Seminario 6

Microscopa

Microscopa S 6

Figure 9-1 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

Rango de aumentos dos microscopios pticos e electrnicos, e tamao das estruturas para os que se usan

O estudo das clulas dependeu primordialmente do uso do microscopio

Figure 9-1 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

Microscopa S 6

1. Microscopio ptico

Microscopa S 6

1. Microscopio ptico

Instrumento bsico en bioloxa Aumenta ata 1000 veces Permite ver clulas e orgnulos grandes: nucleo, mitocondrias, cloroplastos...

Microscopa S 6

Figure 9-3b Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

Microscopio ptico con fluorescencia

Microscopa S 6

A resolucin mis importante que o aumento!

Poder de resolucin: capacidade para distinguir como separados dous puntos prximos

Microscopa S 6

AN= n sin()

O lmite de resolucin (menor distancia entre dous puntos para que se vexan separados) do microscopio de 0,22 m Esta limitacin est determinada por 2 factores : lonxitude de onda da luz visible (vai de 0,4 a 0,7 m) AN: apertura numrica (poder de captacin da luz que tean as lentes)

Lmite de Resolucin: 0,61 /AN

onde n o ndice de refraccin do medio entre a mostra e o lente, e a metade da anchura do cono de luz recollido polo lente. O valor mis alto de AN 1,4

n aire=1 n aceite=1,4

Microscopa S 6

Campo claro

Campo oscuro Contraste de fases interferencial

Contraste de fases ordinario

Campo claro. A capacidade para distinguir as partes da clula depende do contraste que se obtn ao pasar a luz a travs dos distintos compoentes.

transparente: pouco contraste porque absorbe pouca luz

Varios tipos de microscopios pticos:

Tincin en clulas fixadas para facilitar a observacin.

Microscopa S 6

Figure 9-8 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

Clula viva en cultivo fotografiada con diferentes mtodos de microscopa ptica ideados para aumentar o contraste da imaxe

Campo claro

Campo oscuro Contraste de fases interferencial

Contraste de fases ordinario

En clulas vivas, o microscopio de contraste de fases e o de contraste de fases interferencial convirten as variacins de densidade ou grosor entre as partes da clula en diferencias de contraste.

Microscopa S 6

As protenas e os xenes pdense detectar especficamente usando anticorpos ou sondas de cidos nucleicos

Microscopa S 6

A fluorescencia fenmeno molecular polo que unha substancia absorbe fotns dunha determinada lonxitude de onda e case instantneamente emite fotns dunha lonxitude de onda maior.

O microscopio de fluorescencia permite observar molculas fluorescentes

Microscopa S 6

Cada fluorforo ten un espectro de excitacin e outro de emisin propio, que se detecta en distintas reas do espectro visible (distinta cor).

Microscopa S 6

Ncleo de clula humana hibridado con sondas para os cromosomas 18 (azul claro), X (verde) e Y (vermello). Hai 2 sinais verdes e ningn vermello, polo tanto femenino.

Ncleo hibridado con sondas para os cromosomas 13 (verde) e 21 (vermello). Os tres sinais vermellos indican unha trisoma do par 21.

Aberracins cromosmicas inducidas por radiacin.

a-e cromosomas dicntricos

f-k translocacins terminais

l-p traslocacins intersticiais

r-s fusins cntricas

t-y fragmentos cromosmicos

Microscopa S 6

Algunhas utilidades do microscopio de fluorescencia FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) para estudar distancias e interaccins entre molculas.

Transferencia a un fluorocromo aceptor situado a menos de 10 nm de distancia

Microscopa S 6

Fotoblanqueamento: alteracin do fluorocromo mediante luz lser que agota a fluorescencia de forma irreversible.

a In fluorescence recovery after photobleaching (FRAP), the fluorescence intensity in a small area after bleaching by a short laser pulse is measured using time-lapse microscopy. The recovery kinetics of mobile molecules are dependent on the mobility of a protein. Immobile proteins show no recovery.

Microscopa S 6

Fotoactivacin: conversin a un estado fluorescente por irradiacin.

Microscopa S 6

Eleccin do fluorforo: Asociacin especfica estructura de inters Forte seal (brillo, eficiencia cuntica) e resistencia ao fotoblanqueamento. Ter en conta: lias lser dispoibles, especificacins dos filtros (compatibilidade co noso fluorforo), mximos de excitacin e emisin dos fluorocromos (espectros), separacin espectral para marcaxe mltiple.

Microscopa S 6

O microscopio de fluorescencia confocal permite observar molculas fluorescentes con maior contraste, analizando a fluorescencia emitida por cada punto da mostra.

Microscopa S 6

M. Confocal Ilumninacin restrinxida a un punto da mostra.

O microscopio confocal ilumina un punto da mostra con luz lser e elimina o sinal (luz reflexada ou fluorescencia) que ven de fra do plano de foco.

M. ptica Iluminacin uniforme da mostra A luz recollida procede de fra do plano focal: reduce contraste e resolucin, emborrona.

Microscopa S 6

Fonte de luz puntual Bloquea a luz que procede das reas fra de foco

A cantidade de informacin eliminada depende do tamao do diafragma de deteccin

Os diafragmas (pinholes) deben estar CONFOCALIZADOS

Marvin Minski, 1955

Microscopa S 6

Algunhas utilidades do microscopio de confocal

Microscopa S 6

Proxeccins mximas

Microscopa S 6

Estudos de colocalizacin

Microscopa S 6

Estudos de colocalizacin

Microscopa S 6

2. Microscopio electrnico

Microscopa S 6

2. Microscopio electrnico

Pode acadar unha resolucin moito mellor (menor lmite de resolucin) que a do microscopio ptico porque a lonxitude de onda dos electrns menor que a da luz (ata 0,004 nm: 100.000 veces menor que a da luz visible). A AN mxima de 0,01**. Por tanto, en condicins ptimas o lmite de resolucin do microscopio electrnico de 0,2 nm. Xeralmente s se consigue un lmite de 1-2 nm, por falta de contraste. 2 tipos: . ME transmisin . ME barrido

Lmite Resolucin: 0,61 /AN AN= n sin()

**Os lentes electromagnticos limitan o ngulo de apertura () a 0,5 grados

Microscopa S 6

Figure 9-42 (part 1 of 2) Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

Comparacin da ptica dun microscopio electrnico de transmisin e a dun microscopio ordinario. Este est boca abaixo para facilitar a comparacin. Lentes con bobinas electromagnticas concentran e enfocan feixes de electrns, de modo anlogo a cmo os lentes pticos enfocan a luz.

Fonte de electrns

Soporte dos cortes ultradelgados, cortados con ultramicrotomos

Figure 9-42 (part 2 of 2) Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

Un microscopio electrnico de transmisin

Microscopa S 6

Figure 9-44 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

Dimensins do entramado de cobre estndar no que se poen os cortes ultrafinos sobre unha pelcula delgadsima de carbono ou plstico

Microscopa S 6

Microscopa S 6

Figure 9-47 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

As seccins empregadas en ME de transmisin son tan delgadas (sobre 50 nm) que s mostran unha parte moi pequena de cada orgnulo. Aqu, unha mitocondria ramificada est contida en numerosas seccins. Pdese reconstruir o total a partir de fotografias das seccins.

Microscopa S 6

Figure 9-49 (part 1 of 2) Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

A microscopa electrnica de barrido usa un feixe finsimo de electrns para ir bombardeando a mostra en lias sucesivas (escaneo). Un detector recolle os electrns de baixa energa devoltos pola mostra e con ese sinal modulase a luminosidade dos puntos dunha pantalla dun monitor ao que se lle aplica o mesmo patrn de barrido. na pantalla onde aparece a imaxe por primeira vez. Os electrns non teen que atravesar a mostra, que pode ser moi grande. Non hai que cortala!!!

Microscopa S 6

Figure 9-49 (part 2 of 2) Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

Microscopio electrnico de barrido

Microscopa S 6

Scanning electron micrograph of the asexual reproductive apparatus of Aspergillus niger. Partially freeze-dried

Ollo composto

Microscopa S 6

Microscopa S 6

http://en.wikipedia.org/wiki/Pollen

Microscopa S 6

http://www.guardian.co.uk/science/gallery/2007/jul/24/?picture=330260802

CUESTIONARIO S 6

1. Cal o lmite de resolucin dun microscopio ptico se a mostra se observa a travs de aire? Asume que a lonxitude de onda da luz visible 0,5 micras.

2. Queres comprar un microscopio de investigacin e podes escoller entre dous lentes de obxectivo. Un ten un aumento de x100 de unha AN de 1,1. O outro ten un aumento de x60 e unha AN de 1,3. Cal dos dous escolleras?

3. Identifica con que tipo de microscopio se obtiveron as seguintes imaxes. A B C