STEM CELL DIVISION IS REGULATED BY THE

MICRORNA PATHWAY

MATHEUS ANDRADE RAJÃO

S. D. Hatfield, H. R. Shcherbata, K. A. Fischer, K. Nakahara, R. W. Carthew

and H. Ruohola-Baker

NATURE 2005

Introducão

Dicer

Silenciamento

MicroRNAs e siRNA

Introducão

- Repressão gênica via microRNA:

-Havia registros anteriores de miRNA diferencialmente expressos em células tronco

-Sugeriu-se então que miRNAs poderiam ter um papel na regulação

do caráter tronco

Experimento

Como testar ??? Inibir a via de miRNA

Drosophila melanogaster

dicer 1

dicer 2

Processamento de miRNA

Processamento de siRNA

Proposta: eliminar dicer 1 Elimina miRNA

Pouco efeito em siRNA

Experimento

Células tronco da linhagem

germinativa (GSC)

-Se renovam

-Divisões geram câmaras de células

-Que se diferenciam em blastocistos

Ovário de Drosophila

Experimento 1

- Analisar se a ausência de dcr 1 altera a taxa de divisões celulares

Wild Type

dcr 1 -

Experimento 1

- Vários estágios do desenvolvimento estão faltando nos mutantes em dcr 1

Wild type

dcr 1 -

Inferências obtidas com o experimento 1

-Dcr 1 mutante X heterozigoto

Pouco desenvolvimento das câmarasDicer 1 requerida para produção de linhagem germinativa

- Dcr 2 mutante X heterozigoto (data not shown)

Desenvolvimento normal das câmaras

Indica a participação de somente miRNA, e não siRNA

Experimento 2

A GSC está boa? Está ruim?

Manutenção

Identidade

Divisão

Experimento 2

Confirmar a identidade de GSC, e se ela está no lugar certo

Marcadores de localização e de padrões de expressão

Experimento 2

Presença de espectrassomo confirmada

dcr 1 -

(sem GFP)

Experimento 2

Marcadores de localização e de padrões de expressão

Mad fosforilada:

Indica que a sinalização por TGF-beta está funcionando

Experimento 2

dcr 1 -

(sem GFP)

dcr 1 -

Presença de P-Mad confirmada

Experimento 2

Marcadores de localização e de padrões de expressão

A ausência de BamC, causada pela sinalização

de TGF-beta

Experimento 2

dcr 1 -

(sem GFP)

Segundo os autores, a ausência de BamC foi confirmada

Experimento 3

A GSC está boa? Está ruim?

Manutenção

Identidade

Divisão

Experimento 3

Análise da distribuição dos estágios do ciclo celular nas GSCs mutantes

Corando o ovário com anticorpos específicos para diferentes marcadores celulares

Experimento 3

Os mutantes em dcr-1 apresentaram um acúmulo

de CycE

Porém apresentam os outros marcadores em concentrações

iguais ou reduzidas

Experimento 3

dcr 1 -

(sem GFP)

Isso sugere que os mutantes estão parando a divisão na transição entre G1 e S

Experimento 3

E em machos? Será que a ausência de dicer 1 provoca conseqüências similares?

Cada testículo contém aproximadamente 10 GSCs circundando uma estrutura chamada “hub”

Experimento 3

Hub

Esses dados mostram que em machos a dicer funciona semelhantemente, sugerindo que ela possui

um papel conservado, na evolução, na divisão de GSCs

Experimento 4

Será que a via de miRNA regula o ciclo celular de outros tipos celulares?

Em outros tipos celulares não se observou o acúmulo de CycE. (data not shown)

Dessa forma, a via de miRNA se mostra específica para células tronco

Experimento 5

Será que a parada em G1/S estaria ligada à Dacapo (homólogo de p21/p27, inibidores de CDKs)?

Dacapo sequestra CycE/CDK2 em um complexo estável e inativo, travando o ciclo em G1/S, com uma expressão prolongada de CycE

Mutantes apresentaram mais GSCs coradas para Dacapo

Experimento 5

E se diminuirmos a expressão de Dacapo? O que acontece?

Os níveis de CycE voltaram aos níveis normais

Experimento 5

- Ao que tudo indica, miRNA atua na célula tronco diminuindo os níveis de Dap

- Como isso é feito?

Conclusões

- Propôs-se então um mecanismo da via de miRNA que regula a divisão em células tronco