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Universidad Politécnica de Pachuca DOCTORADO EN BIOTECNOLOGÍA
PRODUCCIÓN Y PURIFICACIÓN DE XILANASAS EXTRACELULARES
PRODUCIDAS POR Pleurotus opuntiae (Dur. & Lév.) Sacc.
I. INTRODUCCIÓN
Las enzimas son catalizadores biológicos que acelera la velocidad de las reacciones
bioquímicas con un elevado grado de especificidad, además de requerir temperatura,
pH, presión determinados; en su ausencia la mayoría de las transformaciones químicas
requeridas para mantener activas a las células, tardarían mucho tiempo en efectuarse.
Con base a estas características, las enzimas, se han aplicado a procesos
biotecnológicos que han venido a impulsar a la industria farmacéutica para la obtención
de vitaminas, antibióticos, en análisis clínicos (diagnóstico); para curtir cuero, se han
usado en síntesis orgánicas, en la industria textil; en industria de alimentos para la
obtención de jarabes glucosados y fructosados, producción de aromas, sabores y
manufactura de queso entre otros (Biely, 1993).
Tradicionalmente las enzimas de uso práctico se han extraído a partir de vegetales y
animales, pero actualmente se ha preferido el uso de microorganismos, porque es más
fácil manejar la producción de enzimas mediante la estandarización de condiciones de
cultivo, como pH, temperatura, concentración de nutrientes, etc. que lleva a aumentar
los rendimientos en la producción de una enzima específica (Ball et al., 1988).
Los xilanos son componentes importantes de las hemicelulosas de las plantas y ellos
están compuestos de una cadena linear de residuos de D-xilosa con un tipo muy
variado y número de sustituyentes dependiendo de la fuente de donde provengan
(Bastawde, 1992). Debido a su compleja estructura, la degradación del xilano requiere
de la acción concertada de un número de enzimas (Christov y Prior, 1993). La
degradación de la cadena principal es llevada a cabo por las xilanasas, las cuales dan
lugar a oligosacáridos de diferentes tamaños (Biely, 1985). Estas enzimas son
producidas por hongos y bacterias, un fenómeno interesante que existe en estos
microorganismos xilanolíticos, es la multiplicidad de las xilanasas (Wong, Tan, y
Saddler,1988), es decir la producción de isoenzimas con la misma actividad de endo-
xilanasa. La aparición de múltiples xilanasas extracelulares en un mismo
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microorganismo, crea preguntas concernientes al origen y al papel que juegan las
diferentes xilanasas en la degradación de los xilanos (Biely, Markovik, y
Mislovicová,1985).
El uso de los hongos tiene gran importancia en la producción de enzimas debido a su
metabolismo de digestión extracelular, estos procesos han sido aprovechados por la
industria para diversas aplicaciones biotecnológicas. Una de las estrategias utilizadas
para la obtención de las enzimas es el cultivo in vitro de estos organismos, lo que nos
lleva a estudiar el medio ambiente donde se desarrollan de manera natural, para lograr
la experimentación en el cultivo de hongos silvestres saprótrofos con fines de obtención
de extractos enzimáticos.
Por otra parte, las relaciones que se establecen entre los hongos y otras especies por
ejemplo con el Agave spp. (maguey), se han manifestado con un efecto mayor o menor
en cada una de las etnias de nuestro país, donde los agaves han establecido una
relación entre la diversidad biológica y cultural dentro de una amplia perspectiva
agroecológica y económica a través de los que Gentry (1982) ha considerado la
simbiosis “hombre-agaves”. Por ello, su conocimiento, usos, beneficios y
aprovechamiento por los diversos grupos humanos, se ha transformado conforme se
desarrollaron las grandes culturas mesoamericanas hasta llegar a un aprovechamiento
integral y racional de cada una de las partes que lo conforman. Entre ellas se encuentra
el consumo de P. opuntiae que es conocido comúnmente en México como “hongo de
maguey” u “hongo blanco de maguey”, entre otros nombres.
En el presente trabajo también se realizará la evaluación del potencial enzimático de P.
opuntiae que es un hongo comestible silvestre que crece en la base de magueyes
cultivados en algunas regiones de México y que además pertenece a un género, donde
la mayoría de sus especies han logrado cultivarse en diferentes tipos de sustratos
lignocelulósicos (Romero, 2002).
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II. ANTECEDENTES
2.1 Estructura de los xilanos y su distribución en la naturaleza
La pared celular de las plantas terrestres en general esta constituida de: i) celulosa
(40%), que es un polímero insoluble compuesto de residuos -D-glucopiranosil, ii)
hemicelulosa (33%), que es una serie de heteropolisacáridos que incluye xilanos,
mananos, galactanos y arabinanos. En los pastos y cereales el arabinoxilano (GP de
70) está sustituido con grupos feruloil y/o p-coumaroil en el C-5 de la L-arabinofuranosa
(Coughlan y Hazlewood, 1993). Cabe mencionar que también se han encontrado
xilanos lineales no sustituidos en el Lygeum spartum (pasto de esparto) y en la planta
de Tabacum (tabaco). Los xilanos no se acumulan en la naturaleza y juegan un papel
significante en la integridad estructural de la pared celular de las plantas (Bastawde,
1992).
2.2 Importancia y clasificación de las enzimas que degradan los xilanos
Debido a la diversidad, complejidad y abundancia de los xilanos, son necesarias las
enzimas xilanolíticas para su degradación, que además tienen importancia biológica
porque participan en conjunto con otras enzimas en la reincorporación del CO2 al ciclo
del carbono, el cual es fijado por las plantas durante la fotosíntesis y posteriormente
liberado a la atmósfera a través de la acción microbiana sobre los residuos de vegetales
(Wong et al., 1988; Biely et al., 1992; Coughlan y Hazlewood, 1993).
El sistema xilanolítico, es complejoy está formado por varios tipos de enzimas como las
xilanasas y las enzimas accesorias, que cooperan en conjunto para la degradación de
los xilanos presentes en las hemicelulosas de las plantas (Biely, 1985; Christov y Prior,
1993).
2.3 Producción de enzimas xilanolíticas
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Las xilanasas están ampliamente distribuidas en organismos procariotes y eucariotes
que incluyen: plantas, insectos, caracoles, protozoarios (Bastawde, 1992), y en una
gran variedad de microorganismos como: levaduras, hongos y bacterias que producen
estas enzimas.
Actualmente los más estudiados son los hongos filamentosos del género Aspergillus y
Trichoderma, ya que se utilizan a gran escala para la producción de estas enzimas,
pero un problema existente, es que estos hongos coproducen xilanasas y celulasas
(Wong et al., 1988), lo cual no es conveniente para algunas aplicaciones de las
xilanasas. Para producir sistemas xilanolíticos libres de celulasas provenientes de
hongos, los extractos deben ser sometidos a procesos de separación de las celulasas
como en el caso de las cepas Aspergillus y Trichoderma, otra posibilidad es el
aislamiento de nuevas cepas mutantes no productoras de celulasas o la clonación de
genes de xilanasas en organismos no celulolíticos. También se puede inhibir la
actividad de celulasas, adicionando mercurio a la preparación enzimática, pero este
tratamiento es costoso y además tóxico (Biely, 1991).
Una de las ventajas de los basidiomicetos lo constituye su amplio espectro de
actividades enzimáticas, lo que conlleva a que estos microorganismos jueguen un papel
importante en diversos sistemas biológicos, por lo que resulta conveniente profundizar
en el cultivo y manejo de estos microorganismos (Brizuela et al., 1998). Los hongos de
pudrición blanca que pertenecen a los géneros Trametes, Pleurotus, Lentinus y Cerrena
se han estudiado para la producción de celulasas y xilanasas por cultivo sólido, aunque
se han enfocado en la producción de lacasas y peroxidasas. La selección del sustrato
debe realizarse de acuerdo al microorganismo y tipo de enzima que se requiera; para
producir celulasas y xilasas, se seleccionará un sustrato con altos porcentajes de
celulosa y hemicelulosa (Ordaz, 2008).
2.4 El género Pleurotus
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2.4.1 El cultivo de Pleurotus spp.
Debido a un mayor conocimiento de la naturaleza biológica de los hongos, así como a
los avances en el desarrollo de técnicas de cultivo, se han ido sumando nuevas
especies para ser domesticadas. Se ha estimado, de acuerdo con diferentes datos, que
los hongos comestibles podrían representar el 50% de las especies totales de
macromicetes que corresponden aproximadamente a 5,000 especies a nivel mundial.
Alrededor de 80 especies, en su mayoría saprobias, se han logrado cultivar en forma
experimental y de éstas, 40 han sido trasladadas a naves de cultivo, pero sólo
alrededor de 20 con fines comerciales y sólo 6 han sido contempladas para la escala
industrial (Chang, 1993).
Es una actividad que se ha venido desarrollando en diferentes partes del mundo como
Estados Unidos, Europa y el sureste de Asia. Particularmente, la producción de hongos
del género Pleurotus ha experimentado un crecimiento extraordinario en países como
Japón, Corea, Taiwán, Filipinas, Estados Unidos y Alemania. Ha estado condicionado
por las ventajas que presenta en comparación con otras especies como Agaricus
bisporus (champiñón comercial). Algunas de estas ventajas son: simplicidad de la
tecnología de producción; la posibilidad de utilizar una amplia gama de sustratos
orgánicos; rendimientos que en algunas especies superan el 100% de eficiencia
biológica, en cortos periodos de tiempo; amplio margen de tolerancia del cultivo en
climas fríos, templados y tropicales; costos de producción relativamente bajos en
instalaciones económicas con una biotecnología sencilla provocando un bajo impacto
ecológico; obtención de alimento con alto valor nutritivo que ha demostrado tener una
buena aceptación por parte de los consumidores, entre otros (Chang y Quimio, 1982).
2.5 Descripción de Pleurotus opuntiae
A continuación se presenta la descripción general de Pleurotus opuntiae realizada por
Petersen y Krisal-Greilhuber (1999).
2.5.1 Pleurtous opuntiae (Durieu y Lév.) Sacc.
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El nombre de Pleurotus opuntiae ha sido utilizado para representar las últimas tres
interpretaciones: 1) un Pleurtous del Norte de África; 2) basidiomas frescos con
prominente estípite presentándose en la parte basal de un gran Agave en las tierras
altas de México; y 3) basidiomas con muy reducido estípite, reportados como parásitos
de Cordyline (árbol de berza) en Nueva Zelanda.
Después del primer reporte sobre la incompatibilidad sexual entre variantes
morfológicas dentro de P. djamor, monocariontes, junto con aislamientos de otros
basidiomas con similar morfología, se estableció una sexualidad compatible dentro del
grupo con aislamientos monocarióticos de otras formas macromorfológicas
representados por otros nombres, por ejemplo P. djamor de un blanco pálido oliváceo
de P. ostreatoroseus, P. flabelatus, P. salmoneostramineus para las formas rosadas,
resumió la situación morfológica y todas estas formas podrían estar representadas por
el viejo nombre P. djamor.
A fin de probar el uso del nombre de P. opuntiae en trabajos mexicanos, es que fue
necesario examinar el espécimen tipo y así compararlo con el material mexicano
presentando una descripción más completa (Romero, 2002).
III. OBJETIVOS
III.1 Objetivo General
Realizar cinéticas de producción de enzimas (lacasa, manganeso peroxidasa, lignina
peroxidasa, celulasa, xilanasa) de Pleurotus opuntie mediante la utilización de
diferentes técnicas para producir y purificar enzimas de importancia biotecnológica.
FASES DEL PROYECTO:
1. Realizar cinéticas de producción de xilanasa.
-Evaluar diferentes medios de crecimiento (líquido y sólido).
-Evaluar diferentes fuentes de carbono a varias concentraciones.
2. Determinar el perfil enzimático.
- En medio líquido y sólido.
- Por electroforesis.
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3. Purificación enzimática.
- A partir del medio seleccionado.
4. Caracterización cinética (enzima pura).
- KM
- VMAX
- pH óptimo
- Temperatura óptima
- Energía de activación
5. Secuenciación de la enzima purificada.
- Estructura putativa.
- Establecer relaciones evolutivas de la proteína.
IV. JUSTIFICACIÓN
Una gran cantidad de microorganismos tienen la capacidad de excretar enzimas
lignocelulolíticas, no obstante, las bacterias y hongos son los microorganismos que las
producen en mayor cantidad en condiciones de cultivo líquido y sólido. Al respecto, el
género Pleurotus es capaz de excretar dichas enzimas en ambos sistemas de
producción, pero la mayoría de los estudios se enfocan a la obtención de lacasas por
cultivo líquido, porque son utilizadas en varias aplicaciones en biotecnología ambiental.
En medio líquido, el hongo sólo se ha cultivado para la producción de lacasas y, en
medio sólido para la producción de celulasas, xilanasas y lacasas. Hasta ahora sólo se
sabe que Pleurotus opuntiae es capaz de producir enzimas lignocelulolíticas, sin
embargo, por las características antes mencionadas, es interesante la exploración de
esta cepa como fuente nueva para la obtención de xilanasas que puedan ser usadas en
algún campo de trabajo específico, desde biotecnología ambiental hasta en nutrición
animal, a través del uso de los extractos enzimáticos obtenidos durante su cultivo.
Teniendo en cuenta estos aspectos, en este trabajo se evaluarán los residuos agrícolas
de aserrín y bagazo de diferentes especies de Agave, como sustratos para el
crecimiento de Pleurotus opuntiae. Se evaluarán también los niveles de producción de
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lacasa, manganeso peroxidasa, lignina peroxidasa, celulasa, xilanasa sobre el mejor
sustrato, relacionando los niveles de producción de enzimas con los niveles de
producción de proteína extracelular y de pH, manteniendo la humedad del sustrato
constante durante todo el cultivo.
V. MATERIAL Y MÉTODOS
V.1 Microorganismo, propagación y conservación
V.1.1 Mantenimiento de la cepa de Pleurotus opuntiae
La cepa de Pleurotus opuntiae se mantendrá en placas de Agar Papa y Dextrosa
(PDA). Las placas serán cultivadas a 37 °C y se mantendrán a 4 °C hasta su uso.
V.1.2 Propagación de la cepa de Pleurotus opuntiae
Se seleccionará una placa de donde se obtendrán fragmentos cúbicos de 0.5 cm2
aproximadamente los cuales se colocarán en nuevas placas con PDA. Las placas se
incubarán nuevamente a 37 °C durante aproximadamente seis días (tiempo en el cual
la cepa se desarrolla en toda la placa) y posteriormente se conservarán a 4 °C hasta su
uso).
V.1.3 Conservación de la cepa de Pleurotus opuntiae
La cepa fúngica será sistemáticamente subcultivada después de 4 semanas,
almacenada y sellada con papel parafilm en placas de PDA, manteniéndolas a 4 °C
hasta su resiembra posterior.
V.2 Preparación del preinóculo para el cultivo en sólido con Pleurotus
opuntiae
Para la preparación del preinóculo del cultivo en sólido se tomará una placa de PDA
con Pleurotus opuntiae, la cual será seccionada en fragmentos cúbicos de 0.5 mm
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aproximadamente, se adicionarán a un matraz Erlenmeyer de 250 mL con 100 mL de
agua destilada previamente estéril. El matraz se mantendrá con agitación rotatoria a
37°C y 180 rpm durante 24 horas. Posteriormente se filtrará el sobrenadante con una
coladera de acero previamente estéril. El sobrenadante contendrá las células fúngicas
de P. opuntiae, las cuales serán adicionadas a la matriz de residuos del sustrato sólido
(aserrín) para iniciar el proceso de deslignificación.
5.3 Sistema de cultivo en sólido para deslignificación los residuos de aserrín
5.3.1 Preparación del sustrato
La matriz de residuo lignocelulósico de aserrín con el tamaño de partícula de interés
seleccionado se colocará en un cristalizador de vidrio y se recubrirá con aluminio para
ser esterilizada en autoclave a 121ºC durante 15 min con al menos 24 horas de
anticipación (Márquez-Araque et al., 2007).
5.3.2 Preparación del material para el reactor
Las columnas de Raimbault para el proceso de deslignificación serán empacadas con
2.5 cm de algodón en la parte inferior, se les adicionará en la parte superior un tapón de
goma con un fragmento de tubo de vidrio como salida de aire para evitar el acúmulo de
presión. Después estas serán envueltas en papel estaño por los extremos y colocadas
en bolsa de polietileno para su esterilización en autoclave a 121ºC durante 15 min con
al menos 24 horas de anticipación.
5.3.3 Inoculación de la matriz de deslignificación y preparación de las
columnas de Raimbault con el material inoculado
La matriz de crecimiento estéril será inoculada en la campana de extracción con el
sobrenadante obtenido en el apartado 5.2. Esta mezcla se agitará suavemente hasta
que el inóculo sea absorbido de manera uniforme y posteriormente a este paso se
empacará cada columna tomando en cuenta la densidad de empaque.
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5.3.4 Montaje del sistema de cultivo en sólido para deslignificación
Las columnas de Raimbault con la matriz a deslignificar serán ensambladas con el
humidificador lleno de agua estéril y la manguera de hule con conexión a un difusor de
aire (Zhang et al., 2009).
Obtención del extracto enzimático crudo del proceso de deslignificación
El material deslignificado se depositará en una bolsa con cierre hermético (Zipoc) el
cual se homogenizará durante 1 minuto. Después se toma 1 g de muestra y se colocará
en un tubo de polipropileno, al cual se le adicionará 3 mL de solución amortiguadora de
buffer de acetatos 10 mM (pH= 6.0). El tubo se agitará durante 1 minuto en vortex,
inmediatamente se filtrará el líquido resultante y se colocará en un tubo Eppendorf, el
cual se centrifugará durante 10 minutos a 14000 rpm. Posteriormente se separará el
sobrenadante y este se depositará en una gradilla sumergida en hielo para evitar la
desnaturalización de las enzimas.
5.5 Determinación de la actividad enzimática celulolítica (xilanasas y
celulasas)
5.5.1 Xilanasas
La actividad xilanasa será ensayada espectrofotométricamente usando xilano de abedul
como sustrato, según Márquez-Araque et al, (2007).
5.5.2 Celulasas
La actividad celulasa será determinada espectrofotométricamente usando como
sustrato carboximetilcelulosa (CMC), según Márquez-Araque et al, (2007).
5.6 Cuantificación de Azúcares Reductores y Proteína total
5.6.1 Azúcares reductores
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El ensayo se llevará a cabo espectrofotométricamente usando xilano y CMC para las
actividades de xilanasa y celulasa respectivamente, según Márquez-Araque et al,
(2007).
5.6.2 Proteína total
El ensayo se llevará a cabo espectrofotométricamente utilizando un Kit enzimático para
la determinación de proteína por el método de Bradford según Bradford, (1976) y León,
(2008).
5.7 Determinación de actividad enzimática ligninolítica (Lacasa (Lcc),
Manganeso peroxidasa (MnP) y Lignina peroxidasa (LiP))
5.7.1 Lacasa (Lcc)
La actividad Lcc será ensayada espectrofotométricamente con 2,2´-azino-bis-
etilbentiazolina (ABST) como sustrato, según Minako et al, (2008).
5.7.2 Lingina Peroxidasa (LiP)
La actividad LiP será ensayada espectrofotométricamente usando alcohol veratrílico
como sustrato, inicializado por la adición de H2O2, según León, (2008).
5.7.3 Manganeso Peroxidasa (MnP)
La actividad MnP será ensayada espectrofotométricamente usando Rojo Fenol como
sustrato, inicializado por la adición de H2O2 (del apartado 5.3), según León, (2008).
5.8 Ultrafiltración
Las muestras obtenidas se concentrarán pasando el filtrado con una bomba peristáltica
a través de un Pellicon Cassette System (Millipore Co. Massachusetts U.S.A.) de
ultrafiltración por flujo tangencial equipado con una membrana de filtración con
capacidad de corte de 10,000 daltones.
5.9 Liofilización
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Las muestras previamente filtradas (en gasa y algodón), así como clarificadas (por
centrifugación) y/o ultrafiltradas, se colocarán (200ml) en matraces Kitasato de 1 l.
Luego las muestras se congelarán en un baño que contenga hielo seco más acetona y
después se colocarán en una liofilizadora (previamente enfriada a –70ºC) de 12 a 14
horas. Terminado esto, el polvo obtenido, se resuspenderá en buffer acetato de sodio
100 mM pH 5.5 y se dializará en frío como se describió anteriormente. El filtrado será
dividido en alícuotas pequeñas que tengan de 5 a 6 unidades de actividad por mililitro
de filtrado y se almacenarán en tubos ependorff (1.5ml) a –20ºC para su uso posterior.
5.10 Electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE)
5.10.1 PAGE nativos y desnaturalizantes
Se harán electroforesis en geles discontinuos (gel separador pH 8.8 y gel concentrador
pH 6.8) de poliacrilamida (a distintas concentraciones) tanto nativos (no
desnaturalizantes) como desnaturalizantes como se ha descrito por Laemmli, (1970)
para la separación de proteínas basándose en su peso molecular.
5.10.2 PAGE de gradiente
Estos geles de poliacrilamida (en gradiente linear) serán usados para permitir una
separación amplia de proteínas.
VI. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
Descripción de las actividades a realizarcuatrimestre
1 2 3 4 5 6
Optativa IProbar diferentes medios de crecimiento (líquido y
sólido) para producción de xilanasa.
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Probar diferentes fuentes de carbono con
diferentes concentraciones.
Determinar perfil enzimático en medio líquido y sólido.
Optativa II
Determinar perfil enzimático por electroforesis.
Purificación enzimática.
Examen TOFEL
Publicación de artículo científico
Caracterización cinética (enzima pura)
Cálculo de Km, vmax, pH óptimoCálculo de temperatura óptima y energía de activación.
Tesis Secuenciación de la estructura putativa de la enzima. Establecimiento de las relaciones evolutivas de la proteína.
Examen pre doctoral
Seminario de investigación
VII. LITERATURA CITADA.
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