Reacciones enzimáticas en sistemas heterogéneossgpwe.izt.uam.mx/files/users/uami/sho/Sistemas_heterogeneos.pdf · reactions were performed at 60 °C using low molecular weight artificial

Planta Piloto de FermentacionesDepartamento de Biotecnología

Sergio Huerta OchoaUAM-Iztapalapa

Reacciones enzimáticas en sistemas heterogéneos


Reacciones enzimáticas en sistemas heterogéneos

Involucrando sustratos insolubles� Enzimas en solución actuando

sobre sustratos insolubles

Involucrando enzimas inmovilizadas� Enzimas inmovilizadas sobre una

superficie actuando sobre sustratos en solución

Quitina insoluble

Quitinasas

ss

ss

ss


Reacciones enzimáticas involucrando sustratos insolubles

La enzima se adsorbe ahora en el sustrato. Si A es un sitio vacante sobre la superficie del sustrato, podemos asumir el siguiente equilibrio:

[ ] [ ] [ ]EAAEdes

ads

k

k

←→

+

Si a0 es el número total de sitios de adsorción sobre la superficie del sustrato por unidad de volumen de la mezcla de reacción, tenemos

aeaa +=0

( )eK

eaea

A += 0

ads

desA k

kK =

Combinando con la relación de equilibrio para la adsorción de una enzima da

con


El desarrollo se completa asumiendo que la hidrólisis se completa por descomposición irreversible del complejo [EA], consecuentemente

( )eK

eakeakv

A +== 03

3

Donde e es la concentración de enzima libre y está relacionada a la concentración total e0 al inicio del experimento por

( )eaee +=0

Si la concentración inicial de enzima es mucho mayor que la del sustrato (e0>>a0), podemos asumir con un excelente grado de aproximación que

ee ≈00

003

eK

eakv

A +=

La situación e0>>a0 no es poco común para reacciones involucrando sustratos sólidos. La tasa de reacción de la ecuación anterior revela que una gráfica doble recíproca, análoga a la ecuación de Lineweaver-Burk, (1/v versus 1/e0) podría ser lineal.

así


Catálisis enzimática heterogénea

Para combinar las ventajas de la catálisis homogénea y heterogénea, se desarrolló la heterogenización de la catálisis homogénea

Las enzimas inmovilizadas son enzimas físicamente confinadas o localizadas en una cierta región definida de espacio con la retención de sus actividades catalíticas, que pueden ser usadasrepetidamente y continuamente

Los métodos más comunesde inmovilización de enzimasHeterogenización de enzimas solubles a través del acoplamientode un soporte insoluble mediante: adsorción o enlace covalente, por entrecruzamiento de la enzima o por atrapamiento en un enrejado o en microcápsulas


Método de inmovilizaciónRendimiento (%)

Enzima Soporte

Propiedades bioquímicas Características químicas

Tipo de reacción y cinética Propiedades mecánicas

Efectos de transferencia de masaEficiencia (η)

ComportamientoConsumo de enzima (U/kg producto)

Productividad (kg producto/U)

Estabilidad operacional# de ciclos

Las propiedades de las enzimas inmovilizadas están gobernadas por las interacciones de las propiedades de la enzima y el material del soporte


Inmovilización de enzimas

• Costo de la enzima

• Grado de purificación requerido de la enzima

• Costo del proceso de inmovilización

• Estabilidad de la enzima

• Efectos de inhibición y envenenamiento


Pros y contras de la Inmovilización

PROS

Alta estabilidad y resistencia al esfuerzo cortante y a la contaminación

Fácil de desarrollar procesoscontinuos

Rápidas tasas de reacción

Fácil separación de los productos

Uso repetitivo del catalizador

CONTRAS

Existencia de la resistencia a la transferencia de masa

Necesidad del proceso de inmovilización

Costos adicionales de reactivos para la inmovilización

Pérdida de actividad durante la etapa de inmovilización


Inmovilización de enzimasLa inmovilización es la restricción espacial de la movilidad de la enzima


Métodos de inmovilización

A: Métodos de enlace a soportesa) Enlace covalente; b) Adsorpción física; c) Fuerzas electrostáticas

B: Entrecruzamiento

C: Atrapamiento

Enzyme in Industry: Production and Applications, pg66.

B C

A


Atributos ideales de un soporte

• Alta área superficial

• Permeable

• Insoluble

• Alta rigidez

• Regenerable

• Resistente a ataque microbiano y químico

• Estable mecánicamente y térmicamente

• Hidrofobicidad controlada


Métodos de inmovilización claves

• Unión Covalente– Glutaraldehido– CNBr-activación– Ácidos cíclicos (glicoproteinas)– Carbodimidas

• Adsorción– Intercambio iónico– Hidrofobicidad

• Entrecruzamiento• Encapsulación

– Geles poliméricos– Liposomas y otras bicapas

Más común para enzimas

Más común para células


Métodos de inmovilización: Soportes

Tipos de Soporte

• Inorgánicos: p.ej. Sílica, Vidrio poroso

• Orgánicos: p.ej. Poliamida, Poliacrilamida

• Biológicos: p.ej. Celulosa, Quitosano

Tipos de enlace

• Enlace covalente

• Adsorción física

• Enlace iónico


Enlace Covalente

Handbook of Heterogeneous Catalysis, Vol. 1, pg. 237

El soporte en este caso es amino alkoxy silano


Enlace Covalente

Handbook of Heterogeneous Catalysis, Vol. 1, pg. 237


Adsorción Física

• Los biocatalizadores enlazan a los soportes porinteracciones físicas tales como interaccioneshidrofóbicas, fuerzas de van der Waal’s, etc.

• Frecuentemente se usan soportes inorgánicos. Actualmente, están disponibles varios materialesnaturales que tienen fuertes capacidades de adsorción.


Unión a un soporte por adsorción física

El método se basa en la adorción física de lasmoléculas de enzima en la superficie de unamatriz sólida, poniendo en contacto una soluciónacuosa de enzima con el soporte.

Procedimiento estáticoElectrodeposiciónProceso de reactorBaño con agitación

Métodos deadsorción física


Métodos de inmovilización: Atrapamiento

El método de atrapamiento de inmovilización está basado en la localización de una enzima dentro de un enrejado de una matrizpolimérica o membrana de tal forma que previene la liberación de proteina mientras permite la penetración de substrato.

-La enzima no se enlaza de ninguna forma a la matriz del gel o a la membrana.


Métodos de inmovilización: EntrecruzamientoDefinición: Formación de enlaces covalentes entre las moléculas de enzima, por medio de reactivos bi- o multifuncionales, formandoagregados entrecruzados tridimensionales.

Métodos: Adición de una cantidad apropiada de agente entrecruzantea una solución de enzima bajo condiciones que den un aumento en la formación de enlaces covalentes múltiples.


Métodos de inmovilización: Entrecruzamiento (cont…)

Handbook of Enzyme Biotechnology, pg. 585


Efecto de la inmovilización sobre la estabilidad

(a) activity of free underivatised chymotrypsin. (b)activity of chymotrypsin derivatised with acryloylchloride. (c) activity of acryloyl chymotrypsin copolymerised within a polymethacrylate gel. Up to 12 residues are covalently bound per enzyme molecule. Lower derivatisation leads to lower stabilisation. (d) activity of chymotrypsin non-covalently entrapped within a polymethacrylate gel. The degree of stabilisation is determined by strength of the gel, and hence the number of non-covalent interactions. All reactions were performed at 60 °C using low molecular weight artificial substrates. The immobilisedchymotrypsin preparations showed stabilisation of up to 100,000 fold, most of which is due to their multipoint nature although the consequent prevention of autolytic loss of enzyme activity must be a significant contributory factor.


Limitaciones difusionales en sistemas de enzimas inmovilizadas

( )

maximum rate of reaction

maximum rate of diffusion

m ss L b s

m s

mDa

L b

V SJ k S S

K S

VN

k S

= − =+

= =

NDa<<1 Limitado por reacción

NDa≈1 Reacción y difusión -resistencias comparables

NDa>>1 Limitado por difusión

NDa = Número de Damhköler


Factor de efectividad

Para reacciones donde las limitaciones pueden ser importantes, la tasa de reacción aparente es frecuentemente expresada en términos de un factor de efectividad, η

reaction with diffusional limitations

intrinsic reaction rateη =

Para una reacción enzimática que sigue la cinética de Michaelis-Menten

m ssurface

m s

V Sr

K Sη=

+


Limitaciones difusionales para enzimasinmovilizadas en pelletsporosos


Perfil de concentraciónen estado estacionarioen pelletsporosos

Consideraciones:Cinética de Michaelis-Menten

Enzima uniformemente distribuida a través del pellet

No hay partición de substrato entre el interior y el exterior del pellet

Ecuaciones gobernantes:2

2

0

2

( )

0

me

m

s

r

V Sd S dSD

dr r dr K S

S R S

dS

dr =

+ = +

=

=


Adimensionalización

, , m

s s

KS rS r

S R Sβ= = =Definir variables adimensionales:

22

2

0

2

1

(1) 1, 0, m m

er

d S dS S

r dr Sdr

V Kd SS R

Ddr

φ

β

φ=

+ =+

= = =

Introducir en los balances de masa y las condiciones frontera

A menos que la reacción sea de 1er orden, el sistema no tiene soluciónanalítica con la cinética de Michaelis-Menten


Gráfica η η η η versusφφφφ en el sistemaMichaelis-Menten


• Minimizar el radio de partículadentro las limitacionesmecánicas

• Optimizar la carga de la enzima– Alto contenido de enzima

incrementa la tasa intrínseca de la reacción pero disminuye el factor de efectividad

– Bajo contenido de enzimaincrementa el factor de efectividad pero disminuye la tasa intrínseca de la reacción

Diseño de pellets inmovilizados


Reactores enzimáticos

Tipos dereactores

Discontínuos(Enzimas libres e inmovilizadas)

Contínuos (Enzimas inmovilizadas)


Reactores discontinuos

Tipo tanque agitado con paletasque incluyen enzimas inmobilizadas

Tipo tanque agitado con mamparasque incluyen enzimas inmobilizadas

Reactor de lecho empacadocon reciclado total

Reactor de lecho fluidizadocon reciclado total


Reactores continuos

Tipo tanque agitado con recuperación por ultrafiltración

Reactor de lechoempacado

Reactor de lechofluidizado

Reactor de fibrahueca


Reactor de tanque agitado continuo


Reactor de lechoempacado


Reactor de lechofluidizado


Reactor de membrana


http://www.bccresearch.com/report/enzymes-industrial-applications-bio030f.html

The global market for industrial enzymes is estimated at $3.3 billion in 2010. Thismarket is expected to reach $4.4 billion by 2015, a compound annual growth rate

(CAGR) of 6% over the 5-year forecast period.


Tecnologíade enzimas comerciales

Technical enzymes are valued at just over $1 billion in 2010. This

sector will increase at a 6.6% compound annual growth rate (CAGR)

to reach $1.5 billion in 2015.

The highest sales of technical enzymes occurred in the leather

market, followed by the bioethanol market.

The food and beverage enzymes segment is expected to reach

about $1.3 billion by 2015, from a value of $975 million in 2010,

rising at a compound annual growth rate (CAGR) of 5.1%.

Within the food and beverage enzymes segment, the milk and dairy

market had the highest sales, with $401.8 million in 2009.

http://www.bccresearch.com/report/enzymes-industrial-applications-bio030f.html


• GI es un tetrámero de 4 unidades idénticas de cerca de 45,000 kDa

• Compuesto como un dímero de dímeros

• Cada monómero está compuesto de aproximadamente 16 hélices alfa y 15 láminas beta

• La interface monómero-monómero es 3 veces más grande y fuerte que la interface dímero-dímero

• 2 Mn2+ son necesarios para la actividad xilosa y 2 Co2+ para la actividad glucosa isomerasa

Información estructural

From Bacillus Coagulans, Isolated by Novozyme, Inc.

Aplicaciones industrialesGlucosa isomerasa inmovilizada



La isomerización de glucosa a jarabes de maíz de alta fructosa(HFCS), exclusivamente como un reemplazo de costo reducido para soluciones de sacarosa y azúcar invertida

•Background:Altas temperaturas de reacción para altos rendimientos de fructosapH ≥ 7 para la actividad y estabilidad de la enzimaPERO, la glucosa y la fructosa son inestables, fácilmente se descomponen a ácidos orgánicos y subproductos coloreadosEl tiempo de reacción debe ser minimizado



• Condiciones del proceso:

En reactores de lecho fijo contínuos

Temperatura: 55-60 oC

pH: óptimo pH de la enzima

Los gránulos de la enzima deben sersuficientemente rígidos para prevenir la compactación durante la operación



Método de InmovilizaciónRendimiento

(kg producto seco/ kg enzima)

1. La enzima, después del aislamiento y purificación, es covalentemente inmovilizada sobre un soporte inerte

20,000

2. Entrecruzamiento de células que contienen las enzimas deseadas

2,000-4,000

3. La enzima parcialmente purificada es inmovilizada sobre resinas de intercambio iónico

7,000- 10,000


Conclusiones

• La inmovilización permite el uso repetitivo de la enzima lo que significa un ahorro significativo en los costos

• La selección de los métodos de inmovilizacióndeberán estar basados en los requerimientos técnicosespecíficos y en el marco global de su aplicacióncomercial

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