Problemas HPLC

8/20/2019 Problemas HPLC

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Consejos para el mantenimiento de su equipo de HPLC

Resolución de Problemas en

Técnicas, Consejos , y Trucos

Agilent Technologies

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Pasos en la Resolución de Problemas

¿Cómo lo solucionas?

•1st ¿Falló el sistema o la calibración de la muestra?

Hacer Blancos•2n Revisar el cumplimiento del método

– ¿ Se ha seguido el procedimiento adecuadamente?

– ¿ Son correctos los parámetros en el instrumento?•3rd Hágase más preguntas!

– ¿Cuándo funcionó correctamente el sistema por última vez?

– ¿ Se ha cambiado alguna cosa?

• th – Lo obvio no es siempre la causa – Hubo más de un cambio?

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Bomba

In ector /Automuestreador

Columna

Sistema de datos/Integrador

Los roblemas ueden estar relacionados con todos loscomponentes del sistema

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Encuesta a usuarios en LC-GC sobre Problemas de Columnas

Alta presión, fritas obstruidas 24%

Pobre reproducibilidad (formas de

pico, retención)

16%

Perdida de resolución 13%

Inestabilidad 11%

Volumenes muertos 8.1%Fugas, conexiones 4.8%

Rango de pH 2.0

Bajo numero de platos 2.0%

.

Cost 1.7%

Miscellaneous 15%

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Problemas de Presión

Sintomas de la columna Posibles causas

-

- Contaminación de la

- Obstrucción en el

Baja presión - Fuga- Flujo incorrecto

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Corrección de la sobrepresión

Determinación de la causa y corrección de una presión alta

.Comprobar la presión del sistema con y sin columna.

Si la resión con columna es alta: • Hacer un Back flush a la columna (con cuidado para el rendimiento futuro)• Limpiar la frita bloquead (flujo reverso con un solvente fuerte)

•

Eliminar la contaminación en la column y limpiar el empaquetado bloqueadoRetirar compuestos adsorbidos de alto peso molecular

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Obstrucción del empaquetado

Tamaño departícula

Area(um2)

Diam intersticialmedio (um)

Porosidad dela frita(um)

5.0 2.7 0.9 2.0

3.5 1.3 0.6 2.03.0 . 0.6 .

2.7 0.7 0.5 2.0

. . . .

1.7 0.3 0.3 0.5

u a o con as ases m v es ampona asLos tampones contienen material insoluble– filtrar

de orgánico* - evitar 100%B con tampones salinos*Schell inger,A.P. and Carr,P.W., LC-GC North America, 22, 6, 544-548 (2004)

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Solubilidad del tampón

La Tabla I resenta una estimación de la concentrationsoluble del tampón menos soluble (fosfato potásico a pH 7.0)en tres solventes orgánicos

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Solubilidad de 5 tampones en mezclas con , ,

acetonitrilo THF

El trazo — representa acetato amónico a pH 5.0, •••• representa fosfato amónico. , --- . , – –

amónico a pH 7.0, y – – representa fosfato potásico a pH 7.0.

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Cambiar la frita puede no ser buena idea

Puede dañar columnas de alto rendimiento

CompressionColumnInlet Frit

Ferrule

Wear glovesDo not allow bed to dr

Column Body

Do not touch the column -

body heat will extrude packing

Do not overtighten

Female End Fitting

Male End Fitting

Consejo: Prevenir es mucho mejor!

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Tecnicas de Prevención- La mejor elección!

• Usar protección de la columna

- Filtros en linea- Salva columnas

• Filtrar las muestras

Fácil

• Filtrar fases móviles tamponadas

• Extracción de la muestra(i.e. SPE)No tan fácil• Lavado apropiado de la columna

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Limpieza de la columna

Limpiar con solventes más fuertes que la fase

óvil

Opciones de Solventes de Fase Reversaen orden de fuerza creciente

Use al menos 25mL de cada solvente para columnas analíticas

• Fase Móvil sin sales de tam ón

• 100% Metanol• 100% Acetonitrilo

•DebeEsto lleva tiempo,

• 100% Isopropanol

• 100% Cloruro de Metileno*

*

Re-Equilibrar

Offline

*Consejo: Cuando use Hexano o Cloruro de Metileno debe lavar la columna con

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.





¿Cuáles son los problemas más comunes

1.Picos dividos

2. Colas en los picos (simetría <1 )

. .

• - . .ensanchamniento y colas o colas al incrementarse la retención.

cromátograma.

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• a a uno e es os pro emas pue en ener m p es causas.



Picos dobles por perturbacion en el flujo

•Perturbación en el flujo por un volumen muerto

• a mues ra uye por eren es v as a rav s ela columna

•Pobre empaquetamiento de las partículas

•El pH alto disuelva la Silice

Picos dobles o partidos

Normal Picosdobles

Consejo: Un efecto similar se produce con una frita

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Picos divididos por efectos del solvente

Columna: StableBond SB-C8, 4.6 x 150 mm, 5 μm Fase móvil: 82% H2O : 18% ACNVolumen de inyección: 30 μL Muestra: 1. Cafeina 2. Salicilamida

1

.100% Acetonitr ilo

.Fase Móvil

1

2

2

0 10Time (min)

0 10Time (min)

Consejo: Inyectar un solvente más fuerte que la fase móvil puede provocar problemasen los picos tales como picos divididos o ensanchamiento

Truco: Mantener la concentración de orgánico en el solvente de muestra < Fase móvil

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o as, ensanc am en oy perdida de eficacia

Pueden ser causadas por:• “Interacciones secundarias” en

• Contaminación en la Columna

• nve ec m en o e a co umna

• Saturación de la columna• Efectos extra columna

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Forma del pico: Colas en los picos

Simetría > 1.2Causas

Algunos picos con cola:

Interacciones secundarias – Efectos de

Retención

Normal Cola

. Pico pequeño eluyendo en la cola de un pico

mayor.

Todos los picos con colas:

Efectos extra-columna. Acumulación de contaminación en la

entrada de la columna. Metales pesados. Mala columna.

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Colas en los picos- Contaminación en laColumna

Consejo: Test Rápido para Determinar si la Columna está Sucia o está DañadaTruco: Revetir la columna y analizar–Si hay mejora, una limpieza puede

- -

Test QC dirección Test QC dirección inversa Test QC despues lavado°

3

3

3Platos TF

1. 7629 2.08Platos TF

1. 7906 1.43

Platos TF

1. 7448 1.06

correcta ,

2

2

2

. .

3. 13727 1.694 13355 1.32

2. 12443 1.21

3. 17999 1.194 17098 1.25

2. 12237 1.21

3. 15366 1.114 19067 1.17

41

41 41

0.0 2.5 5.0

Time (min)0.0 2.5 5.0

Time (min)

0.0 2.5 5.0

Time (min)

Columna: StableBond SB-C8, 4.6 x 250 mm, 5μm Fase Móvil: 20% H2O : 80% MeOH Flujo: 1.0 mL/min

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Temperatura: R.T. Detección: UV 254 nm Muestra: 1. Uracilo 2. Fenol 3. 4-Cloronitrobenzeno 4. Tolueno



Forma de Picos: Picos con Frente (Fronting)

2000

1500

1000

m A U

500

0

0 5 10 15 20 25

NormalFrontingSimetría < 0.9

empo m n)

Causas:

Saturación de columna

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Colas en los picos/Ensanchamiento

Efectos de carga de muestraColumnas: 4.6 x 150 mm, 5μm Fase Móvil: 40% 25 mM Na2HPO4 pH 7.0 : 60% ACN Flujo: 1.5 mL/min

°empera ura: ues ra: . es pram na . or r p na . oxep na . m pram na . m r p na . r m pram na

Ensanchamiento A. Alta CargaPlatos de una C8.x10

C D

Eclipse XDB-C8USP TF (5%) i

1. 850 59412. 815 78423. 2776 62314. 2539 8359

1. 1.60 1.702. 2.00 1.903. 1.56 1.564. 2.13 1.70

0 5 10Time (min)

0 5 10Time (min)

B. D.Baja Carga5. 2735 100226. 5189 10725

5. 2.15 1.866. 1.25 1.25

0 5Time (min)0 5

Time (min)

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Dispersión Extra-Columna

Aumentando el Volumen Extra-Columna

n Use tubos cortos de pequeño diámetro interno entre el inyector yla columna y entre la columna y el detector.

n Asegúrese de que todas las conexiones de los tubos estánhechas con los fittings adecuados.

n Use una celda de detector de bajo volumen.

n Inyecte pequeños volumenes de muestra.

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Consejo: Malas Conexiones en el HPLC

pue en ausar nsanc am en o e cos

– Todas las longitudes de los Tubos son Mínimas

– e us e ame ro m s peque o e u o

– Una celda de flujo de volumen adecuado

Volumen Extra-Columna

¿ u es ma

¿ha hecho las conexiones adecuadamente?

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Conectores de Columna Usados en HPLC

Swa elok Waters

, . . . . .

0.090in .

0.130in .

0.090 0.170in .

Parker Rheodyne

.

Valco Uptight

0.090in.

0.080in.

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¿Qué Ocurre si las conexiones no son correctas?

Incorrecto … demasiado largo

La Férrula no asienta adecuadamente

Incorrecto … demasiado corto

Si la distancia X es muy larga, habrá fuga Cámara de mezclaX

Si la distancia X es demasiado cor ta, segenerará un volumen muerto o cámara demezcla

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Los cambio en Retención puedes ser Químicos o

Físicos

ue en es ar causa os por:

• Enve ecimiento de la columna• Contaminación de la columna

•

• Pobre combinación columna/fase móvil

• Cambio en el flujo.

•

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Enve ecimiento de la fase móvil/E uilibración

Causan Cambios en la Retención/SelectividadColumna 1 – Tras lavado con

1% H3PO4 /Equilibracióno umna – a s gu en eColumna 1 - Inicial

2 2

0 3 5 9 12 15Time (min)

0 3 5 9 12 15Time (min)

• El analito primario era sensible al envejecimiento de la fase

movil/ acondicionamiento de la columna• La forma de pico fue un asunto secundario (compuestoquelante de metal)resuelto por “des-activación” de la

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Los compuestos sensibles a los metales

pue en ue arsePista: Busca un par solitario de Electrones en :

:

:O: o N que pueda formar anillos de 5 or 6miembros con un Metal

OH

M +2

OH + M+2

:

:

:

Salicilaldehido Complejo Anillo de 6-miembros

OH :

:

M +2C O

OHC N

N: M +2 :

:

:

8-hidroxiquinolinaComplejo Anil lo de 5-

a-benzoinoxominaComplejo Anil lo de 5-

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pH de la Fase Móvil y pH de tampones

•El pH afecta la Ionización

– Superficie de la Silica de la Columna

– Componentes de Interés de Muestra

• Tampones –

– Mejoran la Forma de Pico de los Compuestos Ionizables

• Efectos en el tiempo de Vida de la Columna

– Hs ba os liberan las cadenas al uilicas de la Fase estacionaria – pHs altos Disuelven la Silica

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,



¿Porqué preocuparse del pH?,

- + Ka =[[RCOO-][H+]

= -5

COOH COO _

.pKa = 4.2+ H+

A pH 4.2 – la muestra contiene ácido benzoico e ión benzoato en proporciónde 1:1. La forma de Pico puede ser pobre

A pH 5.2 – el 91% de la muestra es ión benzoato. La retencion RP disminuye. A pH 3.2 – el 91% de la muestra es ácido benzoico. La retencion RP aumenta.

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Efecto del pH en la Forma de Pico

a

Columna: ZORBAX SB-C8 4.6 x 150 mm, 5 mm Fase Móvil: 40% 5 mM KH2PO4: 60% ACNFlujo: 1.0 mL min. Temperatura: RT

CH3CHCOOH

. .

CH2CH(CH3)2

IbuprofenopKa = 4.4

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10Time (min) Time (min)

• Cuando se trabaja cerca del pka de un analito se obtienen picos con colas y esto

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.

P é d l H?



¿Porqué preocuparse del pH?,

+R3NH+ R3N + H+

Ka =[R3NH+]

-a

pKa = 9CHOCH CH N

2 2

CH3

∅H

CH3

∅

CHOCH CH N2 2 + H+

3 3

A pH 9 – la muestra contiene difenhidraminas protonadas y desprotonadasen relación 1:1. La forma de pico puede ser pobre

p – e a mues ra es en ram na espro ona a. A pH 8 – 91% de la muestra es difenhidramina protonada.

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pH vs. Selectivdad para Acidos y Bases

5

Columna: Nucleosil-C18Fase Móvil: 45% ACN/55% tampón fostato

Muestra: Acidos Biliares

Columna: mBondapak-C18Fase Móvil: 60% 25 mM tampón fostato

40% Metanol

SCD1.5

40

6

.2. Fenobarbital3. Fenacetin4. Nicotina

5. Metamfetamina

5

1.0

k «

30

o n

UDC

SOC4

2 +0.5

l o

4

20

R

e t e n t i

+++

3

17,12 - OC

C

12-OC J.C. 111(1975) 149

+

+

1

0.0 310J.C. 268(1983) 1

-0.53 4 5 6 7 8 pH

B C

3 5 7 9

ELUENT pH

10

Page 36

.

I i d l H l T



Importancia del pH y los Tampones

•Por qué la Muestra impone las condiciones de uso•Qué pasa cuando el tampón se usa con efectividad

• u pasa cuan o se gnora e amp n o se usainadecuadamente

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T á d F R HPLC



Tampones más usados en Fase Reversa HPLC

Buffer pKa Buffer Range UV Cutoff (nm)

Phosphate 2.1 1.1-3.1 200

7.2 6.2-8.2

12.3 11.3-13.3

Formic acid* 3.8 2.8-4.8 210Acetic acid* 4.8 3.8-5.8 210

Citrate 3.1 2.1-4.1 230

4.7 3.7-5.7

5.4 4.4-6.4

Tris 8.3 7.3-9.3 205

Triethylamine* 11.0 10.0-12.0 200

Pyrrolidine 11.3 10.3-12.3 200

* Volatile buffers for LC/MS applications

La capacidad de tamponamiento óptima se dá a un pH igual al pKa del tampon. La mayoría deos tampones t enen una capac a a ecua a e tamponam ento para contro ar e p e a asemovil solo en ±1 unidades de su pKa

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N T Ti d H T Aj t l



No Tengo Tiempo de Hacer Tampones o Ajustar el…

Columna: StableBond SB-C184.6 x 150 mm, 5 mm

B: 80% MeOH

Flujo: 1.0 mL/min.

Temperatura:35°C

Detección UV:254 nmMuestra: Fármacos Cardíacos

Incluso a mu alto % MeOH La ma óría de

interaccionessecundarias

componentes fuertemente retenidos muestran

pobre forma de pico debido al IEX en lasuperficie

e a mues ra

(aminas) conla superficie dela columna

0 5 10 15 20 25

Time (min)

Page 40

.

¿Qué pasa si trabajas fuera del rango del tampón?



¿Qué pasa si trabajas fuera del rango del tampón?

2

Columna: StableBond SB-C184.6 x 150 mm, 5 mm

Fase Móvil: A: 30% 25 mM NaH2PO4, pH 4.8 no tamponado

B: 70% MeOHSe añadió

1

. .

Temperatura:35°C

Detección UV:254 nm

Muestra: Fármacos Cardíacos

amp n,pero no

.2. Dipyridamol

3. Nifedipina4. Lidoflazina5. Flunarizina

Forma de Pico Inadecuada

pH a 4.85

34

0 5 10 15 20 25Time (min)

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N l id El i l l d d l H d l



No olvidar- Elegir la columna adecuada al pH de la

pH Alto y Temperatura Ambiente (pH 11 RT)

Fase Móvil : 50%ACN: 50% Agua : 0.2% TEA(~ pH 11, disolución de la sílica)

Después de 30 inyecciones

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Efecto del Tiempo de Respuesta del Detector



Efecto del Tiempo de Respuesta del Detector -

Bajas Velocidades de Adquisición Pueden Dificultar la Detección de Impurezas y

Reducir la Sensibilidad

0.1 seg

Tiempo de Respuesta

Agilent 1100 DADAgilent 1100 WPS with ADVR

Columna: Poroshell 300SB-C180.2 seg1er pico = 1.2 seg

A 20 pts/seg = 24 pts

. ,Fase Móvil:

A: 95% H2O, 5% CAN con 0.1% TFAB: 5% H2O, 5% CAN con 0.1% TFA

Flujo: 2 mL/min

0.5 seg

1er pico = 1.2 seg

Temperatura:70°C

Detector: UV 215 nm

Embolada de Piston : 20

.

2.0 se

A 5 pts/seg = 6 pts

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9

Time (min)

1.0

Muestra:1. Neurotensina 3. Lisozima2. RNasaA 4. Mioglobina

•

Page 43

.

Conclusiones



Conclusiones

Los problemas en Columnas HPLC más comunes son:• Alta Presión (Prevenir mejor que curar)

• Malas Formas de Pico

• Cambio en la Retención/Selectividad

A menudo estos problemas no están asociados con la columna y puedenser causados por el instrumento o por problemas químicos:

•

• Conexiones del Instrumento• Parámetros del Detector

• Contaminación por Metales

Comenzar con las pregunta correctas

• ncon rar as respues a• Las respuestas conducirán a soluciones

Page 44

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Problemas HPLC