic process

cellular catabolic process

organic substance catabolic process

translational elongation

regulation of translational initiation

response to abiotic stimulus

catabolic process

cellular nitrogen compound catabolic process

aromatic compound catabolic process

chemical homeostasis

cellular localization

transmembrane receptor protein tyrosine kinase signaling pathway

enzyme linked receptor protein signaling pathway

nuclear−transcribed mRNA catabolic process, nonsense−mediated decay

mRNA processing

translation

cellular response to oxygen−containing compound

response to endogenous stimulus

organic cyclic compound biosynthetic process

mRNA catabolic process

cellular macromolecule biosynthetic process

heterocycle catabolic process

cation homeostasis

cellular response to chemical stimulus

regulation of cellular macromolecule biosynthetic process

regulation of translation

cellular response to endogenous stimulus

RNA processing

organelle organization

ion homeostasis

response to oxygen−containing compound

cellular homeostasis

cellular cation homeostasis

cellular response to nitrogen compound

protein transport

regulation of macromolecule biosynthetic process

cellular chemical homeostasis

cellular ion homeostasis

response to nitrogen compound

cellular response to organic nitrogen

metal ion homeostasis

establishment of protein localization

biosynthetic process

response to organic substance

cellular metal ion homeostasis

response to hormone stimulus

response to organic nitrogen

protein localization

homeostatic process

macromolecule biosynthetic process

cellular biosynthetic process

organic substance transport

cellular response to hormone stimulus

nucleic acid metabolic process

macromolecule localization

RNA metabolic process

nucleobase−containing compound metabolic process

cellular response to organic substance

cellular response to peptide hormone stimulus

cellular response to peptide

gene expression

organic substance biosynthetic process

response to insulin stimulus

cellular response to insulin stimulus

response to peptide

response to peptide hormone stimulus

multi−organism process

mRNA metabolic process

insulin receptor signaling pathway

metal ion transport

symbiosis, encompassing mutualism through parasitism

interspecies interaction between organisms

transition metal ion transport

iron ion homeostasis

cellular iron ion homeostasis

interaction with host

phagosome maturation

iron ion transport

trivalent inorganic cation transport

transferrin transport

ferric iron transport

UUKUNIEMI Infection Inhibitors (pooled)

5 10 15 20 25

Value

Color Key

15

4 REFERENCES

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