Research Collection

Doctoral Thesis

Ueber das Patulin und einige andere antibiotisch wirksameStoffwechselprodukte von Pilzen

Author(s): Brzeski, Olgierd Wojciech

Publication Date: 1949

Permanent Link: https://doi.org/10.3929/ethz-a-000092387

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ETH Library

ÜBER DAS PATULIN

UND EINIGE ANDERE ANTIBIOTISCH WIRKSAME

STOFFWECHSELPRODUKTE

VON PILZEN

VON DER

EIDGENÖSSISCHEN TECHNISCHEN

HOCHSCHULE IN ZÜRICH

ZUR ERLANGUNG

DER WÜRDE EINES DOKTORS DER

TECHNISCHEN WISSENSCHAFTEN

GENEHMIGTE

PROMOTIONSARBEIT

VORGELEGT VON

Olgierd Wojciech Brzeski

Dipl Ingenieur-Chemiker

aus Poznan (Polen)

Referent: Herr Prof. Dr. PI. A. Plattner

Korreferent: Herr Prof. Dr. L. Ruzicka

AKADEMISCHE DRUCK-UND VERLAGSANSTALT

t,U\/ IWSBUlfk VVILN

1919

Meinem hochverehrten Lehrer, Herrn Prof. Dr. L. Ruzicka,

möchte ich für seine grosszügige Zuvorkommenheit und Hilfe mei -

nen besten Dank aussprechen.

Ebenfalls danke ich Herrn Prof. Dr. PI. Plattner und

Herrn Dr. B.G. Engel, unter deren Leitung diese Arbeit

durchgeführt wurde, für ihre bereitwillige Hilfe und ihre wert¬

vollen Ratschläge.

Inhaltsverzeichnis

Ueber das Patulin und einige andere antibiotisch wirksame

Stoffwechselprodukte von Pilzen

Theoretischer Teil

Einleitung 1

Die Konstitutionsformel des Patulins 2

Eigene Arbeiten

üeber das Patulin

Allgeneines 7

Analytische Versuche 11

Synthetische Versuche 18

Ueber eine chinhydronartlge Verbindung aus Pénicillium

urticae 20

Ueber ein schwefelhaltiges Antibiotikum aus Verticillium

cinnabarinum und Chaetomium spirale 22

Experimenteller Teil

Arbeiten über die Stoffwechselprodukte von Pénicillium

urticae

Kulturbedingungen und Extraktion 26

Arbeiten über die Konstitution des Patulins 30

Versuche zur Synthese der Dihydro-desoxy-patulinsäure 45

Arbeiten über Gentlsinchinhydron 48

Arbeiten Über das Antibiotikum aus Verticillium cinnabari¬

num und Chaetomium spirale 54

Zusammenfassung 65

Literaturzusammenstellung 67

- 1 -

Theoretischer Tell

Einleitung

Die ersten ltittellungen der sogenannten Oxfordgruppe (l, 14)

Über Penicillin und die aufsehenerregenden klinischen Erfolge des

neuen Chemoterapeutikums lösten, zunächst in der angelsächsischen

Welt, eine Wellt von Untersuchungen aus, die das Ziel verfolgten,

andere antibiotisch wirksame Stoffwechselprodukte von Pilzen zu

finden, unter den Stoffen, die In dieser allerersten Zeit isoliert

wurden, findet sieh ein Antibiotikum, das wegen seiner grossen

Verbreitung von verschiedenen Forschern fast gleichzeitig ent¬

deckt wurde (3, 6, 7, 15, 22, 29, 31, 32, 38, 43, 50, 51, 52).

Es erhielt deshalb mehrere Namen, wie Clavacin (50, 52), Clavi-

formin (15), Patulln (3, 43), Clavatin (6,7) oder Expansin (38),

die sich alle von Namen der Pilze, aus deren Kulturen es isoliert

wurde, ableiten. Die hohe biologische Wirksamkeit des Antibioti¬

kums in vitro gab anfänglich Anlas3*zu ziemlich grossen Hoffnun¬

gen. Obwohl es nur äusserliche Verwendung finden konnte, da es

innerlich ziemlich toxisch wirkt (30, 46, 49), wurde das Produkt

als Mittel gegen schwere Schnupfen und Halsweh in verschiedenen

Versuchen, auch bei der Truppe, ausprobiert (26, 27). Die Resul¬

tate entsprachen aber keinesfalls den Erwartungen, und so ver¬

schwand das Kittel aus der-Medizin ebenso schnell, wie es aufge¬

taucht war.

Die erste eingehende analytische Arbeit über das neue Anti¬

biotikum stammt von H. Raistrick und Mit. (43), die es

Patulln nannten. Sie schrieben dem Patulin die Struktur eines

3-0xymethylen-tetrahydro-comansaure-lactons (Anhydro-3-oxymethy-

len-4-oxo-tetrahydro-pyran-2-carbonsäure) (I) zu, auf Grund von

Resultaten, auf die wir später zurückkommen «erden.

- 2 -

Ihre Formel wurde kurz darauf von Bergel, Morri¬

son, Moss und Hinderknecht (7) ("Clavatln")

und von N a u t a und Mit. (38) ("Expansln") bestätigt. Parallel

zur Konstitutionsaufklfirung ging der Kachweis der Identität all

der Präparate vor sich (6, 7, 15, 29, 33, 38, 50, 52), welche

aus verschiedenen Pilzen erhalten worden waren. Wir werden die

Substanz mit dem Namen Patulln. den H. Raistrick (A3),

der erste Forscher, der sie rein erhielt, ihr gab, bezeichnen.

Die Konstitutionsformel des Patulins.

Raistrick und Kitarbeiter (43) haben, wie wir

schon erwähnten, als erste eine Konstitutionsformel für Patulln

vorgeschlagen. Wir möchten hier nur ihre Haupt-Resultate zusam¬

menfassen und verzichten auf eine Wiedergabe ihrer Kultur- und

Extraktionsmethode.

Die Bruttoformel des Patulins ist C^O,. Es krystallisiert

In schönen farblosen Prismen vom Schmelzpunkt 111 und ist

optisch Inaktiv. Die Bestimmung des aktiven Wasserstoffs nach

Zerewitinoff in Pyridin-Lösung bei 23 zeigt die Anwesenheit

eines aktiven H-Atoas. Es sind keine C-Methylgruppen (Kuhn-Roth)vorhanden. Die Bildung eines Phenyl- und Dinitrophenylhydrazons,sowie eines Acetates werden der Anwesenheit einer leicht enoli-

sierbaren Ketogruppe zugeschrieben, welche auch für die positive

Zerewitinoff-Bestimmung verantwortlich sein soll. Die Substanz

gibt keine Färbung mit Ferrichlorid und ist neutral gegen Lack-

cms. Bei der Behandlung mit einem Ueberschuss an kalter 0,1-n

Natronlauge verbraucht sie aber zwei Aequivalante Alkall. Die

Lesung färbt sich dabei gelb und gibt nach der Neutralisation

eine starke Ferrichlorid-Reaktion. Nach dem Ansäuern lässt sich

kein Pi-tulin mehr daraus zurückgewinnen. Dies wird von Rai¬

strick und Mitarbeitern (4.3) mit der Oeffnung des Lacton-

ftinges in (I) erklärt, die zur Bildung einer ß-Keto- y-oxymethy-len-carbonsäure (II) führen würde.

- 3

höh

OOH

Weiter lässt sich Patulin sowohl durch Kochen mit Alkali

wie auch mit Mineralsäure hydrolysieren. Im ersten Fall werden,

wie bei der kalten Hydrolyse, zwei Aequivalente verbraucht, wo¬

bei aber in der Wärme 0,675 Mol Ameisensäure sich bilden. Letzte¬

re erhält man auch, wenn Patulin in 2-n Schwefelsäure in Stick¬

stoff-Atmosphäre gekocht wird. Ausserden entsteht in ca. 10-proz.

Ausbeute eine krystalline Säure C^H-O,, die als Tetrahydro-co-

mansäure (ill) identifiziert werden konnte. Danach kann man für

die saure Hydrolyse des Patulins folgende Gleichung aufstellen:

C?H60 + 2 H20 C6H80/ + HC00H

Die Lage der Carbonyl- und der Oxymethylen-Gruppe wurde

auf Grund des Abbaus des Patulins bzw. der Hydrierungsprodukte

desselben mit konz. Jodwasserstoffsäure festgestellt.

Aus Patulin wurde in 65-proz. Ausbeute eine Jod-säure er¬

halten. Es handelt sich um E-Jodo-y-keto-n-hexansäure (IV), die

durch Reduktion mit Zink und Salzsäure zu Y-Keto-n-capronsäure

(V) und durch die Bildung von y-Keto-korksäure (VI) bei der Kon¬

densation mit Natrium-malonester charakterisiert wurde. Dies

beweist, dass die Keto-gruppe in y-Stellung zum Lacton-Carboxyl

stehen muss.

AJ

IHjj-COOH HOOC-CH^-CH

ÇH2 ÇH2 ÇH2 -CH2 ÇH2 ÇH2

CH2J CHj-COOH CH CHj—C00H HOOC-CHj—CH2 CHj—C00H

IV V VI

Die hydrolytische Abspaltung der Oxymethylen-Gruppierung konnte

durch vorhergehende Hydrierung vermieden werden: Das Patulin

wurde zu diesem Zwecke mit Platin-cxyd als Katalysator hvdriert

und das nach der Aufnahme von 2 r.ol '/.asserstcff erhaltene Oel

reit konz. Jodwasserstoffsäure und rotem Phosphor bei 150-160°

- 4 -

-CH3

behandelt. Das gebundene Jod wurde durch Kochen mit Zink und

Salzsäure entfernt und das Produkt in Neutralstoffe, Lactone

und Säuren getrennt. Aus der Lactonfraktion erhielt R a i -

8 t r i c k und Mitarbeiter (43) ß-Methyl-caprolacton (VII),

aus den sauren Anteil ß-Methyl-caoronsaure (VIII).

3 j ^"2 ' CH2—COOH^°

VIII

VII

B e r g e 1 und Mitarbeiter (7) isolierten das Patulin aus

Kulturen von Aspergillus clavatus und nannten es deshalb Clavatln.

Sie stellten die Identität ihres Präparates mit denen von

Chain und Mitarbeitern (15) ("Claviformin") und der R a i -

strick- Gruppe (43) ("Patulin") fest. Auch beschrieben sie

einige neue Derivate des Patulins, welche sich vom enolisierten

Carbonyl ableiten, so ein Benzoat und einen Methyläther.

Ihre unabhängigen Beweise für die Formel (I) sind im wesent¬

lichen die folgenden:

1. Die Bildung von ß-n-Propyl-butyrolacton (X) durch er¬

schöpfende Hydrierung von Patulin und darauffolgende Bromierung

und Reduktion des Bromlactons (IX). In der Substanz, die noch 7

Kohlenstoffatome enthält, soll der Lacton-Ring des Patulins er¬

halten geblieben sein. Es konnte sich aber bei dieser energischen

Reaktion auch ein neuer Lacton-King gebildet haben.

-CH2

CH3 ^

2. Die Resultate des Abbaus eines Chlorwasserstoff-Anlage¬

rungs-Produktes (XII) von Patulin:

Patulln I-effeo^CllH17°5C1 SAW*01(XI) (XII)

Die Behandlung von Patulin mit trockenem Chlorwasserstoff in

absolutem Alkohol führte zu einem öligen neutralen Produkt (XI),das durch milde Hydrolyse in eine feste Chlor-säure (XII) über-

- 5 -

ging. Sowohl (XI) wie auch (XII) können mit kochender konz. Jod¬

wasserstoffsäure hydrolysiert werden und liefern die gleiche Jod-

.säure (IV), welche Raistrick aus Patulin direkt erhielt.

Bei der Behandlung mit 2-n Schwefelsäure bilden sich Je ein Mol

Ameisensäure und Salzsäure.

Durch katelytisehe Hydrierung wurde das Chlor-Produkt (XII)

unter Verbrauch von 2 Mol H_ in eine ölige Ketosäure C_H.Q0, (XIII)

übergeführt, welche mit konz. Jodwasserstoffsäure in sehr guter

Ausbeute zu einer krystallisierten Dijod-säure C_H100,J2 abgebaut

wurde.

C7Wl r C7H1004 , C7K10°3J2 * C7H12°3(XII) (XIII) (XIV) (XV)

Letztere schliesslich wurde zur y-Keto-ß-methyl-n-capronsäure

CO. (XV) hydriert, die durch Vergleich mit einem syntheti¬

schen Präparat Identifiziert werden konnte. Die Säure (XV) be¬

sitzt die gleiche Anzahl 1."

enstoffatome wie das Patulin und

enthalt noch die Carboxyl- und die Carbonyl-Gruppe des Patulins.

Es ist anzunehmen, dass die relative Lage der funktionellen Grup¬

pen im Patulin und in diesen Abbauprodukten die gleiche ist.

Raistrick und Mitarbeiter hatten schon auf die

Möglichkeit des Vorhandenseins von verschiedenen tautomeren For¬

men von Patulin (I) hingewiesen: Das Acetat kann man zum Beispiel

nur von einem Enol-Isomeren (ib ev. Ic) ableiten. Sie gaben aber

der Formel (i) den Vorzug, obwohl mit dieser das U-V-Spektrum

(^ax = 2760 2; Igt = 4,3) (7. ?2) und das Fehlen der optischen

Aktivität schwer zu erkläre.', »inö.

0

°\

I In

B e r g e 1 und Mitarbeiter (7) versuchten diese Schwierig¬keit mit der Hypothese zu überwinden, dass das Patulin in vier

verschiedenen tautomeren Formen (I, Ia, Ib, Ic) reagieren kann,

- 6 -

und dass diese koexistieren. Immerhin schien die Formel des

Patulins bis auf die Lage der Doppelblndung abgeklärt zu sein,

una es blieb Aufgabe einer Synthese, diese letzte Einzelheit

festzustellen und die Struktur überhaupt zu bestätigen.

Es wurden auch sofort von zwei Seiten Versuche unternommen,das Patulin zu synthetisieren. Der eine stammt von P u e t z e r

Wield und Barry (42), der andere von Hems und

Mitarbeitern (2,9).P u e t z e r gelang es, ein Patulin-Isomeres (XIX) mit

der Doppelbindung im Pyron-Ring zu erhalten, während die Versuche

von Hems an experimentellen Schwierigkeiten scheiterten und

aufgegeben werden mussten.

P u e t z e r ging vom 3-Keto-butyl-methylöther (XVI) und

vom Methyl-vinyl-keton (XVII) aus und erhielt aus beiden durch

Kondensation zuerst mit Oxalester und dann mit Formaldehyd das

gleiche Diketo-Lacton (XVIII). Letzteres liess sich durch Be¬

handlung mit Schwefelsaure zum gewtinschten Patulin-Isomeren (XIX)

cycllsieren.

XVII nicht isol. XIX

Das Produkt war aber mit dem natürlichen Patulin nicht identisch;

es schttolz bei 87 und war in vitro gegen Staphylococcus aureus

praktisch Inaktiv. Das U-V-Spektrum zeigte hingegen eine grosse

Aehnlichkeit mit jenem des Patulins: das Maximum lag bei 2760 X,und der Logarithmus der t'olekular-Extinktion betrug 4,0 (Patulin:

'œax.^2760 Â' lgfc = 4>30) (7> 32)«

- 7 -

Das Vorliegen einer tautomeren Form konnten P u e t z e r

und Mitarbeiter am Beispiel der homologen Verbindung (XX) nicht

beobachten, ebensowenig die Bildung eines Acetates oder eine

leichte Hydrlerbarkeit. Vielmehr Hess sich (XX) erst unter

Druck zum ungesättigten sekundären Alkohol (XXI) hydrleren, wel¬

cher mit Chromsäure leicht zur Ausgangssubstanz zurück oxydiert

werden konnte.

0 OH

XX XXI

Somit war eine der tautomeren Formeln nach B e r g e 1

und Mitarbeitern (7) durch die Synthese widerlegt. Es war aber

noch möglich, dem Patulin die Formel (I) und dem Enol die ent¬

sprechende (ib) zuzuschreiben, wobei allerdings die erwähnten

Schwierigkeiten (ü-V-Spektrum, Fehlen der optischen Aktivität)wieder auftauchen.

Dies sind die wichtigsten Ergebnisse, welche zur Aufstel¬

lung der Konstitutionsformel (I, Ia, b, c) für das Patulin führ¬

ten.

Die Arbeit von N a u t a und Mitarbeitern (38) tragtnichts wesentlich Neues bei, so dass wir auf eine Besprechungihrer Resultate verzichten können. Erwähnt sei nur, dass sie

durch Hydrolyse mit 20-proz. Schwefelsäure Acetvl-propionvl

erhielten, ein Befund, für den sie weiter keine Erklärung geben.

Eigene Arbeiten

üeber das Patulin.

Wir haben das Patulin im Laufe unserer systematischen Suche

nach neuen Antibioticis mehrmals in Kultur-Filtraten von unbe¬

kannten Pilzen nachgewiesen. Zunächst war unser Ziel lediglich

- 8 -

die Herstellung grosserer Mengen des Antibioticums fur die bio¬

logischen Versuche von Herrn Prof. Dr. E. G K u m a n n,

Leiter des Instituts für spezielle Botanik der E.T.H., der des¬

sen Wirkung auf Pflanzen untersucht (23). Ausserdem war es als

Vergleichsstoff für biologische Tests nützlich.

Herr Dr. L . Ettlinger befasste sich im Institut

für spezielle Botanik der E.T.H. mit der biologischen Seite des

Problems, und wir möchten ihm auch an dieser Stelle für seine

Mitarbeit danken.

Als bester Produzent von Patulin erwies sich das Pénicillium

urticae (Balnler) (Stamm E.T.H. 1634)« Es wurde auf einer Raulin-

Thom-Nährlösung bei 18-22° gezüchtet. Die Aufarbeitung des Kul-

tur-Filtrates bereitete uns keine allzu grossen Schwierigkeiten,

und die Ausbeuten betrugen bis zu 1,5 g pro Liter Nährlösung.

Das Pénicillium urticae produziert neben Patulin eine wei¬

tere Verbindung, den Gentislnalkohol (XXII), den wir aus den

Mutterlaugen des Patullns isolieren konnten. Der Alkohol wurde

zum ersten Mal von Birkinshaw,Bracken und

Raistriek (8) als Nebenprodukt bei der Herstellung von

Patulin aus dem Kultur-Filtrat von Pénicillium patulum erhalten

und als Oxymethyl-hydrochinon (XXII) identifiziert.

OH

H?0HXXII

r>H

Schliesslich fanden wir in gewissen Fällen eine dritt»

Substanz, auf welche wir noch zurückkommen werden.

Die Ausbeute und das Verhältnis der drei Produkte sind von

den Kulturbedingungen stark abhängig (ll).

Das chemische Problem des Patullns fing erst an, uns zu

Interessleren, als es uns beim genauen Studium der Publikationen

von Raistriek (43) und B e r g e 1 (7) bewusst wurde,

dass die Abbauprodukte, deren Konstitution sicher feststeht,kei¬

nen Pyron-Rlng mehr enthalten. Die einzige Ausnahme ist die

Tetrahydro-comansäure (III), welche Raistriek (43) in

Cr

äusserst niedriger Ausbeute durch saure Hydrolyse des Patullns

erhielt. Diese Feststellung und die Schwierigkeit der Interpre¬

tation des U-V-Spektrums veranlassten uns, nach einer anderen

Fonralierung zu suchen, welche die experimentellen Resultate

besser erklären konnte.

Eine eingehende Betrachtung zeigt, dass sich von der Formel

(XXIII) tatsächlich alle .Abbauprodukte ebensogut ableiten lassen

wie von der Struktur (I).

I XXIII

Dies möchten wir an einigen Beispielen durch Vergleich der

zwei Formulierungen zeigen:

0 o

ÙHCOOHJv

^^^

CS, CKr

nicht isol.

HBr

CH. CH^ 0

III

A H.

f^Y 2>^C0 Zn + HCl

i T i

nicht isol.

|2-n H2S04

XXIII

CH,'2S,CO

CH, CH- 03 2

IX X

- 10

"0'

XXVIII

C00H

OOH

Cr-r(rXIII a

HJ

0 *

OCH

CH„J JCH' \CQOH

C7H]o°?J2XIV

CH3 CH?

XV

•

CH2J CH2J

C7Hlo°3J2XIV a

- 11 -

Diese rein schematischen Ueberlegungen konnten natürlich

nicht genügen, um die Richtigkeit der Formel (XXIIl) zu beweisen.

Wir mussten sie noch experimentell stütxen. Es schien uns zunächst

wichtig, das Gerüst des Patulins wenn möglich aufsuklären. Zu

diesem Zweck eignete sich offenbar die Ketosäure (XIII a) unter

den oben formulierten Produkten am besten. Wir versuchten sowohl

auf analytischem wie auch auf synthetischem Wege die Richtigkeit

der von uns vorgeschlagenen Formulierung (XIII a) zu beweisen.

Analytische Versuche.

Der Methylester der Ketosäure (XIII b), den wir auf einem

spater diskutierten Wege erhalten haben, gibt durch Kochen mit

Hydrasinhydrat in Methanol ein substituiertes Pyridazon (XXIV),

das sich mit Brom in Bisessig zum entsprechenden Oxy-pyrldazin

(XXV) dehydrieren lässt. Das Vorliegen von Pyridazin-Derivaten

wurde durch Vergleich der U-V-Spektra der zwei Produkte (XXIV)

und (XXV) mit jenen des aus Lävulinester leicht erhältlichen

3-Metfayl-pyridajiinons-(6) (XXVI) (18, 41, 56) bzw. des 3-Methyl-

-6-oxy-pyrldazins (XXVII) (41) bewiesen.

CH C0CH2CH2C00R

CH3

I NH2NH2

N ^

XXVI

nax- '

Br2 in

I Eisessig

xyCH3

XXVII

*n>ax.= 2900 *i *8« = 3,5

- 12 -

Die Bildung der zwei Pyridazin-Verbindungen oit einer blcyclt-

schen Struktur, von welchen das Pyrldazinon (XXIV) eine Doppelbln¬

dung an einer Verknüpfungsstelle und das Oxy-pyridazin (XXV) dazu

noch einen aromatischen Ring aufweist, wäre auf Grund der Formel

(XIII) ausgeschlossen. Die zwei gemeinsamen Kohlenstoffatome wären

nämlich In beiden Ringen In meta-Stellung zueinander, und das 1st

sterisch unmöglich.

Für unsere Versuche stellten wir die Ketosäure (XIII a) aus

dam Chlor-derivat (XXI a) her, das wir auf einfache Art und in

sehr guter Ausbeute beim Behandeln einer ätherischen Lösung von

Patulin (XXIII) mit Chlorwasserstoff direkt erhielten.

Die Hydrierung des Chlorwasserstoff-Anlagerungsproduktes

(XII a), für das wir den Kamen Chlor-desoxy-patulinsäure verwen¬

den, lieferte uns, wie schon von B e r g e 1 und Mitarbeitern

(7) angegeben wurde, nach Verbrauch von 2 Mol Wasserstoff, die

Säure (XIII a). Wir nennen sie im folgenden Dihvdro-desoxv-patu-

llnsäure. um die Dihydro-desoxy-patullnsäure von eventuell durch

Ueberhydrierung entstandenem Lacton (XXIX) zu befreien, wurde das

Hydrierungsprodukt mit Natronlauge auf Bromthymolblau neutrali¬

siert und die neutrale Losung mit Aether extrahiert (vgl. B e r -

gel und Mit. (7)). Die neutralen Anteile wurden von uns nicht

untersucht.0 CO

XXIX

Wenn man die Hydrierung In Anwesenheit eines wenig aktiven

Palladium-Kohle-Katalysators durchführt, verbraucht die Chlor-

desoxy-patullnsäure (XII a) nur ein Mol Wasserstoff. Es entsteht

in beinahe quantitativer Ausbeute unter Herausspaltung des Chlors

eine neue krystallisierte Verbindung, die Desoxy-patulinsäure

(XXVIII). Durch weitere Hydrierung lässt sie sich in Dihydro-

desoxy-patullnsäure (XIII a) überführen.

Wir wollen die Eigenschaften dieser Verbindungen hier kurz

besprechen.

- 13 -

Die Chlor-desoxy-patulinsäure (XII a) lfisst sich mit 0,1-n

Natronlauge glatt titrieren und verbraucht ein Aequlvalent Alkali.

Das p~ der Säure In Wasser beträgt 4,4 *).

Wenn man die Saure In überschüssiger Lauge löst, wird sie

hydrolysiert: nach 10 Minuten sind schon 3 Aequivalante Lauge ver¬

braucht. Die angesäuerte Lösung gibt eine positive Ferrichlorid-

Reaktion, wie das Patulln selbst nach ähnlicher Behandlung.

Das U-V-Spektrum der Chlor-desoxy-patullnsäure zeigt ein

Maximum bei 2700 A, lg £ = 3,6j es ist also dem Spektrum des Pa-

tulins sehr ähnlich.

Die Chlor-desoxy-patullnsSure gibt mit Dlazomethan in Aether

einen öligen Methylester, aus welchem ein oranges Dinitrophenyl-

hydrazon bereitet wurde, das noch Chlor enthält und keine Khorr'

sehe Reaktion zeigt.

Die Desoxy-patulInsaure kann mit 0,1-n Natronlauge titriert

werden und verbraucht ein Aequlvalent Alkali. Durch elektrooetrl-

sche Titration konnte das p_ der Säure In Wasser bestimmt werden:

es beträgt 4,4 bei 20°.

Auch die Desoxy-patullnsäure 1st aber gegen überschüssiges

Alkali unbeständig. Sie wird bei Zimmertemperatur hydrolysiert

unter Verbrauch zweier Aequlvalent« Lauge. Die angesäuerte Lösung

zeigt die übliche Ferrichlorid-Reaktion, wie sie beim Patulln

beobachtet wurde.

Gegen Säuren 1st die Desoxy-patulinsäure ziemlich stabil.

Erst beim Erhitzen ihrer Lösung in 2-n Salzsäure über 100 wird

sie verändert. Kohlendioxyd wird dabei nicht abgespalten. Als

Produkt der Hydrolyse konnte in niedriger Ausbeute eine Säure

vom Fp 165-167° Isoliert werden. Ihre Bruttoformel ist C-H^O..Das Aequivalentgewicht wurde durch elektrometrische Titration

bestimmt. Der gefundene Wert von 157,0 steht mit dem berechneten

(154,1) In guter üebereinstlamung. Das p» betrug 4,4. Auf Grund

des U-V-Spektrums (\ = 2500 2; lg £ = 3,95) vermuten wir,

dass hier die in der Literatur nicht beschriebene Pyronyl-(3)-

esslgsäure (XXX) vorliegt. Zum Vergleich seien hier die Spektra

*) Die elektrometrischen Titrationen verdanke ich Herrn Dr. W.

I n g o 1 d und Herrn W . F r i c k .

_ h -

des Pyrons (25) und des 2,6-Dimethyl-pyrons (25) angegeben, wel¬

che Maxima bei 2450 X bzw. 2470 2 (lg * 4,12 bzw. 4,12) aufwei¬

sen. 0

I JT T300H

XXX

Die gleiche Pyronyl-essigsäure (XXX), aber in noch geringerer

Ausbeute, erhielten wir durch Ansäuern und Extraktion einer Lö¬

sung von Desoxy-patulinsäure in überschüssigem Alkali, also nach

alkalischer Hydrolyse. Das Produkt gab mit dem durch saure Hydro¬lyse erhaltenen Präparat keine Depression.

Das U-V-Spektrum der Desoxy-patulinsäure selbst (A =-

max.= ?6R0 A, lg £ = 4,10) ist wiederum Jenem des Patulins sehr ähn¬

lich.

Der ölige Desoxy-patulinsäure-methylester weist ein Maximum

bei 2650 8, lg C = 3,95 auf. Seine Molekularrefraktion beträgtM_ = 40,49 und zeigt somit eine Exaltation von EMp = + 0,71.

Der Acetyl-acrylsSure-Hthylester zeigt eine KM von + 1,28 (4).Das Dinitrophenylhydrazon des Methylesters ist ein schön

krystallisiertes, blutrotes Derivat.

Die Desoxy-patulinsäure lässt sich unter keinen Bedingungenzu einem Enol-Acetat acetylieren und verhält sich also in dieser

Hinsieht anders als das Patulin, das sehr leicht in Patullnacetat

übergeht.

Die gesättigte Dihydro-desoxv-patullnsäure ist ölig und lässt

sich nicht destillieren, so dass sie leider nicht analysiert wer¬

den konnte. Sie wurde, in Anlehnung an die Angaben von B e r g e 1

und Mitarbeitern (7), durch Herstellung eines Dinitrophenylhydra-zons und eines p-Phenyl-phenacyl-esters charakterisiert.

Ausserdem stellten wir den Methylester dar. Er ist ölig,lässt sich aber im Hochvakuum unzersetzt destillieren. Seine Mo¬

lekularrefraktion beträgt Mp = 40,73 und die Exaltation somit

EMD = + 0,48.

Mach Angaben von I. M. Nazarov und Mitarbeitern

(39, 40) weisen Tetrahydropyron-Derlvate Exaltationen von + 0,3 bis

- 15 -

zu +0,8 auf. Das Tetrahydropyron selbst zeigt eine molekulare

Kraltation von Ekp = +0,4 (17).Das Dinitrophenylhydrazon des Methylesters ist gelb.Die Interessanteste Eigenschaft der Dihydro-desoxy-patulin-

säure ist ihre Beständigkeit gegen Alkalien. Sie verbraucht auch

nach längerem Stehen in Überschüssiger 0,1-n Natronlauge nur ein

Aequlvelent Alkali.

Zum Schluss möchten wir unsere analytischen Resultate kurz

diskutieren.

Für die Dlhydro-desoxy-patullnsàure kann man die Formel

(XIII a) als gesichert betrachten, auch wenn der synthetischeBeweis noch aussteht. Als Beweise der Formel (XIII a) liegen vor:

1. Bildung eines Pyridazinons (XXIV) und eines Oxy-pyridazins(XXV).

2. Stabilität gegen Alkall: letrahydropyrone sind gegen Alkali

stabil.

3. Bildung einer Dljod-ketosäure bei der Hydrolyse mit konz.HJ(7).4* Die Holekularrefraktion des Methylesters.

Aus dieser Formulierung 1st es aber schwierig, Rückschlüsse

auf die Konstitution der Desoxy- und der Chlor-desoxy-patulinsäu-re zu ziehen, und hauptsächlich bleibt die Lage der Doppelblndungin diesen beiden Produkten unsicher.

Das Verhalten der Desoxy-patulinsäure gegen Überschusses0,1-n Natronlauge, d.h. der Verbrauch von 2 Aequivalenten Alkali,1st auf Grund der Formel (XXVIII) alt senlcyclischer Doppelbindungnur unter der Annahme verständlich, dass bei der alkalischen Hy¬drolyse die Doppelbindung in den Ring wandert, und dass sich bei

der Aufspaltung des Pyron-Rlnges somit ein ß-Keto-aldehyd bildet,dessen Eholform das zweite Aequivalent Alkall verbraucht (vgl.Herzlactone, ß-Angellcalacton).

Allerdings *st es nicht ausgeschlossen, dass bei der Ueber-

führung von Chlor-desoxy-patulinsäure In Desoxy-patulinsäure eine

ümlagerung stattfindet, so dass der Chlor-desoxy-säure die Formel

mit semlcycllscher, der Desoxy-säure die Formel mit ringständigerDoppelbindung zukommen konnte.

Immerhin kann man annehmen, dass es sich bei der Desoxy- und

- 16 -

der Chlor-desoxy-patullnsäure tatsächlich um hydrierte Pyron-

Derlvate mit einem Essigsäure-Rest in 3-Stellung handelt. Mr

betrachten deshalb die angegebenen Formeln (XII a) und (XXVIIl)

für Desoxy- bzw. Chlor-desoxy-patullnsäure bis auf die Lage der

Doppelblndung als sehr wahrscheinlich.

Die Formulierungen von B e r g e 1 und Mit. (7), in wel¬

chen eine 3-Methyl-2-carboxy-dihydro-pyron-Struktur angenommen

wird, sind auf jeden Fall unrichtig.

Für das Patulin selbst ist die Sache komplizierter, denn es

ist möglich, dass bei der ziemlich energischen Behandlung mit

Chlorwasserstoff, die zur Bildung der Chlor-desoxy-patullnsäure

führt, eine Italagerung stattfinden könnte. Dies ist aber nicht

sehr wahrscheinlich, well K a t z m a n und Mit. (32) ein "Te-

trahydro-patulln" beschreiben, das sie durch Hydrierung von Patu¬

lin mit Platinoxyd in Wasser erhielten: auf Grund des Schmelz¬

punktes (111,5-112°) und des Spektrums Q^^ = 2660 8, lg l - 3,5)

glauben wir, dass es sich hier um nicht ganz reine Desoxy-patu-

linsäure handelt, so dass dieses Produkt auch in milder Reaktion

aus Patulin herstellbar ist.

Es ist also wahrscheinlich, dass auch das Patulin das Gerüst

einer Pyronyl-3-essigsäure besitzt, unter dieser Voraussetzung

kommen für das Patulin nur die drei folgenden Formeln (XXIII,

XXIII a, XXIII b) In Betracht.

XXIII XXIII a XXIII b

Gegen (XXIII a) spricht erstens das U-V-Spektrum des Patu-

11ns und zweitens die Tatsache, dass die Hydrolyse des Patulins

Ameisensäure, nie aber Kohlendioxyd geliefert hat.

Sonst 1st es, nach unserem Erachten, zur Zelt noch unmöglich,

zwischen den drei Formeln (XXIII, XXIII a, XXIII b) mit Sicher¬

heit zu entscheiden..

Wir glauben, dass das Problem des Patulins erst nach vielen

vergleichenden Versuchen und durch eine eindeutige Synthese end¬

gültig gelöst werden kann.

- 17 -

Zuaammenstellung der untersuchten Verbindungen.

Patulln.

Fp. 109-110,5°,Ü-V-Spektrum: /j. =2770 X; lg t>4,3

Pjf « 0 (neutralT^'Verbrauch an Ubersch. 0,1-n NaOH: 2 Aeq.Farbe des Dlnltrophenylhydrazons: gelb-

XXIII orange

Chlor-desoxy-patullnseure.

Fp. 131-132,5°_

U-V-Spektrun: Ä „,.

. 2700 X; lg £.- 3,6_ / i max.

Verbrauch an Ubersch. 0,1-n NaOH: 3 Aeq.

Farbe des Dlnltrophenylhydrazons des

^jj aMethylesters: orange

0 Cl

6^

erDesoxy-patullnsäure.

COOH Fp. 110-113°Ü-V-Spektrum:-lm„_» 2680 Xj Igt« 4,10

-* y -amax.

Verbrauch an Ubersch. 0,1-n NaOH: 2 Aeq.

XXVIII Farbe des Dlnltrophenylhydrazons des

Methylesters: blutrot

DlhYdro-desoxy-patullnsaure.

COOH Fp. öligVerbrauch an Ubersch. 0,1-n NaOH: 1 Aeq.

Farbe des Dlnltrophenylhydrazons des

Methylesters: gelbXIII a

0Pyronyl-esslgsaure.

r^f^COOH fp. 165-167°I U-V-Spektrm:*^ .2500 Xj Igt -3,95

- 18 -

Synthetische Versuche.

Unsere synthetischen Aibeiten sind aus Mangel an Zeit nicht

über das Stadium von Vorversuchen hinausgekommen.

Es war unsere Absicht, die Jetrahydro-y-pyronyl-(3)-essig-säure ("Dihydro-desoxy-patulinsäure") (XIII a) zu synthetisieren.

Zuerst versuchten wir, den jj,ß>-Dicyan-diäthyl-äther (13)

nach Z i e g 1 e r (57, 58, 59) zun 3-Cyano-4.-oxo-ta%ra-

hydropyran zu cyclisieren, um aus diesem Produkt durch Kondensa¬

tion mit Bromessigester zur gewünschten Verbindung zu gelangen.

>"ir hatten aber keinen Erfolg und erhielten unverändertes Aus-

Ejangsmaterial.

Ein anderer Cyclisierungsversuch, den wir in Anlehnung an

die Angaben von G. B. Bachmann und B. S. Bar¬

ker (5) ausführten, lieferte uns Acrylsäure, neben Polymerisa-

tionsprodukten.

Wir wandten uns dann der klassischen Herstellungsmethode für

Tetrahydro-Y-pyrone (10,17) zu, in' der Absicht, die Lävullnsäure

mit 2 Mol Oxalester zur "Xantocbelidon-essigsäure" (XXXl) zu kon¬

densieren und aus dieser die Chelidon-(3)-essigsäure (XXXII) und

durch Decarboxylierung und Hydrierung die gewünschte Ketosäure

(XIII a) bzw. deren Aethylester (XIII e) zu e: halten.

CO CH3-C0OC2H50

ch3+

cHi -

__ rV^coov5COOR COQR KaOC2H CC

XXXI

COCR COOR ROOC' TJOOR

O 0

l^J"*

b) +2.H2 HOOcJsoxLcOO

COOC H-£ 5

00H

XIII c XXXII

Die Reaktion von LSvulinester mit einem Mol Oxalester ist

von Wislicenus (J4, 55) untersucht worden. Er bewies,

- 19 -

dass die Kondensation an der endständigen Methylgruppe stattfindet.

Wir führten den Versuch In Aether-Losung aus, Indem wir zu¬

erst zwei Mol Qxalsäure-äthyl?«ter und dann 1 Hol Lävulinsäure-

äthylester zu einer Suspension von 2 Mol Natriumäthylat In Aether

zutropften. Wir erhielten wohl ein rotes Natrium-Salz, das wir als

Dlnatriumsalz des Xantochelldon-esslgsäure-triäthylesters (XXXI)

anschauten, allein es gelang uns nicht, das Salz zum Pyron-Derlvat

zu cyclisieren.

Wir probierten darnach, die Dihydro-desoxy-patullnsäure

durch Oxydation aus dem entsprechenden Alkohol, 3-(ß-0xyäthyl)-

tetrahydropyron, herzustellen. Wir gingen vom y-Aceto-propanol

(XXXIII) aus. Diese Verbindung liess sich mit zwei Mol Oxalester

kondensieren und gab ein orange-rotes Dinatrium-Salz (XXXIV).

Letzteres konnte durch Behandeln mit Chlorwasserstoff in Aether

zu einer krystalllnen Verbindung umgesetzt werden, die als 2-Carb-

äthoxy-5-(ß-oxyäthyl)-6-carbory-pyron-lacton (XXXV) erkannt wurde.

Dieses konnten wir zur entsprechenden Carbonsäure (XXXVI) hydro¬

lysleren .

,co.ch: ^h;

,CH2-CH20H

XXXIII

COORICOOR

COORICOOR

XX;-HOOC 0 CO

NaOC2H'

,verd. HCl

ROOC-

ONa NaO

0

ROOC

XXXVI

"0 "CO

XXXV

CH„

C0 XXXIV

HCl-Gas

CK-

/

Wir hätten nun die Säure decarboxylieren und das 3-(6-Oxy-

äthyl)-2-earboxy-pyron-lacton aufspalten, decarboxylieren, hydrie¬

ren und oxydieren sollen zur Tetrahydro-pyronyl-3-esslgsäure

(XXII a). Es gelang uns indessen nicht, die experimentellen

Schwierigkelten bei der ersten Stufe, der Decarboxyllerung, in

der kurzen Zeit, die uns vor dem Abschluss dieser Arbeit zur Ver¬

fügung stand, zu überwinden. Wir mussten deshalb die Versuche an

dieser Stelle unterbrechen.

- 20 -

Ueber eine chlnhydronartlge Verbindung aus

Pénicillium urticae Balnler

Wie wir schon erwähnten, erhielten wir bei der Aufarbeitung

von Kultur-Flltraten von Pénicillium urticae Bainler in einigen

Versuchen neben Patulin und Gentislnalkohol (XXII) ein drittes

Produkt. Wir konnten feststellen, dass es bei höheren Züchtungs-

temperaturen (25-27°) von Pilz gebildet wird und verweisen auf

den experimentellen Teil für die Einzelheiten über Nährboden,

Kulturbedingungen und Extraktion.

Oie Substanz schmilzt bei 86-89° und kristallisiert In dun¬

kelvioletten Nadeln. Aus den etwas schwankenden Analysenwerten,

die zwischen c?HgO, und C_H,0, lagen, konnten keine genauen Rück¬

schlüsse auf die Zusammensetzung der Verbindung gezogen werden.

Das Produkt gibt mit Eisen-(III)-chlorid in Wasser eine vor¬

übergehende, grün-blaue Färbung. Es löst sich in 2-n Natronlauge,

Natriumcarbonat oder verdünntem Ammoniak mit intensiver, grüner

Farbe, die nach einigen Sekunden verschwindet. Die alkalischen

Lösungen sind dann braun-gelb und werden an der Luft allmählich

dunkler.

Die Losungen in organischen Lösungsmitteln sind hellgelb

gefärbt. In saurem Milieu setzt die Verbindung Jod aus Kalium¬

jodid frei, entfärbt dagegen Jod bei einem Pg von ca. 6,5 bis 8,0.

Nach der katalytischen Hydrierung in Anwesenheit von 10 %

Palladiumkohle (19) in Alkohol konnte als einziges Produkt Gen¬

tislnalkohol (XXJI) isoliert werden. Wird die Reduktion in Anwe¬

senheit von Adams-Platin-Katalysator weitergeführt, so erhält

man Toluhydrochlnon, das durch Schmelzpunkt und Klschschmelzpunkt

identifiziert wurde.

Die Reduktion mit Kaliumjodid in saurer Läsung liefert

Gentislnalkohol (XXII). Die Substanz lässt sich andererseits

durch Oxydation mit Eisen-$II)-alaun in Oxymethyl-p-benzochinon

(XXXVII) überführen.

Die Acetylierung mit Essigsäureanhydrid und konz. Schwefel¬

säure als Katalysator, wie auch die reduzierende Acetylierung

liefern das ölige Gentislnalkoholtrlacetat als einzig fassbares

- 21 -

Produkt. Ebenso konnte nach Behandlung mit Phenylisocyanat in

absolutem Benzol nur das Trisphenylurethan des Gentislnalkohols

erhalten werden.

Aus diesen Versuchen kann die Schlussfolgerung gezogen

werden, dass eine îftlPftTironartlge Molekelverbindung von Gentl¬

slnalkohol (XXLL) und Oxymethyl-p-benzochinon (Gentisinchlnon)

(XXXVII) vorliegt.

Die genaue Zusammensetzung der Verbindung konnten wir nach

drei verschiedenen Methoden einwandfrei feststellen: 1. Durch

Jod-Titration nach der Vorschrift von Kolthoff (34),

2. durch quantitative Acetyllerung nach Smith und B v y a n t

(48) und 3. auf polarographischem Wege. Die gefundenen Verte

stimmen alle auf eine Zusammensetzung von 3 Mol Gentlslnalkohol

auf 1 Mol Orvmethvl-p-benzofthinon (XXXVIII). Durch umkristalli-

satlon eines künstlichen Gemisches von Gentlslnalkohol und

Qxymethyl-p-benzochinon aus Aether-Petroläther erhielten wir

tatsächlich eine nach Aussehen, Schmelzpunkt und Mischschmelz¬

punkt mit der natürlichen identische Verbindung (XXXVIII).

Hydrochinone und hauptsächlich Chinone, sind schon viel¬

fach aus Kultur-Filtraten von Pilzen isoliert worden. (28, 36,

44, 45) Dagegen scheint der vorliegende Fall die erste Isolierung

einer chlnhydronartlgen Molekelverbindung darzustellen.

CH20H

CH5OH

- 22 -

Ueber ein schwefelhaltiges Antibiotikum

aus Vertlcllliua cinnabarlnum und Chaetomlum spirale.

Neben unseren Arbeiten Über das Patulin und das Gentisinchin-

hydron führten wir auch Untersuchungen Über ein Pilz-Stoffwechsel¬

produkt aus, das gegen Mykobakterien aktiv 1st.

Wir hatten den Stoff aus Kulturen von Verticillium cinnabari-

num (Corda, Reinke et Berthold) (Stamm E.T.H. 1428) Isolieren kön¬

nen und nannten ihn deshalb "Cinnabarln". Wir verzichteten aber

im Laufe unserer Arbeit auf die Anwendung dieses Namens, da uns

die Charakterisierung des Produktes nicht gelang. In der Folgewerden wir also die Bezeichnung "Cinnabarin" nur der Verständlich¬

keit wegen verwenden.

Das Antibiotikum ist In Wasser unlöslich und fand sich des¬

halb hauptsächlich im Uycel. Daraus Hess es sich mit organischen

Lösungsmitteln extrahieren. Die Züchtung des Pilzes auf festem

Nährboden erwies sich bald als ergiebiger, und die im experimen¬

tellen Teil dieser Arbeit beschriebenen Versuche wurden alle mit

Kleie-Kulturen ausgeführt.

Herr Dr. L. Ettlinger wird die Kulturbedingungen,die Testmethodik und weitere biologische Einzelheiten In einer

eigenen Mitteilung beschreiben, so dass wir auf weitere Ausfüh¬

rungen darüber verzichten können.

Wir wollen nur auf die Unlöslichkeit der aktiven Substanz

in Wasser hinweisen: diese Eigenschaft erschwerte die Ausführungder biologischen Tests und war die Ursache der grossen Schwankun¬

gen in den Aktlvitätsbestimmungen. Die Resultate variierten oft

um 100 %, so dass die Ermittlung der biologischen Wirksamkeit

keine genaue Auskunft über die Reinheit der Präparate ergab. Es

gelang uns rasch, eine Isolierungsmethode auszuarbeiten, die ei¬

nigernassen reproduzierbare Resultate lieferte. Die aktive Sub¬

stanz wurde mit Aether aus der Kiele extrahiert, der Extrakt ein¬

geengt und nach Zugabe von "Cellite" biw. "tforlte A" mit Petrol-,

äther versetzt. Aus dem Niederschlag Hess sich das Produkt mit

Aceton »luieren und aus der Aceton-Lösung durch Zugabe von Petrol-

fither fällen.

- 23 -

Der so erhaltene aktive Stoff war ein gelbes bis bräunliches

Pulver von mikrokrystalllner Struktur. Er war schwer löslich in

den meisten Lesungsmitteln ausser Aceton, Chloroform, Essigester,

Pyridin und Eisessig. Er schmolz unter Zersetzung und unscharf

zwischen 185 und 215° und zeigte in Chloroform eine sehr hohe

spezifische Drehung von ca. 700°. Die Messung der optischen Akti¬

vität war nicht genau, denn manchmal waren die Lösungen nicht

ganz klar.

Am Rohprodukt studierten wir die wichtigsten chemischen und

biologischen Eigenschaften der Substanz. Wir stellten fest, dass

sie gegen Hitze und gegen Säure ziemlich beständig ist. Von alka¬

lischen Reagentien wird sie hingegen rasch angegriffen, wobei die

Aktivität verloren geht. Eine qualitative Elementaranalyse zeigte

die Anwesenheit von Schwefel und Stickstoff.

Das Rohprodukt gibt mit Jod-Azid nach F e 1 g 1 (2l) eine

positive Reaktion, mit Nitroprussidnatrium in Anwesenheit von

Natriumoyanid oder Natronlauge eine violette bzw. dunkelbraune

Färbung. Mit Quecksilberacetat in Alkohol entsteht ein weisser

Niederschlag. Permanganat In Aceton, Jod in Eisessig oder Alkohol,

Brom in Eisess.ig werden in der Kälte entfärbt. Die Ferrichlorid-

und die Ninhydrin-Reaktion sind hingegen negativ.

Alle unsere Versuche, den aktiven Stoff In makrokrystalllner

Form zu gewinnen, scheiterten. Wir bemühten uns, dieses Ziel

durch ümlBsen und Umfallen aus verschiedenen Losungsmitteln, sowie

durch Chromatographieren an Aluminiumoxyd und an Sillcagel zu er¬

reichen, jedoch ohne Erfolg. Das Produkt hatte immer ähnliches

Aussehen und schmolz in den oben angegebenen Grenzen (185-215 )•

Die optische Aktivität war ebenfalls immer um +700°. Zwar be¬

obachteten wir, dass Mutterlaugen-Präparate und solche, die lange

an der Luft gestanden hatten, eine Aktivität von weniger als

800 E/mg und einen niedrigeren Schmelzpunkt, sowie eine geringere

spezifische Drehung als die aktiven Fraktionen zeigten; aber

zwischen den aktiven Fraktionen selbst kannten wir mit Hilfe

dieser Eigenschaften allein nicht unterscheiden.

Die quantitativen Elementaranalysen zeigten jedoch, dass

auch die aktivsten Präparate gar nicht einheitlich waren, obwohl

- 24 -

sie nach Aussehen, Schmelzpunkt und Drehung kaum zu unterscheiden

waren. Die C,H-Werte schwankten zwischen 48,5 bzw. 4,2 und 50,8

bzw. 4,9 %. Der Stickstoff-Gehalt variierte zwischen 9,4 und 11,1 %

und der Schwefel zwischen 17,4 und 18,3 %.

Es war deshalb absolut notwendig, noch weitere Kriterien für

die Reinheit und Einheitlichkeit der verschiedenen Fraktionen zu

finden.

Wir probierten die alkalische Inaktivierung und die Oxydation

ait Jod, mit Pernianganat und mit Brom quantitativ auszuwerten, in

der Hoffnung, auf chemischem Wege das "Cinnabarin" charakterisie¬

ren zu können.

Leider erwiesen sich auch diese Methoden als zu ungenau. Die

Reproduzierbarkeit Hess zu wünschen übrig, und ein Zusammenhang

zwischen den gefundenen Werten und der. Provenienz oder Aufarbei¬

tung der Präparate konnte nicht festgestellt werden. Ausserden

gab es zwischen den einzelnen Bestimmungen (alkalimetrischer,

Jodometrischer, bromometrlscher Titration) keine proportionale

Beziehung, ein weiterer Beweis der Dheinheitlichkeit der unter¬

suchten Fraktionen.

Als wir mit dem Charakterislerungsproblem beschäftigt waren,

kamen uns zwei Publikationen von W a k s ni a n und Mitarbeitern

(24, 5l) zur Kenntnis. Sie berichten über die Isolierung eines

Stoffes aus dem Pilz Chaetomium cochlloides (Palliser), den sie

Chaetomin nannten. Die von ihnen angegebenen Eigenschaften waren

mit jenen unseres Produktes sowät übereinstimmend, dass es sehr

wahrscheinlich war, dass es sich um dieselbe Substanz handelte.

Auch die Bakterien-Spektra des Chaetonins und des "Cinnabarlns"

zeigten, nach Versuchen von Herrn Dr. Ettlinger, eine

weitgehende Aehnlichkeit.

Da einige Verticillla Nebenfruchtformen (ungeschlechtliche

Formen) von Chaetomia darstellen, ist die Produktion gleicher

bzw. sehr ähnlicher Verbindungen auch vom biologischen Stand¬

punkt aus ganz gut möglich.

In der Tat gelang es uns, auch aus Chaetomium spirale Zopf

(Stamm E.T.H. 1016) ein Produkt zu Isolieren, das die gleichen

physikalischen Eigenschaften und das gleiche chemische Verhalten

- 25 -

wie das "Cinnabarin" zeigte. Es war natürlich schwer, beim

Fehlen einer genauen Charakterisierung auf die Identität der

beiden Produkte zu sehliessen. Da aber das Verticillium cinna-

barinum praktisch kein Antibiotikum mehr produzierte, sahen wir

uns trotzdem gezwungen, unsere Versuche zum grossen Teil irit

Präparaten auszuführen, die wir aus dem neuen Pilze isolierten.

Es sei noch erwähnt, dass ein Chaetomin-Präparat, das uns

Herr Prof. Dr. S.A. Waksman in liebenswürdiger Weise

zur Verfügung stellte, in Aussehen, Schmelzpunkt, Aktivität und

Löslichkeit dem "Cinnabarin" sehr ähnlich schien. Es zeigte im

Mischschmelzpunkt mit unserem Stoff keine Depression. Die Drehung

des Vergleichspräparates in Chloroform betrug aber bloss + 314°•

Wegen der kleinen Menge Substanz, die uns zur Verfügung stand,

konnten wir leider keine anderen Vergleichsversuche ausführen.

2s ist daher nicht ganz sicher, ob es sich um identische Substan¬

zen handelt. Die grossen Schwierigkeiten, die einer chemischen

Bearbeitung des '^Cinnabarins" im Wege standen, und die Veröffent¬

lichungen Waksman's veranlassten uns, auf eine weitere

Untersuchung des Antibiotikums zu verzichten.

- 26 -

Experimenteller Teil*)

Arbeiten über die Stoffwechselprodukte von Pénicillium urticae

Bainler.

Kulturbedingungen und Extraktion. **)

Der Pilz wurde in Fernbachgefässen auf Je 500 ccm einer

Haulin-Thom-Lösung folgender Zusammensetzung gezüchtet:

Saccharose 75,0 g Ammoniumsulfat 0,25 g

Weinsäure 4,0 g Zinltsulfat (7 H20) 0,07 g

Ammoniumtartrat 4,0 g Elsensulfat :

Kaliuncarbonat

Diammoniutnphosphat

Magnesiumcarbonat

0,6 g

0,6 g

0,4 g

a) Ferrosulfat (7H20) 0,07 goder

b) Ferrisulfat 0,07 g

Wasser ad 1500 ccm

Die Temperatur variierte zwischen 18 und 27 je nach Versuch

Es wurde nach 13 - 30 Tagen geerntet.

Wir waren nur an der Isolierung des Patulins, des Gentisin-

*) Alle Schmelzpunkte wurden im Kupferblock bestimmt und sind

unkorrigiert. Alle D-V-Spektra wurden in Aethanol aufgenommen.

**) Der Pilz wurde im Institut für spezielle Botanik der E.T.F

(Leitung Prof. Dr. E. Gäumann) gezüchtet. Dort wurden

auch die biologischen Tests nach der Verdünnungsmethode (vgl. L.

Ettlinger (20) und W. Schlegel (47)) ausgeführt.

Als Testbakterium diente Staphylococcus aureus (Stämme E.T.H. No.

2014, 2024 und 2026). Ich möchte Herrn Dr. L. Ettlinger, Frau S.

Naef-Roth, Fräulein M. Dieth, F. Turel, N. Hediger, N. Hemmeler,H. Fellenberg und Y. liorf für ihre wertvolle Hilfe auch an dieser

Stelle bestens danken.

- 27 -

alkohols und später des Gentisinchlnhydrons Interessiert, die

unter den angegebenen Kulturbedingungen als Hauptprodukte auftre¬

ten. Zu diesem Zweck wurde folgende Extraktionsmethode ausgear¬

beitet:

Das Kultur-Filtrat wurde Jeweils mit Kochsalz gesättigt und

mit dem gleichen Volumen Essigester ausgeschüttelt. Die Essig-

esterschlcht wurde mit einer gesättigten Natrlumhydrogencarbonat-

lösung (welcher noch Ammoniumsulfat bis zur Sättigung zugegeben

worden war) und dann mit einer gesättigten Kochsalzlösung gewa¬

schen.

Durch biologische Tests wurde bei jeder Operation die Extrak¬

tion des aktiven Stoffes verfolgt. Nachstehend geben wir ein Bei¬

spiel einer solchen Aktivitätskontrolle.

Versuch 5 (s. Tab. I):

im Kultur-Filtrat (KF) ca. 2 100 000 E *)im Essigester ca. 2 O4.O 000 E 97,0 %im extrahierten KF ca. 53 000 E 2,5 %im Natriumhydrogencarbonat ca. 3 4-00 E 0,2 %in der Kochsalzlösung ca. 14 800 E 0,7 %

Der Extrakt wurde schliesslich getrocknet und im Vakuum

eingeengt. Durch Abkühlen und eventuell Animpfen der konzentrier¬

ten Lösung wurden die einzelnen Verbindungen in krystallisierter

Form erhalten. In gewissen Fällen musste man die chromatographi¬

sche Reinigungsmetkode anwenden.

So wurden z. B. aus einem eingeengten Hoh-Extrakt (Versuch

5) als direktes Krystallisat 9,2 g Patulln (l,15 mg/ccm) erhalten.

Die Mutterlaugen (11,0 g) wurden an neutralem Aluminiumoxyd

chromatographiert.

Die ersten drei Fraktionen des Chromatogramms (total 6,9 g)

lieferten nach Umkrystalllsation aus Benzol weitere 5,15 g (0,65

mg/ccm) Patulln.

Die Aether-Essigester-Eluate bestanden aus 3,12 g (0,4 mg/

ccm) rohen Gentislnalkohol mit dem Schmelzpunkt 86-95 .

*) Die Verdünnungseinheit wurdtdefiniert als die Kenge Substanz,

welche, in einem ccm Bouillon gelöst, das Wachstum des Testorga¬

nismus gerade noch vollständig hemmt.

- 28 -

Der Elnfluss der Temperatur und ZUchtungsdauer auf die Aus¬

beute an Patulln, Gentisinalkohol und Gentislnchinhydron wird in

der folgenden Tabelle gezeigt.

Tabelle 1

Vers.

Ho.

Kultu

Temp.

r-Bed

Tage.ngungen

Eisen

Akti¬

vität

Ausbeuten mg/ccm KF BemerkungenPatul. Gentalk, lientchin.

des KF

E/ccm

1 21° 13 a 80 1,5 _ Spuren

2 21° 13 b 80 1,8 -n

2a 21° 30 b 80 0,8 Spuren -

3 27° 13 a 10 _ _ 1,0 FeCl -Test auf

Pat.^lm KF -

4 27° 13 b 12 - - 0,7 n n n

4a 27° 30 b 17 - 0,6 -n n n

5 21° 18 a 100 1,8 0,4 - chromât.gerein.

6 24° 17 a 80 0,3 ~ 0,9 Pat.aus den

Kutterlaugendes Chinhydr.

7 24° 16 a 90 1,7 - 0,5 Chinhydr.aus d.

Mutterlg.d.Pat.S 24° 30 a 80 0,3 0,9 Pat.aus den

Mutterlaugen d.

Gentislnalkoh.

9 21° 13 a 100 1,9 — -

Es ergibt sich daraus, dass die besten Ausbeuten an Patulln

bei tiefer Temperatur und kurzer ZUchtungsdauer erzielt werden.

Analysen.

a) Patulln. Eine Probe Patulln wurde mehrmals aus Benzol umkry-

stallisiert und zur Analyse im Hochvakuum bei 90 sublimlert.

Der Schmelzpunkt lag bei 109-110,5° (Ralstrlck und Mit.

(43) Fp. 111°).

3,710 mg Substanz gaben 7,408 mg C02 und 1,274 mg H20C„H£0, ber. C 54,55 H 3,92 %

gef. C 54,49 H 3,84 %"7H6U4

U-V-Spektrum: \ ' 2770 8, ig £ . 4,3.

- 29 -

Die Aktivität des Patulins gegen Staphylococcus aureus

(Stamm E.T.H. 2024) betrug 40 E/mg.

Das von uns isolierte Patulin stimmte in allen seinen che¬

mischen und physikalischen Eigenschaften mit dem von R a i -

strick und Mit. (43) beschrieben Produkt überein.

b) Gentisinalkohol. Die durch chromatographische Reinigung er¬

haltene Substanz (3,12 g - Versuch 5) wurde aus Aceton-Chloro-

form umkrystallisiert. Der Schmelzpunkt des Analysenpräparates

(800 mg) betrug 100-101° ( R a i s t r i c k und Mit. (8) Fp.

10CQ), Die Analysenprobe wurde während 24 Stunden im Hochvakuum

bei 20° getrocknet.

3,750 mg Substanz gaben 8,250 mg C02 und 1,956 mg H"20C_Ha0, ber. C 59,99 H 5,75 %7 ö *

gef. C 60,04 K 5,84 %

Die Aktivität des Gentisinalkohols gegen Staphylococcus

aureus (Stamm E.T.H. 2024) betrug 5 E/mg.

In seinen chemischen und physikalischen Eigenschaften

stimmte das Produkt mit dem von ïtaistrick und Mit. (8)

isolierten vollständig überein.

c) Gentisinchinhydron. Die Molekelverbindung kann aus Essigester-

Petroläther in Form kleiner, dunkelvioletter Nadeln, die etwas

unscharf zwischen 86° und 89° schmelzen, erhalten werden. Sie ist

in Benzol, Chloroform, Petroläther sehr schlecht, in Wasser, Ace¬

ton, Alkohol, Essigester, Aether leicht löslich. Die wässerigen

Lösungen geben mit Eisen-(lII)-chlorid eine vorübergehende grün¬

blaue Färbung. Bei Zugabe von Natronlauge, Natriumcarbonat oder

Ammoniak färbt sich die wässerige Lösung am Anfang intensiv grün,

dann dunkelbraun. Der Stoff entfgrbt augenblicklich Kaliumperman¬

ganat und Jod. Die Analjsenpräparate wurden während 48 Stunden

im Kochvakuum bei Zimmertemperatur getrocknet.

3,646; 3,896 mg Substanz gaben 8,085; 8,609 mg C0? und

1,845; 1,998 mg H20

(C7Hg03)3.C7H603 ber. C 60,21 .

H 5,41 >

gef. C 60,52 H 5,66 jlC 60,30 K 5,74 ;-

- 30 -

Ü-V-Spektrum: Amax>= 2950 8, lg ( * 4,25

Aminlj -» 3320 8, lgf = 2,90

/Iminjj = 2700 8, lgfc = 3,97

Pie lîolekelverbindung hat gegen Staphylococcus aureus (Stamm

E.T.H. 2024) eine Aktivität von 5 E/mg.

Arbeiten über die Konstitution des Patulins.

Patullnacetat. (43)

300 mg Patulin wurden mit 5 ccm Acetanhydrid und 0,5 ccm

Pyridin versetzt und bei -3° Über Nacht stehen gelassen. Das

Gemisch wurde auf Eis gegossen und das ausgefallene Oel in Es¬

sigester aufgenommen. Die Essigesterlösung wurde neutral gewa¬

schen, getrocknet und eingedampft. Es wurden 240 mg Oel erhal¬

ten, das aus Eisessig-Wasser krystallislerte. Der Schmelzpunkt

betrug 118-119° ( R a i s t r i c k und Mit. (43) Fp. 118°).

Das Acetat wurde zur Analyse 15 Stunden bei 60° im Hochvakuum

getrocknet.

3,790 mg Substanz gaben 7;630 mg C02 und 1,449 mg H.,0

CgHgO, ber. C 55,10 H 4,11 %

gef. C 54,94 H 4,28 %

U-V-Spektrum:) = 2770 8, lg £ = 4,30.

Alkalische Hydrolyse des Patulins.

157,5 mg Patulin wurden in 30 ccm 0,1-n Natronlauge ( = 2,93

Aequlv.) gelöst. In bestimmten Zeltabständen wurden Proben zu Je

5 ccm entnommen und mit 0,1-n Salzsäure zurücktitriert (Indikator:

Phenolphthalein).

- 31 -

Zelt

nin

Verbrauch an

0,1-n HCl (ccm)Total-Verbrauch für 25 com Aequivalente

NaOH/Mol Subst.0,1-n HCl 0,1-n NaOH

6

15

20

25

2,00

1,60

1,55

1,56

12,00

9,60

9,30

9,40

18,00

20,^0

20,70

20,60

1,76

1,99

2,02

2i01

Versuch zum Nachwels von Formaldehyd bei der alkalischen

Hydrolyse des Patullns.

83,0 mg Patulln und 166,0 mg Dimedon (=2,2 mlfol) wurden in

10 ccm Alkohol gelöst und mit 11,3 ccm 0,1-n Natronlauge (=2,1

Aequiv.) versetzt. Nach 30 Stunden wurde die klare gelbe Lösung

mit 1 ccm 2-n Salzsäure angesäuert und einige läge stehen gelas¬

sen. Es bildete sich kein Niederschlag, weder in alkalischer noch

in saurer Lösung.

Versuch zum Nachweis von Kohlensäure bei der alkalischen

Hydrolyse des Patullns.

57,3 mg Patulln wurden in 9,0 ccm 0,1-n Natronlauge gelöst

und i Stunde in Stickstoff-Atmosphäre gehalten. Dann wurde mit

2-n Schwefelsäure angesäuert und Stickstoff durchgeleitet. In

der mit Barytlauge beschickten Vorlage trat keine Trübung ein.

Es wurde dann lj Stunden auf 100° erhitzt. Auch in diesem Falle

entstand keine Kohlensäure.

Cnlor-desoxy-patullnsäure. (7)

1,0 g Patulln wurde in 100 ccm Aether gelbst. Die Lösung

wurde mit SalesSure-Gas gesättigt und 3 Stunden bei 10 ste¬

hen gelassen. Der Aether wurde im Vakuum abgedampft und der

krystalllne Rückstand im Exsikkator über fester Natronlauge

getrocknet. Nach dem ümkrystallisieren aus Benzol wurden

800 mg Substanz vom Schmelzpunkt 129-132° erhalten. Zur Analyse

- 32 -

wurde die Substanz aus Benzol oder Aether-Petroläther umkrystal-

lisiert und la Hochvakuum bei 110° sublimiert. Fp. 131-132,5°( B e r g e 1 und Mit. (7) rp. 129-130°).

3,882 mg Substanz gaben 6,249 mg CO. Und 1,313 mg H„0

4,784 mg Substanz gaben 3,612 mg AgCl

C_H_0,C1 ber. C 44,11 H 3,70 Ç1 18,6o %' ' *

gef. C 43,93 H 3,78 Cl 18,68 %

U-V-SpektrumaBax- 2700 Î, Igt = 3,6; t^^." 225° X' lg £ = 2'45*

Mikrotitrationi 0,658 mg Substanz, In 1 eea Wasser gelöst, ver-

3brauchten 32,0 mm 0,1-n Tetramethyl-ammonium-hydroxyd.

C-H-0.C1 Aequivalentgewicht ber. 191" A

ngef. 205

0

= *'*

Mlkrohydrlerung; 5,91» 6,06 mg Substanz absorbierten 1,60; 1,54

ccm Wasserstoff (0°, 760 mm); Zelt 15 Min.; Katalysator: 5 mg

PtO,; Lösungsmittel: 2 ecm Eisessig. Doppelbindungen/Mol: gef.

2,30; 2,16.

6,06 mg Substanz absorbierten 1,75 ocm H_ (0°, 760"mai); Zeit 30

Min.; Katalysator: 5 mg PtO« Lösungsmittel: 2 ccm Eisessig.

Doppelbindungen/Mol: gef. 2,45.

Test mit Sorbinsiiure: 3,956 mg Substanz absorbierten 1,78 ccm H_

(0°, 760 mm); Zeit 30 i5in.; Katalysator: 5 mg PtOp» Lösungsmittel:

2 ccm Eisessig. Doppelbindungen/Mol: ber. 2,00gef. 1,95

Alkalische Hydrolyse der Chlor-desoxy-patullnsäure.

93,8 mg Chlor-desoxy-patulinsaure wurden in 25 ccm 0,1-n

Natronlauge (= 5,03 Aequlv.) gelöst. In bestimmten ZeltabstSnden

wurden aliquote Teile zu je 5 ccm der Lösung entnommen und mit

0,1-n Salzsäure zurücktltrlert (Indikator: Phenolphthalein).

Zeit

min

Verbrauch an Total-Verbrauch für 25 ccm AequivalenteNaOH/Mol Subst.0,1-n HCl (ccm) 0,1-n HCl 0,1-n NaOH

10 2,05 10,25 U,75 3,0

15 1,95 9,75 15,25 3,1

19 St. 1,55 7,75 17,25 3,5

48 St. 1,45 7,25 17,75 3,6

- 33 -

Chlor-desoxy-patullnsaure-methylester.

100 ag Chlor-desoxy-patullnsaure wurde" in Methanol gelöst

und mit einer ätherischen Lösung von Diazomethan wie üblich ver-

estert. Der erhaltene ölige Methylester wurde zur Analyse im

Hochvakuum dreimal destilliert. Kp._ _. ca. 110°.

3,496 mg Substanz gaben 6,027 mg CO« und 1,379 mg H_0

5,216 mg Substanz gaben 3,665 mg AgCl

CftHo0,Cl ber. C 46,96 H 4,43 Cl 17,33 %094

gef. C 47,06 H 4,40 Cl 17,38 %

Dlnltrophenylhydrazonxvon Chlor-desoxy-patulinsäure-methylester.

60 mg Chlor-desoxy-patulinsSure-methylester (Kp.Q 0,ca. 110c)

wurden mit 70 mg Dinitrophenylhydrazin (in Methanol/Schwefelsaure)

versetzt. Es fiel ein oranges Dinitrophenylhydrazon aus, das aus

Benzol-Methanol umkrystallisiert wurde. Der Schmelzpunkt des De¬

rivates betrug 182-183°. Zur Analyse wurde es 24 Stunden bei 70

im Hochvakuum getrocknet.

3,962 mg Substanz gaben 6,402 mg C02 und 1,179 mg H20,2,970 » « n o,393 ccm ^-(21°, 728 mm)

5,830 n " " 2,206 mg AgCl

Cn.H.,0„ClN, ber. C 43,70 H 3,40 N 14,56 Cl 9,22%14T-3 7 4

gef> c Ufl0 H 3)33 jj Uj71 C1 9i36%

Desoxy-patulinsaure.

212 mg Chlor-desoxy-patulinsäure wurden in 10 ccm Wasser

gelöst und in Anwesenheit von 210 mg Palladium-Kohle (nach

D i e 1 s und G ä d k e (19)) in Wasserstoff-Atmosphäre ge¬

schüttelt. Nach Aufnahme von 24,4 ccm ( = 1 Mol) Wasserstoff

wurde die Hydrierung unterbrochen. Die wässerige Lösung wurde

mit Aether extrahiert. Nach Abdampfen des Aethers wurden 150 mg

Krystalle erhalten. Sie wurden aus Benzol umkrystallisiert und

bei 100° im Hochvakuum sublimiert. Das Analysenpräparat schmolz

bei 110-113°.

- 34 -

3,715; 3,820 mg Substanz gaben 7,332; 7,630 ffg C0_ und 1,704;1,765 mg H20.

*=

C7Hg04 ber. C 53,84 H 5,16 %

gef. C 53,86 H 5,13 %C 53,79 H 5,17 %

U-V-Spektrum:^max>= 2680 8, lgt = 4,10;ABln#» 2330 8, Igt = 3,05.

Mikrotltratlon: 0,713 mg Substanz in 1,0 ccm Wasser ver-

brauchten 43,7 mm 0,1-n Tetramethyl-ammonium-hydroxyd.

C_Ho0, Aequivalentgewicht ber. 156^8 4

gef. 162

28°pK, A'3

Mlkrohydrlerung; 7,139; 6,621 mg Substanz absorbierten 2,39;

2,17 ccm H_ (0°, 760 mm); Zeit 15 Min.; Katalysator: 5 mg PtO,;

Lösungsmittel: 2 ccm Eisessig. Doppelbindungen/Mol: gef. 2,33; 2,23.

6,957 mg Substanz absorbierten 1,1 ccm H_ (0°, 760 mm); Zeit

40 Min.; Katalysator: 10 mg Pd 4-proz. auf BaSO,; Lösungsmittel:

2 ccm H„0. Doppelbindungen/Mol: gef. 1,06.

Test mit Sorbinsäure: 4,825 mg Substanz absorbierten 1,915

ccm H_ (0°, 760 mm); Zeit 15 Min.; Katalysator: 5 mg Pt0_; Lösungs¬

mittel: 2 ccm Eisessig. Doppelbindungen/Mol: ber. 2,00gef. 1,98

Desoxy-patullnsäure-methylester.

100 mg Desoxy-patullnsäure wurden in Aether gelöst und mit

einer ätherischen Lösung von Dlazomethan versetzt. Es wurde dabei

eine heftige Stickstoff-Entwicklung beobachtet. Nach einer Stunde

wurde im Vakuum eingedampft, der Rückstand in Essigester aufge¬

nommen und mit Salzsäure, Natriumhydrogencarbonat und iVasser ge¬

waschen. Die getrocknete Lösung wurde im Vakuum eingedampft und

das erhaltene Oei bei 60° im Hochvakuum dreimal destilliert.

3,500; 3,833 mg Substanz gaben 7,245; 7,934 mg CO, und 1,850 ;

1,946 mg H20.*

C8H10°4 b8r- C 56j46 H 5'92 *

gef. C 56,48 H 5,91 %C 56,49 H 5,68 J6

- 35 -

Ü-V-Spektrum: ^max^= 2650 2, Igt = 3'95^^min.= 2200 ^» lgi = 2'7'

n2,6* 1,4961, d|6= 1,2279; Mp gef. = 40,49, Mp ber. = 39,78;

EMp = 0,71.

Dlnltrophenylhydrazon von Desoxy-patulinsäure-methylester.

a) aus Desoxy-patulinsäure-methylester t 110 mg Desoxy-patulin-

säure-methylester (Kp.Q 0-ca. 85°) wurden mit einer Lösung von

120 mg Dinitrophenylhydrazin in 10 ccm Dioxan und 3 Tropfen konz.

Salzsäure versetzt. Nach dem Verdünnen nsit etwas Wasser fiel ein

blutroter Niederschlag aus, der aus Dioxan-Wasser umkrystalli-

siert wurde. Das in schönen, blutroten Nadeln krystallisierende

Derivat schmolz bei 175-177° und wurde zur Analyse 24 Stunden

bei 60° im Hochvakuum getrocknet.

3,798 mg Substanz gaben 6,659 mg C02 und 1,411 mg H202,518 mg Substanz gaben 0,360 ccm N2 (20°, 723 mm)

C, ,R,.0JJ. ber. C 48,00 BT 4,03 N 16,00 %1414 7"4

gef< c 47>35 H 4fl6 N 15,84!«

b) aus Desoxv-patulinsäure; 60 mg Desoxy-patullnsäure wurden in

Methanol aufgenommen und mit 8J mg 2,4-Dinitrophenylhydrazln,

gelöst in einem Gemisch von konz. Schwefelsäure und Methanol

nach Brady (12) ,bei ca. 40° versetzt. Beim Abkühlen fiel

ein blutroter, krystalllner Niederschlag aus, der nach mehrmali¬

gem Einlösen aus Methanol bei 175-177° schmolz. Das Produkt war

gegen Lackmus neutral und löste sich weder in Natriurahydrogen-

carbonat noch in Natriumcarbonat. Es lag das Dinitrophenylhydra-

zon des Desoxy-patulinsäure-methylesters vor, wie durch Analyse

des Produktes und Vergleich mit dem nach a) hergestellten Prä¬

parat bewiesen wurde. Das Analysenpräparat wurde 24 Stunden bei

70° im Hochvakuum getrocknet.

3,492 mg Substanz gaben 6,138 mg C02 und 1,272 mg H202,376 mg Substanz gaben 0,344 com N2 (19°, 725 mm)

C-.H-.O-tf. ber. C 48,00 H 4,03 M 16,00 f,1ATW 7-4 gef> c 47)97 h 4,09 N 16,1V jt

- 36 -

Versuche zur Acetyllerung von Desoxy-patullnsäur«.

a) mit Acetanhydrld und Pyridin bei Q°i 30 mg Desoxy-p*tulin-säure wurden mit 0,5 ccm Acetanhydrld und 3 Tropfen Pyridin

während 24 Stunden stehen gelassen. Das Reaktionsgemisch wurde

dann auf Eis gegossen, mit Essigester extrahiert und die Essig¬esterschient mit Natrlumhydrogencarbonat ausgeschüttelt. Die

alkalischen Auszüge wurden nach dem Ansäuern mit Essigester

extrahiert. Nach dem Trocknen und Eindampfen erhielt man 20 mg

einer krystalllnen Verbindung, welche aus Benzol-Petroläther

umkrystalllsiert und Im Hochvakuum subllmlert wurde. Der Schmelz¬

punkt lag bei 110-112°, unverändert beim Mischen mit dem Aus¬

gangsprodukt.

b) mit Acetanhydrld und Pyridin bei 80°; 30 mg Desoxy-patulln-

säure wurden mit 0,5 ccm Acetanhydrld und 3 Tropfen Pyridin ver¬

setzt, die Lösung auf dem Wasserbad wahrend 30 Minuten auf 80°

erhitzt und 48 Stunden bei Zimmertemperatur stehen gelassen.

Dann wurde das Reaktionsgemisch im Vakuum eingedampft, der Rück¬

stand aus Benzol-Petroläther umkrystalllsiert und schliesslich

Im Hochvakuum subllmlert. Das Produkt schmolz bei 109-111° und

erwies sich als unveränderte Desoxy-patulinsäura.

c) mit Acetanhydrld und Hatriumacetat bel 100° t 30 mg Desoxy-

patulinsäure wurden In 2 ccm Acetanhydrld gelöst, mit 100 mg

Natriumacetat versetzt und die Lösung während 10 Minuten auf

100° erhitzt. Nach der Aufarbeitung erhielt man ein dunkelbrau¬

nes Oel, das nicht krystallisiert werden konnte und im Hochva¬

kuum auf 80° erhitzt vollständig verharzte.

d) mit Acetanhydrld und BF--Katalysator; 100 mg Desoxy-patulin-

säure wurden in 1 ccm Acetanhydrld gelöst, die Lösung bei 0 mit

2 ccm eines Gemisches von Acetanhydrld und Bortrifluorid-Aether-

Komplex (20 ccm : 3 Tropfen) versetzt und 2 Stunden in Eis ste¬

hen gelassen. Nach dem Eindampfen im Vakuum wurde der Rückstand

zweimal aus Benzol umkrystalllsiert und im Hochvakuum subllmlert.

- 37 -

Die 'farblosen Krystalle schmolzen bei 112-113° und gaben bei der

Mischprobe mit Desoxy-patulinsäure keine Depression.

Alkallbesiändlgkeit von Desoxy-patulinsäure.

a) Beständigkeit gegen Natriumhydrogencarbonat; 50 mg Desoxy-

patulinsäure wurden in Essigester gelöst und mit 2-n Natriumhy-

drogencarbonatlösung geschüttelt. Die wässerige Schicht wurde

angesäuert und mit Essigester extrahiert. Es wurden 35 n>g Des¬

oxy-patulinsäure vom Fp. 108-110° zurückgewonnen.

b) Beständigkeit gegen Natriumcarbonat; 50 mg Desoxy-patulin¬

säure wurden in Essigester gelöst und mit 2-n Natriumearbonat-

lösung geschüttelt. Die wässerige Schicht wurde angesäuert und

nit Essigester extrahiert. Es wurden 40 mg Substanz vom Fp. 108-

-110° erhalten. Der Mischschmelzpunkt mit dem Ausgangsprodukt

wies keine Depression auf.

c) Beständigkeit gegen 1 Aeaulv. 0.1-n Natronlauge; 25 mg Des¬

oxy-patulinsäure in 2 com 'Wasser wurden mit 1,55 ccm (= 1 Aequiv.)

0,1-n Natronlauge versetzt und 24- Stunden bei 20 stehen gelassen.

Es wurde dann angesäuert und mit Essigester extrahiert. Es wurden

20 mg Desoxy-patulinsäure vom Fp. 108-110° zurückerhalten.

d) Beständigkeit gegen überschüssige O.l-n Natronlauge; 33,6 mg

Desoxy-patulinsäure in 3 ccm Wasser wurden mit 5,4- ccm ( = 2,5

Aequiv.) 0,1-n Natronlauge versetzt. Nach 24 Stunden wurde rit

0,1-n Salzsäure zurücktitriert (Indikator: Phenolphthalein). Es

wurden 0,85 ccm 0,1-n Säure verbraucht, was einem Verbrauch von

4,55 ccm ( = 2,11 Aequiv.) 0,1-n Natronlauge entspricht.

Die titrierte Lösung wurde mit Salzsäure angesäuert und Biit

Essigester extrahiert. Nach Eindampfen des Lösungsmittels wurden

20 mg Oel erhalten, das nicht krystallisiert werden konnte.

- 38 -

Alkalische Hydrolyse der Desoxy-patulinsäure.

68,C mg Desoxy-patulinsäure wurden zuerst mit 0,1-n Natron¬

lauge titriert (Indikator: Phenolphthalein). Es wurden 4.4 ccm

verbraucht ( = 1,01 Aequiv.). Die Lösung wurde nun mit 0,1-n Na¬

tronlauge allmählich versetzt, bis die rote Färbung des Indika¬

tors nicht mehr verschwand. Der Lauge-Verbrauch betrug nach 25

Stunden 8,0 ccm ( = 1,84 Aequiv.). Es wurde dann mit 2-n Salz-

saure angesäuert und die Lösung mit Essigester ausgeschüttelt,

tfach Abdampfen des Extraktionsmittels erhielt man 37 mg öligen

Rückstand. D&s Produkt sublimierte im Hochvakuum bei 90° und

lieferte dabei etwas Oel und einige mg Krystallei, Der Hauptteil

verharzte. Das krystalline Sublimat schmolz bei 165-168°, war

also mit Desoxy-patulinsäure nicht identisch. Bei der Mischprobe

mit dem. durch saure Hydrolyse erhaltenen Produkt (s. unten) wurde

keine Depression beobachtet.

Säurebestandlgkeit von Desoxy-patullnsaure.

a) bei 60 alt 0.1-n Salzsäuret 20 mg Desoxy-patulinsäure wurden

in 1,2 ccm 0,1-n Salzsäure gelöst und 15 Stunden auf 60° erhitzt.

Nach Eindampfen im Vakuum wurde unveränderte Ausgangssubstanz

isoliert.

b) bei 100 mit 2-n Salzsäure; 20 mg Desoxy-patulinsäure warden

mit 1 ccm 2-n Salzsäure bei 100° behandelt. Die Säure wurde im

Vakuum abgedampft. Im Reaktionsrückstand konnte keine Desoxy-

patulinsäure mehr nachgewiesen werden.

Saure Hydrolyse der Desoxy-patulinsäure.

100 mg Desoxy-patulinsäure wurden In 5 ccm 2-n Salzsaure

gelöst und 3 Stunden in einem offenen Kolben auf dem "Aasserbade

erhitzt. Die Lösung voirde dann auf die Hälfte eingeengt und mit

Essigester extrahiert. Es wurden 65 mg Oel erhalten, das in wenig

Methanol gelöst, mit Chloroform versetzt und eingeengt wurde. Es

- 39 -

krystallisierten 15 mg Substanz, die nach nochmaligem Umlösen aus

Chloroform und Sublimieren bei 110 im Hochvakuum bei 165-167

schmolz. Das Produkt reagiert sauer auf Lackmus und gibt eine ro-

ie Pfirbung mit Ferrichlorid erst nach alkalischer Hydrolyse. Der

Mischschmelzpunkt mit dem aus der alkalischen Hydrolyse von Des-

oxy-patulinsäure erhaltenen Produkt (Fp. 165-167°) ergab keine

Depression. Das Analysenpräparat wurde im Hochvakuum bei 110

jublimiert.

3,730 mg Substanz gaben 7,443 mg CO. und 1,367 mg H20C„H,0. ber. C 54,55 H 3,92 %

' ° 4gef. C 54,46 H 4,10 %

0-V-Spektrum:^.max_= 2500 2, lgfc = 3,95.

3tikrotltratlon; 0,454 mg Substanz, in 0,8 ccm Wasser gelöst, ver-

3brauchten 29,0 mm 0,1-n Tetramethyl-amroonium-hydroxyd.

C_H,0 Aequivalentgewicht ber. 154,16 *

gef. 157,0

P*° =4,4

\o

Dihydro-desoxy-patulinsäure. (7)

a) aus Desoxv-patullnsäure: 96 mg Desoxy-patulinsäure wurden in

10 ccm Alkohol gelöst, mit 1 ccm Eisessig versetzt und in Anwe¬

senheit von 100 mg Palladium/Bariumsulfat-Katalysator (2,4 % Pd)

in Wasserstoff-Atmosphäre geschüttelt. Nach 80 Min. waren 14>0

:em H_ aufgenommen worden (0°, 760 mm) (Theorie: 13,8 ccm). Die

weitere Aufnahme von Wasserstoff ging sehr langsam vor sich. Die

Hydrierung wurde unterbrochen und die Lesung filtriert, im Vakuum

eingedampft und der Rückstand mit 0,1-n Natronlauge auf Bromthy-

molblau neutralisiert. Es wurden 5,6 ccm Lauge verbraucht. Die

wässerige, neutrale Lösung wurde mit Essigester extrahiert, um

eventuell vorhandenes Lacton (XXIX) zu entfernen. Der Essigester

wurde getrocknet und im Vakuum abgedampft. Der neutrale Bückstand

Tog 20 mg und wurde nicht näher untersucht. Die wässerige Schicht

wurde dann angesäuert und mit Essigester extrahiert. Es wurden

60 mg farbloses Oel erhalten, das im Hochvakuuir nicht destilliert

«erden konnte.

- 40 -

b) aus Chlor-desoxy-patullnsgure; 1,0 g Chlor-desoxy-patulinsäure

wurde in 30 ccm Wasser gelöst und in Anwesenheit von 1,0 g Palla-

dium/Bariumsulfat-Katalysator (2,4 % Pd) hydriert. Nach 100 Min.

war die theoretische Wasserstoffmenge ( = 231 ccm; 0°, 760 mm Hg)

aufgenommen worden. Die Wasserstoffaufnähme ging langsam welter.

Nach Aufnahme von 250 cca Wasserstoff (0°, 760 mm) wurde die Hy¬

drierung unterbrochen. Die filtrierte Lösung wurde mit 1-n Natron¬

lauge titriert (Indikator: Bronthymolblau). Es wurden 10,4 ccm

Lauge verbraucht. Die neutralisierte Lösung wurde kontinuierlich

mit Aether extrahiert, und so wurden 30 mg neutrales Oel erhalten,

das nicht weiter untersucht wurde (s. oben).

Die wässerige Lösung wurde dann angesäuert und mit Essigester

extrahiert. Nach Abdampfen des Lösungsmittels wurden 550 mg farb¬

loses Oel erhalten, welches im Hochvakuum nicht destillierte.

Die Identität der zwei Präparate wurde durch Vergleich der

festen Derivate bewiesen.

p-Phenyl-phenacylester von Dihydro-desoxy-patullnsäure. (7)

Das rohe Hydrierungsprodukt aus 100 mg Desoxy-patulinsäure

wurde in Wasser gelöst und mit 5,8 ccm 0,1-n Natronlauge auf

Bromthyrrolblau neutralisiert. Zu der neutralen Lesung wurden

135 mg p-Phenyl-phenacylbromid in 20 ccm Alkohol zugegeben. Die

Lösung wurde 1 Stunde am RUckfluss gekocht, im Vakuum bis auf

15 ccm eingeengt und stehen gelassen. Es fielen 50 mg Substanz

vom Schmelzpunkt 115-122° aus. Sie wurden in Benzol gelöst und

an 1,5 g neutralem Aluminiumoxyd (Aktivität III) chromatogra-

phiert. Die Benzol-Fraktionen (40 mg) wurden vereinigt und aus

Benzol-Petroläther umkrystallisiert. Der Schmelzpunkt stieg auf

125-126,5° ( B e r g e 1 und Mit. (7) Fp. 125-127°). Zur Ana¬

lyse wurde die Substanz 24 Stunden bei 60 im Hochvakuum ge¬

trocknet .

3,750 mg Substanz gaben 9,851 mg C02 und 1,907 mg HjOG-.H-nO, ber. C 71,57 H 5,72 %21 20 5

gef. C 71,69 H 5,69 %

- 41 -

Dlnltrophenylhydrazon von Dlhydro-desoxy-'patulinsäure. (7)

100 mg rohes Natriumsalz der nach b) aus Chlor-desoxy-patu-

llnsäure erhaltenen Dihydro-desoxy-patulinsäure in 5 ccm Wasser

wurden mit einer helssen Lösung von 125 mg 2,4-Dinitrophenylhy-

drazin in 10 ccm 2-n Salzsture versetzt. Nach dem Abktlhlen fielen

130 mg Substanz aus, die nach mehrmaligen Umlösen aus Alkohol-

Wasser bei 192-195° schmolzen ( B e r g e 1 und Mit. (7) Fp.

197-199°). Zur Analyse murd« die Substanz 3 Tage bei 60° im

Hochvakuum getrocknet.

3,620 mg Substanz gaben 6,114 ng C02 und 1,336 mg H„0

C-.H-.O-N, ber. C 46,15 H 4,17 %13-14 7"4

gftf. c ^^o h 4,13 %

Dlhydro-desoxy-patullnsäure-niethylester.

200 mg rohe Dihydro-desoxy-patulinsUure(aus Desoxy-patulin-

säure) wurden in Aether gelöst und mit einer ätherischen Lösung

von Diazomethan versetzt. Nach einer halben Stunde wurde das Lö¬

sungsmittel im Vakuum abgedampft, der Rückstand in Aether aufge¬

nommen und mit wenig verd. Salzsäure, Natriumhydrogencarbonatlö-

sung und Aasser gewaschen. Nach dem Trocknen und Eindampfen wur¬

den 180 mg Oel erhalten, das bei 90° im Vakuum der Wasserstrahl¬

pumpe zweimal destilliert wurde.

2,217; 3,436; 3,842 mg Substanz gaben 4,530; 7,000; 7,862 mg CO

und 1,416; 2,196; 2,431 mg H26C8H12°4 ber* C 55'80 H 7'03 ^

gef. C 55,76 H 7,15 %C 55,60 H 7,15 %C 55,84 H 7,08 % (Präp. III)

d*°= 1,1658, n£°= 1,4637 (Präp. III); Mp gef.: 40,733, Mp ber.

für CgH120, (l C-0-C ; 1 C=0 ; 1 -C00CH ) = 40,252.

Dlnltrophenylhydrazon von Dihydro-desoxy-patullnsäure-methylester.

100 mg roh* Dihydro-desoxy-patulinsäure (aus Chlor-desoxy-

patulinsäure) wurden In wenig Meth»nol gelöst und mit einer Lö-

- 42 -

sung von 150 ng 2,4-Dlnltrophenylhydra,zln (in kons. Schwefelsäu¬

re/Methanol nach Brady (12)) versetzt. Es fiel ein Nieder¬

schlag aus, der aus Methanol umkrystallisiert wurde. Zur Analyse

wurde das Derivat 24. Stunden bei 70° im Hochvakuum getrocknet.

Es schmolz bel H9-1500.

3,766 mg Substanz gaben 6,589 mg COj und 1,570 tng HjOC-.H-AH. ber. C 47,73 H 4,5814 16 7 4

gef< c 47>75 H 4>66

Alkalibeständlgkelt von Dlhydro-desoxy-patullnsaure.

100 mg ( = 0,64 mMol) rohe Dihydro-desoxy-patulinsäure wur¬

den in Wasser gelöst und mit 0,1-n Natronlauge neutralisiert. Als

Indikator diente Phenolphthalein. Es wurden 6,4 ccm ( = 1,01

Aequiv.) verbraucht. Die Lesung wurde dann mit 10 ccm 0,1-n Na¬

tronlauge versetzt und 4 Stunden bei 20 stehen gelassen. Bei der

Rücktitration (Indikator: Phenolphthalein) wurden 9,6 ccm 0,1-n

Salzsäure verbraucht(Theorie: 10 ccm). Es wurden nochmals 5 com

0,1-n Natronlauge zugegeben und 15 Stunden bei Zimmertemperatur

stehen gelassen. Nach dieser Zeit wurde wiederum mit 0,1-n Salz¬

säure (Indikator: Phenolphthalein) zurücktitriert. Der Stturever-

brauch betrug 4,85 ccm (Theorie: 5,0 ccm).

Verseifung von Dihydro-desoxy-patulinsäure-methylester.

32 mg ( = 0,186 mMol) Dihydro-desoxy-patulinsäure-methyl-

ester wurden mit 5,0 ccm 0,1-n Natronlauge versetzt und 24 Stun¬

den bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Es wurde dann mit 2,9

ccm 0,1-n Salzsäure (Indikator: Phenolphthalein) zurücktitriert.

Der Verbrauch an 0,1-n Natronlauge betrug 2,1 ccm ( = 1,14 Aequiv.).

Pyrldazlnon aus Dihydro-desoxy-patulinsäure.

42 mg Dihydro-desoxy-patulinsäure-methylester wurden In

5 ccm Methanol gelöst und mit 22 mg ( = 1,5 Mol) Hydrazinhydrat

- 43 -

in 5 ccm Methanol 1 Stunde am Rückfluss gekocht. Das Methanol

wurde im Vakuum abgedampft und der Rückstand aus Benzol-Petrol-

äther umkrystallisiert. Nach mehrmaligem Umlösen schmolz das Pro¬

dukt bei 156-158 . Der Test auf Hydrazide mit Natriumpentacyano-

amino-ferroat war negativ. Zur Analyse wurde die Substanz bei

120° im Hochvakuum sublimlert.

3,590; 4,020 mg Substanz gaben 7,177; 8,018 mg C02 und 2,072;

2,400 mg H20.2,183 mg Substanz gaben 0,353 ccm N„ (19°, 729 mm).

CyH^iy^ ber. C 54,53 H 6,54 N 18,17 %

gef. C 54,56 H 6,45 N 18,13 %

C 54,42 H 6,68 %

U-V-Spektrum: ylmax>= 2500 5, lg l = 3,95.

Oxy-pyrldazin aus Dlhydro-desoxy-patulinsäure.

70 mg Oxy-dihydro-pyridazin aus Dihydro-desoxy-patulinsäure

wurden mit 0,5 ccm einer 1-mol. Bromlösung in Eisessig versetzt

und das Gemisch auf 100 erhitzt. Es trat sofort eine heftige

Reaktion unter Bromwasserstoff-Entwicklung ein. Nach dem Abkühlen

krystallisierten ca. 70 mg Oxy-pyridazin-hydrobromid vom Schmelz¬

punkt 250-252° aus. Sie wurden in Wasser gelöst und mit 2-n Na-

triumcarbonat behandelt. Um das Überschüssige Brom zu entfernen,

wurde noch etwas Natriumsulfit zugegeben. Durch Extraktion mit

Essigester Hessen sieb. 50 mg Oxy-pyridazin vom Schmelzpunkt

226-229 isolieren. Nach mehrmaligem umlösen aus Methanol-Benzol

betrug der Schmelzpunkt 230-231,5 .Die Analysenprobe wurde im

Hochvakuum bei 130° sublimlert.

3,859 mg Substanz gaben 7,803 mg C02 und 1,806 mg H203,290 mg Substanz gaben 0,543 ccm N2 (20°, 730 mm)

C-H-O-N, ber. C 55,25 H 5,30 N 18,41 %' * * *

gef. c 55,18 H 5,24 N 18,47 %

Ü-V-Spektrum:^^^ 2960 2, lg £ = 3,5; Amin>= 2510 8, lg£= 2,5.

- u -

3-Methyl-pyrldazinon-(6). (18,41,56)

Das Produkt wurde nach der Vorschrift von Wolff (56)hergestellt. Das Analysenpräparat wurde längere Zelt an der Luft

stehen gelassen. Fp. unscharf bei 80° ( W o 1 f f (56): Fp. 82°

mit Krystallwasser, 104-105° ohne Krystallwasser).

4,020 mg Substanz gaben 6,796 mg CO. und 2,766 mg H?02,388 ng Substanz gaben 0,462 ccm N,C.HaOW.j.H-O ber. C 46,14 H 7,75 N 21,53 %5 ö * "

gef. C 46,14 H 7,70 N 21,47 %

U-V-Spektrum: Ämax<= 2450 8, lg fc = 4,2.

3-Methyl-6-oxy-pyrldazin. (41)

130 mg 3-Methyl-pyridazinon-(6) wurden mit 1 ccm einer 1-

mol. Bromlösung in Eisessig versetzt und auf 100 erhitzt. Es

erfolgte heftige Bromwasserstoff-Entwicklung. Nach dem Abkühlen

krystalllslerten 120 mg Hydrobromid vom Schmelzpunkt 161-165°aus. Dieses wurde in Wasser gelöst, mit Watriumcarbonat und we¬

nig Natriumsulfit versetzt und das freie Pyrldazin mit Essigester

extrahiert. Es wurde aus Benzol-Petroläther umkrystalliaiert. Die

reine Verbindung schmolz bei 140-142 (Poppenberg (41)

Fp. 143°). Sie wurde zur Analyse im Hochvakuum bei 100° subli-

miert und vor der Verbrennung noch 12 Stunden über Phosphorpent-

oxyd getrocknet, da sich die Substanz als hygroskopisch erwies.

3,830 mg Substanz gaben 7,632 mg CO, und 1,865 mg H_0

2,879 mg Substanz gaben 0,660 ccm Ng (20,727 mm)

C,HA0N, ber. C 54,53 H 5,49 N 25,45 %502

gef. C 54,33 H 5,45 N 25,56 %

U-V-Spektrum: /*max#= 2900 Î, lg £ = 3,45j Amla.= 2480 X, lgfc= 2,4.

- 45 -

Vorversuche zur Synthese^ der Dlhydro-despxy-patullnsäure (XIII a)

Kondensation von Acetopropanol mit Oxalsäureester.

t

995 mg ( = 0,0433 Mol) Natrium wurden in 50 ccm absolutem

Alkohol gelöst, Im Vakuum eingedampft und mit einer Lösung von

6,35 g ( = 0,0435 Mol) Oxalsäure-äthylester in 100 ccm Aether ver¬

setzt. Unter Rühren wurden nun bei Zimmertemperatur 2,2 g ( = 0,0216

Mol) Acetopropanol in 50 ccm Aether langsam zugetropft. Es wurde

4 Stunden gerührt 'und über Nacht stehen gelassen. Das ausgefallene

rote Pulver wurde abgenutscht, mit Aether gewaschen, getrocknet

und gewogen. Es wurden 6,1 g Natriumsalz erhalten.

Bestimmung der Estergruppen durch Hydrolyse. (37)

Die genau eingewogene Probe wurde in 10 ccm Wasser gelöst,

mit 0,5 ccm 2-n Schwefelsäure versetzt und 10 Minuten mit abstei¬

gendem Kühler gekocht. Das Destillat wurde in einen Kolben mit

10 ccm 0,354-n Kaliuabichromat und 10 ccm konz. Schwefelsäure

eingeleitet. Diese Lösung wurde dann i Stunde erhitzt, mit 200

ccm Wasser verdünnt, mit 2 g Kaliumjodid versetzt und mit 0,1-n

Natriumthiosulfatlösung titriert.

Resultate.

Substanz Menge

mg

ccm 0,1-n

K2Cr2°7Menge Alkohol

in mg

% Alk.

gef.Bemerkung

gef. ber.

Chelidonsäureester

(MG 240)Natriumsalz aus d.

Kondensation von

Acetopropanol mit

Ozalester (MO 300)

54,0

90,7

105,3

13,5

9,7

11,4

15,5

11,1

13,1

20,7

13,9

16,1

75,0

79,8

81,4

für 2 Mol

tt j n

- 46 -

Rlngschluss: 2-Carbgthoxy-5-ß-oxyathyl-6-carboxy-pyron-lacton

(XXXV)f (16)

300 mg N&triumsalz wurden In 30 ccm absolutem Aether suspen¬

diert. In die Suspension wurde während einer Minute trockener

Chlorwasserstoff eingeleitet. Dann wurde la Vakuum eingedampft

und der Rückstand aus Aceton-Alkohol umkrys'tallisiert. Es wurden

100 mg Ester erhalten (Ausbeute 49 %). Nach mehrmaligen) Italösen

aus Aceton-Alkohol und Benzol-Petroläther schmolz die Substanz

bei 168-169°. Zur Analyse wurde sie bei 120° im Hochvakuum subli-

miert.

3,897; 3,802 mg Substanz gaben 7,910; 7,702 mg C0_ und 1,564;1,388 mg H20.

•

*

C11H10°6 ber' C 55'46 H 4'23 *

gef. C 55,39 H 4,49 %C 55.,28 H 4,09 %

U-V-Spektrum:^max>= 2810 2, lg£=4,05; Ämln#= 2510 X, Igt = 3,5.

Alkalische Hydrolyse des. Lacton-esters (XXXV),

50,8 mg ( = 0,214 mMol) Ester (XXXV) wurden In 10 ecm 0,1-n

Natronlauge gelöst und nach 24 Stunden mit 0,1-n Salzsäure zurück¬

titriert (Indikator: Phenolphthalein). Es wurden 3,4 cca 0,1-n

Salzsäure verbraucht. Dies entspricht einem Lauge-Verbrauch von

6,6 ccm =3,08 Aequlv.

Zum Vergleich wurde Chelidonsäureester in gleicher Weise

titriert. 66,5 mg verbrauchten 8,2 ccm 0,1-n Natronlauge, was

2,95 Aequlvalenten pro 1 Mol Ester entspricht.

Saure Hydrolyse des Lactonesters (XXXV):

3-( ft-Oxytthyl)-2-carboxy-pyron-lacton (XXXVI).

50 mg Ester (XXXV) wurden In 2 ccm 1-n Salzsäure 1 Stunde

auf 100° erhitzt, im Vakuum eingedampft und der Rückstand aus

Methanol-Benzol krystallislert. Zur Analyse wurde die Substanz

bei 160° 1b Hochvakuum sublialert. Sie schmolz bei 233-235° (Zers.).

- 47 -

3,68^ mg Substanz gaben 6,919 mg C02 und 0,988 mg H.0

CQH,0, ber. C 51,44 H 2,88 %v ° °

gef. C 51,25 H 3,00 %

Titration der Lacton-sSure (XXXVI).

50,2 mg ( = 0,24 oHol) Lacton-säure (XXXVI) wurden in 10 ccm

Alkohol gelöst und mit alkoholischer 0,05-n Natronlauge titriert

(Indikator: Phenolphthalein). Die erste Rotfärbung, die nur etva

10 Sekunden bestehenblieb, wurde nach Zugabe von 5,05 ccm Lauge

beobachtet (1,05 Aequlv.). Nach Zugabe von total 9 ccm Lauge

blieb die rote Färbung 48 Stunden bestehen. Es wurde dann mit

0,1-n Salzsäure zurUcktitriert. Dabei wurden 0,7 ccm Säure ver¬

braucht. Der Total-Verbrauch an 0,05-n Natronlauge betrug also

ca. 7,6 ccm ( = 1,58 Aequlv.).

- 48 -

.^£ËËiîS2 uȧE_222y-si5Ç*îi??!ïy.⣰3.

Jodometrlsche Bestlinnung.

Die Substanz wurde jeweils in Wasser gelöst, mit 1 ccm 4-n

Essigsäure, 20 ccm 2-n Natriumacetat und 19,18 ccm 0,05-n Jod-

lösung versetzt und der Jodüberschuss mit 0,05-n Thiosulfat zu¬

rücktitriert (Indikator: Stärke). 71,6; 42,7; 59,4; 23,9 mg

Substanz verbrauchten 14,58; %0&; 12,88; 5,3»! ccm 0,05-n Jod-

lösung.

Gehalt an Gentisinalkohol: Gef. 71,2; 74,5; 75,9; 78,2 %.

der. für (CfaO^)yC^Oy. 75,3 %.

Kontroll-Titration von Gentisinalkohol: 29,6 mg Gentisin¬

alkohol verbrauchten 8,29 ccm 0,05-n Jodlösung (ber. 8,46 ccn).

Quantitative Acetylierung. (48)

Die Substanz wurde zu einem Gemisch von 0,5 ccm Pyridin

und 2 ccm einer ca. 1,5-mol. Lösung von Aoetylchlorid in Toluol

unter Eiskühlung gegeben. Nach 24-stündigem Stehen bei Zimmer¬

temperatur wurde das Gemisch mit 5 ccm Wasser versetzt, gut

umgeschwenkt und mit 0,1-n Natronlauge titriert (Indikator:

Phenolphthalein). Bei jeder Bestimmung wurde eine Blindprobe

mit 0,5 ccm Pyridin und 2 ccm einer ca. 1,5-mol. Lösung von

Aoetylchlorid in Toluol ausgeführt.

101,5; 102,1 mg Substanz verbrauchten 36,5; 36,6 ccm 0,1-n

Natronlauge. Bltndversuche: 53,2; 53,4 ccm 0,1-n Natronlauge.

Dies entspricht einen 0,1-n N&tronlauge-Verbraueh von 16,7;

16,8 ccm (theoretisch für Gentisinalkohol 21,72; 21,90 ccm).

Oentlsinalkohol-Gehalt: gef. 76,V %', 76,7 %.

(C7H803)3,C?H603: ber. 75,3 %.

- 49 -

Katalytische Hydrierung.

a) mit 10-proz. Palladiumkohle: Oentislnalkohol, 123 mg Substanz

wurden In 15 ccm Alkohol gelöst und in Anwesenheit von 100 mg

lC-proz. Palladium-Kohle hydriert. Die Wasserstoffaufnahme war

nach 30 Min. beendet. Die Lösung wurde filtriert und Im Vakuum

eingedampft. Der Rückstand wurde aus Methanol-Chloroform umkry-

stallisiert. Man erhielt 95 mg Gentisinalkohol vom Fp. 99-101°.

Der Mischschmelzpunkt mit einem aus Patulin-Hutterlaugen isolier¬

ten Vergleichspräparat von Oentislnalkohol gab keine Schmelz¬

punktserniedrigung. Das Analysenpräparat wurde AB Stunden im

Hochvakuum bei Zimmertemperatur getrocknet.

3,726 mg Substanz gaben 8,165 mg C02u. 1,970 mg H.,0

C-Ha0, ber. C 59,99 H 5,75 %' ö J

gef. C 59,80 H 5,92 %

b) mit Platin8 Toluhydrochlnon. 200 mg Chinhydron in 5 com Fein¬

sprit wurden in Anwesenheit von 200 mg 10-proz. Palladium-Kohle

vorhydriert. Die Wasserstoffaufnähme betrug 15 ccm (l Mol = 16

ccm, 0°, 760 mm). Das Gemisch wurde filtriert und das Filtrat

im Vakuum eingedampft. Die Hälfte des Rückstandes wurde in 5 ccm

Feinsprit und in Anwesenheit von 30 mg vorhydriertem Platinoxyd-

Katalysator in 3 ccm Feinsprit weiterhydriert. Nach Aufnahme von

17,2 com Wasserstoff (Theorie: 16 ccm) wurde die Hydrierung un¬

terbrochen und der Katalysator durch Filtration entfernt. Die

klare, farblose Lösung wurde eingedampft und der Rückstand bei

110° im Hochvakuum subllmiert. Das subllmierte Produkt wurde

zweimal aus Benzol umkrystallisiert und schliesslich nochmals

subllmiert. Der Schmelzpunkt lag bei 120-122°, unverändert beim

Mischen mit Toluhydrochlnon vom Schmelzpunkt 123-124 .

üeberführung in Oentislnalkohol durch Reduktion mit

Jodwasserstoffsäure.

100 mg Substanz wurden in Wasser gelöst, mit 500 mg Kalium¬

jodid versetzt und die Lösung mit S-lzsäure angesäuert. Das

- 50 -

Reduktionsprodukt wurde nach Entfernung des freigesetzten Jods

mittels Thiosulfat mit Essigester extrahiert. Nach Eindampfendes Lösungsmittels Im Vakuum wurden 75 mg ölige Substanz erhal¬

ten. Letztere wurde an neutralem Aluminiumoxyd (Akt. Ill) chro-

matographiert. Mit Aether Hess sich der reine Gentislnalkohol

eluleren. Er schmolz zwischen 98 und 101°. Der Ilischschmelzpunkt

mit einem Vergleichspräparat zeigte keine Erniedrigung.

Oxydation mit Eisen-(lII)-alaun: Oxymethyl-p-benzochlnon.

a) 100 mg Substanz wurden in 20 ccm Wasser gelöst, mit 1000 mg

Eisen-(lll)-alaun versetzt und die Lösung dann ausgeäthert. Nach

dem Trocknen und Eindampfen wurden 90 mg gelbe Krystalle erhal¬

ten. Sie Hessen sich aus Aether-Petroläther umkrystallisieren

und schmolzen bei 75-76°. Das Analysenpräparat wurde im Hochva¬

kuum bei 60° sublimiert.

3,638 mg Substanz gaben 8,094 mg C02 und 1,400 mg H,0C„H,0_ ber. C 60,87 H 4,38 %

' ° igef. C 60,72 H 4,31 %

U-V-Spektrum:A^

= 2460 8, Igt = 4,2max.

b) Verelaichspräparat aus Gentislnalkohol. 100 mg Gentislnalko¬

hol wurden wie oben in wässeriger Lösung mit Eisen-(lll)-alaun

'behandelt. Das erhaltene Chlnon (70 mg) wurde aus Aether-Petrol¬

äther umkrystallisiert und zur Analyse im Hochvakuum bei 60°

sublimiert. Es schmolz bei 75-76°. Mit dem obigen Präparat gab

es keine Schmelzpunktserniedrigung.

3,740 mg Substanz gaben 8,323 mg C02 und 1,438 mg HO

C„H,0_ ber. C 60,87 H 4,38 %' ° i

gef. C 60,74 H 4,30 %

Ü-V-Spektrum: Xmax,= 2470 8, lg i. = 4,25

- 51 -

Acetylierung; Oentislnalkohol-triacetat.

t

a) alt Acetanhydrid in Pyridin. 100 mg Substanz wurden in 2 ccm

Pyridin gelöst und die Lösung mit 1 ccm Acetanhydrid versetzt.

Nach einer Stunde wurde das dunkelgelbe Gemisch auf Eis gegossen,

das ölige Produkt in Aether aufgenommen und neutral gewaschen.

Hach Abdampfen des Lösungsmittels wurden 150 mg braungelbes Oel

erhalten. Letzteres wurde viermal im Hochvakuum bei 85° destil¬

liert und dann analysiert.

.4,205 mg Substanz gaben 9,062 mg C02 und 1,974 mg H20C.,H..,0, ber. C 58,65 H 5,30 %Li M °

gef. C 58,81 H 5,25 %

ü-V-Spektrum:/lmax_= 2670 2, Ige = 2,8} Xmixl = 2480 8, lg£ = 2,4

b) mit Acetanhydrid und konz. Schwefelsäure. 100 mg Substanz

wurden in 2 ccm Essigsäure gelöst, die Lösung in Eis gekühlt,

mit 1 ccm eines Gemisches von Acetanhydrid und konz. Schwefel¬

säure (lOO Volumen-Teile : 5 Volumen-Teile) tropfenweise unter

stetem Umschwenken versetzt, zehn Minuten bei 0 und fünfzehn

Minuten bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Nun wurde die Lö¬

sung auf Eis gegossen, gut umgerührt und mit Aether ausgeschüt¬

telt. Die ätherische Lösung wurde neutral gewaschen, getrocknet

und Im Vakuum eingedampft. Man erhielt 170 mg eines dickflüssi¬

gen, fast farblosen Oeles, das nach zweimaliger Destillation im

Hochvakuum (Block-Temperatur 80-90°) in zwei Teile geteilt wurde.

Ein Teil wurde einer reduzierenden Acetylierung unterworfen (s.

unten); der zweite wurde zur Analyse noch zweimal im Hochvakuum

destilliert.

3,860 mg Substanz gaben 8,269 mg CO, und 1,873 mg H.,0

Ct-H-.O, ber. C 58,65 H 5,30 %Li ** 6

gef. C 58,46 H 5,43 %

c) reduzierende Acetylierung des Acetates. 50 mg des nach b)

hergestellten Acetates wurden in 4 ccm Eisessig gelöst, die

Lösung mit 3 ccm Acetanhydrid, 250 mg Zink-Staub und 100 mg

- 52 -

wasserfreiem Natriumacetat versetzt und zwei Stunden am Rückfluss

gekocht. Das Gemisch wurde nach dem Erkalten filtriert und das

Filtrat im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wurde in Aether auf¬

genommen, neutral gewaschen und der Aether abgedampft. Das so er¬

haltene, dickflüssige Oel (50 mg) wurde zur Analyse im Hochvakuum

bei 90-95° dreimal destilliert.

3,552 mg Substanz gaben 7,616 mg C02 und 1,690 mg H20C.-H-.O, ber. C 58,65 H 5,30 %u M b

gef. C 58,51 H 5,32 %

d) Vergleichspräparat aus Gentisinalkohol. 100 mg Qentlsinalkohol

wurden, wie unter b) angegeben, acetyliert. Das ölige Produkt

wurde zur Analyse dreimal im Hochvakuum bei 80 destilliert.

3,514 mg Substanz gaben 7,528 mg CO« und. 1,680 mg H.O

C.,H.,,0, ber. C 58,65 H 5,30 %13 u °

gef. C 58,47 H 5,35 %

U-V-Spektrum:/1max>= 2670 X, Igt = 2,75; ÄmiB.= 2490 2, lg £= 2,45

Behandlung mit Phenylisocyanat:

Tris-phenylurethan von Gentisinalkohol."

a) 100 mg der violetten Molekelverbindung vrurden bei 0 mit 0,5 g

Phenylisocyanat versetzt und nach Zugabe von 5 com absolutem Ben¬

zol 24 Stunden stehen gelassen. Das Gemisch wurde filtriert und

das Filtrat im Vakuun eingedampft. Der Rückstand wurde aus Essig¬

ester mehrmals umkrystallisiert. Das Produkt krystallislerte in

feinen, verfilzten Nadeln vom Fp. 163-165°. Es wurde zur Analyse

40 Stunden bei 65° im Hochvakuum getrocknet.

3,684 mg Substanz gaben 9,105 n>g CO und 1,541 mg HO

2,378 mg Substanz gaben 0,225 ccm N^ (17 , 715 mm)*

C,aH_,0,lI, ber. C 67,59 H 4,66 H 8,45 >><:ö o t> i

gef# c 67>A3 H ;^68 N Sj65 ^

b) Vergleichspräparat aus Gentlslnalkohol. 100 mg Gentlslnalkohol

wurden, wie oben beschrieben, mit Phenylisocyanat behandelt. Das

Produkt wurde ebenfalls aus Essigester umkrystallisiert und

schmolz bei 16,4.-166 .Es gab mit dem aus der Molekelverbindung

erhaltenen Derivat keine Schmelzpunktserniedrigung. Das Anslysen-

präpe

net.

präparat wurde im Hochvakuum während 40 Stunden bei 65° getrock-

3,758 mg Substanz gaben 9,268 mg C0_ und 1,610 mg H?03,041 mg Substanz gaben 0,235 ccm N^ (13 ,

716 mm)

C,.,H„0,N, ber. C 67,59 H 4,66 N 8,45 >M ° ° i

gef. C 67,30 H 4,79 H 8,54 %

Synthetische Herstellung der Molekelverbindung.

Eine Lösung von Gentlslnalkohol wurde mit einer ätherischen

Losung von Oxymethyl-p-benzochinon versetzt. Durch Zugabe von

Petroläther krystallisierte die Molekelverbindung aus. Das Pro¬

dukt wurde mehrmals aus Essigester-Petrolather unkrystallisiert

und schmolz dann bei 89-90°. Der Ltischschrelzpunirt nit dem aus

Kultur-Filtrat isolierten Produkt zeigte keine ScmrelzpunKtser-

niedrigung. Das Analysenpräparat wurde 48 Stunden bei Zimmer¬

temperatur im Hochvakuum getrocknet.

3,652 ng Substanz gaben 3,020 mg C0_ und 1,834 ng K,0

(C„Hs0,),.C_HA0, ber. C 60,21 H 5,4l %'

7 8 3 3 7 6 3gef# c 59f9A ,d

_ 5)62 %

U-V-Spektrunr/L^^ 2950 X, lg£ = 3,8; ^^ = 3300 2, lgt = 2,4;

*ir.in. = 2700?-> ût=3,3. *X

- 54 -

Arbeiten über das schwefelhaltige Antibiotikum ausVertlcllllum

cinnabarlnum und Chaetomluat spirale. *) **)

Kulturbedingungen.

Der Pilz wurde in rotierenden Flaschen unter Zuführung von

steriler Luft auf feuchter Kleie gezüchtet. Das Optimum an Akti¬

vität (ca. 800 E/g Kleie) wurde nach 6-8 Tagen erreicht.

Erste Extraktionsversuche.

a) durch Chromatographleren an Alumlniumoxvd. 300 g Kleie

(Trockengewicht) wurden mit 1,4 L Aether versetzt und 24 Stunden

bei 0° stehen gelassen. Nach dieser Zeit betrug die Aktivität

der Lösung 270 E/ccm = 378000 E tot. = 1265 E/g Kleie **). Der

Aether wurde abgegossen, die Kleie nachgewaschen und ausgepresst.

Nach dem Abdampfen des Aethers wurden 2,78 g öliger, unangenehm

riechender Rückstand erhalten. Dieser wurde in Benzol gelöst und

an 80 g neutralem Aluminiumoxyd (Aktivität I/Il) Chromatograph! ert.

*) Alle Drehungen wurden in Chloroform und mit einem 1 dm langen

Rohr bestimmt.

**) Die Aktivitätsbestlmmungen wurden gegen Bouillon-Kulturen

von Staphylococcus aureus (Stamm E.T.H. 2024 und 2026) durchge¬

führt. Die Unlöslichkeit des Antibiotikums in Wasser zwang uns,

Acetonlösungen zu verwenden, die mit 2-proz. Gunrniiarabicumlösung

(als Schutzkolloid) verdünnt wurden. Trotzdem schwankten die Tests

bis zu 100 %. Deshalb sind die Aktivitätsangaben nur als Annähe¬

rungswerte zu betrachten.

- 35 -

Tabelle II

Ho, Lösungsmittel OCtD E/cca E tot. g E/mg a

1 Benzol 300 0 0 504 Ä 18,72 Benzol-Aether 1:1 250 0 0 22 - 0,83 Aether 50 0 0 18 - 0,74 il 80 0 9 40 - 1,55 n 50 238 11900 252 42 9,36 n 50 800 40000 408 98 15,17 n 50 477 23900 480 48 17,88 n 50 477 23900 197 121 7,39 n 50 477 23900 130 177 4,810 n 50 477 23900 73 328 2,711 n 50 200 10000 66 151 2,412 n 200 142 28400 58 483 2,113 Aether-Aceton 10 $ 80 2660 213000 142 1500 5,2

14 Aceton 80 40 3200 30 106 0,915 Aceton-Methanol 50 160 8000 100 80 3,716 Methanol 200 56 11200 120 93 4,517 n 200 10 2000 50 40 1,8

Wie aus obiger Tabelle ersichtlich ist, enthielten die Ben¬

zol-Fraktionen nur inaktives Material. Die ersten Aether-Fraktio-

nen waren ebenfalls inaktiv, die spateren zeigten eine Aktivität

von 50-300 E/mg. Die Aceton- und Methanol-Fraktionen waren wenig

aktiv und ölig. Die Hauptmenge des aktiven Stoffes wurde In der

ersten Aether-Aceton 10 : 1 -Fraktion eluiert. Das amorphe, aber

feste Material wies eine Aktivität von ca. 1500 E/mg auf. Es

wurde in Benzol gelöst und mit Petroläther gefällt. Es wurde

eine hellgelbe, feste Substanz, deren Aktivität 2000 S/mg betrug,

erhalten. Unter dem Mikroskop schien der Stoff mlkrokrystallin

zu sein. Es gelang aber nicht, ihn anders als in Form eines fei¬

nen, gelblichen Pulvers zu erhalten. Der Zersetzungspunkt lag bei

200°.

b) durch Fällung der aktiven Substanz mit Petroläther.

10 kg Kleie wurden mit 25 Liter Aether versetzt und 24 Stunden

stehen gelassen. Die Aktivität der ätherischen Lösung betrug

315 E/ccm oder 800 E/g Kleie.

Der Aether-Extrakt wurde auf 400 ccm eingeengt, mit wenig

Petroläther versetzt, weiter eingeengt und bei -10° stehen ge¬

lassen. Es fielen 2,0 g hellgelbe, pulverige Substaxu aus, deren

- 56 -

Aktivität ca. 2000 E/mg betrug. Sie zersetzte sich bei 205° nach

Sintern und Dunkelwerden ab 185°.•

Das Filtrat wurde nochmals mit Petroläther versetzt und ein¬

geengt. Es fielen 1,2 g etwas klebrige, gelbe Substanz mit einer

Aktivität von ca. 1200 E/mg und einem Zersetzungspunkt von 180°

aus.

Beide Fraktionen waren im wesentlichen nicht sehr verschie¬

den von der oben beschriebenen. Auch in diesem Falle war es nicht

möglich, das Produkt in makrokrystalliner Form zu erhalten.

c) Präparative Extraktionsmethode. Als Beispiel sei hier der

Arbeitsgang der Extraktion 13 wiedergegeben: 6 kg Kleie wurden

mit 23 Liter Aether versetzt und 2 Tage stehen gelassen. Die Ak¬

tivität der ätherischen Lösung betrug 200 E/cem = 4600000 E tot.

Der Aether wurde abdekantiert, die Kleie ausgepresst und mit 12

Liter frischem Aether 24 Stunden stehen gelassen. Die Aktivität

des zweiten Extraktes betrug 50 E/ocm = 600000 E tot.

Die Total-Aktivität der Kleie betrug also 850 E/g.

Die Aether-Lösungen wurden vereinigt und bis auf 300 can

eingeengt. Dann gab man 5 g "Cellite" (bzw. "Norite") und 600

com Petroläther zu. Der Niederschlag wurde abgenutscht, mit Pe-

troläther nachgewaschen, getrocknet und mit Aceton eluiert. Aus

dem Aceton-Eluat wurden durch Fällen mit Petroläther 3,05 g Sub¬

stanz (Aktivität ca. 2000 E/mg) erhalten (Fraktion A). Das fil¬

trat lieferte nach weiterer Zugabe von Petroläther 0,75 g Sub¬

stanz (Aktivität ca. 1200 E/mg) (Fraktion B).

In der Tabelle III findet sich eine Zusammenstellung über

die Ausbeuten an Ron-Produkt, welche nach der standardisierten

Aufarbeitung in verschiedenen Ansätzen erreicht wurden. In eini¬

gen Versuchen wurden aus dem Aceton-Eluat mehr als nur zwei

Fraktionen gefällt (Fraktionen C, D, u. w.).

- 57 -

Tabelle III «*)

o

W1a II

•

•

Ö

Ron-Produkt

4» T •

co

a

+»:o > i•H O

is

S "g•H «»} V •H

g

o

0

4»•H «OV M"H »O

4»H•

2 43 no ta £4»

O4»

«0

34»

•3S

a »0•H

« ä > «0H

0EH

5*: 1800 5,0 2800 18,1 5 A

5 B

5 C

5 D

0,100,100,250,6

230015001000

1530

0,230,150,250,92

5 E 0,25 800 0,20 1,30 1,756 2700 2,4 890 33.X 6 A 0,40 1600 0,64

6 B 1,20 440 0,53 1,60 1,177 5400 4,4 815 55,8 7 A

7 B

7 C

0,900,600,10

2100

770

690

1,890,460,07

7 D 0,70 370 0,26 2,30 2,688 2100 1,0 475 8 A 0,17 790 0,13

8 B 0,30 750 0,22 0,47 0,35

9*: 10100 8,0 800 9 A

9 B2,001,20

30001200

6,001,44

9 C 0,70 1500 1,05 3,90 8,5110 12000 13,0 1080 10 A

10 B

10 C

3,002,001,60

1800

25002200

5,405,003,50 6,60 13,90

11 6000 6,8 1130 11 A

11 B1,201,00

1300

24001,562,40

11 C 1,40 900 1,26 3,60 5,2212 15000 12,0 800 132,0 12 A 9,6 450 4,30 9,60 4,3013 6000 5,2 860 81,3 13 A 3,05 2500 7,63

13 B 0,75 1200 0,90 3,80 8,5314 18000 22,2 1230 228,0 H A

14 B2,806,20

1000

9002,805,57

14 C 0,90 650 0,58 9,90 8,95

«*) s. Fussnote **) S. 54.

*) Bei den Extraktionen 5-8 wurden Kleiekulturen von Verticilliumcinnabarinum (Stamm E.I.H. 1428), bei 9-14 von Chaetomium spirale(Stamm E.T.H. 1016) verwendet. Die isolierten Substanzen unter¬schieden sich in ihren chemischen und physikalischen Eigenschaf¬ten nicht wesentlich voneinander.

- 56 -

Physikalische Eigenschaften der Rohprodukte.

a) Aussehen: Die so erhaltenen Produkte waren hellgelbe

Pulver, die unter den Polarisationsmikroskop keine krystallln«

Struktur zeigten.

b) Röntgendlagramn '\ Es wurde ein Pulverdiagramm yon der

Substanz S 11 A aus Chaetomium mit Eisen-Strahlung aufgenommen.

-Belichtungsdauer 3i Stunden (Tabelle IV). Aus dem Diagramm kann

man schllessen, dass das Produkt mlkrokrystallin ist.

Tabelle IV

TT57 dhkl

A

Intensität

1 4,46 sehr schwach

2 4,07 stark

3 3,70 schwach

K 3,36 sehr schwach

5 2,12 sehr schwach

6 1,798 sehr schwach

c) Löslichkeit: Der Stoff war in Aceton, Chloroform, Essig¬

ester, Pyridin und Eisessig relativ gut löslich. In Benzol, Al¬

kohol und Aether war er massig löslich. In Wasser und Petroiather

löste er sich praktisch nicht.

d) Schmelzpunkt ; Die Substanz schmolz unter Zersetzung zwi¬

schen 180 und 215°. Vor der Zersetzung schrumpfte sie und wurde

dunkel. Die tiefer schmelzenden Präparate waren bedeutend weniger

aktiv und hatten auch eine niedrigere spezifische Drehung.

Die Zersetzungspunkte der einzelnen Präparate sind in der

Tabelle V zusammengefasst.

e) Drehung? Die Drehung in Chloroform betrug im Mittel

+ 690 +50° und war von der Konzentration unabhängig. Weniger

aktive Produkte hatten eine niedrigere spezifische Drehung.

' Das im Röntgeninstitut der E.T.H. aufgenommene Diagramm Ter

danke ich Herrn H. GUnthard.

- 59

Tabelle Y

Fraktion Smp. dLn

5 A *) 210" + 672

5B» 168° + 4965 C *} 1950 617

5 D •) 1700 + 3956 B *) 190o + 4107 A *) 2080 -

7 B *) 206° + 720

7 C *) 2Q40 + 7579 A **) 2050 -

10 A **) 1980 + 45010 B **) 1950 -

13 A **) 208o -

M A **) 2050 -

H B **) 1900 -

Li C **) 190 -

Beständigkeit. ***)

a) Temperaturbeständigkeit bei 35° in Aether; Eine ätheri¬

rische Lösung des Rohproduktes wurde am Rückfluss gekocht und

nach der angegebenen Zeit getestet.

Stunden Aktivität

E/ccra0 80

2 80

6 80

8 80

b) Temperaturbeständigkeit bei 25°. 50° und 100° in Wasser;

Getestet wurde eine wässerige, kolloidale Lesung der aktiven

Substanz (3,1 mg in 100 ccm) von der Anfangsaktivität 30 E/ccm.

Zelt Temperatur Aktivität

5 Tage60 Min.

10 n

50o

100°

25 E/ccm40" "

20 r n

*) aus Verticillium.

*») aus Chaetomium.

***) s. Fussnote »*) S. 54.

- 60 -

c) Beständigkeit gegen ffUflTWÜfUfTe; Eine Probe aktiver Sub¬

stanz In Wasser wurde alt zwei Tropfen 2-n Natronlauge versetzt

und 3 Stunden bei 20° stehen gelassen, dann neutralisiert und ge¬

testet.

Anfangsaktivität: 160 E/com.

Aktivität nach Behandlung mit Lauge: 0 E/ccm.

d) Beständigkeit gegen Salzsäure; Eine Probe aktiver Sub¬

stanz in Wasser wurde mit zwei Tropfen 2-n Salzsäure versetzt

und 3 Stunden bei 20° stehen gelassen, dann neutralisiert und

getestet.

Anfangsaktivität: 80 E/ccm.

Aktivität nach Behandlung mit Säure: 80 E/ccm.

Chemische Eigenschaften des Rohproduktes.

a) Qualitative Elementaranalyse: Die Substanz enthielt

Stickstoff und Schwefel. Die Proben auf Halogene und Phosphor

waren negativ.

b) Reaktionen:

Ferrichlorld in Alkohol: -

Jodlösung lq Alkohol und Eisessig: Entfärbung

Bromlösung in Eisessig: Entfärbung

Kaliumpermanganat in Aceton: Entfärbung

Ninhydrinreaktion bei p„ 6,5: -

Natriumazid-Test nach Feigl (2l) : +

Sublimatlösung In Alkohol: Niederschlag

Nltroprussidnatrium *) allein: -

Nltroprussidnatrium + Natriumcyanid: rot-violetter Ring

Nltroprussidnatrium + Natronlauge: dunkelbrauner Ring

*) Bei den Reaktionen mit Nltroprussidnatrium wurde die Substanz

in Pyridin gelöst, dann mit einer Nitroprussldnatrium-Lbsung und

zuletzt mit einer LtSsung des zweiten Reagens unterschichtet. Beob¬

achtet wurde die Färbung an der Berührungsfläche der zwei Schich¬

ten.

- 61 -

e) Quantitative Elementaranalysen von Rohurodukt-Fraktlonen:

100 mg Substanz wurden Jeweils in Aether gelöst, die Lösung fa¬

serfrei filtriert und auf die Hälfte eingeengt. Nach einigen Mi¬

nuten wurde das ausgefallene Produkt abgenutscht und zur Analyse

in Hochvakuum bei Zimmertemperatur während 24 Stunden getrocknet.

30°Fraktion 5 A (aus Verticillium): Zersp. 210 ; (*)i9= + 672 t ^ü(c = 0,608)

3,332 mg Substanz gaben 6,200 mg C0_ und 1,463 mg H„0

2,221 mg Substanz gaben 0,187 ccm N* (17 , 724 mm)4,079 mg Substanz verbrauchten 2,219 ccm 0,02-n KJ0,

gef. C 50,78 H 4,91 S 9,44 S 17,44 %

U-V-Spektrum: A = 2980 8, lg « = 3,6:A .= 2820A,

lg i = 3,5 (angenommenes Mol.-Gew.: 500)min'

Fraktion 7 A (aus Verticillium): Zersp.AIS"

3,798 mg Substanz gaben 6,940 mg C0_ und 1,474 mg H„0

2,848 mg Substanz gaben 0,262 ccm N_ (21,727 mm)

3,623 mg Substanz verbrauchten 2,06s ccm 0,02-n KJ0,

gef. C 49,87 H 4,34 N 10,22 S 18,30 %

Fraktion 7 C (aus Verticillium): Zersp. 215°; (*)i9= + 752°* 80°ü

(c = 0,103)3,808 mg Substanz gaben 6,774 mg C0? und 1,417 mg H„02,792 mg Substanz gaben 0,282 ccm IC (18

, 713 mm)3,251 mg Substanz verbrauchten l,83o ccm 0,02-n KJ0

gef. C 48,55 H 4,16 N 11,12 S 18,11 %

C21H22°6N4S3 ber. C 48,2 H 4,2 N 10,7 S 18,4 %

C22H24°6N4S3 ber. C 49,2 H 4,5 H,

10,4 S 17,9 %

C23^26°6V3 ber. C 50,2 H 4,8 N 10,2 S 17,4 $

Reinigung sversuche.

a) durch umfallen aus Benzol und Benzol-Petroläther. 120 mg

Fraktion 7 B (aus Verticillium, s. Tabelle III, S. 57), Zersp.

215°, («0D= + 717*32° (c = 0,616) wurden in 15 ccm heissem Ben¬

zol gelöst und die Lösung auf 6 ccm eingeengt. Es fielen 40 ig

gelbe Substanz (Fraktion 7 B II) vom Zersp. 215°, («Op« + 710+43

(c = 0,460) aus. Nach weiterem Einengen und Versetzen mit Petrol-

o

V

- 62 -

äther fielen 60 mg gelbwelsse Substanz (Frakt. 7 B III) vom Zersp.

210°, (*)D= + 720 ±30° (c = 0,554) aus. Aus den Mutterlaugen wur¬

den durch weiteres Einengen 10 mg gelbwelsse Substanz (Frakt. 7 B

IV) vom Zersp. 210°, (*)D= + 709 ±30° (o = 0,635) erhalten.

Nach Eindampfen der letzten Mutterlauge blieb als Rückstand

etwas stechend riechendes Oel, das grün-gelb gefärbt war.

b) durch Umfallen aus Chloroform-Aether; 30 mg Fraktion 7 B

II wurden aus Chloroform-Aether umgelöst. Es wurden 10 mg gelbe

Substanz (Frakt. 7 B V) vom Zersp. 212°, (*)D= + 692+60° (c =

= 0,298) erhalten.

Nach weiterem Einengen der Mutterlaugen fielen 15 mg gelb¬

welsse Substanz (Frakt. 7 B VI) vom Zersp. 206°, (»0D= + 662+41°

(c = 0,608) aus.

c) durch umfallen aus Aether; 40 mg Fraktion 7 B III wurden

aus Aether umgelöst. Es wurden erhalten:

1. 15 mg gelbe Substanz (Frakt. 7 B VII), Zersp. 208°, (<*•)„ =

= + 670 t50° (c = 0,527)

2. 15 mg gelbe Substanz (Frakt. 7 B VIII), Zersp. 208,

(*)_ nicht

ablesbar

3. A mg gelbe Substanz (Frakt. 7 B IX), Zersp. 210, (ot)r, nicht

ablesbar

Die Aktivität der verschiedenen Fraktionen war innerhalb der

Fehlergrenze für alle identisch und betrug Im Durchschnitt etwa

1250 E/mg.

Versuche zur Charakterisierung durch Titration. *)

a) Alkalische Hydrolyse, ca. 10 mg Substanz wurden Jeweils

in 1 ccm Alkohol gelöst, mit 1 ccm Barytlauge versetzt und im

Stickstoff-Strom stehen gelassen. Dann wurde mit 0,1-n Salzsäure

zurücktitriert (Indikator; Phenolphthalein).

*) wurden mit Substanzen aus Chaetomium durchgeführt.

- 63 -

Tabelle VI

Substanz Menge Zeit Verbr.0,1-n Barytlauge Aequiv.-Gev,icr.tKg St. ccm/10 mg

10 C 10,9 1 0,650 154n 9,2 3 0,748 134H 10,3 4 0,724 138ti 11,3 5 0,774 129n 11,8 15 0,723 137T! 9,4 15 0,734 136n 12,2 48 0,769 13C

9 C 13,6 15 0,696 144

10 A 9,3 15 0,752 133tt 9,9 15 0,744 134

11 A 11,4 15 0,738 136

11 C 11,9 15 0,696 144

13 A 10,6 15 0,682 146ft 10,2 15 0,660 152

13 B 16,2 15 0.625 160

b) Oxydation mit Jod (35). ca. 20 mg Substanz v.urden jeweils

in 2 ccm Eisessig gelbst und mit 5 ccm 0,01-n Jodlbsung in 90-

proz. Essigsäure versetzt. Jach einer Mnute wurden 10 cck nasser

zugegeben und mit 0,01-a Thiosulfatlösung zurücktitriert (Indika¬

tor: Stärke).

Tabelle VII

Substanz Venge Verbr.Jodmenge Verbr. Jodirenge/1 irg Aequiv.-Gewicht

n>g CCI? ccir/mg

9 C 16,0 2,3 0,144 700

10 A' 17,5 2,4 0,137 730n 20,0 2,7

'

0,135 74.0n 20,0 2,7 0,135 740n 20,5 i,8 0,137 730n 20,5 ',9 C,U1 705V 23, S 3,5 0,146 635

IC C 17,3 2,2 C,127 785n 15,3 2,1 0,133 750IT 17,3 2,2 0,127 785V 15,2 2,1 0,133 750

11 A 20,7 2,9 0,14C 715

11 c 19,4 ?,8 0,U4 690

n '5,? 3,6 0,142 705

13 A 19,6 2,2 0,112 8Ç0

1! 25, C 2,9 0,116 ivs

13 S ?*,1 3,0 0.K4 805

14 h 37,1 2,3 0,135 7*0n "i,c 2,3 0,1.-3 750

14 3 24,1 2,6 0,108 925n 23,9 2,8 0,117 S55

14 C 21,^ 2,4 0,-H- 8SO

V -LiO_ 2..1 :,ii> 890

- 64 -

c) Oxydation mit Brom, ca. 5 mg Substanz wurden jeweils in

1 ccm Eisessig gelöst und mit 5 ccm 0,01-n Bromlösung in Eisessig

versetzt. Nach 5 Minuten wurden 2 ccm ca. 0,5-n Kaliurajodidlösung

und 5 ccn> Wasser zubegeben und mit 0,01-n Thiosulfatlösung zurück¬

titriert (Indikator: Stärke).

labelle VIII

Substanz Menge Verbrauchte Brorru-jenge Aequiv.-Gewicht

mg ccm ccm/mg

10 A 7,4 3,85 0,520 192

ti 7,1 3,65 0,515 195

10 c 6,8 3,7 0,545 184h 6,9 3,8 0,550 182

IIA 7,6 3,85 0,506 197

HC 6,0 3,25 0,541 185

n 6,7 3,4 0,506 197

13 A 7,S 4,0 0,513 195

IT 6,4 3,5 0,546 1S3

11 8,0 3,9 0,488 205

1t 7,4 3,8 Q,514 195

H A 6,9 3,4 0,493 .203!1 8,7 3,8 0,437 229

H B 8,2 3,7 0,451 222

tt 7,5 3,55 0,472 212

M C 8,7 3,8 0,^37 229

» 8,2 3,6 0,438 228

Die Mikroanalysen wurden in der mikrochemischen Abteilung

der ELdg. Technischen Hochschule von den Herren W. Yenser und

G. Cornali ausgeführt.

Den beiden Herren sowie Trau G. Acklin sei auch an dieser

Stelle für ihre wertvolle Mitarbeit der beste Dank ausgesprochen.

- 65 -

Zusammenfassung.

Es wurden antibiotisch wirksame Stoffwechselprodukte fol¬

gender Pilze untersucht:

1. Pénicillium urticae (Bainier) Stamm E.T.H. 1634,

2. Vertlclllium einnabarinum (Corda, Reinke et Bertnold) Stamm

E.T.H. 1428,

Q. Chaetomlum spirale (Zopf) Stamm E.T.H. 1016.

Aus den Kulturfiltraten von Pénicillium urticae konnten wir

drei verschiedene' aktive Stoffe isolieren. Es sind die schon be¬

nannten: Patulln (3, 7, 15, 38, 43, 50) und Gentlsinalkohol (?)

>ind eine neue Molekelverbindung, die wir als Gentislnchlnhydron

von der Zusammensetzung (3 Vol Gentlsinalkohol : 1 Hol Gentisin-

chinon) identifizieren konnten.

Ein genaues Studium der Resultate Ralstrick's

und B e r g e 1 ' s (43, 7) veranlasste uns, die Konstitutions¬

formel dos Patulins (I) wieder in Erwägun« zu ziehen. Unsere Re¬

sultate führten uns zur Aufstellung dreier möglicher Formulierun¬

gen (XXIII, XXIII a, XXIII b), haben jedoch keinen direkten, po¬

sitiven Beweis für die Richtigkeit dieser Formeln erbringen kön¬

nen. Sicher steht nur folgendes:

1. Die Formel von Raistrick una B e r g e 1 fur das

Patulln (i) 1st nicht die einzige, welche die Abbau-Resultate

erklärt.

2. Die Formel (I a) und die entsprechende Enolform (I b) sind

durch die Synthese von P u e t -z e r und Vit. (42) als

falsch bewiesen worden.

3. Die Formel (I) von Raistrick und Mit. (43) steht

mit dem U-V-Spektrum des Patulins im Widerspruch.

4. Die Formel von B e r g e 1 und Mit. (7) für die Dihydro-

desoxy-patulinsäure (XIII) kann nicht richtig sein.

Demzufolge glauben wir, dass

a) der Dihydro-desoxy-patulinsäure die Struktur einer Tetrahyaro-

pyronyl-3-essigsaure (XIII a) zuzuschreiben ist.

b) das Gerüst des Patulins als bewiesen anzusehen ist. L'as Anti¬

biotikum könnte man also formell von der y-Pyronyl-3-essig-

säure ableiten.

- 66 -

i.'ir haben versucht, die Synthese der Tetrahydro-pyronyl-3-

essigsäure (Dlhydro-desoxy-patullr.säure (XIIl a)) durchzuführen.

Regen Zeltwengel und experimenteller Schwierigkeiten sind die

synthetischen Versuche.nicht zu tilde feebrt-cht v.orden.

Aus den Kleie-Kulturen von Verticillium cinnabc.rinun und

Chaetomium spirale haben »ir ein wasstrvr.lösliches, hocht-ktives,

schvtefei- und stickstoffhaltiges «ntibiotiKum von mikrokrystal-

liner Struktur isoliert.

Wir haben eine Isolierungsirethode ausgearbeitet und den

Stoff an Hand seiner physikalischen und chemischen Eigenschaften

zu charakterisieren versucht. Unsere Resultate lassen vermuten,

öass es sich um ein nicht einheitliches Produkt rändelt.

- 67 -

L iter a t u r z u s a m m e n s t e^ 1 1 u n g

1) E. P. Abraham, E. Chain, C. U. Fletcher, H. \\. Florey, A. C.

Gardner, N. G. Heatley, M. A. Jennings, Lancet 241. 177 (l94l)2) J. Attenburrow, J. Elks, D. F. Elliott, B. A. Heir>s, J. 0.

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Lebenslauf

Ich, Olgierd Wojciech Brzeski, wurde am 19. Februar 1921 in Poznan gebo¬

ren. Ich besuchte dort die Primarschule und das Gymnasium im A. Mickiewicza.

Das Ablegen des Maturitätsexamens wurde mir wegen der Schließung der pol¬

nischen Mittelschulen durch die Deutschen nach dem deutsch-polnischen Feld¬

zug im Herbst 1939 verunmöglicht. Im Frühjahr 1940 floh ich von Polen über

Ungarn nach Frankreich, wo ich der polnischen Armee beitrat. Mit der 2. Pol¬

nischen Division wurde ich an die Schweizer Grenze gedrängt und überschritt

diese im Juni 1940. Ich wurde in verschiedenen Lagern interniert, bis ich im

Internierten-Gymnasiallager Oberburg-Wetzikon meine Studien wieder aufneh¬

men konnte. Im Oktober 1941 bestand ich dort das Maturitätsexamen und wurde

in das Hochschullager Winterthur versetzt. Ich fing dort mein Chemie-Studium

an und konnte dieses nach zwei Jalren an der Eidgenössischen Technischen

Hochschule in Zürich fortsetzen. Im Herbst 1949 erhielt ich das Diplom als Ing.

ehem. E. T.H.

Seit dieser Zeit war ich mit der Durchführung dieser Promotionsarbeit im

organisch-chemischen Laboratorium der E. T. H. beschäftigt.

Zürich, den 10. Juni 1948.

OLGIERD WOJCIECH BRZESKI