1

Raport științific sintetic

privind implementarea proiectului: “Ion sensing and separation through modified cyclic peptides,

cyclodextrins and protein pores”/ “Detecţia şi separarea ionică prin intermediul peptidelor

ciclice, al ciclodextrinelor şi al porilor proteici”, pe toată perioada de execuție (2012-2016)

În acest proiect ne-am propus să proiectăm şi să realizăm unele nanostructuri capabile să

detecteze şi să separe molecule individuale şi ioni, activități ce reprezintă un domeniu

actual şi important de cercetare. În acest sens, o atenţie deosebită a fost acordată

nanostructurilor proteice, datorită capacităţii lor reglabile de recunoaştere moleculară şi a

metodelor facile de modificare chimică a acestor molecule, factori de importanţă majoră

într-o multitudine de aplicaţii. Obiectivele propuse în acest proiect sunt:

O1: Obiectivele includ managementul contractului (comunicare şi raportare), monitorizarea

calităţii şi sincronizarea rezultatelor proiectului, precum şi managementul cunoştinţelor

acumulate pe parcursul proiectului. Coordonatorul de proiect (CO) va lucra îndeaproape cu

Comitetul ştiinţific (CS) (echipa de coordonatori ştiinţifici), asistat de către Managerul de

Proiect (PM) şi directorul economic (AC):

O2: Proiectarea, sintetiza şi analiza structurală a diferitelor tipuri de compuşi organici

macrociclici (I) şi peptide ciclice (II) ca posibile sisteme gazdă pentru fixarea în porii proteici de

α-HL sau pentru depunerea pe diferite suprafeţe polimerice: de Au şi Si:

O3: Testarea sistemelor moleculare inovatoare bazate pe adaptori moleculari reprezentaţi de

peptide ciclice şi compuşi organici macrociclici care pot să detecteze, să separe şi să cuantifice

liganzi specifici, printr-o proiectare raţională a interacţiunilor care au loc în interiorul

lumenului porului proteic de α-HL inserat într-un bistrat lipidic.

O4: Dezvoltarea de noi metode pentru studierea proprietăţilor membranare şi a modificărilor

comportamentului celular.

O5: Proiectarea şi caracterizarea SAM-urilor moleculare funcţionalizate pe suprafeţe de Au, Si

şi polimer/sticlă pentru aplicaţii electronice (bio)moleculare.

O6: Testarea suprafeţelor funcţionalizate pentru ataşarea selectivă de celule.

O7: Ințelegerea mecanismelor care stau la baza proprietăților de transfer electronic între

biomolecule și suprafață, distribuția lor de sarcină sau influența linker-ului. Fabricarea de

micro-nano-rețele.

2

Consorțiul este format din:

(CO): Universitatea “Alexandru Ioan Cuza” Facultatea de Fizică, Iaşi, România

(P1): Institutul Naţional de Cercetare Dezvoltare pentru Tehnologii Izotopice şi Moleculare, Cluj

Napoca, România

(P2): Universitatea „Babeş - Bolyai”, Facultatea de Chimie, Cluj-Napoca, România

(P3): Institutul Naţional de Cercetare - Dezvoltare pentru Fizică şi Inginerie Nucleară “Horia

Hulubei” - IFIN-HH, Bucureşti, România

(P4): Universitatea de Medicină şi Farmacie "Carol Davila", Bucureşti, România

Datorită complexității acestui proiect, coordonatorul împreună cu partenerii din consorțiu au

realizat 2 workshop-uri în perioada 10-12 iunie 2014 și 25-28 iunie 2016. În cadrul acestor

întâlniri fiecare partener și-a prezentat rezultatele obținute dar și provocările cu care s-au

confruntat. Comunicarea nu s-a rezumat doar la această întâlnire ci s-a realizat și prin discuţii

bilaterale (chat, mail-uri, telefon).

Activitățile desfășurate în 2012-2016 au fost concentrate pe realizarea activităților cuprinse în

planul de activități. O primă serie de compuși macrociclici cu grupări bitiofen au fost sintetizați

printr-o metodă clasică pornind de la derivați ai bitiofenului decorați cu grupări hidroximetil și

oligoetilenglicoli activați (Schema 1).

Schema 1. Derivați ai bitiofenului decorați cu grupări hidroximetil și oligoetilenglicoli activați

Acești compuși prezintă interes deoarece partea bifenilică poate electropolimeriza formând un

polimer conductor. Această metodă ar fi una extrem de simplă și de eficiență maximă pentru a

depune macrocicluri pe diverse suprafețe.

Macrociclurile 3 și 4 nu au format polimeri stabili, dar compusul 2 (Schema 1) a format un astfel

de polimer a cărui stabilitate este remarcabilă. Poly(2) a fost testat pentru a vedea dacă

complexează cationi din grupa I. Metoda de investigare a fost una electrochimică bazată pe

voltametria ciclică. Astfel, s-au înregistrat voltamogramele polimerului singur și apoi pe rând în

prezența a câte unui cation din grupa I. Cu excepția Li+, pentru ceilalți cationi nu s-au înregistrat

modificări ale voltamogramelor. Pentru Li+ se observă o deplasare remarcabilă a potențialului de

oxidare de 70 mV, astfel încât poly(2) est un candidat important pentru construcția de senzori

selectivi pentru cationii de litiu.

3

O a doua serie de compuși macrociclici s-au obținut pornind de la derivați disubstituiți ai

fenotiazinei tot în reacție cu oligoetilenglicoli ditosilați (Schema 2).

Randamentele reacțiilor sunt corecte 32-57 %, randamentul cel mai mare fiind obținut pentru

compusul cu cinci unități etilenoxid, caz în care există cea mai bună potrivire între lungimea

lanțului și deschiderea din substrat.

Cu aceasta serie de compuși s-au făcut studii de complexare folosind spectrometria de masă în

tehnica ESI-MS.

Schema 2. Derivați disubstituiți ai fenotiazinei în reacție cu oligoetilenglicoli ditosilați

S-a urmărit abilitatea acestor macrocicluri (6-8) de a complexa cationi din grupa I. Se remarcă

preferința celui mai mic macrociclu (6) pentru cationii de Li+, în timp ce macrociclurile mai mari

(7 și 8) prezintă preferințe pentru cationii de Na+ și K

+. Doar cel mai mare macrociclu

complexează slab Cs+, dar pentru toți macrociclii se observă formarea de specii sandwich cu

cationul de K+.

Alti compuși macrociclici cu unități fenotiazinice au fost obținuți printr-o sinteză originală

bazată pe utilizarea reacției de cuplare Suzuki-Miyaura. Această reacție a fost utilizată pentru

prima dată de noi pentru obținerea de macrocicluri flexibile. S-au folosit două strategii în care

derivații diboronici și dibromurați au fost inversați (Schema 3).

Schema 3. Derivații diboronici și dibromurați au fost inversați

4

Aceeași reacție de tip cross-coupling Suzuki-Miyaura a fost aplicată și pentru obținerea de

derivați macrociclici ai bi- și tertiofenului (Schema 4)

Schema 4. Obținerea de derivați macrociclici ai bi- și tertiofenului

Macrociclurile cu unități triazinice sunt deosebit de importante deoarece ele au dimensiuni

potrivite pentru a intra în pori și au o structură aproape plană care convine experimentelor de

incluziune în por și de selectivitate pentru diverși cationi.

Reactiile sunt prezentate în schemele 5 și 6.

Schema 5. Obținerea macrociclurilor cu unități triazinice

Schema 6. Obținerea macrociclurilor cu unități triazinice

5

Reacția cheie este desimetrizarea derivatului triazinic, obținerea compusului 28. Trimerizarea

amestecului de nitrili în raport molar de 2,1/1 (exces de hidroxibenzonitril) conduce la un

amestec de compuși în care compusul 28 este majoritar. Acesta se separă prin cromatografie pe

coloană. Macrociclizările au fost realizate în condiții standard cu randamente acceptabile.

În vederea posibilității de a atașa grupări cât mai versatile în raport cu interacțiunea

macrociclurilor cu porii -HL am obținut derivați ai bazelor azotate decorate cu funcțiuni azidă

(Schema 7). În cursul acestor sinteze am descoperit și o nouă metodă de deprotejare a timinei și

uracilului. Rezultatele obținute au fost publicate.

Schema 7. Obținerea de azido-nucleobaze și deprotejarea uracilului și timinei cu NaN3

Peptida ciclică prezentată în schema 8 a fost obținută din aminoacizi cu configurație D- și L-

dispuși alternativ, fapt ce orientează catenele laterale ale tuturor aminoacizilor înspre exteriorul

ciclului. Secvența peptidică conține în poziții simetrice un aminoacid funcționalizat pe catena

laterală cu legătură triplă care a fost obținut anterior în două etape pornind de la Fmoc-Asp-

OtBu.

Peptida ciclică a fost obținută prin strategia Fmoc de sinteză de peptide pe suport solid, etapa de

ciclizarea realizându-se pe peptida atașată pe suportul solid. Peptida a fost analizată folosind

HPLC analitic, separată și purificată prin HPLC preparativ și analizată prin HRMS.

Schema 8. Structura dodecapeptidei ciclice sintetizate

Referitor la molecule depozabile pe diverse suprafețe am sintetizat derivați ai terpiridinei și ai

fenantrolinei potrivit substituiți pentru această operațiune (Schemele 9 și 10)

6

Scheme 9. Derivați ai terpiridinei

Schema 10. Derivați ai fenantrolinei

Compușii 34 și 36 au fost obținuți anterior în grupul nostru. S-a reușit obținerea unei depuneri

multistrat folosind o suprafață comercială funcționalizată cu grupări amino. De grupările amino

s-au legat unități ciclooctinice și de acestea printr-o reacție cu derivați azidici ai terpiridinei s-au

obținut suprafețe funcționalizate cu terpiridine. Experiențele anterioare au arătat că acești

compuși heterociclici rigizi, extrem de sensibili la diverși cationi, sunt de preferat derivaților

macrociclici. Compușii macrociclici depuși pe suprafață datorită flexibilității și datorită

numărului mare de heteroatomi preferă să se "culce" pe suprafață și astfel să nu mai fie accesibili

pentru potențialele specii "guest". Suprafața derivatizată cu terpiridine a fost complexată cu

diverși cationi și apoi s-a mai adăugat un strat de terpiridină astfel fiind obținut în premieră un

strat multilayer cu terpiridine (Figura 1).

Figura 1. Strat multilayer cu terpiridine

7

Se lucrează în prezent la obținerea de suprafețe limitrofe care să fie acoperite cu depuneri diferite

(Figura 2) și pe care să se poată realiza migrarea cationilor de la o arie la cealalta sub control

electrochimic sau chimic.

Figura 2. Obținerea de suprafețe limitrofe acoperite cu depuneri diferite

Asamblarea controlată, bazată pe un design riguros, a moleculelor organice funcţionalizate se

constituie din ce în ce mai mult ca o tehnică de bază în dezvoltarea materialelor moleculare

nanostructurate. Aplicaţiile sunt deosebit de ample în domenii dintre cele cu cel mai rapid

progres tehnologic: nano- și bio-tehnologiile, biomimetică, chimia supramoleculară, nano-

medicină, biologia moleculară etc Structura şi proprietăţile acestor sisteme autoasamblate se

bazează pe diferite tipuri de interacţiuni intermoleculare cum ar fi: legături de hidrogen, forţe

slabe Van der Waals (VdW), interacţiuni electrostatice în sisteme cu transfer de sarcină.

Un rol important îl are compatibilitatea substrat-sisteme moleculare. Două tipuri de substraturi

au fost alese, pe bază de aur (Au) și pe bază de siliciu (Si). Filmele de aur obținute au fost testate

în ceea ce privește posibilitatea fabricării de microstructuri de dimensiuni controlate, dar și de a

depune molecule prin tehnica de nanolitografie de tipul DipPen (DPN – Dip Pen

Nanolithography). Rezultatele experimentale au fost completate de simularea teoretică a

interacțiunii aur-sisteme moleculare, dar și de testarea a mai multe clase de macrociclii

compatibili cu proteina α-hemolizină privind inserția membranară și transportul ionic prin porul

proteinei.

În investigațiile noastre au fost utilizate diferite combinaţii moleculare de tip oaspete gazdă.

Drept molecule „gazdă” au fost utilizate macrociclii conţinând lanţuri de tip eter-coroană de

8

diferite lungimi. Spre exemplificare, prezentăm 2 structuri moleculare reprezentative având cea

mai mare, respectiv cea mai mică cavitate (Figura 3):

BDBTU40C6

Bis(3,9-dibenzo-2,4,8,10 tetraoxo [5.5]

undecan)-40-crown-6.

O

O

O

O

O

O O

O

BBDC32C6

Bis(2-benzo-1,3dioxane)cyclohexano-32-

crown-6

Figura 3. Structuri moleculare reprezentative pentru experimentele de ITC efectuate

Cavitatea internă accesibilă cationilor diferă de la un macrociclu la altul atât în ceea ce priveşte

constrângerile spaţiale cât şi din perspectiva densităţii de sarcină din zona cavităţii. În acest sens

există evidențe solide că în cavităţile interioare se acumulează cu preponderenţă sarcinile

negative iar înspre exterior cele pozitive.

Interacţia dintre ionii de potasiu şi cei doi macrociclii are caracter exoterm în ambele cazuri.

Macrociclul BDBTU40C6 prezintă afinitate scăzută faţă de ionul de potasiu şi metoda ITC nu

este capabilă de a obţine parametri termodinamici. Figura 4 prezintă curbele de titrare

reprezentative pentru macrociclul BDBDC32C6 cu triflat de K.

(a) (b)

Figura 4. Titrarea macrociclului BDBDC32C6 cu triflat de K.

Din termograma (a) se poate observa că amplitudinea peak-urilor este de aproximativ 10 ori mai

mare decât în cazul macrociclului BDBTU40C6. Dependenţa căldurii eliberate per injecţie de

raportul molar al partenerilor de reacţie este prezentată în Figura 4 (b). Linia continuă

corespunde celei mai bune curbe de fitare. Din nefericire variația lentă a căldurii cu fracția

molară a celor doi parteneri de reacție are drept consecință o importantă marjă de imprecizie

O

O

O

O

O

O

O

O

OO

O

O

O

O

O

O

O

O

0 2000 4000 6000 8000 10000

-40

-30

-20

-10

0

Pu

tere

ca

lorica

(W

)

Timp (s)

a)

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5

-2.2

-2.0

-1.8

-1.6

-1.4

-1.2

-1.0

-0.8

Q(k

Ca

l/mo

l)

Ratie molara

b)

9

privitoare la valorile parametrilor de fit. În astfel de cazuri procedura de fitare nu este suficientă

pentru o selectare exhaustivă a modelului de interacție fiind necesare investigții prin metode

complementare.

Experimentele de titrare calorimetrică au fost analizate în termeni de stochiometrie 1:1, 3:2

respectiv 2:1. În Tabelul 1 sunt prezentaţi parametrii termodinamici obținuţi prin ITC în urma

complexării ionului de potasiu de către macrociclul BDBDC32C6.

Tabelul 1

În urma datelor obţinute am propus următoarele structuri potentiale ale complecșilor

(Figura 5).

O

O

O

O

O

OO

O

O O

K+

n=1

OO

OO

OOOOOO

O

OO

O

O O O O O O

K+

K+

K+

n=1.5

O

O

O

O

O

OO

O

O O

K+

K+

n=2

Figura 5. Potențiale structuri ale complecșilor

Cea mai stabilă structură (ΔG = -2.37 Kcal/mol) este cea corespunzătoare complexului obţinut

prin legarea a doi ioni de K la macrociclu. Pe de altă parte, în cazul stoichiometriei 2:1 variaţia

de entalpie este relativ mică. În consecinţă, rezultatele obţinute sugerează o contribuţie

importantă a entropiei care de asemenea prezintă o scădere uşoară în timpul procesului de

asociere.

O a doua structură propusă este cea de tip sandwich cu stoichiometrie de 3:2. Într-o astfel de

arhitectură supramoleculară trei ioni de potasiu sunt capturaţi între doi macrocicli într-un

complex macromolecular coordinat.

A treia structură propusă este cea obtinuţă în cazul stoichiometriei de 1:1. Procesul de

complexare este oarecum similar cu cazul 18-crown-6 coronand dar cu afinitate mult mai mică.

Această scădere semnificativă a randamentului de legare poate fi atribuită diferenţei dintre

dimensiunile geometrice ale cavităţii macrociclului şi raza cationului de potasiu. În plus,

flexibilitatea lanțului polietilenic este limitată de rigiditatea unităţilor spiro-dioxan.

K (M-1

) ΔH (Kcal) ΔG (Kcal) TΔS (Kcal) Adj. R-Square

n = 1 42.5 - 18.7 - 2.21 - 16.49 0.85027

n = 1.5 48 - 12 - 2.30 - 9.7 0.98969

n = 2 55.62 - 8.46 - 2.37 - 6.09 0.99012

10

În vederea măsurării interacțiunilor rezultate între biomolecule precum și urmărirea întregului

proces de interacțiune creat (detecția în timp real) s-a utilizat metoda bazată pe măsurarea

fenomenelor de rezonanță a plasmonilor de suprafață (surface plasmon resonance, SPR). Scopul

acestor experimente a fost de a pune în evidență interacțiunile dintre moleculele implicate în

procesul de funcționalizare al senzorului de aur, precum și abilitatea acestuia de a detecta ioni

din soluție. Ca molecule test s-au utilizat: cisteamina, ciclooctina, terpiridina-azida si perclorid

de fier(III), cu scopul detecției de ioni de fier din soluție, ca urmare a formării complexului bi-

terpiridină-Fe(III).

Funcționalizarea senzorului de aur cu moleculele selectate este reprezentată schematic în Figura

6, observându-se interacțiunile care au loc între acestea (etapa A, C, E si G). Etapa A constă în

injectarea soluției de Ciclooctină (3 mM / DMSO : EtOH : H2O = 1 : 1 : 2). Astfel are loc

legarea covalentă între grupările funcționale terminale: amino libere (NH2) ale CIS și carboxilice

protejate (prin gruparea succinimidil ester - NHS) ale OCT. Se continuă apoi cu Etapa B de

spălare cu etanol. Datorită legăturii covalente nou formate între CIS și OCT, se observă creșterea

semnalului senzogramei SPR cu patru unități. În Etapa C se introduce soluția de compus

Terpiridină - Azidă (T - A) (3 mM / DMSO : EtOH = 1 : 1), având loc reacția click, în absența de

cupru, între OCT și azida -N3 cu formare de ciclu triazolic (cicloadiția Huisgen). După Etapa D

despălare cu etanol, semnalul senzogramei a crescut cu cinci unități. Etapa E presupune

injectarea unei soluții de perclorid de fier (EtOH : H2O = 1 :1) cu formarea in situ a complexului

între Fe(III) și gruparea terminală Terpiridinină din molecula T – A. În urma Etapei F de spălare

cu alcool, în senzograma SPR semnalul crește doar cu două unități. În ultima Etapă de reacție G,

se injectează din nou o soluție de Terpiridină – Azidă, ducând la formarea complexului bi-

terpiridină cu ionii Fe(III) introduși în etapa precedentă. În final, după Etapa H de spălare se

observă creșterea semnalului cu două unități.

Aur

O ON

O

O

O

N

N

N

N3 Fe(ClO4)3 . xH2O

S

NH2

monostrat deCisteamina (CIS)

Ciclooctina (OCT)

S

NH

O

Terpiridina - Azida (T - A)

S

NH

O

N NN

S

NH

O

N NN

N

N N

Fe

S

NH

O

N NN

N

N NFe

N

NN

N3

Etapa C

Etapa A

Etapa E Etapa G

Figura 6. Funcționalizarea substratului de aur cu moleculele selectate.

Un alt obiectiv a constat în testarea câtorva clase de compuși pe bază de macrociclii (MC)

organici și polipeptide ciclice (PPC), cu scopul găsirii structurilor energetice optime pentru

inserția lor în interiorul proteinei α-hemolizină. Pentru a determina structura de echilibru a

11

sistemelor moleculare studiate s-a folosit programul DFTB+ bazată pe teoria „density functional-

based tight binding method” combinată cu tehnica „self-consistent charge technique” (SCC-

DFTB).

Pentru a fi capabili să capturăm metale în interiorul macrociclurilor cavitatea interioară trebuie să

aibă dimensiunea volumului van der Waals a atomului de metal. De aceea, au fost construiți noi

structuri de macrociclii de dimensiune mai mică având ca componente trei sau patru unităţi de

etilmetiletertiofen (Figura 7).

Figura 7. Structurile geometrice ale macrocililor pe bază etilmetiletertiofen.

Macrociclul cu trei unităţi arată o simetrie de rotaţie de tip C3 cu atomii de S orientaţi în aceeaşi

direcţie care în cazul absorbţiei pe suprafaţă se pot aşeza foarte uşor pe suprafaţă. Distanţa medie

Na-O este de 2.75 Å, iar cea de S-S este de 6.56 Å. Macrociclul cu patru unităţi nu mai are o

formă simetrică, iar complexarea cu metalul de Na generează o structură distorsionată care greu

se poate absorbi pe o suprafaţă de aur.

Din analizele teoretice se poate concluziona că macrociclii cu trei unităţi de etilmetiletertiofen

sunt cei mai potriviţi pentru absorbţia autoasamblată pe o suprafaţă de aur netedă (de tipul 111).

O altă clasă de molecule studiate este clasa polipeptidelor ciclice (PPC) unde aminoacizi cu

chiralitate stânga şi dreapta apar alternativ în secvenţă. S-au ales diferite forme de aminoacizi

unde atomii din lanţul primar au chiralitatea deja menţionată, dar lanțul secundar conţine diferite

structuri moleculare specifice diferitelor tipuri de aminoacizi: aminoacizi încărcaţi cu sarcină –

lisină (PPC3) şi acidul aspartic (PPC4); aminoacizi polari – asparagină (PPC5); aminoacizi

aromatici – triptofan (PPC6). Geometria structurii spaţiale a polipeptidelor ciclice optimizate în

condiţii de vid sunt prezentate în Figura 8.

12

PPC1 PPC2

PPC3 PPC4

PPC5 PPC6

Figura 8. Polipeptidele ciclice optimizate.

După cum rezultă din imagini, structura ciclică a polipetidelor nu se distorsionează semnificativ,

iar structura grupărilor funcţionale ale aminoacizilor sunt orientate spre partea exterioară a

ciclului peptidic. Se pot întâmpla cazuri când o grupare funcţională se leagă prin legătură internă

de H sau forţe slabe de tip van der Waals cu alte grupări de pe ciclul peptidic.

Detaliile microscopice ale translocării peptidelor prin nanopori reprezintă factori esenţiali în

înţelegerea transportului prin pori proteici transmembranari şi au importanţă deosebită în

dezvoltarea de noi nano-tehnologii. Până la ora actuală, rezoluţia tehnicilor de investigaţie la

nivel de singură moleculă nu a permis detecţia şi înregistrarea unor etape distincte care să

caracterizeze procesele foarte rapide de translocare.

13

Utilizând experimente de electrofiziologie în condiţii specifice de pH şi simulări de dinamică

moleculară, am reuşit să încetinim trecerea unor peptide prin porul proteic de α-HL suficient de

mult încât să punem în evidenţă etape intermediare în procesul de translocare corelate cu zone

structurale distincte ale porului, şi am reuşit să controlăm timpul de rezidenţă, direcţia,

succesiunea şi dinamica tranziţiilor spaţio-temporale ale unei singure molecule peptidice în

interacţiune cu porul. Simulările de dinamică moleculară au relevat succesiunea temporală, la

rezoluţie atomică, a conformaţiilor intermediare ale peptidei în procesul de translocare, iar

amplitudinile calculate ale diferitelor microstări de blocaj ale porului şi succesiunea lor

temporală au fost în acord cu semnalul de curent ionic înregistrat experimental (L. Mereuta, M.

Roy, A. Asandei, J.K. Lee, Y. Park, I. Andricioaiei, T. Luchian, 2014, Scientific Reports

(Nature Publishing Group) 4: 3885).

Peptida utilizată în cadrul acestor experimente a fost CAMA P6 (având următoarea structură

KWKLFKKIGIGKFLQSAKKF-NH2), adăugată în concentraţie de 30 µM de partea trans a

membranei lipidice în care a fost inserat un singur por proteic de α-HL. Sub acţiunea unui câmp

electric generat de diferenţa de potenţial aplicată de o parte şi de alta a membranei lipidice, sunt

înregistrate blocaje reversibile ale curentului ionic prin porul de α-HL generate de pătrunderea

unui singur monomer CAMA P6 în interiorul lumenului proteinei şi care se succed într-o

manieră stocastică.

Aşa cum poate fi observat în figura 9, la pH neutru, interacţiunea dintre peptide şi interiorul

lumenului proteinei (β-barrel) conduce la evenimente de blocaj omogene, pentru care reducerea

în amplitudinea curentului ionic (ΔI B1 = IB1 - IO) este asociată substării de blocaj B1. O vedere

detaliată a evenimentelor de blocaj a pus în evidenţă faptul că, pe măsură ce valoarea pH-ului

scade, se poate observa o a doua sub-stare de blocaj, B2, de amplitudine relativă mai mică (ΔI B2

= IB2 - IO). Zona de β-barrel a proteinei (diametru interior de 2 nm) şi vestibulul acesteia

(diametru interior maxim de 4.6 nm) prezintă dimensiuni şi proprietăţi fizico-chimice şi

topologice distincte. Acest lucru determină înregistrarea unor blocaje de curent ionic distincte în

funcţie de compartimentul în care se găseşte peptida în interiorul porului proteic, în timpul

translocării. Nivelul de blocaj superior (B1) a fost atribuit prezenţei peptidei în lumenul α-HL, cu

structură de β-barrel, pe când nivelul de blocaj inferior (B2, amplitudine relativă mai mică a

blocajului), a fost atribuit prezenţei peptidei în vestibulul proteinei. În urma translocării peptidei

de partea cis a membranei, amplitudinea curentului ionic revine la nivelul iniţial corespunzător

potului liber (O). Această cale de translocare secvenţială a peptidei prin nanopor este confirmată

de simulările de dinamică moleculară realizate la pH neutru.

14

Figura 9. Secvenţe tipice ale înregistrărilor de curent ionic prin porul de α-HL care arată

interacţiunea reversibilă, la nivel de singură moleculă, dintre peptida CAMA P6 şi porul proteic

imobilizat într-o membrană lipidică planară. Înregistrările au fost efectuate la o diferenţă de

potenţial ΔV = 150 mV, într-o soluţie simetrică de 2M KCl, la o valoare a pH-ului de: pH = 7.1 (a),

pH = 5.1 (b), pH = 4.5 (c), respectiv pH = 3.3 (d), sub acţiunea a 30 µM peptidă introdusă de partea

trans a membranei (potenţialul de comandă). Linia punctată în secţiunea de sus a panelului (a-d)

reprezintă nivelul de curent ionic prin porul liber (O); în secţiunea de jos a panelului (a-d) se pot

observa fluctuaţiile de curent evidenţiate de tranziţia pe nivelurile inferioare B1 şi B2 care reflectă

blocajele stocastice ale curentului ionic în urma interacţiunii reversibile dintre peptidă şi porul

liber de α-HL. Substările distincte B1 şi B2 sunt evidenţiate în reprezentările „scatter plot” din

panelul (e-h), care arată distribuţia timpilor de rezidenţă ai peptidei în por în funcţie de

amplitudinea relativă a blocajului. Substarea B1 este evidenţiată la pH = 7.1 (e), iar substarea B2

este evidenţiată la o valoare acidă ale pH-ului, pH = 4.5 (g).

Simulările de dinamică moleculară au pus în evidenţă trei conformaţii diferite ale peptidei. Prima

este cea corespunzătoare peptidei libere în soluţie, reprezentată de o conformaţie aleatoare,

eterogenă, răsucită la nivelul celor două glicine succesive (Gly 9 şi Gly 11), separate de o

izoleucină (Ile 10). În por, datorită constrângerilor impuse de zona cu structură de β-barrel,

peptida adoptă o a doua conformaţie răsucită, cu împachetare de tip “hairpin”, stabilizată de

legături de hidrogen intramoleculare, care determină blocajul complet al curentului ionic (nivelul

B1). Cea de a treia conformaţie este una liniară, corespunzătoare trecerii peptidei prin zona de

constricţie a α-HL. După trecerea în vestibul, blocajul parţial al porului proteic dă naştere

nivelului intermediar al curentului ionic (B2).

Aşa cum poate fi observat în figura 10, am constatat că rata de asociere a procesului de

interacţiune dintre peptidă şi porul de α-HL (rateon = 1/ton), scade semnificativ odată cu scăderea

valorii pH-ului. Acest lucru se datorează aminoacizilor încărcaţi de la gura porului proteic (14

resturi de acid aspartic, Asp 127 şi Asp 128, şi 7 lizine, Lys 131) care, la valori acide ale pH-ului,

determină o încărcare electrică netă pozitivă a zonei prin protonarea aminoacizilor încărcaţi

negativ, şi constituie astfel o barieră electrostatică pentru peptidele cationice din soluţie. De

asemenea, pentru a elucida mecanismul care determină dependenţa de pH a dinamicii peptidelor

15

prin porul proteic de α-HL, am determinat timpul de rezidenţă al peptidei în por, corespunzător

celor două substări distincte. Durata evenimentelor de blocaj (toffB2), corespunzătoare nivelului

intermediar B2, creşte odată cu scăderea valorii pH-ului.

Figura 10. a) Dependenţa de pH a ratei de asociere dintre peptidă şi lumenul porului de α-HL

(rataon) determinată cu ajutorul intervalelor de timp dintre două evenimente de blocaj succesive

(ton), distribuite exponenţial. b) dependenţa de pH a ratei de disociere a peptidei din vestibulul

proteinei (rateoffB2), determinată din valoarea medie a timpilor de rezidenţă ai peptidei în vestibul,

în substarea B2 (toffB2). c) fragment dintr-o înregistrare originală de curent ionic, la pH = 5.1, care

evidenţiază intervalele de timp care caracterizează asocierea dintre peptidă şi por (ton), respectiv

translocarea peptidei de-a lungul vestibulului (toff B2). Peptida a fost adăugată în concentraţie de 30

µM de partea trans a membranei lipidice, iar diferenţa de potenţial aplicată a fost de 150 mV.

Analiza statistică a ratelor de translocare a peptidei prin vestibul (rateoffB2 = 1/toffB2) în funcţie

de pH şi de diferenţa de potenţial aplicată de o parte şi de alta a membranei, a revelat scăderea

dramatică a ratei de traversare a zonei vestibulului odată cu scăderea pH-ului, sugerând faptul că

dinamica şi mecanismul de translocare al moleculelor prin porul proteic de α-HL depind într-o

manieră critică de aciditatea mediului fiziologic. Acest lucru se datorează abilităţii pH-ului de a

modula sarcina netă a vestibulului α-HL care devine încărcat pozitiv la valori acide, datorită

protonării resturilor de acid aspartic (Asp 13, Asp 2, Asp 4 şi Asp 227) pe fiecare dintre cei şapte

monomeri ai α-HL care lasă necompensate sarcinile pozitive ale resturilor de lizină şi arginină

(Lys 8, Arg 56, Arg 104 şi Lys 154). Astfel efectul modulator al pH-ului asupra translocării

peptidelor poate fi explicat prin două posibile mecanisme: (i) interacţiuni nespecifice, de rază

lungă, de repulsie electrostatică dintre peptidă şi suprafaţa internă a porului proteic şi (ii)

contribuţia fluxului electroosmotic prin canalul proteic anionic selectiv care se opune mişcării

electroforetice a peptidei prin por în câmpul electric generat de diferenţa de potenţial aplicată.

Am demonstrat că putem controla dinamica de capturare a unei singure peptide dar și trecerea

acesteia prin porul proteic la aplicarea unei diferențe de potențial (Asandei, A; Schiopu, I;

Chinappi, M; Seo, CH; Park, Y; Luchian, T., Electroosmotic Trap Against the

Electrophoretic Force Near a Protein Nanopore Reveals Peptide Dynamics During Capture

and Translocation, 2016, ACS APPLIED MATERIALS & INTERFACES 8 (20) 13166-

13179). În aceste condiții s-a putut observa că factorul care predomină este forța electroosmotică

exercitată asupra analitului și nu forța electroforetică. Am demonstrat astfel, că prin extinderea în

afara porului, forța electroosmotică este capabilă să captureze fie la intrarea în lumenul porului

fie la intrarea în vestibulul porului și să țină peptida în interiorul porului împotriva forței

16

electroforetice. Analiza statistică a timpilor de rezidență metastabilă a peptidei care se găsește fie

în lumenul porului fie în vestibul arată detalii cinetice importante cu privire la direcția și ratele

stocastice ale mișcării peptidei în interiorul porului. Abordarea prezentată în această etapă

demonstrează abilitatea moleculelor de a se deplasa dintr-o parte în alta a porului, și în acest

context am reușit să studiem calea de trecere a moleculei în interiorul porului oferind astfel o

dovadă convigătoare a translocării peptidei. Analiza cinetică a drumului peptidei care oscilează

între diferitele microstări din interiorul nanoporului, a permis o descriere detaliată a imaginii

energiei libere a interacțiunii dintre peptidă și α-HL. Atunci când s-au studiat aceste interacțiuni

la un potențial transmembranar foarte mic, s-a obținut descrierea termodinamică a procesului

reversibil de legare a peptidei cu, și în interiorul porului de α-HL în condiții de echilibru, în

absența contribuților electrice și electroosmotice. Am observat, pentru prima dată, că fluxul

electroosmotic este capabil să producă un câmp efectiv de absorbție care va captura peptida în

interiorul porului proteic împotriva forței electroforetice (Figura 11).

Figura 11. Substările microscopice distincte care caracterizează dinamica peptidei în interiorul

porului de α-HL la valori acide de pH. (a) Înregistrările reprezentative ale evenimentelor de

blocare produse de peptidă adăugată la cis, la ΔV = 80 mV, sub influența cumulată a forței

electroosmotice (Felo) și a forței electroforetice (Felp), la pH = 2.8. Amplitudinea curentului pentru

porul deschis este notată cu „free α-HL‟ iar timpul de asociere pentru capturarea peptidei care

separă evenimente de blocare consecutive este reprezentat prin (on). Peptida capturată de

vestibulul proteinei de α-HL și trecerea ulterioară a acesteia prin nanopor, generează în principal,

trei tipuri de evenimente distincte; blocaje ale curentului de scurtă durată prin α-HL, orientate în

jos. Pentru primul tip de eveniment de blocare, peptida este capturată în vestibulul α-HL prevalent

prin forța electroosmotică și se mișcă reversibil între vestibul și lumenul nanoporului, așa cum este

indicat de stările curentului corespunzând în panelul b, „‟ unde reprezintă tranzițiile vestibul →

lumen și „‟ reprezintă tranzițiile lumen → vestibul. Uneori este posibil ca peptida să se miște

ireversibil din lumen spre vestibul și apoi să iasă prin partea cis, reprezentată în figură prin „ ‟,

asociată cu tranziția vestibul → cis. Al doilea tip de evenimente de blocare reflectă mișcarea

unidirecțională a peptidei capturate din vestibul spre lumen reprezentat ca tranziția vestibul →

lumen (), și apoi eliberată pe partea trans descrisă ca tranziția lumen → trans () (panel c). Al

treilea tip de eveniment de blocare arată capturarea peptide în vestibulul nanoporului și apoi

reîntoarcerea acesteia în partea cis, fără ca peptide să se miște prin por, eveniment asociat cu

tranziția vestibul → cis ( ) (panel d). Reprezentarea schematizată a stărilor moleculare și a

tranzițiilor microscopice associate cu evenimentele de tipul I, II și III descrise mai sus, sunt

17

prezentate în panelurile e (type I), f (type II) și g (type III). reprezintă câmpul electric de-a lungul

porului de α-HL.

Această peptidă prezintă două reziduuri de Gly ceea ce face ca peptida să prezinte o structură de

β – hairpin, a cărei cinetică prin porul de α – HL poate fi reglată efectiv de fluxul electroosmotic.

Am demonstrat că o singură peptidă poate fi constrânsă în interiorul porului și în regiunea cea

mai apropiată de gura porului și am reușit să vizualizăm pașii elementari distincți asociați cu

capturarea peptidei, translocarea reversibilă de-a lungul vestibulului și a lumenului porului

proteic și eliberarea acesteia din nanopor. Această abordare demonstrează un important pas

înainte în ceea ce privește prinderea și manipularea unei singure peptide, și ne permite să studiem

fizica procesului de capturare și de mișcare a unei molecule atunci când interacționează cu un

nanopor proteic (Figura 12).

Figura 12. Schema cinetică care descrie translocarea peptidei în mai multe etape de-a lungul

porului de α-HL sub influența colectivă a forțelor elo și elf, la pH=2.8. Sistemul poate ocupa patru

stări, denumite cis, vestibul, lumen și trans. Ratele de tranziție a mișcării înainte și înapoi au fost

estimate experimental. În datele experimentale s-a observat că au loc doar câteva tranziții trans –

lumen, din această cauză le-am exclus din analiza statistică. Panelul de jos reprezintă profilul

calitativ al energiei libere care corespunde translocărilor peptidei. În roșu sunt semnalate cele trei

valori care au putut fi determinate din datele cinetice derivate din datele experimentale. Profilul de

energie liberă (F) reflectă și rezumă ceea ce s-a obținut din analiza ratelor de tranziție. Cele două

minime centrale corespund stărilor specific din vestibul și din lumen. În toate experimentele

realizate de noi, starea din vestibul este mai populată (timpul de rezidență este cel mai lung), decât

starea din lumen; astfel, putem spune că F (vestibul) < F (lumen). În ceea ce privește evadarea

peptidei din lumen, k (lumen → trans) este întotdeauna mai mic decât k (lumen → vestibul), și de

aceea bariera de energie liberă asociată tranziției lumen → trans, ΔF (lumen → trans), este

întotdeauna mai mare decât ΔF (lumen → vestibul). În același mod, ΔF (vestibule → lumen) < ΔF

(vestibul → cis), i.e odată peptida în vestibul, este mult mai probabil ca aceasta să se îndrepte către

lumen decât să se întoarcă în cis.

18

După ce peptida a fost capturată în interiorul porului de fluxul electroosmotic, aceasta își va

continua mișcarea sub influența forțelor colective electroforetice și electroosmotice, care conduc

peptida înainte și înapoi între lumen și vestibul. Aceste evenimente sunt pe deplin rezolvabile

prin semnătura volumetrică a blocajelor curentului ionic prin por, și pentru că difuzia peptidei

este semnificativ micșorată în interiorul nanoporului, analiza detaliată a cineticii arată

caracteristicile esențiale ale mișcărilor moleculare de-a lungul porului de α-HL. Procesul de

recapturare repetată și de blocare al analitului în nanoporul proteic la pH acid, care în acest caz

servește pentru a mări forța electroosmotică, poate fi în mod particular folositor pentru

examinarea, la nivel de singură moleculă, a aceluiași substrat (peptide, proteine, acizi nucleici),

înainte și după interacțiile chimice care au avut loc asupra substratului în soluție, pentru a

descifra conformațiile tranzitorii și slab populate ale substratului, care în alte condiții ar fi fost

greu de analizat. Noi subliniem faptul că extinderea abordării prezentate în ceea ce privește

capturarea la nivel de singură moleculă a unei molecule în interiorul unui nanopor pentru

studierea caracteristicilor cinetice și volumetrice ar trebui să fie realizată cu grijă. De exemplu, în

funcție de compoziția chimică specifică, dacă analitul conține catene ionizabile care își modifică

starea de protonare în funcție de pH se pot întâmpla cel puțin două lucruri: (a) sarcina netă a

analitului se va modifica în funcție de pH și astfel se va modifica și valoarea netă a forței

electroforetice (b) sau de asemenea, modul general de împachetare al moleculei s-ar putea

modifica ceea ce se va reflecta într-o modificare a secțiunii transversal și a mobilității peptidei în

funcție de pH. Astfel, ca urmare a modificărilor proprietăților fizice și a comportamentului

cinetic al analitului însuși la valori mici de pH efectul electroosmotic descris aici ar putea să se

însumeze sau chiar să fie ignorat.

Aşa cum a fost menţionat mai sus, un alt aspect foarte important care poate fi pus în evidenţă în

urma interacţiunilor cu porul proteic de α-HL este reprezentat de stările conformaţionale

adoptate de peptide în condiţii diferite ale mediului de reacţie.

Interacţiunile electrostatice manifestate între perechi specifice de resturi de aminoacizi prezenţi

în structura primară a peptidelor şi a proteinelor aduc o contribuţie majoră în stabilitatea

conformaţională a acestora, influenţând modul lor de împachetare şi interacţiunea cu alte

macromolecule. Variind pH-ul sau tăria ionică a mediului în care se desfăşoară aceste

interacţiuni, am studiat modul în care împachetarea unor peptide cu conformaţii de “β-hairpin”,

care conţin histidină în structura lor primară, depinde de interacţiunile electrostatice manifestate

între resturi de aminoacizi (L. Mereuta, A. Asandei, C.H. Seo, Y. Park, T. Luchian, 2014, ACS

Appl. Mater. Interfaces 6(15), 13242-13256). Peptidele utilizate în cadrul acestor studii au fost

CAMA 1 (KWKLFKKIGIGKHFLSAKKF-NH2), de hidrofobicitate 45%, sarcină +8 la pH = 8,

respectiv +9 la pH = 4.5, şi CAMA 3 (KWKLKKHIGIGKHFLSAKKF-NH2), de hidrofobicitate

40%, sarcină +8 la pH = 8, respectiv +10 la pH = 4.5.

Am cuantificat, la nivel unimolecular, frecvenţa de translocare a acestor peptide prin porul

proteic de α-HL, timpul de rezidenţă al peptidelor în interiorul porului, respectiv amplitudinea

blocajelor de curent ionic asociate cu interacţiunea dintre monomerii de peptidă şi por.

19

Figura 13. Înregistrări originale de curent ionic care arată interacţiunea dintre peptidele CAMA 3

(A, roşu), respectiv CAMA 1 (B, albastru), şi porul proteic de α-HL, la pH = 7 (panel a), respectiv

pH = 4.5 (panel b). Diferenţa de potenţial aplicată a fost de ΔV = +70 mV, iar experimentele au fost

realizate într-o soluţie simetrică de 2 M KCl, cu 30 µM peptidă adăugată de partea trans a

membranei. Nivelul „O” indică curentul ionic prin porul liber de α-HL, nivelul „C1” este

corespunzător curentului ionic în timpul unui eveniment de blocaj, atunci când peptida se află în

lumenul porului, respectiv „C2” corespunde prezenţei peptidei în vestibulul proteinei, vizibilă la pH

acid. Vederile detaliate de mai jos evidenţiază substările distincte de blocaj B1 şi B2, caracterizate

de amplitudinile relative ΔIB1 şi ΔIB2 şi timpii caracteristici τon (intervalul de timp dintre două

evenimente de blocaj succesive), respectiv τoff (durata unui eveniment de blocaj). Panelurile c) şi d)

prezintă diagrame „scatterplot” ale substărilor de blocaj B1 şi B2, la pH = 7, respectiv pH = 4.5.

Am arătat că rata de captură a peptidelor în lumenul proteinei scade semnificativ la pH acid,

datorită contribuţiilor entalpice şi entropice aduse barierei de energie liberă care controlează

viteza de asociere dintre peptidele aflate în soluţie şi porul de α-HL (Fig. 13). Din punct de

vedere entalpic, interacţiunea de atracţie electrostatică dintre sarcina netă pozitivă a peptidelor

cationice şi inelul de sarcina netă negativă de la gura porului (7x Asp 127; 7x Asp 128; 7x Lys

131) este diminuată la pH acid, când intrarea în lumen devine mai puţin negativă şi se comportă

ca o barieră de potenţial care reduce concentraţia locală de monomeri de peptidă. În acelaşi timp,

la pH = 4.5, protonarea histidinelor conduce la o creştere a interacţiunilor electrostatice inter-

aminoacizi şi conferă peptidelor aflate la intrarea trans a porului o structură mai dezordonată.

Astfel, la pH acid, peptida petrece un timp mai îndelungat în căutarea unei conformaţii favorabile

din punct de vedere entropic care să asigure pătrunderea şi translocarea ei prin lumenul proteinei.

Timpul de rezidenţă al peptidelor în por scade odată cu scăderea pH-ului de la valoarea 7 la 4.5.

Acest lucru se datorează creşterii forţei electroforetice care acţionează asupra peptidelor ca

urmare a creşterii sarcinii nete pozitive a acestora prin protonarea histidinelor. Valorile ratelor

de asociere şi disociere ale reacţiilor reversibile, investigate la cele două valori ale pH-ului,

pentru cele două peptide analizate, sunt sintetizate în tabelul 2.

Tabel 2. Valori ale ratelor de asociere (rateon), respectiv disociere (rateoff) pentru cele două peptide

adăugate de partea trans a membranei într-o concentraţie de 30µM, determinate la o diferenţă de

potenţial aplicată ΔV = +70 mV, la pH = 7, respectiv pH = 4.5.

20

CAMA 1 CAMA 3

pH = 7 pH = 4.5 pH = 7 pH = 4.5

rateon (s-1

) 7.5 ± 24.3 1.43 ± 0.13 13.23 ± 0.92 1.17 ± 0.08

rateoff (s-1

) 296.45 ± 24.3 471.36 ± 40.36 520.40 ±36.62 966.85 ± 68.27

De asemenea, la pH acid, amplitudinea blocajelor de curent ionic este mai mare decât la valori

neutre ale pH-ului, datorită modificărilor conformaţionale induse peptidelor. Acestea prezintă la

pH acid o stabilitate mai redusă a structurii de “β-hairpin” care conduce la o obstrucţionare

redusă a porului în timpul translocării. În acest context, rata de disociere dintre monomerii de

peptidă şi por este mai mare la pH acid.

Am realizat de asemenea experimente în soluţii electrofiziologice de tărie ionică diferită: 2M,

1M, respectiv 0.5M KCl. Rezultatele au arătat că rata de captură a peptidelor scade odată cu

scăderea tăriei ionice a mediului datorită creşterii razei norului de contra-ioni asociaţi

monomerilor de peptidă care împiedică partiţia acestora în lumenul proteinei (Fig. 14 a) şi c)).

Protonarea histidinelor la pH acid accentuează acest efect. Mobilitatea peptidelor în interiorul

porului este mai mare la tărie ionică mică şi valori neutre ale pH-ului, datorită diminuării ariei

transversale efective a acestora în aceste condiţii şi a creşterii extensiei lanţului peptidic ca

urmare a intensificării interacţiunilor electrostatice dintre aminoacizi.

Figura 14. Dependenţa de tăria ionică a soluţiei electrofiziologice a ratelor de asociere (rateon),

respectiv disociere (rateoff) ale interacţiunilor reversibile dintre peptidele CAMA 3 (roşu), respectiv

CAMA 1 (albastru) şi porul proteic de α-HL. Liniile punctate reprezintă intervalele de confidenţă

de 95% pentru valorile estimate.

Astfel, prin analiza parametrilor care caracterizează evenimentele de blocaj determinate de

trecerea peptidelor prin porul proteic de α-HL, am descoperit că dinamica unor macromolecule

prin canalul proteic este determinată în mare măsură de sarcina electrică netă a porului de-a

lungul căii de permeaţie şi că fluxul electroosmotic poate avea o contribuţie importantă la

translocarea macromoleculelor prin por, mai ales la valori acide ale pH-ului, când selectivitatea

pentru anioni a porului creşte semnificativ. De asemenea, cinetica acestor procese de interacţiune

depinde de proprietăţile moleculelor care interacţionează cu interiorul porului, sarcină electrică,

secţiune transversală efectivă, interacţiuni electrostatice inter-aminoacizi, gradul şi stabilitatea

împachetării monomerilor, proprietăţi ce pot fi modificate controlat prin intermediul mediului de

reacţie. Rezultatele noastre subliniază potenţialul imens al tehnicii la nivel de singură moleculă

21

bazate pe nanopori în identificarea unor etape consecutive distincte care compun interacţiunea de

asociere a moleculelor cu porul proteic şi translocarea lor prin regiuni distincte ale acestuia,

caracterizate de viteze de reacţie de ordine de mărime diferite, imposibil de detectat în

măsurători obişnuite. Aceste rezultate demonstrează posibilitatea de a creşte într-o manieră

controlată timpul de rezidenţă al macromoleculelor gazdă în por şi de a discretiza astfel calea de

permeaţie a acestora corespunzător trecerii lor prin compartimentele distincte ale porului,

conducând la o înţelegere detaliată a acestor procese complexe de interacţiune.

Un obiectiv important al proiectului îl constituie detecţia ionilor cu ajutorul nanoporilor proteici

hibrizi. Pentru aceasta, este foarte importantă identificarea unor interacţiuni specifice dintre

anumite tipuri de ioni şi alte macromolecule care să facă posibilă detecţia acestora prin astfel de

tehnici de detecţie stocastică. În acest sens, ne-am oprit atenţia asupra ionilor metalici (Cu2+

,

Zn2+

, Al3+

, Fe3+

) şi a interacţiunii lor specifice, prin legături coordinative, cu aminoacidul

histidină (His), ce poate fi uşor integrat în structura unor peptide model sau ce se găsește în mod

natural în structura acestora (ex. peptidele beta amiloidice), proiectate şi utilizate ca partener de

interacţiune în procesul de detecţie stocastică prin nanoporul de α-HL. În studiile noastre, am

arătat că procesul de complexare cu ioni metalici al peptidelor ce conţin aminoacizi histidină în

structura lor primară induce modificări conformaţionale ale acestora. Ţinând cont de experienţa

dobândită în studiul proceselor de interacţiune dintre peptide şi nanopori proteici, aceste

modificări conformaţionale pot fi detectate în urma analizei cinetice a acestor procese şi conduc

în mod indirect la detecţia respectivilor ioni metalici.

Aşa cum este prezentat în figura de mai jos, ionii metalelor tranziţionale (ex.: Cu2+

) formează

legături coordinative cu aminoacidul histidină în forma sa neprotonată, mai exact cu azotul din

gruparea imină. Utilizând peptida chimerică CAMA (KWKL FKKI GIGK FLHS AKKF-NH2),

am pus în evidenţă interacţiunea dintre ionii metalici de Cu2+

şi aminoacidul histidină din

structura primară a acesteia prin experimente de spectroscopie de fluorescenţă.

Figura 15. a) Structura chimică a aminoacidul Histidină în forma protonată, la pH acid, şi forma

neprotonată, la pH neutru/bazic şi reacţia sa reversibilă cu ionii metalici.b) Structuri moleculare

care prezintă modificările induse de ionii de Cu2+

(verde) în conformaţia peptidei CAMA în urma

interacţiunii lor cu aminoacidul His 15 (roşu). c) Variaţia deplasării maximului de emisie al

22

triptofanului (Δλ) în funcţie de concentraţia de ioni de cupru, într-o soluţie salinăcu pH = 7.

Graficul încadrat reprezintă spectrele de emisie fluorescentă normalizate a 1.5 mM peptidă CAMA

în absenţa ionilor de cupru (negru), respectiv în prezenţa concentraţiei maxime de 22 mM

Cu2+

(roşu).

În urma acestor investigaţii bazate pe deplasarea maximului de emisie al aminoacidului triptofan

(panel b), am determinat constanta de disociere dintre peptida CAMA şi ionii de Cu2+

, Kd = 6.3

µM. Datorită legăturilor coordinative formate între ionii metalici şi aminoacidul histidină,

peptidele suferă modificări conformaţionale (panel c) care au putut fi detectate prin tehnici

bazate pe interacţiunea stocastică dintre peptide şi porul proteic de α-HL în prezenţa, respectiv în

absenţa ionilor metalici (L. Mereuta, I. Schiopu, A. Asandei, Y. Park, K.-S. Hahm, T. Luchian,

2012, Langmuir 28, 17079-17091).

Figura 16. Înregistrări tipice de electrofizologie care arată efectul creşterii concentraţiei de ioni de

Cu2+

asupra interacţiunii dintre un singur por proteic de α-HL şi 30 µM peptidă CAMA, într-o

soluţie simetrică de 2M KCl, la pH = 7, în absenţa (a), respectiv în prezenţa ionilor de Cu2+

în

concentraţii de 10 µM (b) şi 100 µM (c), adăugate de partea trans a membranei. Fluctuaţiile de la

nivelul iniţial al curentului ionic, corespunzător porului liber, indică fenomenele de blocaj induse de

interacţiunea reversibilă dintre o singură peptidă liberă sau complexată cu Cu2+

şi un singur por de

α-HL. Panelurile de jos prezintă reprezentări schematice care ilustrează efectul ionilor deCu2+

asupra interacţiunii dintre peptidă şi por, din punctul de vedere al reducerii volumului de electrolit

exclus de peptida complexată în interiorul porului (ΔI >ΔICu2+). Peptida liberă pătrunde integral în

lumenul α-HL (d), pe când peptida complexată poate să acceseze doar parţial interiorul porului

datorită modificărilor conformaţionale induse de Cu2+

(e). Diagramele dreapta-sus din panelurile d)

şi e) redau o reprezentare simplificată a profilului de energie liberă simţit de peptida liberă (d),

respectiv peptida complexată cu Cu2+

(e), în interacţiune reversibilă cu porul. Reprezentările

grafice dreapta-jos din panelurile d) şi e) arată dependenţa de diferenţa de potenţial aplicată a

valorilor medii ale timpilor de rezidenţă ai peptidei în por (τOFF) în absenţa (d), respectiv prezenţa a

100 µM Cu2+

(e).

Rezultatele arată că atât intervalul de timp dintre două evenimente succesive, cât şi durata unui

eveniment de blocaj, cresc în urma adiţiei în sistem a ionilor de Cu2+

. Conform teoriei lui Eyring

cu privire la stările de tranziţie, şi ţinând cont de faptul că efectul potenţialului transmembranar

23

poate fi privit ca o alterare a energiilor libere de activare a proceselor de asociere/disociere,

dependenţele de diferenţa de potenţial aplicată a timpilor τOFF şi τON au putut fi fitate cu funcţii

exponenţiale simple de forma (( ( ))/ )( , ) x V t

OFF ONy Ae . Dependenţa de diferenţa de potenţial

aplicată a timpului de rezidenţă al peptidei în por (τOFF) poate fi fitată cu o scădere exponenţială,

în cazul peptidei libere (linia punctată din panelul d) dreapta-jos), respectiv cu o creştere

exponenţială în cazul peptidei complexate cu Cu2+

(linia punctată din panelul e) dreapta-jos).

Atunci când cuprul lipseşte din soluţia electrofiziologică, peptida liberă poate fi acomodată în

întregime în lumenul porului de α-HL. În interiorul porului, o singură peptidă CAMA este

reţinută temporar de zona de constricţie formată de Met 113, Lys 147 şi Glu 111. Dacă forţa

electrică care acţionează asupra peptidei este suficient de mare, peptida poate depăşi această

barieră şi trece de partea cis a porului proteic. Acest comportament este în acord cu dependenţa

nemonotonă de diferenţa de potenţial aplicată a timpului de rezidenţă al peptidei în por (τOFF).

Când peptida este complexată cu ioni de Cu2+

prin intermediul His 15, ea suferă o modificare

conformaţională care împiedică pătrunderea totală a monomerului în interiorul porului. Astfel,

frecvenţa evenimentelor de translocare scade semnificativ. Pentru translocarea unei peptide

împachetate, este necesară atât despachetarea ei parţială de partea trans a membranei, cât şi

reîmpachetarea de partea cis, fenomene ce adaugă un cost energetic suplimentar în procesul de

translocare, fapt ce explică creşterea timpilor τOFF şi dependenţa lor crescătoare de diferenţa de

potenţial aplicată.

În cazul prezenţei cuprului în soluţie, adăugarea de EDTA în exces de partea trans a membranei

lipidice a condus la anularea aproape completă a efectului ionilor de Cu2+

. De asemenea, la valori

acide ale pH-ului, când histidina este protonată, aceste modificări nu au mai fost observate.

Aceste rezultate demonstrează că efectele observate se datorează întradevăr complexării peptidă-

Cu2+

.

În acest context, pornind de la afinitatea aminoacidului histidină pentru ionii metalici şi rolul pe

care l-ar putea juca această interacţiune reversibilă în detecţia acestor ioni sau a unor molecule ce

conţin aminoacidul, am studiat şi o serie de alte peptide ce conţin în structura lor primară

histidină, cum ar fi fragmentul Aβ1-16 din peptida amiloid de origine umană (Asp-Ala-Glu-Phe-

Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys), respectiv fragmentul Aβ1-16 din peptida

amiloid de la şoareci. (Asp-Ala-Glu-Phe-Gly-His-Asp-Ser-Gly-Phe-Glu-Val-Arg-His-Gln-Lys).

Peptida de origine murină conţine doar doi aminoacizi histidină faţă de cei trei prezenţi în

structura peptidei umane.

Peptidele au fost adăugate într-o concentraţie de 50 μM de partea trans a membranei lipidice în

care a fost în prealabil inserat un singur por proteic de α-HL. În urma experimentelor, am pus în

evidenţă proprietăţile de detecţie ale nanoporului proteic în compararea la nivel de singură

moleculă a celor două peptide prin intermediul analizei interacţiunilor reversibile dintre acestea

şi diverse metale. Rezultatele noastre ne-au permis să calculăm afinităţile dintre Cu2+

şi cele două

fragmente Aβ1-16 (A. Asandei, I. Schiopu, S. Iftemi, L. Mereuta, T. Luchian, 2013, Langmuir

29(50), 15634-15642), iar analiza statistică a blocajelor induse în curentul ionic prin porul liber

în urma pătrunderii monomerilor de peptidă în lumenul α-HL, a arătat că propensitatea de

24

interacţiune dintre diverse metale şi peptidele analizate, având ca urmare modificări

conformaţionale ale acestora, se supune ordinii: Cu2+

> Zn2+

> Fe3+

> Al3+

(A. Asandei, S. Iftemi,

L. Mereuta, I. Schiopu, T. Luchian, 2014, J. Membrane Biol 247(6), 523-530).

Cercetările au arătat că peptidele amiloid interacţionează cu ionii metalelor tranziţionle; pentru

mutanţii amiloid cărora li s-au substituit aminoacizii histidină, s-a observat diminuarea

procesului de agregare a monomerilor de peptidă în prezenţa unor metale (Pagel et al., 2008).

Interacţiunea dintre peptidele amiloid şi ionii de Cu2+

a fost pusă pe seama a patru legături

coordinative coplanare între un ion metalic şi atomii de azot ai inelelor imidazol de la trei

aminoacizi intramoleculari de histidină (His 6, His 13 şi His 14), respectiv un al patrulea partener

care ar putea fi: gruparea amino din capătul N-terminal, un oxigen de la Tyr 10, un oxigen de la

Glu 3, gruparea carboxil de la Asp 1, sau gruparea carbonil de la Ala 2 (Karr et al. 2005; Stellato

et al. 2006; Hong et al. 2010). Complecşii formaţi de peptide amiloid cu ioni de Zn2+

par să fie

structuri mai complicate, deşi, un mecanism similar de coordinare a fost propus atât în cazul Zn2+

(Danielsson et al. 2007), cât şi în cazul Fe3+

(Nair et al. 2010).

În ciuda eforturilor experimentale susţinute, estimările cantitative ale constantelor de disociere

care caracterizează afinitatea ionilor metalici pentru peptidele amiloid au generat rezultate

disparate, cu valori raportate în domeniul atomolar - 11 µM pentru Cu2+

, respectiv 2-300 µM

pentru Zn2+

(Atwood et al. 2000; Tougu et al. 2008). În cadrul studiilor noastre, am implementat

tehnica de investigaţie la nivel unimolecular bazată pe inserţia unui singur nanopor proteic de α-

HL în membrana lipidică, pentru a cuantifica detaliile microscopice care guvernează

interacţiunea dintre diferite metale Cu2+

, Zn2+

, Fe3+

, Al3+

, şi fragmentul amiloidic Aβ1-16 de

origine umană. Rezultatele noastre au confirmat posibilitatea utilizării acestui sistem pentru a

dezvolta o nouă tehnică de analiză cinetică a interacţiunilor dintre diverse metale şi peptide Aβ,

şi ne-au permis estimarea cantitativă a constantelor de echilibru care caracterizează aceste

interacţiuni reversibile.

Figura 17. Înregistrări tipice de curent ionic la nivel de singură moleculă care arată interacţiunea

reversibilă dintre fragmentul Aβ1-16 şi porul de α-HL la o diferenţă de potenţial aplicată ΔV = -100

mV, în absenţa (a), respectiv prezenţa a 200 µM Cu2+

(b), Zn2+

(c), Fe3+

(d), Al3+

(e). Fluctuaţiile de

curent de la nivelul de bază corespunzător porului liber (~ -150 pA), reflectă procesele reversibile

de asociere dintre un singur monomer de peptidă şi lumenul porului proteic.

25

Figura 18. Diagrame “scatter-plot” care arată distribuţia amplitudinii relative de blocaj, ΔIblock, a

timpilor de rezidenţă a fragmentelor peptidice Aβ1-16 în interiorul porului de α-HL, care

evidenţiază amprenta distinctă a blocajelor induse de aceste peptide adăugate de partea trans a

membranei într-o concentraţie de 50 µM, în absenţa (a), respectiv prezenţa diferitelor metale (b-e)

în concentraţie de 200 µM. Blocajele distincte asociate cu peptidele libere (ΔIpeptide), respectiv

peptidele complexate cu diferiţi ioni metalici (ΔIpeptide-M), au fost evidenţiate prin încadrare în

contururi eliptice. Evenimentele de ciocnire a peptidelor la gura porului, caracterizate de

amplitudini relative reduse ale blocajelor, au fost excluse din analiza statistică.

Figura 19. Dependenţa timpului mediu de disociere a peptidei din por, τOFF (a), respectiv a timpului

mediu de asociere a peptidei cu porul , τON (b), ce caracterizează reacţia reversibilă dintre monomerii

de peptidă şi lumenul α-HL, de concentraţia de metal adăugată de partea trans a membranei: Cu2+

(triunghiuri cu vf. în sus), Zn2+

(cercuri), Fe3+

(triunghiuri cu vf. în jos), Al3+

(pătrate). Concentraţia

de fragmente amiloidice Aβ1-16 a fost de 50 µM.

Tehnica dezvoltată de noi se bazează pe amprenta unică a fluctuaţiilor curentului ionic mediat de

un singur por de α-HL imobilizat în membrana lipidică, ca urmare a pătrunderii fragmentelor

libere de peptidă, respectiv a fragmentelor complexate cu metale în lumenul porului. Analiza

cinetică a frecvenţei fenomenelor de blocaj induse de interacţiunea dintre peptidele amiloid şi

porul proteic, în prezenţa unor metale cu afinitate crescută faţă de aceste peptide (ex. Cu2+

, Zn2+

),

ne-a permis cuantificarea constantelor de disociere ale proceselor de complexare a acestor metale

cu monomerii de peptide (Kd, Cu2+

= 4.5 9 10-7

M, si Kd,Zn2+

= 9.2 9 10-5

M). Rezultatele

noastre arată că această tehnică generază rezultate ce pot complementa cu succes abordările

analitice de descriere a interacţiunilor metal - peptide amiloid şi întăresc posibilitatea generării

unor senzori bazaţi pe peptide pentru detecţia diferitelor metale, bazaţi pe funcţionalizarea

26

raţională a nanoporilor proteici cu secvenţe peptidice capabile să recruteze selectiv şi cu afinitate

crescută diferite metale de interes.

A) B)

Figura 20. A) Înregistrări tipice de curent ionic printr-un singur canal de α-HL care arată

interacţiunea reversibilă dintre fragmentul Aβ1-16 de origine umană (stânga, roşu), respectiv

fragmentul Aβ1-16 de origine murină (dreapta, albastru), adăugate de partea trans a membranei în

concentraţie de 50 µM, şi lumenul porului proteic. Diferenţa de potenţial aplicată a fost ΔV = -100

mV. Datorită duratei foarte mici a evenimentelor de blocaj cauzate de peptida de origine murină,

frecvenţa de tăiere a filtrului “trece-jos” a fost 20 kHz în cadrul acestor înregistrări, spre deosebire

de 10 kHz în cazul experimentelor cu peptida de origine umană, fapt ce se reflectă în zgomotul

crescut al înregistrărilor corespunzătoare peptidei de la şoareci. B) Dependenţa de concentraţia de

Cu2+

adăugată de partea trans a membranei a timpului mediu de asociere a peptidei cu porul, τON

(paneluri a,c), respectiv a timpului mediu de disociere a peptidei din por, τOFF (paneluri b,d), ce

caracterizează reacţia reversibilă dintre monomerii de peptidă Aβ1-16 de origine umană(panelurile

de sus), respectiv Aβ1-16 de origine murină (panelurile de jos), şi lumenul porului de α-HL.

Nivelurile curentului ionic corespunzătoare porului liber şi porului blocat de peptidă sunt indicate

prin săgeţi “open”, respectiv “closed”.

27

Figura 21. Dependenţa de diferenţa de potenţial aplicată a timpului mediu de disociere a peptidei din

por, τOFF, ce caracterizează reacţia reversibilă dintre fragmentele de peptidă Aβ1-16 de la om (roşu),

respectiv de la şoareci (albastru), şi lumenul porului de α-HL, în absenţa (panelurile a şi c), respectiv

prezenţa ionilor de Cu2+

de partea trans a membranei (panelurile b şi d). Concentraţia de fragmente

amiloidice adăugate a fost de 50 μM. Cu2+

a fost adăugat în concentraţie de 200 μM în cazul

experimentelor pe peptide de origine umană (b), respectiv 600 μM în cazul experimentelor pe peptide

de origine murină (d). În cazul absenţei metalului din soluţia electrofiziologică pentru ambele peptide

şi a prezenţei Cu2+

în interacţiune cu peptidele de la şoarece, dependenţele de ΔV ale timpului mediu

de disociere τOFF au fost fitate cu scăderi exponenţiale odată cu creşterea în modul a diferenţei de

potenţial (a,c,d). În cazul prezenţei Cu2+

în interacţiune cu peptidele de origine umană, dependenţa de

ΔV a timpului mediu de disociere τOFF a fost fitată cu o scădere exponenţială odată cu scăderea în

modul a diferenţei de potenţial (b).

În cadrul investigaţiilor realizate pe cele două fragmente amiloidice similare Aβ1-16, unul de

origine umană, respectiv unul de origine murină, a fost pusă în evidenţă afinitatea crescută

aacestor peptide pentru porul proteic de α-HL în prezenţa ionilor de Cu2+

. Analiza cinetică a

frecvenţei şi duratei fenomenelor de blocaj, în contextul interacţiunilor dintre două populaţii

diferite de peptide (libere, respectiv complexate cu metal) cu porul proteic, a generat următoarele

valori pentru constantele de disociere ale interacţiunilor: Kd (α-HL; Cu2+

) = 26.8 µM (Aβ de la

şoareci) and Kd (α-HL; Cu2+

) = 32.6 µM (Aβ de la om). Afinitatea crescută a celor două peptide

complexate cu metale faţă de porul proteic a fost pusă pe seama unei creşteri a hidrofilicităţii

complecşilor formaţi care conduce la creşterea contribuţiei entalpice la diferenţa de energie

liberă asociată reacţiei la echilibru dintre fragmente Aβ1-16 complexate cu Cu2+

şi α-HL.

Datorită faptului că legarea Cu2+

conduce la constrângerea conformaţională a fragmentelor Aβ1-

16, probabilitatea contribuţiilor entropice de a avea un rol în creşterea afinităţii complecşilor

metal-peptidă pentru porul α-HL este neglijabilă. Aceste concluzii întăresc rezultatele unor studii

recente care arată că chelarea ionilor de Cu2+

de către aminoacizii His 6, His 13 şi His 14, din

structura primară a peptidelor Aβ de la om, inhibă formarea fibrilelor amiloidice prin stabilizarea

peptidelor amiloyd în stare solubilă şi reducerea interacţiunilor hidrofobe care conduc la

agregarea peptidelor.

28

Analizând în detaliu procesele de asociere, respectiv disociere, ale interacţiunilor reversibile

studiate, rezultatele noastre arată că asocierea peptidelor Aβ1-16-Cu2+

de la şoareci cu porul α-

HL este mai favorabilă faţă de cazul peptidei libere, pe când în cazul peptidelor Aβ1-16-Cu2+

de

la om, asocierea este redusă faţă de interacţiunile cu peptida liberă. Aceste observaţii ar putea fi

puse pe seama unor modificări conformaţionale ale peptidei peptidelor Aβ1-16-Cu2+

de la

şoareci care rezultă într-o interacţiune mai favorabilă la gura porului de α-HL.

De asemenea, rezultatele au arătat că modificările conformaţionale ale peptidei Aβ1-16 de la

şoareci, rezultate în urma complexării cu metale, păstrează o topologie spaţială favorabilă

translocării peptidei complexate de partea cealaltă a porului de α-HL. Contrar acestei situaţii,

peptida Aβ1-16 de la om îşi pierde abilitatea de translocare prin por în urma complexării cu

Cu2+

. (Fig. 21, panelurile b, d). Aceste rezultate întăresc observaţia că legarea metalelor produce

efecte diferite asupra celor două fragmente amiloidice prin alterarea distinctă a împachetării

acestora în urma complexării. Ca urmare, modificările conformaţionale induse asupra celor două

fragmente amiloid depind în mare măsură de prezenţa în plus a aminoacidului His 13 la peptida

de origine umană faţă de cea de la şoareci, care conţine doar doi aminoacizi histidină (His 6, His

14) în structura primară.

Din datele experimentale obţinute până în acest moment se poate concluziona că:

a) tăria ionică a soluţiei fiziologice mărește timpul de rezidenţă a peptidei în por iar timpul

dintre evenimete scade.

b) modificarea pH-ului soluţiei duce la mărirea sau micșorarea timpului de rezidenţă a

peptidelor în porul proteic. De asemenea pH-ul soluţiei influenţează semnul potenţialului

aplicat pentru ca molecula să se insere în porul proteic. Astfel dacă se ia în considerare

moleculele de ciclodextrină s-a putu observa că la pH acid aceste molecule interacţionează cu

α-HL mai ales la aplicarea unui potenţial negativ. Mai mult timpul de rezidenţă crește foarte

mult în aceste condiţii. La un pH neutru moleculele de ciclodextrină pot pătrunde în porul

proteic atât la potenţiale negative cât și la potenţiale pozitive, dar timpul de rezidenţă scade

foarte mult. Dacă se lucrează la pH bazic se observă că moleculele se inseră mai ales la

aplicarea unui potenţial pozitiv și de asemenea timpul de rezidenţă crește odată cu creșterea

pH-ului.

c) prezenţa ionilor metalici produce complexarea peptidelor înainte de a interacţiona cu porul

proteic ducând la o modificare a conformaţiei acestora, crescând atât timpul de rezidenţă a

complexului în por cât și timpul dintre evenimentele de blocare.

d) un alt element foarte important care influenţează „dramatic” timpul de rezidenţă dar si timpul

dintre blocaje al unui compus ciclic sau nu, este dimensiunea acestuia. Astfel cu cât molecula

are diametru mai mic cu atât timpul de rezidenţă este mai mic.

29

Figura 22. Înregistrarea fluctuaţiilor de curent produse de interacţiunea dintre γ-CD (diametrul

interior 7.5–8.3Å și exterior 16.9Å) și β-CD (diametrul interior 6.0–6.6 Å și exterior 15.3 Å) și porul

proteic de α-HL. Aceste înregistrări s-au realizat în condiţii diferite de pH. Panel a și b reprezintă

blocajele produse de γ-CD la pH=4.4 și ΔV = -50 mV și ΔV = +50mV iar panel e și f reprezintă

blocajele produse de β-CD la pH=4.4 și ΔV = -50 mV și ΔV = +50mV. Fluctuaţiile de curent

înregistrate la pH = 7 și ΔV = -50 mV și ΔV = +50mV sunt reprezentate în panel c și d pentru γ-CD și

g și h pentru β-CD.

Moleculele ciclice sunt utilizate din ce în ce mai mult în procesul de detecție și cuantificare a

diferiților analiți. Ciclodextrinele au fost utilizate pe scară largă în procesul de incluziune a

diferitelor substanţe cu importanţă fiziologică dar şi în secvenţierea genomului uman cu costuri

mici (Nature doi:10.1038/ nature. 2012.10051). O problemă majoră cu aceste molecule este

faptul că interiorul macrociclului este hidrofob şi nu poate fi funcţionalizat cu uşurinţă şi cu

costuri mici cu grupări specifice pentru diferiţi compuşi hidrofili, impundu-se utilizarea acestora

într-un domeniu restrâns.

O moleculă sintetizată în cadrul acestui proiect a fost oxicalix[3]arena. Acestă moleculă are

structură asemănătoare cu a ciclodextrinelor dar poate fi ușor funcţionalizată în interiorul ciclului

putând fi apoi utilizată ca senzor pentru diferiţi compuși.

30

Figura 23. Reprezentarea fluctuaţiilor de curent produse de interacţiunea dintre un canal de α-HL și o

moleculă de calix[3]arena. Molecula ciclică blocheaza lumenul porului aproape în totalitate,

amplitudinea blocajului tinzând spre zero. Potenţialul aplicat (a) ΔV = +50 mV și (b) ΔV = -50 mV.

Soluţie: 2 M KCl, 10 mM HEPES, pH=7.3

Din datele experimentale obţinute (Figura 23) s-a observat că aceste molecule se „acomodează”

bine în interiorul porului având un timp de rezidenţă suficient de mare.

Un studiu foarte interesant pe care l-am realizat a fost acela în care am utilizat complexul format

de α-HL • γ-CD pentru a înțelege o nouă paradigmă de actualitate, aceea de a descifra cu ajutorul

electrofiziologiei, la nivel de singură moleculă structura primară a unei peptide. O dată cu

acumularea de cunoștințe noi în domeniul medicinei și a biologiei moleculare, s-a putu observa

că proprietățile unor proteine sau peptide depind de structura primară a acestora. Interesant este

faptul că prezența unui aminoacid sau absența sa, sau înlocuirea lui cu altul poate să producă

perturbări dramatice asupra structurilor terțiare sau quaternare ale proteinelor. Mai mult, s-a pus

în evidență de curând că prezența glutaminei în locul asparaginei produce modificări de

împachetare ale proteinei. Astfel putem să înțelegem și mai bine importanța cunoașterii

compoziției unor peptide. În acest studiu am reușit să obținem o amprentă specifică pentru trei

aminoacizi care se găsesc într-o peptidă sintetică. Acesta are următoarea structură primară: P8-

HRWWRWWRH peptidă ce are în structura sa 9 aminoacizi, având q = +5 la pH = 4.4 și

VH=153.2 Å3 , VR=173.4 Å 3 , VW=227.8 Å 3 (Figura 24).

Figura 24. Formula structurală a peptidei P8

31

După cum se observă, fiecare aminoacid are un volum specific și bine determinat. Ținând cont

de acestea, am presupus că din considerente sterice acești aminoacizi pot fi detectați cu ajutorul

complexului format de α-HL • γ-CD. Atunci când o moleculă cu un anumit volum trece prin

complex va produce un blocaj cu o amplitudine proporțională cu dimensiunea ei. Astfel curentul

rezidual prin complex va avea următoarea ordine: IresH >Ires R>Ires W. Din înregistrările

fluctuațiilor de curent prin complex se confirmă această ipoteză (Figura 25).

Figura 25. Reprezentarea fluctuațiilor de curent produse de peptida P8 care pătrunde în complexul

proteic de α- HL • γ-CD (stânga). În inset s-au pus în evidență diferitele niveluri ale amplitudinii

curentului, amplitudini obținute la trecerea diferiților aminoacizi prin CD. În panelul din dreapta a

fost reprezentată histograma de amplitudine în care se observă amplitudinea specifică fiecărui

aminoacid. Soluția utilizată a fost 2 M KCl, 5 mM MES, pH = 4.4, la un potențial aplicat ΔV = -90

mV.

Acest studiu este doar într-o fază incipientă, urmând ca în următoarea perioadă de timp să

aprofundăm acest studiu utilizând alte peptide și alte condiții fizico-chimice experimentale.

Un alt obiectiv a fost studierea cineticii bazată pe eliberarea diferiților fluorofori din lipozomi

gigant realizată prin microscopie optică de fluorescență. Veziculele unilamelare gigant au fost

obținute prin metoda electroformării (Angelova, M.I., 1986) folosind diverse amestecuri de

lipide: 1,2-dioleyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) 100% sau DOPC şi lipidă anionică 1,2-

dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1’-rac-glycerol (DOPG) în proporții diferite: 20%, 30%,

respectiv 40% DOPG (procente molare). 20 µl din amestecul de lipide dizolvate în cloroform au

fost depuși pe o lamelă de sticlă acoperită cu un strat de ITO (indium tin oxyde, Sigma-Aldrich,

Germania) și uscat sub vid. Peste filmul lipidic format s-au adăugat 250 µl soluție de sucroză 250

mM ce conține izotiocianat de fluoresceină 10 µM. Camera de electroformare a fost închisă cu o

a doua lamelă ITO și conectată la o sursă de curent alternativ la 1,2 V la 12 Hz pentru 3 ore.

Veziculele astfel electroformate conțin în interior fluoresceină.

Lipozomii au fost vizualizaţi cu ajutorul unui microscop confocal Nikon Eclipse Ti-E, excitând

fluorescina cu ajutorul unui laser argon ion la lungimea de undă de 488 nm.

32

În cadrul experimentului ne-am propus să investigăm formarea porilor de α-hemolizină (α-HL)

în aceste membrane lipidice. α-HL formează canale ionice heptamerice care se inseră în

membrana celulară şi permit trecerea ionilor şi a moleculelor mici prin aceste canale.

Principiul metodei de monitorizare a formării porilor proteici de α-HL în membrana lipozomilor

gigant prin microscopie confocală este prezentat mai jos. Atunci când nu avem α-HL în soluţie,

fluoresceina nu se poate elibera din interiorul lipozomilor. Când adăugăm proteină în mediul

extern, aceasta formează pori în membrană şi permite “scurgerea” fluoresceinei din vezicule

(Figura 26).

Figura 26. Reprezentare schematică a principiului de monitorizare indirectă a formării porilor

proteici de α-HL în membrana lipozomilor gigant. In stânga se observă lipozomul cu fluorescina în

interior, iar în dreapta, prin porul de α-HL se eliberează fluoroforul. În această figură,

dimensiunea lipozomului (10-150 μm) nu este cea reală în raport cu dimensiunea porului proteic

(nm). Pentru simplitate, am reprezentat un singur por în membrană.

Peste soluția de vezicule cu compoziție lipidică diferită am adăugat 10 nM α-HL şi am

achiziţionat imagini ale acestora la diferite intervale de timp, realizând în același timp și

experimente control, fără α-HL. S-a observat că intensitatea fluorescenţei din interiorul

lipozomilor descreşte în timp, pentru că fluoresceina se eliberează din vezicule prin porii de α-

HL (Figura 27):

5 min 10 min 15 min

Figura 27. Intensitatea fluorescenţei din interiorul lipozomilor descreşte în timp.

Acest lucru a fost observat pentru toţi lipozomii indiferent de compoziţia lipidică. Acest lucru

arată că α-HL formează pori atât în membrane neutre, cât şi în membrane încărcate electric net

negativ (Figura 28).

33

0 3 6 9 12 15 180.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

40 % PG

30 % PG

20 % PG

DOPC

No

rmal

ized

in

ten

sity

Time, min

Figura 28. Eliberarea fluoresceinei din lipozomii gigant cu compoziții lipidice diferite: DOPC

100%, DOPC/DOPG 80/20, DOPC/DOPG 70/30, DOPC/DOPG 60/40.

Experimentele control au arătat faptul că în absența α-HL, intensitatea fluoresceinei în interiorul

lipozomilor rămâne constantă în același interval de timp de 15 minute, necesar eliberării

fluoroforului în prezența porilor formați de proteină (Figura 29):

5 min 10 min 15 min

Figura 29. Intensitatea fluorescinei în interiorul lipozomilor rămâne constantă în același interval de

timp de 15 minute

În cadrul filosofiei generale a proiectului BIOSENS care vizează folosirea ca senzor a

ciclodextrinelor acomodate în porul de a-hemolizină, obiectivul nostru a fost verificarea modului

în care prezența acestor compuși în bistratul lipidic afectează proprietățile acestuia.

A. Spectroscopia de fluorescență a Laurdanului, pentru a evidenția eventuala destabilizare a

membranei și permeabilizarea ei pentru apă, evaluată prin parametrul GP – polarizarea

generalizată și

B. Măsurarea depolarizării fluorescenței (r) a markerului TMA-DPH încorporat în

membrana ce permite o evaluare a fluidității acesteia

Modelul de membrană folosit au fost lipozomii SUV în suspensie, preparați din DMPC, în care

s-au încorporat, pe rând, α-hemolizina și apoi β-ciclodextrina.

A. Parametrul GP s-a calculat folosind spectrele de emisie a Laurdanului în intervalul de

temperatură 10-400C

,

34

în care și sunt intensitățile maxime ale emisiei de fluorescență a Laurdanului în

domeniul albastru și roșu, după cum reiese din înregistrările de mai jos.

Figura 30. Spectrele de emisie ale Laurdanului din membrana lipozomală la diferite temperaturi

Curbele de variație a polarizării generalizate GP cu temperatura pentru supensiile de lipozomi

DMPC martori, precum și pentru lipozomii conținând α-HL și α-HL + β-CD sunt date mai jos.

Fitarea Gaussiana a curbelor a permis identificarea punctului de inflexiune ce corespunde

temperaturii de tranziție a membranei lipozomale în jurul valorii de 290C.

S-au repetat măsuritorile pe probe diferite din cele trei situații mentionate: lipozomi DMPC

martori, lipozomi+ α-HL si lipozomi + α-HL + β-CD.

10 15 20 25 30 35 40

-0.15

-0.10

-0.05

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

DMPC

DMPC + a-HL

DMPC + a-HL + CD

Boltzmann of GP

Boltzmann of GP

Boltzmann of GP

GP

t (0C)

Figura 31. Variația polarizării generalizate GP cu temperatura în cazul lipozomilor DMPC simpli

(negru), conținând α-HL (roșu) și α-HL + β-CD (verde)

Aplicarea testelor nonparametrice Paired Sample Wilcoxon pentru setul de date de la fiecare

temperatură în parte a arătat că pentru nici una dintre temperaturile din intervalul 100C-40

0C,

valorile probelor cu α-HL și valorile probelor cu α-HL + β-CD, la un nivel de p< 0.05, luate ca

două distribuții, nu au fost semnificativ diferite față de martori.

35

B. Valoarea fluidității membranare este o consecință a compoziției lipidice a membranei,

dar și a interacțiunilor proteine-lipide de la nivelul membranei. Din acest motiv, putem

folosi fluiditatea membranară ca instrument de studiu pentru interacțiunea proteină-lipide

și ne asteptăm ca aceasta să se modifice în prezența α-HL.

Ca modalitate de măsurare a fluidității membranare s-a folosit metoda depolarizării fluorescenței.

Parametrul (r) - o măsură a depolarizării fluorescenței markerului TMA-DPH încorporat în

membrană, scade atunci când fluiditatea bistratului lipidic crește.

Figura 32 Curbele de variație a anizotropiei fluorescenței suspensiilor lipozomale martor (negru), a

suspensiilor de lipozomi care conțin α-HL (roșu) și care conțin α-HL + β-CD (albastru)

Fitarea Gaussiana a curbei de anizotropie a probelor martor (s-au folosit 10 probe martor) a

permis identificarea valorii temperaturii de tranziție a bistratului lipidic de 260C.

Probele conținând α-HL + β-CD prezintă un interval mai larg de temperaturi la tranziția de

fază din cauza compoziției mixte lipid+ proteină.

S-au efectuat înregistrări pe probe-martor ce conţineau suspensia de lipozomi DMPC, pe probe la

care s-a adăugat α-HL în suspensia de lipozomi şi pe probe ce conţineau α-HL + β-CD. S-au

efectuat teste nonparametrice (Paired Sample Wilcoxon), pentru fiecare temperaturã din

intervalul 100C-40

0C, comparând valorile probelor cu α-HL şi cele ale probelor cu α-HL + β-CD,

reieșind că cele două distribuții nu sunt diferite în mod semnificativ.

Diferențele între probele cu α-HL și probele cu α-HL + β-CD sunt foarte mici, tocmai pentru că

β-CD nu interacționează cu membrana, ci se leagă direct în lumenul porului de α-HL; ca atare,

prezența acesteia nu influențează proprietățile membranei.

a. Prezența α-HL și a complexului α-HL + β-CD nu afectează organizarea bistratului

lipidic în sensul permeabilizării sale pentru specii polare (apa) la temperaturi superioare

temperaturii de tranziție a lipidelor DMPC

b. Prezența α-HL și a complexului α-HL + β-CD rigidizează membrana în intervalul de

temperaturi superioare temperaturii de tranziție a membranei lipozomale

10 15 20 25 30 35 40

0.10

0.12

0.14

0.16

0.18

0.20

0.22

0.24F

luo

rescen

ce a

nis

otr

op

y(r

)

t (0C)

Control

- Hemolysin

- Hemolysin + Cyclodextrins

36

c. Diferențele între probele cu α-HL și probele cu α-HL + β-CD sunt foarte mici, tocmai

pentru că ciclodextrina nu interacționează cu membrana, ci se leagă direct în lumenul

porului de α-HL; ca atare, prezența acesteia nu influențează proprietățile membranei.

După testarea efectului asupra membranei lipozomale a α-HL și a complexului α-HL + β-CD,

s-a trecut la testarea efectului acestora asupra membranei unor celule umane, respectiv asupra

plachetelor sanguine. Testările s-au făcut pe plachete proaspăt extrase de la donatori, la câteva

ore după prelevarea probelor de sânge. Întrucât în literatură se semnalează un efect pro-agregant

al α-HL, s-a verificat în ce măsură inserarea ei, cu și fără β-CD, induce agregarea trombocitelor,

prin comparație cu un agonist cunoscut al agregării, adenozin difosfatul (ADP).

Trombocitele sunt principala țintă a α-HL în sângele uman. α-HL se inseră în membrana celulară

formând un por în care se fixează β-CD. De β-CD se pot atașa alte structuri care să fie prezente

intra- sau extracelular. Interesul pentru complexul α-HL + β-CD este datorat raportărilor din

literatura de specialitate ce avansează acest complex ca pe o structură cu un mare potențial în

domeniul biotehnologic și farmaceutic fiind un posibil micro- sau nanodispozitiv, o moleculă

sensor ce ar putea chiar să transporte substanțe active.

Agoniștii sunt substanțe cu afinitate specifică pentru anumiți receptori pe care îi activează și care

produc un anumit răspuns biologic, în cazul de față, agregarea trombocitelor. Agregarea

trombocitelor se produce într-un interval de câteva secunde până la câteva minute de la adiția

agonistului

Adenozin difosfatul (ADP) este o nucleotidă capabilă să activeze diferiți receptori trombocitari,

în special P2Y1, P2Y12 și P2Y13. Acești receptori sunt activați și in vitro într-un mod direct

proporțional cu concentrația agonistului.

Legarea ADP-ului de receptorul P2Y1 induce modificarea formei trombocitului și inițiază

agregarea primară prin mobilizarea calciului intracelular. La nivelul membranei trombocitare, α-

HL are efecte diferite în funcție de doză.

Deși formarea porilor și liza celulară sunt principalele consecințe ale acțiunii α-HL, studii

recente au evidențiat un răspuns celular în cazul intoxicațiilor sublitice, în special alterarea căilor

de semnalizare care guvernează proliferarea celulară, răspunsul inflamator, secreția de citokine și

interacțiunile intercelulare.

Figura 33. Efectul α-HL dependent de doză

37

α-HL generează o agregare direct proporțională cu doza, într-un interval de 1 minut de la adiție.

Inserarea α-HL în trombocit are loc rapid, în 30-90 de secundela 37°C.

Figura 34:Agregarea trombocitară măsurată folosind adiția unor doze crescătoare (0.5–10 μg/mL)

de αHL

Concentrația de α-HL care determină un efect mediu (EC50) este de3 µg/mL.

După adiția α-HL se observă o fază inactivă de 30-70 de secunde urmată de schimbarea formei

trombocitelor și apoi agregare ireversibilă.

Monomerii de α-HL aderă inițial la membrana celulară fără să provoace excreție. Ulterior

difuzează și se asociază formând oligomeri legați non-covalent care crează pori membranar.

Când porii se formează în membrana unei celule nucleate, porul se comportă ca un canal de

calciu non-fiziologic, influxul acestui cation generând diverse reacții, inclusiv eliberarea unor

lipide cu rol mediator provenite din cascada arahidonică. Trombocitele fiind celule anucleate,

adiția α-HL induce activarea lor care are loc prin eliberarea factorului plachetar 4 (PF4 sau altfel

spus Ca2+

), transpusă în curba de agregare ca fază inactivă urmată de schimbarea formei

trombocitelor.

Celulele umane au o capacitatea naturală de a inactiva o fracțiune substanțială de α-HL in vitro

prin implicarea lipoproteinelor cu densitate mică (LDL) și a anticorpilor din plasma indivizilor

sănătoși.

In vitro α-HL poate reduce timpii de coagulare (efect procoagulant) cu până la 70%, un efect

dependent de prezența trombocitelor.

β-CD face parte dintr-o familie de oligozaharide ciclice obținute prin degradarea enzimatică a

amidonului. Ciclodextrinele sunt formate din 6-8 monomeri de glucoză. Β-CD are o structură de

inel cu 7 molecule de zahăr. Este o moleculă solubilă în apă care poate fi inserată în lumenul

canalelor ionice cum este și canalul format de α-HL. βCD se leagă de porul αHL prin legături de

hidrogen, legături CH-π și interacțiuni hidrofobe.

38

Figura 35. Complexul α-HL + β-CD și suprafețele de legare ale β-CD

Complexul astfel format poate avea multiple aplicații în biotehnologie: moleculă senzor pentru

detecția stocastică și ultrarapidă în secvențierea ADN-ului,detecția anumitor canale ionice în care

se inseră, nanoreactanți pentru a observa reacțiile chimice de la nivelul unei singure molecule,

cât și în construirea unor micro- sau nanodispositive.

Există clase importante de pori care conțin molecule adaptoare cu rol de situs de legare pentru

alte molecule mici. Puterea de legare a β-CD de α-HL poate fi modulată, obținându-se în prezent

mutanți de α-HL care leagă adaptorul β-CD de aproximativ de 104 mai multe ori decât legarea

spontană.

Figura 36. Curbe de agregare induse cu agonisti diferiţi observate pe parcursul a 700 de secunde.

39

Figura 37. Agregarea cu α-HL în comparatie cu agregarea ireversibilă indusă de ADP

Figura 38. Agregarea indusă de complexul α-HL+β-CD

Complexul α-HL+β-CD nu a generat modificări semnificative în aspectul curbelor de agregare,

nici din punct de vedere al transmitanței măsurate, nici ca viteză a procesului de agregare. Cu

alte cuvinte, micșorarea dimensiunii porului format de α-HL prin înserarea β-CD în acesta (1.53

nm) nu a influențat agregarea.

O situație diferită a fost întâlnită în cazul prelucrării probelor recoltate de la un voluntar ale cărui

curbe de agregare indusă cu α-HL au arătat o agregare complet ireversibilă. Ulterior am aflat că

voluntarul avea o valoare crescută de colesterol (LDL 275 md/dL).

Figura 39. Curbe de agregare în cazul unei dislipidemii. Gradul de agregare se apreciaza prin

valoarea transmitantei T

40

Observăm că agregarea cu ADP nu a fost influențată și trombocitele au avut capacitatea de a

dezagrega. Restul caracteristicilor observate în situațiile anterioare se regăsesc și aici, excepție

făcând lipsa pantei de dezagregare a curbelor cu α-HL. În acest caz α-HL a indus o agregare

complet ireversibilă.

Fiind vorba despre o singură curbă cu acest aspect, va fi nevoie de reproducerea experimentului

pe o serie asemănătoare de voluntari pentru a putea ajunge la o concluzie. Nici în acest caz,

complexul α-HL+β-CD nu a produs modificări semnificative.

În Figura 36 am observat că agregarea maximă indusă de ADP măsura o transmitanță

asemănătoare cu agregarea maximă indusă de α-HL. În Figura 39 observăm că agregarea indusă

cu α-HL generează o agregare maximă asemănătoare cu agregarea indusă de soluția cu ADP și

α-HL administrate împreună, putem spune că α-HL a declanșat și fază secretorie.

Dezagregarea ar putea fi explicată prin expresia enzimei CD39 întâlnită în majoritatea celulelor

vasculare. CD39 acționează asupra ATP-ului și ADP-ului liber hidrolizându-l la adenozin

monofosfat (AMP) readucând trombocitele în faza de repaus și cu ajutorul lui CD73, AMP este

transformat mai departe în adenozină care inhibă chiar agregarea. Aceste caracteristici au fost

demonstrate în celulele endoteliale. CD39 este implicat și în modularea expresiei receptorilor

P2Y de pe trombocite, coexpresia acestor receptori pe membrana trombocitară a fost confirmată.

Se știe că depleția de colesterol a membranei trombocitare în care se găsește și CD39 generează

o întârziere semnificativă în procesul de inhibarea al agregării plachetare și o substanțială

scădere a gradului de dezagregare. S-a demonstrat că depleția colesterolului membranar scade

legarea α-HL în membrana celulară. În literatură, la indivizii sănătosi s-a observat că LDL-ul din

plasmă inactivează o mică parte din α-HL. Putem să speculăm că un exces plasmatic de LDL,

generează o creștere a colesterolului membranar ce ar putea astfel lega mai multă α-HL și induce

o agregare irevesibilă.

Figura 40. Model teoretic al efectului pe care ar putea să-l producă depleția de colesterol

membranar asupra agregării

41

Cercetarea modificărilor bistratului lipidic (liposomi ) în prezența hemolizinei și a complexului

α-HL+β-CD a fost dublată de studiul proteinei integrale receptoare din membrana trombocitului

uman ce are o afinitate și specificitate înaltă pentru fibrinogen și fibronectină, jucând un rol

crucial în coagulare. Receptorii CD41 și CD 42 a, CD42 b sunt exprimați mai slab în membrana

plachetară a pacienților cu Sindrom Mielo Displazic. Am demonstrat că acest fapt se corelează

semnificativ cu fluiditatea membranară scăzută a plachetelor recoltate de la acești pacienți.

Pentru expresia CD41 vs anizotropie: coeficientul de corelare r = -0.714 și P=0.04 iar pentru

expresia CD42a vs anizotropie: r= -0.786, P= 0.02.

Expresia proteinelor receptoare CD41 și CD42a/42b în grupul martor și cel al pacienților cu

sindrom mielodisplazic

CD41 CD42a CD42b

MDS 22.22 (min 4.17, max

53.33)

45.39 (min 10.16,

max 66.67)

36.08 (min 3.49, max

60)

Control

group

89.03(min 33.67, max

92.6)

91.19 (min 50.95,

max 99.86)

89.22 (min 48.57, max

95.88)

p 0.005 0.01 0.005

Figura 41 Structura receptorului CD42

Concluzia în acest caz este că subexpresia receptorior specifici CD41 și CD42a/b este însoțită de

o fluidizare a membranei plachetare.

Se poate face o paralelă între cazul α-HL, a cărei prezență induce rigidizarea membranei

lipozomale și cazul subexpresiei receptorilor menționați (senzori moleculari selectivi) din

membrana plachetară în situația patologică MDS, când observăm o fluidizare (scădere a

rigidității membranei).

În urma experimentelor realizate în cadrul acestui proiect, am obținut rezultate comparabile cu

cele întâlnite în literatura de specialitate.

42

Concluzia globală a studiilor privind afectarea bistratului lipidic prin inserția α-HL sau a

complexului α-HL+β-CD este că în cadrul modelelor studiate – lipozomi tip SUV din DMPC și

trombocite umane recoltate de la donatori sănătoși, parametrii investigați nu se modifică în

mod esențial, ceea ce face din complexul α-HL+β-CD un instrument cu calități de potențial

biosensor ce nu alterează aparent proprietățile bistratului lipidic artificial cât și cele ale

celulei vii.

Un alt obiectiv important al acestui proiect a fost să realizăm un biomaterial compus dintr-un

material plastic a cărui suprafaţă să fie construită astfel încât să permită legarea covalentă a

lamininei care constituie un important component glicoproteic al membranelor. Lamininele joacă

un rol important în ataşarea, creşterea, diferenţierea celulară [Sasaki et al., 2004]

Pentru a putea fi supuse testului de difuzie prin agar, materialele plastice luate în studiu (nylon

6.6, PMMA-polimetilmetacrilat, PET-polietilentereftalat) au fost sterilizate prin iradiere gama cu

o doza de 25 kGy şi apoi supuse procedurii de extracţie. Extractele probelor au fost obţinute în

condiţii standardizate. Probele au fost imersionate în mediul de cultură complet pentru o perioadă

de 24 h, la o temperatură de 37ºC, cu agitaţie, cu un raport de extracţie greutate-volum de 0.2

g/ml. Culturilor de celule li s-au aplicat extractele pure. Ca probă de control negativ a fost utilizat

MEM fară ser, iar ca şi control pozitiv am utilizat o soluţie apoasă de 0,45 % fenol.

Testul de difuzie în agar a fost utilizat pentru evaluarea citotoxicităţii materialelor plastice PET,

PMMA şi nylon 6,6 . Metoda a fost aplicată în conformitate cu standardul SN ISO 10993.

Testul MTS s-a aplicat atât pentru materialele plastice PET, PMMA şi nylon 6,6. Celulele au fost

folosite pentru însămânţare în plăci cu 96 godeuri (200 microlitri mediu de cultură/godeu):

Determinarea viabilităţii celulare s-a făcut prin utilizarea kitului “Cell Titer 96 Aqueous One

Soluţion Cell Proliferation Assay” (Promega) ce are la bază reducerea de către celulele viabile a

reactivului MTS (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-

2H-tetrazolium) şi apoi detectarea spectrofotometrică a acestuia. Măsurarea absorbţiei la 490 nm

s-a făcut cu un cititor de plăci de Tecan. S-au calculat medii ale absorbţiilor măsurate pe replicile

culturilor aflate în aceleaşi condiţii de tratament.

Viabilitatea s-a calculat prin normarea valorilor obţinute la celulele tratate în raport cu acelaşi

număr de celule netratate. Viabilitatea (%) = [Abs 490nm(corectat)]proba tratata *100/ [Abs 490nm

(corectat)]proba netratata

În prima etapă benzile de polietilentereftalat (PET) de dimensiuni de (1x5) cm şi grosime 0,165

mm au fost tratate cu HCl 10 % la 40° C timp de o oră şi apoi spălate cu apă deionizată şi alcool

etilic şi uscate. În cea de-a doua etapă grupările carboxi formate în urma atacului chimic acid au

fost activate cu o soluţie de 10 mg N-hidroxisuccinimidă (NHS) şi 40 mg N-ciclohexil-N’-(2-

morfolinoetil)-carbodiimida-metil-p-toluolsulfonat (CDI) la un volum total de 20 ml

dimetilformamidă (DMF) aceasta reacţie de activare a fazei solide desfăşurându-se timp de 3 ore.

43

Figura 42. Schema cuplarii covalente a lamininei la suprafaţă PET.

În etapa a treia benzile de PET activate au fost puse în reacţie cu o soluţie de laminina în

concentraţie de 1 µg/ml în tampon carbonat 50 mM pH 9,5 şi lăsate să reacţioneze 24 ore pentru

cuplajul covalent la suprafaţă PET (conform schemei din figura nr 1). Benzile au fost ulterior

spălate cu tampon fosfat 10 mM pH 7,24 şi conservate în vederea testării cu diferite tipuri de

celule. Soluţii de laminina cu concentraţia de 2 ng/ml au fost folosite pentru AFM iar pentru IR

au fost folosite concentraţii de 1 µg/m şi 10, 100, 1000 µg/ml. Pentru adsorbţia lamininei la

suprafaţă PET, se pune PET-ul neactivat în contact cu o soluţie de laminina de 1 µg/ml în

tampon carbonat 50 mM pH 9,5 şi se lasă să reacţioneze.

În vederea determinării densităţii masice de suprafaţă a proteinei, a fost folosită pentru cuplajul

covalent peroxidază - o glicoproteină cu conţinut de carbohidraţi legaţi structural.

La 0.4 ml de 2% glutaraldehidă în 50 mM fosfat de sodiu (pH 7.2) s-au adăugat 10 mg de

peroxidază din hrean. După agitare timp de 8 h la temperatura camerei excesul de glutaraldehidă

a fost îndepărtat prin filtrarea prin gel prin utilizarea coloanelor cu Sephadex G25 cu 1mM fosfat

de sodiu ca eluent. Au fost colectate fracţiile ce conţin activitate peroxidazică şi amestecate, iar

concentraţia de proteină determinată. Tamponul soluţiei enzimatice a fost schimbat prin adăugare

de 100 mM de tampon de bicarbonat de sodiu (pH 9.5). 100 µl de soluţie de laminina (1 mg/ml)

a fost amestecată cu 100 µl de enzimă (0.5 mg/ml). Amestecul de reactive a fost incubat la 4C

pentru 24 h iar conjugatul laminin-peroxidază a fost purificat prin filtrare pe coloane cu

Sephadex G200. Concentraţia markerului sintetizat LAM-PRH=0,625 mg/ml.

Stripurile activate sau neactivate au fost introduse într-o soluţie de conjugat laminin-peroxidaza

(5µl) -10 ng/ml (în tampon de carbonat de sodium pH9,5) şi agitate pentru 6 ore la temperatura

camerei. Stripurile care conţin conjugatul au fost spălate cu 10 mM/l citrat de sodiu. Activitatea

peroxidazică a fost măsurată prin utilizarea soluţiei de substrat (1 mg/ml tetramethylbenzidină,

0.1 % apă oxigenată în 10 nM/l tampon citrat de sodiu pH 5.4). Măsurătorile spectrofotometrice

s-au realizat la 450 nm, iar activitatea enzimatică s-a calculat cu ajutorul unei curbe etalon şi a

O

O

o

O

C

O CH2

CH2

Polietilentereftalat (PET, poliester)

+ HCl

n

O C COOH

O

O-CH2-CH2-OH

Faza solida

R-N=C=N-R'

1-etil-3(3'-diaminopropil)-carbodiimida (CDI)

N-OH

O

O

N-hidroxisuccinimida (NHS)

++

O-CO- COO-N

O

OO-CH2-CH2-OH

Faza solida activa

H2N-LAMININA+

O-CO- CO-NH-LAMININA

O-CH2-CH2-OH

Laminina cuplata la faza solida (produs final)

Etapa 1: Reactia de scindare la suprafata a polietilentereftalatului

Etapa 2: Reactia de activare a gruparii carboxi cu carbodiimida si N-hidroxisuccinimida

Etapa 3: Reactia de cuplare covalenta a lamininei la faza solida

44

fost raportată la suprafaţa activată (suprafaţă de PET acoperită cu marker enzymatic exprimată în

cm2.

Analiza AFM a fost realizata cu un AFM comercial (XE-100, Park Systems, South Korea).

Suprafeţe de 1 um x 1um au fost analizate pentru toate probele prin metoda non–contact

utilizând cantiliveri de silicon (PPP NCHR, Nanosensors, Switzerland).

Spectrele de absorbţie IR au fost înregistrate cu un spectrometru IR TENSOR II (Bruker,

Billerica, MA, USA) echipat cu un modul ATR (attentuated total reflectance). Probele au fost

scanate de 16 ori şi mediate pentru a obţine spectrul final.

Limfocite izolate din sângele periferic uman precum şi fibroblaste de şoarece din linia L929

suspendate în mediu de cultură au fost depuse pe PET netratat şi tratat cu laminină pentru a testa

aderenţa acestora la suprafeţele biofuncţionalizate. Aderenţa celulelor la suprafeţe a fost

examinată după diferite intervale de timp de incubare a celulelor şi anume: 2 h şi 24 h pentru

limfocite şi, respectiv 1 min, 5 min, 15 min şi 24 h pentru fibroblaste. Celulele au fost colorate cu

doi markeri fluorescenţi acridine orange şi ethidium homodimer şi s-a efectuat numărarea

acestora la microscopul de fluorescenţă. Numărul celulelor s-a raportat la o suprafaţă de 1 cm2.

Pentru a induce diferenţierea, celulele OLN-93 au fost însămânţate pe rondele din materialul

plastic PET netratate şi tratate fie cu laminina (10 ug/mL), poli-D-lizină (40ug/mL), fie cu

matrice extracelulară ECM gel-100ug/ml, Sigma-Aldrich, Germania), folosind ca mediu DMEM

cu 10% FBS, respectiv DMEM cu 1% FBS, timp de 7 zile. Rondelele cu diamentrul de 10 mm

au fost aşezate în plăci cu 6 godeuri. Au fost însămânţate 500 celule/rondea în 60 µL de DMEM

10% FBS. După circa o oră de incubare la 37°C, 5% CO2, timp în care celulele au aderat la

substrat, în vasele de cultură s-a adăugat mediu până la un volum de 1 mL/godeu. Culturile au

fost lăsate peste noapte în incubator, iar a doua zi mediul a fost fie schimbat cu unul conţinând

1% FBS, fie înlocuit cu unul nou (cu 10% FBS), ulterior fiind reînnoit odată la 2-3 zile.

La 7 zile de la iniţierea culturilor în vederea diferenţierii, celulele au fost marcate cu o soluţie de

faloidină-FITC (Sigma-Aldrich, SUA), printr-un protocol specific. Faloidina este o toxină

fungică ce se leaga la fibrele de F-actină ale citoscheletului. Astfel, folosind faloidina conjugată

cu FITC, pot fi uşor observate chiar şi prelungirile foarte fine ale celulelor. Protocolul de

marcare constă în: spălare de 3 ori, 5 minute, cu PBS; fixare: paraformaldehida 3% (Sigma) în

PBS, 5 minute; spălare: de 3 ori, 5 minute, cu PBS; permeabilizare: Triton X 100 (Sigma) 0.1%

în PBS, 10 minute; spălare: de 3 ori, 5 minute, cu PBS. Lamelele au fost apoi mutate pe o folie

de parafilm. Marcarea s-a realizat prin aplicarea a 40 µL de soluţie faloidina-FITC 40 µg/mL, pe

fiecare lamelă, urmată de incubarea la temperatura camerei, la întuneric, timp de o oră; spălate de

3 ori, 5 minute, cu PBS. Lamelele au fost montate pe lame de sticlă folosind mediu de montare

antifade ProLong Gold Antifade Reagent (Invitrogen, SUA), lăsate la uscat şi sigilate cu lac de

unghii.

Celulele marcate cu faloidina-FITC au fost vizualizate folosind un microscop de fluorescenţă

(Olympus IX 71, Germania) dotat cu un set de filtre adecvat şi cu o camera CCD (iXON EM+

45

DU-897 E-CSO-UVB, Andor Technology, Irlanda) necesară pentru captura imaginilor. Analiza

morfologică s-a realizat folosind ImageJ (http://www.rsbweb.nih.gov/ij/) şi a constat în

măsurarea ariei corpului celular, cu ajutorul uneltei ”Poligonal selection” şi a lungimii

proceselor, utilizând ”Segmented line”. Utilizând comanda ”Measure”, programul a cuantificat

aceste date ca număr de pixeli. Informaţiile obţinute au fost apoi copiate într-un tabel în Origin.

Ulterior, folosind un factor de transformare calculat pe baza analizei imaginii unui micrometru

obiectiv prin intermediul unei scale de măsură, s-a aflat dimensiunea în microni a celulelor.

Pe lângă datele oferite din analiza în ImageJ, celulele au fost analizate din punct de vedere

morfologic prin încadrarea în 3 categorii, în funcţie de forma, numărul de prelungiri şi prezenţa

proceselor secundare.

Pentru fiecare dintre condiţiile de creştere am analizat minim 200 de celule, măsurand aria

corpului celular, lungimea proceselor şi încadrându-le într-una din cele 3 categorii descrise.

Pentru caracterizarea biochimică, expresia genica a unor markeri de diferenţiere ai OLN-93 a

fost analizată cantitativ prin utilizarea tehnicii RT-PCR. ARN-ul din celulele însămânţate a fost

extras utilizând ARN Minikit. ADNc a fost sintetizat din ARN prin utilizarea unui kit de revers

transcriere. Pentru PCR s-a utilizat sistemul Quantitec Sybr Green RT-PCR. Primeri specifici

pentru genele markerilor: NG2, CNP, MOG şi MAG au fost utilizaţi. Nivelele transcripturilor au

fost normalizate la actina prin utilizarea metodei Ct şi apoi la cele obţinute pentru PET.

Materialele plastice selectate (nylon 6.6, PMMA-polimetilmetacrilat, PET-polietilentereftalat) au

fost mai întâi testate sub aspectul biocompatibilităţii lor prin utilizarea liniei celulare de

fibroblaste de şoarece, L929. Două tehnici au fost utilizate pentru evidenţierea

biocompatibilităţii: testul standardizat de difuzie prin agar şi testul MTS de analiză a viabilităţii

celulare. Rezultatele sunt prezentate în tabelul 3 şi figura 43.

Tabel 3. Testarea biocompatibilităţii materialelor plastic: testul de difuzie prin agar şi testul MTS

de determinare a viabilității.

Material testat Tehnica Caracteristici

determinate

Rezultate

Obţinute

Verdict

PET MTS Viabilitate

celulară %

101.6 Non citotoxic

Difuzie prin

agar

Index de liză /

Index de zonă

0/1 Non citotoxic

Nylon 6,6 MTS Viabilitate

celulară %

94.4 Non citotoxic

Difuzie prin

agar

Index de liză /

Index de zonă

0/1 Non citotoxic

PMMA MTS Viabilitate

celulară %

100.7 Non citotoxic

Difuzie prin

agar

Index de liză /

Index de zonă

0/1 Non citotoxic

46

CN CP Nylon 6,6 PET PMMA

Figura 43. Morfologia celulelor L929 (observată la microscop) supuse contactului cu extractele

materialelor studiate şi controlul negativ şi pozitiv (CN-control negativ - mediu de cultură fară ser;

CP-control pozitiv - sol fenol 0.45%); Se observa celulele lizate în cazul controlului pozitiv în timp

ce în prezenţa CN şi a extractelor obţinute din material celulele au o morfologie normală.

Experimentele au evidenţiat lipsa citotoxicităţii materialelor: nylon 6.6, PET, PMMA.

Într-o primă fază se vor utiliza în studiu benzile de polietilentereftalat (PET) cu dimensiuni de

(1*5) cm şi grosime 0,165 mm. Studii anterioare au demonstrat de asemenea biocompatibilitatea

unei structuri tridimensionale a PET-ului (care mimează mai bine matricea extracelulară) fară a

fi nevoie de o depunere ulterioară a unor proteine de adeziune (Gustafsson Y et al., 2012).

Cinetica markerului enzimatic LAM –PRH la diferite concentraţii ale acestuia este prezentată în

figura 44. Se observă că începând cu concentraţia de 10 ng/ml se obţine o cinetică optimă, acesta

fiind motivul pentru care s-a ales această concentraţie pentru caracterizarea densităţii de

suprafaţă a lamininei.

0 5 10 15 20 25 30 350.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

Cinetica LAM-PRH la diferite concentratii

De

nsita

tea

op

tica

la

=

45

0 n

m

Timp (min)

1 ng/ml

10 ng/ml

5 ng/ml

Figura 44. Cinetica markerului enzimatic LAM-PRH la diferite concentraţii.

Utilizând procedura enzimatică descrisă anterior s-a putut calcula densitatea de suprafaţă a

lamininei legate covalent sau prin adsorbţie la suprafaţa PET prin folosirea curbei etalon aşa cum

se observă în figura 45.

47

0 20 40 60 80 1000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

PET cuplat prin adsorbtie cu LAM-PRH

OD450nm

=1,15

densitatea de suprafata calculata =82 ng/cm2

PET cuplat covalent cu LAM-PRH

OD450nm

=1,3

densitatea de suprafata calculata =93 ng/cm2

Densitate

a o

ptica la

= 4

50 n

m

Concentratia laminina-PRH (ng/ml)

Curba etalon -activitatea enzimatica a markerului enzimatic laminina-PRH

la 15 min, substrat enzimatic tetrametilbenzidina (TMB) si H2O

2

Figura 45. Evaluarea densităţii de suprafaţă a markerului LAM-PRH cuplat la PET

(polietilentereftalat) cuplat covalent sau adsorbţie fizica

Densitatea de suprafaţă calculată în cazul foliilor PET activate covalent a fost de 93 ng/cm2 iar în

cazul celor cuplate prin adsorbţie fizică a fost de 82 ng/cm2. Se pare că datorită capacităţii mari

de adeziune a lamininei, cuplarea covalentă în condiţiile experimentale date este aproximativ

egală cu cuplarea prin adsorbţie fizică în cazul formării unui strat monomolecular. În continuare

s-a urmărit realizarea unu sistem miniatural de citometrie folosind suprafețe funcționalizate cu

bioconjugate - în particular cu anticorpi pentru caracterizarea cantitativă a populației limfocitare

în probe de sânge uman. Anticorpii anti CD3, anti CD4 și anti CD8 au fost utilizați pentru

captarea și caracterizarea atașării selective a limfocitelor T din sângele uman.

Leucocitele sunt participanți esențiali în imunoprotecția împotriva patogenilor. Variații ale

numărului unor tipuri specifice de leucocite sunt folosite curent ca indicatori ai unor infecții,

afecțiuni maligne sau boli autoimune [MI Turgeon, Clinical Hematology 3rd ed, Lippincot

Williams &Willkins 1999]. Citometria în flux este folosită în mod obișnuit ca metodă standard

de numărare diferențiată a tipurilor de limfocite T [Storie et al.,Cytometry B 57B (2004) 47-52].

Imobilizarea și caracterizarea celulelor T fixate pe diverse tipuri de suprafețe a fost abordată din

cel puțin 2 motive: avantajul legat de posibilitatea de a lucra pe un număr mic de celule și acela

de a urmări simultan proprietăți morfologice și funcționale. Construirea unor micro-array de

anticorpi pentru captarea leucocitelor prin antigenii lor de suprafață a fost abordată de câteva

grupuri de cercetare [Sekine et al., J.Immunol. Methods 313 (2006) 96-109; Zho et al., Analytica

Chemica Acta 608 (2008) 186-196; Belov et al., British J. Of Haematology 135 (2006) 184-197;

Khvastunova et al., Scientific Reports 5:12573 (2015)].

Studiul nostru aduce ca noutate realizarea unui sistem miniatural de citometru construit pe o

suprafață flexibilă (dar robust) și rezistent în timp datorită legării covalente a anticorpilor de

suprafața fazei solide. S-a urmărit pe de o parte testarea aderenței subseturilor pure de celule T

din probe complexe de sânge uman sărăcit în eritrocite iar pe de altă parte s-a intenționat

determinarea cantitativă a proporției subseturilor CD3,CD4 și CD8 de leucocite în probele de

sânge investigate.

48

În acest studiu au fost folosite - leucocite din sânge integral uman. S-a recoltat sânge de la un

singur donator adult, sănătos, de gen feminin. Experimentele s-au efectuat în mare parte pe

suspensii leucocitare obținute prin sărăcirea în eritrocite a sângelui integral. Procedura a

presupus spargerea eritrocitelor ca urmare a unui tratament cu o soluție de liză (NH4Cl 8.02 g,

NaHCO3 0.84 g, EDTA (disodium) 0.37 g în 1000 mL apă Millipore). Sângele recoltat pe

heparină se amestecă cu soluția de liză în raport 1:15.Timp de 10 min se amestecă soluția la

temperatura camerei până se obține un lichid roșu deschis. Celulele albe rămase intacte se spală

de 2 ori cu PBS prin centrifugare 10 min la 250xg la 4 oC. În final se aduce suspensia de celule

la volumul de sânge folosit inițial. Concentrația de leucocite în suspensiile finale a variat în jur

de 15000 celule/5 μL. Anticorpii utilizați pentru a obține legarea specifică a unor subpopulații

leucocitare sunt anti CD3, anti CD4 și anti CD8 (eBioscience). S-a lucrat la două concentrații:

2μg/mL și 200 ng/mL. Ca și control negativ s-a folosit imunoglobulina IgG la aceleași 2

concentrații ca și anticorpii: 2 μg/mL și 200 ng/mL. PLL (poli-L-lisină) la o concentrație de 40

μg/μL a fost folosită ca și control pozitiv. Pentru observarea, în microscopie de fluorescent, a

celulelor legate s-au folositi anticorpi marcați fluorescent (obtinuți de la eBioscience); antiCD8-

PE și antiCD4-FITC utilizați la o concentrație de 5 μg/mL. Activarea fazei solide - folii PET

pornind de la selecția de materiale efectuată și raportată în fazele anterioare ale acestui proiect. În

prima etapă foliile de polietilentereftalat (PET), transparent, grosime 0,25 mm, dimensiune 7,5

cm x 1,2 cm producător Goodfellow Cambridge Limited, UK, au fost tratate timp de 20 ore în

HCl 10 %, apoi scoase, spălate cu apă deionizată și uscate. În cea de a doua etapă, foliile având

grupări carboxi formate la suprafață în urma atacului chimic acid ce au fost activate cu o soluție

de N-hidroxisuccinimidă (50 mg), 100 mg N-ciclohexil-N’-(2-morfolinoetil)-carbodiimida-

metil-p-toluolsulfonat (CDI) și 100 mL dimetilformamidă pentru 20 ore, apoi scoase, și uscate și

păstrate la 4° C în vederea cuplării cu anticorpi. În cea de a treia etapă, un volum de 5 μL soluție

de anticorpi de concentrație 2 μg/mL și 200 ng/mL a fost depus pe suprafața activată în vederea

reacției dintre grupările amino libere ale proteinei (anticorp) și grupările carboxi activate, iar

foliile au fost depuse în cutii tip Petri. Reacția de cuplare s-a desfășurat timp de 24 ore la 4° C în

atmosferă saturată în vapori de apă. În final, foliile au fost spălate cu apă deionizată și au fost

folosite în reacțiile cu componentele leucocitare. După reacția de cuplare covalentă a anticorpilor

la suprafața PET-ului s-a încercat o blocare a grupărilor carboxi rămase activate pe suprafața

foliei. În acest scop, s-au făcut tratamente cu glicină (5 mg/mL, suprafața rămânând încărcată

negativ – COO-), cu etanol amină (5 mg/mL, suprafața rămânând neutră) sau cu polilizină (5

mg/mL, suprafața rămânând încărcată pozitiv NH3+); reacțiile s-au desfășurat timp de 6 ore. S-a

comparat aderarea leucocitelor la toate aceste suprafețe. În final, s-a renunțat la orice tratament

suplimentar, ulterior reacției de cuplare covalentă a anticorpilor pe suprafață. Rezultatele au fost

obținute prin numărarea celulelor legate pe spoturile realizate pe PET-ul activat. Imaginile au

fost obținute atât în transmisie (pentru verificare legării și determinarea numărului de celulele

legate), cât și prin microscopie de fluorescență (pentru verificarea purității celulelor legate pe

fiecare spot). În cazul microscopiei de fluorescență s-au folosit anticorpii antiCD8-PE (λex=488-

561 nm; λem>578 nm) și antiCD4-FITC (λex=488nm; λem>518 nm). Celulele au fost examinate

49

cu un microscop de fluorescență Olympus BX-51 utilizând obiective cu măririle de 20x și 40x și

echipat cu următorul cub de filtre: filtru de excitare - 480/40, filtru dicroic - 505LP și filtrul de

emisie - 535/50.

Pe foliile de PET activate, tăiate la dimensiunea 7,5 cm x 1,2 cm s-au realizat 5 zone de legare a

leucocitelor prin depunere manuală a câte 5 μL de anticorpi. Legarea anticorpilor la 20

suprafață a fost evidențiată prin observarea la microscopul de fluorescență a lamelor PET

activate pe care s-au depus anticorpi marcați fluorescent (AntiCD8-PEsiAntiCD4-FITC). S-a

observat astfel că spoturile depuse manual sunt reproductibile dimensional (diametru

aproximativ 1.5 mm), că stabilitatea lor se extinde pe un interval de minim 2 săptămâni și că sunt

rezistente la spălări multiple (Figura 46)

Figura 46. Imagini de fluorescență ale spoturilor de anticorpi legați pe suprafețele PET activate:

stânga - antiCD8-PE și dreapta - antiCD4-FITC

Suspensia de leucocite reconstituită la densitatea celulară din sânge și resuspendată în final în

PBS este depusă pe spoturile de anticorpi și apoi incubată o perioadă de timp pentru a permite

atașarea celulelor la anticorpii specifici sau nespecifici.

Au fost testate diferite condiții experimentale: volum probă, densitate celulară, timp de incubare,

temperatura de incubare. Au fost selecționate drept optime condițiile: 5 μL suspensie

reconstituită/ spot, incubare 20 min la 4oC. Măsurătorile au fost realizate de două persoane care

au repetat în aceleași condiții experimentale (concentrație anticorpi depuși, număr de celule

depuse, viteza de spălare) de cel puțin 3 ori fiecare experiment.

Pentru a stabili concentrația optimă de lucru la anticorpii cuplați pe suprafață, s-au testat două

concentrații de anticorpi: 2 μg/mL și 200 ng/mL. Conform cu rezultatele obținute, după spălare,

numărul de celule legate a fost mai mare în cazul anticorpilor cu concentrațiile de 2 μg/mL

(Tabel 4).

Testarea purității populației de celule legate la fiecare spot de anticorpi și evaluarea

proporției de celule antiCD4 și antiCD8 din totalul de celule anti CD3.

Pentru a determina puritatea populației de celule legate pe fiecare spot, acestea au fost marcate

cu anticorpii antiCD8-PE si antiCD4-FITC. Spoturile antiCD4 și antiCD8 au fost evaluate pentru

50

a vedea dacă pe ele s-au legat și celule din cealaltă populație de celule. Astfel, cum se poate

observa și în Figura 18, pe suprafața cu antiCD4 sunt legate și câteva celule CD8.

În medie puritatea populației de celule a fost 90% pentru CD4 și 80% pentru CD8.

Figura 47. Limfocite legate pe PET cu antiCD4 și marcate cu antiCD8-PE și antiCD4-FITC. Cu

săgeți sunt evidențiate limfocitele marcate cu antiCD8-PE (legare nespecifică)

Pentru evaluarea populațiilor de celule, s-au realizat fotografii (Figura 48) pentru toate condițiile

experimentale și apoi s-au numărat celulele legate pe minim 20 câmpuri vizuale. S-a făcut apoi o

extrapolare astfel încât în tabelul 4 este trecut numărul total de celule găsit per spot.

Figura 48. Limfocite legate pe PET cu (A) antiCD3 (2 ng/μL), (B) antiCD4 (2 ng/μL),(C) antiCD8 (2

ng/μL) și (D) 40 μg/μL PLL

Tabelul 4

Conditii experimentale Nr. celule legate

CD3 CD4 CD8

Suspensie

Leucocite

15000 cel/5μL

390

μL/min

200 ng/mL 2016 ± 310 1290 ± 261 725 ± 180

2μg/mL 5104 ± 675 2378 ± 300 1055 ± 227

260

μL/min

2μg/mL 5705 ± 261 3617 ± 137 1602 ± 57

51

Sange - 5μL

390

μL/min

2μg/mL

2972 ± 352 1943 ± 300 957 ± 292

260

μL/min

3958 ± 879 2813 ± 492 1073 ± 334

S-au făcut și câteva experimente pornind de la probe de sânge integral. În această situație s-au

obținut imagini care prezintă numeroase aglomerări eritrocitare și leucocitare, ceea ce are drept

consecință imposibilitatea numărării limfocitelor apărând erori considerabile (Tabel 4).

Pentru condițiile selecționate drept optime s-a obținut un raport CD4/CD8 de aprox. 2.6, ceea ce

este plauzibil pentru aceste populații de limfocite. Erorile sunt însă mari, ceea ce nu permite

deocamdată utilizarea sistemului pentru caracterizarea unor probe diferite de sânge individual

Conditiiexperimentale CD4/CD8 CD4/CD3 CD8/CD3

Suspensie

Leucocite

15000

cel/5μL

Flux

spalare

260

μL/min

Conc

Anticorp

i

2µg/mL

2.61 ± 1.58

0.77 ± 0.58

0.30 ± 0.09

Pentru o caracterizare calitativă a depunerilor de laminină pe PET s-au efectuat investigaţii de

imagistică utilizând tehnica microscopiei de forţă atomică (Atomic Force Microscopy, AFM).

Probe de PET şi PET depuse cu laminină 2ng/mL au fost examinate prin AFM. Imaginile au fost

obţinute cu un instrument tip XE-100 (Park Systems, South Korea). S-a scanat o arie de 1 µm2,

în modul non-contact utilizând un cantilever din silicon (PPP NCHR, Nanosensors, Switzerland).

Rezultatele sunt prezentate în figurile 49 şi 51.

În figura 49 se pot vedea două imagini ale suprafeţei probei de PET.

52

Figura 49. Imagini ale suprafeţei de PET

Se observă atât din imaginile tridimensionale (mijloc) cât şi din cele plane (dreapta) ca suprafaţa

probei de PET nu este cu adevărat plană (într-un domeniu de dimensiuni ale înălţimii

neregularităţilor de ordinul nanometrului). Înălţimea neregularităţilor observate este de ordinul 6-

10 nm. De altfel, acest lucru este observabil (într-o manieră calitativă) şi în imaginea optică

(stânga). Prezenţa acestor neregulatăţi reprezintă un impediment pentru o bună evaluare

cantitativă a depunerii de laminină luând în considerare dimensiunile moleculei de laminină

(aprox 100 nm lungime şi 8 nm grosime). În figura 50 este prezentată structura moleculei de

laminină însoţită de imagini de microscopie electronică.

Figura 50. Structura moleculei de laminină. Imagini de microscopie electronică

În figura 51 sunt prezentate imagini ale unor suprafeţe de probe de PET cu depunere de laminină.

53

Figura 51. Imagini ale unor suprafeţe PET cu depuneri de laminină.

Din punct de vedere calitativ se observă că peste neregularităţile suprafeţei de PET apare o

granulaţie de dimensiuni mici. O încercare de analiză cantitativă a profilului pe înălţime

sugerează o înălţime de ordinul 3-4 nm pentru această granulaţie ceea ce nu se potriveşte cu

54

grosimea moleculelor de laminină (8 nm). Pe de altă parte, prezenţa neregularităţilor suprafeţei

suportului (PET) îngreunează analiza cantitativă, posibilitatea apariţiei de rezultate artefactuale

fiind mult crescută.

Un rezultat important obţinut în această etapă este densitatea superficială mare obţinută prin

legarea covalentă a lamininei. Pentru comparaţie, în figura 52 este prezentată imaginea AFM

obţinuta de Hernandez şi colaboratorii (Hernandez JCR et al, 2007) care au folosit pentru

depunere o soluţie de laminină de 2 µg/mL (de 1000 de ori mai mare decât cea folosită de noi)

însă legarea lamininei de substrat (copolimer de etilacrilat şi hidroxietilacrilat) s-a realizat prin

adsorbţie simplă. Se observă că metoda legării covalente propusă de noi în acest studiu asigură o

capacitate mult mai bună de acoperire a suprafeţei suportului polimeric.

Figura 52. Imagine AFM obţinută de Hernandez et al. (2007).

Acest rezultat (densitatea superficială de aprox. 1000 molecule/µm2) este comparabil cu cel

obţinut din analiza făcută pe baza markerului enzimatic. Într-adevăr, 92 ng/cm2 (valoarea

determinată prin marcarea enzimatică a lamininei), considerând masa molară a complexului

proteic de laminină (aprox 800000 d) reprezintă aprox. 700 molecule/µm2. Ţinând cont de erorile

introduse de prelucrarea de imagine putem spune că avem o concordanţă rezonabilă a celor două

metode total independente.

Aşa cum am specificat şi la materiale şi metode, spectrele de absorbţie IR au fost înregistrate cu

un spectrometru IR TENSOR II (Bruker, Billerica, MA, USA) echipat cu un modul ATR

(attentuated total reflectance). Probele au fost scanate de 16 ori şi mediate pentru a obţine

spectrul final. Datele prezentate sprijină studiile anterioare în sensul că se respectă o

proporţionalitate a modificării absorbţiei la lungimea de undă cu concentraţia de laminina la

valori ale concentraţiei mai mari de 10 µg/ml.

55

1600 1400 1200 1000 800

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

14

59

.98

cm

-1

15

50

.64

cm

-1

Ab

so

rba

nta

/ cm

-1

1 mg/mL Laminina

100 g/mL Laminina

10 g/mL Laminina

1 g/mL Laminina

PET

16

27

.78

cm

-1

Figura 53. Spectrele IR ale PET-ului la diferite concentraţii de laminină (1, 10, 100, 1000 µg/mL)

depuse pe PET

Limfocite izolate din sângele periferic uman precum şi fibroblaste de şoarece din linia L929

suspendate în mediu de cultură au fost depuse pe PET netratat şi tratat cu laminină pentru a testa

aderenţa acestora la suprafeţele biofuncţionalizate. Aderenţa celulelor la suprafeţe a fost

examinată după diferite intervale de timp de incubare a celulelor şi anume: 2 h şi 24 h pentru

limfocite şi, respectiv 1 min, 5 min, 15 min şi 24 h pentru fibroblaste. Am utilizat limfocitele

datorită importanţei pe care o prezintă în cazul în care biomaterialul confecţionat se

intenţionează a fi utilizat ca implant, ele fiind primele care interacţionează cu acesta (Chang D.,

2009). Aşadar, comportamentul lor este vital pentru dezvoltarea de biomateriale noi sau alte

tehnologii terapeutice care utilizează materiale sintetice. Rezultatele obţinute sunt prezentate în

tabelul 5 şi Figurile 54 şi 55.

Tabel 5. Testarea aderenţei celulelor la suprafaţa biofuncţionalizată din PET cu laminină:

Densitatea celulară (celule/cm2 )

PBMC L929

2 h 24 h 1 min 5 min 15 min 15 min +

24 h

PET 11700 11730 850 2839 2839 6120

PET cu

laminina

44.200 40400 2040 8500 11339 16320

Densitatea limfocitelor aderente este de aproximativ 3 ori mai mare pe suprafaţa funcţionalizată

faţă de cea ne-funcţionalizată (Tabelul 5 şi Figura 54). În cazul fibroblastelor, densitatea

celulelor aderente este semnificativ mai mare încă din primele minute de incubare: de 2.5 ori mai

mare după 1 min şi 5 min şi de 3 ori mai mare după 15 min şi 24 de h (Tabelul 5 şi Figura 55).

56

Figura 54. Limfocite aderente pe PET şi PET cu laminină.

24 h – pe PET-laminina (stânga) şi pe PET (dreapta) (marcate cu AO şi Eth-1)

Figura 55. Aderenţa fibroblastelor L929 pe PET şi PET cu laminină L929.

24 h- pe PET (stânga) şi pe PET-laminina (dreapta)

OLN-93 reprezintă o linie celulară folosită în numeroase studii ca model al oligodendrocitelor,

celule ce formează teaca de mielină în sistemul nervos central. Procesul de mielinizare este unul

complex, ce implică trecerea oligodendrocitelor prin stadii succesive de diferenţiere pornind de

la celule precursoare, cu o morfologie simplă, bipolară, până la cel de celule mature, puternic

ramificate, ce pot mieliniza până la 50 de axoni diferiţi (Miller, 2002).

Bazându-ne pe studii anterioare privind rolul componentelor serului în reglarea proliferării,

respectiv diferenţierii celulare, am testat capacitatea de diferenţiere a celulelor OLN-93

cultivându-le timp de 7 zile în mediu cu o concentraţie redusă de ser (DMEM, 1% FBS) pe

suprafeţe de PET funcţionalizate prin cuplare cu laminină prin comparaţie cu suprafeţe de PET

netratate sau acoperite cu şi poli-D-lizina (PLL) şi mediu extracelular (ECM).

Pentru a caracteriza stadiul de diferenţiere al celulelor pe substraturile funcţionalizate am

efectuat o analiză morfologică şi una biochimică a acestora. În cadrul analizei morfologice am

folosit criterii precum gradul de ramificare, aria corpului celular respectiv lungimea prelungirilor

emise. Studiile biochimice au constat în evidenţierea expresiei unor markeri specifici stadiilor

succesive de diferenţiere a oligodendrocitelor (NG2, CNP, MAG şi MOG).

57

Într-o primă etapă în cadrul analizei morfologice, au fost descrise trei categorii celulare (figura

56), pornind de la celule bipolare, alungite asemănătoare precursorilor oligodendrocitelor

(categoria 1), până la unele arborizate formând o reţea în jurul corpului celular asemănătoare, fie

pre-oligodendrocitelor fie OLG imature sau chiar mature (multipolare), precum şi o categorie

distinctă ce constă în celule de tip amoeboid care au corpul foarte extins cu prelungiri scurte sau

chiar absente (intinse, plate).

Figura 56. Imagini reprezentative pentru categoriile de celule descrise, conform morfologiei: 1.

Bipolară; 2. Multipolară; 3. Plată, fară procese. Imagini de microscopie de fluorescenţă obţinute în

urma marcării cu faloidin-FITC. Coloraţie verde: fibre F-actina.

O analiză a distribuţiei celulelor în categoriile descrise anterior, specifică fiecarei

variante de creştere oferă informaţii asupra capacităţii suprafeţelor utilizate de a permite

diferenţierea morfologică a celulelor OLN-93.

În urma analizei culturilor după 7 zile de creştere pe diferitele suprafeţe utilizate, influenţa

substratului asupra diferenţierii este vizibilă. Se observă că proporţia cea mai mare de celule

multipolare se află pe PET tratat cu laminină, suprafaţă care va fi utilizată în studiile viitoare

pentru culturile primare de neuroni în vederea ghidării creşterii neuronale.

În figurile 57 și 58 sunt prezentate lungimea medie a prelungirilor şi respectiv aria medie a

corpului celular în condiţiile de creştere analizate.

Figura 57. Lungimea medie a prelungirilor funcţie de tipul de suprafaţă de creştere.

58

Figura 58. Aria medie a corpului celular în condiţiile de creştere analizate.

Măsurătorile s-au realizat pe imagini de microscopie de fluorescenţă obţinute în urma marcării

cu faloidin-FITC, fiind astfel evidenţiate fibrele de actină. În ceea ce priveşte lungimea medie a

proceselor nu se observă modificări semnificative induse de suprafeţele utilizate pentru

diferenţierea celulelor cu excepţia PET-ului tratat cu ECM care pare să inducă o creştere vizibilă

a lungimii prelungirilor faţă de restul materialelor de creştere utilizate. În figura 58 se pot

observa modificări semnificative ale ariei medii celulare pe cele 4 tipuri de suprafeţe de creştere:

pe PET-urile pe care s-au depus PLL şi ECM s-au obţinut celel mai mari valori ale ariei probabil

şi datorită faptului că pe aceste suprafeţe au fost regăsite cele mai multe celule plate; pe PET-ul

pe care s-a cuplat laminina s-a obţinut cea mai mică arie medie a celulelor în ciuda faptului că în

acest caz regăsim cele mai multe celule multipolare însă este adevărat că în acelaşi timp numărul

celulelor plate este cel mai mic.

Caracterizarea biochimică a celulelor OLN-93 a constat în analiza expresiei unor markeri

specifici anumitor stadii de diferenţiere ale oligodendrocitelor (NG2, CNP, MAG, MOG) prin

analiza expresiei genice a acestora prin metoda RT-PCR. Markerii moleculari urmăriţi sunt

corelaţi cu stadiile evolutive ale oligodendrocitelor, după cum urmează: NG2 este un condroitin-

sulfat proteoglican transmembranar prezent din stadiul de celule precursoare ale

oligodendrocitelor până la cel de preoligodendrocite când expresia sa este oprită; CNP este

primul marker al mielinei, fiind o peptidă exprimată de la începutul stadiului de oligodendrocite

imature, până la finalul diferenţierii; MAG reprezintă o glicoproteină ce apare odată cu stadiul de

oligodendrocite mature; MOG este glicoproteină ce defineşte atingerea stadiului final al

diferenţierii.

O primă observaţie este că gena MOG nu se exprimă pe niciuna dintre suprafeţele de creştere

testate. Se remarcă o expresie crescută a genelor NG2 (prezentă înainte ca celulele să atingă

stadiul de oligodendrocite) şi CNP (primul marker al mielinei), la celulele crescute pe PET

funcţionalizate prin cuplare cu laminină. Expresia acestor gene e mult scăzută pe PET-ul tratat cu

PLL şi ECM prin raportare la expresia acestora pe PET

59

În privinţa expresiei genei MAG (exprimată în OLG mature), se observă o creştere semnificativă

a acesteia pe PET-ul tratat cu PLL. Gena apare exprimată şi în celulele crescute pe PET-ul cuplat

cu laminina dar mai puţin prin comparaţie cu PET-ul netratat, în cazul suprafeţei PET tratat cu

ECM fiind absentă.

Rezultatele obţinute sugerează că suprafaţa PET funcţionalizată prin cuplarea covalentă a

lamininei permite ataşarea şi diferenţierea celulelor ceea ce sugerează citocompatibilitatea

acestui biomaterial. În urma studiului efectuat am realizat un biomaterial compus din PET care a

fost activat într-o maniera care să permită cuplarea covalentă a lamininei la suprafaţă acestuia.

Biomaterialul obţinut s-a dovedit a fi citocompatibil permiţând aderarea celulelor de tipul

fibroblastelor şi limfocitelor umane precum şi diferenţierea celulelor OLN-93. Acest biomaterial

este util în ghidarea creşterii neuronale. Apoi s-a realizat unele suprafețe funcționalizate pentru

creșterea ghidată a neuronilor in vitro și realizarea de rețele neuronale. De asemenea, s-a urmărit

caracterizarea funcțională a neuronilor și rețelelor neuronale prin imagistica rațiometrică de

calciu.

Pentrua a realiza funcționalizarea suprafeței în vederea obținerii atașării și creșterii ghidate a

neuronilor am folosit mai multe metode cea mai eficientă dovedindu-se a fi tehnica

microstampling.

Este o tehnică prin care se obțin modele complexe de depuneri moleculare la scală micrometrică.

Aceste microștampile au fost realizate din polydimethylsiloxane prin turnare într-o formă de

silicon realizată prin prelucrare laser. Avantajul principal este că odată obținut modelul se pot

face foarte multe replici fiind astfel o tehnică relativ ieftină de microstructurare. Aceste structuri

au fost realizate prin ștampilare manuală dar procesul poate fi automatizat. De asemenea, am

obținut și structuri simple sub formă de linii sau curbe.

Pentru evidențierea clară a urmelor lăsate de microștampilă am folosit albumina serică bovină

(BSA) marcată cu fluoresceină.

Figura 59. Imagine de fluorescență cu patern obținut prin metoda microstampling (obiectiv 10x)

60

Figura 60. Imagine de fluorescență cu modele de linii și curbe din BSA cu fluoresceină pe sticlă

(obiectiv 10x)

În cadrul experimentelor realizate am depus prin microștampilare polilizină (Sigma) 0.1mg/mL

și matrice extracelulară (ECM Gel- Sigma)

Figura 61. Patern de ECM realizat prin microștmpilare - contrast de fază (obiectiv 10X)

Obţinerea culturilor de neuroni din ganglionii rădăcinilor dorsale (DRG). Cultura primară

de neuroni din rădăcinile dorsale ale măduvei spinării. Ganglionii rădăcinilor dorsale sunt

grupuri de corpuri neuronale ale neuronilor senzoriali. DRG se dezvoltă în stadiul embrionar din

61

celulele crestei neuronale nu din tubul neural. Deci DRG pot fi priviţi ca materie cenuşie a

măduvei spinării aflată în afara cordonului neural.

În cadrul experimentelor s-au folosit culturi de neuroni extrași din DRG de la șoarece.

Experimentele pe șoarece s-au realizat în spiritul celor 3 r (replacement, reduction, refinament)

în sensul că încercările s-au optimizat pe linii celulare (neuroblastoma – SH-SY5Y). S-au utilizat

3 șoareci balb/c, masculi, sănătoși de la care s-au extras toți ganglionii rădăcinilor dorsale.

Eutanasierea șoarecilor s-a realizat cu dioxid de carbon conform legii 43/2014 privind protecţia

animalelor utilizate în scopuri ştiinţifice. Soluția tampon (IncMix) folosită pentru prepararea

diverselor amestecuri enzimatice necesare extracției neuronilor din DRG conţine: 155 mM NaCl,

1,5 mM K2HPO4, 5,6 mM HEPES, 4,8 mM NaHEPES, glucoză 5mM şi gentamicină 50mg/mL.

După îndepărtarea tuturor DRG s-a realizat un amestec de enzime: dispază 3mg/mL (din Bacilus

polimixa - Gibco, Invitrogen) și 0.6mg/mL colagenaza tip XI (din Clostridium histoliticum -

Sigma) în cantitatea adecvată de IncMix. Amestecul de enzime a fost apoi filtrat cu filtru de 0,22

μm și adăugat peste DRG și se incubează la 37ºC timp de o oră. După incubare se scoate DRG

din placa Petri în care acestea au fost incubate (folosind pipeta Pasteur și para) și se pune în tubul

Corning, cu cel mai mic volum posibil de amestec de enzime, se adugă DMEM/Ham’s F12,

10%FBS (Biochrom) până la 1 mL apoi se triturează de 20 de ori folosind pipeta Pasteur cu pară,

se adaugă DMEM/Ham’s F12 până la 5 ml și se centrifughează la 700 g, 10 minute. La sfârșitul

centrifugării se elimină supernatantul cât de mult posibil, apoi se adaugă DMEM/Ham’s F12 și

se resuspendă cu pipeta Pasteur. Se face o numărătoare a celulelor neuronale pentru a avea o

densitate corespunzătoare după care se diluează dacă este necesar. Pentru a stopa multiplicarea

celulelor gliale se adaugă 5 µM arabinosylcytosine (Sigma) din a doua zi de cultură (Jing Bi et

al. 2006).

Figura 62. Neuroni pe patern de ECM (linie) în prima zi de cultură – contrast de fază (obiectiv 10x)

Ionii de calciu generează semnale intracelulare care determină o mare varietate de funcții în toate

tipurile de celule ale organismului (Berridge et al., 2000), controlând contracția musculaturii

cardiace (Dulhunty, 2006) și de asemenea aspecte importante ale ciclului celular de la proliferare

la moartea celulară (Lu and Means, 1993 and Orrenius et al., 2003). În sistemul nervos ionii de

62

calciu își extind funcțiile datorită morfologiei complexe a neuronilor. În terminațiile presinaptice

influxul de calciu determină exocitoza veziculelor care conțin neurotransmițători (Neher and

Sakaba, 2008). Postsinaptic, o creștere tranzitorie a nivelului de calciu în terminațiile dentritice

este esențială pentru inducerea plasticității sinaptice (Zucker, 1999). În nucleu semnalele de

calciu reglează transcrierea genelor (Lyons and West, 2011). Foarte important este că

semnalizarea intracelulară prin intermediul calciului reglează procese care se întind pe o plajă

mare de timp, începând cu eliberarea de neurotransmițători (microsecunde) până la transcrierea

genelor (minute sau ore) (Berridge et al., 2003). Prin urmare, durata de timp, amplitudinea și

localizarea intracelulară sunt determinanți esențiali pentru funcționalitatea semnalelor de calciu.

Multe dintre funcțiile de bază ale celulei depind de echlibrul delicat și dinamic al ionilor (calciu,

magneziu), diferențe de potențial (încărcare electrică) și pH între mediul intra și extracelular.

Modificările acestora duc la modificarea comportamentului și funcțiilor celulare. De aceea

măsurarea dinamicii concentrației ionice, potențialului transmembranar și pH-ului în timp real

sunt de mare importanță pentru neuroștiințe, biologie și fiziologie celulară. În cele mai multe

cazuri estimarea exactă a concentrației ionice în diferite regiuni celulare sau ale unei rețele

celulare este dificilă pentru microscopia de fluorescență convențională. Aceasta se datorează

faptului că aceste metode nu țin cont de diferențele în morfologia celulară în anumite părți ale

celulei sau ale unei rețele celulare care pot influența calitatea și cantitatea luminii emise ceea ce

poate duce la erori substanțiale atunci când este vorba despre modificări dinamice în concentrația

ionică, voltaj sau pH. Tehnicile de imagistică rațiometrică depășesc aceste probleme prin

observarea modificărilor la două lungimi de undă de emisie sau excitare, sau prin compararea

intensității de emisie a unei combinații de fluorofori în loc de măsurarea modificărilor de

intensitate.

Metoda rațiometrică este o metodă reproductibilă în măsurarea absolută a modificărilor ionice,

ținând cont și de diametrul celular, concentrația de fluorofor și proprietățile optice ale

aranjamentului experimental.

În cazul fluoroforului folosit, fura-2 (5-Oxazolecarboxylic acid, 2- (6- (bis (2- ((acetyloxy)

methoxy) -2 - oxoethyl) amino)- 5- (2- (2- (bis (2- ((acetyloxy) methoxy) -2 - oxoethyl) amino) –

5 - methylphenoxy) ethoxy) -2 -benzofuranyl) - ,(acetyloxy) methyl ester 108964-32-5 (Life

Technologies) excitația se face la 340 și 380nm și înregistrarea emisiei la 510 nm. Deci,

intensitatea emisiei este măsurată de două ori și este calculat un raport.

R= I340/I380

R-raportul intensității fluorescenței citită la 510 nm

I340-intensitatea fluorescenței când proba este excitată la 340 nm

I380-intensitatea fluorescenței când proba este excitată la 38 0nm

Fiecare pixel măsurat pentru cele două valori (I340 și I380) poate fi cuantificat prin formula:

I=cxdxKx[f(x)]

I-intensitatea fluorescenței

c-concentrația fluoroforului

63

d-diametrul probei

K-constanta optică a componentelor prin care trece lumina (celule, filtre, obiective)

f(x)-descrie comportamentul fluoroforului în cazul modificării concentrației ionice și pH-

ului

Pentru că se păstrează constante c,d și K pot fi eliminate ecuația devenind:

R= I340/I380=f(Ca2+

)

Acest raport este calculat automat de software-ul utilizat pentru înregistrarea imaginililor (în

cazul nostru Andor IQ) și expus în timp real sub formă de grafic. Aranjamentul experimental

cuprinde monocromator Polychrome V (TILL Photonics) microscop Olympus IX71, camera

CCD cu răcire Andor instalație de perfuzieVC3 8 Channel Focal Perfusion Systems (ALA

Scientific Instruments, Inc.) împreună cu micromanipulator (Narishige –Japan).

Am obținut patern-uri sub formă de linii și „steluțe” din ECM și polilizină. Polilizina a facilitat

aderarea neuronilor pe substrat, pe măsura dezvoltării prelungirilor acestea nu s-au menținut pe

suprafața funcționalizată. ECM a susținut dezvoltarea prelungirilor neuronale pe suprafața

funcționalizată. În cazul folosirii arabinosylcytosine, pe lângă inhibarea celulelor gliale a inhibat

puțin dezvoltarea prelungirilor neuronale, acest efect fiind mult diminuat pe structurile realizate

din ECM.

Figura 63. Imagini de fluorescență (colorare acridine orange) a zonei funcționalizate (obiectiv 10x

stânga, obiectiv 20x dreapta).

Figura 64. Neuroni înainte de imagistica rațiometrică de calciu (stânga transmisie,dreapta colorare

fura-2 AM excitație 380 nm).

64

Figura 65. Imagistica rațiometrică de calciu – înainte de stimulare, în timpul stimulării și în etapa

de revenire.

0 200 400 600

0.0

0.3

0.6

0.9

Ra

po

rt I3

40

/I38

0

Secunde

Neuroni

Celule gliale

Figura 66. Variația calciului intracelular în neuroni în timpul stimulării.

Neuronii/rețelele neuronale din culturile neuronale primare pot fi flosite ca biosenzori folosind

suprafețe funcționalizate prin crearea de pattern-uri moleculare cu ECM care să ajute la ghidarea

creșterii neuronilor. ECM, față de polilizină stimulează dezvoltarea prelungirilor nervoase. În

cazul structurilor în formă de „steluță” se observă mai greu organizarea conform patern-ului.

Substraturile care vor deservi construirii de senzori miniaturizați de înaltă senzitivitate și

specificitate pentru detecția de ioni se bazează pe filme subțiri de aur și siliciu pe substrat de

siliciu reconstruit 7×7. Cele două seturi de filme subțiri au fost obținute utilizând tehnica

modernă de depunere epitaxială cu fascicul molecular (MBE-Molecular Beam Epitaxy). Doi

parametrii experimentali au fost optimizați (temperatura substratului și rata de depunere) cu

scopul obținerii unor filme de aur de înaltă calitate și rezoluție, cu terase atomice întinse pe

suprafețe mari, potrivite pentru autoasamblarea de molecule.

Reconstrucția Si (111) 7 × 7 a fost obținută cu ajutorul unui tratament termic bine stabilit și

cunoscut. Confirmarea reconstrucției s-a făcut pe baza imaginilor de difracție de electroni de

energie înaltă (RHEED) (Figura 67) și de microscopie de scanare prin efect tunel (STM) (Figura

68). Imaginea STM reflectă distribuția spațială a stărilor electronice ocupate de la suprafață.

Celula elementară (7 × 7) este arătată în Figura 64 (a) iar dimensiunea ei s-a găsit ca fiind de 2.7

× 2.7 nm, așa cum se regăseşte şi în literatura de specialitate. Profilul de linie din Figura 68 (c)

arată pozițiile și diferenţa de înălţime a șase tipuri distincte de atomi (numerotaţi de la 1 la 6)

evidențiați în Figurile 68 (a) și (b).

65

Figura 67. Imaginea RHEED pentru reconstrucția 7x7 a substratului de Si(111).

Figura 68. a) Imaginea STM a reconstrucției Si(111) 7×7inregistrată cu un potențial negativ aplicat

probei de -2V și un curent de tunelare de 0.3 nA; b)Celula elementară 7×7 și evidențierea tipurilor

de atomi; c)Profilul de linie extras de-a lungul liniei reprezentată în b).

Tabelele 6 și 7 cuprind parametrii experimentali folosiți pentru filmele de aur depuse.

Orientarea filmelor subțiri a fost studiată cu ajutorul

difracției de raze X, în geometria Bragg-Brentano (-

2și sunt prezentate în Figura 69. Se poate observa din

difractogramele XRD că filmele depuse la temperaturi

mai scăzute decât 580 oC și cu rate de depunere diferite

de 1.6 nm/min conțin maxime corespunzătoare indicilor

Miller (111), (200), (220) și (311), indicând faptul că

aceste filme nu sunt depuse numai după direcția (111) a

substratului de Si. Filmele 3 și 7 depuse la o temperatură

a substratului de 580 oC și cu o rată de depunere de 1.6

(a)

(b)

Figura 69. Difractogramele filmelor

subțiri de Au/Si(111) obţinute la (a)

temperaturi diferite ale substratului și la

(b) rate diferite de depunere.

Tabel 6

Parametrii de depunere pentru filmele de Au

obținute la temperaturi diferite ale substratului

Film

depus

Temperatura

substratului (ºC)

Rata de depunere

(nm/min)

1 480

1.6 2 530

3 580

4 630

Tabel 7

Parametrii de depunere pentru filmele de Au

obținute la rate diferite de depunere

Film

depus

Temperatura

substratului (ºC)

Rata de

depunere

(nm/min)

5

580

0.15

6 0.8

7 1.6

8 4.3

66

nm/min prezintă un singur maxim de difracție corespunzător planului cu indicii Miller (111).

Toate celelalte maxime de difracție ale aurului nu sunt prezente în difractograma filmului subțire.

Lipsa lor sugerează în mod clar orientarea preferențială a cristalitelor filmului după planele (111)

pe substrat [8]. Pe baza imaginilor STM s-a determinat modul de creștere a filmelor, morfologia

suprafețelor, dar și rugozitatea lor, aceasta din urmă rezultând prin calculul RMS (root mean

square).

Pentru ca topografia suprafețelor filmelor obținute să fie sub formă de terase atomice, o condiție

absolut necesară este ca RMS-ul să aibă valoarea de sub 1 nm.

Filmele depuse de către noi prezintă o creștere 2D, arătată în Figurile 70 și 71. Filmul 1 prezintă

numeroase terase incomplete și discontinuități. Înălțimea maximă este de ∼150 nm. Granulele de

Au par să se unească, în încercarea de a forma o suprafață continuă, dar energia furnizată de

substrat pe durata depunerii și a procesului de tratament termic de după depunere, este

insuficientă. În cazul filmului 2, înălțimea maximă este de ∼4 nm, iar suprafața sa este formată

din terase întinse, separate de pași monoatomici. O observație interesantă în cazul topografiei

acestui film este prezența unei insule de Au, fapt care ne duce cu gândul la existența centrilor de

nucleație.

Film 5 Film 6 Film 7 Film 8

Figura 71. Imagini 3D reprezentative de STM pentru filmele de Au/Si(111) la rate de depunere de

(a) 0.15 nm/min; (b) 0.8 nm/min; (c) 1.6 nm/min; (d) 4.3 nm/min.

Film 1 Film 2 Film 3 Film 4

Figura 70. Imagini 3D STM (1.2 μm × 1.2 μm) a filmelor de Au depuse la diferite temperaturi ale

substratului. Imaginile STM au fostobținute la o diferență de potențial de 1.6V și un curent de

tunelare de 0.3 nA.

67

De fapt, în general, creșterea filmelor metalice pe suprafețe nemetalice are loc în modul Volmer–

Weber în prima etapă, sub forma de insule 3D.

Acest mod de creștere este urmat de unirea insulelor și formarea de entități de dimensiuni mari.

După ce se realizează acoperirea completă a suprafeței substratului, creșterea filmului este una pe

direcție verticală (2D).

Temperatura de depunere de 580 oC pare destul de potrivită pentru formarea de terase atomice de

mică rugozitate cu pași atomici de 3 Å. Creșterea strat cu strat a acestui film este aratată în

Figura 66. În cele din urmă, înalțimea maximă a suprafeței în cazul filmului 4 ajunge la ∼10 nm,

cu o suprafață formată din terase plane separate de găuri mari, cu o adâncime de câteva zeci de

monostraturi atomice. Calitativ, filmul 3 este cel mai uniform dintre filmele depuse de noi, cu o

suprafață formată din straturi monoatomice și rugozitate de 0.32 nm. Toate filmele depuse cu

rate de depunere diferite au o orientare 2D, independent de rata de depunere folosită (Figura 71).

Grosimea filmelor este direct proporțională cu rata de depunere. Filmul 5 obținut cu cea mai

mică rată de depunere are terase atomice incomplete și doar câteva monostraturi de Au, pe când

filmul 8, depus cu cea mai mare rată de depunere prezintă multiple terase incomplete și tinde să

formeze pe suprafețe mari mari site-uri de nucleație. Filmul depus la 0.8 nm/min are cea mai

mare rugozitate,de 1.41 nm. Filmul obținut la rata de depunere de 1.6 nm/min are terase atomice

line, o înălțime maximă de 0.05 nm și un RMS de 0.02 nm.

În concluzie, filme de Au depuse prin tehnica MBE, de înaltă calitate, optime pentru utilizarea

lor drept substrat în fabricarea de senzori, se obțin la o temperatură a substratului de 580 ºC și o

rată optimă de depunere de 1.6 nm/min.

Bazându-ne pe experiența dobândită în depunerea de filme subțiri de aur, am obținut cu succes

suprafețe microstructurate de aur pe substrat de sticlă, folosind tehnica de fotolitografie. Aceste

suprafețe, sub forma de microelectrozi interdigitizați (μIDE) cu o înălțime de 100 nm și o lățime

de 300 μm vor deservi atașării selective a unor compuși nou sintetizați pe bază de macrocicluri și

peptide ciclice, cu scopul final de a fabrica biosenzori ionici, de înaltă calitate și senzitivitate.

Etapele procesului fotolitografic pentru realizarea

unor modele pe suprafața unei probe constau în:

curățarea și degresarea substratului; depunerea

materialului care urmează să fie folosit pentru

realizarea structurilor; depunerea stratului de

fotorezist pe întreaga suprafață a plachetei;

poziționarea fotomăștii și expunerea la radiația UV;

developarea fotorezistului; tratarea termică a

stratului de fotorezist rămas precum și corodarea

chimică a stratului de metal prin ferestrele făcute în

fotorezist; îndepărtarea stratului de fotorezist prin

spălarea cu solvenți organici.

(a) (b)

Figura 72. (a) Proiectarea măștii; (b)

Imaginea măștii realizată cu ajutorul

microscopului optic.

68

Stratul metalic a fost acoperit cu un

fotorezist pozitiv comercial (Positiv 20), iar

sandwich-ul sticlă/Au/Pozitiv 20, împreună

cu masca, a fost supus iradierii UV, cu

lumină la lungimea de undă de 395 nm,

compatibilă cu intervalul de expunere al

fotorezistului folosit. Desenul schematic al

măștii folosite pentru fabricarea μIDE este

prezentat in Figura 72 (a), iar rezoluția

laterală a măștii se poate observa în Figura 72 (b). Sistemul sandwich-mască a fost supus iradierii

UV timp de 10 minute, la o distanță de iradiere de ≈ 4 cm, pentru a obține o rezoluție laterală a

microelectrozilor comparabilă cu cea a măștii.Polimerul iradiat a fost developat în soluție de

NaOH 0.7% până când acesta a fost îndepărtat complet (Figura 73).

Stratul de Au neacoperit de fotorezist a fost îndepărtat chimic prin scufundarea sandwich-ului în

soluție de apă regală. Rezultatul este prezentat in Figura 74. Ultimul pas a reprezentat

îndepărtarea fotorezistului rămas în soluție de acetonă.

Caracterizarea structurală și morfologică a electrozilor s-a făcut pe baza măsurătorilor de raze X

și a imaginilor de microscopie de forță atomică (AFM). Difractograma obţinută prezintă un

singur maxim de difracţie corespunzător planului cu indicii Miller (111). Toate celelalte maxime

de difracţie ale Au nu sunt prezente în difractograma filmului subţire (Figura 75). Lipsa lor

sugerează în mod clar orientarea preferenţială a cristalitelor filmului cu planele (111) pe substrat.

Figura 715. Difractograma filmului de Au utilizat pentru fabricarea μIDE.

Măsurătorile AFM de topografie au permis obţinerea unor informaţii asupra „reliefului” probei

în ansamblu, a suprafeţei substratului pe care s-a efectuat depunerea şi a stratului de Au depus.

Figura 76 prezintă măsurătorile AFM realizate pe sistemul Au/sticlă, unde grosimea filmului

metalic a fost setată la valoarea de 100 nm. Dupa cum se poate observa din Figura 77 (a) si (b),

grosimea filmului depus se situeaza in jurul valorii de 110 nm.

Figura 73. Developarea

polimerului folosit în

procesul de fotolitografie.

Figura 74. Corodarea

chimică a metalului.

69

Analiza rugozităţii stratului de Au efectuată pentru aria specificată în Figura 77 (a) (16450

puncte de scan incluse) indică grosimi cuprinse în intervalul 102.2-161.5 nm, media înălţimilor

120.3 nm, rugozitatea medie Sa 7.3 nm, abaterea pătratică medie (RMS) Sq 9.4 nm. Asimetria

distribuţiei (skewness) Ssk 0.95 şi aplatizarea (kurtosis) curbei de distribuţie Ska 0.88 descriu

distribuţia datelor de înălţime aferente ariei decupate (Figura 77).

Următorul obiectiv a constat în optimizarea metodei de obţinere a nanostructurilor de siliciu

utilizând tehnica de MBE, cu aplicații în nanodetecție. Parametrul experimental găsit a fi optim

este temperatura substratului. Prin această activitate am urmărit obținerea de suprafete

nanostructurate de Si/Si(111) 7×7, în vederea posibilității de detecție a semnalelor de intensitate

scăzută, pentru realizarea de biosenzori sau dispozitive de tip lab-on-a-chip precum și în

tehnologia microarray-urilor. Structurile realizate experimental au fost caracterizate prin tehnici

de STM și AFM, pentru studierea proprietăților morfologice ale acestora.

Temperatura substratului a fost variată în intervalul -100 – 450 ºC, parametrii de depunere a

filmelor nanostructurate obținute fiind în Tabelul 8.

Tabelul 8. Valorile parametrilor relevanți pentru filme de Si depuse la diverse temperaturi ale

substratului.

Filmul

depus

Temperatura celulei

de efuzie

(oC)

Presiunea fluxului

de atomi

(10-8

mbar)

Temperatura

substratului (ºC)

1

1350 1.2

-100

2 24

3 450

Din imaginile STM (Figurile 78, 79) obținute pe filmul 1 depus la temperatura de -100 ºC a

substratului se observă o tendință de creștere unidimensională a filmului din cauza fasciculului

molecular omogen și a temperaturii scăzute a substratului, atomii neavând energia suplimentară

necesară migrării pe suprafață. Din imaginea STM de 1 μm × 1 μm (Figura 79) se observă că

filmul este crescut omogen cu o înălțime maximă de ≈ 2 nm.

Figura 76. Histograma corespunzătoare

ariei decupate din imaginea topografică a

suprafeţei de aur.

Figura 77. (a) Topografia AFM a unei limite a stratului de

aur depus sub formă de electrod pe substrat de sticlă. (b)

Profilul de-a lungul secţiunii S2 indicată în imaginea

topografică.

b a

70

Figura 78. Imaginea 2D obţinută prin STM de 8 μm ×

8 μm pentru filmul depus la temperatura de -100 0C.

Figura 79. Imaginea 3D obţinută prin STM de 1 μm

× 1 μm pentru filmul depus la temperatura de -100 0C.

Filmul depus la temperatura camerei prezintă un mod de creștere 2D cu coloane discontinue și

înălțimi neregulate (Figura 82), înălțimea maximă a acestora fiind de 10 nm.

Figura 80. Imaginea 2D obţinută prin STM de 8 μm × 8

μm pentru filmul depus la temperatura camerei.

Figura 81. Imaginea 3D obţinută prin STM de

500 nm × 500 nm pentru filmul depus la

temperatura camerei.

Figura 82. Distribuția înălțimii maxime a

nanostructurilor de Si observate experimental.

Figura 83. Distribuția perimetrului

nanostructurilor de Si observate experimental.

Din imaginile STM pe o suprafață de 500 nm × 500 nm se poate observa modul de creștere

colonar, imposibilitatea coalescenței acestora datorându-se energiei insuficiente primită în timpul

1086420

30

25

20

15

10

5

Maximum Height [nm]

Nu

mb

er o

f H

ills

0.40.350.30.250.20.150.10.050

250

200

150

100

50

Perimeter [µm]

Num

ber

of

Hil

ls

71

depunerii filmului. Dintr-un studiu statistic efectuat pe imaginea STM de 8 μm × 8 μm (Figura

80) rezultă faptul că înalțimea medie a suprafeței este in jur de 2-3 nm iar perimetrul grăunților

ce o alcătuiesc este de aproximativ 100 nm (Figura 83).

Filmul depus la temperatura substratului de 450 ºC prezintă nanostructuri de Si bine

definite și crescute în mare majoritate urmând terasele atomice ale substratului de Si(111) pe care

s-a făcut depunerea (Figura 80). Acest lucru se datorează energiei furnizate de substrat atomilor

de Si pe durata depunerii, crescându-le astfel mobilitatea pe suprafață.

Figura 84. Imaginea 2D obţinută prin STM de 8 μm

× 8 μm pentru filmul depus la temperatura de 450 ºC.

Figura 85. Imaginea 3D obţinută prin STM de 500

nm × 500 nm pentru filmul depus la temperatura de

450 ºC.

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100

18

27

36

he

igh

t (

m)

width (m)

Figura 86. Profilul topografic extras de-a lungul liniei

reprezentată în imaginea STM de 8 μm × 8 μm

Figura 87. Distribuția înălțimii maxime a

nanostructurilor de Si observate experimental.

Figura 88. Distribuția perimetrului nanostructurilor

de Si observate experimental.

2520151050

6

5

4

3

2

1

Maximum Height [nm]

Nu

mb

er o

f H

ills

350300250200150100500

10

8

6

4

2

Perimeter [nm]

Nu

mb

er o

f H

ills

72

Înălțimea medie a nanostructurilor obținute este de 15-20 nm (Figurile 86, 87) cu perimetrul

cuprins în intervalul 100-150 nm (Figura 88). Aceste date au fost obținute în urma măsurătorilor

STM pe o suprafață de 8 × 8 µm (Figura 84). Imaginile

au fost înregistrate cu un potenţial al probei de 2V şi un

curent de tunelare de 0.3 nA. Imaginea STM pe o

suprafață de 500 × 500 nm (Figura 85) colectată cu un

curent de tunelare de 0.33 nA și un potențial de 2 V

arată procesul de creștere a nanostructurilor de Si/Si

(111). Procesul de nucleație are loc la granița dintre

domenile substratului de Si(111) 7×7 urmat de

coalescența insulelor proaspăt formate urmărind fidel terasele atomice ale substratului.

Au fost determinate energetica unor molecule ciclice adsorbite pe suprafețe de Au(111)

respectiv SiO2 precum şi proprietăţile lor electronice şi structurale prin Teoria Funcţionalei de

Densitate (DFT) folosind codul SIESTA. S-au calculat în detaliu energiile de interacțiune și

geometriile de adsorpție pentru terminațiile macrociclurilor care acționează ca linkeri pentru

suprafețe (amintim aici benzenul, tiofenul și cisteina care pot interacționa prin sulf și piridina

care poate interacționa prin atomul de azot) (Figura 89). Se oferă o perspectivă teoretică a

efectului interacțiunii van der Waals asupra mecanismului de adsorbție a unei molecule test

(tiofen) pe suprafața de Au (111), dar și o comparație între rezultatele obținute prin mai multe

funcționale însoțită de o analiză a proprietăților geometrice, a energiilor de legare și a

transferului energetic între moleculă și suprafață.

Experimentele au arătat că benzenul interacționează slab cu suprafețe de metal nobil. Pe

suprafețe de tip (111) se adsoarbe într-un mod ordonat în formă de straturi de 3x3 unități.

Moleculele heteroaromatice, cum ar fi tiofenul sau piridina se adsorb diferențiat. În regim de

acoperire redus, moleculele heteroaromate adoptă o conformație plată, în timp ce la creșterea

ariei de acoperire, a fost observată o orientare înclinată sau verticală.

S-au testat trei functionale dedicate calculului interacțiunii van der Waals: VDW-DF2 a lui Lee

et al. (LMKLL); VDW-DF a lui Dion et al. (DRSLL) și KBM a lui Klimes et al. Electronii din

seturile de baze au fost înlocuiți cu pseudopotențiale. Pentru fiecare tip de funcțională, un set

specific de pseudopotențiale a fost generat și testat pornind de la parametrii pentru funcționala

GGA-PBE.

Pentru început s-au calculat parametrii relevanți de bulk pentru

suprafața de aur goală, utilizând cele 3 funcționale (Tabelul 9), în

intervalul de energie 300-400 meV. Valori mai mari ale energiei

decât cele prezentate în tabel conduc la restrângerea orbitalilor

atomici gama, care nu ar mai putea descrie în mod optim

interacțiunea de tip van der Waals. Pentru atomii organici am

testat valori ale energiei între 10 și 150 meV (Tabelele 10 și 11).

Figura 89. Macrociclurile

adsorb pe suprafețe prin

linkeri specifici. În imagine

este reprezentat schematic

un macrociclu adsorbit prin

tiofen.

Tabel 9 .Valorile parametrului de bulk

(în Å) pentru aur, calculați cu 3

funcționale diferite.

73

Tabel 10. Momente de dipol (în Debye) pentru

tiofen pentru cele trei funcționale ca funcție de shift

de energie utilizat pentru a defini orbitalii DZP în

SIESTA.

Tabel 11. Momente de dipol (în Debye) pentru

tiofen pentru cele trei funcționale ca funcție de shift

de energie utilizat pentru a defini orbitalii TZP în

SIESTA.

În Tabelul 12 am rezumat testele pentru moleculele libere și pentru aur în bulk.

Prin compararea momentelor de dipol obținute cu fiecare dintre cele trei funcționale observăm că

toate rezultatele sunt apropiate ca precizie de calcul. Pentru a optimiza procedura de calcul, am

folosit 3 modele a căror rezultate sunt sumarizate în Tabelul 11. În urma acestor teste, s-a impus

crearea celui de-al patrulea model schematizat în Figura 90.

Figura 90.Reprezentarea schematică a modelului final. Zona roșie indică regiunile în care se

petrece relaxarea geometrică cu scanarea mai multor seturi de bază . Zona albastră indică regiunile

în care parametrii geometrici și setul de baze sunt fixe.

În concluzie, prin fixarea atomilor de aur în pozițiile ideale într-o suprafață de Au(111) cu

parametrul de rețea de 4.08 Å obținem rezultate realiste. Se mai poate argumenta că prin

utilizarea de pseudo-orbitali atomici largi (PAO) cu raza scurtă de acțiune, se obțin valori

nerealiste ale energiilor de legare; cauza lor este efectul de BSSE mare, care face ca rezultatele

finale de fie discutabile.

În continuare, am studiat adsorbția tiofenului (T) pe Au (111), la o valoare a modificării energiei

de 15 meV. Am construit mai multe structuri prin translatarea moleculei paralel cu suprafața,

pentru a investiga efectul localizării pe suprafață asupra geometriei de adsorbție (Figura 91). Au

rezultat 25 locații pe suprafață pentru care am calculat energia totală. Doar cele cu energia cea

mai mică sunt caracterizate în continuare. Diferențele sunt de până la 0.22 Å (pentru DRSLL)

Tabel 12. Rezultatele testelor pentru cele 3 funcționale: momente de dipol P pentru tiofen, parametrul de

bulk și momentul de dipol al suprafeței de aur relaxată. Momentele de dipol sunt prezentate în Debye,

distanțele sunt date în Å și energiile de legare în eV.

74

indicând o orientare ușor înclinată a moleculei în raport cu suprafața. Pentru orientarea

perpendiculară a tiofenului, funcționala KBM favorizează o geometrie cu distanțe mici față de

suprafață (Tabel 13).

A fost calculată și energia de adsorbție (sau de legare) a complexului aur-moleculă precum și

energia de deformare elastică a moleculei adsorbite. S-a constatat că valorile energiei de

deformare elastică sunt mai mici de 0.01 eV pentru toate configurațiile investigate, valoare care

este aproape de precizia numerică a metodei DFT. Într-o primă aproximare, putem considera că

molecula nu este deformată prin adsorbția pe suprafață, în acord cu modelul fizisorbției slabe

(Tabelul 14).

Energia de legatură a tiofenului în configurație plană este cu aproximativ 0.1 eV mai joasă decât

cea în configurație perpendiculară, ceea ce indică faptul că la o rată mică de acoperire este

preferată configurația plană în vreme ce la o rată ridicată de acoperire este preferată configurația

perpendiculară. Cele mai bune rezultate au fost obținute prin utilizarea funcționalei LMKLL.

Pentru a calcula transferul de sarcină am folosit două metode. În primul model, am eliminat o

parte a sistemului (de exemplu, metalul sau atomii organici) și am calculat densitățile de sarcină

pe atomii ramași. În a doua metodă, am păstrat întregul sistem rezultat în urma relaxării

Tabel 13. Parametrii geometrici ai adsorbatelor

(distanțele minime și maxime față de suprafață (Dmin

și Dmax), variația maximă a unghiului asimetric. De

sus în jos, rezultatele LMKLL, DRSLL si KBM.

Figura 91. Reprezentarea grafică a

structurilor relaxate împreună cu

conturul transferului de energie între

moleculă și suprafată calculat la 0,0005

e/Bohr3.

Tabel 14. Energia de adsorpție pentru tiofen fară/cu corecția BSSE și suma populațiilor Hirschfeld.

Sunt raportate valorile pentru toate cele trei funcționale.

75

structurale, dar am setat ca atomi-fantomă atomii componenți pentru fiecare dintre cele două

părți ale sistemului (substratul de aur și moleculele). S-a estimat transferul de sarcină între

moleculă și suprafață prin integrarea densității electronice pe domeniile spațiale selectate, iar

valorile transferului de sarcină sunt prezentate în Tabelul 14 și sunt comparate cu valorile

populațiilor Hirschfeld pentru toți atomii din molecule. Se poate observa că rezultatele sunt

negative și apropiate de zero. Integrala densităților de sarcină este în acord calitativ cu

populațiile Hirschfel. Dacă folosim atomi-fantomă pentru a calcula densitatea de sarcină, există o

tendință clară de a obține valori mai mari. O investigație detaliată a transferului de sarcină pentru

regiunile selectate (Figura 92) este prezentată în Figura 93. Variațiile sunt relativ mari, indicând

faptul că pentru acest sistem suprapunerea seturilor de bază are cel mai important efect asupra

densității de sarcină.

Figura 92. Reprezentarea schematică a traseului pentru

calcularea transferului de sarcină între moleculă și

suprafață.

Figura 93. Reprezentarea schematică a

densităților de sarcină calculate cu LMKLL

pentru toate configurațiile investigate.Liniile

roșii - BSSE inclus. Linii negre punctate fără

BSSE.

Se observă o fluctuație relativ importantă în segmentul DE (molecula-suprafață) dar valorile sunt

neglijabile. Acest lucru este în concordanță cu concluzia anterioară, principalul efect al

suprapunerii setului de bază este de a produce variații ale densității electronice pe regiuni largi în

spațiu, mai degrabă decât de a produce schimbări importante în regiuni bine localizate.

În continuare s-au simulat doi macrociclii (Figura 94) pe suprafețe de Au și SiO2. Două forme

izomerice (molecula 1 – curbată și molecula 1* - planară) au fost testate. În urma comparării

stabilității energetice a moleculei în cele două stări în urma relaxării structurale (în vid) s-a

stabilit că nu există diferente energetice semnificative între cele două structuri.

76

Figura 94. Molecula 1 (stânga). Structura moleculară optimizată până la 0.04 eV/Ang; Molecula

1* (centru) relaxată în vid până la un gradient de 0.4 eV/Ang; Molecula 2 (dreapta). Structura

planară a moleculei relaxată în vid până la un gradient de 0.4 eV/Ang.

Construcția suprafeței de Au (Figura 95 (a)) s-a făcut ținându-se cont de dimensiunea celei mai

mari molecule astfel încât să nu existe interacțiune între mai multe molecule adsorbite pe

suprafață. În consecință suprafața include 12x12 atomi pe strat și două straturi (în total 288

atomi). Suprafața de SiO2 (Figura 95 (b)) a fost construită cu o dimensiune suficientă pentru a

evita interacțiunea între mai multe molecule adsorbite pe suprafață. Moleculele simulate pe

suprafețe sunt prezentate în Figura 56.

(a) (b)

Figura 95. (a) Suprafața de Au(111) cu dimensiunea de 12x12x2 atomi. (b) Suprafața de SiO2 cu

dimensiunea de 4x4x1 unități de bază.

(a) (b) (c)

Figura 96. (a) Molecula 1 pe Au(111); (b) Molecula 1* pe Au(111); (c) Molecula 2* pe Au(111).

77

Tabelul 15 sumarizează valorile energiei de adsorbție moleculă-suprafață pentru toate sistemele

investigate, iar Tabelul 16 prezintă distanțele minime atom – suprafață pentru fiecare tip de

atom din moleculă în cazul fiecărui sistem.

Structura electronică a moleculelor relaxate în vid este reprezentată în Figura 97. Sunt

reprezentate densitățile de stări proiectate pe fiecare tip de atom din moleculă.

Molecula 1: Se remarcă

posibilitatea de interacțiune dintre

acești atomi și suprafața de aur.

Molecula 1*: principala modificare

față de molecula 1 este aplatizarea

picului azotului, pierzând

capacitatea de a interacționa cu

suprafața.

Molecula 2: nu mai există stări

suficient de apropiate de

nivelul Fermi.

Figura 97

Structura electronică a moleculelor adsorbite pe Au(111) este reprezentată în Figura 98. Sunt

reprezentate densitățile de stări proiectate pe fiecare tip de atom din moleculă.

Tabelul 15

Molecula C O N S

1_Au 2.99 4.84 3.66 3.37

1*_Au 3.08 3.33 3.27 3.23

2_Au 3.11 3.38 3.5 3.03

1_SiO2 1.02 3.66 2.66 2.53

2_SiO2 0.93 1.23 1.97 0.53

Tabelul 16

Molecula Eleg (eV)

1_Au -4.22

1*_Au -5.30

2_Au -3.28

1_SiO2 -14.90

2_SiO2 -16.50

78

Molecula 1: sulful

interacționează cu metalul.

Molecula 1*: atomii de oxigen

interactionează puternic cu

suprafața.

Molecula 2: oxigenul este cel care

interacționează cu suprafața.

Figura 98

Structura electronică a moleculelor adsorbite pe SiO2 este reprezentată în Figura 99.

Molecula 1: reprezentare geometrică a sistemului

moleculă-suprafață.

Molecula 2: structura adsorbită pe SiO2.

Molecula 1: se remarca anularea densitatilor de stari

la nivelul Fermi – consecinta a interactiunii cu

suprafata.

Molecula 2: similar cu datele pentru molecula 1, dar

fara densitate de stari la nivelul Fermi pentru oxigen.

79

Densitatea de stări a atomilor din suprafața de SiO2

în interacțiune cu molecula 1: se remarcă existența

stărilor de nivelul Fermi atât pentru siliciu cât și

pentru oxigen.

Densitatea de stări a atomilor din suprafața de SiO2

în interacțiune cu molecula 2: structura electronică

este foarte similară celei din cazul primei molecule.

Figura 99.

Pentru testarea electrozilor interdigitizați obținuți în vederea posibilității de funcționalizare cu

molecule cu afinitate pentru Au și cu proprietăți de autoasamblare, s-a folosit tehnica de

nanolitografie DPN, iar cerneala moleculară testată a fost MHA (acid mercaptohexadecanoic).

Imaginea AFM a noului sistemului poate fi vizualizată în Figura 100.

Figura100. Imagine AFM a unui electrod de Au cu molecule de MHA.

Tehnica de nanolitografie DPN a fost aplicată și în vederea scrierii cu cerneluri moleculare pe

bază de L-Glutation (GSH) pe suprafață de Au și albumină serică umană (HSA) pe suprafață de

sticlă funcționalizată cu gruparea amino. Pentru procesul de nanolitografie Dip-Pen, un vârf de

AFM se imersează în soluția conținând compusul de lucru, timp de 10 minute.

Au fost efectuate experimente de scriere pe suprafețe de aur utilizând soluții de GSH (2 mgmL-1

)

în apă dublu distilată în care s-a adăugat un surfactant netoxic, și anume Tween 20 (TW 20)

(Figura 101), în diferite concentrații, de 0.005, 0.01, 0.025, 0.05 și 0.1% (v/v).

Pătrat de 1 × 1 µm

obținut prin depunerea

de MHA pe electrodul

de Au prin tehnica DPN

80

O

HO NH

O

NH2

SH

HN

O

OH

O

L-Gutation (GSH) =

glicisglu

HOO

O

OOH

OOH

OO

O

y

x

w

z

w+x+y+z=20

Tween 20 (TW 20)

Y

Figura 101. Nanolitografia Dip-Pen cu cerneală moleculară de L-Glutation și Tween 20.

Adăugarea de Tween a favorizat atingerea unui optim de umectare ducând la un optimum al

forțelor de distribuție pentru transferul cernelii pe suprafața de aur. Îmbunătățirea rezoluției

spațiale pe măsura creșterii concentrației de surfactant TW 20 adăugat în soluția de GSH a fost

observat. Procedeul de scriere a constat în: (i) inițierea procedeului standard de scriere a unei

suprafețe mari de 1 μm (Figura 102 (a)) pentru a fi siguri că cerneala este pe vârf și aderă la

suprafață. În Figura 98 (b) se poate observa o secțiune medie care arată înălțimea stratului de

glutation pe suprafață; (ii) 5 linii de calibrare de diferite grosimi au fost trasate cu acul DPN pe

suprafața de Au (Figura 102 (c)) pentru setarea finală premergătoare scrierii dorite pe suprafață.

Figura 102 (d) arată secțiunea medie a înălțimii stratului molecular pe suprafață.

(a) (b)

(c)

(d)

Figura 102. (a) Topografia AFM a suprafeței solide de Glutation; (b) Secțiunea medie a profilului

de înălțime a glutationului pe suprafață; (c) Scrierea liniilor de calibrare de diferite grosimi; (d)

Secțiunea medie a profilului de înălțime a glutationului pe fiecare linie scrisă.

Suprafata de Au

Varf AFM

Directia de Scriere

Menisculde Apa

TransportMolecular

YYYYYYYYY

Y YY

YY

Y

YYY

Y

YY

Y

1 µm

3D

Line 1 Line 2 Line 3 Line 4 Line 5

2D

292 nm

263 nm 241 nm 215 nm

185 nm

1.25 µm

2D

2.9 µm

3.5 µm

81

În procesul final de scriere am ales să scriem pe suprafața de Au într-un domeniu de 5.33 μm atât

cu linii de diferite grosimi, dar și cu puncte care au o rază diferită. Figura 103 arată rezultatul

scrierii atât în format 2 D cât și 3D.

(a) (b)

Figura 103. (a) Imaginea LFM de linii si puncte de GSH a procesului de depunere prin DPN; (b)

Imaginea 3D a liniilor si punctelor trasate.

Se demonstrează astfel capabilitatea DPN de a crea modele complexe de scriere la scară

nanometrică cu posibile aplicații în electronică moleculară sau biosenzoristică. În cazul

experimentelor DPN pe bază de albumină serică umană (HSA) (Figurile 104 și 105), s-a preparat

o soluție de HSA (1.9 mg mL -1

) în tampon fosfat salin (pH = 7.4).

Figura 104. Imagini AFM ale suprafeței de sticlă Figura 105. Scriere DPN cu HSA

funcționalizată cu aldehidă. pe sticlă funcționalizată cu aldehide

Spectroscopia Raman și în particular, spectroscopia Raman amplificată de suprafață (SERS –

Surface enhanced Raman scattering) este un instrument foarte util în determinarea proprietăților

fizico-chimice și a structurii moleculare a probelor, pe baza poziției și intensității benzilor

spectrului Raman. Cantitățile de substanță folosite sunt de ordinul mg, mai ales în cazul

spectroscopiei SERS, unde detecția este posibilă chiar la nivel de single-molecule detection.

Scopul utilizării celor 2 tipuri de spectroscopii vibraționale a fost pentru a oferi informații

complementare celor furnizate de imaginile AFM obținute pe molecula de GSH, folosită în

procesul de scriere DPN.

3D 2D

Sticla functionalizata

cu aldehide

HSA

Linia

1

Linia

2

Linia

3

100nm

nmn

80 nm 60 nm

0.30 0.22

X Range: 5.33

µm

82

Înregistrarea spectrelor Raman ale compusului GSH (Figura 106) s-a realizat pe o platformă

NTEGRA Spectra, care îmbină un spectrometru Raman confocal SOLAR TII cuplat cu

microscoape AFM în două configurații diferite. Spectrele Raman și SERS au fost obținute

utilizând laserul 532 nm (verde) la o putere de 4.5 mW, atât pe probe în stare solidă (Raman,

SERS), cât și în stare lichidă (experimentele SERS). Ca și substrat SERS s-a utilizat coloid de

argint. Probele lichide pentru spectrele SERS au fost preparate prin adăugarea a 100 sau 200 µl

de soluție GSH (concentrație de 10 mM) la 400 µl coloid de argint (50 - 60 nm).

Figura 106. Formula chimică a GSH. Figura 107. Coloid de argint folosit în

experimentele SERS.

Spectrul Raman a fost înregistrat cu un număr de 500 de acumulări, un timp de expunere de 2

secunde fiecare, cu rețeaua de difractie 600/600 și este prezentat în Figura 108.

Spectrele SERS au fost înregistrate cu un număr de 100 de acumulări cu timpul de expunere de 2

secunde fiecare și cu rețeaua de difractie 600/600. Figura 109 prezintă spectrul SERS al

moleculei de GSH în stare lichidă, iar Figura 110 este spectrul SERS al probei uscate pe lamelă.

Figura 108. Spectrul Raman al moleculei de GSH în stare solidă.

83

Figura 111. Spectrul SERS al moleculei de GSH în stare lichidă, obținut cu o cantitate de coloid de Ag

de 3 ori mai mare.

Figura 109. Spectrul SERS al moleculei de GSH în

stare lichidă.

Figura 110. Spectrul SERS al moleculei de GSH în

stare solidă.

Următorul spectru SERS a obținut folosind o cantitate de trei ori mai mare a coloidului de Ag

(Figura 111).

Comparând spectrele Raman şi SERS ale glutationului pot fi observate modificări semnificative

ale poziţiilor şi intensităţilor benzilor, ca urmare a interacţiunilor moleculei cu suprafaţa

nanoparticulelor de argint.

Informațiile structurale care pot fi extrase din aceste spectre sunt foarte importante pentru a

observa modul în care se realizează interacțiunea între compușii biologici și suprafețele metalice.

Acesta este un stadiu important în caracterizarea senzorilor moleculari fabricați pe substraturi de

aur.

Proprietățile electronice ale moleculei GSH în stare izolată și adsorbită pe un substrat de Au

(111) au fost investigate teoretic prin tehnici DFT (chimie cuantica ăi fizica solidului). Calculele

84

teoretice au fost inițiate cu scopul de a ințelege procesele electronice locale (și de adsorpție) în

astfel de sisteme hibride complexe.

Molecula GSH izolată

Structura geometrică a moleculei GSH a fost optimizată iar valorile distanțelor dintre atomi și

respectiv a unghiurilor sunt foarte apropiate (în cele mai multe cazuri identice) cu cele

experimentale. Analiza orbitalilor moleculari din diagrama orbitalilor moleculari descrie

comportamentul energetic în jurul nivelurilor HOMO și LUMO.

GSH/Au(111)

Calculele periodice au fost făcute cu scopul de a corela structura electronică a moleculei de GSH

cu topologia locală a substratului de Au. Figura 112 descrie structura optimizată a moleculei

GSH pe suprafața de Au (111). Dupa cum se poate vedea, molecula ramane stabilă pe suprafață

și nu colapsează în timpul procedurii de relaxare. De asemenea, dupa grefarea pe suprafață cu un

linker de tip tripod, molecula își păstrează conformația Y în poziție verticală. Presupunem că un

astfel de comportament are loc și în timpul nano-litografierii prin DPN sau prin formarea de

SAM-uri.

Figura 112. Structura optimizată a moleculei GSH pe substrat de Au.

În molecula GSH, analiza PDOS scoate în evidență câteva stări apropiate de nivelul Fermi, ce

aparțin atomului S din gruparea cisteină. Acest aranjament electronic este în concordanță cu

spectrele XPS, care arată explicit picul caracteristic legăturii S-Au, și sugerează modul de

adsorpție pe suprafață. Putem considera în acest fel că nivelul LUMO al moleculei GSH este

deasupra nivelului FERMI și că atomii de Au contribuie cu electroni în moleculă.

Protocolul de funcţionalizare a suprafetelor în vederea formării complexului bi-Terpiridina-

Fe(II), Au-CIS-CO-AT-Fe-AT presupune parcurgerea unui număr de 5 etape (A-E) prezentate

succint în Schema 10 şi dezvoltă experimentele preliminare de funcționalizare a suprafețelor

metalice. Diferențele notabile constau în utilizarea tehnicii SPR în etapa precedentă și a

spectroscopiei fotoelectronice de raze X (XPS) în etapa actuală. În prezentul raport ne-am propus

funcționalizarea suprafețelor de Au cu complecși bi-Terpiridină-Fe(II) spre deosebire de etapa

precedentă când au fost obţinuţi şi analizați complecși bi-Terpiridină-Fe(III).

85

O ON

O

O

O

N

N

N

N3

S

NH2

Cisteamina (CIS)

Ciclooctina (CO)

Azida-Terpiridina (A-T)

S

NHO

O

N

N NFe

N

NN

Etapa C

Etapa A

Etapa E

NN

N

Au

Au - CIS - CO - AT - Fe - AT

S

NHO

O

Etapa B

Etapa D

Fe(ClO4)2 . H2O S

NHO

O

N

N NFe

NN

N

2+

2(ClO4)-

S

NHO

O

N

N N

NN

N

N

N

N

N3

Azida-Terpiridina (A-T)

N3

2+

2(ClO4)-

Schema 10. Etapele A-E de funcționalizare a suprafeței de aur

și obținerea complexului bi-Terpiridină-Fe(II)

Formarea legăturilor covalente (Etapele A-C: Au-CIS-CO-AT), respectiv a complexului dintre

Terpiridină și Fe(II) (Etapa D: Au-CIS-CO-AT-Fe, Etapa E: Au-CIS-CO-AT-Fe-AT), au fost

puse în evidență prin spectroscopia XPS. Măsurătorile au fost realizate cu echipamentul SPECS

PHOIBOS 150 MCD având radiaţia Al Kα (1486.69 eV). În timpul măsurătorilor parametrii

sursei de raze X au fost 14 kV şi 20 mA, iar presiunea în camera de analiză, p<10−9

mbar.

În Figura 113 este prezentat spectrul XPS obţinut pentru S2p după Etapa A care prezintă două

componente în raportul 2:1 datorită cuplajului spin-orbită al electronilor 2p. Energia de legătură

a vârfului din zona de energii de legătură mici (S2p3/2) este 161.6 eV, caracteristică pentru

gruparea tiol legată covalent de suprafaţa de Au.

Figura 113. Deconvoluţia spectrului XPS

obţinut pentru linia S2p după funţionalizarea

probei cu Cisteamină.

Figura 114. Deconvoluția spectrului XPS obținut pentru

linia N1s după Etapa D.

Confirmarea legării CO de A-T prin reacţia de tip click este ilustrată in Figura 114 prin prezența

liniei caracteristice ciclului triazolic (N=N-N).

170 168 166 164 162 160 158 156

B.E. (eV)

I (a

.u.)

S2p Au-CIS

S-Au

S2p1/2

S2p3/2

410 405 400 395 390

C=N

Au-CIS-CO-AT

I

(a.u

.)

N=N-N

N1s

NH

B.E.(eV)

86

Prezenţa ionilor Fe(II) legați la o singură moleculă T respectiv la două molecule T la suprafaţa

probelor se observă în Figura 115 unde liniile Fe2p din spectrul XPS sunt la aceleaşi valori ale

energiei de legătură, 710 eV indicând prezenţa unei singure specii de ioni şi demonstrând

complexarea moleculelor de Terpiridină cu ionii Fe(II).

Figura 115. Spectrul XPS obţinut pentru Fe2p.

Tehnologia de inscripționare cu cerneluri moleculare de tip DPN folosește tehnica AFM

(Atomic Force Microscopy) în vederea inscripționării de structuri complexe la scară nanometrică

și micrometrică. Metoda a fost aplicată pe un electrod de aur interdigitat funcționalizat cu

moleculele de interes: CIS, CO, AT și Fe(II) (AuI1-CIS-CO-AT-Fe).

Etapa de obținere a complexului bi-Terpiridină-Fe(II) a fost testată prin nanoinscripționarea cu

DPN a unei soluţii conținând un al doilea compus de tip terpiridinic (TBr). Figura 116 confirmă

nanoincscripționarea unei suprafeţe de 1 micron ceea ce demonstrează prezența ionilor de Fe(II)

și formarea complexului bi-Terpridină-Fe(II).

S

NHO

O

N

N NFe

NN

N

2+

2(ClO4)-

N

N

N

Br

Terpiridina-Brom (TBr)

DPN

S

NHO

O

N

N NFe

N

NN

NN

N

AuI

AuI-CIS-CO-AT-Fe-TBr

Br

1

2+

2(ClO4)-

Figura 116. Nanolitografiere DPN 1µm×1µm pe Au evidenţiind complexul bi-Terpridină-Fe(II).

Depunerea succesivă a straturilor de molecule CIS-CO-AT pe suprafaţa electrodului de Au

interdigitat s-a realizat conform Etapelor A-C descrise anterior. După etapele de depunere,

electrodul a fost imersat în soluţia de transfer unde a fost investigat cu ajutorul voltametriei

740 730 720 710 700 690

740 730 720 710 700 690

Fe2p3/2

Au-CIS-CO-AT-Fe-AT

Fe2p1/2

Fe2p

Fe2p3/2

Fe2p1/2

Au-CIS-CO-AT-Fe

B.E. (eV)

I (a

.u.)

87

ciclice. Voltametria ciclică a fost înregistrată utilizând potenţiostatul modular VSP de la firma

BiLogic conectat la booster-ul extern de 5 A. Voltamogramele au fost înregistrate în soluţie de

KCl 500 M şi KCl 500 M+FeCl2 5 M între -1V şi 1V folosind o viteză de baleiere de

0.02V/s. Voltamograma ciclică pentru electrodul funcţionalizat în soluţie de KCl 500 mM este

prezentată în Figura 117 şi este caracterizată de un maxim de oxidare situat la 0.42V şi un

maxim de reducere la -0.66V faţă de electrodul de referinţă de Calomel.

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

-0,0010

-0,0005

0,0000

0,0005

0,0010

0,0015

electrod functionalizat KCl 500M

Ewe/V vs. SCE

I (m

A)

a)

-1,0 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0,0

-0,16

-0,14

-0,12

-0,10

-0,08

-0,06

-0,04

-0,02

0,00

electrod functionalizat KCl 500M

Ewe/V vs. SCE

I (m

A)

b)

Figura 117. Voltamogramele ciclice pentru electrodul funcţionalizat de Au în soluţia de transfer ce

conţine KCl 500 M obţinute prin baleierea potenţialului în domeniul a) (0;1)V şi b) (-1,0)V cu

viteza de baleiere: 0.02 V/s.

Voltamograma pentru cazul în care soluţia de transfer a fost KCl 500 M+FeCl2 5 M este

prezentată în Figura 118 şi este caracterizată de două maxime de oxidare situate la 0.47V si

0.67V şi de un maxim de reducere la -0.47V faţă de electrodul de Calomel.

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

-0,0005

0,0000

0,0005

0,0010

0,0015

a)

electrod functionalizat KCl 500M+FeCl2

5M

Ewe/V vs. SCE

I (m

A)

-1,0 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0,0

-0,16

-0,14

-0,12

-0,10

-0,08

-0,06

-0,04

-0,02

0,00

electrod functionalizat KCl 500M+FeCl2

5M

Ewe/V vs. SCE

I (m

A)

b)

Figura 118. Voltamogramele ciclice pentru electrodul funcţionalizat de Au în soluţia de transfer ce

conţine KCl 500M+FeCl2 5M obţinute prin baleierea potenţialului în domeniul a) (0;1)V şi b) (-

1,0)V cu viteza de baleiere: 0.02 V/s.

Scanarea potențialului în ambele sensuri ne oferă posibilitatea de a explora comportamentul

electrochimic al specilor generate la electrod. Acesta este un avantaj distinct al voltametriei

ciclice față de alte tehnici voltametrice.

88

Parametrii electrochimici obtinuţi prin caracterizarea electrochimică a electrodului de Aur

funcţionalizat obtinuţi prin baleierea potentialului pe domeniul (-1;1)V sunt prezentaţi în Tabelul

17.

Tabelul 17. Parametrii electrochimici obtinuţi

Souţia Epc

(V)

Epa

(V)

E1/2

(V)

Ipc

(mA)

Ipa

(mA)

KCl 500 M 0.42 -0.66 -0.12 3.16·10-4

-0.055

KCl 500 M +

FeCl2 5 M 0.47 0.67 -0.47 0 0.1 3.17·10

-4 -0.011

Spectroscopia Raman este cunoscută a fi una dintre metodelele spectroscopice cele mai sensibile

pentru determinarea structurii moleculare din date spectrale vibraționale. Una dintre versiunile

îmbunătățite ale acestei tehnici este spectroscopia Raman amplificată de vârf (TERS) care

folosește o sondă de scanare microscopică (SPM) ca și o unitate externă de amplificare. TERS

utilizează rezonanța plasmonilor de suprafață, efectele de dipol și de rezonanță chimică,

amplificând foarte mult efectul de împrăștiere Raman în câmpul apropiat de sub sondă.

Vârfurile SPM fabricate sau învelite cu Ag sau Au s-au dovedit a îmbunătăți împrăștierea Raman

a moleculelor din apropierea vârfului cu ordine de mărime de la 3 la 6. În INCDTIM am cuplat

un spectrometru Raman confocal echipat cu două lasere (532 și 633 nm) şi masa de scanare

acționată piezo cu un microscop de forță atomică (AFM) care operează în modul contact sau

semi-contact (AC).

Platforma NTEGRA Spectra prezentată în Figura

119 îmbină un Spectrometru Raman confocal

cuplat cu un Microscop de Forţă Atomică în două

configuraţii: i) directă - pentru experimente

simultane AFM - Raman TERS pentru probe

opace; obiectiv 100x (NA 0.7); ii) inversată -

optimizată pentru experimente simultane AFM -

Raman - TERS pentru probe pe substrat

transparent; Microscop Olympus IX71, obiectiv

cu imersie în ulei (NA 1.3). Modalităţile de

scanare pot să fie cu vârful sau cu proba iar

măsurătorile se pot efectua în aer, lichide, medii

gazoase, vid (0.5 x 10-2 Torr), celulă QCM

(Quartz Crystal Microbalance), celulă închisă pentru măsurători în lichid. Scannerele sunt

interschimbabile: 100x100x10 μm şi 1x1x1 μm. Detecţia se realizează cu o cameră CCD.

Platforma beneficiază de un sistem de izolare la vibraţii: masă optică NEWPORT RS4000.

Experimentele preliminare de funcționalizare din soluție a suprafețelor metalice, Au și AuI, cu

moleculele de interes (CIS, CO, AT) au fost raportate în 2015. În această ultimă etapă s-a obținut

captarea la suprafețele de Au funcționalizate ale diferitelor specii ionice (azotat de fier, azotat de

Figura 119. Platforma NTEGRA Spectra existentă

în INCDTIM.

89

nichel și azotat de cupru), prin complexarea speciilor ionice la unitățile terpiridinice libere de pe

suprafața de Au funcționalizată (Au-CIS-CO-AT-Fe / Au-CIS-CO-AT-Ni / Au-CIS-CO-AT-

Cu).

Figura 120. Nanoinscripționarea cu DPN pe AuI cu speciile ionice: Fe(III), Ni(II) și Cu(II) (A);

Cerneluri moleculare cu ioni metalici diferiți (B).

Formarea acestor complecși a fost pusă în evidență prin spectroscopie fotoelectronică de raze X

(XPS). În Figura 121 este prezentat spectrul XPS al probei Au-CIS-CO-AT-Fe. Din spectrul

survey obținut s-au identificat liniile caracteristice fotoelectronilor emiși de pe nivelele atomice

caracteristice elementelor prezente la suprafața probei investigate (Fe, O, C, Au, N, S). Linia

caracteristică nivelului Fe2p este mai bine evidențiată în spectrul de înaltă rezoluție (Figura 23

Inset) obținut pentru această probă, și prezintă două regiuni corespunzătoare celor două

subnivele (dubleţi) Fe2p1/2 şi Fe2p3/2 la energiile de legătură 712 eV și respectiv 726 eV, în

conformitate cu cele raportate in literatură pentru Fe3+

.

În Figura 122 este redat spectrul XPS obţinut pentru Ni(II), pentru proba Au-CIS-CO-AT-Ni,

punându-se în evidență liniile caracteristice fotoelectronilor emiși de pe nivele adânci ale

atomilor prezenți la suprafața probei investigate (Ni, O, Au, N, Ni, S). Spectrul Ni2p conține cele

două componente caracteristice Ni2p3/2 și Ni2p1/2 la energiile de legătură 855.6 eV și respectiv

874 eV, valori caracteristice pentru Ni2+

. Prezența ionilor Cu(II) legați la unitatea terpiridinică,

Au-CIS-CO-AT-Cu, se observă în Figura 123.

Spectrul XPS de înaltă rezoluție pentru Cu2p prezintă cele două componente caracteristice la

energiile de legătură 931.5 eV și 951 eV cararctersitice pentru Cu2+

. Spectrul XPS survey

confirmă prezența elementelor caracteristice grupărilor existente la suprafața probei investigate.

S

NHO

O

NN

N

NN

N

DPN

AuI

Au-CIS-OT-ATAu-CIS-CO-AT-Fe

Fe(NO3)3

Ni(NO3)2

Cu(NO3)2

3+

3(NO3)-

S

NHO

O

NN

N

NN

N Fe

AuI

Au-CIS-CO-AT-Ni

2+

2(NO3)-

S

NHO

O

NN

N

NN

N Ni

AuI

Au-CIS-CO-AT-Cu

2+

2(NO3)-

S

NHO

O

NN

N

NN

N Cu

AuI

A B

90

În continuare a fost utilizată tehnologia DPN pentru depunerea acestor specii ionice pe electrod

de aur interdigitat (AuI) funcționalizat în vederea formării complecșilor mono-terpiridinici cu

speciile ionice menționate anterior. Preliminar, suprafețele de AuI au fost funcționalizate din

soluție până la etapa de legare a terpiridinei, AuI-CIS-CO-AT (Figura 120 A) pe baza

protocolului raportat în etapele anterioare. Pentru procedeul de nanoinscripționare cu DPN au

fost astfel preparate trei tipuri de cerneluri moleculare conținând azotat de fier, azotat de nichel și

respectiv azotat de cupru. S-a folosit un ac de tip A (nitrat de siliciu) care a fost imersat în

cerneluri moleculare (Figura 120B) pentru un timp de 5 minute.

Figura 125. Imagini AFM (5 μm ×5 μm) ai complecșilor metalici AuI-CIS-CO-AT-Fe (A), AuI-CIS-

CO-AT-Ni (B) și AuI-CIS-CO-AT-Cu (C).

Figura 124. Imagine AFM -3D a unei arii de 30 μm × 30 μm apartinand AuI.

Figura 121. Spectrul XPS

survey al probei Au-CIS-CO-

TA-Fe. Inset: Spectrul Fe2p

Figura 122. Spectrul XPS

survey al probei Au-CIS-CO-

TA-Ni. Inset: Spectrul Ni2p

de înaltă rezoluţie.

Figura 123. Spectrul XPS

survey al probei Au-CIS-CO-

TA-Cu. Inset: Spectrul Cu2p

de înaltă rezoluţie.

A B C

91

Măsurătorile de spectroscopie de impedanță prin tehnica PEIS (reprezentare Bode) s-au efectuat

în toate cazurile prin compararea cu electrodul funcționalizat înainte și după adăugarea ionilor

metalici. S-a folosit ca buffer soluție de NH4NO3 100 mM, iar ionii metalici s-au măsurat în

soluții de Fe(NO3)3 5 µM, Cu(NO3)2 5 µM și Ni(NO3)2 5 µM. S-au utilizat 3 electrozi

funcționalizați pentru cei trei ioni metalici. Reprezentarea Bode a fazei și a logaritmului

impedanței este ilustrată în Figura 126.

Figura 126. Comparație PEIS a electrozilor funcționalizați cu Fe, Cu și Ni.

Sunt vizibile mici diferențe în comportamentul impedanței (în particular la Ni) și

modificări mai însemnate pentru cei trei ioni metalici în fază în domeniul de frecvențe înalte.

Aceste diferențe pun în evidență detecția ionilor metalici funcționalizați pe electrozii interdigitați

de Au și certifică în același timp litografia de scriere DPN.

Al treilea obiectiv a constat în proiectarea și realizarea unui dispozitiv electronic dedicat pentru

măsurarea impedanței Z a senzorului, alcătuit dintr-o pereche de electrozi interdigitați. Aparatul

este de tip portabil alimentat cu o celulă Li-Ion de 3.7V, având o capacitate de 1000 mAh.

Controlul blocurilor componente este asigurat de către un microcontroler de tip Microchip care

rulează la frecvența de 40MHz.

Aplicația software propiu-zisă rulează și este afișată pe un calculator PC. Programul rezultat este

un fișier executabil realizat pe platforma LabView, care permite afișarea graficelor de tip Bode-

Nyquist. Comunicația dintre aparat și calculatorul PC este asigurată în tehnologie wireless la

frecvența de 2.4 GHz, prin intermediul unui protocol SSP (Serial Port Profile) implementat pe un

modul de tip Bluetooth. Acest tip de conexiune permite transferul aplicației principale către un

sistem de operare Android. Dispozitivul permite chiar și achiziția probelor în regim autonom față

92

de PC, în vederea unei analize ulterioare datele obținute fiind stocate într-o memorie nonvolatilă

având capacitatea de 1Mb. Schema bloc a dispozitivului este prezentată în Figura 127.

Elementele hardware sunt astfel proiectate

încât dispozitivul să acopere un domeniu

relativ larg de frecvențe între 0.1 Hz÷100

KHz. De asemenea, valoarea tensiunii de

excitație este programabilă între 20 mV÷5 V.

3.1. Descrierea principalelor module

componente

Sursa de alimentare

Alimentarea dispozitivului este asigurată de o celulă Li-Ion la o tensiune nominală de 3.7 V.

Deoarece sistemul impune tensiuni de alimentare mai ridicate decât valoarea oferită de către

baterie se impune utilizarea unei surse principale de tip convertor boost. Această sursă de

alimentare ridică tensiunea la 7.5 V și este capabilă să furnizeze un curent de 0.8 A. Valorile de

3.3 V respectiv 5 V se obțin folosind surse liniare de tip LDO. Blocul analogic de măsură este

alimentat dintr-o sursă auxiliară în comutație 5 V/ 15 V, pentru a asigura tensiunile necesare

amplificatoarelor diferențiale utilizate.

Blocul de calibrare și polarizare

Eliminarea tensiunilor de offset precum și stabilirea tensiunii de polarizare pentru

electrodul de măsură se realizează prin utilizarea unor convertoare DAC pe 16 biți. Astfel este

posibilă fixarea tensiunii de polarizare cu precizie ridicată în domeniul 1 V. Curentul de

polarizare scăzut la nivelul convertorului curent-tensiune, permite introducerea în proba de

măsură a unui electrod de referința cu impedanța 100 MΩ, valoare suficient de mare pentru a

nu introduce erori de conversie.

Blocul analogic de măsură

Setarea actuală a dispozitivului permite măsurarea unei impedanțe la nivelul electrodului

de măsură, în domeniul 1 KΩ÷1 MΩ. Semnalul sinusoidal aplicat de către generatorul DDS,

impune un curent invers proporțional cu valoarea Z de la bornele electrodului. Pentru măsurarea

acestui curent se folosește un amplificator operațional de tip OPA129. Curentul de polarizare la

nivelul acestui amplificator operațional nu depășește 100 fA. Protecția circuitului de intrare se

realizează cu ajutorul a două diode FJH1100 montate în antiparalel.

Figura 29. Shema bloc a dispozitivului de măsurare.

93

Blocul de calcul DFT

Măsurarea cu mare precizie a impedanței cât și a fazei, pe un domeniu de frecvențe între

0.1 Hz÷10 KHz impune calculul transformatei Fourier discrete (DFT) pentru a obține

componenta reală, respectiv imaginară pentru fiecare valoare a frecvenței semnalului de test.

Pentru calculul transformatei DFT se folosește circuitul specializat AD5933 având capabilitate

DSP pentru calculul a 1024 de puncte. Circuitul furnizează componentele Re și Im pentru fiecare

frecvență de test, urmând efectuarea calculelor pentru determinarea valorii impedanței Z; astfel

pentru un factor de amplificare dat, rezultă:

22 ImRe eAmplitudin

eAmplitudinFamplifZ

1

ReIm/tan 1radsfaza

Blocul de sinteză DDS

Utilizarea circuitului AD5933 într-un domeniu de frecvențe mai coborât de 1 Hz impune

reprogramarea valorii frecvenței semnalului de ceas MCLK. Chiar dacă circuitul menționat

conține un modul DDS dedicat, acesta nu poate cuprinde întregul domeniu de frecvențe impus.

Astfel pentru generarea semnalului de ceas necesar sistemului, se folosește circuitul DDS,

AD9851. Ambele circuite necesită o accesare complexă a regiștrilor de lucru. Microcontrolerul

PIC18F4520 asigură programarea circuitelor periferice cât și efectuarea calculelor în virgulă

mobilă pe 32 de biți. Pentru platforma LabView, transferul valorilor calculate dinspre

microcontroler este compatibil conform IEEE 754, în modul simplă precizie (SGL).

3.2. Realizarea dispozitivului de măsură

Întreg dispozitivul este proiectat pe o monoplacă de circuit imprimat având dimensiunile

de 117 mm×60 mm. Traseele de pe ambele straturi cât și modul de amplasare a componentelor

este prezentat în Figura 128.

Figura 30. Dispozitivul de măsură.

94

Printre avantajele unui astfel de dispozitiv se numără gradul ridicat de portabilitate și

interfațare de tip wireless, dar și proiectarea modulară din punct de vedere software care permite

extinderea numărului de aplicații ale dispozitivului, atât în industrie pentru determinări calitative

asupra acoperirilor și detecției coroziunilor, cât și în sistemele care includ biosenzori pentru

detecția concentrațiilor bacteriene. Deoarece funcționarea acestui dispozitiv se bazează pe

spectroscopia de impedanță, industria alimentară poate să beneficieze de acesta pentru

determinarea interacțiunilor aliment-ambalaj, analiza diverselor compoziții alimentare cât și a

gradului de perisabilitate. În domeniul medical analiza de impedanță bioelectrică permite

determinări la nivel de fluide intra- și extracelulară. În domeniul științei materialelor dispozitivul

proiectat se poate utiliza pentru investigarea mecanismelor în cadrul reacțiilor electrochimice,

pentru măsurarea dielectricului și a proprietăților de transport în cazul electrozilor precum și a

porozității acestora.

Director proiect,

Prof. Univ. Dr. Tudor Luchian