33

RESUMEN

En este trabajo se estudió la producción desuspensión de Bordetella pertussis porfermentación para obtener el ingrediente activode la vacuna contra tosferina. Se probarondiferentes medios de cultivo para el proceso,seleccionando el medio Stainer-Scholteadicionado con 3 g/L de casaminoacidos, el cualpermite obtener altas concentraciones de célulasy suspensiones de buena calidad. Se estudiótambién la cinética de consumo de glutamato desodio, producción de biomasa y evolución delpH. El crecimiento fue descrito por un modelologístico. Se compara la tecnología de cultivoestacionario con el cultivo en fermentadorpresentándose esta última como la mejoralternativa de producción.

Palabras Claves: Bordetella pertussis, vacuna,medio de cultivo, cinética, fermentación.

SUMMARY

Bordatella pertussis suspensions are used toprepare Whooping Cough Vaccine. This workstudied the production by fermentation ofBordatella pertussis suspensions. After severalmedia were tested, the Stainer-Scholte mediumsupplemented with 3g/L of casaminoacids wasused as a fermentation medium. High cellconcentrations and good quality suspensionswere obtained with this medium. During theprocess sodium glutamate intake, biomass

production and pH were also determined. Theculture followed a growth Logistic Model. Acomparison between the stationary culture andthe fermentation process was done. The last onewas a better production alternative.

Keywords: Bordetella pertussis, vaccine,culture media, kinetic, fermentation.

INTRODUCCION

Una vacuna es un producto rico en antígenos, elaboradosa partir de un microorganismo patógeno o una de susfracciones o subproductos, capaz de desencadenar enel organismo humano la formación de loscorrespondientes anticuerpos que confieren inmunidadcontra aquel microorganismo.

La tosferina es una enfermedad causada por la bacteriaBordetella pertussis y puede prevenirse con uso devacunas. Estas pueden ser células de B. pertussismuertas o vacunas acelulares que se preparan a partirde uno o varios factores de virulencia que produce elmicroorganismo (Manclark y Cowell, 1984).

El primer aislamiento exitoso del agente causal detosferina fue logrado por Bordet y Gengou en 1906,empleando un medio rico en sangre. Desde entonces eldesarrollo de la vacuna contra la tosferina ha sido unproceso evolutivo. Los pasos iniciales para el desarrollode una vacuna se dieron por la época de la primera guerramundial y se realizó en forma empírica, dado que no setenía un conocimiento de la anatomía del organismo ysu relación con la patogénesis de la enfermedad. Estasprimeras vacunas fueron notoriamente crudas y decontenido incierto; ellas algunas veces incluyeron florarespiratoria mezclada con B. pertussis y fue usada paratratamiento como tambien para la profilaxis. La segundaera se inició con el refinamiento de los métodos de

PRODUCCION DE SUSPENSIONES DE Bordetella pertussis PORFERMENTACION

PRODUCTION OF Bordetella pertussis SUSPENSIONS BY FERMENTATION

Algecira N., Dueñas A., Parra L., Granados J1.

1 Instituto Nacional de Salud. Subdirección Industrial. Santafé deBogotá

PRODUCCION DE SUSPENSIONES DE Bord...

REVISTA COLOMBIANA DE BIOTECNOLOGIA

34

producción y culminó con la vacuna usadaampliamente recuperada con células completas,preparada en forma estándar. La tercera era dió origena las vacunas acelulares actuales. La anticipadacuarta era es la de las vacunas fabricadas utilizandoingeniería genética (Manclark y Cowell, 1984).

La bacteria B. pertussis se ubica en la familiaBordetellae, género Bordetella, especie pertussis. Esun microorganismo Gram negativo, aerobio estrictoy tiende a sufrir variaciones genotípicas, de las cualesse conocen las llamadas fase I, fase II, fase III y faseIV. La fase I posee características virulentas y es uncocobacilo pequeño provisto de pili. La fase IV tieneun crecimiento pol imórf ico, no posee pi l i n icaracterísticas virulentas (Bergey, 1984).

El medio de cultivo es de gran importancia pues debesuministrar, entre otros, los requerimientos mínimossuficientes de fuentes de carbono, nitrógeno,vitaminas y factores de crecimiento. No debecontener compuestos que inhiban el crecimiento o laproducción de las proteínas de interés. La principalactividad metabólica de B. pertussis es la oxidaciónde glutamato, aunque otros aminoácidos comoprolina, serina, alanina, ácido aspártico, asparagina,histidina y lisina también pueden ser metabolizados.Se ha encontrado que el glutamato es la principalfuente de carbono, nitrógeno y energía (Bergey,1984). En los trabajos de Cohen y Wheeler (1946) yStainer y Scholte (1971) se demuestra que B.pertussis puede crecer en un medio conteniendo unamezcla de algunos aminoácidos, factores decrecimiento y sales. Una revis ión de losrequerimientos para el crecimiento de B. pertussis ycondiciones para el cultivo se encuentra en lostrabajos de Rowatt, (1957) y Parker, (1976).

En el laborator io de producción de vacunasbacter ianas del Inst i tuto Nacional de Salud,tradicionalmente se ha utilizado el método de cultivounitario estacionario en la producción de vacunapertussis, el cual tiene varias desventajas: tiemposde proceso largos, heterogeneidad por la cantidadde recipientes de cultivo empleados y control de lascondiciones de cultivo menos estrictas que enfermentador. Se tiene el propósito de desarrollar elproceso de producción de vacunas utilizando latecnología de fermentación para aumentar laproducción de vacuna y mejorar su calidad. Elobjetivo general de este trabajo fué estudiar laobtención de la suspensión de B. pertussis en unfermentador Bioflo III New Brunswick Scientific, de5L. Se plantearon como objetivos específicos:seleccionar el medio de cultivo apropiado para elcultivo de B. pertussis; determinar la cinética deconsumo de glutamato de sodio, producción de

biomasa y evolución del pH; y comparar el procesoen fermentador con el cultivo unitario estacionario.

MATERIALES Y METODOS

Microorganismo.Se utilizó B. pertussis, cepa 137, suministrada por elInstituto Butantan de Brasil, la cual es utilizada en laproducción por fermentación y posee las característicasbiológicas apropiadas para la producción de vacunas. Lacepa se conserva liofilizada y se almacena a 4°C.Con el propósito de verificar la ausencia de contaminaciónse realizaron observaciones al microscopio empleandola tinción de Gram. En el microscopio se deben observarcocobacilos Gram negativos.

Procedimiento con los cultivos.La preparación del inóculo de B. pertussis se iniciaseleccionando un liofilizado del microorganismo. Elcontenido de la ampolleta se resuspende en condicionesasépticas con 1,5 mL de solución de casaminoácidos al1%, se siembra en cajas de Petri con medio Bordet-Gengou e incuba a 35°C durante 72 horas, verificando lapureza del cultivo por tinción de Gram y observación almicroscopio. Si el cultivo es puro se hace un subcultivoen tubo inclinado con medio Bordet-Gengou, se incuba a35°C durante 48 horas, se verifica nuevamente la pureza,se recolecta asépticamente el microorganismo utilizandosolución de casaminoácidos (INS, 1995). A continuación,la suspensión se siembra en erlenmeyer de 500 mL con100 mL de medio de cultivo de producción, se mantienea 35°C en agitación a 200 rpm durante 24 horas. Paraverificar la pureza del cultivo, se hace un nuevo subcultivoen erlenmeyer de 1000 mL con 25O mL de medio deproducción, utilizando como inóculo la suspensiónobtenida en el paso anterior en un porcentaje del 10% v/v. Este mismo porcentaje de inóculo se continua utilizandoen adelante y se mantiene a 35°C con agitación a 250rpm durante 24 horas. Una vez verificada la pureza delcultivo, con esta suspensión se inocula el fermentadorde 5 L.

Medios de cultivo.El medio de Bordet-Gengou (Difco Laboratories) se utilizópara la recuperación de los liofilizados delmicroorganismo y en esta forma tener un profuso y rápidocrecimiento de este. Para la producción por fermentaciónse utilizaron los medios Cohen-Wheeler (Cohen yWheeler, 1946); FGP-1 (Medina y Reyes, 1981); Stainer-Scholte (Stainer y Scholte, 1971) y modificaciones a esteúltimo. En la Tabla 1, se presentan los medios de cultivoque diferentes investigadores han desarrollado para elcrecimiento de B. pertussis.

EQUIPOS

- Incubadora. Marca New Brunswick Scientific, NBS

35

(U.S. patent 3002.895); con capacidad para quinceerlenmeyer, con control de agitación de 0 a 500 r.p.m. ytemperatura de 0 a 60 °C, empleado en la selección delmedio de cultivo con erlenmeyers de 1000 mL.

- Fermentador. Se realizaron los ensayos en un sistemade fermentación Bioflo III - NBS, con 5L de capacidad, elcual es apropiado para el cultivo de microorganismos enforma continua y discontinua. Permite un amplio rangode condiciones de operación. Posee la instrumentaciónnecesaria para el control de temperatura, pH, agitación,oxígeno disuelto y espuma (NBS, 1993). Se verificaronlos medidores del fermentador en cuanto a su buenfuncionamiento, siguiendo las instrucciones del manualde operación del fermentador (NBS, 1993). El sensor depH fue calibrado usando soluciones buffer de pH 4 y 7antes de esterilizar el equipo.

TECNICAS ANALITICAS

Determinación de Biomasa. El método empleado paradeterminar el peso seco de biomasa, obtenida duranteel crecimiento del microorganismo fue el nefelométrico.La medición se hace por espectrofotometría, previaelaboración de una curva patrón según el procedimientomostrado por Gomez, (1997) y las unidades de medidason la absorbancia, cantidad de luz retenida por lascélulas la cual es proporcional al número de estaspresentes (Caicedo, 1996).Para la determinación de la concentración celular obtenidaen la cosecha de cultivos de B. pertussis la OMSrecomienda utilizar un método opacimétrico. La unidadde opacidad es la medición de opacidad determinada porcomparación con un estandar internacional de referenciapara la opacidad (OMS, 1979).Determinación de glutamato de sodio. Ladeterminación de glutamato en el medio de cultivo serealizó con el sistema kit Sigma Cell Culture Reagents,Glutamine/Glutamate determination-Stock No.GLN-1. Losisómeros D, no son detectados por este método. Puedendeterminarse tanto el ácido glutámico como sus sales.

Tabla 1. Composición de medios para cultivar B.pertussis

PROGRAMACION EXPERIMENTALSelección del medio de cultivo. Según se reporta en laliteratura, existen diferentes medios apropiados para laproducción por fermentación en suspensión de B.pertussis, (Cohen y Wheeler, 1946, Stainer y Scholte,1970; Medina y Reyes, 1981 y Rodriguez et al, 1993).Teniendo esto como consideración inicial se realizaroncultivos en erlenmeyer de 1000 mL con B. pertussis cepa137 en los siguientes medios de cultivo: Stainer-Scholte,Cohen-Wheeler, FGP-1 y Stainer-Scholte modificado conla adición de 0.5, 1, 2, 3, 4, 5 g/L de extracto de levadurao casaminoácidos para establecer la producción medidaen U.O./mL en estos medios y seleccionar el mejor mediode cultivo para el proceso. Se usaron 250 mL de medio,10% de inóculo, bajo condiciones de agitación a 250 rpm,35°C y tiempo de cultivo de 24 h. La suspensión obtenidase evaluó con el título en unidades de opacidad (UO)/mLy por la tinción de Gram. Con los resultados se procedióa seleccionar el medio que permite obtener los mayoresrendimientos.

Determinación de la cinética de producción debiomasa, consumo de glutamato y cambios en el pH.La B. pertussis se cultivo en un fermentador de 5L BiofloIII, NBS, sin deflectores, sin usar antiespumantes, con3.5 L del medio de cultivo seleccionado previamente, 10%de inóculo, temperatura 35 °C, pH inicial 7.6, aireaciónsuperficial, velocidad de agitación 900 rpm y velocidadde aireación de 1 volumen de aires por volumen del medioen minuto (vvm). La biomasa se determinó por peso seco,el consumo de glutamato de sodio por mediciónespectrofotométrica vía deshidrogenación y reducción deNAD+ con el kit para la determinación de glutamato/glutamina (Sigma Cell Culture Glutamine/Glutamatedetermination - Stock No.GLN-1) y los cambios del pHcon un potenciómetro Ingold, parte NBS P0720-5021. Losanteriores análisis se realizaron por triplicado.

3. RESULTADOS Y DISCUSION SELECCION DELMEDIO DE CULTIVO

En la Figura 1, se muestra la opacidad obtenida para elcultivo en erlenmeyer en diferentes medios de cultivoutilizados para la producción por fermentación ensuspensiones de B. pertussis.

Figura 1. Resultados de crecimiento para Bordetellapertussis cepa 137, obtenidos con diferentes mediosde cultivo. Condiciones: 250 mL de medio enerlenmeyer de 1 l, 10 % del inóculo, 250 rpm, 35 C.

C O M P U E S T O (g /L ) S ta in e r & F G P -1 C o h e n &

S c h o lte W h e e le r

G lu ta m a to 1 0 .7 0 1 0 .7 0

C a s a m in o 1 0 .0 0

L -P ro lin a 0 .2 4 0 .2 4

K H 2 P O 4 0 .5 0 0 .5 0 0 .5 0

K C l 0 .2 0 0 .2 0

M g C l2 .6 H 2O 0 .1 0 0 .1 0 0 .4 0

C a C l2 0 .0 2 0 .0 2 0 .0 1

T r is 1 2 1 1 .5 2 1 .5 2 3 .0 0

N a C l 2 .5 0 2 .5 0 2 .5 0

F e S O 4.7 H 2 O 0 .0 1 0 .0 1

L -c is tin a 0 .0 4 0 .0 4

A . a s c ó rb ic o 0 .0 2 0 .0 2

N ia c in a 0 .0 0 4 0 .0 0 4

G lu ta tio n 0 .1 0 0 .1 0

E x t. le v a d u ra 0 .5 0 1 2 .5 0

A lm id ó n 1 .5 0

PRODUCCION DE SUSPENSIONES DE Bord...

20

22

24

26

28

30

32

34

C-W SS

SS+1

CA

SS+3

CA

SS+5

SS+1

EL

SS+3

EL

SS+5

EL

MEDIOS DE CULTIVO

OPA

CID

AD (U

.O./m

L)

REVISTA COLOMBIANA DE BIOTECNOLOGIA

36

o extracto de levadura que proporciona la máximaproducción de biomasa. El medio Cohen-Wheeler es unmedio apropiado para la producción de suspensión de B.pertussis, y concuerda con la experiencia previa de nuestrolaboratorio, pues tradicionalmente ha usado este mediode cultivo para la producción de B. pertussis en cultivoestático.

Las suspensiones de B. pertussis obtenidas en medioStainer-Scholte y variantes de éste presentan una mejorapariencia, son más homogéneas y limpias, en cambiolas obtenidas con el medio Cohen-Wheleer son de colorcrema claro, tienden a ser ligeramente grumosas, y sepresenta formación de residuos negruzcos. Estascaracterísticas afectan la calidad del producto final,particularmente si se piensa que en la producción a escalaindustrial podrían presentarse problemas, puesto que serequerirían sistemas de recuperación de células de mayorcapacidad, como centrifugación continua y filtración, enlas cuales la formación de grumos puede disminuir laeficiencia y rendimiento de estas operaciones a pesar deno haberse presentado problemas en nuestro laboratorio,puesto que los niveles de producción son bajos y lapurificación y detoxificación del producto se hace encentrífugas y placas agitadoras de baja capacidad ypermiten garantizar la obtención de un buen producto sinmayores dificultades. Adicionalmente, la presencia degrumos en la suspensión puede conducir a la obtenciónde producto tóxico porque al interior del grumo puedenquedar células no expuestas a la acción del agentedetoxificante. Para lograr la homogeneidad de lasuspensión se requiere una fuerte acción mecánica; sinembargo, esta puede deteriorar las células y disminuir supotencial inmunógeno.

En la preparación del medio Cohen-Wheeler se requierela adición de carbón activado, el cual permite inactivarinhibidores del crecimiento como ácidos grasos y sulfuros.En medio sólido el carbón forma parte del medio, en mediofluído se filtra para retirar el carbón (Rowatt, 1957 y Stainer,1988). Para las siguientes etapas de este trabajo seseleccionó como medio de cultivo el Stainer-Scholtesuplementado con 3 g/L de CA como fuente deaminoácidos.

CINÉTICA DE PRODUCCIÓN DE BIOMASA, CONSUMODE GLUTAMATO Y pHLos perfiles cinéticos de biomasa, consumo de glutamatoy pH para el cultivo de B. pertussis son mostrados en lasFiguras 3, 4 y 5.

En la Figura 3, se observa que el cultivo inicia en la fasede crecimiento exponencial y se presenta un descenso enla concentración de glutamato (Figura 4) lo cual confirmaque efectivamente este aminoácido es metabolizado porel microorganismo, (Bergey, 1989). El pH (Figura 5) se,incrementó en el cultivo hasta valores entre 8.0 y 8.2,(Stainer, 1988).

Los medios de cultivo ensayados son apropiados para elcrecimiento del microorganismo. El medio Stainer-Scholte(SS), si bien cuenta con los requerimientos nutricionalesmínimos para el microorganismo y la opacidad obtenidacon este medio es alta, los ensayos realizados demuestranque la adición de fuentes semisintéticas de aminoácidoscomo el extracto de levadura (EL) y casaminoácidos (CA)incrementan la producción de biomasa. En las Figuras 1 y2 se presentan resultados de la opacidad, medida enunidades de opacidad, leídas en cultivos de 24 horas deedad. En la Figura 1 se muestran los resultados de laadición de extracto de levadura (EL) y casaminoácidos(CA) entre 0 y 5 g/L, así como la opacidad obtenida conlos medios de Cohen y Wheleer (C-W) y FGP-1. Losmayores valores se obtuvieron con la adición de 3 g/L deCA y EL al medio SS y una mayor opacidad del medioFGP-1 comparado con el medio C-W. Los resultadosobtenidos concuerdan con los obtenidos previamente porRodriguez y colaboradores, (1994) y Medina y Reyes,(1981). Sinembargo, la concentración de EL que reportanpara lograr la mayor producción es diferente, en el primercaso es de 0.75 g/L de extracto de levadura y en el segundocaso de 0.5 g/L de extracto de levadura. En el InstitutoButantan al medio Stainer-Scholte se le adiciona 0.5 g/Lde casaminoácidos, obteniéndose en todos los casosopacidades similares a las alcanzadas en este trabajo. Esteresultado puede deberse a diferencias en las cepas delmicroorganismo utilizadas en los diferentes trabajos, a lossistemas de cultivo empleados y a los lotes de materiaprima utilizados en la preparación del medio de cultivo.

Figura 2. Influencia de la adición de casaminoácidos(CA) y extracto de levadura (EL) en la producción debiomasa Bordetella pertussis cepa 137. Condiciones:250 mL de medio en erlenmeyer de 1 l, 10 % del inóculo,250 rpm, 35 C.

Los resultados permiten preveer la importancia deenriquecer el medio de cultivo Stainer-Scholte cuando esutilizado en producción, y también encontrar para cadalote de materia prima cual es la adición de casaminoácidos

20

25

30

35

40

0 1 2 3 4 5Adición (g/L)

Opa

cida

d (U

.O./m

L)

EL CA

PRODUCCION DE SUSPENSIONES DE Bord ...

.6

.4:::J .2:9 1~(f) 0.8~:2; 060as 0.4

0.20

0 4 208 12 16

TIEMPO (h)

Figura 3. Perfil de crecimiento de Bordetellapertussis cepa 137, 3,5 L de medio 55 + 3 gIL CAen fermentador de 5 L, 10 % de lnoculo, 900 rpm,1 vvm, 35 C.

En la Figura 3, se observa que el cultivo inicia en lafase de crecimiento exponencial y se presenta undescenso en la concentraci6n de glutamato (Figura4) 10 cual confirma que efectivamente estearninoacido es metabolizado por el microorganismo,(Bergey, 1989). EI pH (Figura 5) se increment6 en elcultivo hasta valores entre 8.0 y 8.2, (Stainer, 1988).

912 ,-------------------,

~;; 10<l:f--3 8<.9wo 6zo~ 4-a::f--

i:5 2oZ80l------+------+----+-----~

o 8 12 16

TIEMPO (h)

Figura 4. Perfil del consumo de glutamato desodio en el cultivo de Bordetella pertussis cepa137.

8.1 --,..-----------------.,

8 -7.9

~ 7.8

7.7 --

7.6

7.5

4 20

o 4 12 16 208

TIEMPO (h)

Figura 5. Perfil cinetlco de la evaluaclon de pHen el cultivo de Bordetella pertussis cepa 137.

EI perfil de biomasa (Figura 3) se ajusta a una curvade tipo sigmoide y se puede describir por medio de unmodelo logistico:

XLn(-)

Xoa Ec. 1

1 + ibc1)

24 Donde X Y Xo son concentraciones de biomasa en glL; en cualquier instante de tiempo y en el tiempo inicialrespectivamente, t es el tiempo en horas; a = 2.511,b = 2.323, Y c = 0.225 son constantes de ajuste. Estasconstantes no tienen senti do biol6gico, pero si elmodele es adecuadamente manipulado se puedetransformar en una ecuaci6n con parametresbiol6gicos como 10 muestra Zwieteering et ai, (1990)con la ecuaci6n:

X ALn(-) =

Xo 1 + i4~m(0d")+2)

Ec. 2

Donde IJm es la maxima velocidad especifica decrecimiento; A, el maximo valor de Ln(X/Xo) quealcanzarla el cultivo y qd el tiempo de la fase lag delcultivo. Comparando las dos ecuaciones anteriores seencuentra IJm=0.141 h·1,A=2.511 yqd=1.43hy X=1.5187 9 celulas/l, = 43 U.O./mL.

La concentraci6n de glutamato en el medio de cultivoversus tiempo (Figura 4) sa ajust6 a un modelopolin6mico de orden 3, sequn la siguiente ecuaci6n:

S = a + bt + ct' + dt3 Ec. 324

Donde S es la concentraci6n de glutamato en el mediode cultivo en giL; a = 11.018, b = -0.056, c = -5.15x1 O'3 Y d = -7.46 son constantes de ajuste del modelo. Seobserva que en 24 h de cultivo no se ha consumidototal mente el glutamato de sodio.

24

Se grafic6 la concentraci6n de biomasa versusconcentraci6n de sustrato residual en el medio decultivo (Figura 6) obteniendose de la pendiente de estael rendimiento observado biomasa/sustrato yxJs= 0.254g cel./g glutamato. Como esta qrafica se ajusta muybien a la ecuaci6n de una linea recta, se puede decirque este coeficiente de rendimiento permaneceaproximadarnente constante durante el cultivo.Rodriguez y colaboradores (1993) investigaron lacinetica de crecimiento de B. pertussis, en un cultivocontinuo Iimitado por glutamato, encontrando para elrendimiento te6rico (y'x/s ) un valor de 0.33 g cel/gglutamato y el coeficiente de mantenimiento (ms) de0.07 g glutamato por g de biomasa por hora.

37

REVISTA COLOMBIANA DE BIOTECNOLOGIA

1.6 -,.-----------------,

:J' 1.4:a3 1.2~ 1:;z 0.8 -

~ 0.6

~ 0.4 -iii 0.2

o5 7 9 11

SUSTRA TO RESIDUAL (giL)

Figura 6. Curva de ajuste de biomasa vs sustrato encultivo de Bordetella pertussis cepa 137.

En el cultivo de B. pertussis el pH se va incrementandodesde 7.6 hasta aproximadamente 8.2 (Figura 5). Laevoluci6n del pH en funci6n del tiempo se ajust6 a unmodelo cuadratico, sequn la siguiente ecuaci6n:

pH = a + bt + ct' Ee. 4

Donde a = 7.6, b = 0.011, c = 0.00028 son constantes deajuste del modelo. La elevaci6n del pH durante el cultivose debe, principalmente a que el microorganismoconsume aminoacidos y que posiblemente se generaamoniaco durante el cultivo (Stainer, 1988).

En la Figura 7 se muestran los resultados obtenidos endos cultivos realizados en fermentador de 5L Bioflo III,NBS en las mismas condiciones de operaci6n de losensayos realizados para determinar la cinetica deproducci6n de biomasa, consumo de glutamato y cambiosdel pH con el prop6sito de confrontar la capacidad delmodelo cinetico de representar la producci6n de biomasaen terrninos de opacidad del cultivo. Se observa que elmodele describe bien la producci6n de biomasa.

40 r------------------:a.~ 35 -....JE 30g 25--

-0 20CIl:s 15

~ 10o 5 ..... _0""- !....- ---l

o 4 8 16 2012

Tlsmpo (h)

Figura 7. Ensayo de cornprobacion, Cultivo deBordetella pertussis cepa 137, 3,5 I de medio 55 + 3gil de CA en fermentador de 5L, Modelo , ensayo 1,ensayo 2 .Las opacidades finales de estos dos cultivos de B.

38

pertussis en fermentador fueron 33 y 35 UO/mL. Conestos resultados se puede hacer una comparaci6n entrela producci6n en fermentador y el cultivo estatico enbote lias de Roux que corresponde a la tecnologia utilizadaactual mente en nuestro laboratorio. En la Tabla 2, sepresentan los resultados obtenidos en lotes de producci6nen cultivo estatico de B. pertussis cepa 137 en nuestrolaboratorio de Vacunas Bacterianas.

13Tabla 2. Resultados de la produce ion de suspensionde B. pertussis en cultivo estatlco en bote lias deRoux.

Grupo No. Placas n Opacidad de la suspension (U)

22 460

29 810

28 660

29 660

26 610

29 610

26 510

26 510

30 960

30 1010

30 960

10

11

* Cada grupo 10conforman 30 bote lias placas sembradas, este nurnerocorresponde a bote lias no contaminadas en el grupo.** Opacidad en UO/mL, en un volumen final de suspensi6n de 200mL.

24

Para comparar las dos tecnologias se utilizaron losindicadores intensidad y productividad. Se define laintensidad como las unidades de opacidad producidaspor unidad de volumen en la unidad de tiempo (G6mez,1997), de esta manera en el proceso estatico unasuspensi6n con una opacidad promedio de 705.4 UO/mL en un volumen de 200 mL equivale a una producci6nde 141.080 UO/grupo. Para cada grupo se utilizan 30placas con 200 mL de medio y el cultivo requiere 72 hpor 10 tanto la intensidad del cultivo es de 0.326 UO/mLh.La productividad corresponde a las unidades de opacidadproducidas por unidad de tiempo (G6mez, 1997), en laproducci6n normal se cultivan 9 grupos seman alesobteniendose una productividad de 1'269.720 UO/semana. Para el cultivo en fermentador se obtiene unaopacidad promedio de 34 UO/mL en 48 horas de cultivoen un fermentador de 5L con un volumen de trabajo de3.5L loqrandose una intensidad de 0.705 UO/mLh y unaproductividad de 118.440 UO/semana solamentehaciendo un cicio de fermentaci6n a la semana. AI escalarel proceso y produciendo suspensiones con la mismaopacidad en un fermentador de 50 L con un volumen detrabajo de 35 L, en un solo cicio de fermentaci6n se puedelograr la misma producci6n de 9 grupos en cultivoestacionario. Con los valores de intensidad para las dostecnologias se prevee que para lograr la mismaproductividad de 1'269.720 UO/semana, en cultivoestatico se consumen 54 L de medio de cultivo mientras

39

que en fermentador se requieren solamente 38 L. Estascomparaciones son válidas no obstante que los mediosde cultivo para los datos comparados son diferentes,sinembargo el medio de Cohen-Wheeler da resultadosno muy lejanos del medio seleccionado aquí para el cultivoen fermentador. Mediante estos indicadores se puedeapreciar que es mas favorable implementar la tecnologíade producción de suspensión de B. pertussis enfermentador. Los resultados de la Tabla 2 muestran queel nivel de pérdida de producto por contaminación es altocon la tecnología actual, este aspecto puede controlarsemejor en el cultivo en fermentadores mientras se cuentecon unas instalaciones apropiadas para la producción debiológicos y con el personal idóneo para trabajar en estetipo de industria (OPS-INS, 1996).

CONCLUSIONESLos medios de cultivo Cohen-Wheeler y Stainer-Scholtey sus modificaciones con adición de casaminoácido yextracto de levadura son apropiados para el cultivo de B.pertussis porque producen suspensiones con altaopacidad. Además los microorganismos presentan unamorfología típica de la fase I, sin pleomorfismo y/opolimorfismo de las células, adecuada para la producciónde vacuna.

La adición de fuentes semisintéticas al medio Stainer-Scholte incrementan la opacidad final de los cultivos deB. pertussis. Con 3 g/L de casaminoácidos se alcanzahasta 21% de incremento y con 3 g/L de extracto delevadura 14%. Lográndose así suspensiones de mejorapariencia frente a las suspensiones obtenidas en medioCohen-Wheeler.

La cinética de crecimiento de B. pertussis en medioStainer-Scholte adicionado de 3 g/L de casaminoácido

puede ser descrita por un modelo de tipo logístico. Segúnesta ecuación la velocidad específica de crecimientomáxima es 0.141 h-1 y la máxima concentración de célulases 1.518 g/L equivalente a aproximádamente 43 UO/mL. Los ensayos de comprobación mostrados en laFigura 7 permiten corroborar la bondad del modelo.

Se corrobora que B. pertussis tiene la capacidad demetabolizar aminoácidos tal como fue reportado porRowatt, (1957); Lane, (1970); Stainer, (1970); Parker,(1976); Bergey, (1984).

El cultivo se inicia con un pH de 7.6 y finaliza con valoresentre 8.0 a 8.2. El pH se incrementa durante el cultivodebido a que no se controla y la bacteria B. pertussisutiliza oxidativamente glutamato y otros aminoácidos conproducción de amoniaco y dioxido de carbono (Bergey,1984).

Al comparar la intensidad del proceso en cultivo estáticocon el cultivo en fermentador se obtiene para el estático0.326 UO/mLh y en fermentador 0.705 UO/mLh. Laproductividad del cultivo estático es 1´269.720 UO/semana, que en fermentador puede ser alcanzada en unciclo con un fermentador de 50L. Estos resultadosconsolidan el proceso de obtención de suspensión de B.pertussis en fermentador como la mejor alternativa frentea la tecnología de cultivo estático. Sinembargo, serequiere hacer pruebas biológicas que permitandeterminar si la suspensión de B. pertussis obtenida enfermentador reune los requerimientos técnicos de la OMSpara la formulación de vacunas con este antígeno.

AGRADECIMIENTOSAl Ing. Gustavo Buitrago, del Instituto de Biotecnologíade la Universidad Nacional de Colombia por sus valiosasorientaciones.

BIBLIOGRAFÍA

Bergey D. 1984/86/89. Bergey‘s manual of systematic bacteriology.Baltimore: Williams & Wilkins. Vol 4.Caicedo L.1996. Curso de Biotecnología - Magister en IngenieríaQuimica, Universidad Nacional de Colombia.Cohen S.M. Y Wheeler M.W. 1946. Pertussis vaccine prepared withphase I cultures grown in fluid medium. Amer. J. Publ. Hlthl, 36, 371-376.Gomez A. 1997, Evaluación de la fermentacion como un procesoalternativo de producción de toxina difterica. Tesis magister enmicrobiologia, Pontificia Universidad Javeriana.INS. 1995. Manual de producción de Bordetella pertussis. SubdirecciónIndustrial - INS.Lane A.G. 1970. Use of Glutamic Acid to suplement Fluid Medium forCultivation of Bordetella pertussis. Applied Microbology, 512-520.Manclarck C.Y Cowell. 1984. J. Pertussis, En: Germanier, Rene.Bacterial vaccines, Academic Press, Londres.Medina A, M. T. Y Reyes E. 1981. “Estudio comparativo de los mediosde cultivo HBP-2 y FGP-1 en la producción de Bordetella pertussispor fermentación”. Salud Pública de México, Vol XXIII, Nº 6, 575-584.NBS. 1993. Manual of operation fermentator Bioflo III, Edison N.J.

OMS. 1979. Manual para la producción y control de vacunas- Bordetellapertussis.OPS-INS. 1996. Taller de Buenas Prácticas de Manufactura (BPM).Santafé de Bogotá.Parker C.C. 1979. The genetics and physiology of Bordetella pertussis.En: Third International Symposium on Pertussis. (Eds. C. R. Manclark,J. C. Hill), DHEW Publ. No. NIH 79-1830, Washington, DC., 65-69.Rodriguez M. 1993. “Effect of hydromechanical forces on theproduction of filamentous haemagglutinin and pertussis toxin ofBordetella pertussis”. Journal of Industrial Microbiology, 12, 103-108.Rowatt E. 1957. The growth of Bordetella pertussis: a review. J. Gen.Microbiol., 17, 297-326.Stainer D. 1988. Growth of Bordetella pertussis. En: Wardlaw, A.,Parton, R. Pathogenesis and immunity in Pertussis. De. John Wiley,Glasgow, 19 - 32.Stainer, D. Y Scholte. 1971, M. “A simple chemically defined mediumfor the production of phase I Bordetella pertussis”. Journal of GeneralMicrobiology, 63, 211-220.Zwietering, M.H. 1990. Modeling of the bacterial growth curve. Appliedand Envionmental Microbiology, Vol. 56, No.6, 1875-1881.

PRODUCCION DE SUSPENSIONES DE Bord...