ROADSHOW LCMS AMÉRICA LATINA AGILENT …quimica.udea.edu.co/~carlopez/cromatohplc/tripleq_agilent_jul_2008.pdf · Capilar de entrada al MS con escudo y N ... • Uso excesivo de

SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

Page 1

Aplicaciones de QQQ (Soluciones Analíticas en Cuantificación con LCMS)

Juan Carlos López Flores, M.ScMarzo-Abril-Mayo Junio , 2008

ROADSHOW LCMSAMÉRICA LATINA

AGILENT TECHNOLOGIES


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Comparación entre cromatogramas con diferentesdetectores, detectabilidad

PesticidasOrganfosforados


Page 3

Consideraciones en la Conexión LC/MS

LCSeparación en fase líquida a alta presiónProduce una alta carga de vaporTemperatura próxima al ambienteSin límites en el intervalo de masasPuede utilizar buffers no volátiles

MSSe necesita alto vacíoTolera una carga de gas limitadaOpera a temperatura elevadaDepende de m/z y del tipo de filtro de masas

Prefiere buffers volátiles

1 ml/min líquido 1 litro/min vapor (aprox)

Interfase¡ La clave del éxito! Opera a elevado vacío

MSLC

Interfases LC/MS: API-Electrospray / API-APCI /APPI/AP-MALDI / FAB-MALDI/ Particle Beam/ Termospray

Filtros MS: Cuadrupolo (Q) / Trampa Iones / QQQ/ TOF /Q-TOF/ Sector Magnético


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Pero antes del MS….¿como se ionizan los compuestos?

+ ++

++ ++

+++-

--

--

+ ++

++

++

++

+-----

++

++++--

+

+++++--

Evap

orac

ión

+

Gotas cargadas

Iones del analitoCalor

Calor o vacío

Electrospray

ExplosionesCulómbicas

Ionización Química a PresiónAtmosférica (APCI)

Analito contenido en el aerosol

Vapor

++ +

+

Calor

++

+ ++

++

+

+Gas reactivocargado

Transferencia de

carga

Decarga Corona

Rocío en un ambiente de cargaLas gotas se evaporan y estallanEvaporación de gotas con un solo ión

Rocío en un ambiente de calorPaso a fase gaseosaLa decarga corona crea ionesOcurre una transferencia de carga quegenera iones


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Funcionamiento interfases individuales (se muestrael modo de ión positivo)

Electrospray Ionización Química a PresiónAtmosférica (APCI)

Calefactor

Desechos

++ + + +++ ++

+++

N caliente2

+ + + ++ + + +++

Waste

N2 caliente

++

+

++

Desechos

Aterrizado

+kV para mantenerla corriente

-3000V


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Fuente multimodo de Agilent: Diseñorevolucionario

Nebulizador (aterrizado)

Electrodo reverso (+vo)

Aguja corona APCI (+vo)

Pin del contraelectrodo APCI

Controlador de la temperaturadel gasLa potencia de los emisores IR escontrolada por retroalimentaciónde un sensor de temperatura en la corriente de vapor en la fuente

Electrodo de carga ES (-vo)

SeparadorAisla iones generadospor ES y APCI

Calefactor infrarrojoAjustado a la frecuencia IR del agua

Calefactor infrarrojoAjustado a la frecuencia IR del agua

Capilar de entrada al MS con escudo y N2 a contracorrientepara secado

Electrodos de ajuste de campo ES

Contenedor térmico

El consumo del gas de secadose reduce ca. 50% comparadocon la fuente normal ESI debidoal calor subministrado por los emisores de IR

Heated N2 counter flow


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Diagrama para optimización para API-LC/MS

AP CI Ne gativeIon De te ctio n

E S-Ne gativeIo n Detection

AP CI Po si tiveIo n Detection

E S- PositiveIo n Detection

Tun e an d Calib rate A PI-MS

A na lyze Test S amp le (1 -10 n g/mL)

E va luate Da ta :Cho ose O ptimal

Mod e ofOp era ti on

Poo r A PCI Sensitiv ity

In cre ase Sa mple pH(0 .1% N H4 OH or TEA)

D ecrease Sam plep H (1% A cetic Acid)

Evalua teD if fe re ntPro be Tem peratu res

Op tim ize Ca pil lar y E xit Vo ltage toO btain CID S tr uctura l In for matio n

μ


Page 8

Optimization Scheme for API-LC/MS – cont.

L C S ep ara tio nDevelop ed ?

No NoAre

cond ition scom pat able

withAPI -M S

Post co lu mna ddition to

a ch ievecom pat a-

bil it y

D eve lo p API -M Sco mpa table LCsepa rat io n (use

p ost-co lu mn add it io n ifnecessary)

Evau ate LC/AP I-MS Me th od for Se nsitiv ity,Spe cific ity, Accura cy, Per ci si on, Lin ea rity

Me tho dM ee ts

A nalysisGoa ls

No E va luate a ll Aspe ctso f Meth od to

Imp rove Resul ts

A nal yze S amp le

Ye s No

Ye s Ye s

Ye s


Page 9

• Reemplazo de buffers no volátiles con buffers volátiles en concentraciones de <10 mM para ES o <100 mM para APCI.

Substituír fosfatos, sulfatos y boratos con acetato o formato de amonio, ácidotrifluoroacético (TFA), ácido heptafluorobutírico (HFBA) o hidróxido de tetrabutilamonio (TBAH)Si se debe emplear un buffer no volátil, usar un buffer donde solo la parte aniónica o catiónica es no volátil, i.e. fosfato de amonio, no fosfato de sodio. La porción no volátil del buffer debe ser ionizable en el modo usado, i.e. fosfato(H2PO4) en modo negativo

• Tener el mismo pH que con aditivos volátiles:Ácido fórmico, ácido acético, TFA, hidróxido de amonio

• Reactivos de par de iones deberán ser volátiles

Adaptación de métodos de LC existentes a LC/API-MS


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Adecuados para ES y APCIMetanolEtanolPropanolIsopropanolButanolAcetonitriloAguaDMF(1)

DMSO(1)

Ácido AcéticoÁcido FórmicoAcetonaCH2Cl2CHCl3

Adecuados solo para APCIToluenoBencenoHidrocarburos

(e.g., Hexano)EstirenoCCl4CS2Hidrocarburos cíclicos

(e.g., ciclohexano)

(1) A menores porcentajes de disolventes (~10% o menos) bajo condiciones ES

Disolventes compatibles: API-MS


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Principales problemas de compatibilidad:

Los iones en disolución son favorables para electrospray, peropueden dar poca retención en fase reversa. Fuerza iónica altay/o buffers no volátiles puedenser difíciles para electrospray

Modos cromatográficos (LC)MODE

Electrospray APCI

Reversed Phase *** **

Normal Phase * ***

Size Exclusion *** *

Ion Pair ** **

Ion Exchange * *

Hydrophobic * *Interaction

Immunoaffinity *** *


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¿Que columna uso con mi método de MS?: Nomenclatura de tecnología de columnas LC

> 5 mL/min> 5 mm I.D.Semipreparative Column Liquid Chromatography

1.5 – 5 mL/min4 – 5 mm I.D.Normal Bore Column Liquid Chromatography

500 – 1500 µL/min> 2 mm < 4 mm I.D.Small (Narrow) Bore Column Liquid Chromatography

100 – 500 µL/min1 - 2 mm I.D.Microbore Column Liquid Chromatography

0.05 – 100 µL/min> 25 µm < 1 mm I.D.Capillary Column Liquid Chromatography

< 50 nL/min< 20 µm I.D.Open Tubular Liquid Chromatography

Flujo típicoDimensiónDescripción


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Flujo de la columna 2 = (ID columna 2)2/(ID columna 1)2 x Flujo de la columna 1

Analítica

Micro

Capilar

Nano

ID Columna Flujo (volume/min)

4.6mm 1.0ml/min

3.0mm 0.42ml/min

2.1mm 0.21ml/min

1.0mm 47μl/min

0.8mm 30μl/min

0.5mm 12μl/min

0.3mm 4.2μl/min

0.2mm 1.9μl/min

180μm 1.5μl/min

100μm 472nl/min

75μm 266nl/min

50μm 118nl/min

Cambios de flujo para mantener la velocidad lineal del disolvente equivalente en el cambio de ID de la columna


Page 14

Factor de ganancia de sensibilidad con unacolumna de ID menor

4.6 2.1 1 0.5 0.3 0.2 0.1

4.6 0 5 20 80 200 500 2000

2.1 0 5 20 50 200 400

1 0 4 10 25 100

0.5 0 3 6 25

0.3 0 2 10

0.2 0 4

A Columna IDDe ID

Factor de ganancia = (ID Columna mayor )2/(ID Columnamenor )2


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Intervalo de volúmenes de inyección para disminuír el ID de la columna (150 mm Column)

Volúmen de columna = 3.14 x (ID Columna/2)2 x Longitud de columna x 0.75

ID Columna Volúmen de columna Inyeción típica intervalo típico deinyección

4.6mm 1900 µl 20 µl 5 - 50 µl

3.0mm 800 µl 10 µl 3 - 30 µl

2.1mm 400 µl 2 µl 0.5 - 15 µl

1.0mm 90 µl 0.5 µl 0.1 - 3µl

0.8mm 60 µl 300 nl 80nl - 2 µl

500 µm 20 µl 150 nl 40 - 500 nl

300 µm 8.00 50 nl 15 - 250 nl

200 µm 4.00 20 nl 5 - 100 nl

180µm 3.00 15.00 4 - 90 nl

100µm 900 nl 10 nl 1 - 10 nl

75µm 500 nl 2 nl 0.5 - 5 nl

50µm 200 nl 0.5 nl 0.1 - 2 nl


Page 16

Un libro reciente de Colborn, Dumanoski y Myers ha llamado la atención

- Reducción de la inmunidad- Fertilidad disminuída- disminución de la inteligencia…


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Pesticidas y disruptores endocrinos


Page 18

Datos en esta parte de la presentación

• Herbicidas ácidos clorinados en suelos

• Pesticidas en agua


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Información general de herbicidas ácidos clorados

• Su uso es popular para matar maleza en jardines y en granos

• Hay una contaminación potencial en pozos de agua porfiltración

• Se requiere de cuantificar en

niveles traza


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Métodos tradicionales de análisis en suelos

• Extracción Líquido-Líquido

• Derivatización con diazometano

• Métodos de GC con ECD y ELCD

• Confirmación con un 2nd instrumento

Problemas:• Uso excesivo de disolvents• Interpretación problemática de datos• Preocupaciones de seguridad por el agente de metilación


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Agilent LC/MSD Single Quad -

Sistema de desarrollo de métodos para el cromatografista• Selectividad del Espectrómetro de masas

– Capacidad de usar mezclas en desarrollo de métodos cromatográficos– Métodos cuantitativos con mayor selectividad que

• DAD• FD• EC

– El costo empieza a cercarse a GC/MS • Propuesta “Facilidad de uso”

– Autocalibración con CDS– Optimización vía FIA


Page 22

Detector

El cuadrupolo es barridosecuencialmente permitiendo el paso de cada m/z en el intervalode masas seleccionado

Full Scan MS


Page 23

Cromatograma Iónico Total (SCAN)


Page 24

Fuente

SIM

• La mejor sensibilidad para cuantificación• Incrementa la selectividad• La cromatografía puede mejorar la especificidad• No da información estructural

Detector

ion guideque transporta

los iones al cuadrupolo

El cuadrupolo solo permite el paso de algunos iones de determinada m/z alcanzar el detector

Iones +/- y neutrosformados en la fuente API


Page 25

SIM


Page 26

- Los herbicidas como fenil urea no se pueden determinar por GC, ya que son térmicamente lábiles.

- Las regulaciones en UK requierendetección y cuantificación tan bajo como0.1ug/l (0.1 ppb).

Determinación de herbicidas fenil urea y triazinaen agua por LC/MS SQ


Page 27

Ión positivo

0.1 µg/L (ppb)

Ión Negativo

0.1 µg/L (ppb)

1. Metamitron

2. Chloridazon

3. Monuron

4. Carbetamide

5. Simazine

6. Cyanazine

7. Chlortoluron

8. Atrazine

9. Isoproturon

12. Propazine

13. Terbuthylazine

14. Prometryn

15. Trietazine

16. Terbutryn

10. Diuron

11. Linuron


Page 28

LC/MSD SQ

• Diseñado para ser un detector de LC, fácil de usar y de bajocosto

• Con sistema de autotune interconstruído, como en un GC/MSD

• FIA (Análisis por Inyección en Flujo) para optimización de parámetros del método

• Método cualitativo; para confirmación de MW y estimación de pureza para síntesis de compuestos nuevos

• Método cuantitativo, mayor selectividad que UV

• SIM cuantifica hasta el nivel de ppt con eficiencia(dependiendo de una mariz limpia o una buena limpieza de muestra)


Page 29

¿Por que LC/MS/MS?

• No requiere derivatización

• Confirmación/cuantificación en un mismo análisis

• Bajos límites de detección en matrices complejas/sucias

• Mejora la eficiencia/productividad del laboratorio

• Más confiable y con resultados defendibles

QQQs son empleados en aplicaciones donde el analista quiere tener la menor preparación de muestra.

Estos normalmente involucran una gran cantidad de muestras con cuantificación de pocos compuestos (en lugar de muchos)


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Filtro cuadrupolarPadre

Q1 Modo de registroselectivo (SRM):Q1 en una sola m/zQ3 en una sola m/zFiltro cuadrupolar

ProductoQ3

Celda de Colisión

Full Scan MS/MS:Q1 en una sola m/zQ3 es scannedDetector

Modelo conceptual de un espectrometro de masascon triple cuadrupolo


Page 31

Triple Cuadrupolo: Full Scan MS/MSLos iones

padres entrana la celda de

colisión y chocan con argón y se disocian

Q1 solo permiteel paso de iones padres

de cierta m/z a la celda de colisión

Q3 es barridopasando todoel productodel scan al

detector

La guía de ionestransporta los

iones a Q1

Detector

Energia

Iones +/- y neutros

formados en la fuente API


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Triple Cuadrupolo: SRM

Q3 solo permite el

paso de ionesproducto de

m/z específica al

detector

Detector

Energy

La guía de ionestransporta los

iones a Q1

Los ionespadres entrana la celda de

colisión y chocan con argón y se disocian

Q1 solo permiteel paso de iones padres

de cierta m/z a la celda de colisión


Page 33

MRM (Multiple Reaction Monitoring); fenilurea

170 210 250 290

210

222

268 280165

Filtro de Masas Cuadrupolar(Q3)Filtro de Masas Cuadrupolar (Q1)

Celda de colisión

Espectro con iones del ruido de fondo (de ESI)

Q1 deja pasarsolo el iónseleccionado 210

190 210

210

La celda de colisión rompe el ión 210

150 170 190 210

210158

191

Q3 monitorea solofragmentoscaracterísticos 158 y 191 del ión 210 paracuantitativo y cualitativo.

160

158

190

191

Sin ruido de fondo


Page 34

La historia del analizador y la búsqueda para tener el menor nivel de ruido

1. Gas de secado a contracorriente y capilar dieléctrico frío para mejorar la desolvatación mientras se minimiza el ruido químico.

2. Guía octapolo de RF, para alta eficiencia en captura de iones mientras que se optimiza la transmisión de iones en todo el intervalo(banda ancha)

3. L1 y L2 RF, mejora la transmisión de iones de masa alta, patentado

4. Cuad 1, cuadrupolo hiperbólico para mejorar la transmisión de iones y la resolución espectral

5. Segmento RF del cuadrupolo, mejora la transmisión de iones a la entrada y salida de la celda de colisión

6. Celda de colisión, celda de alta presión con aceleración lineal que optimiza la fragmentación MS/MS mientras que elimina la contaminación cross-talk aún con tiempos de lectura (dwell) muy cortos. El ensamble del hexapolo con diámetro grande ayuda a la captura de los iones fragmentados.

7. Cuad 2, cuadrupolo hiperbólico para mejorar la transmisión de iones y la resolución espectral

8. Detector de dínodo de alta energía fuera de eje, con compresión de señal Log amp, permite una alta ganancia con cambio rápido de polaridad, larga vida y bajo ruido.

9. Multiplicador con vida extremadamente larga, ya que los iones nunca tocan la superficie, solo los electrones.

9a

Rough Pump Edwards E2M28

Single 3 stage Edwards Turbo Pump

1

2 3 4 5 6 75

8


Page 35

Gas de Colisión

+ Potencial de aceleración axial -

Beam Turn-off Characteristics

10

100

1000

10000

100000

-500 0 500 1000 1500 2000

microseconds

Arb

. Uni

ts

mz922 mz118

Beam Turn-off Characteristics

10

100

1000

10000

100000

-500 0 500 1000 1500 2000

microseconds

Arb

. Uni

ts

mz922 mz118

600μsec

350μsec

Transporte de iones en milisegundos

Nueva celda de colisión con Aceleración Axial por parte de Agilent

Evita efectos de memoria o cross-talk- mediante un transporte de iones de alta velocidad

Maxima sensibilidad- usando un diseño de hexapolo de amplio intervalo de masas

Simple para operar- no utiliza wave forms complicadas


Page 36

Evaluación de Crosstalk 500 pg Alprazolama, 20 ms tiempo de lectura (dwell)

00.5

11.5

22.5

33.5

44.5

55.5

66.5

77.5

8

Abundance vs. Acquisition Time (Min)0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8 8.5 9

+EIC (281.0 m/z) MRM (400.0 m/z); from alprazolam 20 Dwell Cross Talk 500 pg OC -101705-28V_5uL.d

1 1

Area RSD= 0.68%

=> No se detectacross-talk

m/z 309 → m/z 281

m/z 400 → m/z 281

Top scale is225X bottom

1800 cts →

8 cts →


Page 37

Evaluación del tiempo de lectura (Dwell)200 pg Alprazolama, tiempos de 100, 20, 5 ms

2.250.740.61% RSD132021360514860Area

5 ms20 ms100 msDwell

5 ms dwell


Page 38

Sensibilidad con estándard de Reserpinainyectado en columna

100pg

500pg

50pg

10pg5pg1pg0.5pg0.1pgBlanco

1pg

0.5pg

0.1pgBlanco


Page 39

Reserpina en matriz sucia (restos de café) (3 MRMs)inyectados en columna

10pg

5pg

2.5pg1.25pg

0.63pg0.32pg0.16pgBlank

1.25pg

0.63pg

0.32pg

Blank

0.16pg

20pg


Page 40

Procedimiento de extracción de muestra(herbicidas en suelos)- desarrollado por el Depto de Agricultura de Montana

Pesar 20 +- 0.1 g de suelo.

Añadir 50 mL de 0.5N KOH en 10% KCl de disolución de extracción a cada muestra. Mezclar bien por agitación.

Colocar las muestras en agua hirviendo por 15 minutos.

Centrifugar las muestras a 1200-1500 rpm por 15 minutos.

Para cada alícuota de 3.0 mL, añadir 150 µL de ácido sulfúrico 12 N.

Agitar en vortex y confirmar que el pH está < 1.5. Caso contrario, agregar ácido adicional

Colocar las muestras en un agitador horizontal por 15 minutos.


Page 41

Procedimiento de limpieza

Añadir 2 mL de cloroform el extracto.

Retirar la capa inferior de cloroformo en otro tubo de centrífuga. Repetir estos pasos dos veces adicionales

Evaporar el extracto de cloroformo a sequedad

Añadir inmediatamente 4.0 mL de agua grado HPLC, mezclaren el vortex brevemente, sonicar 5 minutos y agitar en el vortex otra vez. Traspasar al vial(20 g a los 4 mL finales)

Vortex 30 seg y centrifugar a 3000 rpm por 2 minutos.

Referirse a nota de aplicación 5989-5246, Julio 2006, para los parámetrosLC y MS/MS.


Page 42

MS: G6410 QQQESI (-) Intervalo de masas: 100-400 amuTiempo de barrido: 300 msGas de secado: 200 oCFlujo de gas: 9 L/minNebulizador: 40 psiCapilar: 3500 VLC: 1200Fase A: 0.04% Ac. acético glacial

en aguaFase B: ACNFlujo: 0.3 mL/minColumna:ZORBAX Extend-C-18

2.1 x 100 mm, 1.8 µm, RRHTColumna: 60 oC1 µL inyección

Time B(%)0 01 402 523 604 1008 1009 0

Parámetros del método (Herbicidas)


Page 43

4x10

0

2

4

6

Abundance vs. Mass-to-Charge (m/z)150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310

-MS (5.666 min) neg_pest_frag60_2000V_200C.d (BP=72858) #1

160.8246.9

226.9

284.8275.8196.8 218.8 294.7262.9154.1

4x10

0

2

4

6


160.8

246.9

226.9 275.7200.8 294.7171.0

5x10

0

0.2

0.4

0.6

0.8


160.8

246.9

227.0275.7196.7 294.9264.8

5x10

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1


160.8

232.8 248.8 275.7197.0 218.8 294.7262.9 306.9154.8

4x10

0

2

4

6


160.9246.9

226.9282.7218.5201.0 302.8262.9

2000V, 200C

2000V, 225C

2000V, 350C

3500V, 200C

2000V, 300C

2,4-DBEfecto de la temperatura del gas de secado

Precursor

MW = 247Cap. V, Gas desecado


Page 44

3x10

01234567

Abundance vs. Mass-to-Charge (m/z)50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300

-MS (3.686 min) MS/MS(239.0 m/z) USGS_pest_ProductION_CE_0.d (BP=8430) #1

239.3

195.3

3x10

01234567


195.3

239.4

3x10

01234567


195.3

123.3159.3 239.3

3x10

01234567


195.3

159.3123.5

3x10

01234567


123.4 195.5159.4

CV = 0 V

CV = 5 V

CV = 10 V

CV = 15 V

CV = 20 V

Picloram Precusor

MW = 239

Efecto del voltaje de la celda de colisión


Page 45

2x10

123

Abundance vs. Acquisition Time (min)3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 4 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 4.8 4.9 5 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 5.9 6

-EIC (146.0 m/z) MRM (190.0 m/z); from mont_neg_10.d Smooth (1)

3.522

2x10

0.5

1

1.5


3.722

3x10

0

0.5

1


4.379

2x10

0

2

4


5.098

3x10

123


5.130

2x10

0.51

1.5


5.327

2x10

2

46


5.481

3x10

1

2


5.497

3x10

0.5

1


5.670

Clopyralid, 7.4 pg

Picloram, 2.3 pg

Dicamba, 10.3 pg

2,4-D, 2.2 pg

MCPA, 6.9 pg

Triclopyr, 1.6 pg

2,4-DP, 1.8 pg

MCPP, 3.4 pg

2,4-DB, 8.6 pg

4x below Montana State LOQ, ESI (-)

Anchos de pico entre 0.1 y 0.2 min

5.8 min3.5 min


Page 46

Linealidad y repetibilidad, Herbicidas (ESI-)10, 20, 40, 80, 200, 400, 800, 8000 pg en columna

0.99732,4-DB

0.9999MCPP

0.99982,4-DP

0.9993Triclopyr

0.9999MCPA

0.99982,4-D

0.9999Dicamba

0.9991Picloram

0.9995Clopyralid

R2

(linear fit, include origin)

Compound

Res

pons

esR

espo

nses

ClopiyralidR2 = 0.9995

DicambaR2 = 0.9999

Cada analito tiene una concentración diferente en la solución estandard. Las concentraciones de la curva mostradas son para Dicamba, las concentraciones paraTriclopyr son: 1.6, 3.1, 6.2, 12.4, 31, 62, 124 y 1240 pg


Page 47

Arcilla Arena CienoTriclopyr 27 22 22

MCPP 6 5 7

MCPA 2 6 5

Clopyralid 14 15 13

2,4-DP 9 8 13

2,4-DB 9 3 9

2,4-D 11 14 13

En columna

3.1 pg

6.8 pg

13.7 pg

14.8 pg

3.5 pg

4.4 pg

17.3 pg

Estudio de repetibilidad en tres matrices (n = 8, 1 ulinyectado)

%RSDs


Page 48

4.4

3.8

3.0

3.85.1

2.79.3

0

5000

10000

15000

20000

25000

Triclop

yrMCPPMCPA

Clopyra

lid2,4

-DP

2,4-D

B

2,4-D

Nivel 20 en aguaNivel 20 en arcillaNivel 20 en arenaNivel 20 en cieno

4.4

3.8

3.0

3.8 5.12.7

9.3

Respuesta del analito (20 pg o menos) paraextractos de agua y suelo

El valor de % de RSD de las 4 respuestas para cada analito se listaarriba de las barras. Tener valores bajos representan el efecto mínimode la matriz


Page 49

Resumen (Herbicidas en suelos)

• Este método LC/MS/MS es rápido, fácil y sensible para la detrminación de herbicidas clorados en suelos

• La eliminación del paso de metilación resulta en eficiencia del laboratorio y la eliminación de un paso con riesgo a la salud

• La cuantificación y la confirmación son logradas en un mismoanálisis (MRM)

• Excelente linealidad para cuantificación

• Buena sensibilidad 4x por debajo del LOQ del estado de Montana

• El método muestra un efecto de matriz mínimo en arcilla, arena y cieno


Page 50

Notificaciones RASFF (Rapid Alert System for Food and Feed) 2004

(Drogas Veterinarias/Estados miembros y países terceros)


Page 51

Notificaciones RASFF 2005(Drogas Veterinarias/Estados miembros y países terceros)


Page 52

Decisión 2003/181/EC

2 μg/kgAquaculture productsΣ malachite/leuco malachite green

1 μg/kg for all

Poultry meat Aquaculture products

Nitrofuran metabolites:

— furazolidone

— furaltadone

— nitrofurantoin

— nitrofuranzone

1 μg/kgPig kidney fatMedroxyprogesterone acetate

0.3 μg/kg

Meat

Eggs

Milk

Urine

Aquaculture products

Honey

Chloramphenicol

MRPLMatrixSubstance

MRPL = minimum required performance limit


Page 53

Cloramfenicol


Page 54

Linealidad del método en diferentes matrices

Chloramphenicol - 5 Levels, 5 Levels Used, 5 Points, 5 Points Used, 0 QCs

Re

lativ

e R

esp

on

ses

Relative Concentration

-0.5

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

5

5.5

6

6.5

7

7.5

8

8.5

-0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 2.2 2.4 2.6 2.8 3 3.2 3.4 3.6 3.8 4 4.2

y = 1.9565 * x + 0.0669R^2 = 0.99967712


Re

lativ

e R

esp

on

ses


-0.250

0.25

0.50.75

1

1.251.5

1.752

2.25

2.52.75

3

3.253.5

3.754

4.25

4.54.75

55.25

5.5

5.756

6.25

-0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 2.2 2.4 2.6 2.8 3 3.2 3.4 3.6 3.8 4 4.2

y = 1.3871 * x + 0.3325R^2 = 0.99854947


Re

lativ

e R

esp

on

ses


-0.5

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

5

5.5

6

6.5

7

7.5

8

-0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 2.2 2.4 2.6 2.8 3 3.2 3.4 3.6 3.8 4 4.2

y = 1.7891 * x + 0.2085R^2 = 0.99890473


Re

lativ

e R

esp

on

ses


-0.5

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

5

5.5

6

6.5

7

7.5

-0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 2.2 2.4 2.6 2.8 3 3.2 3.4 3.6 3.8 4 4.2

y = 1.7027 * x + 0.0150R^2 = 0.99985348

Solvent Honey

Shrimp Chicken


Page 55

Abu

ndan

ceA

bund

ance

- MRM (321.0 -> 152.0)

Ab

und

anc

e

Acquisition Time (min)

2x10

-0.5

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

5

1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 2.2 2.4 2.6 2.8

1.849

- MRM (326.0 -> 157.0)

Ab

und

anc

e


1x10

0

1

2

3

4

5

6

7

1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 2.2 2.4 2.6 2.8

1.818

A

B D

C

Relaciones de iones para CAP y el estándarinterno


Page 56

Sensibilidad para miel en 0.5 ppt CAP

- MRM (321.0 -> 152.0) WorklistData5-r001.d

Ab

un

da

nce


1x10

-0.10

0.10.20.30.40.50.60.70.80.9

1

1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 2.2 2.4 2.6 2.8

1.779Chloramphenicol

Re

lativ

e A

bu

nd

an

ce (

%)


2x10

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 2.2 2.4 2.6 2.8

321 -> 152.0 , 257.0

Ratio=43.1


Page 57

Repetibilidad – 0.1 ppb CAP en miel chloramphenicol d5-chloramphenicol

Quantitative ion (321-152)

Qualifier ion (321-257) Ratio Quantitative

ion ( 326-157) Qualifier ion ( 326-262) Ratio

1 350 165 47.1 262 121 50.42 346 157 45.2 258 114 55.33 346 158 44.6 259 118 49.44 313 164 52.3 267 127 47.65 301 154 49.5 261 121 46.46 313 168 53.6 253 124 49.07 320 160 50.1 228 111 48.68 326 145 44.5 225 113 50.49 317 141 44.5 241 117 48.6

10 290 135 46.6 226 107 47.111 300 138 46.2 253 90 45.712 281 136 48.4 240 90 47.613 303 143 47.3 220 101 45.914 290 140 48.3 214 107 49.815 261 131 50.3 217 101 46.6

RSD 8.11% 8.30% 5.91% 7.67% 9.99% 4.83%


Page 58

2x 1 0

0 .6

0 .8

1

1 .2

1 .4

1 .6

1 .8

2

2 .2

2 .4

2 .6

2 .8

3

3 .2

Ab u n d a n c e v s . Ac q u i s i t i o n T i me ( mi n )1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5 1 6 1 7 1 8 1 9 2 0 2 1 2 2

+ M R M M R M (2 3 6 .0 -> 1 3 4 .3 ) N F re a ls a m p le B la n k _ 1 .d S m o o th (1 )

1 1 2 2 3 3 4 4

2x 1 0

0 .6

0 .8

1

1 .2

1 .4

1 .6

1 .8

2

2 .2

2 .4

2 .6

2 .8

3

3 .2

3 .4

3 .6

3 .8

Ab u n d a n c e v s . Ac q u i s i t i o n T i me ( mi n )1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5 1 6 1 7 1 8 1 9 2 0 2 1 2 2

+ M R M M R M (2 4 9 .1 -> 1 3 4 .2 ) N F _ M R M s p ik e 1 0 0 p p t_ 2 .d S m o o th (1 )

1 0 .0 9 3

1 1 2 2 3 3 4 4

Adición de metabolitos de nitrofuranos en tilapia(100 ppt)

Blanco

AdiciónAMOZAMOZ

SCSC

AOZAOZ

AHAH


Page 59

Reproducibilidad para metabolitos de nitrofuranos

1.050.1AMOZ

2.010.1SC

1.580.1AOZ

8.070.1AH

RSD

(%)

Concentración

(ng/mL)Compuestos

a Cada valor es el promedio de 8 réplicas (n=8).


Page 60

1

1 .5

2

2 .5

3

3 .5

4

4 .5

5

5 .5

6

6 .5

7

7 .5

8

Ab u n d a n c e v s . Ac q u i s i t i o n T i me ( mi n )0 .5 1 1 .5 2 2 .5 3 3 .5 4 4 .5 5 5 .5 6 6 .5 7 7 .5 8 8 .5 9 9 .5 1 0 1 0 .5 1 1 1 1 .5 1 2

+ M R M M R M (3 3 1 .3 -> 2 3 9 .2 ) S p ik e _ B la n k _ 1 .d

1 1 2 2

2x 1 0

0

0 .1

0 .2

0 .3

0 .4

0 .5

0 .6

0 .7

0 .8

0 .9

1

1 .1

1 .2

1 .3

1 .4

1 .5

1 .6

1 .7

Ab u n d a n c e v s . Ac q u i s i t i o n T i me ( mi n )0 .5 1 1 .5 2 2 .5 3 3 .5 4 4 .5 5 5 .5 6 6 .5 7 7 .5 8 8 .5 9 9 .5 1 0 1 0 .5 1 1 1 1 .5 1 2

+ M R M M R M (3 3 1 .3 -> 2 3 9 .2 ) S p ik e 1 0 0 p p t_ 1 .d

1 1 2 2

Adición de Verde de malaquita y Verde de Leucomalaquita en Tilapia (100 ppt)

Blanco

Adición

MGMGLMGLMG


Page 61

Reproducibildad de MG y LMG

2.250.1LMG (m/z 331.3→239.2)

3.520.1MG (m/z 329.3→313.3)

RSD

(%)

Concentration

(ng/mL)Compounds

a Cada valor es el promedio de 8 réplicas (n=8).


Page 62

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

x102

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

x10

0.3

0.5

0.7

0.9

1.1

x10

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

x102

0.2 1.0 1.8 2.6 3.4 4.2 5.0 5.8 0.2 1.0 1.8 2.6 3.4 4.2 5.0 5.8

1.Fumonisina B1

2.Fumonisina B33.Fumonisina B2 2

3m/z=722>334

m/z=706>336

1.Fumonisina B1

2.Fumonisina B33.Fumonisina B2 2

3

m/z=722>334

m/z=706>336

20ppb 2ppb

Fumonisinas: Selected Reaction Monitoring


Page 63

Resultados para Extractos de maíz

n Conc (ppb) RSD (%)Fumonison B1 6 700 8.6Fumonison B2 6 40 6.3Fumonison B3 6 30 7.5


Page 64

AFG2

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

45000

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Abu

ndan

ce

AFG1

r2= 0.99940

100002000030000400005000060000700008000090000100000

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100Conc(ppb)

AFB1

0100002000030000400005000060000700008000090000100000

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100Conc(ppb)

AFB2

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

80000

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Abu

ndan

cer2= 0.9993 r2= 0.9990

r2= 0.9998

Curvas de calibración de aflatoxinas (100-1ppb)


Page 65

0.3

0.5

0.7

0.9

1.1

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

0.3

0.6

0.9

1.2

1.5

0.3

0.5

0.7

0.9

1.1

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

x102

x102

2.Aflatoxin G1

3.Aflatoxin B2

4.Aflatoxin B1

x102

m/z=331>245

m/z=329>243

m/z=315>287

m/z=313>241

x102

Cromatogramas MRM de Aflatoxinas en maíz (2ppb)

2.Aflatoxin G2


Page 66

Repetibilidad de aflatoxinas en extractos de maízen 2 ppb

AFG1 AFG2 AFB1 AFB2

% RSD 5.6 6.5 6.8 3.2

n= 5


Page 67

Amendments to the Drug Price Competition andPatent Term Restoration ActLa bioequivalencia es determinada comparando la velocidad de absorción y eliminación de la droga bajo estudio

– La investigación es hecha con 12-36 sujetos sanos– Estudio cruzado de tratamiento doble– Con adultos sanos – Las muestras pueden ser sangre u orina (3185/99)

En la Disposición 3185/99 se establece que el periodo de eliminación es determinado mediante– Por lo menos tres veces la vida media del principio activo o su metabolito en

sangre o en orina; o– Por lo menos tres veces la vida media de desaparición del efecto farmacológico

agudo.


Page 68

Problemas analíticos en bioequivalencia

•Número de muestras

•Matriz de las muestras

•Requerimientos de intervalo dinámico

•Requerimientos de sensibilidad

•Sistema analítico robusto


Page 69

Cuantificación de Tiotropium en plasma

•Tiotropium is empleado para prevenir la dificultad al respirar o la falta de aliento en pacientes con padecimientos crónicos pulmonares de obstrucción de vías respiratorias, como ocurre con la bronquitis crónicay/o enfisema.•Tiotropium está en la clase de medicamentos llamadosbroncodilatadores.•Funciona relajando y abriendo el paso de aire a los pulmones. •La forma de administración del Tiotropium es por inhalación


Page 70

Condiciones de análisis


Page 71

Determinación de transiciones en QQQ

392

152

170


Page 72

MRM

TIC MRM392 ⇒ 170

TIC MRM392 ⇒152

TIC MRM


Page 73

Resultados de muestra 100 pg Tiotropium/mg plasmaConc extracción 23.8 fg/µl, iny 20 µl, 476 fg en columna


Page 74

Curva de Calibración para Tiotropium


Page 75

Resultados de calibración Alprazolama (LP5)1pg – 10 ng, Modo Positivo ESI

1 pg

5 pg

10 pg

5 ng

10 ng

2 ng

1 ng

0

100000

200000

300000

400000

500000

600000

700000

800000

900000

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000

Abun

danc

e

Amount (pg)

Linealidad Alprazolama

Y=77.2x +1593.4R2=0.9974


Page 76

Agilent MassHunter Quant SW “Batch-At-A-Glance”

Tabla de Batch

Información del compuesto

(Croms+ Especs)

Curva de calibración

+ Asistente

de ajuste de curva

Navegaciónortogonal

céntrica pormuestra o compuesto

Compuestos

Mue

stra

s

Compuestos

Mue

stra

s

Compuestos

Barra de herramientas

Filtrado porOutlier

+Flagging

Ver resultados de un solo compuesto o de variosFiltrarpor tipo

de muestra


Page 77

Asistente de ajuste de curva


Page 78

Nuevo integrador sin parámetros

• El integrador Sin-parámetrosvalida la calidad del picocon base en

• Altura de pico• Área del pico• Ancho del pico• Simetría del pico• Picos unidos a la derecha o a la izq.• Nivel de spikes en un pico


Page 79

Integrador Sin-parámetros con validación de picos

Integrador MSMS

Sin-parámetros

Intergrador tradicional basado en derivadasPicos no integrados

Mala línea base

Picos adicionales

• Integradores tradicionales basados en derivadas

• Requieren el ajuste de los parámetros de integración

• Cerca del Límite de cuantificación tienden a fallar

• Requieren se aplique redondeo (smoothing) para funcionar


Page 80

Intergrador Sin-parámetros con validación de picosRSD 14.0%Resp. Factor 1512

RSD 2.0%Resp. Factor 1546




100 fg

1 pg

10 pg

100 pg

1 ng

• Integrador MSMS sin parámetros• No tiene ningún

parámetro

• Discrimina entre picos yspikes

• Integra correctamente desdeconc. bajas a altas

• Elimina virtualmente la integraciónmanual

Funciona en 4 órdenes de magnitud


Page 81

Intergrador Sin-parámetros con validación de picos

• Integrador MSMS sin parámetros• No requiere redondeo

(smoothing)

Comparación con y sin redondeo

5 iny. de 670 fg deHomocisteína(transición 136 > 90 m/z) .

Area 676

Area 717

Area 631

Area 654

Area 623

Area 667

Area 711

Area 741

Area 620

Area 675RSD 6.7% RSD 5.4%

Picos adicionales


Page 82

Intergrador Sin-parámetros con validación de picos

• Clasifica la calidad del pico como• Aceptado• Inspeccionar• Rechazado

• Permite enfocarse en los picos en cuestión

Alturadel valle

15 %

Pico Aceptado

Altura de valle

39 %

Pico aInspeccionar

Altura devalle

54%

Pico Rechazado


Page 83

Batch-at-a-Glance: Detección de Outlieres


Page 84

Actualización del Agilent 6410: 100 fg Cloramfenicol con relación señal:ruido de > 50:1


Page 85

17β-Estradiol

•Estradiol (17β-estradiol) es una hormona sexual, presente en hombres y mujeres.•Representa el mayor estrógeno en humanos.•Tiene un impacto crítico en el funcionamiento reproductor y sexual, aunque también afecta la estructura ósea•En plasma, estradiol está unido a globulina y a albúmina, con unapequeña porción libre (y biológicamente activa)

•Valor típico <50 ng/ml en la menstruación

17β-EstradiolC18H24O2272.39


Page 86

17β-Estradiol: 100, 50, 10, 1 y 0.5 pg en columna, triplicados

3x10

00.25

0.50.75

11.25

1.51.75

22.25

2.52.75

33.25

3.53.75

44.25

4.54.75

55.25

5.55.75

66.25

6.56.75

77.25

7.57.75

Abundance vs. Acquisition Time (min)0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8

- MRM (271.2 -> 145.1) 07_bE2_50pg-r003.d

1

100 pg

50 pg

10 pg

1 pg


Page 87

Curva ESTD para 17β-Estradiol, 5 niveles (0.5, 1, 10, 50, 100 pg), lineal

beta_Estradiol - 5 Levels, 5 Levels Used, 15 Points, 15 Points Used, 0 QCsR

espo

nses

Concentration (pg)

4x10

-0.2

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

2

2.2

2.4

2.6

2.8

3

3.2

3.4

3.6

-5 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105

y = 359.5838 * x - 147.7005R^2 = 0.99897849


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Para incrementar el desempeño del espectrómetro de masas Triple Cuadrupole 6140 de Agilent TechnologiesPerformance

Compliance (soporte de CFR 21 Part 11)Chip Cube (Máxima sensibilidad)Intervalo de masas extendido (2000 amu)tAutotune soportado para otras fuentes (Multimodo, Chip Cube)Soporte de Atmospheric Pressure Photo Ionization

Software para desarrollo automático de métodos Chip system

QQQ MS


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¿Por que usar LC-Chip?

“Flujo alto”200 μL/min

ChipLC(300 nL/min)

30x incremento de señal


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Cuantificación de proteínas a nivel ultratrazasAqua Peptides en sistema LC-Chip QQQ para análisis de proteínas objetivo

40amol ALEFLR*Triplicado

Pept i de pr ecur sor f r agment quant / qualLFTGHPETLEK 636. 3 716. 4 quantLFTGHPETLEK 636. 3 1011. 6 qualLFTGHPETLEK* 640. 3 724. 4 quantLFTGHPETLEK* 640. 3 1019. 9 qual

ALELFR 374. 7 564. 3 quantALELFR 374. 7 435. 3 qualALELFR* 379. 7 574. 3 quantALELFR* 379. 7 445. 3 qual

HPLC Chip: 43mm Zorbax SB C18nanoPump: 400nL/min, A. water+0.1%FA, B. 95%ACN 0.1%FA

0 min 5%B, 10min 30%B, 12min 80%BCapPump: 3µL/min, 2%ACN waterSample: 0.04fmol/µL * 1µL injection, sample is in 240ng/µL

digested serum

LC-MRM

Time

Abu

ndan

ce

AL ELFR

(379.7 > 574.3)

AL ELFR*

(374.7 > 564.3)


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Number ofTransitionsper group

QQQ inMRM

TOF Full Scan2 ppm Accuracy20-50 pg

1

10

100

300

Instrument Detection Limit10 pg1 pg 100 pg

Screening de pesticidas:Límite de detección por TOF es X y es el “punto de cruce”

QQQ5 msec100+ transitions


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Efecto del incremento de picos en un QQQ y disminución del tiempo de lectura (Dwell time)

0 5 10Time (min)

0 5 10Time (min)


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Conclusiones• Para necesidades de mejor sensibilidad y especificidad que detectoresconvencionales, la espectrometría de masas es el instrumento de elección.

•Para aplicaciones que no requieran la más alta sensibilidad, a costosbajos, existe el cuadrupolo sencillo (SQ)

– Buen punto de entrada a MS– Para desarrollo de métodos

• Análisis cuantitativos de trazas y aún screening con QQQ– QQQ es el instrumento más sensible, especialmente si las transiciones

(compuestos) están entre 1 y 20 (dwell times de 10 ms mínimo)• La fuente multimodo permite el análisis de compuestos sin importar la naturaleza polar de los mismos.

•En suma, Agilent technologies ofrece el portafolio de MS más completo


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Portafolio LC/MS Agilent 6000 Series

TodasTodas laslas ventajasventajas. . TodoTodo el el tiempotiempo..

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ROADSHOW LCMS AMÉRICA LATINA AGILENT …quimica.udea.edu.co/~carlopez/cromatohplc/tripleq_agilent_jul_2008.pdf · Capilar de entrada al MS con escudo y N ... • Uso excesivo de