Rapid preparation of human insulin and insulin analogues in high yield by

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  • 8/7/2019 Rapid preparation of human insulin and insulin analogues in high yield by

    1/6

    B i o c h e m . J .( 1 9 8 3 )2 1 1 ,6 7 1 - 6 7 6 6 7 1P r i n t e di nG r e a tB r i t a i n

    R a p i dp r e p a r a t i o no f human i n s u l i na n d i n s u l i na n a l o g u e si nh i g hy i e l db ye n z y m e - a s s i s t e ds e m i - s y n t h e s i s

    K e i t hRO S E , *H e l e nDE PURY a n d R o b i nE .OFFORDD e p a r t e m e n td e B i o c h i m i eM e d i c a l e ,C e n t r eM e d i c a lU n i v e r s i t a i r e ,9 Av e n u ed e C h a mp e l , 1 2 11G e n e ' v e4 ,

    S w i t z e r l a n d

    ( R e c e i v e d8 N o v e m b e r1 9 8 2 / A c c e p t e d4 F e b r u a r y 1 98 3 )

    R e a c t i o nc o n d i t i o n sa r e d e s c r i b e dt h a tp e r m i tt h e e n z y m e - a s s i s t e ds e m i - s y n t h e t i cr e p l a c e m e n to f r e s i d u eB 3 0o f p i gi n s u l i n( o ro f a n a n a l o g u e )t o p r o c e e di n v e r yh i g hy i e l di n 2 h o r l e s s .I m m o b i l i z e dt r y p s i nmay b e u s eda sc a t a l y s t ,a n de x c e s sa m i n oa c i de s t e rmay b e r e c y c l e da f t e ra s i m p l ee x t r a c t i o n .A l a n i n e - B 3 0m a yb e r e p l a c e db y av a r i e t yo f n u c l e o p h i l e s ,i n c l u d i n gt h r e o n i n eO - t - b u t y le t h e rt - b u t y le s t e r ,i n w h i c hc a s et h ey i e l do f c r u d e p r o du c ti s a b o u t 9 9 % .D e - p r o t e c t i o no f t h eB 3 0 t h r e o n y le s t e ra n a l o g u eo fi n s u l i nt h u sf o r m e dt h e na f f o r d sh u m a ni n s u l i ni n a n o v e r a l l y i e l do f a b o u t9 2 % , b a s e d o n p i g s t a r t i n gm a t e r i a l .T h e p r o d u c t h a s f u l lb i o l o g i c a lp o t e n c y ,a sd e t e r m i n e db y d e p r e s s i o no f b l o o d g l u c o s ec o n c e n t r a t i o ni n r a t s ,a n d s h o w e dt h ee x p e c t e db e h a v i o u ro n r a d i o i m m u n o a s s a y .

    T h e o n l yd i f f e r e n c eb e t w e e n t h e a m i n o a c i ds e q u e n c eo f h u m a ni n s u l i na n d t h a to fp i gi n s u l i n - i st h a t t h ef o r m e r h a s t h r e o n i n ea t p o s i t i o nB 3 0w h e r e a st h e l a t t e rh a s a l a n i n e .T h e f a c t t h a tt h ed i f f e r e n c ei s s o s m a l l ,a n d t h a t i t o c c u r s a t s oe x p o s e da s i t e ,h a s l e dt o a g r e a td e a lo f w o r ko n t h es em i - s y n t h e t i cc o n v e r s i o no f p i gi n s u l i ni n t oh u m a ni n s u l i n .F o r i n s t a n c e ,r e s i d u eA l a - B 3 0o f p i gi n s u l i nc a n b e r e m o v e db y t r y p s i n ,b y c l e a v a g ee i t h e ra tA r g - B 2 2o r a t Ly s - B 2 9 .T h e s e q u e n c eo f h u m a ni n s u l i nc a n b ef o r m e df r o m t h e r es u l t in gt r u n c a t e di n s u l i n s ,i n t h e f i r s tc a s eb y c o u p l i n gb a c k t h ea p p r o p r i a t eo c t a p e p t i d eo f t h e h u m a n i n s u l i ns e q u e n c e ,a n d i n t h e s e c o n d b y c o u p l i n gb a c kt h r e o n i n e .I n b o t h c a s e s c o u p l i n gm u s tb e l i m i t e dt ot h ea - c a r b o x yg r o u po f t h eB - c h a i no f t h et r u n c a t e dd e r i v a t i v e ,y e ta t t e m p t st o a c h i e v et h i sb y r e v e r s i b l ec h e m i c a lp r o t e c t i o no f a l li t so t h e rc a r b o x yg r o u p sh a v eb e e nf r a u g h tw i t hd i f f i c u l t y( O b e r m e i e r ,1 9 7 8 ) .I f p r o t e c t i o no f c a r b o x yg r o u p s i s a v o i d e d ,h o w -e v e r ,c h e m i c a lc o u p l i n go f a n o c t a p e p t i d ef r a g m e n tt o d e s o c t a p e p t i d e - B 2 3 - B 3 0 - i n s u l i ny i e l d sa m i x t u r e ,f r o mw h i c ht h ed e s i r e dp r o d u c tmay b e i s o l a t e dw i t ha y i e l do f 1 0 - 1 5 %( O b e r m e i e r& G e i g e r ,1 9 7 6 ) .A n o t h e rm e a n so f a c h i e v i n gs e l e c t i v ec o u p l i n gi s b yu s e o f p r o t e i n a s e su n d e rc o n d i t i o n st h a tl e a dt h e mt oc a t a l y s et h es y n t h e s i s ,r a t h e rt h a n t h eh y d r o l y s i s ,o fp e p t i d eb o n d s .I t i s r e a s o n a b l et o e x p e c tt h a tt h ee n z y m i cc o u p l i n gs h o u l db e s i m p l e rt o c a r r yo u t a n dw o u l d d ol e s sd a m a g et o t h ep r o t e i nt h a n a r o u t ei n v o l v i n gm a n yc h e m i c a lo p e r a t i o n s .Ta b l e 1 l i s t s

    * T owhomc o r r e s p o n d e n c es h o u l db ea d d r e s s e d .

    t h e p r i n c i p a lp u b i examp t h e u s e o fe n d o p r o t e i n a s e si n t h i sr e g a r d .E x o p e p t i d a s e sh a v ea l s ob e e nu s e d ,b u ts of a rh a v eg i v e nm o r ec o m p l e xm i x t u r e so f p r o d u c t s( s e e ,e . g . ,B r e d d a me t a l . ,1 9 8 2 ) .A l t h o u g ht r y p s i nc a n c l e a v eb o t h a f t e rr e s i d u eB 2 2a n d a f t e rr e s i d u eB 2 9 ,Ta b l e 1 s h o w st h a ti t i s p o s s i b l et o f i n dc o n d i t i o n su n d e rw h i c hi t sa c t i o ni s c o n f i n e dt o t h e p e p t i d eb o n d b e t w e e nr e s i d u e sB 2 9a n d B 3 0 ,w i t h o u ti t b e i n gn e c e s s a r yt ob l o c kt h es i d ec h a i no f r e s i d u eB 2 2 .T h i ss p e c i f i c i t yi s s h o w nb o t h i n t h ec o u p l i n go f t h r e o n i n ee s t e r st od e s - A l a - B 3 0 - i n s u l i nt h a th a d b e e n p r e v i o u s l yi s o -l a t e d ,o r i n t h e c a t a l y s i so f d i r e c te x c h a n g eb e t w e e na t h r e o n i n ee s t e ra n dt h eA l a - B 3 0o fi n t a c ti n s u l i n .I tw i l lb e s e e nf r o mTa b l e 1 t h a t ,i no r d e rt oo b t a i n

    h i g hy i e l d s ,t h eh o r m o n eh a s h a d t o b e e x p o s e dt ot h er e a c t i o nc o n d i t i o n sf o re x c e s s i v e l yl o n g p e r i o d so ft i m e .T h ep r e s e n tp a p e rd e s c r i b e sa m e t h o df o ras i g n i f i c a n t l ym o r e r a p i dc o n v e r s i o no f p i gi n s u l i ni n t oh u m a ni n s u l i nw i t hh i g he f f i c i e n c y.I n a d d i t i o n ,w e b r i e f l yd i s c u s st h e u s e o f o u r m e t h o di n t h ep r o d u c t i o no f a n a l o g u e so f i n s u l i n .

    M a t e r i a l sa n dm e t h o d sU n l e s s o t h e r w i s es p e c i f i e d ,r e a g e n t sw e r e o f

    a n a l y t i c a lg r a d ea n d w e r e u s e d w i t h o u tf u r t h e rp u r i f i c a t i o n .

    C o n v e r s i o no f p i g i n s u l i ni n t o h u m a n i n s u l i n :m e t h o dAZ i n c - f r e ep i gi n s u l i nw a s p r e p a r e db y e x t e n s i v e

    d i a l y s i so f a s o l u t i o no f p i g i n s u l i n( M o n o -

    Vo l .2 1 1

  • 8/7/2019 Rapid preparation of human insulin and insulin analogues in high yield by

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    K . R o s e ,H . d e P u r ya n dR . E .O f f o r d

    Ta b l e 1 . M e t h o d sf o r t h ee n z ym e - a s s i s t e ds e m i - s y n t h e s i so f h u m a ni n s u l i nA b b r e v i a t i o n s :B o c 2 D O I ,[ N a - B u t O C O G l y - A l ,N a - B u l O CO P h e - B l ] - d e s - o c t a p e p t id e - B 2 3 - B 3 0 - iD A I , d e s -A l a - B 3 0 - i n s u l i n ;DA I * ,[ 1 , 2 - d i h y d r o x y c y c l o h e x - 1 , 2 - y l e n e - A r g - B 2 2 1 - d e s - A l a - B 3 0 - i n s u l i n ;O c t a ( B o c ) ,G l y - P h e - P h e -Ty r - T h r - P r o - Ly s ( B u t O CO ) - T h r ;T , t r y p s i n ;A , A c h r o m o b a c t e rp r o t e i n a s eI ; I ,p i g i n su l i n;D M F ,NN - d i m e t h y l -f o r m a m i d e ;DMA,NN - d i m e t h y l a c e t a m i d e ;THF, t e t r a h y d r o f u r a n ;B D ,b u t a n e -1 , 4 - d i o l ;DMSO,d i m e t h y ls u l p h o x i d e .

    S t a r t i n gm a t e r i a lB o c 2 D O ID A I *DAIDA IDA I1

    A m i n oc o m p o n e n tO c t a ( B o c )T h r O B u tT h r O B u tThrOMeT h r O B u tT h r O B u t

    I ThrOMeI T h r O B u tI ThrOMeI T h r ( B u t ) O B u t

    E n z y m e S o l v e n ts y s t e mT DMF/H20T DMF/EtOH/H20T DMF/EtOH/H20T DMF/H20A DMF/EtOH/H20T DMF/H20

    T DMA/H20T DMA/H20T T H F / H 2 0T BD/DMSO/H20

    T e m p .C o up l i n g C o up l i n g( OC ) t i m e ( h ) y i e l d( % )3 7 2 0 5 83 7 2 0 7 13 7 2 0 7 33 8 2 0 6 73 7 2 0 8 3

    2 0 5 0 - 6 04 55

    2 4 5 51 2 4 8 9 73 7 2 4 8 01 2 4 7 53 7 2 9 9 *

    Y i e l da f t e rd e - p r o t e c t i o n

    ( % ) R e f e r e n c e4 9 I n o u y ee ta l .( 1 9 7 9 )5 0 M o r i h a r ae t a l .( 1 9 7 9 a )4 1 M o r i h a r ae ta l .( 1 9 7 9 b )4 0 G a t t n e re t a l ( 1 9 8 0 )5 2 M o r i h a r ae ta l ( 1 9 8 0 )

    J o n c z y k& G a t t n e r( 1 9 8 1 )

    M a r k u s e n( 1 9 8 1 )M a r k u s e n( 1 9 8 1 )M a r k u s e n( 1 9 8 1 )

    9 2 P r e s e n tp a p e r ,m e t h o dA* T h i s v a l u er e p r e s e n t sa c t u a lr e c o ve r y o fm a t e r i a l( s ee F ig .1 f o rp u r i t y ) .I n o t h e rc a s e st h ev a l u eg i v e nr e p r e s e n t sa

    c o n v e r s i o ne f f i c i e n c ya s d e t e r m i n e db y e . g .h i g h - p r e s s u r el i q u i dc h r o ma t o g r a ph y , a n dt h ec o r r e s p o n d i n gy i e l do f p r o d u c tw a sl o w e rw h e r er e c o r d e d .

    c o m p o n e n t ;Novo I n d u s t r i ,C o p e n h a g e n ,D e n m a r k ;1 0 m g / m li n d e i o n i z e d8M - u r e a )a g a i n s ta c e t i ca c i d( 1 % ,v / v )a t 4 0C f o l l o w e db y f r e e z e - d r y i n g .A 20mgp o r t i o no f t h ep r o d u c tw a s s u s p e n d e di n 2 7 0 , u 1o fab u f f e r e ds o l v e n ts y s t e mp r e p a r e db y f i r s td i s s o l v i n gT r i sh y d r o c h l o r i d e( r e a g e n tg r a d e ;S i g m aC h e m i c a lC o . ,S t .L o u i s ,MO, U . S . A . )i n d i m e t h y ls u l p h o x i d e( p u r i s s . ;F l u k a ,B u c h s ,S w i t z e r l a n d )t o a c o n c e n -t r a t i o no f 1 . 5 M ,a n d t h e na d d i n g 2 v o l .o f b u t a n e -1 . 4 - d i o l( p u r u m ;F l u k a ) t o 1v o l .o f t h eT r i sh y d r o -c h l o r i d e / d i m e t h y ls u l p h o x i d es o l u t i o n ,a n d f i n a l l ya d d i n g t h e a m i n o c o m p o n e n to f t h e c o u p l i n g ,L - t h r e o n i n eO - t - b u t y le t h e r t - b u t y l e s t e r[ T h r ( B u t ) OB u t ;f r e eb a s e ,l i q u i d ;B a c h e m ,B u b e n -d o r f ,S w i t z e r l a n d l ;6 2 . 3 m go f e s t e rw a s a d d e d t o660mg o f T r i sh y d r o c h l o r i d e / d i m e t h y ls u l p h o x i d e /b u t a n e -1 , 4 - d i o l .To t h i s i n s u l i ns u s p e n s i o nw a sa d d e d 3 6 , l o f a s o l u t i o np r e p a r e d b y d i s s o l v i n g3mg o fb o v i n et r y p s i nI L -1 - c h l o r o - 4 - p h e n y l - 3 - t o s y l -a m i n o b u t a n - 2 - o n e( ' T P C K ' ) - t r e a t e d ;Wo r t h i n g t o nB i o c h e m i c a lC o r p . ,F r e e h o l d ,NJ , U . S . A . 1i n 501 o fd i s t i l l e dw a t e r . T h e i n s u l i nd i s s o l v e da s s o o n a s t h et r y p s i ns o l u t i o nw a s m i x e di n .A 0 . 5 , u 1s p o to f t h ec o u p l i n gs o l u t i o np l a c e do n d r y e x t e r n a li n d i c a t o rp a p e r ( D u o t e s t3 . 5 - 6 . 8r a n g e :M a c h e r e yu n dN a g e l ,D i i r e n ,We s t G e r m a n y )g a v e a n i m m e d i a t epHi n d i c a t i o no f 5 . 9 - 6 . 2 ,a n d w i t h i n1 5 - 3 0 s t h es a m es p o tg a v e a n i n d i c a t e dpH o f 6 . 5 - 6 . 8 .T h e r e a c t i o n

    m i x t u r ew a s c o v e r e d a n d i n c u b a t e da t 3 7 0 C f o r2 h a t w h i c hp o i n tt h e r e a c t i o nw a s s t o p p e d b yc h i l l i n gt h e v e s s e lt o 0-41C a n d a d d i n g3 0 0 p uo f100% a c e t i ca c i d , w i t hm i x i n g .T h e p r o d u c t ,

    [ T h r ( B u t ) O B u t - B 3 0 1 - i n s u l i n ,w a si s o l a t e db y d i l u t i o no f t h e r e a c t i o nm i x t u r ew i t h 3 0 0 , p 1o f a c e t i ca c i d( 1 % , v / v ) ,f o l l o w e db y g e l f i l t r a t i o nt h r o u g h ac o l u m n( 8 0cm x 2 . 6 cm d i a m . )o f S e p h a d e xG - 5 0( f i n eg r a d e ;P h a r m a c i a ,U p p s a l a ,S w e d e n )e l u t e dw i t h1% a c e t i ca c i d .A d s o r p t i o no fp r o d u c to n t h ec o l u m nw a s m i n i m i z e db y p r e v i o u sp a s s a g eo f b a t c h e so fi n s u l i n( 2 - 1 0 m g )u n t i lq u a n t i t a t i v er e c o v e r y w a so b t a i n e d ;t h i s p r o c e d u r en e e d o n l y b e p e r f o r m e do n c e f o re a c h b a t c h o f S e p h a d e x .The a p p r o p r i a t ef r a c t i o n sw e r ep o o l e da n d f r e e z e - d r i e d ;t h e y i e l dwas2 0 . 1mg ( 9 9 % , b a s e d o n p i g i n s u l i ns t a r t i n gma t e r i a l ) .D e - p r o t e c t i o nw a s a c c o m p l i s h e db y d i s -s o l v i n g1 9 . 9 m go f t h e i n s u l i ne s t e r i n 2 m l o fr e d i s t i l l e dt r i f l u o r o a c e t i ca c i dc o n t a i n i n g1 mg o fL - t r y p t o p h a na n dm a i n t a i n i n gt h es o l u t i o na t 220Cf o r 4 5 m i n .A f t e r c o n c e n t r a t i o no f t h e s o l u t i o n t oa b o u t 0 . 5 m l o n t h er o t a r ye v a p o r a t o r ,t h e p r o d u c tw a s p r e c i p i t a t e dw i t h1 5 m lo f s o d i u m - d r i e dd i e t h y le t h e ra n d i s o l a t e db y c e n t r i f u g a t i o n .T h e p e l l e twasw a s h e db y r e s u s p e n s i o ni n a f u r t h e r1 5m l o f d i e t h y le t h e r , r e - c e n t r i f u g e d ,d r i e di n a va cuum d e s i c c a t o ra n d t h e n s u b j e c t e dt o g e lf i l t r a t i o na s b e f o r e .T h ef r e e z e - d r i e dp r o d u c tw e i g h e d 1 8 . 5m g .T h i s r e p r e -s e n t sa y i e l do f 93% f o rt h ed e - p r o t e c t i o ns t e p ,a n d92% f o r t h e p r o c e s s a s a w h o l e ( c o u p l i n ga n dd e - p r o t e c t i o n ) .

    S am p l e so f p r o d u c tw e r eh y d r o l y s e d( 6M - H C Ia t

    1 8 0 0 Cf o r2 4 h i n v a c u o )f o ra m i n oa c i d a n a l y s i sona n LKB 4 0 0 0a n a l y s e r .I m m u n o r e a c t i v ei n s u l i nwas d e t e r m i n e db y a

    s t a n d a r d r a d i o i m m u n o a s s a yt e c h n i q u ew i t h u s e o f

    1 9 8 3

    6 7 2

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    H i g h - y i e l ds e m i - s y n t h e s i so f i n s u l i n

    t h e c h a r c o a ls e p a r a t i o nm e t h o d( H e r b e r te t a l . ,1 9 6 5 ) .P i gi n s u l i n( N o v o )w a su s e d a s t h es t a n d a r di n t h ea s s a yw i t h g u i n e a - p i ga n t i - ( p i gi n s u l i n )s e r u m( g e n e r o u s l yg i v e nb y D r . H . H . S c h o n e ,F a r b w e r k eH o e c h s t ,F r a n k f u r t ,We s tG e r m a n y ) .

    To a s s a yt h ep r o d u c ti n v i v o ,t h es t o c ks o l u t i o no fs e m i - s y n t h e t i chuman i n s u l i nw a s d i l u t e do n t h eb a s i so f i t si m m u n o r e a c t i v ei n s u l i nc o n c e n t r a t i o nt og i v ea s o l u t i o nc o n t a i n i n g8, g / m l . R a t s w e r e t h e ni n j e c t e dw i t h0 . 1m l o f t h i ss o l u t i o np e r1 0 0 gb o d yw t . ( i . e .a f i n a ld o s e o f 8 p g / k ga c c o r d i n gt o t h ei m m u n o r e a c t i v i t y ) ,a n d t h ec u m u l a t i v ed e p r e s s i o no fp l a s m a g l u c o s ec o n c e n t r a t i o nw a s r e a d o f f as t a n d a r dc u r v e ( H a l b a ne t a l . ,1 9 8 1 ) .

    C o n v e r s i o no f p i g i n s u l i ni n t o h u m a n i n s u l i n :m e t h o dB

    A 4 0 . 6 m gp o r t i o no f z i n c - f r e ei n s u l i n( p r e p a r e db y d i a l y s i s ,a s i nm e t h o dA , o fs o d i u mi n s u l i nf r o mB o o t s C o . ,N o t t i n g h a m ,U . K . ) w a s t a k e n u p i n6 0 0 , u 1o f a m i x t u r eo f b u t a n e -1 , 4 - d i o ls a t u r a t e d( a t2 2 0 C )w i t hT r i sh y d r o c h l o r i d e ,a n d T h r ( B u t ) O B u t( 2 2 0 :2 3 ,v / v ) .To t h i sw a s a d d e d4 0,1 o f a s o l u t i o no ft r y p s i ni n w a t e r ( 7 . 5 1 m gi n 6 0 , u 1 ) ,w i t hm i x i n g .A f t e ri n c u b a t i o nf o r2 h a t 3 7 C , t h er e a c t i o nw a sq u e n c h e da n d t h e p r o d u c t w a s o b t a i n e db y g e lf i l t r a t i o na s d e s c r i b e df o rm e t h o dA . T h e y i e l dw a s38mg ( 9 1 % ) .D e - p r o t e c t i o no f 2 1 . 4 6 m go f i n s u l i ne s t e rw i t ht r i f l u o r o a c e t i ca c i da t 2 2 0 C f o r 1 h ( n o

    t r y p t o p h a na s s c a v e n g e r )a f f o r d e d2 0 . 4 m g o fs e m i - s y n t h e t i ch u m a ni n s u l i n .T h i sr e p r e s e n t sa y i e l do f 97% f o rt h ed e - p r o t e c t i o n ,a n d a n o v e r a l ly i e l d( c o u p l i n ga n dd e - p r o t e c t i o n )o f8 8 % .

    C o n v e r s i o no f p i g i n s u l i ni n t o h u m a n i n s u l i n :m e t h o dC

    A s m a l lc o l u m n ( 3 0mm x 2mm d i a m . )w a sp a c k e dw i t ht r y p s i na t t a c h e dt o c r o s s - l i n k e db e a d e da g a r o s e( S i g m aC h e m i c a lC o . ;l o t4 8 C - 7 6 3 0 1 )a n dr i n s e dt h r o u g hw i t h0 . 5 m l o f a c e t i ca c i d( 1 % ,v / v )f o l l o w e db y a m i x t u r eo f s a t u r a t e d( a t 2 2 0 C )T r i sh y d r o c h l o r i d ei n b u t a n e -1 , 4 - d i o l ,a n d w a t e r1 0 0 0 : 6 7( v / v ) .T h i sw a s f o l l o w e db y a m i x t u r eo fs a t u r a t e dT r i s h y d r o c h l o r i d ei n b u t a n e -1 , 4 - d i o l /w a t e r / T h r ( B u t ) O B u t( 2 2 3 : 1 5 : 2 3 ,b y v o l . ) ,w h i c hw a s c o n t i n u e du n t i lt h epH o f t h e e l u e n tr o s e f r o ma n i n d i c a t e dv a l u eo f a b o u t 4 t o 5 . 3 .A t t h i sp o i n t2mg o f z i n c - f r e ep i gi n s u l i nd i s s o l v e di n 3 0 , u 1o f t h et h r e o n i n ee s t e rs o l u t i o nw a s a p p l i e dt o t h ec o l u m na n d w a s r i n s e di n w i t ht w o 3 0 , u 1v o l u m e so f t h eb u f f e r e dt h r e o n i n ee s t e r s o l u t i o ni n b u t a n e -1 , 4 -d i o l / w a t e r .P r e s s u r ei sr e q u i r e dt o i n d u c et h ev i s c o u ss o l u t i o nt o f l o wt h r o u g ht h ec o l u m na t a n a p p r e c i -a b l er a t e .A f t e r9 0 m i na t 2 2 0 C , t h ep r o d u c tw a sf l u s h e df r o mt h ec o l u m nb y a p p l y i n gt h em i x t u r eo fT r i s h y d r o c h l o r i d e / b u t a n e -1 , 4 - d i o l ,a n d w a t e r1 0 0 0 : 6 7( v / v ) .

    C o n v e r s i o no f p i g i n s u l i ni n t o h u m a n i n s u l i n :m e t h o dD

    T o 2mg o fd e s - A l a - B 3 0 - i n s u l i n( p r e p a r e de s s e n t i -a l l ya s d e s c r i b e db y S c h m i t t& G a t t n e r ,1 9 7 8 )w a sa d d e d3 0 , u 1o fb u f f e r e dt h r e o n i n ee s t e rs o l u t i o n( s e e

    m e t h o dA ) f o l l o w e db y 4 , u lo f a q u e o u st r y p s i ns o l u t i o n( 1 2 5 m g / m l ) .A f t e rm i x i n ga n d i n c u b a t i o na t 3 7 0 Cf o r2 m i n ,c e l l u l o s ea c e t a t ee l e c t r o p h o r e s i sd e m o n s t r a t e da n a l m o s tq u a n t i t a t i v ec o u p l i n gy i e l d .

    C o n v e r s i o n o f d e s - Al a - B 3 0 - i n s u l i n i n t o[ L y s ( B u ' O C O ) O B u ' - B 3 0 1 i n s u l i nA 7 2 . 4mg p o r t i o no f NE -B u t OCO - L - l y s i n et - b u t y l

    e s t e ra c e t a t e( B a c h e m )w a sd i s s o l v e di n 4 0 0 , 1 o f am i x t u r e o f 1 . 5M - T r i sh y d r o c h l o r i d ei n d i m e t h y ls u l p h o x i d e ,a n d b u t a n e - 1 , 4 - d i o l( 1 : 2 .v / v ) .A 20mgp o r t i o no f d e s - A l a - B 3 0 - i n s u l i nw a s s u s p e n d e di n

    3 0 0 , 1 o ft h i ss o l u t i o n ,a n d t o i t w a s a d d e d4 O u 1o fw a t e rc o n t a i n i n g2 . 4 m go f t r y p s i n .T h ea p p a r e n tpHw a s5 . 6 - 5 . 9 .I n c u b a t i o nf o r2 h a t 3 7 Cf o l l o w e db yq u e n c h i n ga n d g e lf i l t r a t i o na s i nm e t h o dA a f f o r d e d1 9 . 5mg o f [ L y s ( B u t O C O ) O B u t - B 3 0 1 i n s u l i n

    R e s u l t sa n dd i s c u s s i o nP o s s i b l ev a r i a t i o n si ne x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n sS o l v e n t .T h e s a t i s f a c t o r yr a n g e f o r t h e f i n a l

    p e r c e n t a g eb y v o l u m eo f b u t a n e - 1 , 4 - d i o lw a s b e -t w e e na b o u t 80% a n d 96% ( n oc o r r e c t i o nm a d ef o rv o l u m ec h a n g e so n m a k i n gu p t h em i x t u r e s ) .I fg l y c e r o lw a s s u b s t i t u t e df o rt h ed i o l ,c o u p l i n gy i e l d sf e l lt o a b o u t h a l ft h e i ro r i g i n a lv a l u e .On t h eo t h e rh a n d ,u p t oo n e - t h i r do ft h ed i o lc o u l db e r e p l a c e db yd i m e t h y ls u l p h o x i d ew i t hl i t t l ee f f e c to n c o u p l i n ge f f i c i e n c y :t h er e s u l t i n gm i x t u r ei s a b e t t e rs o l v e n tf o rs o m ep o s s i b l es u b s t r a t e s .I t s e e m st o b e i m p o r t a n tt oa d d t h e w a t e r l a s t a n d ( e x c e p tw h e nu s i n gi m -m o b i l i z e de n z y m e )t o a d d t h e t r y p s i no n l ya t t h i ss t a g e .C o n c e n t r a t i o n .T h e r a t i ob e t w e e nt r y p s i na n d

    i n s u l i nw a s u s u a l l yb e t w e e n1 : 8 a n d 1 : 1 0 ( w / w ) ,b u t t h er e a c t i o ns t i l lp r o c e e d sr a p i d l ya t a r a t i oo f1 : 5 0 .A r a t i oo f 1 : 4 o r 1 : 5 g a v e f a s t e rc o u p l i n g .We h a v e s u c c e s s f u l l yu s e d i n s u l i nc o n c e n t r a t i o n si nt h er a n g e4 - 1 2mm. T h e u p p e r l i m i ti s c l o s et o t h a to f t h es o l u b i l i t yo ft h ei n s u l i n .T h em o l a re x c e s so fa m i n oc o m p o n e n tw a sn o r m a l l ya b o u t4 0 - f o l d .A t ac o n c e n t r a t i o no fd e s - A l a - B 3 0 - i n s u l i no f 3 . 5 r m a n da c o n c e n t r a t i o no f A l a O B u to f 3 0 ,6 0 a n d 1 2 0 m m ,t h ec o u p l i n gy i e l d s ,a s j u d g e db y c e l l u l o s ea c e t a t ee l e c t r o p h o r e s i s ,w e r e a p p r o x . 5 0 , 7 5 a n d 90%r e s p e c t i v e l y .T h e s el o w e rc o u p l i n ge f f i c i e n c i e sn o n e -t h e l e s sc o r r e s p o n dt o a g r e a t e rmass o f p r o d u c t( f o ra f i x e da m o u n to f A l a O B u t ) ,a n d ,p r o v i d e dt h a tt h ep r o d u c t c a n b e e a s i l ys e p a r a t e df r o m s t a r t i n gm a t e r i a l ,s u c h c o n d i t i o n sr e p r e s e n ta m e t h o do fm a x i m i z i n gt h em a s s o fp r o d u c to b t a i n a b l ew i t has c a r c e a m i n oc o m p o n e n t .T r i si s n o t n e c e s s a r ya t

    Vo l .2 1 1

    6 7 3

  • 8/7/2019 Rapid preparation of human insulin and insulin analogues in high yield by

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    K . R o s e ,H . d e P u r ya n dR . E .O f f o r d

    a l l ; t h e c o u p l i n go f T h r ( B u t ) O B u tw i t hi n s u l i np ro c e ed s n o r m a l l yi f t h epH i s a d j u s t e dw i t h a c e t i ca c i di n s t e a do f T r i sh y d r o c h l o r i d e .

    Te m p e r a t u r e .T h er a n g eb e t w e e n220C a n d 420Cw a sf o u n db e s t .T h er e a c t i o nt o o ka p p r o x .2 0 h t o g ot o c o m p l e t i o na t 40C a n dd i dn o t t a k ep l a c ea t a l la t6 0 0 C .p H . I t w a sn o t c o n v e n i e n tt o u s e a g l a s se l e c t r o d e

    b e c a u s eo f t h es m a l lv o l u m e si n v o l v e d .T h ee x t e r n a li n d i c a t o rt h a twe e m p l o y e dd i dn o t a l l o wu st o p u t ar e l i a b l en u m e r i c a lv a l u et o t h e p H , b u t i t w a sa d e q u a t ef o r c o n t r o lo f r e a c t i o nc o n d i t i o n s .T h eo p t i m u mi n d i c a t e dr a n g e i s pH 5 . 3 - 5 . 6 .A t a ni n d i c a t e dpH o f 4 . 7 , t h e c o u p l i n gr e a c t i o ni sn o t i c e a b l ys l o w e r ,a n d a n i n d i c a t e dpH o f m o r et h a n6 g a v e p r o d u c t sh a v i n g e l e c t r o p h o r e t i cm o b i l i t i e sc o n s i s t e n tw i t hc l e a v a g ea n d s u b s e q u e n tc o u p l i n ga tA r g - B 2 2 .

    R e c y c l i n go f a m i n o a c i d e s t e r .T h i s h a s b e e ne x a m i n e df o rt h ec a s e o f A l a O B u t .A f t e rc o u p l i n g ,e x c e s se s t e rmay b e e x t r a c t e di n t oe t h y la c e t a t ef r o mt h es a l tp e a ke l u t e df r o mt h eS e p h a d e xG - 5 0c o l u m n( s e em e t h o dA a b o v e ) .T o d o t h i s ,t h e p o o l e df r a c t i o n s a r ea d j u s t e dt o a pH a b o v en e u t r a l i t yw i t h1M-NaOH a n d t h e nt o pH 1 1 . 0b y a d d i t i o no f1M - N a 2 C O 3a n d 1M-NaOH.A f t e rt h r e ee x t r a c t i o n sw i t he t h y la c e t a t e ,t h e a m i n oa c i de s t e ri s b a c k -e x t r a c t e di n t o 2mM-HCI a n d f r e e z e - d r i e da s t h eh y d r o c h l o r i d e( a s t h e a c e t a t e ,i t i s v o l a t i l e ) .R e c o v e r yi sg r e a t e rt h a n 7 0% e v e nw h e nw o r k i n go na s m a l ls c a l e( 1 4 0 0 n m o lo fe s t e r ) .E s t e rr e c o v e r e di nt h i s w a y may b e c o u p l e da g a i nd i r e c t l yw i t h o u ti m p a i r e de f f i c i e n c y.H o w e v e r , i f d i e t h y le t h e r( a n a l y t i c a lg r a d e ;M e r c k , D a r m s t a d t ,We s t G e r -m a n y )i su s e di np l a c eo f t h ee t h y la c e t a t e ,r e c o v e r e de s t e rd o e s n o t c o u p l ewe l l ;t h i s i s i n s p i t eo f an e g a t i v es t a r c h / i o d i d et e s tf o rp e r o x i d e si nt h ee t h e r .I n s u l i na n a l o g u e s .I n s u l i na n a l o g u e sc o n t a i n i n ga

    v a r i e t yo fg r o u p sa t p o s i t i o nB 3 0may b e p r e p a r e db y t h ea b o v et e c h n i q u e s .When c o u p l i n gm o l e c u l e st h a t may r e q u i r ev e r y r a p i dr e a c t i o nt o a v o i dd a m a g et o t r y p s i no r i n s u l i n( e . g .c y s t a m i n e ,w h i c hmay c o n t a i ns o m ec y s t e a m i n e ) ,m o r e s a t i s f a c t o r yr e s u l t sa r e o b t a i n e db y c o u p l i n gt o d e s - A l a - B 3 0 7i n s u l i nr a t h e rt h a n u s i n gp i g i n s u l i na s s u b s t r a t e .F i g . 1( a ) s h o w s t h a t t h e d e g r e eo f c o u p l i n go fLy s ( B u t O C O ) O B u tt o d e s - A l a - B 3 0 - i n s u l i ni s e f f e c -t i v e l yq u a n t i t a t i v e .I t i s o f i n t e r e s tt o n o t e t h a tv a r i o u sm o l e c u l e s( e . g .A l a O B u t )may b e r a p i d l ya n d a l m o s t q u a n t i t a t i v e l yc o u p l e d t o d e s - o c t a -p e p t i d e - B 2 3 - B 3 0 - i n s u l i n ,s u g g e s t i n gt h a tt h el a c ko fc l e a v a g e( a n dc o u p l i n g )a t A r g - B 2 2o b s e r v e dw h e ni n s u l i no r d e s - A l a - B 3 0 - i n s u l i ni s u s e d a s s u b s t r a t ei sa k i n e t i ca n d n o t a t h e r m o d y n a m i cp h e n o m e n o n .

    Huma n i n s u l i n .M e t h o d sA- D r e p r e s e n tr a p i d ,c o n v e n i e n ta n d ( i nt e r m s o f i n s u l i n )e f f i c i e n tr o u t e st o s e m i - s y n t h e t i chuman i n s u l i n .M e t h o dC i np a r t i c u l a rl e n d si t s e l ft o l a r g e r - s c a l eo p e r a t i o n s ,a n d

    ..:. . . . .

    WS

    a n a l o g u e s on cellulose acetate

    Samples are: (a ) ( i ) des-Ala-B30-insulin; ( i i )

    [ L y s ( B u t O C O ) O B u t - B 3 0 l i n s u l i n : .( b) ( i ) pi g i n s u l i n - ,( i i ) f T h r ( B u t ) O B u t - B 3 0 l i n s u l i nproduced by methodA; O i )d e - p r o t e c t e d semi - syn the t i c human i n s u l i n :( c ) ( i ) p ig i n s u l i n ; ( i i ) [ T h r ( B u t 9 O B u t - B 3 0 1 i n s u l i nproduced by meth od B; ( i i i ) de-protected se mi-

    s y n t h e t i c human insul in; , ( d) ( i ) p i g i n s u l i n ; (i )

    [ T h r ( B u t )OBu t - B 3 0 l i n s u l i n produced by method C.

    The e l e c t r o p h o r e s i swas p e r f o r m e do n s t r i p s ofc e l l u l o s ea c e t a t e i n a u r e a - c o n t a i n i n g borate bu f f e r ,pH a 8 . 0 ,s t a i n i n g w i t h Ponceau l, as d e s c r i b e dp r e v i o u s l y (Rose et a l . , 1 9 8 1 ) .FF i n d i c a t e sthep o s i t i o n r e a c h e dby the dye Cyanol FF, appl ied att h e o r i g i n .The c o u p l i n gmixture may be appl ieddirectly to c e l l u l o s ea c e t a t e for conven i ence inm o n i t o r i n g the progress of the react ion: a l t e r -n a t i v e l y ,a sample of the a p p r o p r i a t e freeze-driedpooled f r a c t i o nfrom t h eSeph a d e x G-50 s e p a r a t i o nof t h ec o u p l i n gm i x t u r emay b e a p p l i e d .

    h a s t h ea d v a n t a g e ,b e s i d e se f f i c i e n tu s e o f t r y p s i n ,o fr e q u i r i n go n l yd i a l y s i s ,a n d n o t g e lf i l t r a t i o n ,a f t e rt h e c o u p l i n gr e a c t i o n .F i g s .1 ( b ) - l ( d ) i n d i c a t et h ep u r i t yo f t h ei n t e r m e d i a t ei n s u l i ne s t e r .T h ec o u p l i n gr e a c t i o ni s s e e n t o h a v e p r o c e e d e de f f e c t i v e l yq u a n t i t a t i v e l y :u n c o u p l e dm a t e r i a li s p r e s e n to n l yi nt r a c ea m o u n t s .F i g .1 a l s od e m o n s t r a t e st h ed e g r e eo f h o m o g e n e i t yo f s e m i - s y n t h e t i ch u m a ni n s u l i no b t a i n e d a f t e rd e - p r o t e c t i o n .A m i n oa c i da n a l y s i ss h o w e d2 . 7 2 r e s i d u e so f t h r e o n i n e( u n c o r r e c t e d )a n d1 . 1 1 r e s i d u e so f a l a n i n ep e r m o l e c u l e .T h et h e o r e t i c a lv a l u e s f o r human i n s u l i na r e 3 a n d 1r e s p e c t i v e l y .An a n a l y s i so f t h ea p p r o p r i a t ef r e e z e -d r i e dp o o l e d f r a c t i o nf r o m t h e S e p h a d e xG - 5 0s e p a r a t i o no f a c o u p l i n gm i x t u r ewas p e r f o r m e db yh i g h - p r e s s u r el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y .T h e r e s u l t i n gc h r o m a t o g r a m( F i g .2 ) s h o w sa v e r y h i g hy i e l do fhuman i n s u l i ne t h e re s t e r ,c o n f i r m i n gr e s u l t so b -t a i n e db y e l e c t r o p h o r e s i so n c e l l u l o s ea c e t a t e .As i m i l a ra n a l y s i so f p u r i f i e dd e - p r o t e c t e dhuman

    1 9 8 3

    6 7 4

  • 8/7/2019 Rapid preparation of human insulin and insulin analogues in high yield by

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    H i g h - y i e l d s e m i - s y n t h e s i so f i n s u l i n

    r 4 - - - - - 4- + - - ., .@_I _- I

    _ _ _ ;, 1 _____ __.F - - - ---- -1 t t___ t__ t __1

    'I--t --t 1 - t -- Lr t t - -

    t _ . -

    t . ~ - - - - H4 F|' I~ --+ _~ ~1 _!rn~ -E _ I;

    C 2 -~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~4

    I F- *t- / -- - O l e

    1 m i n E s t e rp o s i t i o n

    I n s u l i np o s i t i o n

    I n j e c t i o n

    F i g .2 . H i g h - p r e s s u r el i q u i d - c h r o m a t o g r a p h i ca n a l y s i so ft h ep o o l e di n s u l i n / i n s u l i ne t h e re s t e rf r a c t i o n

    F o r t h i s a n a l y s i st h e s a m p l eo f p i g i n s u l i nw a sc o u p l e di n t h ep r e s e n c eo fT h r ( B u t ) O B u t( 1M ) ,w i t ht r y p s i na s c a t a l y s t .A f t e r2 h a t 3 7 0 C ,t h ec o u p l i n gm i x t u r ew a sa c i d i f i e da n dt h ep r o d u c tw a ss e p a r a t e df r o mt r y p s i na n d s m a l lm o l e c u l e sb y g e lf i l t r a t i o no nS e p h a d e xG - 5 0a sd e s c r i b e di n t h et e x t .C o n d i t i o n sf o rh i g h - p r e s s u r el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y :s e p a r a t i o no f h u m a ni n s u l i ne t h e re s t e rf r o mr e m a i n i n gi n s u l i nw a sa c h i e v e db y r e v e r s e d - p h a s e h i g h - p r e s s u r el i q u i dc h r o m a t o g r a p h yo n a 4 5mm x 4 . 6mm - d i a m .c o l u m np a c k e dw i t h5 g , m - p o r e - s i z eU l t r a s p h e r eODS( B e c k m a n ) .T h e e l u e n tc o n t a i n e ds o d i u mb u t a n e -s u l p h o n a t e( 5mM ) , N a H 2 P O 4( 5mM ) , N a 2 S O 4( 5 0 mM )a n d a c e t o n i t r i l e( 2 5 % ,v / v ) .On i n j e c t i o n ,al i n e a rg r a d i e n to f a c e t o n i t r i l ew a s s t a r t e d ,r u n n i n gf r o mt h eo r i g i n a lv a l u eo f 25% t o 60% ( v / v )o v e r a1 0 m i np e r i o d .A f l o wr a t eo f 1 . 5 m l / m i nw a s u s e dt h r o u g h o u t .T h e a b s o r b a n c eo f t h e e l u a t ew a sm o n i t o r e da t 2 1 4 n m . T h ea b s o r b a n c es c a l ew a sd i v i d e db y 5 f o ra s h o r tp e r i o di n o r d e rt o k e e pt h ee s t e rp e a ko n s c a l e .T h ee l u t i o np o s i t i o n so f h u m a ni n s u l i ne t h e re s t e ra n do f p i gi n s u l i nw e r ee s t a b l i s h e di n s e p a r a t er u n s w i t ha u t h en t i c m a t e r i a l sa p p l i e ds e p a r a t e l ya n da s a m i x t u r e .

    insulin is shown i n Fig. 3. The s em i - s y n t h e t i c human

    i n s u l i np r e p a r e db y m e t h o dA w a s t e s t e db o t h b yr a d i o i m m u n o a s s a ya n d b y d e p r e s s i o n o f b l o o d

    Vo l . 2 1 1

    U.:S4-_.4___-t--_, 1 : _: _ ._ ____ _.a= _ .:I-= _:=___.:____t__.-

    . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ._____. -=S 0-=i - _ _ F_ _ ..... _ X, _ _

    _ -= i - 8 --=__ _ = w-_ _ _ _- - , - - - - - ----- -I___._,___ ,__ _ _ Fj_ __ _ _ _

    . _ = _ _ = _ =_ = _ v_ _ ___...____ _ __ _ _+_ _ .__ _ 4 _ _._ __ _- - -C- - - -- - _ = - .i - -= .---_ ---- 4 -- - - - = ---- - - - - -- --t - - - - - j - - - - - tL - - - - - - - - -_ __, . . . . , _ - -; -- - -- - - - . -- - - 1. -- ----

  • 8/7/2019 Rapid preparation of human insulin and insulin analogues in high yield by

    6/6

    6 7 6 K . R o s e ,H . d e P u r y a n dR . E .O f f o r d

    We t h a n k M r s . D a n i e l l eB o g h i k i a n ,M r . A s l l a nG j i n o v c ia n d D r .P h i l i p p eA . H a l b a no f t h eI n s t i t u td eB i o c h i m i eC l i n i q u e ,S e n t i e rd e l a R o s e r a i e ,G e n e v a ,Sw i t z e r l a n d ,f o r t h e r a d i o i mm u n o a s s a ya n d a s s a y s i nv i v o ,D r . J . G . D a v i e so f t h i sD e p a r t m e n tf o ra d v i c ea n da s s i s t a n c ew i t hh i g h - p r e s s u r el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ,a n dM r . Te r r y B i l h a mo f

    B i o g e nS . A . ,G e n e v a ,Sw i t z e r l a n d ,f o rt h ea m i n oa c i da n a l y s e s .T h i sw o r kw a ss u p p o r t e db yt h eF o n d sN a t i o n a lS u i s s ed e l aR e c h e r c h eS c i e n t i f i q u e .

    R e f e r e n c e sB r e d d a m ,K . ,Wi d m e r ,F . & J o h a n s e n ,J . T . ( 1 9 8 2 )E u r .

    P a t e n tA p p l i c a t i o n8 1 3 0 3 3 8 3 . 4G a t t n e r ,H . G . ,D a n h o ,W. & N a i t h a n i ,V .K . ( 1 9 8 0 )i nI n s u l i n :C h e m i s t r y ,S t r u c t u r ea n dF u n c t i o no f I n s u l i na n dR e l a t e dH o r m o n e s( B r a n d e n b u r g ,D . & Wo l l m e r ,A . ,e d s . ) ,p p .1 1 7 - 1 2 3 ,W. d e G r u y t e r ,B e r l i na n dNewYo r k

    H a l b a n ,P . A . ,B e r g e r ,M . , G j i n o v c i ,A . & R e n o l d ,A . E .( 1 9 81 )D i a b e t e sC a r e4 ,2 3 8 - 2 4 3

    H e r b e r t ,V . ,L a u , K . S . ,Go t t l i e b ,C . V . & B l e i c h e r ,S . J .( 1 9 6 5 )J . C l i n .E n d o c r i n o l .Me t a b .2 5 ,1 3 7 5 - 1 3 8 4

    I n o u y e ,K . ,Wa t a n a b e ,K . ,M o r i h a r a ,K . ,To c h i n o ,Y . ,K a n a y a ,T . ,E m u r a ,J .& S a k a k i b a r a ,S . ( 1 9 7 9 )J .Am .C h e m .S o c .1 0 1 ,7 5 1 - 7 5 2

    J o n c z y k ,A . & G a t t n e r ,H . G . ( 1 9 8 1 )H o p p e - S e y l e r ' sZ .P h y s i o l .C h e m .3 6 2 ,1 5 9 1 - 1 5 9 8

    M a r k u s s e n ,J . ( 1 9 8 1 )U . K . P a t e n t A p p l i c a t i o nGB 20 6 9 5 0 2AMo r i h a r a ,K . , Ok a , T . , Ts u z u k i ,H . , I n o u y e ,K . &S a k a k i b a r a ,S . ( 1 9 7 9 a )i n P e p t i d e s :S t r u c t u r ea n dB i o l o g i c a lF u n c t i o n( G r o s s ,E .& M e i e n h o f e r ,J . ,e d s . ) ,p p .6 1 7 - 6 2 0 ,P i e r c eC h e m i c a lC o . ,R o c k f o r d

    Mo r i h a r a ,K . ,Ok a , T . & Ts u z u k i ,H . ( 1 9 7 9 b )N a t u r e( L o n d o n )2 8 0 , 4 1 2 - 4 1 3

    M o r i h a r a ,K . , Ok a , T . , Ts u z u k i ,H . , To c h i n o ,Y . &K a n a y a ,T . ( 1 9 8 0 )B i o c h e m .B i o p h y s .R e s .C o m m u n .9 2 ,3 9 6 - 4 0 2

    O b e r m e i e r ,R . ( 1 9 7 8 )i n S e m i s y n t h e t i cP e p t i d e sa n dP r o t e i n s( O f f o r d ,R . E . & D i B e l l o ,C . , e d s . ) ,p p .2 0 1 - 2 11 ,A c a d e m i cP r e s s ,L o n d o n ,New Yo r k a n dSa nF r a n c i s c o

    O b e r m e i e r ,R . & G e i g e r ,R . ( 1 9 7 6 )H o p p e - S e y l e r ' sZ .P h y s i o l .C h e m .3 5 7 ,7 5 9 - 7 6 7

    R o s e , K . ,D r a k e , C . S . ,R e e s ,A . R . & O f f o r d ,R . E .( 1 9 8 1 )B i o c h e m .J . 1 9 5 ,7 6 5 - 7 6 8

    S c hm i t t ,E .W. & G a t t n e r ,H . - G . ( 1 9 7 8 )H o p p e - S e y l e r ' sZ . P h y s i o l .C h e m .3 5 9 ,7 9 9 - 8 0 2

    1 9 8 3