i

PRODUKSI BIOETANOL DARI LIMBAH TANAMAN JAGUNG MELALUI SAKARIFIKASI DAN FERMENTASI

SIMULTAN DENGAN KULTUR CAMPURAN Saccharomyces cereviseae DAN Pichia stipitis

SKRIPSI

SMUNINDAR F34060652

FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR 2010

ii

BIOETHANOL PRODUCTION USING HYDOLIZED WASTES OF CORN PLANT BY A SIMULTANAEOUS SACCHARIFICATION AND

FERMENTATION BY MIXED CULTURES OF Saccharomyces cerevisiae AND Pichia stipitis

Anas Miftah Fauzi and Smunindar

Department of Agricultural Industry Technology, Faculty of Agricultural Technology, Bogor Agricultural University, IPB Darmaga Campus, Bogor,

West Java, Indonesia. Email: smun_as@yahoo.com

ABSTRACT

Corn crop waste as a lignocellulosic material has a large potential in Indonesia. Lignocellulosic material is a renewable raw material for ethanol production. Most of the composition of lignocellulisic materials consist of cellulose, hemicellulose, and lignin. Cellulose hydrolysis will produce glucose that can be fermented into ethanol by Saccharomyces cereviseae. Hemicellulose hydrolysis will produce xylose. Sacharomyces cerevisiae is the most applied and traditional microorganism for ethanol production. It has a high ethanol tolerance, and high yields and rates of fermentation, but its inability to ferment xylose, the second most abundant sugar in nature, limits its use in biofuel production. This study applies simultaneous saccharification and fermentation techniques to the production of ethanol from corn crop waste materials using a culture volume Saccharomyces ceseviseae, Pichia stipitis, and mixed culture of Saccharomyces cereviseae and Pichia stipitis.Simultaneous saccharification and fermentation with individual yeasts Pichia stipitis shows the best results with high ethanol at 5.84 g/l and yield 0.11. Saccharomyces cereviseae and Pichia stipitis mixtures with etnanol 4.34 g/l and yield 0.10, and Saccharomyces cereviseae at least with the results 3.79 g/l ethanolo and yield 0.07 at the time of 96 hours. The results of this study indicate that at 96 hours of mixed culture of Saccharomyces cereviseae and Pichia stipitis not improve the performance their single culture. Further research still needs to be done by optimizing the ratio and between the two yeasts and sequence inoculation.

Keyword: bioethanol, corn, simultanaeous saccharification and fermentation

iii

SMUNINDAR. F34060652. Produksi Bioetanol dari Limbah Tanaman Jagung Melalui Sakarifikasi dan Fermentasi Simultan dengan Kultur Campuran Saccharomyces cereviseae dan Pichia stipitis. Dibawah bimbingan Anas Miftah Fauzi. 2010.

RINGKASAN

Potensi limbah tanaman jagung sebagai bahan lignoselulosa cukup besar di Indonesia. Bahan lignoselulosa merupakan bahan baku terbarukan untuk pembuatan etanol. Komposisi terbesar bahan lignoselulosa terdiri dari selulosa, hemiselulosa, dan lignin. Hidrolisis selulosa akan menghasilkan monomer gula glukosa yang dapat difermentasi oleh Saccharomyces cerevisiae menjadi etanol. Hidrolisis hemiselulosa akan menghasilkan xilosa. Saccharomyces cerevisiae merupakan khamir yang paling banyak digunakan oleh industri etanol karena memiliki daya tahan yang kuat terhadap etanol hasil fermentasi. Namun, Saccharomyces cerevisiae tidak dapat mengubah xilosa menjadi etanol. Pichia stipitis dapat memfermentasi xilosa menjadi etanol dengan hasil yang cukup tinggi tetapi memiliki daya tahan yang rendah terhadap etanol, yaitu pada konsentrasi antara 30 g/l hingga 35 g/l yang akan menghambat aktivitasnya.

Penelitian ini menggunakan bahan baku limbah tanaman jagung jagung (daun, batang, kelobot, dan tongkol) dengan metode sakarifikasi dan fermentasi simultan pada perlakuan menggunakan kultur Saccharomyces cerevisiae, kultur Pichia stipitis, dan kultur campuran Saccharomyces cerevisiae dan Pichia stipitis. Metode penelitian terdiri dari penelitian pendahuluan dan penelitian utama. Penelitian pendahuluan terdiri dari persiapan bahan awal dan persiapan kultur. Persiapan bahan awal meliputi delignifikasi limbah tanaman jagung 40 mesh dengan Ca(OH)2, hidrotermolisis pada suhu 121oC selama dua jam, hidrotermolisis pada suhu 180oC selama 20 menit, pengeringan, dan prehidrolisis dengan penambahan enzim selama 24 jam. Penelitian utama dengan metode sakarifikasi dan fermentasi simultan, yaitu pemasukan enzim dan kultur pada waktu yang sama.

Dari hasil analisa pada waktu 4 hari didapatkan hasil etanol pada kultur Pichia stipitis sebesar 5.84 g/l dengan yield 0.11, kultur campuran sebanyak 4.34 g/l etanol dengan yield 0.10 dan kultur Saccharomyces cereviseae paling sedikit hasilnya sebesar 3.79 g/l etanol dengan yield sebesar 0.7 pada waktu 96 jam. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa pada waktu 96 jam kultur campuran Saccharomyces cereviseae dan Pichia stipitis tidak meningkatkan kinerja kultur tunggal Saccharomyces cereviseae. Penelitian lebih lanjut masih perlu dilakukan dengan mengoptimalkan nisbah dan antara kedua khamir dan urutan inokulasinya.

iv

PRODUKSI BIOETANOL DARI LIMBAH TANAMAN JAGUNG MELALUI SAKARIFIKASI DAN FERMENTASI

SIMULTAN DENGAN KULTUR CAMPURAN Saccharomyces cereviseae DAN Pichia stipitis

SKRIPSI Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

SARJANA TEKNOLOGI PERTANIAN pada Departemen Teknologi Industri Pertanian,

Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor

Oleh SMUNINDAR

F34060652

FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR 2010

v

Judul Skripsi : Produksi Bioetanol dari Limbah Tanaman Jagung Melalui Sakarifikasi dan Fermentasi Simultan dengan Kultur Campuran Saccharomyces cereviseae dan Pichia stipitis

Nama : Smunindar NRP : F34060652

Tanggal Lulus : 15 November 2010

vi

PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI

Saya menyatakan dengan sebenar-benarnya bahwa skripsi dengan judul Produksi Bioetanol dari Limbah Tanaman Jagung Melalui Sakarifikasi dan Fermentasi Simultan dengan Kultur Campuran Saccharomyces cereviseae dan Pichia stipitis adalah hasil karya saya sendiri dengan arahan Dosen Pembimbing Akademik dan belum diajukan dalam bentuk apapun pada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun yang tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan pada daftar pustaka di bagian akhir skripsi ini.

Bogor, November 2010

Yang memberi pernyataan,

Smunindar

F34060652

vii

© Hak cipta milik Smunindar, tahun 2010 Hak cipta dilindungi

Dilarang mengutip dan memperbanyak tanpa izin tertulis dari Institut Pertanian

Bogor, sebagian atau seluruhnya dalam bentuk apapun, baik cetak, fotokopi, mikrofilm, dan sebagainya

viii

BIODATA PENULIS

Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 7 Maret 1988. Penulis adalah

anak ketiga dari tiga bersaudara dari pasangan Aryadi dan Martha

Diansyah. Pada tahun 2000, penulis menyelesaikan pendidikan sekolah

dasar di SDN Bambu Kuning, Bogor. Penulis menyelesaikan pendidikan

sekolah menengah pertama di SLTPN 7 Bogor pada tahun 2003.

Kemudian penulis melanjutkan pendidikan di SMAN 3 Bogor dan lulus

pada tahun 2006.

Penulis melanjutkan pendidikan di Perguruan Tinggi Negeri, Institut Pertanian Bogor

pada tahun 2006 melalui jalus USMI (Undangan Seleksi Masuk IPB). Karena IPB saat itu sedang

menerapkan Kurikulum Pendidikan Mayor-Minor, maka penulis belum mendapatkan jurusan pada

tahun pertama. Setelah memasuki tahun kedua, melalui proses seleksi, akhirnya penulis diterima di

Departemen Teknologi Industri Pertanian, Fakultas Teknologi Pertanian. Selama kuliah di IPB,

penulis pernah menjadi asisten praktikum mata kuliah Penerapan Komputer periode 2007/2008.

Penulis juga aktif dalam organisasi kemahasiswaan dengan menjadi pengurus Himpunan

Mahasiswa Teknologi Industri pada tahun 2007/2008 sebagai Staff Departemen Profesi serta

menjadi panitia dalam beberapa acara.

Penulis melaksanakan praktek lapang pada tahun 2009 dengan topik “Mempelajari

Manajemen Produksi di Pabrik Gula Kebon Agung, Malang”. Untuk menyelesaikan tugas akhir,

penulis melakukan penelitian yang dituliskan dalam skripsi “Produksi Bioetanol dari Limbah

Tanaman Jagung Melalui Sakarifikasi dan Fermentasi Simultan dengan Kultur Campuran

Saccharomyces cereviseae dan Pichia stipitis”.

iii

KATA PENGANTAR

Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT karena dengan rahmat dan tuntunan-Nya penulis dapat menyelesaikan skripsi “Produksi Bioetanol dari Limbah Tanaman Jagung Melalui Sakarifikasi dan Fermentasi Simultan Dengan Kultur Campuran Saccharomyces cerevisiae dan Pichia stipitis” ini dengan baik. Penulis sepenuhnya menyadari bahwa penulisan skripsi ini tidak akan selesai tanpa adanya dukungan secara moril maupun materil dari semua pihak. Oleh karena itu, dalam kesempatan ini penulis mengucapkan terimakasih kepada:

1. Kedua Orang tua dan Kakak penulis atas doa, kasih sayang dan dukungan yang sangat berarti bagi penulis.

2. Dr. Ir. Anas Miftah Fauzi. M, Eng sebagai dosen pembimbing yang memberikan segala bimbingan, kebijakan, ilmu, dan kelancaran yang selalu diberikan.

3. Seluruh dosen dan laboran Teknologi Industri Pertanian atas segala ilmu yang telah diberikan.

4. Bapak Wagiman dan Tim bioetanol limbah tanaman jagung (Kak Arif, Laura Surya, Rizka Ardhiyana, Sandra, Kirana Sanggrani, Dyanza Arya, dan Indah) yang membantu selama penelitian.

5. Seluruh pihak yang telah membantu dalam pelaksanaan penelitian dan pembuatan skripsi ini.

Penulis menyadari bahwa dalam penulisan skripsi ini penulis tidak luput dari kesalahan yang manusiawi. Oleh karena itu, penulis sangat mengharapkan saran, masukan, maupun kritik agar skripsi ini dapat mendekati kesempurnaan. Semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi penulis maupun semua pihak yang memerlukannya.

Bogor, November 2010

Penulis

iv

DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR ............................................................................................................................. i

DAFTAR GAMBAR ............................................................................................................................. vi

DAFTAR LAMPIRAN ........................................................................................................................ vii

I. PENDAHULUAN ......................................................................................................................... 1

A. LATAR BELAKANG ............................................................................................................... 1

B. TUJUAN ................................................................................................................................... 2

II. TINJAUAN PUSTAKA .................................................................................................................... 3

III. BAHAN DAN METODE ............................................................................................................... 12

A. BAHAN DAN ALAT.............................................................................................................. 12

B. METODE PENELITIAN ........................................................................................................ 12

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ...................................................................................................... 15

1. PENELITIAN PENDAHULUAN ........................................................................................... 15

2. PENELITIAN UTAMA .......................................................................................................... 17

a. Persiapan Kultur Media Fermentasi .................................................................................... 17

b. Total Gula Pereduksi Terkonversi ....................................................................................... 17

c. Hasil Etanol ......................................................................................................................... 19

d. Total Biomassa Akhir ......................................................................................................... 20

e. Pemanfaatan Substrat menjadi Etanol ................................................................................. 21

V. KESIMPULAN DAN SARAN ....................................................................................................... 23

A. KESIMPULAN ....................................................................................................................... 23

B. SARAN ................................................................................................................................... 23

DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................................................... 24

LAMPIRAN ......................................................................................................................................... 24

v

DAFTAR TABEL

Tabel 1. Komposisi Kimia Limbah Tanaman Jagung .......................................................................... 15 Tabel 2. Perubahan Komposisi Kimia Bahan Baku.............................................................................. 16 Tabel 3. Perhitungan sel inokulum ....................................................................................................... 17 Tabel 4. Hasil etanol pada sakarifikasi dan fermentasi simultan .......................................................... 19 Tabel 5. Biomassa Hasil SSF pada waktu 96 jam ................................................................................ 20 Tabel 6. Perbandingan parameter akhir hasil fermentasi ...................................................................... 21

vi

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Struktur biomassa lignoselulosa .......................................................................................... 4 Gambar 2. Kopolimerisasi conyfeyl ferulate dengan monolignol pada struktur lignin dengan yang

siap diputus oleh penanganan alkalin ................................................................................... 5 Gambar 3. Struktur Lignoselulosa sebelum dan sesudah penanganan ................................................... 6 Gambar 4. Skema Hidrolisis enzim Selulosa .......................................................................................... 9 Gambar 5. Pemutusan xilan oleh A) endoxilanase dan B) β-xilosidase .............................................. 10 Gambar 6. Reaksi Pentose Metabolisme dan Entner Doudroroff Pathway ......................................... 10 Gambar 7. Diagram prapenanganan bahan ........................................................................................... 13 Gambar 8. Gula pereduksi yang terkonversi selama SSF .................................................................... 18 Gambar 9. Hasil etanol pada sakarifikasi dan fermentasi simultan ...................................................... 19

vii

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1.Tatacara karakterisasi limbah tanaman jagung (Konversi Biomassa-UPT Biomaterial-LIPI).............................................................................................................. .................... 26

Lampiran 3. Analisis Fermentasi .......................................................................................................... 28 Lampiran 4. Hasil Uji Etanol ................................................................................................................ 29 Lampiran 5. Total Gula Pereduksi Terkonversi .................................................................................... 29 Lampiran 6. Uji Analisis Ragam Klasifikasi Satu-Arah terhadap Y(p/s) pada 96 jam. ........................ 30 Lampiran 7. Uji Analisis Ragam Klasifdikasi Satu-Arah terhadap Y(x/s) pada 96 jam. ...................... 31

1

I. PENDAHULUAN

A. LATAR BELAKANG

Konsumsi energi yang semakin meningkat seiring dengan bertambahnya penduduk dan laju pertumbuhan ekonomi menyebabkan terjadinya kenaikan harga bahan bakar. Kenaikan tersebut disebabkan karena menipisnya sumber minyak bumi di Indonesia. Oleh karena itu diperlukan bahan bakar alternatif dengan bahan baku terbarukan. Dalam pengembangan energi terbarukan ini memiliki beberapa kendala, diantaranya adalah ketersediaan bahan, keamanan pasokan, harga, kemudahan penanganan dan penggunaannya.

Etanol merupakan salah satu bahan bakar alternatif yang mempunyai kelebihan dibandingkan BBM. Berdasarkan siklus karbon, etanol dianggap lebih ramah lingkungan karena CO2 yang dihasilkan oleh hasil buangan mesin akan diserap oleh tanaman. Selanjutnya tanaman tersebut digunakan sebagai bahan baku pembuatan bahan bakar mesin, dan seterusnya sehingga tidak terjadi akumulasi karbon di atmosfer seperti yang ditimbulkan oleh penggunaan minyak bumi sebagai bahan bakar. Keunggulan lainnya adalah etanol mempunyai angka oktan tinggi (118) dan digunakan sebagai pengganti Metil Tersier-Butil Eter (MTBE). Etanol dapat juga meningkatkan efisiensi pembakaran karena mengandung 35% oksigen dan ramah lingkungan karena emisi gas buangnya seperti kadar karbon monoksida, nitrogen oksida, dan gas-gas lain rendah (19-25%).

Berdasarkan sumbernya, etanol terdiri dari etanol sintesis dan bioetanol. Etanol sintesis sering disebut metanol atau metil alkohol berasal dari sintesa kimia etilen, salah satu turunan dari minyak bumi atau batubara. Bioetanol diperoleh melalui proses biologi dari biomassa. Bahan baku bioetanol berasal dari bahan berbasis pati, gula, dan selulosa. Bahan berbasis pati dan gula sulit diterapkan karena bahan tersebut digunakan juga sebagai bahan pangan. Bahan berlignoselulosa dapat berasal dari limbah pertanian seperti tanaman jagung, jerami padi, ampas tebu, onggok (limbah tapioka), batang pisang, serbuk gergaji dan lain-lain. Salah satu yang prospektif adalah limbah tanaman jagung. Tanaman jagung tersusun sebagian besar oleh batang, daun, tongkol, kelobot, dan biji jagung. Tanaman jagung yang dipanen hanya diambil bijinya saja, sedangkan bagian lainnya hanya dimanfaatkan untuk pakan ternak bahkan dibiarkan mengering dan dibuang oleh petani. Tanaman jagung merupakan bahan lignoselulosa yang tersusun atas lignin, selulosa, hemiselulosa, dan zat ekstraktif lainnya. Komponen yang dapat dimanfaatkan untuk etanol adalah selulosa dan hemiselulosa.

Selulosa merupakan polimer gula tersusun atas monomer-monomer glukosa yang membentuk serat. Hemiselulosa tersusun atas berbagai jenis monomer gula seperti xilosa, arabinosa, glukosa, rhamnose, galaktosa, dan mannosa. Komponen terbesar hemiselulosa adalah xilosa. Saccharomyces cerevisiae dapat mengkonversi glukosa menjadi etanol, tetapi tidak dapat mengkonversi xilosa. Pichia stipitis dapat mengkonversi glukosa dan xilosa menjadi etanol tetapi daya tahan terhadap rendah.

Penelitian ini membandingkan kemampuan kultur tunggal Saccharomyces cerevisiae, Pichia stipitis dan kultur campuran kedua mikroba tersebut dalam produksi etanol melalui sakarifikasi dan fermentasi simultan dengan substrat hidrolisat limbah tanaman jagung Sakarifikasi dan fermentasi simultan merupakan metode yang menggabungkan dua tahap, yaitu

2

sakarifikasi dan fermentasi menjadi satu tahap yang bertujuan untuk mempersingkat waktu proses dan meningkatkan rendemen etanol (Chun, 2008).

B. TUJUAN

Tujuan penelitian ini adalah: 1. Memanfaatkan limbah tanaman jagung sebagai sumber karbon pada pembuatan etanol. 2. Membandingkan hasil etanol dari kultur Saccharomyces cerevisiae, Pichia stipitis, dan

campurannya.

3

II. TINJAUAN PUSTAKA

A. Lignoselulosa

Pada serat-serat alami, selulosa dapat beasosiasi secara erat dengan lignin dan hemiselulosa sehingga disebut sebagai holoselulosa atau lignoselulosa (Judoamidjojo, 1989). Selulosa adalah polimer monomer D-glukopyranosa yang membentuk rantai linear oleh ikatan β-1,4-glikosidik. Selulosa bersifat kristalin, tidak mudah larut dalam air, dan resisten terhadap depolimerisasi (Iborra dalam Duque, 2009).

Selulosa merupakan komponen utama penyusun dinding sel tanaman, berupa polimer glukosa dengan ikatan β-1,4 glukosida dalam rantai lurus yang terhubung secara bersama melalui ikatan hidrogen dan gaya van der Waals. Ikatan hidrogen yang menyusun rantai panjang selulosa dengan kuat membentuk struktur kristalin, yang akan menghambat pemecahan menjadi glukosa Kandungan selulosa pada dinding sel tanaman tingkat tinggi sekitar 35-50% dari berat kering tanaman (Wyman, 1999; Lynd dalam Jacques et al, 2003).

Hemiselulosa adalah polisakarida yang mempunyai berat molekul lebih kecil dari selulosa. Molekul hemiselulosa lebih mudah menyerap air, bersifat plastis dan mempunyai permukaan kontrol antar molekul yang lebih luas dibanding dengan selulosa. Rantai amorf hemiselulosa terdiri dari berbagai macam jenis gula, diantaranya arabinosa, galaktosa, glukosa, manosa, dan xilosa. komponen lainnya adalah asam asetat. Ikatan hemiselulosa lebih mudah diputus menjadi komponen yang lebih kecil dibandingkan dengan selulosa (Judoamidjojo, 1989;Wyman, 1999)

Lignin adalah molekul komplek yang tersusun dari unit phenylphropane yang terikat di dalam struktur tiga dimensi. Lignin merupakan material yang paling kuat di dalam biomassa. Lignin sangat resisten terhadap degradasi, baik secara biologi, enzimatis, maupun kimia. Kandungan karbon yang relative tinggi dibandingkan dengan selulosa dan hemiselulosa sehingga lignin memiliki kandungan energi yang tinggi (Parisi, 1989).

Unit-unit phenylphropane diikat dengan ikatan C-O-C dan C-C yang tidak dapat dikonversi menjadi monomernya tanpa mengalami perubahan pada bentuk dasarnya. Lignin melindungi selulosa sehingga bersifat tahan terhadap hidrolisis disebabkan adanya ikatan arialkil dan ikatan eter. Pada suhu tinggi, lignin dapat mengalami perubahan struktur dengan membentuk asam format, metanol, asam asetat, aseton, vanilin, dan lain-lain sedangkan bagian lainnya mengalami kondensasi. Lignin sulit didegradasi karena strukturnya yang kompleks dan heterogen yang berikatan dengan selulosa dan hemiselulosa dalam jaringan tanaman. Lebih dari 30% tanaman tersusun atas lignin yang memberikan bentuk yang kokoh dan memberikan proteksi terhadap serangga dan patogen, membentuk ikatan yang kuat dengan polisakarida yang melindungi polisakarida dari degradasi mikroba dan membentuk struktur lignoselulosa (Judoamidjojo, 1989).

Biomassa juga mengandung komponen minor yang diklasifikasikan sebagai zat ekstraktif dan abu. Air atau ekstraktif alkohol dapat menjadi lemak, protein, pati, monomer gula, getah, resin, minyak esensial, dan lain-lain. Abu adalah material inorganik tanaman yang diperoleh dari tanah untuk pertumbuhan tanaman. (Duque, 2009).

Holoselulosa dan lignin dalam tanaman mengandung ekstraktif (larut dalam air atau pelarut organik) dan non ekstraktif pada dinding sel tanaman. Non ekstraktif terutama komponen seperti silika dan garam alkali tetapi juga mengandung pektin, protein, dan pati. Komponen non ekstraktif mengandung lebih dari 10% Ca, Mg, dan K merupakan komponen inorganik terbesar

4

dalam lignoselulosa (Saka dalam Klinke, 2004). Biomassa memiliki kadar abu dibawah 1% terdiri dari bahan ekstraktif seperti resin, tarpen, fenol, quinon, dan tanin. Bahan ekstraktif pada tanaman bermanfaat sebagai pelindung biologi anti mikroba (Torseell dalam Klinke, 2004).

Gambar 1. Struktur biomassa lignoselulosa (Iborra dalam Duque, 2009)

B. Tanaman Jagung

Tanaman jagung (Zea mays L) termasuk ke dalam famili rumput-rumputan yang memiliki klasifikasi sebagai berikut: Kingdom : Plantae (tumbuh-tumbuhan) Divisi : Spermatophyta (tumbuhan berbiji) Sub Divisi : Angiospermae (berbiji tertutup) Kelas : Monocotyledone (berkeping satu) Ordo : Ginae (rumput-rumputan) Famili : Ginaceae Genus : Zea Spesies : Zea mays L.

Batang jagung memiliki kandungan 42% selulosa, 39% hemiselulosa, dan 14% lignin (Jacques et al., 2003). Tongkol jagung memiliki kandungan 45% selulosa, 35% hemiselulosa, dan 15% lignin (Prasad, 2006).

C. Prapenanganan Bahan

Hambatan dalam memproduksi etanol dari lignoselulosa adalah sulitnya memutuskan ikatan selulosa menjadi monomer gula. Lignoselulosa tidak dapat langsung dihidrolisis sehingga diperlukan prapenanganan bahan terlebih dahulu. Prapenanganan bahan, hidrolisis enzim, dan fermentasi merupakan langkah utama untuk memproduksi etanol dari lignoselulosa. Prinsip prapenanganan bahan adalah merusak lapisan lignin, merusak struktur kristalin selulosa dan memperluas permukaan selulosa sehingga polisakarida mudah dihidrolisis enzim. Proses ini

5

biasanya menggunakan asam atau pemanasan dengan air menggunakan suhu diatas 150oC dengan tekanan 0,1 hingga 25 MPa (Duque, 2009).

Delignifikasi dengan kapur merupakan proses yang banyak digunakan karena memiliki kelebihan dibandingkan dengan penanganan yang lain, diantaranya biaya operasi rendah, mengurangi degradasi holoselulosa dan penyusun lain sabagai inhibitor proses selanjutnya. Mekanismenya adalah mendegradasi ikatan ester dan memecah ikatan glikosidik dalam matriks dinding sel, mereduksi susunan lignin-hemiselulosa, dan mengembangkan selulosa (Bobleter dalam Duque, 2004).

Pada proses ini terjadi pemutusan ikatan ester untuk depolimerisasi lignin, peningkatan daya serap lignin untuk ionisasi asam ferulic dan berkurangnya sifat lekat lignin sehingga ferulate dapat digunakan sebagai inisiasi untuk polimerisasi. Setelah itu lignin terdegradasi. Penghilangan lignin dan reduksi kristalinitas selulosa dan meningkatkan porositas dalam prapenanganan dapat meningkatkan hidrolisis dengan cepat (McMillan dalam Duque, 1994).

Gambar 2. Kopolimerisasi conyfeyl ferulate dengan monolignol pada struktur lignin dengan yang siap diputus oleh penanganan alkalin (Grabber et al.,2008)

Prapenanganan bahan memiliki beberapa syarat, yaitu meningkatnya pembentukan gula

yang dapat digunakan dalam hidrolisis enzim, mengurangi degradasi atau kehilangan karbohidrat, menghilangkan produk samping yang dapat menghambat dalam proses hidrolisis dan fermentasi selanjutnya, dan memiliki biaya yang efektif (Sun dan Cheng, 2002).

6

Gambar 3. Struktur Lignoselulosa sebelum dan sesudah penanganan (Hector et al., 2008)

Proses prapenanganan lignoselulosa untuk memperluas area selulosa dan degradasi

lignin terdiri dari proses mekanik dengan gabungan proses pemotongan dan penggilingan, pirolisis, energi radiasi tinggi, penguapan tekanan tinggi, hidrolisis asam, perlakuan gas (klorin dioksida, nitrogen dioksida, sulfur dioksida, ozon), perlakuan hidrogen peroksida, hidrotermolisis, dan perlakuan biologis (Sun dan Cheng, 2002).

Perlakuan dengan air panas atau hidrotermolisis merupakan penanganan dengan teknik ramah lingkungan. Metode penanganan dengan air panas menggunakan tekanan tinggi yaitu memanaskan air dengan rasio 1:10 (w/v) lignoselulosa dan air. Setelah itu dicampur dan dipanaskan pada suhu 160-200oC selama 10 menit. Metode ini dapat digunakan untuk ekstraksi bahan organik tanpa menggunakan pelarut organik yang tidak ramah lingkungan (Yoswathana et al., 2010). Bobleter dalam Duque (2009) menyatakan bahwa mekanisme degradasi selulosa dengan hidrotermolisis pada suhu 215-219oC sama dengan menggunakan metode hidrolisis asam dengan reaksi yang lebih lambat. Meskipun demikian, kondisi tersebut akan menyebabkan degradasi glukosa sehingga suhu yang sangat tinggi tidak menguntungkan dalam metode ini.

D. Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces berasal dari bahasa latin Yunani yang berarti “gula-jamur” sedangkan cerevisiae memiliki arti “bir” yang biasa digunakan untuk pembuatan bir dan roti.

Kingdom : Fungi Phylum : Ascomycota Subphylum : Saccharomycotina Class : Saccharomycetes Order : Saccharomycetales Family : Saccharomycetaceae Genus : Saccharomyces Species : S. cerevisiae

7

Saccharomyces cerevisiae merupakan sel eukariotik spesies dari tunas ragi yang berbentuk bulat sekitar 5-10 mikrometer yang dapat tumbuh secara aerobik pada glukosa, maltosa, dan trehalosa namun gagal tumbuh pada laktosa dan selobiosa. Kemampuan ragi ini tergantung pada kondisi apakah sudah dewasa aerobik atau anaerobik. Semua strain ragi dapat memanfaatkan ammonia dan urea sebagai satu-satunya sumber nitrogen, tetapi tidak dapat memanfaatkan nitrat. Persyaratan lain yang diperlukan untuk pertumbuhan ragi adalah fosfor, belerang, magnesium, besi, kalsium, dan seng. Pertumbuhan ragi mencapai ukuran dewasa pada saat memisahkan sel dari induknya dengan waktu generasi pendek yang membutuhkan waktu mengganda sekitar 1,5-2 jam dengan suhu 30oC. Saat ini Saccharomyces cerevisiae sering digunakan untuk memproduksi etanol secara fermentasi karena dapat menghasilkan etanol dalam jumlah besar dan mempunyai nilai toleransi terhadap alkohol yang tinggi. Khamir ini dapat tumbuh dalam media dengan aw terendah 0.88-0.94 dan pada kisaran suhu 25-300C atau 35-470C serta pH 4-4.5. Untuk khamir fermentatif hidup pada kondisi yang anaerobik, Saccharomyces cerevisiae dapat mengubah sistem metabolismenya dari jalur fermentatif menjadi oksidatif (Fardiaz, 1989).

Saccharomyces cereviciae merupakan salah satu spesies khamir yang memiliki daya konversi gula menjadi etanol sangat tinggi. Mikroba ini biasanya dikenal dengan baker’s yeast dan metabolismenya telah dipelajari dengan baik. Produk metabolik utama adalah etanol, CO2 dan air sedangkan beberapa produk lain dihasilkan dalam jumlah sangat sedikit. Selama proses fermentasi akan timbul panas, apabila tidak dilakukan pendinginan, suhu akan makin meningkat sehingga proses fermentasi terhambat (Oura dalam Subekti, 2006). Saccharomyces cerevisiae dapat mengubah glukosa, manosa, dan galaktosa menjadi etanol. Khamir ini memiliki daya, tingkat dan rendemen etanol yang tinggi tetapi tidak mampu memfermentasi xilosa yang merupakan jenis gula terbesar kedua di alam. (Rouhoullah et al., 2006; Kotter dan Ciriacy, 1993).

Pada penelitian Subekti (2006), penyegaran kultur dilakukan pada media padat PDA (Potato Dextrose Agar) yang diinokulasikan secara aseptis kemudian diinkubasi pada suhu 30oC selama 48 jam. Setelah itu diinokulasikan pada media cair PDB (Potato Dextrose Broth) kemudian diinkubasi menggunakan inkubator goyang pada suhu 30oC selama 24 jam.

E. Pichia stipitis

Pichia stipitis merupakan spesies dari khamir yang ditemukan pada bagian tubuh rayap. Khamir ini memiliki kemampuan fermentasi dalam kondisi aerobik dan anaerobik. Klasifikasi Pichia stipitis menurut Pignal dalam Jeffries et al (2007) adalah sebagai berikut:

Kingdom : Fungi Divisi : Ascomycota Kelas : Saccharomycetes Ordo : Saccharomycetales Famili : Saccharomycetaceae Genus : Pichia Spesies : Pichia stipitis Beberapa mikroorganisme seperti Pichia stipitis dan Candida shehateae dapat

memfermentasi xilosa dan bebereapa heksose lainnya dengan rendemen dan kecepatan yang

8

relative tinggi, tetapi memiliki ketahanan etanol yang rendah dan konsentrasi etanol di atas 30 sampai 35 g per liter mengurangi reaksinya (Laplace dalam Rouhoullah, 2007).

Pichia stipitis merupakan salah satu kapang yang terisolasi dari pembusukan kayu oleh serangga. Mikroorganisme ini memiliki kemampuan untuk mengkonversi selulosa dan hemiselulosa menjadi monomer gula (Jeffries et al dalam Agbogbo, 2008). Pichia stipitis dapat memfermentasi glukosa, xilosa, manosa, galaktosa, dan selobiosa menjadi etanol dalam kondisi anaerobik dengan xilitol sebagai produk samping Pichia stipitis dapat bekerja pada afinitas rendah dan tinggi afinitas pada sistem transport proton. Sistem transport dengan afinitas yang rendah terjadi ketika konsentrasi gula tinggi, sedangkan afinitas tinggi terjadi ketika konsentrasi gula rendah. Pada sistem transpor dengan rendah afinitas, glukosa akan menghambat transpor xilosa sehingga pada kondisi ini konsentrasi gula yang digunakan rendah (Killian dan Uden, 1988). Pichia stipitis lebih menyukai glukosa untuk produksi etanol sehingga jumlah pemanfaatan glukosa lebih besar dibandingkan dengan xilosa pada media yang mengandung glukosa dan xilosa (Agbogbo, 2008).

Pichia stipitis dapat tumbuh pada suhu 30oC dalam media agar miring yang mengandung 10 g glukosa, 3 g ekstrak ragi, 3 g ekstrak malt, 5 g pepton, dan 20 g agar per liter dengan suhu optimal untuk fermentasi antara 25-33 oC dengan pH 4,5-5,5. Nutrisi yang berperan penting dalam pertumbuhannya adalah nitrogen, vitamin, asam amino, purin, dan pirimidin (Okur, 2006). Oksigen berperan penting dalam pertumbuhan sel, keseimbangan redoks, fungsi mitokondria, dan ketersediaan energi untuk transport xilosa (Skoog et al., 1990). Konsentrasi awal xilosa akan mempengaruhi parameter fermentasi dengan produktifitas etanol maksimum terjadi pada konsentrasi xilosa sebesar 50 g/l (Preez du dalam Agbogbo, 2008).

Etanol dapat merusak membran sel organisme dan menghilangkan energi proton di membran plasma yang akan meningkatkan keasaman sitoplasma dam kematian sel. Toleransi etanol menunjukkan hubungan korelasi dengan aktivitas ATPase membrane plasma. ATPase digunakan untuk transportasi proton melintasi membrane sel untuk mengurangi peningkatan keasaman sitoplasma (Meyrial et al., 1995). Produktifitas etanol akan terhambat pada saat konsentrasi awal xilosa antara 76-99 g/l dan kadar etanol akan menurun pada saat konsentrasi xilosa di atas 145 g/l (Roberto dalam Agbogbo, 2008).

F. Sakarifikasi dan Fermentasi Simultan

Sakarifikasi dan fermentasi simultan atau SSF merupakan metode produksi etanol dari biomassa yang mengkombinasikan hidrolisis enzim dan fermentasi menjadi satu tahap. Kelebihan SSF dibandingkan dengan sakarifikasi dan fermentasi terpisah adalah kesempatan kontaminasi lebih rendah, tekanan osmotik lebih rendah karena khamir akan mengurangi konsentrasi glukosa, membutuhkan enzim yang lebih sedikit, dan menggunakan energi yang efisien. Kekurangannya adalah adanya perbedaan suhu yang digunakan pada hidrolisis dan fermentasi dan hambatan dari selulase untuk menghasilkan enzim (Chun, 2008).

Selulase merupakan enzim kompleks yang terdiri dari eksoselulase atau eksobiohidrolase, endoselulase atau endo-β-1,4-glukanase dan β-1,4-glukosidase atau selobiase. Ekso- β-1,4 glukanase atau selobiohidrolase bekerja dengan cara melepas unit-unit selobiosa dari ujung rantai selulosa. Aktivitasnya sangat tinggi pada selulosa kristal tetapi sangat rendah pada selulosa amorf. Endo-β-1,4-glukanase mampu menghidrolisis selulosa secara acak menghasilkan selodextrin, selobiosa dan glukosa. Enzim ini sangat aktif memutus ikatan selulosa yang dapat larut (amorf) seperti karboksil metil selulosa (CMC). Enzim β -1,4- glukosidase atau selobiase

9

dapat menghidrolisis selobiosa dan selo-oligomer pendek lainnya untuk menghasilkan glukosa (Anindyawati, 2009)

Pada sakarifikasi dan fermentasi terpisah, hidrolisis enzim akan terhambat setelah terpecahnya gula terutama selobiosa dan glukosa. Pada saat konsentrasi selobiosa dalam cairan sebesar 6 g/l, aktivitas selulase akan berkurang menjadi 60%. Glukosa akan mengurangi aktivitas β-glukosidase. Pada konsentrasi glukosa sebesar 3 g/l, aktivitas β-glukosidase berkurang menjadi 75% (Philippidis dan Smith dalam Taherzadeh dan Karimi, 1995).

Tahap hidrolisis selulosa terdiri dari adsorpsi pada permukaan selulosa, biodegredasi selulosa untuk fermentasi gula dan disorpsi ke dalam permukaan selulase. Degradasi selulosa menjadi glukosa biasanya terjadi karena adanya aksi sinergi dari tiga jenis enzim, yaitu endo-glukonase dan ekso-glukanase yang tergabung menjadi enzim selulase, dan β-glukosidase (Wyman, 1996). Proses terjadinya pemecahan selulosa dapat dilihat pada gambar 5.

Gambar 4. Skema Hidrolisis enzim Selulosa (Sulzenbacher et al., 1997)

Pertama, endo-selulase akan memutuskan ikatan non kovalen dalam struktur kristalin

selulosa menjadi serat selulosa yang terpisah. Kemudian ekso-selulase memutuskan unit glukosa dari ujung non pereduksi pada rantai selulosa menjadi selobiosa dan glukosa (dimer dan glukosa). Enzim ini menyebabkan gula-gula reduksi meningkat dan menurunnya derajat polimerisasi perlahan-lahan. Selobiosa adalah disakarida yang terdiri atas dua molekul glukosa yang berikatan glikosidik antara atom karbon 1 dengan atom karbon 4 yang mempunyai efek inhibisi pada aktivitas ekso-selulase. Kemudian selobiosa dipecah menjadi unit glukosa oleh β-glukosidase. Enzim ini bukan bagian dari selulase tetapi fungsinya sangat penting untuk menyempurnakan depolimerisari selulosa menjadi glukosa (Taherzadeh dan Karimi, 2007).

Pada proses hidrolisa biomassa selulitik secara enzimatis, baik selulosa maupun hemiselulosa akan terhidrolisa dan menghasilkan senyawa gula, seperti xilosa dan glukosa. Hal ini disebabkan enzim selulase umumnya mempunyai aktivitas tehadap hemiselulosa (Judoamidjojo, 1989).

Pada hidrolisis xilan yang terdapat pada hemiselulosa terdapat beberapa langkah pemutusan yang dilakukan oleh enzim yang tergabung dalam kelompok enzim xilanase, yaitu 1,4-β-D-xylosidase atau endoxilanase, β-D-xylosidase atau xilosidase. Pertama, 1,4-β-D-xylosidase atau endoxilanase akan memutuskan xilan secara acak menjadi polimer-polimer yang lebih kecil, kemudian β-D-xylosidase atau xilosidase akan melepaskan unit xilosa dari polimer non reduksi.

10

Gambar 5. Pemutusan xilan oleh A) endoxilanase dan B) β-xilosidase (Goldman, 2009)

Pada fermentasi glukosa oleh Saccharomyces cerevisiae, terjadi proses sederhana

sebagai berikut: C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2 +2 ATP +5 Kkal

Setiap mol glukosa terfermentasi menghasilkan dua mol etanol, CO2, dan ATP. Oleh karena itu secara teoritis setiap g glukosa memberikan 0,5 g etanol. Pada kenyataannya etanol biasanya tidak melebihi 90-95% dari hasil teoritis. Hal itu disebabkan karena sebagian nutrisi digunakan untuk sintesa biomassa dan memelihara reaksi. Reaksi samping juga dapat terjadi yaitu terbentuknya gliserol dan suksinat yang dapat mengkonsumsi 4-5% substrat (Oura dalam Subekti, 2006).

Gambar 6. Reaksi Pentose Metabolisme dan Entner Doudroroff Pathway ( Zhang, 2003)

ADP

ATP

ADP

ATP

D-Xylose

Xylose Isomerase

D-Xylulose

Xylulokinase

D-Xylulose-5-P Ribulose-5-P Ribose-5-P

Sedoheptulose-7-P Glyceraldehyde-3-P

Ecythore-4-P Fructose-6-P

Glyceraldehyde-3-P

Fructose-6-P

Transketolase

Transaldolase

Transketolase

L-ribulose-%-P 4-epimerase

L-Ribulose-5-P

L-Ribulose

L-Arabinose

L-ribulokinase

L-arabinose isomerase

D-Glucose

Glucose 6-P

Gluconolactose 6-P

6-P-Gluconate

2-Keto-3-deoxy-6-P-Gluconate

Glyceraldehyde-3-P

1,3-P-Glycerate

3-P-Glycerate

2-P-Glycerate

Phospoenolpyruvate Pyruvate

Acetaldehyde+CO2

Etanol

ADP

ATP

11

Perbedaan proses utama fermentasi bahan selulosa dengan bahan baku pati adalah terletak pada penggunaan jumlah gula pentose yang relative lebih besar (lima karbon gula seperti xylose dan arabinosa) yang terdapat pada hemiselulosa. Proses fermentasi xilosa oleh Pichia stipitis adalah mengkonversi xilosa menjadi glukosa-6-P dan gliseraldehid-3-P kemudian melalui jalur Enter Doudroroff Pathway dikonversi menjadi etanol. Gula ini perlu difermentasi untuk membuat proses keseluruhan secara layak ekonomi (Eggeman dan Elander, 2005).

Dalam Rouhoullah et al. (2007), fermentasi campuran gula dengan kandungam glukosa 20 g/l dan xilosa 20 g/l, pada waktu 30 jam Pichia stipitis mengkonversi glukosa dengan Y (p/s) 0.41 dan Y (x/s) sebesar 0.13 sedangkan waktu fermentasi xilosa lebih lama, yaitu 60 jam dengan Y (p/s) sebesar 0.40 dan Y (x/s) sebesar 0,14 Saccharomyces cerevisiae hanya mengkonversi glukosa pada etanol pada selama 18 jam dengan Y(p/s) 0.40dan Y (x/s) 0,11.

Pada penelitian Marques et al (2008), pada proses sakarifikasi dan fermentasi terpisah (mengandung 56.2 g/l glukosa dan 12.9 g/l xilosa), xilosa mulai difermentasi 15 jam setelah konsentrasi glukosa berkurang menjadi 38 g/l dan kecepatan fermentasi xilosa lebih lambat daripada fermentasi glukosa. Sel khamir mengkonsumsi glukosa menjadi etanol pada waktu kurang dari 35 jam dengan hasil etanol sebanyak 0.25 g etanol/g total gula.

12

III. BAHAN DAN METODE

A. BAHAN DAN ALAT

1. Bahan

a. Bahan Baku

Bahan baku utama yang digunakan adalah batang, daun, kelobot, tongkol jagung yang telah dikeringkan dan digiling sebesar 40 Mesh. Tanaman jagung merupakan varietas Hawaii yang diperoleh dari daerah Sawah Baru, Dramaga Bogor. Enzim yang digunakan adalah enzim selulase, β-Glukosidase dan xilanase yang diperoleh dari LIPI Bogor. Mikroorganisme yang digunakan adalah Saccharomyces cerevisiae yang diperoleh dari Laboratorium Bioindustri Teknologi Pertanian IPB dan Pichia stipitis dari LIPI Bogor.

b. Bahan Penunjang

Bahan Penunjang pada penelitian ini digunakan untuk pengatur pH pada substrat, analisis bahan awal, dan analisis bahan akhir. Karakterisasi bahan terdiri dari alkohol-benzene, akuades, H2SO4 96%, H2SO4 72%, akuades dan aseton NaClO2 25%, NaOH 17.5%, dan asam asetat glasial 100%. Bahan pengatur pH substrat yaitu buffer asetat pH 4.8. Analisis akhir diantaranya total gula, gula pereduksi, dan biomassa. Analisis gula pereduksi dengan akuades dan larutan DNS.

2. Alat

Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain waterbath shaker, cleanbanch, autoklaf, spektofotometer, oven, pH-meter, timbangan analitik, erlenmeyer, tabung reaksi, gelas ukur, gelas piala, pipet, dan sebagainya.

B. METODE PENELITIAN

Penelitian ini dilakukan dengan dua tahap, yaitu penelitian pendahuluan dan penelitian

utama.

1. Penelitian Pendahuluan

Penelitian pendahuluan diantaranya adalah karakterisasi limbah tanaman jagung, dan prapenanganan bahan. Bahan awal dianalisis kadar air, abu, serat, karbohidrat dengan analisis proksimat. Selanjutnya dianalisis kadar lignin dengan H2SO4 72% (SNI 0492:2008), holoselulosa dengan NaClO2 (SNI 01-1303-1989), dan alfa selulosa dengan NaOH 17.5% (SNI 0444:2009). Prapenanganan limbah tanaman jagung terdiri dari delignifikasi, hidrotermolisis pada suhu 121oC, hidrotermolisis pada suhu 180oC, dan pengeringan.

Delignifikasi dilakukan dengan metode kimia, yaitu dengan menambahkan 0.07 g Ca(OH)2 dalam satu gram limbah tanaman jagung dan akuades sebanyak 10 ml per satu g limbah tanaman jagung, kemudian dipanaskan pada suhu 74.6 oC selama dua jam. Hasil delignifikasi disaring dan dicuci dengan akuades hingga pH menjadi netral. Hidrotermolisis I dilakukan dengan memanaskan air sebanyak 5 ml tiap satu gram bahan

13

pada suhu 121oC selama satu jam. Setelah itu hasil hidrotermolisis disaring, dicuci dengan air, dan disaring kembali agar sisa lignin dan bahan ekstraktif lainnya berkurang.Hidrotermolisis II dilakukan dengan memanaskan air sebanyak 5 ml tiap satu gram bahan pada suhu 180oC selama 20 menit. Hasil hidrotermolisis II disaring kemudian didapatkan cairan dan WIS (Water Insoluble Solid). WIS dikeringkan pada suhu 50oC selama 20 jam. Cairan dan WIS hasil hidrotermolisis II digunakan sebagai bahan baku untuk penelitian utama.

Limbah Tanaman Jagung (40 mesh)

DelignifikasiT: 74.6o C, t: 2

jam

Hidrotermolisis II(T: 180o C, t: 20 menit)

Pencucian

Hidrotermolisis I(T: 121o C, t: 1 jam)

Pencucian Air Cucian 1Akuades

Ca(OH)2 (0.073 g/g bahan

kering)Air dan Lignin

Akuades

Hidrolisat II

Air cucian 2 Akuades

Hidrolisat 1Akuades

(5 ml/g bahan kering)

Akuades(5 ml/g bahan

kering)

Water Insoluble Solid(WIS)

PengeringanT = 50o C

Gambar 7. Diagram prapenanganan bahan

2. Penelitian Utama

a. Persiapan Kultur

1) Saccharomyces cerevisiae

,Biakan murni Saccharomyces cerevisiae diremajakan pada agar miring media PDA (Potato Dexstrose Agar) sebanyak 24 g dalam satu liter akuades. Media dimasukkan ke dalam tabung reaksi masing-masing sebanyak 5 ml. Tabung reaksi disterilisasi pada suhu 121oC dan tekanan 1 atm selama 20 menit, kemudian

14

biakan murni Saccharomyces cerevisiae diinokulasi ke dalam media lalu diinkubasi pada suhu 30oC selama 48 jam.

Media inokulum yang digunakan adalah PDB (Potato Dextrose Broth) sebanyak 1.2 g dalam 50 ml akuades yang dimasukkan ke dalam erlenmeyer. Labu erlenmeyer ditutup dengan menggunakan kapas dan aluminium foil untuk selanjutnya dimasukkan ke dalam autoklaf dan disterilisasi pada suhu 121oC selama 15 menit. Kemudian biakan diinokulasikan ke dalam media cair dan diinkubasi pada suhu 30oC selama 24 jam.

2) Pichia stipitis

Biakan murni Pichia stipitis diremajakan dalam agar miring YMA (Yeast Maltose Agar) yang mengandung 4 g/l yeast ekstrak, 10 g/l malt ekstrak, 4 g/l glukosa, dan 20 g/l agar. YMA dimasukkan ke dalam tabung reaksi sebanyak 5 ml kemudian disterilisasi dalam autoklaf dengan suhu 121oC selama 15 menit. Media fermentasi yang digunakan mengandung 6.4 g urea, 1.2 g KH2PO4, 0.18 g Na2HPO2, 10 g yeast ekstrak dan 50 g D-xylosa dalam satu liter akuades dengan pH 4.5. Khamir diinkubasi pada suhu 30oC selama 24 jam.

b. Sakarifikasi dan Fermentasi Simultan

Hasil prapenanganan bahan, yaitu WIS sebanyak 6% (b/v) dicampur dengan 25 ml buffer asetat pH 4.8 dan 25 ml filtrat hidrotermolisis di dalam erlenmeyer 100 ml. Kemudian dilakukan prehidrolisis dengan enzim selulase 2.94 IU/g bahan kering, β-glukosidase sebanyak 0.24 IU/g bahan kering, dan enzim xilanase sebanyak 0.61 IU/g bahan kering pada suhu 50oC pada waterbath shaker selama 24 jam. Setelah itu dilakukan SSF dengan penambahan enzim selulase 2.94 IU/g bahan kering dan enzim xilanase sebanyak 0.61 IU/ml bahan kering, kultur sebanyak 10% (v/v), dan 0.2 ml larutan urea 24% diinkubasi pada suhu 32oC selama 96 jam. Setelah itu sampel dianalisis.

15

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

1. PENELITIAN PENDAHULUAN

a. Karakterisasi Bahan Baku

Bahan baku yang diperoleh adalah bagian-bagian tanaman jagung berupa batang, daun, tongkol, kelobot, dan bunga tanaman jagung. Bagian-bagian tersebut dikeringkan selama satu hari di bawah sinar matahari kemudian digiling dan dicampur. Komposisi kimia dari suatu bahan merupakan kandungan dalam zat bahan dan mempunyai fungsi tertentu di dalam suatu proses melibatkan bahan tersebut. Komposisi kimia bahan baku limbah tanaman jagung dari hasil uji proksimat dapat dilihat dalam tabel 1.

Tabel 1. Komposisi Kimia Limbah Tanaman Jagung

Komposisi Kimia Limbah Tanaman Jagung Air (% bb) 13.11 Abu (% bk) 2,00 Protein (% bk) 0.57 Lemak (% bk) 4.16 Serat Kasar (% bk) 27.21 Karbohidrat (% bk) 66.08

Dari tabel 1. Terlihat bahwa kandungan terbesar dalam limbah tanaman jagung adalah

karbohidrat dan serat kasar. Tingginya komponen tersebut menunjukkan bahwa bahan ini memiliki potensi sebagai bahan baku untuk pembuatan etanol. Karbohidrat dapat diklasifikasikan menjadi monosakarida, oligosakarida, dan polisakarida. Karbohidrat digunakan sebagai sumber karbon dalam fermentasi oleh khamir. Pada tabel terlihat bahwa karbohidrat dalam campuran tanaman jagung sebesar 66.08% sehingga memiliki potensi sebagai sumber etanol.

b. Prapenanganan Bahan Baku

Prapenanganan bertujuan menghilangkan ikatan struktur lignin, merusak struktur lignoselulosa sehingga proses hidrolisis lebih mudah dilakukan. Pada proses ini diperlukan bahan aditif dan energi, sedangkan keluarannya berupa uap, padatan, dan cairan. Prapenanganan diawali dengan delignifikasi menggunakan Ca(OH)2 pada suhu 74.6oC. Delignifikasi dengan kapur merupakan penanganan yang banyak digunakan karena memiliki kelebihan dibandingkan dengan penanganan yang lain, diantaranya biaya operasi rendah, mengurangi degradasi holoselulosa dan penyusun lain sabagai inhibitor proses selanjutnya. Mekanisme prapenanganan ini adalah mendegradasi ikatan ester dan memecah ikatan glikosidik dalam matriks dinding sel, mereduksi susunan lignin-hemiselulosa, dan mengembangkan selulosa (Bobleter dalam Duque, 2009).

Pada proses ini terjadi pemutusan ikatan ester untuk depolimerisasi lignin, peningkatan daya serap lignin untuk ionisasi asam ferulic dan berkurangnya sifat lekat lignin sehingga ferulate dapat digunakan sebagai inisiasi untuk polimerisasi kemudian lignin terdegradasi. Padatan hasil delignifikasi dihidrotermolisis dengan air panas yang berfungsi untuk merusak struktur lignoselulosa, mengurangi kristalinitas selulosa, mengurangi lignin dan zat ekstraktif. Penanganan selanjutnya dengan hidrotermolisis, penanganan ini tidak memerlukan daur ulang, biaya relatif lebih murah, dan dapat meminimalkan degradasi komponen gula menjadi furfural

16

sebagai degradasi gugus pentosa dan HMF sebagai degradasi gugus heksosa. Prapenanganan dengan hidrotermolisis dengan suhu 121oC yang dilanjutkan dengan pencucian berfungsi untuk melarutkan sebagian zat ekstraktif dan lignin sebagai penghambat fermentasi. Cairan hidrotermolisis dan hasil pencuciannya tidak dipakai pada proses selanjutnya.

Prapenanganan biomassa membutuhkan pencucian dengan air untuk menghilangkan bahan penghambat akibat pembentukan dari produk-produk degradasi yang akan menghambat pertumbuhan mikroba, hidrolisis enzim dan fermentasi (McMillan, 1994). Penggunaan air panas pada hidrotermolisis dapat menyebabkan perubahan ultrastruktur dan susunan pori berukuran mikron yang memperluas luas area untuk membuat selulosa dapat mudah dihidrolisis enzim (Zeng dalam Taherzadeh dan Karimi, 2007). Setelah itu dilakukan hidrotermolisis dengan suhu 180oC yang bertujuan untuk melarutkan hemiselulosa sehingga terlepas dari ikatannya. Dalam Taherzadeh dan Karimi (2007) cairan hasil prapenanganan pada 160oC dapat digunakan untuk proses hidrolisis enzim. Selain itu, sebagian lignin dan ekstraktif yang masih terdapat padatan juga dapat terlarut pada cairan hidrotemolisis.

Tabel 2. Perubahan Komposisi Kimia Bahan Baku

Kandungan Sebelum Prapenangan Bahan (% bahan

kering)

Sesudah Prapenangan Bahan (% bahan kering)

Selulosa 31.38 44.09

Hemiselulosa 23.61 21.31

Ekstraktif 14.43 9.74

Lignin 22.06 19.15

Perlakuan panas berdampak kepada komponen penyusun terutama, hemiselulosa, lignin,

selulosa dan zat ekstraktif. Pada tabel 2, persentase selulosa meningkat karena selulosa tidak terlarut dalam air sedangkan komposisi kimia lainnya berkurang. Selulosa sulit terlarut dalam air karena terdiri dari molekul-molekul glukosa rantai lurus (linear) yang tergabung oleh β-1-4 glikosidik. Kelompok hidroksil (OH) ganda yang terdapat di sepanjang rantai ikatan selulosa dengan kelompok hidroksil selulosa rantai lain membentuk struktur kristal yang kuat (mikrofibril) sehingga membutuhkan hidrolisis asam atau enzim untuk memutuskan ikatannya. Berbeda dengan hemiselulosa yang terdiri dari heteropolisakarida, campuran gula pentosa dan heksosa yang mudah terlarut sehingga kandungannya dalam padatan berkurang karena terlarut.

Pada suhu 121oC senyawa hemiselulosa mengalami perubahan seperti terbentuknya asam asial. Pada suhu 180oC adanya perubahan hemiselulosa menjadi arabinosa, galaktosa, glukosa, manosa, dan xilosa. Struktur lignin akan mengalami perubahan pada suhu 121oC dimana strukturnya mengalami perubahan yang tidak radikal. Hal tersebut dapat dilihat pada tabel 2, persentase hemiselulosa bahan awal 23.61% berkurang menjadi 21.31%. persentase lignin dari 22.06% menjadi 19.15% meskipun perubahannya relatif kecil.

Kandungan ekstraktif dan lignin pada padatan berkurang setelah prapenanganan bahan. Hemiselulosa terlarut dalam fasa cair sebagai oligosakarida yang terlarut dan terpisah dari padatan selulosa. Selama prapenanganan, lignin dan hemiselulosa terlarut atau terurai dalam fasa cair, sedangkan selulosa masih terdapat di padatan. Senyawa aromatik seperti furan dan fenol mudah mengalami reaksi kondensasi dalam suhu kamar dan suhu tinggi menghasilkan tannin berwarna gelap (Butscher et al. dalam Klinke, 2004).

Holoselulosa dan lignin dalam tanaman mengandung ekstraktif (larut dalam air atau pelarut organik) dan non ekstraktif pada dinding sel tanaman (Fan et al dalam Klinke, 2004).

17

Non ekstraktif terutama komponen seperti silika dan garam alkali tetapi juga mengandung pektin, protein, dan pati. Komponen non ekstraktif mengandung lebih dari 10% Ca, Mg, dan K merupakan komponen inorganik terbesar dalam lignoselulosa (Saka dalam Klinke, 2004).

Pengurangan lignin dan reduksi kristalinitas selulosa dan meningkatkan porositas dalam prapenanganan dapat meningkatkan hidrolisis dengan cepat (McMillan, 1994). Prapenanganan bahan memiliki beberapa syarat, yaitu meningkatnya pembentukan gula yang dapat digunakan dalam hidrolisis enzim, meminimalisir degradasi atau kehilangan karbohidrat, menghilangkan produk samping yang dapat menghambat dalam proses hidrolisis dan fermentasi selanjutnya, dan memiliki biaya yang efektif (Sun dan Cheng, 2002). Hasil prapenanganan pada penelitian ini menunjukkan adanya peningkatan pembentukan gula dan sedikit mengurangi bahan penghambat seperti lignin dan ekstraktif. Kadar lignin dan zat ekstraktif yang terhitung dalam bahan dapat menjadi penghambat dalam pembuatan etanol pada proses selanjutnya.

2. PENELITIAN UTAMA

a. Persiapan Kultur Media Fermentasi

Perhitungan jumlah koloni sel dari media padat ke media cair pada suhu 30oC dan waktu 24 jam dapat dilihat pada tabel 3.

Tabel 3. Perhitungan sel inokulum Jenis inokulum Volume media Jumlah sel Saccharomyces cerevisiae 1 ose/20 ml YGA 8 x104 cfu/ml Pichia stipitis 1 ose /25 ml YMA 14 x106 cfu/ml

Jumlah sel Pichia stipitis lebih banyak dibandingkan dengan jumlah sel Saccharomyces

cerevisiae, sehingga pada perbandingan volume kultur Saccharomyces cerevisiae dan Pichia stipitis adalah 2:1 pada penggunaan saat sakarifikasi dan fermentasi simultan.

b. Total Gula Pereduksi Terkonversi

Sakarifikasi dan fermentasi simultan (SSF) pada penelitian ini diawali dengan prehidrolisis substrat prapenanganan. Substrat ditambahkan enzim selulase sebanyak 2.94 IU/g bahan kering, β-glukosidase sebanyak 0.24 IU/ g bahan kering, dan enzim xilanase sebanyak 0.61 IU/g bahan kering diinkubasi selama 24 jam pada suhu optimum, yaitu 50oC. Hal tersebut dilakukan agar sebagian selulosa dan hemiselulosa terpecah menjadi monomer-monomer gula. Setelah prehidrolisis, dilakukan sakarifikasi dan fermentasi simultan dengan panambahan enzim selulase 2.94 IU/g bahan kering, enzim xilanase sebanyak 0.61 IU/g bahan kering dan kultur cair mikroba sebesar 10% (v/v) ditambahkan ke dalam campuran substrat.

Pada saat enzim dan mikroba ditambahkan ke dalam substrat, mikroba dapat langsung memanfaatkan gula hasil prehidrolisis menjadi etanol. Pada saat yang bersamaan, enzim terus bekerja memecah selulosa dan xilan. Hal tersebut merupakan kelebihan SSF dibandingkan dengan sakarifikasi dan fermentasi terpisah (SHF) karena pada SHF, akan terjadi peningkatan konsentrasi gula, terutama glukosa dan selobiosa yang akan menghambat aktivitas enzim.

Pada sakarifikasi dan fermentasi terpisah, hidrolisis enzim akan terhambat setelah terpecahnya gula terutama selobiosa dan glukosa. Pada saat konsentrasi selobiosa dalam cairan sebesar 6 g/l, aktivitas selulase akan berkurang menjadi 60%. Glukosa akan mengurangi aktivitas β-glukosidase. Pada konsentrasi glukosa sebesar 3 g/l, aktivitas β-

18

glukosidase berkurang menjadi 75% (Philippidis dan Smith dalam Taherzadeh dan Karimi, 2007).

Substrat SSF terdiri dari 2.8 g WIS dan 40 ml cairan hidrotermolisis dan buffer pH 5. Pada analisis bahan awal dengan hidrolisis asam, total gula substrat sebesar 68.56 g/l dan gula pereduksi sebesar 53 g/l. Gula pereduksi yang terkonversi selama 96 jam dapat dilihat pada gambar 8.

Gambar 8. Gula pereduksi yang terkonversi selama SSF

Gambar 8 menunjukkan total gula pereduksi yang terkonversi pada sakarifikasi dan

fermentasi. Gula terkonversi menjadi monomer gula, etanol, atau produk samping. Pada gambar 8 menunjukkan bahwa gula pereduksi yang terkonversi semakin meningkat selama SSF dengan laju peningkatan yang berbeda pada Pichia stipitis sedangkan Saccharomyces cerevisiae dan campuran terlihat hampir sama. Adanya perbedaan ini menunjukkan bahwa pemasukan enzim dan mikroba bersamaan setelah prehidrolisis mempengaruhi gula pereduksi yang terkonversi. Pada waktu 96 jam, gula pereduksi yang terkonversi sebesar 33.42 g/l (63.06%) pada kultur Saccharomyces cerevisiae 18.34 g/l (34.61%) pada kultur campuran, dan 19.32 g/l (36.45%) pada kultur Pichia stipitis.

Pada penelitian ini, sebagian besar total gula pereduksi pada bahan tidak terkonversi yang dapat disebabkan adanya zat penghambat seperti lignin. Faktor-faktor yang mempengaruhi hidrolisis enzim adalah konsentrasi dan kualitas substrat yang digunakan, metode prapenanganan, aktivitas enzim, dan kondisi hidrolisis seperti suhu, pH, dan pencampuran enzim. Konsentrasi substrat yang tinggi dapat menyebabkan penghambatan karena lambatnya kecepatan hidrolisis. Hambatan tersebut akan mempengaruhi rasio dari total enzim dan total substrat (Sun dan Cheng, 2002). Menurut Parisi (1989), hidrolisis enzim selulase dan xilanase pada lignoselulosa membutuhkan 15-20 IU/g bahan kering untuk menghidrolisis 70-80% selulosa dan 100% xilan. Pada penelitian ini hanya menggunakan enzim selulase sebesar 2.94 IU/g bahan kering dan xilanase sebesar 0.61 IU/g bahan kering sehingga selulosa tidak terhidrolisis secara optimal. Dalam aplikasinya semakin banyak selulase yang digunakan, semakin meningkatkan kecepatan dan rendemen proses tersebut. Namun, penambahan selulase akan meningkatkan biaya proses.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

24 48 96

Tota

l Gul

a Pe

redu

ksi (

g/l)

Waktu (jam)

Saccharomyces cereviseae

Saccharomyces cereviseae dan Pichia stipitisPichia stipitis

19

c. Hasil Etanol

Etanol yang dihasilkan pada penelitian ini mengalami kenaikan dan menurun pada waktu tertentu. Pada tabel 4 terlihat bahwa kadar etanol yang dihasilkan semakin meningkat pada waktu 0-48 jam. Hal ini menunjukkan bahwa selama 48 jam terjadi peningkatan gula pada hidrolisis diiringi dengan fermentasi mikroba. Penurunan etanol pada jam ke-96 dapat disebabkan gula yang telah terkonversi menjadi produk non etanol. Fermentasi etanol akan menghasilkan etanol sebagai produk utama. Selain itu akan menghasilkan karbondioksida dan asam-asam organik seperti asam piruvat, asam suksinat, asam laktat, dan asam-asam lainnya.

Mikroorganisme Waktu (Jam) Etanol (g/l) Saccharomyces

cereviseae 24 8,92

48 11,12

96 3,79 Saccharomyces cereviseae dan Pichia stipitis

24 3,71

48 9,78

96 4,34 Pichia stipitis 24 3,79

48 13,49

96 5,84

Tabel 4. Hasil etanol pada sakarifikasi dan fermentasi simultan

Hasil etanol tertinggi pada penelitian ini pada waktu 48 jam sebanyak 11.12 g/l pada

kultur Saccharomyces cerevisiae, 9.78 g/l selama 48 jam pada kultur campuran, dan 13.49 g/l pada kultur Pichia stipitis. Pada waktu 96 jam, tidak menunjukkan kenaikan kadar etanol, bahkan hasilnya menurun dibandingkan waktu sebelumnya. Pada kultur Saccharomyces cerevisiae menghasilkan 3.79 g/l, kultur Pichia stipitis sebanyak 5.84 g/l etanol, dan kultur campuran sebanyak 4.34 g/l.

Dalam Rouhoullah et al. (2007) menyatakan bahwa Pichia stipitis mulai mengkonversi glukosa pada waktu 30 jam pertama sedangkan waktu fermentasi xilosa 60 jam dengan hasil akhir Y (p/s) sebesar 0.40 dan Y (x/s) sebesar 0.08. Saccharomyces cerevisiae mulai mengkonversi glukosa menjadi etanol pada waktu 18 jam menghasilkan hasil akhir dengan Y(p/s) 0.32 dan Y(x/s) 0.10. Hal tersebut menunjukkan bahwa Pichia stipitis mengkonversi glukosa terlebih dahulu dengan kecepatan konversi glukosa lebih cepat dibandingkan dengan xilosa.

Pada gambar 9, pada saat 24 jam pertama, jumlah etanol tertinggi pada kultur Saccharomyces cerevisiae (8.92 g/l) kemudian Pichia stipitis (3.79 g/l) dan terendah pada kultur campuran (3.71 g/l). Hal ini sesuai dengan pernyataan Rouhoullah (2007) bahwa Saccharomyces cereviseae memiliki kecepatan memfermentasi glukosa dibandingkan dengan Pichia stipitis. Pada waktu 48 jam, jumlah etanol yang dihasilkan kultur Pichia stipitis (13.49 g/l) kemudian Saccharomyces cerevisiae (11.12 g/l) dan terendah pada kultur campuran (9.78 g/l). Setelah 48 jam kultur Pichia stipitis lebih cepat memproduksi etanol dibandingkan dengan kultur Saccharomyces cerevisiae dan campuran. Hal ini menunjukkan bahwa kultur Saccharomyces cerevisiae mengalami

20

kekurangan glukosa yang dapat diakibatkan karena sebagian besar selulosa tidak terkonversi optimal oleh enzim. Berbeda dengan hasil etanol kultur Pichia stipitis, pada saat sebagian hemiselulosa telah terkonversi, Pichia stipitis terlebih dahulu mengkonversi glukosa menjadi etanol dibandingkan dengan xilosa. Setelah 48 jam dan kehabisan glukosa, Pichia stipitis mengkonversi xilosa. Meskipun konversi selulosa terhambat, Pichia stipitis dapat meningkatkan hasil etanol karena kemampuannya mengkonversi glukosa dan xilosa, sedangkan Saccharomyces cerevisiae hanya mengkonversi glukosa (C6). Hasil etanol pada kultur campuran tidak mempengaruhi pertambahan etanol, bahkan menghasilkan etanol lebih sedikit dibanding dengan masing-masing kultur campuran.

Selama sakarifikasi dan fermentasi simultan terjadi konversi selulosa dan xilan menjadi monomer-monomer gula sehingga bertambah, konversi glukosa, xilosa, dan monomer gula menjadi etanol oleh mikroba. Jika dilihat dari perubahan konsentrasi etanol terhadap waktu, terdapat kecenderungan bahwa kadar etanol akan terus meningkat, namun pada jam ke-96 konsentrasi etanol menurun. Hal ini dapat diakibatkan glukosa maupun pentosa yang telah terhidrolisis telah habis terfermentasi oleh yeast karena sudah tidak ada lagi monosakarida yang dihasilkan dari hidrolisis polisakarida. Selain itu dapat disebabkan oleh inhibitor-inhibitor yang ada dalam

biomassa antara lain lignin, asam lemah, turunan senyawa fenolik.

d. Total Biomassa Akhir

Biomassa yang dihitung adalah jumlah sel kering yang terdapat pada cairan fermentasi.

Tabel 5. Biomassa Hasil SSF pada waktu 96 jam

Keterangan Biomassa awal (g/l)

Biomassa Akhir (g/l) ∆x/x

Saccharomyces cerevisiae

4.67 8.53 0.83

Pichia stipitis 9.53 18.50 0.94 Campuran 8.80 14.33 0.63

Tabel 5 menunjukkan bahwa konsentrasi awal dan peningkatan biomassa Pichia

stipitis lebih besar dibandingkan dengan kultur campuran dan Saccharomyces cerevisiae. Biomassa awal Saccharomyces cerevisiae sebesar 4.67 g/l, Pichia stipitis sebesar 9.53 g/l, dan kultur campuran sebesar 8.80 g/l. Pada waktu 48 jam pertama. konversi gula menjadi glukosa lebih banyak dibandingkan dengan xilosa. Pada kultur campuran terjadi konversi glukosa oleh Saccharomyces cerevisiae dan Pichia stipitis secara cepat sehingga persediaan glukosa cepat berkurang dan sebagian sel Saccharomyces cerevisiae mati karena kekurangan sumber glukosa. Kemudian Pichia stipitis akan beralih mengkonversi xilosa. Namun. akibat pemasukan volume Saccharomyces cerevisiae dua kali lebih banyak dibandingkan dengan Pichia stipitis menyebabkan banyak sel yang mati dan kecepatan fermentasi akan berkurang. Hal tersebut dapat dilihat pada tabel 5 bahwa peningkatan biomassa kultur campuran lebih sedikit dibandingkan dengan masing-masing kultur.

Berbeda dengan Saccharomyces cerevisiae, sel khamir awal (4.67 g/l) lebih sedikit dibandingkan dengan kultur campuran (8.80 g/l) sehingga kebutuhan sumber karbon

21

relatif lebih sedikit dibandingkan kultur campuran. Meskipun konversi selulosa menjadi glukosa setelah 48 jam sedikit namun persediaan glukosa masih tercukupi sehingga ∆x/x lebih besar (0.83) dibandingkan dengan kultur campuran (0.63). Pertambahan jumlah sel pada Pichia stipitis lebih besar dibandingkan dengan Saccharomyces cerevisiae dan kultur campuran sesuai dengan perbandingan etanol yang dihasilkan.

e. Pemanfaatan substrat menjadi etanol

Bardasarkan hubungan waktu fermentasi dengan konsentrasi etanol, substrat, dan biomassa yang diperoleh dapat dibandingkan parameternya. Yield atau rendemen biomassa (Yx/s) dan rendemen produk per substrat (Yp/x).

Tabel 6. Perbandingan parameter akhir hasil fermentasi

Fermentasi Etanol (g/l) Y(p/s) Y(x/s)

S.cerevisiae 3.79 0.07 0.07

Pichia stipitis 5.84 0.11 0.17

Campuran 4.33 0.10 0.10

Tabel 6 menunjukkan bahwa nilai Y(p/s) kultur Pichia stipitis lebih tinggi

dibandingkan dengan S. cerevisiae dan kultur campuran. Y(p/s) menunjukkan konversi substrat sebagai sumbar karbon menjadi etanol. Pada Y(x/s) menunjukkan pemanfaatan substrat menjadi sel. Pada tabel 6 terlihat sel yang dihasilkan pada substrat pada Pichia stipitis paling besar, selanjutnya, kultur campuran dan Saccharomyces cereviseae. Nilai Y(p/s) dan Y(x/s) kultur S.cerevisiae terlihat paling kecil dibandingkan kultur Pichia stipitis dan campuran yang dapat disebabkan karena etanol yang dihasilkan paling sedikit. Nilai dan Y (p/s) dan Y(x/s) pada kultur campuran lebih besar dibandingkan dengan Saccharomyces cerevisiae namun lebih kecil dari Pichia stipitis. Y(p/s) dan Y (x/s) pada Pichia stpitis lebih besar karena kemampuannya dalam memanfaatkan gugus C5 dan C6. Nilai Y(x/s) yang kecil dapat disebabkan monomer gula yang dihasilkan hidrolisis enzim tidak optimal. Hal itu dapat disebabkan penggunaan suhu, penggunaan enzim, dan adanya lignin yang dapat menghambat akses enzim.

Konversi gula menjadi glukosa lebih cepat dibandingkan dengan xilosa dapat menyebabkan kedua khamir hanya mengkonversi glukosa secara cepat. Akibatnya sebelum selulosa terkonversi secara optimal pada SSF, glukosa yang terkonversi telah habis dan sebagian sel Saccharomyces cerevisiae mati kehabisaan sumber karbon. Karena pemasukan volume Saccharomyces cerevisiae lebih banyak dibandingkan dengan Pichia stipitis dapat mengakibatkan biomassa dalam kultur yang mati sangat banyak tanpa diikuti peningkatan kadar etanol. Konsentrasi awal kultur campuran lebih banyak dibandingkan dengan biomassa pada akhir kultur Saccharomyces cerevisiae sehingga Y(x/s) kultur campuran lebih besar.

Pada Lampiran 5, uji analisis ragam terhadap y(p/s) selama 96 jam menghasilkan f hitung pada y(p/s) sebesar 0.04 lebih kecil dari f pada taraf nyata α = 0.05 sebesar 9.55. Hal itu menunjukkan bahwa penggunaan kultur campuran Saccharomyces cerevisiae dan Pichia stipitis tidak meningkatkan yield dari penggunaan masing-masing kultur dan tidak ada pengaruh yang nyata dari ketiga perlakuan.

22

Pada Lampiran 6, uji analisis ragam terhadap y(x/s) selama 96 jam menghasilkan f hitung pada y(x/s) sebesar 25.11 lebih besar dari f pada taraf nyata α= 0.05 sebesar 9.55. Hal tersebut menunjukkan perbedaan yang nyata antara ketiga perlakuan. Perlakuan pada penelitian ini berpengaruh pada jumlah biomassa yang dihasilkan, namun penggunaan kultur campuran Saccharomyces cerevisiae dan Pichia stipitis tidak meningkatkan rendemen biomassa.

Penelitian ini dilakukan dua kali ulangan, namun hasil etanol yang didapatkan sangat berbeda sehingga menggunakan data penelitian ulangan pertama. Pemilihan ulangan pertama karena konsentrasi biomassa awal lebih banyak dan perkembangbiakan biomassa selama proses pada saat sakarifikasi dan fermentasi simultan lebih baik. Perbedaan pemasukkan konsentrasi awal biomassa disebabkan salah satu khamir tidak tumbuh dengan baik sedangkan perkembangbiakannya dapat disebabkan gula pereduksi yang terkonversi selama sakarifikasi pada ulangan kedua lebih sedikit dibandingkan dengan ulangan pertama, terlihat pada Lampiran 4. Hal ini dapat disebabkan penurunan aktivitas enzim.

23

V. KESIMPULAN DAN SARAN

A. KESIMPULAN

Limbah tanaman jagung merupakan bahan lignoselulosa yang dapat digunakan sebagai bahan baku pembuatan etanol. Lignoselulosa mengandung selulosa, hemiselulosa, lignin, dan zat ekstraktif lainnya. Komposisi tanaman jagung setelah dianalisis mengandung 66% karbohidrat dan 27.21% serat kasar yang dapat digunakan sebagai sumber karbon dalam pembuatan etanol. Pembuatan etanol dengan bahan lignoselulosa memerlukan beberapa proses yang terdiri dari delignifikasi, hidrotermolisis, sakarifikasi, dan fermentasi.

Delignifikasi dan hidrotermolisis bertujuan untuk merusak struktur lignoselulosa, mengurangi kristalinitas selulosa, lignin, dan zat ekstraktif. Sebagian hemiselulosa, lignin, dan zat ekstraktif akan terlarut dalam cairan hidrotermolisis. Setelah itu dilakukan sakarifikasi dan fermentasi simultan dengan menambahkan enzim dan khamir ke dalam media fermentasi pada suhu 32oC selama 96 jam. Perlakuan pada penelitian ini adalah penggunaan kultur fermentasi, yaitu dengan kultur Saccharomyces cerevisiae, Pichia stipitis, dan kultur campurannya. Saccharomyces cerevisiae mampu mengkonversi glukosa, manosa, dan galaktosa. Pichia stipitis mampu mengkonversi glukosa, manosa, galaktosa, dan xilosa.

Dari hasil analisa sakarifikasi dan fermentasi simultan, didapatkan hasil etanol kultur Pichia stipitis sebesar 5.84 g/l dengan Y(p/s) 0.11, kultur Saccharomyces cerevisiae menghasilkan 3.79 g/l etanol dengan Y(p/s) sebesar 0.07, dan kultur campuran sebanyak 4.34 g/l etanol dengan Y(p/s) sebesar 0.10 pada waktu 96 jam. gula pereduksi yang terkonversi sebesar 33.42 g/l (63.06%) pada kultur Saccharomyces cerevisiae 18.34 g/l (34.61%) pada kultur campuran, dan 19.32 g/l (36.45%) pada kultur Pichia stipitis. Hasil terbaik berdasarkan etanol dan yield tertinggi adalah menggunakan kultur Pichia stipitis. Pada uji statistik menunjukkan bahwa Y (p/s) ketiga perlakuan tidak berbeda nyata sedangkan Y(x/s) menunjukkan perbedaan yang nyata.

B. SARAN

Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai produksi etanol bahan lignoselulosa dengan menggunakan kultur campuran. Hal yang paling penting dalam mengoptimalkan produksi etanol ini adalah dalam pemilihan metode prapenanganan bahan dan fermentasi. Prapenanganan bahan yang dipilih adalah yang dapat merusak struktur lignoselulosa sebesar mungkin tanpa menghasilkan produk yang menghambat sakarifikasi dan fermentasi sehingga penggunaan enzim dapat dikurangi. Pada penelitian selanjutnya diharapkan perlakuan fermentasi dengan pemasukan kultur secara bertahap. Kultur Pichia stipitis terlebih dahulu dimasukkan ke dalam substrat kemudian kultur Saccharomyces cerevisiae atau kultur Saccharomyces cerevisiae terlebih dahulu, kemudian sebagian etanol yang dihasilkan diambil, lalu kultur Pichia stipitis dimasukkan. Penelitian ini sebaiknya terus dikembangkan mengingat bahan bakunya adalah limbah pertanian yang jumlahnya sangat banyak dan hasil etanol dapat mengkonversi penggunaan bahan bakar fosil.

24

DAFTAR PUSTAKA

Agbogbo FK, Kelly CG. 2008. Cellulosic Ethanol Production Using the Naturally Occurring Xylose-Fermenting Yeast, Pichia stipitis. Biotechnol Lett 30:1515–1524

Anindyawati T. 2009. Prospek Enzim Dan Limbah Lignoselulosa Untuk Produksi Bioetanol. Pusat Penelitian Bioteknoligi-LIPI. BS 44 (1) : 49- 56

Bailey, JE, Oilis DF. 1988. Dasar-dasar Rekayasa Biokimia. Terjemahan. Pusat Antar Universitas, Institut Pertanian Bogor, Bogor.

Chao, GS, Suh JH, Choi YI. 1996. Overproduction, Purification, and Characterization of Bacillus stearothmophillus Endo-xylanase A (xynA). J. Microbiol and Biotechnol. 6:79-85.

Chun C, Xiaojian M. 2008. Application in Fuel Ethanol Production by Simultaneous Saccharification and Fermentation Coupled with Separzation. Engineering Department Zheng Zhou University.

Dien B. S.; Cotta, M. A. and Jeffries, TW. 2003. Bacteria engineered for fuel ethanol production: current status. Applied Microbiology and Biotechnology, 63(3): 258-266.

Duque, PLE. 2009. Acid-Functionalized Nanoparticles for Hydrolysis Of Lignocellulosic Feedstocks. Thesis. Department of Biological and Agricultural Engineering, Kansas State University. Manhattan, Kansas

Eggeman T, Elander RT. 2005. Process and Economic Analysis of Pretreatment Technologies. Bioresource Technology’ 96 (18): 2019-2025.

Fardiaz, S. 1989. Mikrobiologi Pangan. Departemen Pendidikan dan Kebudayaan Dirjen Dikti. Pusat Studi Antar Universitas Pangan dan Gizi. Institut Pertanian Bogor, Bogor.

Goldman N. 2009. Methods for optimizing enzymatic hydrolysis of xylan to improve xylooligosaccharide yield. Michigan State University, East Lansing, MI.

Grabber JH, Ronald DH, Fachuang L, John R. 2008. Coniferyl Ferulate Incorporation into Lignin Enhances the Alkaline Delignification and Enzymatic Degradation of Cell Walls. Biomacromolecules 9: 2510–2516

Hector R, Hughes S, Xin L. 2008. Developing Yeast Strains for Biomass-to-Ethanol Production. http://www.ethanolproducer.com/images/upload/20080512025023.jpg [3 Agustus 2010]

Jacques KA, Lyons TP, Kelsall DR. 2003. The alcohol text book 4th edition. Nottingham: University Press.

Jeffries TW, Grigoriev IV, Grimwood J, Laplaza JM, Aerts A, Salamov A, Schmutz J, Lindquist E, Dehal P, Shapiro H, Jin YS, Passoth V, Richardson PM. 2007. Genome sequence of the lignocellulose-bioconverting and xylose-fermenting yeast Pichia stipitis. Nat Biotechnol 3:319-26

Judoamidjojo, R.M., E.G. Said,. Dan L. Hartoto. 1989. Biokonversi. PAU IPB, Bogor. Kilian SG, Uden N. 1988. Transport of xylose and glucose in the xylose fermenting yeast Pichia

stipitis. Appl Microb Biotechnol 27:545–548 Klinke HB, Thomsen AB, Ahring BK. 2004. Inhibition of ethanol-producing yeast and bacteria by

degradation products produced during pre-treatment of biomass. Appl Microbiol Biotechnol 66: 10–26

Kotter P, Ciriacy M. 1993. Xylose fermentation by Saccharomyces cerevisiae. Applied Microbiology

and Biotechnology. 38: 776-783Lampiran Marques L, Alves JC, Roseiro FMG. 2008. Conversion of recycled paper sludge to ethanol by SHF

and SSF using Pichia stipitis. Biomass and Bioenergy 32 (3008): 400-406. http://www.elsevier.com/locate/biombioe. [12 Oktober 2010]

25

McMillan JD. 1994. Maximizing Ethanol Production by Engineered Pentose-Fermenting Zymomonas mobilis. Departement Of Chemical Engineering University of Colorado. http://bioweb.sungrant.org [24 Januari 2010]

Meyrial V, Delgenes JP, Romieu C, Molleta R, Gounot AM. 1995. Ethanol tolerance and activity of plasma membrane ATPase in Pichia stipitis grown D-xylose or D-glucose. Enzyme Microb Technol 17:535–540

Miller OC. 1959. Use of The Dinitrosalicylic Acid Reagent for The Determination of Reducing Sugar. Analitycal Chemists 31: 189-198.

Mosier N, Wyman C, Dale B, Elander R, Lee YY, Holtzapple M, Ladisch MR, 2004. Features of promising technologies for pretreatment of lignocellulosic biomass. Bioresource Technology 96: 673-686

Okur MT, Nurdan E. 2006. Ethanol Production From Sunflower Seed Hull Hydrolisate By Pichia stipitis Under Controlled pH Conditions In A Bioreactor. Turkish J. Eng. Env. Sci. 30: 317 – 32.

Parisi F. 1989. Advance in Lignocellulosics Hydrolysis and in the Utilization of the Hydrolyzates. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology 38. http://www.engr.usask.ca/ classes/ABE/850/Hydrolysis/AdvancesinLignocellulosicsHydrolysis. pdf [3 Agustus 2010].

Prasad S, Anoop S, Joshi HC. 2006. Ethanol as an alternative fuel from agricultural, industrial and

urban residues. Real World Applicatio 7 �432-457

Rouhoullah H, Nahvi I, Emtiazi G, Abedinifar S. 2007. Mixed Sugar Fermentation by Pichia stipitis, Saccharomyces cerevisiae, and Isolated Xilose Fermenting Kluyveromyces marxianus And Their Culture. African Journal of Biotechnology 6 (9) :1110-1114. http://www.academycjournals.org/AJB [16 Oktober 2009]

Skoog K, Hahn-Hagerdal B. 1990. Effect Of Oxygenation On Xilose Fermentation by Pichia stipitis. Appl Environ Microbiol; 56(11): 3389–3394. http://www.pubmedcentral.nih.gov/ articlerender.fcgi?artid=18495. [17 Oktober 2009]

Subekti H. 2006. Produksi Etanol Dari Hidrolisat Fraksi Selulosa Tongkol Jagung Oleh Saccharomyces cerevisiae. Skripsi. Departemen Teknologi Industri Pertanian, FATETA IPB, Bogor.

Subramaniyan S, Prema P. 2002. Biotechnology of Michrobial Xylanase: Enzymology, Molecular Biology, and Aplication. Crit. Rev. in Biotechnol. 22 (1): 33-64.

Sulzenbacher G, Shareck F, Morosoli R, Dupont C, and Davies GJ. 1997. The Streptomyces lividans family 12 endoglucanase: construction of the catalytic cre, expression, and X-ray structure at 1.75 Å resolution. Biochemistry 36: 16032-16039

Sun Y, Cheng J. 2002. Hydrolysis of lignocellulosic material for ethanol production: a review. Bioresour Technol 83:1–11.

Taherzadeh MJ, Karimi K. 2007. Enzyme-Based Hydrolysis Processes for Ethanol from Lignocellulosic Materials: A Review. Bioresources 2(4): 707-738.

Wyman C. 1999. Biomass Ethanol: Technical Progress, Opportunities, and Commercial Challenges. Annu. Rev. Energy Environ 24:189–226

Yoswathana N, Phattayawadee P, Pattranit T, Eshtiaghi MN. 2010. Bioethanol Production From Rice Straw. Energy Research Journal 1 (1): 26-31, Science Publications : Thailand. Dalam http://www.scipub.org/fulltext/erj/erj1126-31.pdf [27 Mei 2010].

Zhang, M. 2003. Recombinant Zymmomonas mobilis with improved xylose utilization. US Patent 6,566,107.

26

Lampiran 1. Tatacara karakterisasi limbah tanaman jagung

a. Kadar Air Cawan kosong (ukuran medium) diletakkan dalam oven sehari atau minimal 3 jam sebelum

pengujian. Masukkan cawan kosong tersebut dalam desikator sekitar 30 menit. Cawan kosong tersebut ditimbang. Bahan masing-masing ditimbang 6 2 gram ke dalam cawan. Masukkan cawan yang telah berisi bahan ke dalam oven 105oC selama 16-24 jam. Pindahkan menggunakan penjepit ke desikator untuk didinginkan selama 30 menit. Cawan berisi bahan tersebut ditimbang.

Kadar air% (bk) = (berat awal sampel – berat sampel akhir) x 100

berat sampel awal

b. Kadar Bahan Ekstraktif Labu didih ukuran 250 ml disiapkan dalam oven (105oC) atau minimal 3 jam sebelum

pengujian. Masukkan labu kosong tersebut dalam desikator sekitar 30 menit. Labu kosong tersebut ditimbang. Keran air dicek menyala atau tidak sebagai pendingin sokhlet. Siapkan kertas saring segi empat (sebagai kokon), tali pengikat, gunting, kapas, dan pensil 2B. Masukkan bagas masing-masing sebanyak 3 gram (berat kering oven) ke dalam kokon, tutup dengan kapas dan ikat dengan tali, kemudian tuliskan kode sampel pada kokon menggunakan pensil 2B. Kokon dipasangkan pemberat yaitu magnetic stirer. Masukkan kokon pada perangkat sokhlet dan tuang pelarut alkohol-benzene (1:2) sebanyak sekitar 2/3 isi labu didih. Ekstraksi selama 6 jam pada suhu sekitar 90oC (set angka 50 pada hot plate), keluarkan kokon dari sokhlet, masukkan ke oven 105oC semalam. Masukkan kembali pelarut dalam wadahnya, sementara labu yang berisi hanya zat ekstraktif di dalam oven 105oC, keringkan semalam. Masukkan labu yang berisi zat ekstraktif ke desikator selama 30 menit, kemudian timbang. Catatan : sampel yang telah bebas ekstraktif dipisahkan untuk uji klason lignin dan holoselulosa. c. Klason Lignin (SNI 0492:2008)

Siapkan gelas filter IG3 kosong dan cawan ukuran kecil dalam oven sehari atau minimal 3 jam

sebelum pengujian. Masukkan gelas IG3 kosong dan cawan tersebut dalam desikator sekitar 30 menit. Timbang gelas IG3 kosong tersebut, sedangkan cawan digunakan untuk mengukur kadar air bagas bebas ekstraktif (lihat prosedur pengukuran kadar air, namun berat bagas diganti hanya 0,5 gram). Siapkan labu takar ukuran 50 ml untuk membuat larutan H2SO4 72%. Masukkan bagas bebas ekstrakif sebanyak 0.5 gram kering ke dalam beaker glass ukuran 50 ml. Selanjutnya masukkan 7.5 ml H2SO4 72%. Diaduk sesekali (dapat digunakan dengan menggunakan magnetic stirer dan memasang angka 10 pada stirer plate) selama 4 jam pada suhu kamar (dilakukan dengan menuangkan air sebelum pengadukan sekitar beaker glass yang telah disangga cawan petri), masukkan bagas yang telah diaduk selama 4 jam tersebut ke dalam erlenmeyer ukuran 300 ml. Tambahkan masing-masing 280 ml akuades ke dalam erlenmeyer. Tutup erlenmeyer dengan alumunium foil rangkap dua dan diautoklaf 121oC selama 15 menit (pada autoklaf pasang timer +20, sehingga menjadi 35). Saring langsung dengan gelas filter IG3. Cuci dengan air panas masing-masing 100 ml. Keringkan gelas IG3 yang telah berisi filtrat pada suhu 105oC selama 16-24 jam. Dinginkan dalam desikator selama 30 menit kemudian ditimbang. Catatan : Pembuatan H2SO4 72% yaitu tuangkan 37.89 ml H2SO4 95% ke dalam labu takar 50 ml, kemudian secara perlahan tambahkan akuades sampai tanda tera. d. Holoselulosa (SNI 01-1303-1989)

Siapkan gelas filter IG3 kosong dan cawan ukuran kecil dalam oven sehari atau minimal 3 jam

sebelum pengujian. Masukkan gelas IG3 kosong dan cawan tersebut dalam desikator sekitar 30 menit. Timbang gelas IG3 kosong tersebut. Masukkan bagas ekstraktif sebanyak 1.5 gram kering ke dalam

27

erlenmeyer 100 ml. Kemudian masukkan masing-masing 90 ml akuades, 2.4 ml NaClO2, 25% dan 0.12 ml asam asetat glasial 100%. Tutup dengan plastik tahan panas kemudian alumunium foil rangkap, panaskan dalam waterbath selama 1 jam (gunakan masker udara). Kemudian tanpa menunggu dingin tambahkan masing-masing 2.4 ml NaClO2 25% dan 0.12 ml asam asetat glasial 100% berulang-ulang setiap jam sampai serbuk bagas berwarna putih (untuk TKKS 2 x penambahan, untuk hardwood 3x penambahan, untuk softwood 2x penambahan).

Serbuk bagas yang telah menjadi putih segera dimasukkan ke dalam gelas filter IG3 sambil divakum, sementara menunggu penyaringan siapkan nampan yang telah diberi es batu dan air untuk memadamkan erlenmeyer yang belum disaring. Cuci dengan air dingin 250 ml pada setiap bagas. Bilas dengan aseton. Keringkan gelas filter IG3 yang telah berisi filter pada suhu 105oC selama 16-24 jam. Dinginkan dalam desikator selama 30 menit kemudian timbang. Catatan : Hasil penyaringan holoselulosa siap digunakan untuk persiapan kadar alfaselulosa. e. Alfaselulosa (SNI 0444:2009)

Siapkan gelas filter IG3 kosong dan cawan ukuran kecil dalam oven sehari atau minimal 3 jam

sebelum pengujian. Masukkan gelas IG3 kosong dan cawan tersebut dalam desikator sekitar 30 menit. Timbang gelas IG3 kosong tersebut. Timbang 2 labu takar 100 ml untuk membuat larutan NaOH 17.5%. Letakkan di atas cawan penyangga yang telah dituang air di stirer plate yang dipasang pada angka 10 selama 30 menit. Tambahkan maing-masing 12.5 ml akuades, biarkan selama 5 menit. Saring menggunakan gelas filter IG3. Cuci dengan akuades selama sekitar 3 menit. Cuci dengan 20 ml asam asetat glasial 10%. Cuci masing-masing dengan 500 ml air panas. Keringkan glass filter IG3 yang telah berisi filter pada suhu 105oC selama 16-24 jam. Dinginkan dalam desikator selama 30 menit kemudian ditimbang. Catatan : Pembuatan NaOH 17.5% : larutkan 17.5 gram NaOH pure pellets ke dalam labu takar 100 ml dengan akuades sampai tanda tera. Pembuatan asam asetat 10% : larutkan 10 ml asam asetat glasial 100% ke dalam labu takar 100 ml dengan akuades sampai tanda tera.

28

Lampiran 2. Analisis Fermentasi

Analisis yang dilakukan terhadap hasil fermentasi adalah :

1) Pengukuran Biomassa

Pengukuran total padatan dengan mengeringkan sampel pada oven selama 24 jam. Pengukuran

dilakukan dengan penyaringan menggunakan kertas saring. Biomassa kemudian dikeringkan

menggunakan oven dan ditimbang hingga bobotnya konstan

Total biomassa = (bobot kertas dan bahan-bobot kontrol) g/l.

2) Kadar etanol

Pengukuran kadar etanol sampel dilakukan dengan menggunakan GC (Gas Chromatography).

Penentuan dilakukan dengan membandingkan waktu retensi sampel dengan waktu retensi

standar etanol.

3) Total Gula Pereduksi (Miller, 1959)

Efisiensi pemanfaatan substrat dihitung dari selisih kadar gula pereduksi awal substrat fermentasi dengan kadar gula pereduksi akhir substrat fermentasi dibanding kadar gula pereduksi awal substrat fermentasi (∆ S/S) dikali 100%. Prinsip metode ini adalah dalam suasana alkali gula pereduksi akan mereduksi asam 3.5-dinitrosolisilat (DNS) membentuk senyawa yang dapat diukur absorbansinya pada panjang gelombang 550 µm. a) Penyiapan Pereaksi DNS

Pereaksi DNS dibuat dengan melarutkan 10.6 g asam 3.5-dinitrosolisilat dan 19.8 g

NaOH ke dalam 1416 ml air. Setelah itu ditambah 306 g Na-K Tartrat. 7.6 g fenol yang

telah dicairkan pada suhu 50oC dan 8.3 g Na-metabisulfit. Larutan ini diaduk rata kemudian

3 ml larutan ini dititrasi dengan HCl 0.1 N dengan indikator Phenolphtalein. Banyaknya

titran berkisar 5-6 ml. Jika kurang dari itu harus ditambahkan 2 g NaOH untuk setiap ml

kekurangan HCl 0.1 N.

b) Penentuan Kurva Standar

Kurva standar dibuat dengan mengukur atau mengetahui kadar gula pereduksi pada glukosa

pada selang 0.2-0.5 mg/l. Kemudian nilai gula pereduksi dicari dengan metode DNS. Hasil

yang didapat diplotkan pada grafik secara linier.

c) Penetapan Kadar Gula Pereduksi

Pengujian gula pereduksi menggunakan kurva standar DNS adalah sebagai berikut : 1 ml

sampel dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian ditambahkan 3 ml pereaksi DNS.

Larutan tersebut ditempatkan dalam air mendidih selama 5 m,enit. Biarkan sampai dingin

pada suhu ruang. Ukur absorbansi pada panjang gelombang 550 nm.

29

Lampiran 3. Hasil Uji Etanol

Mikroorganisme Waktu (Jam) Etanol 1 (g/l)

Etanol 2 (g/l)

Rata-rata

Saccharomyces cerevisiae

24 8,92 1,74 5,33 48 11,12 2,29 6,71 72 15,53 2,29 8,91 96 3,79 2,84 3,31

Saccharomyces cerevisiae dan Pichia stipitis

24 3,71 1,42 2,56 48 9,78 2,92 6,35 72 11,05 0,79 5,92 96 4,34 1,66 2,99

Pichia stipitis 24 3,79 1,58 2,68 48 13,49 1,58 7,53 72 36,93 2,45 19,69 96 5,84 1,42 3,63

Lampiran 4. Total Gula Pereduksi Terkonversi

Mikroorganisme Waktu (Jam)

Gula Pereduksi 1

(g/l) Gula Pereduksi

2 (g/l) Rata-rata

Saccharomyces cerevisiae

24 8,79 2,53 5,66 48 13,71 7,70 10,70 72 28,14 4,38 16,26 96 33,42 24,15 28,79

Saccharomyces cerevisiae dan Pichia stipitis

24 6,68 16,98 11,83 48 7,83 11,81 9,82 72 10,60 23,34 16,97 96 18,34 34,10 26,22

Pichia stipitis 24 19,52 9,83 14,68 48 29,33 16,38 22,85 72 29,94 14,58 22,26 96 32,05 19,32 25,69

30

Lampiran 5. Uji Analisis Ragam Klasifikasi Satu-Arah terhadap Y(p/s) pada 96 jam.

Keterangan S. cerevisiae Campuran Pichia stipitis

Ulangan 1 0.071 0.082 0.110

Ulangan 2 0.054 0.031 0.027

Total Nilai Tengah 0.125 0.113 0.137 0.375

Rata-Rata 0.063 0.057 0.068 0.063

JKT 0.00491546

JKK 0.00505729

JKG 0.00014183

Sumber Keragaman Jumlah Derajat Bebas

Kuadrat Tengah f Hitung

Nilai Tengah Kolom 0.00014183 2 7.09173E-05 0.043282

Galat 0.00491546 3 0.001638485

Total 0.00505729 5 *α = 0.05 *f0.05{2.3}= 9.55 *f Hitung < f0.05. maka perlakuan tidak berpengaruh nyata pada α = 0.05

31

Lampiran 6. Uji Analisis Ragam Klasifikasi Satu-Arah terhadap Y(x/s) pada 96 jam.

Keterangan S. cerevisiae Campuran Pichia stipitis

Ulangan 1 0,136 0,104 0,169

Ulangan 2 0,073 0,031 0,153

Total Nilai Tengah 0,209 0,136 0,323 0,667

Rata-Rata 0,104 0,084 0,238 0,142

JKT 0,005

JKK 0,084

JKG 0,080

Sumber Keragaman Jumlah Derajat Bebas

Kuadrat Tengah f Hitung

Nilai Tengah Kolom 0,080 2 0,040 25,106

Galat 0,005 3 0,002

Total 0,084 5 *α = 0.05 *f0.05{2.3}= 9.55 *f Hitung >f0.05. maka perlakuan berbeda nyata pada α = 0.05