Resumen Producción de PHA´s

TECNOLOGICO DE ESTUDIOS SUPERIORES DE ECATEPEC

miércoles, 19 de abril de 2023

Temas Selectos de Biotecnología

División de Ingeniería Bioquímica

Profesora: María Isabel Nería González

Alumnos:

Cortes Bautista Juan

Ballesteros Guerrero V. Omar

Grupo 3851

Resumen de Exposición del 3er Parcial:

Production of polyhydroxyalkanoates (PHAs) with canola oil as carbon source

Temas selectos de Biotecnología | Resumen: Producción de polihidroxialcanoatos (PHA´s) con aceite de canola como fuente de carbono

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Producción de polihidroxialcanoatos (PHA´s) con aceite de canola como fuente de carbono

Autores:

M.R. López-Cuellar, J. Alba-Flores, J.N. Gracida Rodríguez, F. Pérez-Guevara

Biotechnology and Bioengineering, CINVESTAV, Av. IPN 2508, Zacatenco Gustavo A, Madero, México, D.F., MexicoBiotechnology, UPP, Carretera Pachuca-Cd Sahagún km. 20, Exhacienda de Santa Bárbara 43830, Zempoala Hidalgo, Mexico

RESUMEN

Wautersia eutropha fue capaz de sintetizar polihidroxialcanoatos de longitud de cadena media (PHAs) cuando se utilizó el aceite de canola como fuente de carbono. W. eutropha se cultivó usando fructosa y sulfato de amonio como fuentes de carbono y nitrógeno, respectivamente, para el crecimiento y el desarrollo del inóculo. Los experimentos se realizaron en un bioreactor a escala de laboratorio en tres etapas. Inicialmente, la biomasa fue adaptada en un cultivo de lote, en segundo lugar, se utilizó un lote alimentado para aumentar el peso seco de células y la concentración de PHA a 4,36 g/L y 0.36 g/L respectivamente. Finalmente, después de la adición de aceite de canola como fuente de carbono hasta una concentración final de 18,27 g/L, el PHA se obtuvo después de 40 h de fermentación. Con el aceite de canola como fuente de carbono, el contenido de polímero en la materia seca de células fue de 90%. El polímero se purifico a partir de las células secas y se analizó mediante FTIR, NMR y DSC usando PHB como referencia. El polímero producido por W. eutropha partir de aceite de canola tenía cuatro monómeros de carbono en la estructura de la PHA y por análisis de NMR se identificó el 1H y 13C como 3-ydroxybutirato (3HB), 3-hidroxivalerato (3HV), 3-hidroxioctanoato (3HO), y 3-hidroxidodecanoato (3HDD).

Palabras clave:Aceite de canola, Polihidroxialcanoatos, caracterización polimérica, Biopolímeros, Wautersia eutropha

1. Introducción

Los plásticos de origen químico tienen cualidades versátiles de resistencia, ligereza, durabilidad y resistencia a la degradación. Se utilizan en casi todas las industrias, en especial para el embalaje en el que representan más del 50% del consumo total. El tiempo de vida útil de la mayoría de ellos es muy corto, especialmente cuando se utilizan para el embotellado y embalaje. Estos se desechan al medio ambiente causando serios problemas de contaminación, por ejemplo; la acumulación de plásticos no degradables o la incineración que causa las emisiones de gases de efecto invernadero. Los plásticos biodegradables son una alternativa para evitar los problemas de contaminación causados por los plásticos comerciales. Los polihidroxialcanoatos (PHA) son 100% biodegradable, termoplásticas, elastómeros, insoluble en agua, polímeros no tóxicos y biocompatibles.


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Estos poliésteres tienen características similares a las de polietileno y el polipropileno, y por lo tanto se pueden utilizar en lugar de los plásticos convencionales. Además, se degradan completamente bajo condiciones aeróbicas y anaeróbicas por microorganismos.Los PHAs se clasifican basándose en el número de átomos de carbono en sus unidades monoméricas y se divide en dos grupos; PHA de cadena corta (PHAscl) con 3-5 átomos de carbono y de cadena media (PHAmcl) con 6-14 átomos de carbono. Tienen un alto grado de polimerización con cristalinidad del 60-80%, son ópticamente activos e isostáticos, piezoeléctricos e insolubles en agua. Estas características los hacen altamente competitivos frente a los derivados de polipropileno y otros plásticos derivados del petróleo. Los PHAs se utilizaron inicialmente como películas en la industria del embalaje. Estas películas también pueden ser utilizadas para hacer las hojas junto con otros polímeros tales como alcohol polivinílico. Otras aplicaciones del PHA es usado para implementos, envases de cosméticos y de champús. También, se utilizan como vehículos biodegradables de los medicamentos, hormonas, insecticidas y herbicidas, como hueso sintético y material de la estructura quirúrgica para la sustitución de los vasos sanguíneo. Los PHAs son producidos por al menos 75 géneros de bacterias diferentes, incluyendo tanto Gram negativos y positivos, tales como Eutropha Wautersia, Bacillus megaterium, Klebsiella aerogenes, Pseudomonas putida, Pseudomonas oleovarans y natans Sphaerotilus.

Estos polímeros son intracelularmente acumulados en la bacteria como inclusiones bajo condiciones de estrés, tales como la limitación de fósforo, nitrógeno, oxígeno o en un medio de cultivo no óptimo de pH, hasta el punto que PHA puede representar hasta el 80% del peso seco de la biomasa seca obtenida en la fermentación.

Se sabe que el PHA producido por microorganismos puede tener diferentes composiciones y estructuras dependiendo del tipo de microorganismo utilizado para su producción, así como la composición y el estado del medio de cultivo.

W. eutropha (antes de Ralstonia eutropha) es una bacteria Gram negativa, aeróbico obligado, quimio-organotrofico, capaz de la acumulación de entre 8 y 13 gránulos de PHA en la célula con un diámetro que oscila de 0,2 a 0,5 μm. Las inclusiones hidrófobas, suspendidas en el citoplasma de la célula, contienen de 5-10% de agua y son en gran parte en un estado amorfo. Después de la destrucción celular, cuando se extrae PHA, la cristalización ocurre rápidamente.

La elección de una fuente de carbono adecuada es un factor importante en la optimización de la producción de PHA. La naturaleza de la fuente de carbono no sólo determina el contenido de PHA, sino también la composición de monómeros, que posteriormente afecta a las propiedades finales del polímero.

Dentro del coste final de los materiales utilizados para producir PHA, 80% corresponde a la fuente de carbono utilizada. Por lo tanto el precio de PHA se puede reducir fácilmente mediante el uso de sustratos baratos.

En consecuencia, las fuentes de carbono simples, como la glucosa o fructosa, se utilizan para producir PHA como PHB, además de ácidos orgánicos volátiles tales como ácidos acético, propiónico y butírico.


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Otras fuentes de carbono se han utilizado como la melaza, suero de leche y aceite vegetal La producción de biopolímeros con aceite vegetal ha mostrado un aumento en unidades monoméricas con 6-14 átomos de carbono. Por ejemplo, Akiyama et al., reportó un rendimiento de 0,8 g PHA por g de aceite vegetal y 0,3 g de PHA por 1 g de glucosa.El aceite vegetal es una fuente viable económica para la producción de PHA, porque es más barato de utilizar una mezcla de ácidos grasos que se encuentran en las plantas que los ácidos grasos purificados. Aunque el uso de técnicas de biología molecular y de ADN recombinante, son de gran utilidad para dirigir la producción de PHA a productos muy específicos, este tipo de metodologías aumentan el precio de la producción de PHA.

La manipulación de métodos de fermentación como cultivo por lote alimentado, se utiliza típicamente en los procesos de bio-industriales para alcanzar una alta densidad celular en el bioreactor y evitar problemas de inhibición por sustrato o de inducción, que limita la cantidad del producto final en el cultivo. Se ha informado de que grandes cantidades de carbohidratos (> 30 g/l) inhiben la producción de biomasa y del producto final.

Srivastava y Khanna compararon el efecto de la fructosa, glucosa, melaza, glicerol y sacarosa sobre la biomasa residual y la producción de PHB. Obtuvieron la producción de biomasa similar, pero menos la producción de PHB cuando se utilizó glucosa en comparación con fructosa, presumiblemente debido a la incapacidad del cultivo para usar estos azúcares que contienen iones y minerales, que tienen un efecto perjudicial sobre el crecimiento microbiano y la síntesis de producto. Por lo tanto, el uso de un sistema de producción de lote alimentado aumenta la densidad celular y reduce la inhibición por diferentes sustratos.

El objetivo de producir PHA con mejores propiedades térmicas y mecánicas se obtuvo a través de fermentaciones en tres etapas. La primera etapa permitió el crecimiento celular y la adaptación a las condiciones de cultivo. En una segunda etapa, una mayor densidad celular es lograda controlando la alimentación de sustratos. En una tercera etapa, el PHA es producido adicionando una fuente de carbono que ayuda a la producción de PHA de cadena media.

2. Experimentación2.1 Microorganismo y medio de cultivo

La cepa bacteriana utilizada en este estudio, W. eutropha ATCC 17699, se mantuvo en placas de nutrientes a 4 °C. El medio utilizado para el cultivo de W. eutropha fue el medio líquido modificado de Luria-Bertani (LB). En todos los casos, fructosa y el resto de los componentes de los medios se esterilizaron por separado y se mezclaron asépticamente antes de la inoculación.


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2.2 Condiciones del medio de cultivo

El cultivo de siembra se preparó en un matraz conteniendo 300 ml de medio LB incubado a 30 ◦C durante 24 h. Este se utilizó para inocular el bioreactor al 10% (v/v). El medio de producción para el sistema contenia por litro: 10 g de fructosa, 1,57 g de NH4SO4, 5,66 g de NaH2PO4·12H2O, 1,5 g de KH2PO4, 0,2 g MgSO4·7H2O, 10 mg de CaCl2·2H2O, 20 mg FeSO4·7H2O, 1 ml de solución de micro-elementos: 0,3 g H3BO3 , 0,2 g CoCl2·6H2O, 0,1 g ZnSO4·7H2O, 30mg MnCl2·4H2O, 30mg Na2MoO4·2H2O, 20mg NiCl2·6H2O y 10 mg CuSO4·5H2O, en solución de HCl 0,1 N.

2.3 Condiciones del Bioreactor

El cultivo se realizó en un bioreactor de 5 L (BIOFLO 3000, New Brunswick Scientific). La temperatura se controló a 30 °C y un flujo de aire de 5 l/min. El valor de pH se mantuvo a 7, utilizando soluciones 0.47M H3PO4 y NaOH 2M. Las muestras para análisis fueron tomadas cada 2 h.

Las fermentaciones se realizaron en tres etapas:

Etapa 1: adaptación de biomasa en cultivo de lote, con un factor inicial C/N = 14, y un volumen de 3 L.

Etapa 2: producción de biomasa en cultivo de lote alimentado. La alimentación fue con una solución de 30 g/l de fructosa y 9,54 g/l de sulfato de amonio, añadido a un gasto de 0,9 l/h.

Etapa 3: la producción de PHA con la adición de aceite vegetal como fuente de carbono, bajo limitación de nitrógeno en el medio en una relación (C/N > 120).

2.4 Procedimiento analítico

El peso celular seco (X) se determinó gravimétricamente y la biomasa residual (Xr) se definió como la concentración de X menos la concentración de PHA. La concentración de fructosa se determinó por el método DNS, la principal ventaja radica en su alta sensibilidad y productividad debido a que es un método espectrofotométrico; el procedimiento se basa en una reacción redox que ocurre entre el DNS y los azúcares reductores presentes en la muestra ácido 3,5 dinitro salicílico (DNS).

El amonio se determinó por el método de Watherburn. La acumulación de gránulos de PHA en células bacterianas se detectó por microscopía electrónica o de contraste de fase observada a 460 nm. Las células bacterianas se tiñeron con azul Nilo Una solución a 55 °C durante 10 min. Después de haber sido teñidos, los portaobjetos se lavaron con chorro de agua para eliminar el exceso de colorante y con ácido acético acuoso al 8% durante 1 min.

2.5 Purificación del biopolímero


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El polímero se extrajo a partir de células hervidas previamente en cloroformo durante 10 min y se precipito en hexano enfriado con hielo (exceso de 10 veces) después de eliminar los residuos celulares. El polímero precipitado se volvió a disolver en cloroformo, y el proceso se repite dos veces. El disolvente residual se eliminó por evaporación.

2.6 Caracterización química

La RMN se realizó con un equipo Bruker (DMX 500 MHz) usando cloroformo deuterado como disolvente. Los espectros de 13C e 1H se obtuvieron a 500 y 125 MHz, respectivamente. El espectro correspondiente a 1H fue analizado utilizando el programa Spinkworks versión 2.5.5.

Los estudios de FT-IR, Espectrometría Infrarroja con Transformada de Fourier (FTIR), se realizaron con un espectrofotómetro (Perkin Elmer 1600) en una ventana de exploración de 400 a 4000 cm-1. Los espectros se obtuvieron a través de 32 barridos por muestra, mientras que el aire se utilizó como referencia para la normalización.

Esta técnica proporciona un espectro de reflexión de las bandas de los grupos funcionales de las sustancias inorgánicas y orgánicas, por lo cual es posible realizar una identificación de los materiales. El equipo dotado de una sonda con fibra óptica permite el análisis directo de la superficie del objeto de estudio. Se trate de un Mid-FTIR, Remspec con resolución de 10 cm-1 en el intervalo espectral de 900-5000 cm-1.

Experimentos de DSC se realizaron en un calorímetro de barrido diferencial (Mettler Toledo DSC823). Las muestras (4 mg aprox.) Se enfriaron a -20 °C y se calentaron después a 180 °C para borrar la historia térmica. Posteriormente fueron enfriados rápidamente a -20 °C, mantenida durante 5 minutos, y se calentó lentamente hasta 180 °C. La rampa de calentamiento fue de 5 °C/min.

La cristalinidad fue estimada a partir de las entalpías de fusión determinados por calorimetría. El PHB (Goodfellow Cambridge Limited) fue por comparación. La entalpía de fusión fue usada en la ecuación. (1), tomando como base la entalpía de fusión del polímero cristalino 100%, suponiendo 146 J/g para PHB.

Donde: Xp es la cristalinidad del polímero (%), ΔHm es la entalpía de fusión del polímero (J/g),


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Wp = proporción del polímero cuando se trata de una mezcla polimérica, y ΔH°m es la entalpía de fusión del polímero cristalino 100%.

3. Resultados y Discusiones

3.1 Producción de PHA en tres etapas

La Fig. 1 muestra la cinética de X, Xr y PHA. El cultivo de lote comenzó con un volumen de 3 L y una concentración de 10 g/l de fructosa. A las 5 h fue observada la fase lag. La concentración de biomasa alcanzó 3 g/l a las 18 h en la primera etapa de fermentación.

Del estado inicial de 10 g/l de fructosa disponible, 8 g/l fue consumida, que corresponden a un rendimiento de Yx/s = 0,32 gx/gs y una tasa de absorción de azúcares promedio de 0,44 g/l h.

En la segunda etapa a partir de 18,5 h, se añadió 30 g/l de fructosa a 0,9 l/h durante 2 h. La fructosa se consumió en 3 h de fermentación y su concentración se redujo a 2 g/l durante el cultivo de lote alimentado. El rendimiento de YXR/s alcanzado durante el proceso de alimentación fue de 0,61 gxr/gs. La adición de sustrato se mantiene dentro del intervalo de 0,8 - 4.5 gsubstrate /h gbiomasa residual. Durante esta etapa, las concentraciones de biomasa total y la biomasa residual fueron de 8,7 y 7,45 g/l respectivamente, lo que indica que la fuente de carbono se utilizó para la producción de biomasa. Una vez que se terminó la alimentación de fructosa, el reactor se hizo funcionar como un cultivo de lotes (Fig. 2).Por consiguiente, la fructosa residual fue consumida.


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La concentración de amonio fue determinado durante las tres etapas de la fermentación. La figura 3 muestra que la concentración de amonio inicia se redujo de 0,42 hasta 0,03 g/l al final de la primera etapa. La tasa de consumo promedio fue de 0,0217 g/l∙h. En la etapa de producción, una concentración de sulfato de amonio de 9,54 g/l fue adicionado a un flujo de 0,9 l/h, simultáneamente con la

fuente de carbono, para alcanzar una concentración de alrededor de 0,20 g/l.


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Fig. 1 Desarrollo de la biomasa total (●), biomasa residual ( ) Y PHAs (○) De Wautersia eutropha en un bioreactor alimentado con aceite de canola como fuente de carbono para la producción de PHA. (a) Cultivo en lote, (b) cultivo por lote alimentado y (c) Etapa de producción PHA.

Fig. 2 Concentración de fructosa durante la fermentación de Wautersia eutropha usando aceite de canola como fuente de carbono para producir PHA en tres etapas. Los cultivos son observados en (a) cultivo en lote, (b) cultivo por lote alimentado y (c) la etapa de producción PHA. Las barras representan la medias ± la desviación estándar.


Estos resultados indicaron que W.eutropha puede utilizar el aceite de Canola como fuente de carbono para producir PHA. Ha sido reportado que la estructura de los esqueletos de carbono de los ácidos hidroxialcanoicos incorporados en el PHA durante la fermentación está relacionada con el sustrato usado

como precursores.

Azul de Nilo se utilizó para probar la producción de biopolímeros y se observó una fuerte fluorescencia naranja dentro de las células, lo que indica que el biopolímero en los cuerpos de inclusión se incrementó después de la adición de aceite a 22 h. La máxima producción de PHA se alcanzó a 36 h.

3.2 Caracterización del PHA obtenido

El PHA purificado se analizó por RMN para elucidar la estructura del biopolímero. La identificación de las unidades monoméricas en el PHA producido fue obtenida analizando los espectros de 13C y 1H, utilizando el biopolímero bacteriano Polihidroxibutirato (PHB) como referencia.


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Fig. 3 Perfil de concentración de amonio durante la fermentación de Wautersia eutropha con aceite de canola como fuente de carbono para la producción de PHA. Los cultivos se observaron en (a) cultivo de lote, (b) cultivo de lote alimentado y (c) la etapa de producción PHA. Las barras representan la medias ± la desviación estándar.

Fig. 4 Micrografías de fluorescencia durante la producción de polímero. PHA teñidas con azul Nilo A.


Los espectros de 13C y 1H de PHB puro mostraron las señales como se esperaba, mientras que las señales de la PHA producidos corresponden a las estructuras de cadena media. La figura 5 muestra los desplazamientos químicos dentro de los intervalos correspondientes a los carbonos de la cadena principal de PHA. Se observaron señales correspondientes a los carbonos en la cadena lateral, lo que indica la presencia de cuatro unidades monoméricas diferentes en el polímero sintetizado.

Los resultados de DSC se muestran en la Fig. 9. Los termogramas obtenidos indican una temperatura de fusión para PHB (Tm) de 170 °C con una ΔHm de 84,74 J/g. La Tm obtenida para el PHA producido fue de 133 °C con una ΔHm de 41.44 J/g.


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Fig. 5 RMN Espectro de 13C a 500 MHz de la obtención de PHAs utilizando el aceite de canola. (3HB: hidroxibutirato; 3HV: hidroxivalerato; 3HO: hidroxioctanoato; 3HDD: hidroxidodecanoato).


4. Conclusiones

En fermentaciones realizadas en bioreactor utilizando el aceite de canola como fuente de carbono, el 92% de PHA se obtuvo en base seca. El análisis termoquímico mostró señales correspondientes a hidroxibutirato, hidroxivalerato, hidroxidodecanoato y hidroxioctanoato como unidades de monómero.


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Fig. 9 DSC termogramas de PHA producido (a) y PHB (b).

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