RAS Mutations in Cutaneous Squamous-Cell Carcinomas

in Patients Treated with BRAF Inhibitors

Catalina Bermúdez GonzálezCamila Cruz Cano

Third semesterMolecular biology

Universidad Pontificia BolivarianaMedellín, 2012

Fei Su, Ph.D., Amaya Viros, M.D., Carla Milagre, Ph.D., Kerstin Trunzer, Ph.D., Gideon Bollag, Ph.D., Olivia Spleiss, Ph.D., Jorge S. Reis-Filho, M.D., Ph.D., Kong, M.S., Richard C. Koya, M.D., Ph.D., Keith T. Flaherty, M.D., Paul B. Chapman, M.D., Min Jung Kim, Ph.D., Robert Hayward, B.S., Matthew Martin, Ph.D., Hong Yang, M.S., Qiongqing Wang, Ph.D., Holly Hilton, Ph.D., Julie S. Hang, M.S., Johannes Noe, Ph.D., Maryou Lambros, Ph.D., Felipe Geyer, M.D., Nathalie Dhomen, Ph.D., Ion Niculescu-Duvaz, Ph.D., Alfonso Zambon, Ph.D., Dan Niculescu-Duvaz, Ph.D., Natasha Preece, B.A., Lídia Robert, M.D., Nicholas J. Otte, B.A., Stephen Mok, B.A., Damien Kee, M.B., B.S., Yan Ma, Ph.D., Chao Zhang, Ph.D., Gaston Habets, Ph.D., Elizabeth A. Burton, Ph.D., Bernice Wong, B.S., Hoa Nguyen, B.A., Mark Kockx, M.D., Ph.D., Luc Andries, Ph.D., Brian Lestini, M.D., Keith B. Nolop, M.D., Richard J. Lee, M.D., Andrew K. Joe, M.D., James L. Troy, M.D., Rene Gonzalez, M.D., Thomas E. Hutson, M.D., Igor Puzanov, M.D., Bartosz Chmielowski, M.D., Ph.D., Caroline J. Springer, Ph.D., Grant A. McArthur, M.B., B.S., Ph.D., Jeffrey A. Sosman, M.D., Roger S. Lo, M.D., Ph.D., Antoni Ribas, M.D., Ph.D., and Richard Marais, Ph.D.

IntroductionCancer•It begins when cells in a part of the

body begin to grow uncontrollably and become cancerous due to an alteration in the DNA of type:

TranslocationLocatedAmplificationDeletionGain or loss of a chromosome

•In cancer cells disobey all repair mechanisms and control, so the cell continues to grow and form new abnormal cells

•These mechanisms include:The regulation of signal transductionCell differentiationApoptosisThe repair of DNAThe cell cycle progressionAngiogenesisThe cell adhesion

•There are three types of mutant genes

Oncogenes

• Genes are mutated that promote cell division

• Involved in cell growth regulation

Tumor suppressor genes

• They are responsible for stopping cell division and induce apoptosis

• When these genes are mutated cells divide uncontrollably.

DNA replication Genes

• When the repair system is defective as a result of acquired or inherited mutation

•Causes:

Result of the interaction of genetic factors with:

Physical Carcinogens• Ultraviolet radiation• Ionizing radiation

Chemical Carcinogens• Snuff• Aflatoxins• Arsenic

Biological Carcinogens• Infections caused by bacteria• Infections caused by viruses• Infections caused by parasites

•Risk factors

Consumption of snuff

Overweight or obese

Physical inactivity

Consumption of alcoholic beverages

HPV infections and HBV

Air pollution in cities

The smoke generated  by burning solid fuels.

•Treatment

Surgery

Chemotherapy• With an antineopl

astic drug whose function is to prevent the reproduction of cancer cells causing an alteration in the nucleic acid synthesis, cell division or protein synthesis

• Cytostatic or cytotoxic drugs

• Low specificity

Radiation therapy• Use of ionizing

radiation on the tumor, destroying the malignant cells and preventing their growth and reproduction because they can damage repair in an efficient manner

• Also acts on normal tissue

Biological therapy• Immunotherapy

• Hormone therapy

Cutaneous Squamous-Cell Carcinomas

•Skin cancer is the most common, are diagnosed each year about 3.5million cases

Cancer

No melanoma

(Keratinocytes carcinoma)

Basal cells

Squamous cells

Melanoma

• Melanoma: They originate from melanocytes (pigment-producing cells)

• Keratinocytes carcinoma:

Basal cell carcinoma:

Arise in sun-exposed areas, especially the head and neck

It tends to be slow growing.

After treatment, basal cell carcinoma can recur in the same area of skin.

Squamous cell carcinoma:

Appears in body areas exposed to sunlight, such as the face, ears, lips and backs of hands

It is often more aggressive than basal cell cancer

It can spread to the fatty tissues under the skin and lymph nodes basal

It starts as a red area with surface crusting, scaling, not cure.

May become nodular, hard and sometimes present a warty surface.

•Risk factors

Exposure to UV lightWhite skinAge greaterMale sexExposure to chemicalsExposure to radiationReduced immunity

RAS

• Monomeric G protein coupled to the cell membrane by prenylation and has a regulating activity GTP-hydrolase, which alternates between two structural conformations:

Activated form: Ras protein is attached to  GTP, called RAS-GTP

Inactivated form: RAS protein is attached to GDP, called RAS-GDP.

• Ras protein is activated by different factors guanine nucleotide exchange, which are also activated by mitogenic signals

• The RAS protein is inactivated by GTPase-activating proteins that increase the ability to hydrolyze GTP

•Activates numerous signal transduction pathways, but is especially important for mitogen-activated protein kinase (MAPK), which also through signal transduction protein kinases activate other genes and regulatory proteins.

•When the gene is mutated acts constitutively, binding GTP and giving continuous signal for cell growth.

BRAF

• Protein family of the RAF protein

• Has an activity of kinase serine-threonine 

• Involved in the MAPK pathway (primary route of cell proliferation) and active in the beginning of the cAMP cascade to phosphorylate MEK protein and send the signs of growth.

• The oncogenic form lose regulatory sequences of the amino terminus and isconstitutively active, preventing proliferation is turned off

The mutation of genes encoding these regulatory proteins of the division, growth and apoptosis will generate a hyperactivation of these, generating permanent stimuli and give rise to abnormal growth of cells that will form a tumor

General objective •Identify which is the incidence of use of

BRAF inhibitors as anticancer  in the development of cutaneous squamous cell carcinomas by-RAS Mutations

Materiales y métodos•Pacientes

Participantes de un estudio de dosis en escala con Vemurafenib en fase 1, 2 y 3 (según ClinicalTrials.gov ) que reciben dosis de 720 a 960 mg dos veces al día de forma oral.

Con melanoma metastásico con una mutación en BRAF V600

Se quiere determinar a que dosis se dan los efectos.

Porque es la mutación que se quiere inhibir

• PCR

Se extrajo ADN de muestras de tumor y se amplificó con PCR para secuenciarlo para:

Esto fue seguido por Sequencing Sanger Con el uso de un examen investigacional

AmpliChip p53 se analizaron sustituciones o delecciones de una sola base en 2 exones de TP53.

Se evaluó la fosforilación de ERK mediante un análisis inmunohistoquímico

HRAS Exones 1 y 2

NRAS Exones 1 y 2

KRAS Exones 1 y 2

CDKN2A Exone 2

El objetivo del PCR es obtener varias copias de un fragmento de DNA específico.

Se fundamenta en la propiedad de las DNA polimerasas

Se alteran ciclos de temperaturas altas y bajas para separar las hebras recién formadas de DNA entre cada replicación y se deja que se vuelvan a unir las polimerasas para una nueva replicación

•Análisis celulares entre mutantes HRAS e inhibidores BRAF

Vemurafenib

PLX4720 (análogo)

Dimetilsulfóxido

Células del carcinoma con B9 de HRAS mutante

Células A431 (ATCC)

Vector vacío

Plásmido con HRAS Q61L

Células NH13T3 (ATCC)

Vector vacío

Plásmido con HRAS Q61L

Sembradas en agar con:

Transferidas

Después de la exposición fue analizada la proliferación

celular mediante ensayos MTT o MTS

• Análisis de expresión del gen

Células B9 después de sembradas enFueron incubadas 16 horas

Se cosecharon y se aisló el RNA y se midió la expresión génica usando Affymetrix Mouse 420 2.0

Los genes que respondieron al Vemurafenib y al PLX4720 se identificaron por que cambiaron factores con relación a los que fueron sembrados con Dimetilsulfóxido (control)

Los patrones de genes de las células B9 se compararon con los genes de vía MAPK de 5 líneas celulares de personas con melanoma y se confirmaron con PCR

Vemurafenib

PLX4720 (análogo)

Dimetilsulfóxido

•Ratones

Dos estados del carcinoma6 ratones por grupoSe usaron Inhibidor BRAF: PLX4720Inhibidos MEK: PD184352Por sonda oral 25 mg/Kg/ día en 200 ul de Dimetilsulfóxido

RESULTADOS

•Como parte del análisis dermatopatológico de pacientes tratados con vemurafenib: 21 confirmaron muestras de carcinoma escamocelular o keratoacantoma.

FIGURA 1•A continuación se presenta fotografías y

fotomicrografías de lesiones de piel sin melanoma en pacientes tratados con vemurafenib.

EXPLICACIÓN FIGURA 1

•22 lesiones (63%) fueron caracterizadas como keratoacantomas y 13 (37%) fueron confirmados como carcinoma escamocelular.

• Esta imagen muestra una lesión con las características clínicas de keratoacantoma observada el día 98 después de que el paciente comenzara a consumir vemurafenib en una dosis de 960mg dos veces al día.

• La imagen inferior es una sección de la lesión obtenida de la piel del torso del mismo paciente sin mutación RAS reportado como carcinoma escamocelular del subtipo keratocantoma.

•Esta imagen muestra la apariencia clínica e histopatología de un keratoacantoma de el menton de un paciente con HRAS Q61R .

FIGURA 2•Muestras de la mutación y del análisis de

señalización de la MAPK en carcinoma cutaneo escamocelular o keratoacantomas.

EXPLICACIÓN FIGURA 2

•La fosforilacion del ERK fue evaluada en 10 muestras con carcinoma escamocalular cutáneo o keratoacantomas y se encontró que el epitelio circundante fue normal.

•En 4 muestras con suficiente epitelio circundante normal se realizo análisis de mutación de RAS y ninguna mutación fue detectada.

•La tinción para pERK la cual fue realizada en 3 de las 4 muestras fue mas común en las células con lesiones que en aquellas de contorneado epitelial normal.

EXPLICACIÓN FIGURA 2

• Tinción inmunohistoquimica para pERK (café) de muestras de piel adyacente normal (izquierda) y de células de carcinoma escamocelular (derecha).Este paciente (al igual que el siguiente) fue tratado con vemurafenib. Este paciente tiene la mutación KRAS G12.

• Este tipo de lesiones aparecieron 87 días después de que la terapia con vemurafenib había comenzado

FIGURA 2 A

FIGURA 2 B

• Este paciente también tiene la mutación KRAS G12.

• Las lesiones del carcinoma escamo-celular aparecieron 51 días después de que hubiese empezado la terapia con vemurafenib.

FIGURA 3•Pruebas

moleculares señalan la

activación de las células

MAPK en las líneas

celulares.

Muestra la estimulación de el crecimiento de las células B9 en el agar después de la exposición a vemurafenib o PLX4720

Muestra la expresión diferencial de la regulación de MAPK y el rendimiento de los genes después de la exposición a vemurafenib o PLX4720 durante toda la noche en comparación con la expresión génica de 5 líneas celulares de melanoma usadas como referencia.Lo rojo indica la alta expresión y lo verde indica la baja expresión en las células no tratadas.

Muestra el resultado del análisis de western blot de las células NIH3T3 transfectadas con un control vector o con un HRASQ61 mutado y tratada con diferentes concentraciones de vemurafenib.

FIGURA 3 A

• La investigación sobre los efectos de los inhibidores del BRAF en las mutaciones de HRAS en carcinomas escamo celulares fueron usados en la línea celular B9 las cuales albergaban la mutación HRASQ61L.

• Al exponerse las células a vemurafenib y a su análogo PLX4720 se estimulo su proliferación en el agar. Para analizar el mecanismo subyacente se comparó la expresión génica de las células B9 antes y después de que fueran expuestas a vemurafenib o PLX4720.

•Una evaluación que incluyo un total de 306 sondas de genes sugirió una tendencia compartida en el tratamiento a inducir cambios en la expresión genética que incluyo de una forma bien caracterizada los genes de la vía MAPK

•Análisis supervisados de estos cambios en las células B9 expusieron que el vemurafenib y PLX4720 revelaron un cambio por un factor de 2:9 de los homólogos de murina de genes que fueron diferencialmente expresados cuando BRAF esta inhibido en las células humanas con melanoma expresando la mutación de BRAFV600E.

FIGURA 3B• Para estos 9 genes el

cambio en las células B9 fue opuesto a el cambio en la parte del gen observada en las células humanas con melanoma BRAFV600E.

• Esto sugiere que la proliferación estimulada por los resultados de los inhibidores del BRAF paradójicamente aumentan el efecto transcripcional de la vía MAPK en células con HRAS mutante.

FIGURA 3C

• Muestra el resultado del análisis de western blot de las células NIH3T3 transfectadas con un control vector o con un HRASQ61 mutado y tratada con diferentes concentraciones de vemurafenib.

FIGURA 4

FIGURA 4 A

• La figura A muestra el numero de tumores palpables que surgieron en ratones tratados con el carcinógeno 7,12 dimethyl benz anthrace (DMBA), el promotor de tumores 12º-tetradecanoylphorbol 13-acetato (TPA), el inhibidor del BRAF PLX4720 (25 mg por kg por día). Cada cohorte consistió en 6 ratones y la respuesta en la formación de tumores en cada uno

FIGURA 4 B

•Esta imagen muestra los resultados de 90 días después que fueran tratados con 4 diferentes régimenes.

Aceleración del crecimiento de los tumores de piel no-melanomas en

ratones con inhibición del BRAF

• Con un modelo invivo los efectos de la inhibición del BRAF en carcinoma de células escamosas y keratoacantomas, se usaron las dos capas de piel del modelo de ratón de carcinogénesis en los cuales la aplicación tópica de del carcinógeno 7,12 dimethylbenz-anthracene (DMBA) induce la mutación de la HRAS Q61L en ratones con keratinocitos. Subsecuentemente la aplicación de un promotor de tumores 12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate (TPA) induce luego las lesiones.

•En ratones que recibieron DMBA y TPA con PLX4720, la apariencia de esas lesiones fue marcadamente acelerada, como se comparo con lso ratones que se les dio DMBA y TPA solo

DISCUSSIONRESEARCHER WHAT ABOUT HE

SAYSYES OR NOT

Davies H Bignell GR RAS was the first oncogene discovered in which point mutations led to cellular transformation.

Malumbres M. Barbacid M.

RAS mutations alone typically result in cellular senescence in conjuntion with other events that alter control of the cell cycle and apoptosis, they induce celular transformation

RESEARCHER WHAT ABOUT HE SAYS

YES OR NOT

Poulikakos PI, Zhang C, Bollag G, Shokat KM, Rosen N.

“Our data indicates that RAS mutations are present in approximately 60% of cases in patients treated with vemurafenib, suggesting that preexisting mutations may confer a predisposition to the development of squamus-cell carcinomas or keratoacanthomas…”

RESEARCHER WHAT ABOUT HE SAYS

YES OR NOT

Nazarian R, Shi H, Wang Q et al.

Recent study have shown that vemurafenib resistance can be mediated by receptor tirosine kinases such as the platelet-derived growth factor an insuline growth factor 1 receptors. Mutation o r amplification of receptor tyrosine kinases may account for the development of cutaneous squamus-cell carcinomas and keratoacanthomas.

CONCLUSIONS

•This study can show us that vemurafenib stimulates proliferation in cells with mutated HRASQ61L through paradoxical activation of the MAPK pathway.

•This kind of drug development a clinical toxicity that is the opposite of what would be expected from a targeted oncogen inhibitor.

•Is important to the advanced study of the possible side effects of anticancer drugs and when dealing with genetic modifications that alter the dynamics of cellular regulation because they can affect other tissues.

•The PCR is a technique widely used in the area of science that should be exploited as it compromises reliable results at the genetic level that can be used for high incidence diseasessuch as cancer

Catalina Bermúdez González