Ricerche Microbiologiche: Procedure Standard del Regno Unito · La tassonomia di Streptococcus ed Enterococcus è stata aggiornata. Maggiori informazioni sono state aggiunte alla

Emesso da the Standards Unit, Microbiology Services Division,PHE Batteriologia - Identificazione | ID 4 | Emissione no: 3 | Data emissione: 28.10.14 | Pagina 1 di 36

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Ricerche Microbiologiche: Procedure Standard del Regno Unito Identificazione di specie Streptococcus, specie Enterococcus e Microrganismi Morfologicamente Simili

Identificazione di specie Streptococcus, specie Enterococcus e Microrganismi Morfologicamente Simili

Batteriologia – Identificazione I ID 4 I Emissione 3 I Data di emissione 28.10.14 I Pagina 2 di 36

UK Standards for MIcrobiology Investigations I Emesso da Standards Unit, Health Protection Agency

Ringraziamenti Le Procedure Standard del Regno Unito per le Ricerche Microbiologiche (SMI - Standards for Microbiology Investigations) sono sviluppate sotto l'egida della Public Health England (PHE) in collaborazione con il Servizio Sanitario Nazionale (NHS - National Health Service), la Sanità Pubblica del Galles e con le organizzazioni professionali i cui loghi sono di seguito elencati sul sito web https://www.gov.uk/uk-standards-for-microbiology-investigations-smi-quality-and-consistency-in-clinical-laboratories. Le SMI sono sviluppate, revisionate e controllate da diversi gruppi di lavoro che sono supervisionati da un comitato direttivo (consultare https://www.gov.uk/government/groups/standards-for-microbiology-investigations-steering-committee). Si ringraziano per contributi forniti i numerosi operatori dei laboratori clinici, gli specialisti e i laboratori di riferimento che hanno fornito informazioni e commenti durante lo sviluppo di questo documento. Si ringraziano i Revisori Medici per le modifiche apportate ai contenuti clinici. Per ulteriori informazioni contattare:

Standards Unit Microbiology Services Public Health Englad61 Colindale Avenue London NW9 5EQ E-mail: [email protected] Website: https://www.gov.uk/uk-standards-for-microbiology-investigations-smi-quality-and-consistency-in-clinical-laboratories Le Procedure Standard del Regno Unito per le Ricerche Microbiologiche sono sviluppate con la collaborazione di:

Loghi corretti al momento della pubblicazione




Contenuti RINGRAZIAMENTI ..................................................................................................................... 2

TABELLA MODIFICHE .............................................................................................................. 4

RICERCHE MICROBIOLOGICHE STANDARD DEL RU: SCOPO E OBIETTIVO ................... 6

SCOPO DEL DOCUMENTO ...................................................................................................... 9

INTRODUZIONE ......................................................................................................................... 9

INFORMAZIONE TECNICA/LIMITAZIONI ............................................................................... 17

1 CONSIDERAZIONI SULLA SICUREZZA ....................................................................... 19

2 MICRORGANISMI BERSAGLIO ..................................................................................... 19

3 IDENTIFICAZIONE .......................................................................................................... 21

4 IDENTIFICAZIONE DI SPECIE STREPTOCOCCUS, SPECIE ENTEROCOCCUS E DI MICRORGANISMI MORFOLOGICAMENTE SIMILI ....................................................... 27

5 REFERTAZIONE ............................................................................................................ 28

6 INVIO ............................................................................................................................. 29

7 NOTIFICA ALLA PHE O EQUIVALENTE ....................................................................... 30

BIBLIOGRAFIA ........................................................................................................................ 31

NICE ha accreditato la procedura usata dalla Public Health England per elaborare gli Standards for Microbiology Investigations. L’accreditamento è valido per 5 anni dal Luglio 2011. Informazioni più dettagliate sull’accreditamento possono essere consultate: www.nice.org.uk/accreditation.

Per ulteriori informazioni sul nostro accreditamento consultare: : www.nice.org.uk/accreditation




Tabella delle Modifiche Ciascun metodo SMI possiede una registrazione separata delle correzioni. Quelle attuali sono specificate in questa pagina. Le precedenti modifiche sono disponibili presso la l: [email protected]

I documenti nuovi o revisionati devono essere controllati in ciascun laboratorio in accordo con il sistema locale di gestione della qualità.

Revisione No/Data 10/28.10.14

Emissione eliminata. no 2.3

Emissione inserita no. 3

Sezione(i) interessate/Pagina no. Modifica.

Scopo del documento . Il campo di applicazione è stato aggiornato con l'aggiunta di metodi molecolari come mezzo di identificazione di specie Streptococcus e Enterococcus isolate da materiale clinico.

Introduzione

La tassonomia di Streptococcus ed Enterococcus è stata aggiornata.

Maggiori informazioni sono state aggiunte alla sezione Caratteristiche. Sono menzionate le specie clinicamente importanti. Sono pure menzionati altri organismi morfologicamente simili e clinicamente importanti e sono descritte le loro caratteristiche.

La Sezione sui Principi d’Identificazione è stata riorganizzata

Informazione Tecnica/Limitazioni Aggiunta di informazioni per quanto riguarda il test della catalasi, sistemi di identificazione commerciali e differenziazione tra i gruppi Streptococcus con metodi rapidi

Considerazioni sulla sicurezza Questa sezione è stata aggiornata per quanto riguarda il personale di laboratorio

Microrganismi target La sezione sugli organismi bersaglio è stata aggiornata e presentata in modo chiaro.

Identificazione

Gli aggiornamenti sono stati fatti su 3.2, 3.3 e 3.4 per riflettere standard nella pratica. Questo include anche tutti i microrganismi morfologicamente simili a parte le specie Enterococcus e Streptococcus.

La tabella in 3.4 e la nota in calce è stato aggiornato con i riferimenti.

Punto 3.5, è stato aggiornato per includere i Metodi Molecolari Rapidi.




Diagramma di Flusso La modifica del diagramma di flusso per l'identificazione di specie Enterococcus e Streptococcus è stato fatto per facilitare l’orientamento.

Refertazione Sottosezione 5.1 è stata aggiornata per riflettere la pratica di di refertazione..

Invio Aggiornati gli indirizzi dei laboratori di riferimento

Intero documento Documento presentato in nuovo formato.

Bibliografia Bibliografia In parte aggiornata.




Ricerche Microbiologiche Standard del RU#: Scopo e Obiettivo

Utilizzatori delle SMI

• Nel Regno Unito le SMI sono principalmente destinate come risorsa generale ai professionisti che operano nel campo della medicina di laboratorio e delle malattie infettive.

• Le SMI forniscono ai clinici informazioni in merito allo standard dei servizi di laboratorio riferibili alle ricerche per la diagnosi delle infezioni nei loro pazienti e le documentazioni forniscono indicazioni che facilitano la prenotazione elettronica di tests appropriati.

• Le SMI forniscono gli standard per le ricerche microbiologiche anche ai responsabili della sanità pubblica che devono considerarle come parte delle procedure da adottare per la salute (sia clinica che pubblica) per la propria popolazione.

Informazioni di Base per le SMI

Le SMI comprendono algoritmi e procedure raccomandate che riguardano tutte le componenti del processo diagstico dalla fase pre-analitica (sindrome clinica) alle diverse fasi analitiche (prove di laboratorio) e post-analitiche (interpretazione e comunicazione dei risultati).

Gli algoritmi delle sindromi sono corredati da informazioni più dettagliate contenenti consigli sulle indagini per specifiche malattie e infezioni. Note orientative riguardano il contesto clinico, la diagnosi differenziale e indagini appropriate per particolari condizioni cliniche. Le note orientative descrivono metodologie di laboratorio essenziali che sono alla base della qualità, ad esempio la validazione della prova,

La Standardizzazione del processo diagnostico conseguente all'adozione delle SMI consente di garantire in tutto il Regno Unito strategie d’indagine equivalenti nei diversi laboratori ed è una condizione essenziale per interventi nel campo della sanità pubblica, della sorveglianza, e per le attività di ricerca e di sviluppo.

Collaborazione Paritaria

La preparazione e stesura delle SMI è effettuata mediante collaborazione paritaria fra PHE, NHS, Royal College of Pathologists e le organizzazioni professionali.

L'elenco delle organizzazioni partecipanti può essere trovato su sito https://www.gov.uk/uk-standards-for-microbiology-investigations-smi-quality-and-consistency-in-clinical-laboratories. L'inclusione del logo di una organizzazione in una SMI implica il sostegno degli obiettivi e del processo di preparazione del documento. I rappresentanti delle organizzazioni professionali fanno parte del comitato direttivo e dei Gruppi di Lavoro che sviluppano le SMI. Le opinioni dei rappresentanti possono non essere rigorosamente conformi a quelle dei membri delle organizzazioni a cui appartengono né a quelle delle loro organizzazioni. I rappresentanti prescelti rappresentano uno strumento bidirezionale per la consultazione e dialogo. Le opinioni espresse sono ricercate con un processo di consultazione. Le SMI sono sviluppate, revisionate ed aggiornate con un ampio processo di consultazione. # Microbiologia è usato come termine generico per includere le due specialità di Microbiologia Medica riconosciute dal GMC (General Medical Council), (che comprende Batteriologia, Micologia e Parassitologia) e la Virologia Medica.




Assicurazione di Qualità

Il NICE (National Institute for Health and Care Excellence) ha accreditato la procedura utilizzata dai Gruppi di Lavoro per produrre le SMI L’accreditamento è applicabile a tutte le linee guida prodotte dall’Ottobre del 2009. La procedura per lo sviluppo delle SMI è certificata dalla ISO 9001:2008.

Le SMI rappresentano una procedura standard di buona qualità pratica alla quale si devono attenere per la propria attività tutti i laboratori di microbiologia clinica e di sanità pubblica del Regno Unito. Le SMI sono accreditate dal NICE e non rappresentano gli standard minimi di attività, e neppure il più alto livello di complesse indagini di laboratorio disponibili nel Regno Unito. Utilizzando le SMI, i laboratori dovranno tenere conto delle esigenze locali e intraprendere ricerche addizionali qualora opportune. Le SMI aiutano i laboratori a soddisfare i requisiti dell’accreditamento con la promozione di procedure d’elevata qualità che possono essere verificate. Le SMI forniscono inoltre un punto di riferimento per lo sviluppo del metodo Le prestazioni della SMI dipendono dal personale ben addestrato e dalla qualità dei reagenti e delle attrezzature utilizzate. I laboratori dovrebbero assicurare che tutti i reagenti di tipo commerciale e quelli messi a punto in laboratorio siano stati validati e risultati idonei allo scopo. I laboratori devono partecipare a programmi di valutazione di qualità esterni ed eseguire le relative procedure del controllo di qualità interno.

Coinvolgimento del Paziente e della Comunità

Nello sviluppo delle SMI i rispettivi Gruppi di Lavoro sono impegnati per favorire il coinvolgimento dei pazienti e dell’opinione pubblica. Grazie al coinvolgendo pubblico, di operatori sanitari, ricercatori e organizzazioni di volontariato la SMI risultante sarà strutturalmente valida e atta a soddisfare le esigenze dell'utente. L’opportunità di partecipazione per contribuire alla consultazione è estesa al pubblico con l’accesso libero al nostro sito web

Informazione della Gestione e dei Dati Sensibili La PHE è un’organizzazione che condivide le direttive Caldicott. Ciò significa prendere ogni possibile precauzione per prevenire la diffusione non autorizzata di informazioni sui pazienti e di garantire che le informazioni relative agli stessi siano mantenute in condizioni di sicurezza. Lo sviluppo di metodi SMI è assoggetto agli obiettivi PHE di Uguaglianza https://www.gov.uk/government/organisations/public-health-england/about/equality-and-diversity. I Gruppi di Lavoro SMI sono impegnati a raggiungere gli obiettivi di parità di consultazione efficace con gli appartenenti al pubblico, i partner, le parti interessate ed i gruppi specialistici coinvolti.

Dichiarazione Legale Mentre ogni cura è stata intrapresa per la preparazione delle SMI, PHE e ogni altra organizzazione di sostegno, deve, per quanto possibile in base a qualunque legge vigente, escludere la responsabilità per tutte le perdite, costi, reclami, danni o spese derivanti da o connessi all'uso di una SMI o con qualsiasi informazione ivi contenuta. Se si apportano modifiche a una SMI, si deve porre in evidenza dove e da chi sono state effettuate tali modifiche. Le conoscenze di base e la tassonomia microbica per la SMI sono le più complete possibili, al momento della pubblicazione. Eventuali omissioni e nuove informazioni saranno considerate nel corso della prossima revisione. Queste procedure standard (SMI) possono essere sostituite solo da revisioni dello standard, azione legislativa, o in seguito ad indicazioni da parte dell’ente accreditato NICE. I diritti d’autore delle SMI sono della “Crown” e questi dovrebbero essere riconosciuti quando appropriato.




Citazione Suggerita per questo Documento Public Health England. (2014). Identification of Streptococcus species, Enterococcus species and Morphologically Similar Organisms. UK Standards for Microbiology Investigations. ID 4 Emissione 3. https://www.gov.uk/uk-standards-for-microbiology-investigations-smi-quality-and-consistency-in-clinical-laboratories




Scopo del Documento

Questa SMI descrive l’identificazione con metodi fenotipici e molecolari di generi o specie Streptococcus ed Enterococcus isolati da materiale clinico. Sono inclusi microrganismi delle specie morfologicamente simili agli streptococchi che possono essere riscontrati in questi campioni.

A causa della costante evoluzione della classificazione tassonomica di questo gruppo di microrganismi il ricorso ai soli metodi fenotipici può non essere sufficiente all’identificazione a livello di specie. Per la classificazione questa SMI adotta un approccio semplificato raggruppando i microrganismi con caratteristiche fenotipiche simili1. Su indicazione clinica od epidemiologica può essere successivamente richiesta una identificazione più specifica.

Questa SMI deve essere usata congiuimalintamente con le altre SMI.

Introduzione Tassonomia

Negli ultimi anni la tassonomia degli streptococchi e dei microrganismi correlati ha subito una sostanziale revisione, in gran parte dovuta all’utilizzo dei metodi molecolari d’identificazione. Inoltre, i sistemi d’identificazione americani ed anglosassoni adottano terminologie di tipo diverso per definire alcuni streptococchi. Ora sono conosciute 99 specie di Streptococcus, molte delle quali sono associate a malattie dell’uomo e degli animali2

Il nome del genere Enterococcus, suggerito nel 1903 per batteri in precedenza definiti Streptococcus faecalis e Streptococcus faecium, è stato modificato nel 1984, quando in questo genere sono stati inclusi altri microrganismi1,3. Ora i componenti del genere Enterococcus presenti in letteratura sono 48. Enterococcus faecalis ed Enterococcus faecium sono quelli di più frequente riscontro nelle infezioni umane4.

Caratteristiche

Gli Streptococchi sono cocchi Gram positivi (sferici od ovoidali) spesso disposti in coppie o in catenelle. Gli Streptococchi sono anaerobi facoltativi e catalasi negativi1. I carboidrati sono metabolizzati per via fermentativa; l’acido lattico è il metabolita principale. Gli Streptococchi producono l’enzima leucina amino peptidasi (LAP) noto anche come leucina arilamidasi.

Sull’agar sangue le specie presentano emolisi di vario tipo, utilizzata come prima fase per l’identificazione clinica degli isolati. Per l’identificazione preliminare sono importanti il tipo di emolisi su agar sangue e la classificazione sierologica di Lancefield.

Emolisi su agar sangue:

• α-emolisi – determina lisi parziale dei globuli rossi che circondano una colonia ed una colorazione verdastra del terreno

• β-emolisi – determina lisi completa dei globuli rossi che circondano una colonia causando un alone di chiarificazione del sangue presente nel terreno




• non-emolisi o in precedenza γ-emolisi ) – nessun cambiamento di colore o chiarificazione del terreno

• α‘-prima (α‘) o “ampia area α“ di emolisi – ristretta area con globuli rossi integri in prossimità della colonia circondata da alone di emolisi completa. Questo tipo di emolisi può essere confusa con la β-emolisi

Classificazione di Lancefield

Gli Streptococchi beta-hemolitici sono ulteriormente caratterizzati con la sierotipizzazione di Lancefield, che riconosce i carboidrati presenti sul parete della cellula batterica5. Sono descritti 20 sierotipi, definiti gruppi Lancefield dalla A alla V (esclusa la I e J)

Gruppo A di Lancefield Streptococcus pyogenes Streptococcus pyogenes è un cocco Gram positivo disposto in catenelle. Dopo 18 - 24 ore di incubazione a 35°C - 37°C su agar sangue le colonie sono circa di 0.5 mm, cupuliformi, con bordo continuo. Alcuni ceppi possono produrre colonie mucose. L’emolisi è più evidente nella coltura incubata in condizioni anaerobiche perché le emolisine sono più stabili in assenza di ossigeno6

Gli streptococchi del gruppo A di Lancefield non si sviluppano su terreni che contengono bile. Le colonie puntiformi del gruppo S. anginosus possono reagire in modo crociato con gli anticorpi del gruppo A di Lancefield e possono crescere su terreni contenenti bile7.

La sensibilità alla bacitracina è stata utilizzata preliminarmente come metodo di screening, ma i risultati non sono stati attendibili perché non ad elevata specificità e i metodi variano nei diversi laborator8-12. Non è stata segnalata resistenza alla benzilpenicillina, fino alla stesura di questo documento.

La prova della pyrrolidonyl arylamidasi (o pyrrolinodyl-aminopeptidasi o PYR) è positiva per gli streptococchi di Gruppo A e negativa per la maggior parte degli altri streptococchi classificabili, sebbene alcuni ceppi dei gruppi C e G isolati dall’uomo siano positivi. Anche gli Enterococchi sono PYR positivi7,9.

Gruppo B di Lancefield Streptococcus agalactiae Gli Streptococcus agalactiae si presenta i cocchi Gram-positivi, disposti in catenelle. Dopo 18 - 24 ore di incubazione a 35°C - 37°C le colonie si sviluppano in modo lievemente maggiore rispetto agli altri streptococchi (circa 1 mm) e producono un alone di β-emolisi meno evidente. Alcuni ceppi non sono emolitici13.

Gli streptococchi del gruppo B di Lancefield non crescono su terreni che contengono bile.

Il terreno di Islam può essere utile per il rilievo della produzione di pigmento arancio nella coltura di isolamento primario e per l’identificazione preliminare, ma non è raccomandato in questa SM13I.




Gruppi di Lancefield A, C, G e L

Streptococcus dysgalactiae sottospecie equisimilis (gruppi di Lancefield A,C,G e L)

Streptococcus equi sottospecie zooepidemicus1 (groppo C di Lancefield)

Stretococcus canis (gruppo G di Lancefield)14. All’osservazione microscopica queste specie sono rappresentate da cocchi Gram positivi disposti in catenelle. Gli streptococchi dei gruppi C e G di Lancefield sviluppano colonie di grandi dimensioni (≥0.5 mm) simili a quelle degli streptococchi di Gruppo A15. Nelle infezioni umane i ceppi S. dysgalactiae di Gruppo C e G, sottospecie equisimilis, sono identificati più frequentemente di quelli dotati di antigene di Gruppo A (o L) 5.

Gli streptococchi del gruppo C e G di Lancefield non crescono su terreni che contengono bile. Colonie puntiformi del gruppo S. anginosus possono reagire in modo crociato con anticorpi dei gruppi C e G di Lancefield10 e crescere su terreni contenenti bile9

Gruppi di Lancefield A, C, F o G Gruppo Streptococcus anginosus: Streptococcus anginosus, Streptococcus anginosus subspecie whileyi, Streptococcus constellatus subspecie constellatus, Streptococcus constellatus subspecie pharyngis, Streptococcus constellatus subspecie viborgensis, Streptococcus intermedius (in precedenza gruppo “Streptococcus milleri”)16 All’osservazione microscopica queste specie sono rappresentate da cocchi Gram positivi disposti in catenelle. Sull’agar sangue le colonie sono piccole (≤0.5 mm) dopo 16 - 24 ore a 35°C - 37°C possono presentare emolisi α, β o assenza d’emolisi. Nell’identificazione preliminare del gruppo S. anginosus le condizioni d’incubazione possono assumere una certa importanza perché la crescita può essere favorita da una bassa concentrazione di ossigeno e dall’aumento della CO2

17.

I microrganismi di questo gruppo possono avere antigene di Lancefield di gruppo A, C, F o G o non essere classificabili in gruppi17. S. intermedius non possiede l’antigene di gruppo. S. constellatus può esprimere antigene di gruppo C, o F, e S. anginosus antigeni di gruppo A, C, F o G. Gli streptococchi isolati dall’uomo che esprimono antigene di gruppo F appartengono con elevata probabilità al gruppo anginosus. Gli streptococchi di questo gruppo crescono su terreni contenenti bile, sebbene non siano alotolleranti.

La Resistenza ai sulfamidici e alla bacitracina può essere utilizzata come prova di screening per microrganismi del gruppo anginosus18.

L’identificazione di un isolato da campione clinico appartenente a questo gruppo ha potenzialmente importanza clinica, dovuta alla propensione di questo gruppo ad essere associato a infezioni piogeniche invasive.

Gruppo D di Lancefield Specie Enterococcus, gruppo Streptococcus bovis Il genere Enterococcus ed i microrganismi del gruppo S. bovis possiedono l’antigene del gruppo D di Lancefield. Gli streptococchi del gruppo D di Lancefield non crescono sui terreni contenente bile e possono essere differenziati dagli altri streptococchi per la rapida idrolisi dell’esculina in presenza del 40% di bile.




All’osservazione microscopica gli enterococchi appaiono come cocchi Gram positivi, di aspetto sferico od ovoidale (0.6 - 2.5 µm), di solito in brodocoltura si presentano a copie o in corte catenelle. Dopo 18 – 24 ore d’incubazione su agar sangue a 35° - 37°C le colonie sono di 1 - 2 mm e su agar sangue di cavallo presentano emolisi di tipo α, β o assenza di emolisi. La maggior parte delle specie si sviluppa su agar nutriente a 45°C. Un numero ridotto si sviluppa a 50°C, pH 9.6 e NaCl 6.5%. Questi possono inoltre sopravvivere ad esposizione termica di 60°C per 30 minuti e sono PYR positivi e ciò li differenzia da S. bovis eS. gallolyticus.

Gli enterococchi sono anaerobi facoltativi. Due specie del genere, Enterococcus cassiflavus ed Enterococcus gallinarum, sono mobili. Gli enterococchi sono ossidasi negativi e fermentano i carboidrati. La maggior parte delle specie è catalasi negativa, alcuni ceppi producono una pseudocatalasi.

La maggior parte degli enterococchi possiede l’antigene di gruppo D, sebbene alcuni ceppi possano reagire in modo crociato con l’antisiero del gruppo G di Lancefield19

Raramente E. faecalis sono resistenti all’ampicillina18. Gli enterococchi resistenti alla vancomicina o al glicopeptide (V/GRE) sono comunque in progressivo aumento e la diffusione della resistenza si ritiene sia causata da trasposoni e plasmidi che diffondono fra le specie batteriche20. La resistenza alla vancomicina negli enterococchi è mediata da geni van che codificano enzimi per la sintesi di precursori a bassa affinità che modificano il bersaglio cui si lega la vancomicina. Ora, sono noti otto fenotipi resistenti alla vancomicina: vanA, vanB, vanC, vanD, vanE, vanG, vanL, e vanM. Sono noti 2 tipi di resistenza ai glicopeptidi negli enterococchi, intrinseco e acquisito. I ceppi con resistenza acquisita sono gli unici a richiedere di essere controllati e segnalati nei programmi di sorveglianza VRE.

La resistenza acquisita si trova principalmente in Enterococcus faecium ed Enterococcus faecalis ed è di solito codificata dai geni vanA e vanB. I ceppi che ospitano il gene vanA presentano elevati livelli di resistenza a vancomicina e teicoplanina, mentre i ceppi che ospitano il gene vanB hanno livelli variabili di resistenza solo alla vancomicina21.

Nel gruppo S. bovis, sono presenti sei specie che comprendono: S. bovis, S. equinus, S. gallolyticus (già S. bovis biotipo I), S. infantarius (già S. bovis biotipo II/2) e S. lutetiensis5. Microscopicamente queste specie sono costituite da cocchi Gram-positivi, che si presentano in catene. Dopo 18-24 ore d’incubazione a 35 ° C-37 ° C in CO2 o in anaerobiosi, le colonie non sono solitamente emolitiche su agar sangue e di 1-2mm di diametro. I componenti del gruppo S. bovis possono essere erroneamente identificati come enterococchi in quanto molti ceppi condividono l'antigene del gruppo D. E 'importante identificare nel materiale clinico i microrganismi del gruppo S. bovis, in particolare nei casi di batteriemia, perché S. gallolyticus e S. pasteurianus sono associati a malattie intestinali croniche, soprattutto all’adenocarcinoma del colon22. Il gruppo S. bovis può essere differenziato dagli enterococchi per la reazione negativa in entrambe le prove PYR e del test dell’arginina, mentre gli enterococchi sono generalmente positivi per entrambe.

Streptococcus suis S. suis è β-emolitico su agar sangue di cavallo, resistente all’optochina e PYR negativo. Questi microrganismi sono di solito membri dei gruppi R, S e T di Lancefield. S. suis I è associato al gruppo S e S. suis II al gruppo R. Non si sviluppano in brodo contenente NaCl al 6.5%. Alcuni ceppi sono in grado di crescere in soluzione contenente bile al 40% e tutti idrolizzano l’esculina.




Gruppi non-Lancefield Streptococcus pneumoniae Gli Streptococcus pneumoniae (“pneumococchi”) sono cellule che si presentano in coppie, Gram-positive, tipicamente a forma lanceolata, possono essere capsulati. Le colonie sono α-emolitiche, di 1 – 2mm, con aspetto a ‘pedina di dama’ conseguente all’emolisi dei microrganismi dopo incubazione in 5 - 10% di CO2 a 35°C - 37°C per 16 - 24 ore. In condizioni anaerobiche le colonie possono apparire più larghe e mucose

Gli S. pneumoniae sono di solito sensibili all’optochina (cloridrato di etilidrocupreina); ciò consente un’identificazione rapida dei microrganismi, ma è stata segnalata una loro resistenza. S. pneumoniae sono solubili in soluzioni di sali biliari.

Gli S. pneumoniae possono essere identificati con metodi sierologici. Per la tipizzazione di S. pneumoniae si può utilizzare la prova microscopica, nota come ‘reazione di Quellung' (rigonfiamento capsulare) 17,18. L’a ricerca rapida dell’antigene pneumococcico può essere eseguita anche con confezioni commerciali per agglutinazione, ma queste devono essere usate con cautela per possibili reazioni crociate con i gruppi di S. oralis e S. mitis.

Streptococchi viridans "Viridans" deriva dal latino viridis, che significa verde. Queste specie sono costituite da cocchi Gram positivi disposti in catenelle, alla colorazione Gram non sono distinguibili dai ceppi di streptococchi β-emolitici. Le colonie sono di 0.5 - 1.0 mm e su agar sangue, dopo incubazione anaerobica a 35°C – 37°C in CO2 per 16 – 24 ore. Non sono dotati di antigeni di Lancefield e sono resistenti all’optochina. Non sono pure solubili nella bile.

Nel sottogruppo Streptococcus mitis, Streptococcus pseudopneumoniae è stato scambiato per S. pneumoniae, ma ha una serie di caratteristiche che permette di distinguerlo da S. pneumoniae:

• Non è dotato di capsula pneumococcica (e pertanto non è tipizzabile)

• Non è solubile nella bile

• E 'sensibile all'optochina quando incubato in ambiente aerobio, ma sembra resistente o avere sensibilità indeterminata, se incubato in 5% di anidride carbonica

• I test di ibridazione con sonda DNA commerciale sono falsamente positivi23

Di solito questi streptococchi, non richiedono successiva identificazione, se non come streptococchi α o non emolitici, da isoali da sedi nelle quali fanno parte della flora residente. Nei casi di sospetta endocardite la loro identificazione assume valore nel confermare la diagnosi e pure a fini epidemiologici. Alcune specie di streptococchi, quali Streptococcus sanguinis e Streptococcus oralis (in precedenza mitior), possono essere responsabili fino all’80% di tutti i casi di endocardite streptococcica24.

Varianti Nutrizionali di Streptococchi (VNS)

Le VNS sono state recentemente classificate come Granulicatella adiacens, Granulicatella elegans e Abiotrophia defectiva25. Per la loro crescita le VNS richiedono terreni arricchiti di piridossale o cisteina26,27.

Le colonie NVS sono piccole, 0.2-0.5mm di diametro e la zona del bordo esterno si ingrossa dopo 24 ore a causa delle sostanze nutrienti presenti nel mezzo circostante. Possono essere non-emolitici o α-emolitici. Le NVS sono catalasi negative, ossidasi negative e anaerobie facoltative. Le NVS devono




essere sospettate quando cocchi Gram-positivi simili a streptococchi sono riscontrati in emocolture positive, che poi non si sviluppano in sottocultura. La ripetizione della sottocultura del brodo sospetto dovrebbe includere una piastra di agar sangue con una semina strisciata di Staphylococcus aureus poi esaminata per satellitismo delle NVS attorno allo stafilococco. In alternativa, i terreni possono essere addizionati con 10mg / L piridossal cloridrato.

Il riconoscimento di queste specie è importante nei casi di infezioni profonde per garantire la terapia antimicrobica più appropriata (specialmente nei casi di endocardite) per fornire la terapia antimicrobica più appropriata, ma questi microrganismi sono spesso associati a emocolture negative27-29.

Specie Streptococcus insolite Sterptococcus acidominimus

Streptococcus acidominimus appartiene al gruppo Streptococcus viridans e al microscopio, si osservano corte catene. Sono α-emolitici e catalasi negativi. Non idrolizzano l'esculina o l’arginina, ma fermentano saccarosio e glucosio. Non possiedono antigeni di Lancefield e sono insolubili nella bile e resistenti all'optochina.

Sono stati segnalati alcuni casi di infezioni umane profonde da S. acidominimus30,31. In genere sono molto sensibili agli antibiotici β-lattamici.

Generi strettamente correlati agli streptococchi Specie Aerococcus

Sono note sette specie di Aerococcus, di cui cinque sono patogene e causano infezione sia del tratto urinario sia di tipo invasivo (tra queste l’'endocardite infettiva nell’uomo) 32-34. Questi sono Aerococcus christensenii, Aerococcus sanguinicola, Aerococcus urinae, Aerococcus urinaehominis e Aerococcus viridans.

In coltura gli Aerococci assomigliano agli streptococchi "viridans", ma al microscopio differiscono in quanto sono tipicamente presenti in coppie, tetradi o a in formazioni a grappolo, simili agli stafilococchi. A volte producono una debole reazione della catalasi o della pseudocatalasi. Questi microorganismi a crescita relativamente lenta, producono colonie piccole su agar sangue, ben delineate, traslucide, alfa-emolitiche. Alcuni ceppi di Aerococcus viridans sono bile esculina positivi e PYR positivi. Aerococcus urinae è bile esculina negativo e PYR negativo. La crescita si manifesta in condizioni aerobiche e anaerobiche.

In alcuni sistemi commerciali d’identificazione , Helcococcus kunzii può essere erroneamente identificato come A. viridans. I sistemi l'API e'Vitek riconoscono A. sanguinicola come A. viridans. In questo modo i referti d’infezioni causate da A. viridans divengono problematiche quando l'identificazione si avvale di questi metodi35.

La maggior parte degli aerococci sono sensibili ai beta-lattamici, ed anche a diversi altri gruppi di antibiotici. Le spècie Aerococcus sono sensibili alla vancomicina, sebbene siano state segnalate MIC elevate35.

Specie Facklamia Sono note sei specie delle quali quattro di origine umana (Facklamia hominis, Facklamia languida, Facklamia sourekii Facklamia ignava). La specie umana più comune è Facklamia hominis. In coltura, le specie Facklamia assomigliano agli streptococchi "viridans". Sono Gram positive e si presentano in coppie, gruppi o catene. Le specie Facklamia sono anaerobie facoltative e crescono meglio in




un'atmosfera arricchita di anidride carbonica. Esse sono debolmente α-emolitiche e di solito idrolizzano l'urea e non aesculin36. Sono catalasi e ossidasi negative, ma positive per pirrolidonil arilamidasi e leucina aminopeptidasi. Crescono bene in 6.5% NaCl a 37°C ma non riescono a crescere a 10 o 45°C. Facklamia languida non idrolizza ippurato, diversamente da tutte le altre specie, e questa è una caratteristica differenziale fra loro37. Non è prodotto acido dal glucosio e altri zuccheri e i nitrati non sono ridotti38.

Tutte le specie Facklamia sono sensibili all’amoxicillina e alcuni ceppi della specie sono risultati resistenti a cefotaxime e cefuroxime36.

Specie Gemella Attualmente sono riconosciute cinque specie isolate da fonti umane: Gemella haemolysans, Gemella morbillorum (ex Streptococcus morbillorum), Gemella bergeriae, Gemella sanguinis e Gemella asaccharolytica specie nov39-42.

Le specie Gemella sono catalasi negative, anaerobie facoltative, cocchi a Gram-variabile, disposti a coppie, tetradi, in grappoli e in catenelle a volte brevi. Alcuni ceppi sono facilmente decolorati alla colorazione Gram, assumendo aspetto di Gram negativi. Inoltre, alcuni ceppi possono esigere condizioni rigorosamente anaerobiche per isolamento primario e diventare aerotolleranti dopo il trasferimento in terreni di laboratorio43. Su agar sangue sono α-emolitici o non-emolitici e assomigliano alle colonie degli streptococchi viridans. Le colonie sono piccole e da grigiastre a incolori.

In alcuni sistemi d’identificazione commerciali,gli streptococchi "viridans" possono essere erroneamente identificati come specie Gemella. L'unica differenza tra gli streptococch “viridans " e le specie Gemella è la disposizione delle cellule e la richiesta per la crescita di piridossale degli streptococchi ”viridans" 43.

Specie Globicatella Sono note due specie Globicatella, ma quella implicata nei casi di infezione umana è la Globicatella sanguinis44-46.

Su agar sangue le specie Globicatella formano piccole colonie simili a quelle degli streptococchi viridans e producono una debole reazione α-emolitica. Al microscopio appaiono come cocchi Gram-positivi isolati, in coppie o in corte catenelle. Sono anaerobie facoltative e catalasi negative. Tuttavia non producono leucina aminopeptidase44. Sono sensibili alla vancomicina.

Le specie Globicatella possono essere distinte dagli aerococci per la morfologia cellulare. Gli Aerococci formano coppie e tetradi mentre le specie Globicatella formano corte catene di cocchi.

Specie Helcococcus Attualmente sono note tre specie di specie Helcococcus isolate da esseri umani. Sono Helcococcus kunzii, pyogenes Helcococcus e Helcococcus sueciensis47-49.

Le specie Helcococcus sono costituite da cocchi Gram-positivi, catalasi negativi e anaerobi facoltativi. Questi sono disposti in coppie, tetradi e a grappolo. Sono a lenta crescita e sulla piastra di agar sangue appaiono come streptococchi viridans. Di solito non sono emolitici a differenza degli aerococci che formano, dopo l'incubazione, grandi colonie circondate da un’ampia zona di α-emolisi. Da glucosio e altri zuccheri è prodotto acido ma non gas. Non si manifesta crescita su agar bile-esculina. Queste specie sono sensibili alla vancomicina.




H. kunzii produce colonie piccole grigie, non-emolitiche;la crescita è stimolata dall'aggiunta al terreno di base di siero o Tween 80. In alcuni sistemi di identificazione commerciali, Aerococcus viridans può essere erroneamente identificato come Helcococcus kunzii43.

H. pyogenes produce colonie puntiformi grigio bianche non emolitiche e non idrolizza l’esculina. Questo pone in evidenza una relativa resistenza alla vancomicina come la specie Pediococcus48.

H. sueciensis produce colonie piccole grigie non-emolitiche dopo 48 ore d‘incubazione anaerobica. Questa specie è stata identificata utilizzando la confezione biochimica commerciale API49.

Specie Lactococcus

Attualmente sono note sette specie Lactococcusi. Le specie Lactococcus sono fisiologicamente simili agli Enterococchi e sono state erroneamente identificate perché possiedono molte delle caratteristiche degli streptococchi e degli enterococchi. Sono anaerobie facoltative, α o non-emolitiche, cocchi Gram-positivi che si presentano isolati, in coppia o in catene. Sono bile esculina positive, ma non possiedono l’antigene di gruppo D43.

Specie Leuconostoc

Il genere Leuconostoc è composto dalle seguenti specie (comprese le specie ri-classificate e sinonimi): Leuconostoc mesenteroides (specie tipo), L. amelibiosum, L, Argentinum, L. carnosum, L. citreum, L. cremoris, L. dextranicum, L. durionis, L. fallax, L. ficulneum, L. fructosum, L. garlicum, L. gasicomitatum, L. gelidum,L. holzapfelii, L. Inhae, L. kimchii, L. lactis, L. miyukkimchii, L. oeni, L. Palmae,L. paramesenteroides, L. pseudoficulneum e L. pseudomesenteroides. Leuconostoc mesenteroides è stato implicato in infezioni umane50,51..

Di queste specie, quattro (L. ficulneum, L. fructosum, L. durionis eL. pseudoficulneum) sono state riclassificate e trasferite al genere Fructobacillus. Ora esse sono rispettivamente Fructobacillus ficulneum, Fructobacillus fructosum, Fructobacillus durionis e Fructobacillus pseudoficulneum. Si tratta di specie non patogene che preferiscono come substrato di crescita il fruttosio, ma non glucosio. Si trovano in nicchie ricche di fruttosio, come fiori, frutta e alimenti fermentati e più recentemente nel tratto gastrointestinale degli animali che consumano fructosio52.

Leuconostoc mesenteroides è stata suddivisa in 4 sottospecie; 2 di queste (L. cremoris e L. dextranicum sono state rinominate rispettivamente Leuconostoc mesenteroides sottospecie cremoris e Leuconostoc mesenteroides sottospecie dextranicum), Leuconostoc mesenteroides sottospecie mesenteroides e poi una aggiunta più recentemente, Leuconostoc mesenteroides sottospecie suionicum53.

Le specie Leuconostoc sono cocchi Gram-positivi lenticolari che si presentano in coppie e catene, sono tipicamente vancomicina resistenti e producono CO2 a partire dal glucosio. Sono catalasi negative e le colonie su agar sangue sono spesso α-emolitiche. Sono anaerobie facoltative e possono essere confuse con gli enterococchi perché la maggior parte delle specie Leuconostoc sono bile esculina positive e alcune presentano reazioni crociate con antiseri del gruppo D43.




Specie Pediococcus In cultura le specie Pediococcus possono assomigliare a streptococchi viridans, ma al microscopio sono simili agli stafilococchi. Sono cocchi Gram-positivi che appaiono in coppie, gruppi e tetradi e sono intrinsecamente resistenti alla vancomicina e moderatamente sensibili agli antibiotici beta-lattamici. Sono anaerobi facoltativi e catalasi negativi. Tutti i ceppi non sono mobili e su piastra di agar sangue appaiono come non-emolitici o α-emolitici. Sono leucina amino peptidasi positivi, ciò li distingue dalle specie Leuconostoc54. Possono essere confusi con gli enterococchi, perché sono bile esculina positivi e presentano reazione crociata con antisieri del Gruppo D43.

Principi di Identificazione

Gli Isolati da coltura primaria sono identificati da: aspetto della colonia, colorazione Gram, prova della catalasi, classificazione di gruppo di Lancefield e sensibilità all’optochina. Per la successiva identificazione ci si può avvale di prove biochimiche o di altro tipo per la differenziazione fra specie.

In alcuni casi, avvalendosi dell’aspetto delle colonie, informazioni cliniche ed esperienza dell’operatore, si possono omettere le prime fasi dell’identificazione (quali colorazione di Gram e catalasi) e procedere ad altri accertamenti. Tutte le prove d’identificazione devono in teoria essere eseguite con colonie sviluppate su agar non selettivi.

Se la classificazione di Lancefield non fornisce una identificazione sufficiente per la gestione clinica, l’accertamento completo può essere ottenuto utilizzando un sistema di identificazione commerciale, in associazione ai risultati dei test di sensibilità.

Una particolare attenzione dovrebbe essere rivolta agli isolati che forniscono un insolita identificazione.

Se è richiesta la conferma dell'identificazione, gli isolati devono essere inviati un Laboratorio di Riferimento in cui è disponibile (a pagamento) il servizio d’Identificazione tassonomica per streptococchi e altri Gram positivi correlati, generi catalasi negativi.

Informazione Tecnica/Limitazioni

Sistemi di identificazione commerciali Al momento della stesura, alcune confezioni commerciali possono fornire risultati inaffidabili per l'identificazione degli streptococchi α-emolitici. Scarsa è anche la differenziazione tra S. pneumoniae e il gruppo S. mitis in quanto non sono geneticamente separabili, e pure per le specie Streptococcus mitis/oralis che possono essere erroneamente identificate come S. pneumoniae55.

Un altro gruppo difficile da differenziare appartiene alle specie S. mitis e gruppi S. sanguinis che sono spesso considerati come un unico gruppo; questi forniscono risultati discordanti dovuti alla scarsa qualità del sistema di identificazione utilizzato.

MALDI-TOF MS Una limitazione di MALDI-TOF MS è dovuta alla mancata pronta differenziazione fra Streptococcus pneumoniae e gli altri componenti del gruppo Streptococcus mitis. Nonostante questa limitazione, la sottotipizzazione dei ceppi di Streptococcus pneumoniae con MALDI-TOF MS può essere eseguita in modo affidabile, anche per ceppi immunologicamente non tipizzabili o non capsulati56.




Test della catalasi A volte è fornita un debole reazione della catalasi o pseudocatalasi da specie Aerococcus e Enterococcus .




1 Considerazioni sulla Sicurezza57-73 2 Microrganismi di Gruppo di Rischio 2.

Fare riferimento alle linee guida sulla sicurezza della manipolazione per tutti i microrganismi presentati in questo documento.

Devono essere indossati e rispettati in ogni momento adeguati dispositivi di protezione individuale (PPE) e tecniche finalizzate a ridurre al minimo l'esposizione del personale di laboratorio

Le procedure di laboratorio che generano aerosol infettivi devono essere eseguite in cabina microbiologica di sicurezza.

I datori di lavoro devono garantire che il personale in gravidanza, immunocompromesso o immunosoppresso deve avere accesso limitato al lavoro con esposizione a questi microrganismi altamente infettivi o alla manipolazione di isolati con richiesta d’identificazione e, in alcune situazioni, queste persone devono aver accesso solo a un laboratori a basso rischio74.

Sono state segnalate infezioni acquisite in laboratorio75.

Le linee guida precedentemente esplicitate devono essere supplementate con la COSHH locale e con la valutazione del rischio.

E’ essenziale il rispetto delle regolamentazioni di spedizione postale e di trasporto.

2 Microrganismo Bersaglio

Specie Streptococcus segnalate come causa di infezione Umana43,76

Streptococci con antigene A-G di Lancefield1

Group A Streptococcus pyogenes (Streptococcus anginosus e Streptococcus constellatus sottospecie constellatus può dare razioni crociate con l’antigene di gruppo A di Lancefield).

Group B Streptococcus agalactiae

Group C Streptococcus dysgalactiae subspecies equisimilis, Streptococcus equi subspecies equi, Streptococcus equi sottospecie zooepidemicus (Streptococcus anginosus e Streptococcus constellatus sottospecie pharyngis può dare razioni crociate con l’antigene di gruppo C di Lancefield).

Group D3,15,19 Specie Enterococcus (consultare di seguito)

Gruppo Streptococcus bovis La Tassonomia del gruppo S.bovis group è u problema ancora irrisolto14 Streptococcus bovis, Streptococcus gallolyticus77 (Streptococcus gallolyticus subsp gallolyticus (S. bovis biotype I), Streptococcus gallolyticus subsp pasteurianus (S. bovis biotype II/2),




Streptococcus gallolyticus subsp macedonicus), Streptococcus equinus, Streptococcus infantarius (in precedenza S. bovis biotype II/1), Streptococcus pasteurianus, Streptococcus lutetiensis Group F Streptococcus anginosus,Streptococcus constellatus sottospecie constellatus

Group G Streptococchi di gruppo G (Streptococcus anginosus e Streptococcus constellatus sottospecie constellatus può dare razioni crociate con l’antigene di gruppo G di Lancefield).

Steptococchi”viridans”

Sono suddivisi in 5 sottogruppi5. Sono di seguito descritti

Streptococcus anginosus group (noto anche come gruppo S. milleri)16,18 Streptococcus anginosus, Streptococcus anginosus subspecies whileyi, Streptococcus constellatus subspecie constellatus, Streptococcus constellatus subspecies pharyngis, Streptococcus constellatus subspecie viborgensis, Streptococcus intermedius

Gruppo Streptococcus mutans - Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus

Gruppo Streptococcus mitis group2 - Streptococcus mitis78, Streptococcus oralis, Streptococcus sanguinis, Streptococcus gordonii, Streptococcus parasanguinis, Streptococcus cristatus, Streptococcus massiliensis79, Streptococcus pneumoniae*14, Streptococcus pseudopnemoniae23, Streptococcus peroris14,80, Streptococcus oligofermentans14, Streptococcus australis14, Streptococcus infantis14,80, Streptococcus sinensis81

Gruppo Streptococcus salivarius Streptococcus salivarius, Streptococcus vestibularis

Altri streptococci con raggruppamento incerto o relazione genetica sconosciuta) -Streptococcus suis, Streptococcus acidominimus82

Varianti Nutrizionali di streptococci27,29,83 - Granulicatella adjacens, Granulicatella elegans, Abiotrophia defectiva.

* Tassonomicamente, questo è dimostrato di essere all'interno del raggruppamenti mitis, ma potrebbe essere separato da tutte le altre specie.

Specie Enterococcus Segnalete come Causa di Infezione Umana Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus casseliflavus, Enterococcus dispar, Enterococcus durans, Enterococcus flavescens, Enterococcus gallinarum, Enterococcus raffinosus

Altri generi generi Segnalati come Causa di Infezione Umana Specie Aerococcus ,specie Facklamia,specie Gemella, specie Globicatella,specie Helcococcus,specie, Lactococcus,specie Leuconostoc,specie Pediococcus




3 Identificazione

3.1 Aspetto Microscopico Colorazione Gram (TP 39 - Staining Procedures)

Le specie Streptococcus, Enterococcus e Lactococcus sono Gram-positive, con cellule rotonde od ovali disposte a coppie, in corte o lunghe catenelle e talvolta a grappolo. Gli Streptococcus pneumoniae sono Gram-positivi, di forma lanceolata disposti in coppie, spesso dotate di capsula visibile. Le specie Aerococcus, Pediococcus, Facklamia, e Helcococcus sono cocchi Gram-positivi disposti a grappolo o tetradi. Le specie Gemella e Leuconostoc sono cocchi Gram-positivi disposti in coppie, grappoli e corte catenelle (Gemella possono essere facilmente decolorate).

3.2 Terreni di Primo Isolamento

Agar sangue incubato in 5 - 10% di CO2 a 35°C – 37° per 16 – 48 ore o in anaerobiosi a 35°C - 37°C per 16 - 24 ore per i tamponi faringei (B 9 - Investigation of Throat Swabs). Agar Staf/Strep incubato in aerobiosi a 35°C – 37°C per 16 - 48 ore. Agar CLED incubato in aerobiosi a 35°C – 37°C per 16 - 24 ore. Agar per anaerobi esigenti incubato in anaerobiosi 16 - 48 ore.

3.3 Aspetto Colonia

Microrganismo “gruppo”

Emolisi Caratteristiche di crescita su agar sangue dopo incubazione a 35°C - 37°C per 16 – 24 ore

Streptococchi β-emolitici β Circa 0.5 mm, margine continuo, possono assumere aspetto asciutto, può essere difficile prelevare le colonie dalla piastra

Streptococchi “viridans” α o non Le colonie sono di 0.5 - 1.0 mm, margine continuo

Enterococchi α, β o non Le colonie sono di dimensioni maggiori di quelle degli streptococchi, di solito 1 – 2 mm, aspetto umido. Emolisi di tipo variabile

S. pneumoniae α Colonie di 1 – 2 mm possono apparire a ‘pedina di dama’. Dopo incubazione anaerobica le dimensioni delle colonie possono essere maggiori e di aspetto mucoso

“S. anginosus” α, β or non Colonie piccole (≤ 0.5 mm), emolisi di tipo variabile. Alcuni ceppi possono presentare un addensamento bianco sopra la colonia

VNS α or non Colonie piccole (≤ 0.5 mm), per la crescita richiedono piridossale o cisteina

Specie Aerococcus α Assomigliano a streptococchi “viridans”

Specie Facklamia α or non Assomigliano a streptococchi “viridans”

Specie Gemella α or non Assomigliano a streptococchi “viridans”




3.4 Procedure di Prova

3.4.1 Test Biochimici Prova della catalasi (TP 8 - Catalase Test) Gli Streptococchi ed i microrganismi di aspetto morfologico simile sono solitamente catalasi-negativi. A volte una debole reazione della catalasi o della pseudocatalasi è prodotta da specie Aerococcus e Enterococcus. Idrolisi bile-esculina (TP 2 - Aesculin Hydrolysis Test) Enterococchi, streptococchi di Lancefield di Group D e lattococchi idrolizzano l’esculina in presenza di bile al 40%, gli altri streptococchi sono negativi. Alcuni ceppi delle specie Aerococcus possono idrolizzare l’esculina. Prova di Sensibilità all’optochina (TP 25 - Optochin Test ) S. pneumoniae di solito è sensibile all’optochina, gli altri streptococchi sono solitamente resistenti. Occasionalmente alcuni ceppi di S. oralis, S. mitis e S. pseudopneumoniae possono essere sensibili all’optochina. Pyrolidonyl arylamidasi (PYR-aminopeptidasi) Enterococchi e S. pyogenes sono positivi, gruppo S. bovis e gruppo S. anginosus sono negativi. Prova di solubilità nella bile (opzionale) (TP 5 - Bile Solubility Test) S. pneumoniae è solubile nei sali biliari al 10%, S. pseudopneumoniae è parzialmente solubile e gli altri streptococchi α-emoliici non sono solubili.

Specie Globicatella α Assomigliano a specie Aerococcus

Specie Helcococcus non Colonie di 0.5 - 1.0 mm, margine continuo

Specie Lactococcus α or non Assomigliano ad enterococchi

Specie Leuconostoc α or non Assomigliano a streptococchi “viridans”

Specie Pediococcus α or non Assomigliano a streptococchi “viridans”




Riassunto risultati delle prove Presenza di

antigene di gruppo Lancefield (Confezione commerciale)

Prova di sensibilità all’optochina24

Catalasi

Idrolisi Bile Esculina

PYR

( TP 25)

(TP 8)

(TP 2)

Gruppo B, C, F, e G

+ R - - -

S. pneumoniae - S - - d

Gruppo D + R - + -

Enterococchi + R v + +

S. bovis (V) #

R - + -

Specie Aerococcus

- R v v D

Gruppo A + R - - +

Gruppo S. anginosus

v R - v -

Streptococchi “viridans”

- v - ND ND

Specie Falklamia - R - - +

Specie Gemella - R w - +

Specie Globicatella

- R - + +

Specie Helcococcus

- R - - +

Specie Leuconostoc

- R - d D

Specie Pediococcus

cr R - + -

v variabile R resistente S sensibile cr reazione crociata d 6 - 84 % di ceppi positivi

w reazione debole ND Nessun dato + -

# - Nel gruppo S. bovis , Streptococcus infantarius (in precedeza S. bovis biotype II/1) e S. lutetiensis entrambi forniscono risultati variabili con gli antigeni della classificazione di Lancefield5. Questi risultati sono coerenti con tassonomia di tre sistemi1,9,84. Diffusamente pubblicati.

3.4.2 Raggruppamento streptococchi (Identificazione confezioni commerciali) Lancefield ha dimostrato che la maggioranza degli streptococchi patogeni possiedono specifici antigeni composti da carboidrati, che permettono la classificazione degli streptococchi in gruppi. Questi antigeni di gruppo dello streptococco possono essere estratti dalle cellule utilizzando acido, formammide o metodi enzimatici85-87. L'uso di una procedura di estrazione enzimatica riduce considerevolmente il tempo necessario per l'estrazione dell'antigene e migliora di molto la resa dell’antigene, solo parzialmente per gli streptococchi del gruppo D.




La maggior parte delle prove con lattici commerciali si avvalgono di reagenti azoto modificati, che rapidamente estraggono gli antigeni dei gruppi, senza richiedere alcuna incubazione. Le particelle del saggio con lattice sono sensibilizzate con anticorpo gruppo specifico e agglutinano in presenza dell’antigene omologo. Gli antigeni gruppo specifici sono estratti da streptococchi utilizzando temperatura ambiente con procedura di estrazione immediata con acido nitroso. L'estratto è poi neutralizzato e gli antigeni sono identificati tramite agglutinazione. Possono verificarsi reazioni crociate per i gruppi Lancefield A, B, C, D, F e G. I laboratori devono seguire le istruzioni del produttore e le prove rapide e le confezioni devono essere validate prima del loro uso avendo dimostrato di essere adatte allo scopo.

3.4.3 Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation Time-of-Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) MALDI-TOF è stato sviluppato e validato per determinare specie e caratteristiche di Streptococcus ed Enterococcus88. Questo ha dimostrato di essere uno strumento rapido e potente per la sua riproducibilità, velocità e sensibilità dell'analisi. Il vantaggio di MALDI-TOF rispetto a PFGE è dovuto a fatto che i risultati delle analisi sono disponibili entro poche ore anziché diversi giorni. Una limitazione di MALDI-TOF è dovuta alla difficoltà di distinguere facilmente tra Streptococcus pneuomoniae e gli altri componenti del gruppo Streptococcus mitis. Nonostante questa limitazione, la sottotipizzazioni di ceppi di Streptococcus pneumoniae mediante MALDI-TOF MS può essere eseguita in modo affidabile, anche per ceppi immunologicamente non tipizzabile o non incapsulati56. Questo strumento è stato anche utilizzato per identificare aerococci a livello di specie, ma tuttavia, la precisione d’identificazione del MALDI-TOF MS per specie batteriche non comuni nei campioni clinici, quali aerococci, deve essere ulteriormente valutata89.

3.4.4 Test di amplificazione degli acidi nucleici (NAAT) La PCR è ormai affermata come una tecnica rapida, affidabile e riproducibile per l'identificazione di specie Streptococcus e Enterococcus. Per le specie Streptococcus, sono disponibili vari tipi PCR; sarà eseguita l'appropriata PCR per i diversi gruppi, loro geni bersaglio e in funzione delle notizie cliniche.

La PCR Multiplex è un'analisi rapida e conveniente che permette l'amplificazione simultanea di più di un locus nella stessa reazione e questo ha fornito un'alternativa affidabile e rapida ai test fenotipici e monoplex PCR per il rilevamento di cinque potenziali geni di virulenza (sostanza di aggregazione, gelatinasi, citolisina, proteine di superficie di enterococchi e, molto recentemente, ialuronidasi) in enterococchi, determinazione del tipo di capsula di Streptococcus agalactiae, per i sierotipi capsulari di pneumococco etc90-92.

La PCR è stata utilizzata anche per la rilevazione simultanea di genotipi di resistenza ai glicopeptidici e l'identificazione a livello di specie di enterococchi clinicamente rilevanti (Enterococcus faecium, E. faecalis, E. gallinarum, e E. casseliflavus)93.

3.5 Identificazione Successiva Se è richiesta una successiva identificazione dopo le informazioni ottenute dalle caratteristiche di crescita, morfologia delle colonie, test della catalasi, colorazione Gram della coltura, risultati sierologici e risultati di identificazione biochimici, inviare l’isolato al Laboratorio di Riferimento.

Metodi rapidi Sono stati sviluppati una grande varietà di metodi rapidi di tipizzazione per isolati da campioni clinici; si tratta di tecniche molecolari come la Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE), 16S rRNA gene sequencing, atpA Gene Sequence Analysis, e la Multilocus sequence typing (MLST). Tutti questi




approcci consentono la sottotipizzazione di ceppi non correlati, ma il risultato ha accuratezza, potere discriminatorio e riproducibilità diversi.

Tuttavia, alcuni di questi metodi rimangono accessibili solo ai laboratori di riferimento e sono difficili da implementare per l’identificazione batterica di routine di un laboratorio clinico.

Sequenziamento

Sequenziamento basato sulla tipizzazione emm l'uso di oligonucleotidi che hanno come bersaglio l’ N-terminale del gene codificante la proteina M rappresenta il metodo più pratico di tipizzazione perché il gene che codifica la proteina M dello Sterptococcus di gruppo A contiene una regione ipervariabile soggetta a molti poliformismi a singolo nucleotide, che serve come base per la tipizzazione emm degli isolati di S. pyogenes94.

atpA Gene Sequence Analysis è utilizzata per differenziare tutte le specie attualmente conosciute di Enterococcus sulla base delle loro sequenze atpA e il gene 16S rRNA è molto utile per discriminare i principali gruppi di enterococchi, ossia gruppi di specie E. avium, E. casseliflavus, E. cecorum, E. faecalis e E. faecium; ma non riesce a discriminare le specie strettamente correlate, vale a dire gli appartenenti alle specie dei gruppi E. faecalis e E. faecium e le specie Streptococcus non sono facilmente individuate dalla sequenza del gene 16S rRNA4.

Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) La PFGE è un metodo di tipizzazione molecolare molto riproducibile, discriminante e efficace per studi epidemiologici di tipizzazione volti a identificare e classificare gli streptococchi e gli enterococchi in sottotipi; è considerato il standard di riferimento95. Tuttavia, PFGE è risultata essere superiore per l'interpretazione dei rapporti tra fra ceppi di enterococchi, ma non ha dato luogo a risultati discriminanti di bande DNA specie-specifiche4. Inoltre, in funzione delle sue caratteristiche, richiede molto tempo (30 ore o più per eseguire la prova) e necessita di attrezzature speciali; la PFGE non è diffusamente usata se non nei laboratori di riferimento.

Multi-locus sequence typing (MLST) La Multi-locus sequence typing (MLST) è uno strumento molto discriminante ampiamente utilizzato per la tipizzazione filogenetica dei batteri, nonché per studi di'epidemiologia molecolare e della struttura genetica della popolazione di microrganismi. La MLST si avvale dell’amplificazione PCR e del sequenziamento di un certo numero di frammenti strutturali di geni essenziali (di solito 6 o 7) o sparsi attorno al cromosoma batterico. La MLST misura direttamente le variazioni di sequenza del DNA in un insieme di geni costitutivi e caratterizza i ceppi per i loro profili allelici unici.

Il principio di MLST è semplice: la tecnica comporta l'amplificazione PCR seguita da sequenziamento del DNA. Le differenze nucleotidiche tra ceppi possono essere controllate in un numero variabile di geni in funzione del grado di discriminazione desiderato. A causa della conservazione della sequenza nei geni costitutivi , a volte la MLST non è in grado di differenziare i ceppi batterici, ciò ne limita l'utilizzo negli studi epidemiologici. I suoi vantaggi sono inequivocabili e i dati di sequenza possono essere facilmente confrontati tra laboratori, inoltre i dati possono essere memorizzati in un database centrale facilmente accessibile via Internet; ciò costituisce una potente risorsa per l’epidemiologia globale96.

Questo metodo è stato utilizzato con successo nella tipizzazione e ricerca della struttura di ceppi di Streptococcus agalactiae (Streptococco di gruppo B di Lancefield, GBS)97. E’ stato pure utilizzato per




identificare i principali cloni associati a grave malattia pneumococcica invasiva e per la caratterizzazione di Streptococcus pyogenes (streptococco gruppo A di Lancefield, GAS ) isolati a fini epidemiologici utilizzando questo metodo con il suo database disponibile su web dedicato e che può essere consultato su http://pubmlst.org/mlst/98,99.

Tuttavia, gli svantaggi della MLST sono il costo e il notevole lavoro di laboratorio richiesto per amplificare, determinare, e rileggere la sequenza nucleotidica dei frammenti di DNA bersaglio; ciò rende il metodo poco adatto per analisi di laboratorio di routine.

3.6 Conservazione e Invio

Se richiesto, eseguire la sottocoltura dell’isolato puro su agar sangue a becco di clarino per l’invio al Laboratorio di Riferimento.


Batteriologia – Identificazione | ID 4 | Emissione no: 3 | Data emissione: 28.10.14 | Pagina: 27 di 36 UK Standards for Microbiology Investigations | Emesso da Standards Unit, Public Health England

4 Identificazione di specie Streptococcus, specie Enterococcus e Microrganismi Morfologicamente Simili

Il diagramma di flusso è solo indicativo.

Identificazione di specie Streptococcus, specie Enterococcus e microrganismi morfologicamente simili

Batteriologia – Identificazione I ID 4 I Emissione no: 2.3| Data emissione: 10.03.14 | Pagina: 28 di 36 UK Standards for Microbiology Investigations | Emesso da Standards Unit, Public Health England

5 Refertazione

5.1 Identificazione Presuntiva

Se si riscontrano appropriate caratteristiche di crescita, aspetto della colonia, colorazione Gram della coltura, catalasi e risultati sierologici.

5.2 Conferma Identificazione

La conferma dell’identificazione e della tossicità sono effettuate solo dalla Respiratory and Vaccine Preventable Bacteria Reference Unit (RVPBRU) PHE Colindale.

5.3 Medico Microbiologo

Informare il medico microbiologo di tutti gli isolati con identificazione preliminare e confermata di specie Streptococcus, Enterococcus, e di microrganismi morfologicamente simili, isolati da campioni prelevati da sedi normalmente sterili. Per motivi correlati a potenziali malattie invasive, allo sviluppo di sequele di tipo immunologico o mediate da tossine, segnalare al medico microbiologo, secondo i protocolli locali, gli isolati di Streptococcus pyogenes ritenuti di “nuovo isolamento” ed i microrganismi dotati di antigeni C o G di Lancefield che sviluppano “grosse colonie”. Considerare la possibilità d’informare il medico microbiologo, secondo i protocolli locali, quando il modulo di richiesta contiene informazioni importanti od aggiuntive che fanno sospettare un’infezione streptococcica grave o di tipo invasivo quale:

• Fenomeni mediati da tossina (Sindrome da Shock Tossico o Scarlattina)

• Fascite (necrotizzante) o miosite, sepsi puerperale

• Endocardite

• Ricerca di possibile epidemie o sospette infezioni crociate in ospedale od in altre istituzioni.

• Profili insoliti di resistenza antimicrobica di specie Enterococcus, includenti vancomicina o altro glicopeptide, e resistenza di S. pneumoniae alla penicillina.

Secondo i protocolli locali il medico microbiologo deve essere informato degli isolati di streptococco β-emolitico di Gruppo B di Lancefield quando:

• La paziente è gravida, nell’immediato post partum o neonato Seguire I protocolli locali per la refertazione al medico del paziente

5.4 CCDC Fare riferimento al Memorandum locale di Informazione.

5.5 Public Health Englnd100

Fare riferimento alle linee guida attuali del CIDSC ed alle indicazioni del COSURV.



5.6 Gruppo Controllo Infezione

In accordo con i protocolli locali, informare il gruppo di controllo delle infezioni degli isolati di streptococchi di Gruppo A, specie Enterococcus glicopeptide resistenti e pneumococchi penicillina resistenti isolati da pazienti degenti secondo le disposizioni locali. Si deve anche valutare la possibilità d’informare il Gruppo di Controllo delle Infezioni sull’entità di questi isolamenti in pazienti che sono attualmente presenti in comunità (incluse le istituzioni per infermiere professionali) secondo le disposizioni locali, in modo particolare nel caso di sospetta trasmissione crociata.

6 Invio

6.1 Laboratorio di Riferimento

Contattare gli appropriati laboratori nazionali di riferimento per informazioni sugli accertamenti disponibili, tempi di risposta, procedure di trasporto ed altre, riguardanti il laboratorio di riferimento, rivolgersi a:

Streptococchi Streptococcus and Diphtheria Reference Section Streptococcus and Diphtheria Reference Section WHO Global Collaborating Centre for Streptococcal and Diphtheria Infections Respiratory and Vaccine Preventable Bacteria Reference Unit Microbiology Services Public Health England 61 Colindale Avenue London NW9 5EQ

https://www.gov.uk/rvpbru-reference-and-diagnostic-services Enterococci: Antimicrobial Monitoring and Health Care Associated Infections Reference Unit (AMRHAI) Microbiology Services Public Health England 61 Colindale Avenue London NW9 5EQ https://www.gov.uk/amrhai-reference-unit-reference-and-diagnostic-services Contattare il centralino della PHE: Tel. +44 (0) 20 8200 4400 Inghilterra e Galles

https://www.gov.uk/specialist-and-reference-microbiology-laboratory-tests-and-services Scozia http://www.hps.scot.nhs.uk/reflab/index.aspx Irlanda del Nord http://www.belfasttrust.hscni.net/Laboratory-MortuaryServices.htm



7 Notifica al PHE100,101 o Equivalente102-105 Le Norme di Denuncia del 2010 rendono obbligatorio ai laboratori diagnostici di denunciare alla Public Health England (PHE) tutti i casi nei quali s’identificano gli agenti causali elencati nella Scheda 2 della Direttiva. Le denunce devono pervenire per scritto, su carta o per via elettronica, entro sette giorni. I casi urgenti devono essere notificati il più presto possibile verbalmente: si raccomanda entro le 24 ore. Questi stessi devono essere in seguito denunciati in forma scritta entro sette giorni. Secondo la Notification Regulations il laboratorio ricevente la notifica è l’ufficio locale della PHE. Se il caso è già stato notificato da un professionista medico abilitato, al laboratorio diagnostico è ancora richiesta la denuncia del caso qualora si riscontrino evidenze d’infezione imputabili ad agenti causali soggetti a tale disposizione. La denuncia secondo la Direttiva dell’Health Protection (Notification) Regulations 2010 non sostituisce l’informazione volontaria alla PHE. La maggior parte dei laboratori del NHS segnala spontaneamente al PHE gran parte delle diagnosi di laboratorio sostenute da vari agenti eziologici e molte sezioni della PHE hanno definito accordi con i laboratori locali per segnalazioni urgenti di alcuni tipi d’infezione. Queste iniziative devono continuare. Nota: La linea guida dell’Health Protection Legislation Guidance (2010) include la segnalazione per Human Immunodeficiency Virus HIV & Sexually Transmitted Infections STIs, Healthcare Associated Infections e HCAIs e Creutzfeldt–Jakob disease CJD da includere nel ‘Notification Duties of Registered Medical Practitioners’, e non al ‘Notification Duties of Diagnostic Laboratories’. https://www.gov.uk/government/organisations/public-health-england/about/our-governance#health-protection-regulations-2010

Esistono accordi diversi in Scozia Scotland102,103, Wales104 and Northern Ireland105.

Roberto

Casella di testo

Traduzione a cura di Roberto Rescaldani, già primario del Laboratorio di Microbiologia e Virologia A.O. San Gerardo dei Tintori - Monza. I testi originali e le traduzioni sono disponibili sul Web APSI - www.apsi.it - Webmaster Sergio Malandrin, Dirigente di primo livello del Laboratorio di Microbiologia e Virologia A.O. San Gerardo dei Tintori di Monza



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Ricerche Microbiologiche: Procedure Standard del Regno Unito · La tassonomia di Streptococcus ed Enterococcus è stata aggiornata. Maggiori informazioni sono state aggiunte alla