Simplexa™ EBV

REF MOL2400

Rév. G

Test PCR en temps réel pour la mesure in vitro du virus d'Epstein-Barr (EBV).

Pour diagnostic in vitro

APPLICATION

Le test Simplexa™ EBV de Focus Diagnostics est destiné au dosage in vitro des acides nucléiques du virus d'Epstein-Barr dans des échantillons de sang total en utilisant l'Integrated Cycler de 3M.

Ce test est prévu pour être utilisé en association avec le tableau clinique et les autres marqueurs biologiques de l'évolution de la maladie pour la prise en charge clinique des patients infectés par l'EBV.

Ce test n'est pas prévu pour effectuer un dépistage des donneurs.

RÉSUMÉ EXPLICATIF

Le virus d'Epstein-Barr (EBV), un virus herpès humain très répandu ayant un tropisme pour les lymphocytes B, est l'agent causal de la mononucléose infectieuse et est fortement associé à plusieurs cancers humains. L'infection par l'EBV est fréquente et habituellement infraclinique ou se présente comme une maladie spontanément résolutive durant 2 à 3 semaines. Comme les autres membres de la famille herpès, l'EBV peut rester latent pendant de longues périodes et se réactiver ultérieurement. Bien que l'infection initiale puisse entraîner un syndrome relativement bénin, la réactivation du virus chez une personne ayant une altération du système immunitaire peut avoir des conséquences plus graves. L'acide nucléique de l'EBV ou ses protéines ont été identifiées dans des tissus de personnes atteintes d'un lymphome de Burkitt

1, d'une maladie de Hodgkin

2-4, d'un carcinome du

nasopharynx1,5

, de troubles lymphoprolifératifs liés à une transplantation6-8

, de lymphome primitif en rapport avec un sida du système nerveux central

9,10, et d'autres lymphomes affectant les leucocytes B et T

11,12.

Les méthodes diagnostiques conventionnelles sont rarement utiles pour l'évaluation des troubles liés à l'EBV chez des patients ayant une immunosuppression. Les cultures ne sont ni pratiques ni utiles dans un cadre clinique et la sérologie est difficile à interpréter dans le cas d'une immunosuppression

13. Les méthodes diagnostiques reposant sur l'amplification par réaction en

chaîne de la polymérase (PCR) offrent la possibilité d'une détection rapide de l'EBV dans des échantillons. La surveillance de la charge virale de l'EBV peut contribuer à l'identification des troubles lymphoprolifératifs post transplantation et à la surveillance des lymphomes chez les patients souffrant du syndrome d'immunodéficience acquise.

14-15

PRINCIPES DE LA PROCÉDURE

Le test est un système d'amplification et de détection par PCR en temps réel qui utilise une sonde-amorce fluorescente bifonctionnelle pour la détection de l'ADN du virus d'Epstein-Barr dans du sang total. Le test comporte deux étapes principales : (1) extraction de l'ADN provenant des échantillons du patient, (2) une sonde-amorce fluorescente bifonctionnelle est utilisée conjointement avec une amorce inverse pour amplifier une cible précise (pour l'analyte et le contrôle interne). Le test fournit un résultat ; une région bien conservée du gène Lmp2A du génome de l'EBV est ciblée pour identifier l'ADN viral dans l'échantillon. Un contrôle interne est utilisé pour contrôler le processus d'extraction et pour détecter une inhibition de la PCR. Le signal d'amplification obtenu pour chaque est comparé à une courbe d'étalonnage et quantifié.

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MATÉRIELS FOURNIS

Le kit SimplexaTM

EBV de Focus Diagnostics contient suffisamment de réactifs pour 100 réactions.

Libellé du kit

Nom du composant RÉF Symboles CE Sur L'étiquette

Nom abrégé Couleur du

bouchon

Nombre de

flacons

Réactions par

flacon/kit

Volume par

flacon

Simplexa™ EBV Primer Mix MOL2401 REAG A PM Brun 2 50/100 50 µL

Simplexa™ Master Mix MOL2000 REAG B MM Vert 2 50/100 200 µL

Simplexa Extraction & Amplification Control DNA MOL9001 CONTROL IC IC Bleu 3 50/150 250 µL

Simplexa™ EBV Low Positive Control MOL2402 CONTROL + LPC Blanc 6 1/6 200 µL

Simplexa™ EBV High Positive Control MOL2403 CONTROL ++ HPC Rouge 6 1/6 200 µL

Description du composant

Composition Description

Simplexa™ EBV Primer Mix (PM) (Mélange d'amorces)

Amorces fluorescentes marquées spécifiques pour la mesure de l'EBV et du contrôle interne.

Cible

Sonde fluorophore Marqueur (colorant)

Excitation Émission Gène ciblé

EBV FAM 495 nm 520 nm Gène Lmp2A

Contrôle interne Q670 644 nm 670 nm Gène de A.

thaliana

Simplexa™ Master Mix (MM) (Mélange maître) ADN polymérase, tampon et dNTP

Simplexa™ Extraction & Amplification Control DNA (IC) (ADN de contrôle d'extraction et d'amplification)

Un fragment d'ADN comportant 577 paires de bases tirées du gène codant pour la N-méthyltransférase de la grande sous-unité de la ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase-oxygénase de la plante Arabidopsis thaliana.

Simplexa™ EBV Low Positive Control (LPC) (Contrôle positif bas)

EBV inactivé dans une matrice de base humaine.

Simplexa™ EBV High Positive Control (HPC) (Contrôle positif haut )

EBV inactivé dans une matrice de base humaine.

Simplexa™ EBV Barcode Card (Carte à code-barres)

Paramètres spécifiques au test.

MATÉRIELS NÉCESSAIRES MAIS NON FOURNIS

1. Simplexa™ EBV Quantitation Standards (normes de quantification) REF MOL2410

2. 3M Integrated Cycler avec le logiciel Integrated Cycler Studio version 3.0 ou plus récente

3. Universal Discs utilisables sur l'Integrated Cycler

4. Laminage de couverture d'un disque universel

5. a Système Roche MagNA Pure LC et consommables associés.

6. a Roche MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit (kit d'isolement d'acide nucléique total Roche MagNA Pure LC,

Roche, num. cat. 03038505001)

7. b Appareil bioMérieux NucliSENS® easyMAG™ avec consommables et réactifs associés

8. b Pipette multicanaux Biohit/bioMerieux

9. b Plaque de micropuits ELISA

10. Micropipette(s) monocanal, multicanaux et/ou à répétition ayant une plage de précision de 1 à 10 µL, 10 à 100 µL et 100 à 1 000 µL

11. Congélateur (dégivrage manuel) à -10 °C à -30 °C (pour stockage des composants congelés du kit)

12. Réfrigérateur à 2-8 °C (pour échantillons et composants du kit décongelés)

13. Enceinte de sécurité (hotte à flux laminaire) pour les extractions

14. Microcentrifugeuse

15. Vortex

16. Embouts antiaérosols, stériles, jetables, sans ARNase/ADNase de micropipetteur.

17. Tubes de microcentrifugeuse de 1,5 mL en polypropylène et portoirs (des tubes sans ARNase/ADNase sont recommandés mais non exigés).

18. Gants à usage unique, non poudrés.

19. Eau sans nucléase (utilisée au cours de l'extraction et comme Contrôle sans matrice [NTC, No-Template Control]) 20. Portoirs de glacière pour tubes de microcentrifugeuse de 1,5 mL a À utiliser avec la méthode d'extraction Roche MagNA Pure LC

b À utiliser avec la méthode d'extraction bioMerieux easyMAG

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DURÉE DE CONSERVATION ET MANIPULATION

1. Conserver les réactifs à une température comprise entre -10 et -30 °C (ne pas utiliser de congélateur sans givre).

2. Laisser les réactifs décongeler à température ambiante (entre environ 18 et 25 °C) avant utilisation.

3. Ne pas utiliser les kits ou les réactifs au-delà de leur date limite d'utilisation.

4. Après addition du Mélange maître, utiliser le mélange réactif dans l'heure qui suit. Conserver le Mélange réactif à une température comprise entre 2 et 8 °C jusqu’au moment de poursuivre par le réglage de la PCR.

5. Une fois décongelés, conserver le mélange d’amorces, le mélange maître et l’ADN de contrôle d’extraction et d’amplification à une température de 2 °C à 8 °C pendant un maximum de 30 jours.

6. Ne pas recongeler le mélange d'amorces, le mélange maître, l'ADN de contrôle d'extraction et d'amplification ou les contrôles positifs.

7. Ne pas combiner des réactifs provenant de différents lots de kits.

MISES EN GARDE ET PRÉCAUTIONS

1. Pour diagnostic in vitro 2. Tous les matériaux d'origine humaine doivent être considérés comme potentiellement infectieux. Les matériaux sources d'où

proviennent ce produit (y compris les contrôles) ont été testés à la recherche de l'antigène de surface de l'hépatite B, des anticorps anti-hépatite C et anti-VIH-1/2 (SIDA) avec des méthodes homologuées par la FDA et sont apparus négatifs. Cependant, comme aucune méthode de test connue ne peut offrir une garantie à 100 % que des produits dérivés du sang humain ne transmettront pas ces agents infectieux (ou d'autres), tous les contrôles, échantillons de sérum et équipements rentrant en contact avec ces échantillons doivent être considérés comme potentiellement infectieux et décontaminés ou éliminés en utilisant les précautions concernant les risques biologiques. Les CDC et les National Institutes of Health préconisent que les agents potentiellement pathogènes soient manipulés ai niveau de biosécurité 2.

16, 17

3. Portez un équipement individuel de protection comme (mais non limité à) des gants et une blouse de laboratoire lors de la manipulation des réactifs du kit. Lavez-vous soigneusement les mains quand vous avez fini le test.

4. Ne pas pipeter à la bouche.

5. Ne pas fumer, boire, manger, manipuler des lentilles de contact ou se maquiller dans les zones où des réactifs de kits et/ou des échantillons d'origine humaine sont utilisés.

6. Éliminez les réactifs de kits non utilisés ainsi que les échantillons d'origine humaine conformément aux règlements locaux, nationaux et fédéraux.

7. Dans le laboratoire, le flux de travail doit progresser dans une seule direction en commençant dans les zones de préamplification et en allant vers la zone d'amplification/détection : vous trouverez ci-dessous la séquence des événements qui se déroulent depuis l'extraction de l'échantillon jusqu'à l'amplification par PCR en temps réel :

Commencez par l'extraction de l'échantillon, suivie par le réglage de l'appareil de PCR en temps réel, la préparation des réactifs et, finalement, l'amplification par PCR en temps réel.

N’utilisez pas de fournitures et d'équipement indifféremment dans les zones dédiées à l'extraction des échantillons et à leur préparation. Il n'est pas recommandé de faire des déplacements croisés entre les différentes zones.

Les fournitures et l'équipement utilisés pour la préparation de l'échantillon ne doivent pas servir aux activités de préparation du réactif, ni au traitement de l'ADN amplifié ou d'autres sources d'acide nucléique cible.

Toutes les fournitures et l'équipement d'amplification doivent être conservés en permanence dans la zone de l'appareil de PCR en temps réel.

L'équipement individuel de protection, comme les blouses de laboratoire et les gants jetables, doit être réservé à la zone de travail.

8. La contamination des échantillons de patients ou des réactifs peut aboutir à des résultats erronés. Utilisez des techniques respectant les règles d'asepsie.

9. Pipetez et manipulez les réactifs avec prudence pour éviter de mélanger les échantillons de puits contigus.

10. Utilisez des techniques de pipetage correctes et conservez le même schéma de pipetage tout au long de la procédure pour garantir l'obtention de valeurs optimales et reproductibles.

11. Ne substituez pas ou ne mélangez pas des réactifs de différents lots de kits ou avec des réactifs d'autres fabricants.

12. N'intervertissez pas les bouchons des tubes de réactifs. Cela pourrait provoquer une contamination et compromettre les résultats des tests.

13. Utilisez uniquement le protocole décrit dans cette notice. Des écarts par rapport au protocole ou l'utilisation de temps et de températures autres que ceux indiqués pourraient aboutir des résultats erronés.

14. L'organisation d'un test doit être effectuée à température ambiante (entre 18 °C et 25 °C, environ). Pendant le mélange des réactifs, maintenez les enzymes au froid en utilisant un bloc réfrigérant.

15. Ne réutilisez pas des Universal Discs qui ont été déjà exposés aux échantillons de patients ou à des réactifs.

16. Éliminez le disque utilisé sans détacher l'adhésif qui le recouvre.

17. Si différents kits ou lots Simplexa™

sont installés sur un même disque, il est nécessaire de tester les contrôles positifs et les contrôles sans matrice de chaque kit.

18. Le Mélange maître contient plus de 1 % de glycérol, ce qui pourrait produire des irritations après inhalation ou contact avec la peau. Les mesures de premiers secours doivent être prises en cas d'inhalation ou de contact avec la peau.

19. Il n'est pas recommandé de conserver pendant une période prolongée des échantillons à une température comprise entre 2 et 8 °C ; la performance du test n'a pas été déterminée dans ces conditions.

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20. Si le matériau d’emballage du kit semble être déchiré ou endommagé, ne pas utiliser et contacter Focus Diagnostics. Les

coordonnées de contact sont indiquées à la dernière page de ce document.

MODE D'EMPLOI

A. PRÉLÈVEMENT DES ÉCHANTILLONS

Le type d'échantillon acceptable est du sang total recueilli par ponction veineuse. N'utilisez pas de tubes de prélèvement utilisant l'héparine comme anticoagulant. L'héparine inhibe la PCR.

B. ZONE D'EXTRACTION DES ÉCHANTILLONS

Travaillez dans une zone dédiée à l'extraction de l'échantillon et du contrôle. La préparation des échantillons pour l'extraction doit être effectuée dans une enceinte de sécurité.

Extraction selon la méthode Roche MagNA Pure LC

1. Procédez à l'extraction des échantillons du patient et des contrôles du test grâce au kit d'acide nucléique total Roche MagNA Pure Total Nucleic Acid et de l'appareil d'extraction automatisé Roche MagNA Pure LC Automated Nucleic Acid Extractor. Reportez-vous au mode d’emploi du fabricant pour l'extraction de l'acide nucléique au moyen de ce kit.

2. Dans le menu déroulant « Protocole » du système MagNA Pure LC System, sélectionner dans la liste « Total NA », puis « Total NA Variable_elution_volume.blk ». Cela chargera les réglages appropriés pour le test.

3. Le protocole de l'échantillon doit être : « Total NA Variable_elution_volume ».

4. Le volume de l'échantillon doit être réglé à 200 µL et le volume d'élution doit être réglé à 50 µL.

5. Le volume de dilution doit être réglé à zéro pour tous les échantillons.

6. Assurez-vous que le protocole post élution est réglé sur « None » [aucun].

7. Assurez-vous que les échantillons et les contrôles sont dans le bon emplacement de la cartouche d'échantillons.

8. Passez chaque échantillon et les contrôles positifs bas et hauts (LPC et HPC) au Vortex pendant 2 à 4 secondes et centrifugez brièvement pour recueillir le contenu dans le fond des tubes.

9. Pipetez 200 µL de chaque échantillon, du contrôle positif bas (LPC), du contrôle positif haut (HPC) et du contrôle sans matrice dans l'emplacement correspondant de la cartouche d'échantillons.

10. Vérifiez visuellement le niveau des échantillons et des contrôles dans la cartouche d'échantillons afin de vous assurer que les échantillons ont été ajoutés.

11. Passez 2 fois au Vortex à pulsations l'ADN de contrôle d'extraction et d'amplification (contrôle interne : IC) et centrifugez brièvement pour recueillir le contenu dans le fond du tube.

12. Pour chaque ensemble de 16 échantillons (de 1 à 16 échantillons), dispensez à l’aide d’une pipette 100 µL de l'IC dans un tube conique contenant 6 mL de tampon de lyse. Mélangez brièvement au vortex. Ajoutez le plateau adéquat à l'appareil d'extraction MagNA Pure.

o Si, par exemple, plus de 16 échantillons (17-32 échantillons) sont extraits, dispensez à l'aide d'une pipette 200 µL d'IC dans un tube conique contenant 12 mL de tampon de lyse. Mélangez brièvement au vortex. Ajoutez le plateau adéquat à l'appareil d'extraction MagNA Pure.

13. Transférez la cartouche d'échantillons dans l'extracteur automatisé d'acides nucléiques MagNA Pure LC et commencez la procédure d'extraction.

14. Lorsque l'extraction de l'acide nucléique est terminée, la cartouche contenant les contrôles et échantillons de patients extraits peut être retirée de l'appareil MagNA Pure et scellée. Conservez l'ADN à une température de 2 à 8 °C avant utilisation. Une conservation prolongée à cette température des échantillons extraits n'est pas recommandée. Gardez les échantillons d'ADN extrait sur un bloc réfrigérant pendant le chargement du disque.

Extraction par la méthode d'extraction bioMérieux NucliSENS® easyMAG™

1. Se reporter au Manuel de l'utilisateur NucliSENS® easyMAG™ pour le fonctionnement de l'appareil et du logiciel.

2. Choisissez la Generic template [matrice générique] dans le logiciel NucliSENS® easyMAG™ avec le paramétrage

suivant ; Default Request [Demande par défaut] :

Generic 2.0.1 (ou équivalent)

Run Name Prefix [Préfixe du nom de la série] :

(selon les besoins)

Sample ID prefix [Préfixe ID d'échantillon] :

(selon les besoins)

Sample Type [Type d’échantillon] :

Primary [Primaire]

Workflow Defaults [Paramètres par défaut du flux de travail] :

On-board lysis Incubation [Incubation de lyse dans l'instrument] On-board Silica Incubation [Incubation de silice dans l'instrument] Sample Addition Guidance Off [Traçabilité échantillons désactivée]

Reagent Tracking [Traçabilité réactif] :

Lysis, Silica, Internal Control reagent tracking disabled [Lyse, Silice, Traçabilité du réactif de contrôle interne désactivée]

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3. Saisissez les renseignements pour chaque échantillon dans l'écran de Demande d´extraction comme ci-dessous.

ID échantillon : (Saisir le nom de l'échantillon) Request (Demande) : Generic 2.0.1 (ou équivalent) Volume (mL) : 0,100 Eluate (Éluat) (µL) : 25 Type : Primary [Primaire] Priorité : Normal Matrice : Other [Autre]

4. Créez la série d'extraction dans le logiciel NucliSENS

® easyMAG™ conformément au manuel de l'utilisateur.

5. Passez chaque échantillon et les contrôles positifs bas et hauts (LPC et HPC) au Vortex pendant 2 à 4 secondes et centrifugez brièvement pour recueillir le contenu dans le fond des tubes.

6. Pipettez 100µL de l'échantillon, du LPC, du HPC ou du contrôle sans matrice dans le(s) tube(s) d'échantillon(s). 7. Passez 2 fois au Vortex à pulsations le contrôle interne et centrifugez brièvement pour recueillir le contenu dans le fond

du tube. 8. Pipettez 5 µL d'IC vers chaque échantillon et tous les puits de contrôles. Changez d'embout entre les échantillons. 9. Chargez le(s) puits d'échantillons, les nouveaux matériels jetables d'aspiration et réactifs dans l'appareil easyMAG™

conformément aux instructions du manuel de l'utilisateur. 10. Démarrez la lyse intégrée et incubez les échantillons lysés pendant 10 minutes avant d'ajouter le mélange de silice

magnétique. 11. Au cours de la période d'incubation de la lyse, préparez le mélange de silice magnétique. Mélangez la silice et diluez

dans de l'eau sans nucléase en ajoutant 1 partie de silice magnétique à 1 partie d'eau sans nucléase (par exemple, 540 µL de silice magnétique + 540 µL d'eau sans nucléase). Préparez à peine 135 µL de mélange de silice magnétique par échantillon.

12. Pour transférer le mélange de silice dans les plaques de puits ELISA, mélangez la silice magnétique et utilisez 1 embout ainsi que le mode de fonctionnement P2 de la pipette Biohit. Appuyez sur Start [Démarrer] pour aspirer 1 050 µL du mélange de silice magnétique et appuyez de nouveau sur Start [Démarrer] pour renvoyer le premier tirage dans le tube de mélange de la silice. Appuyez sur Start [Démarrer] pour distribuer 125 µL du mélange de silice magnétique dans les

8 puits individuels de la plaque ELISA. Répétez selon le besoin pour des plaques ELISA supplémentaires. 13. Après les 10 minutes d'incubation de la lyse, utilisez 8 embouts (par plaque ELISA) et le mode de fonctionnement P3 de

la pipette Biohit pour transférer 100 µL du mélange de silice magnétique avec chaque échantillon dans le puits d'échantillon. Placez les embouts dans les puits des plaques ELISA et appuyez sur Start [Démarrer] pour mélanger et

aspirer le mélange de silice magnétique. 14. Transférez le mélange de silice magnétique dans le puits d'échantillon approprié et placez les embouts de pipette dans

les échantillons, en dessous du niveau liquide. Appuyez sur Start [Démarrer] pour aspirer, distribuer et mélanger (x3) la

silice magnétique et les échantillons. Assurez-vous que les embouts de pipette restent en dessous du niveau liquide afin d'assurer un mélange correct.

15. Répétez les étapes 13 et 14 pour des puits d'échantillons supplémentaires. 16. Après avoir ajouté le mélange de silice magnétique dans tous les échantillons, commencez la série d'extraction. 17. Lorsque la série est terminée, retirez le(s) puits d'échantillon(s) de l'appareil. Si les échantillons ne sont pas destinés à

une utilisation immédiate, transférez-les dans des tubes individuels pour limiter au minimum le risque de voir retomber la silice magnétique dans l'échantillon. Conservez l'ADN à une température de 2 à 8 °C avant utilisation. Une conservation prolongée à cette température des échantillons extraits n'est pas recommandée. Gardez les échantillons d'ADN extrait sur un bloc réfrigérant pendant le chargement du disque.

C. CONFIGURATION DE L'APPAREIL DE PCR TEMPS-RÉEL

1. Reportez-vous au Guide de l'utilisateur de l'Integrated Cycler pour plus de détails sur la façon de configurer le logiciel Integrated Cycler Studio pour ajouter une définition de tests, régler une série de tests et analyser les séries sur l'Integrated Cycler.

Remarque : Une courbe de référence valide (série de tests de calibrage) doit être définie avant d'effectuer une série de tests de prédiction.

D. ZONE DE PRÉPARATION DU RÉACTIF

Zone dédiée à la préparation du mélange réactif du test SimplexaTM

EBV.

1. Décongelez le mélange d'amorces et le mélange maître à température ambiante (entre environ 18 °C et 25 °C). Chaque flacon de composant du kit contient suffisamment de réactifs pour 50 réactions. Avant chaque utilisation, mélangez doucement les composants du kit mélange d'amorces et mélange maître par inversion (6 à 8 fois) et centrifugez brièvement pour recueillir le contenu dans le fond du tube.

2. Préparez le volume requis du mélange réactif dans un tube de microcentrifugeuse en polypropylène de taille appropriée par pipetage du volume de chaque composant comme indiqué dans le tableau ci-dessous.

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Volumes de mélange réactif

Réactif Mélange réactif

Volume / 1 réaction Mélange réactif

Volume / 10 réactions

Simplexa™ Master Mix 4,0 µL 40 µL

Simplexa™ EBV Primer Mix 1,0 µL 10 µL

Volume total 5,0 µL 50 µL

3. Mélangez doucement le mélange réactif par inversion ou par pipetage (8 à 10 fois). 4. Centrifugez brièvement pour recueillir le contenu dans le fond du tube. 5. Poursuivez le paramétrage de la PCR. 6. Utilisez le mélange réactif dans l'heure qui suit sa préparation. Conservez le mélange réactif à une température de 2 à 8

°C si le paramétrage de la PCR ne doit pas être réalisé immédiatement après la préparation du mélange réactif.

E. ZONE D'AMPLIFICATION PAR PCR EN TEMPS RÉEL

Travaillez dans une zone dédiée à la préparation du Disque universel à 96 puits pour le test Simplexa™ EBV.

Reportez-vous au modèle de disposition du disque, à la section C, tout en effectuant la préparation suivante :

1. Ajoutez 5,0 µL du mélange réactif à chacun des puits. 2. Ajoutez 5,0 µL des contrôles positifs extraits dans les puits « HPC » et « LPC » du disque. 3. Ajoutez 5,0 µL de l'extrait de l'échantillon de patient dans le puits « S » approprié du disque. 4. Ajoutez 5,0 µL du contrôle sans matrice extrait dans le puits « NTC ». 5. Recouvrez le disque avec l'adhésif (laminage) de couverture pour disque universel. 6. Ouvrez le couvercle de l'Integrated Cycler. 7. Placez le disque universel scellé sur la platine. 8. Fermez délicatement le couvercle. 9. Cliquez sur Run [Exécuter]. 10. Cliquez sur Start [Démarrer].

F. ANALYSE DES DONNÉES :

1. Quand la série est terminée, cliquez sur Analyze [Analyser]. 2. Vérifiez chaque marqueur un par un, ou sélectionnez tous les marqueurs (canaux) en cochant la case située à côté de

chaque marqueur. 3. Appuyez sur le bouton Print Preview [Aperçu avant impression], en bas à droite, pour revoir un résumé des valeurs

prédictives. Cochez la case Include Graphs [Inclure des graphiques] pour revoir les points d'amplification. Pour inclure un rapport de calibrage associé à la série de tests de prédiction, sélectionnez la case Include Calibration Result [Inclure le résultat de l'étalonnage]. Faites défiler les pages en utilisant les flèches situées dans le coin supérieur

gauche de la fenêtre d'Aperçu avant impression. 4. Imprimez ou enregistrez le rapport si besoin. 5. Exportez les valeurs théoriques (prédites) si besoin.

CONTRÔLE DE QUALITÉ

Chaque laboratoire doit définir ses propres plages de contrôle de la qualité et la périodicité des tests de CQ en fonction des lois locales, règlements et bonnes pratiques de laboratoire standards applicables.

COMPTES-RENDUS DES RÉSULTATS

1. Validité de la série de tests

Déterminez si la série de tests est valide en passant en revue les résultats du contrôle interne (IC) et de l'EBV en examinant le contrôle positif bas (LPC), le contrôle positif haut (HPC), et le contrôle sans matrice (NTC). Ces trois contrôles doivent répondre aux critères d'acceptation pour qu'une série soit valide. Si une série de tests n'est pas valide, tous les échantillons de patients doivent alors être à nouveau testés.

Critères d'acceptation

Contrôle EBV ADN de contrôle d’extraction et d’amplification (IC)

No-Template Control (NTC) Non détecté Détecté

Low Positive Control (LPC) À l'intérieur de la valeur de tolérance sur

l'étiquette de lot spécifique Sans objet*

High Positive Control (HPC) À l'intérieur de la valeur de tolérance sur

l'étiquette de lot spécifique Sans objet*

Le contrôle sans matrice (NTC) satisfait les critères d'acceptation si l'EBV n'est « Pas détecté » alors que l'IC est « Détecté ». La détection d'EBV dans le contrôle sans matrice indique que les échantillons peuvent avoir été contaminés au cours de leur traitement.

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Le contrôle positif bas (LPC) satisfait les critères d'acceptation si l'EBV est « Détecté » dans le LPC à l'intérieur des

limites de tolérance (comme indiqué sur l'étiquette spécifique du lot) et l'IC devrait être « Détecté », mais cela n'est pas exigé.

Le contrôle positif haut (HPC) satisfait les critères d'acceptation si l'EBV est « Détecté » dans le HPC à l'intérieur des limites de tolérance (comme indiqué sur l'étiquette spécifique du lot) et l'IC devrait être « Détecté », mais cela n'est pas exigé.

2. Interprétation des résultats

Interprétation des résultats

Exemple Valeur EBV Valeur IC* Interprétation

1 Non détecté Détecté EBV non détecté

2 < 900 copies/mL S/O EBV détecté, en dessous du seuil inférieur de mesure (LLoQ : Lower Limit of Quantitation).

3 X copies/mL S/O EBV détecté à une concentration spécifique.

4 > 8,07 x 108 copies/mL S/O EBV détecté, au-dessus de la limite supérieure de dosage

(ULoQ : Upper Limit of Quantitation).

5 Non détecté Non détecté Non valide, recommencer l'extraction et le test.

3. Validité du résultat de l'échantillon Un échantillon est valide si l'une de ces conditions est satisfaite

1. EBV n'est pas Détecté et l'IC est Détecté.

2. EBV est Détecté. Il n'est pas nécessaire que l'IC soit détecté pour que les résultats de l'EBV soient positifs.

3. Les courbes d'amplification seront revues pour chaque résultat, en particulier quand un message « Data Quality » (Qualité des données) est transmis. Une courbe d'amplification valide présente une augmentation lisse et exponentielle. Se reporter au Manuel de l’opérateur pour les actions recommandées.

LIMITES

1. Les techniciens doivent être formés et avoir l'habitude des procédures de tests et de l'interprétation des résultats avant d'effectuer le test.

2. L'Integrated Cycler Studio de 3M conserve le dernier fichier valide d'étalonnage pour quantifier les échantillons inconnus de patients. Les normes de dosage et les échantillons de patients doivent être extraits en utilisant la même méthodologie d'extraction, faute de quoi vos résultats pourraient être erronés.

3. Lors du suivi d'un patient, la méthode d'extraction utilisée pour préparer la détermination de l'échantillon initial doit être

utilisée pour tous les tests ultérieurs.

4. Tous les résultats de ce test et des autres tests doivent être corrélés aux antécédents cliniques, aux données épidémiologiques et aux autres données à la disposition du clinicien évaluant le patient.

5. La prévalence de l’infection aura un impact sur la valeur prédictive du test.

6. Comme pour d'autres tests, des résultats négatifs n'éliminent pas la possibilité d'une infection par l'EBV.

7. Il peut y avoir des résultats faux négatifs lorsque l'organisme infectant présente des mutations, des insertions, des délétions ou des réarrangements de son génome ou lorsque le test est réalisé très tôt au cours de la maladie.

8. Des résultats faux négatifs peuvent survenir si la quantité d'organismes présents dans l'échantillon est insuffisante en raison d'un prélèvement, transport ou manipulation inadéquats.

9. Comme avec d'autres tests, des résultats faux positifs peuvent survenir. Dans certains cas, une répétition du test, ou le renouvellement du test avec un autre appareil peut être indiqué.

10. La performance de ce test n'a pas été établie pour son utilisation dans le cadre du dépistage des donneurs.

11. Les performances de ce test n'ont pas été établies avec des médicaments potentiellement interférents utilisés pour le traitement de la mononucléose infectieuse.

12. Ce test ne peut pas exclure la présence de maladies provoquées par d'autres agents pathogènes bactériens ou viraux.

CARACTÉRISTIQUES DES PERFORMANCES

COMPARAISON DE LA MÉTHODE

Un site d'étude interne a participé à l'étude de concordance clinique. Les résultats de référence ont été générés en utilisant un test développé en laboratoire (LDT) de haute performance. Un total de 56 échantillons de sang total ont été obtenus à partir d'un ensemble d'échantillons recueillis de façon prospective, envoyés au site pour la détection ou le dosage de l'EBV. Les échantillons ont été extraits en utilisant la méthode d'extraction MagNA Pure. Les échantillons inclus dans l'analyse se situaient dans la plage combinée de résultats publiables du test « LDT » et du test Simplexa™ EBV. L'analyse de régression Passing-Bablok a fourni une pente de 0,82 et un biais homogène de 0,44.

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REPRODUCTIBILITÉ

L'étude de reproductibilité a été effectuée sur deux systèmes, un opérateur par système, quatre réplicats de chaque échantillon de panel par série, deux séries par jour pendant cinq jours. Les échantillons du panel de reproductibilité étaient des échantillons préparés à partir de sang complet dans lesquels avaient été ajoutées différentes concentrations d'une souche d'EBV. Le panel contient les contrôles (NTC, HPC et LPC), un lot négatif (sang total non additionné), un lot faiblement additionné (à une concentration d'environ 2 à 4 fois le seuil de détection (LoD), un lot intermédiaire (environ 8 à 10 fois le seuil de détection) et un lot fortement additionné (plage supérieure du test). De plus, chaque niveau standard de dosage provenant d'un lot unique d'un ensemble (n = 5) de norme de dosage de l'EBV a été inclus dans le panel. Les résultats de reproductibilité pour chaque échantillon du panel sont présentés dans le tableau ci-dessous.

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Reproductibilité du test Simplexa™ EBV

Écart type

Nom de l'échantill

on

Concentration attendue

(copies/mL)

Moyenne géométrique (copies/mL)

Valeur log moyenne

(copies/mL)

Nb. de Résultats

mesurables

Entre

Instrument

Entre Jour

Entre Série

À l'intérieur de Série

Total

NTC 0 Non détecté Non détecté 0 Sans objet (S/O)

HPC 2,13 x 105 1,97 x 10

5 5,29 80 0,17 0.03 0.02 0.01 0.17

LPC 4,66 x 103 5,67 x 10

3 3,75 80 0,19 0.02 0.03 0.04 0.19

QS-1 3,61 x 108 3,66 x 10

8 8,56 80 0,21 0.07 0.00 0.22 0.32

QS-2 3,91 x 106 4,55 x 10

6 6,66 80 0,18 0.05 0.01 0.02 0.18

QS-3 4,02 x 104 5,01 x 10

4 4,70 80 0,21 0.03 0.01 0.02 0.21

QS-4 4,72 x 103 5,85 x 10

3 3,77 80 0,20 0.03 0.02 0.04 0.21

QS-5 1,03 x 103 1,42 X 10

3 3,15 49 0,12 0.00 0.01 0.11 0.16

Lot fortement additionné

1,0 x 107 1,55 x 10

8 8,19 67 0,25 0.13 0.13 0.05 0.31

Lot moyen 9,0 x 103 9,41 x 10

3 3,97 80 0,26 0.17 0.10 0.07 0.33

Lot faiblement additionné

3,6 x 103 4,23 x 10

3 3,63 78 0,35 0.13 0.08 0.07 0.39

Lot négatif 0 Non détecté Non détecté 0 (S/O)

SENSIBILITÉ ANALYTIQUE/LIMITE DE DÉTECTION

Le seuil de détection (LoD, « Limit of Detection ») a été calculé en créant artificiellement des échantillons en ajoutant des quantités connues d'une souche d'EBV à une matrice de sang total négatif, recueilli en clinique. Le panel comportait des échantillons négatifs (matrice non enrichie) et des échantillons avec différentes concentrations, dilués en série, autour du seuil de détection approximatif. Vingt-quatre (24) réplicats provenant de trois (3) séries différentes d'extraction et PCR pour chaque niveau ont été analysés avec l'analyse Probit pour déterminer quelle était la plus faible concentration pouvant être exactement détectée avec une probabilité de 95 %. Le protocole pour déterminer le LoD a été exécuté pour chaque type d'échantillon préparé en utilisant chacune des deux méthodes d'extraction. Les valeurs individuelles de LoD sont indiquées dans le tableau ci-dessous. Sur la base du LoD le plus élevé mesuré parmi tous les types d'échantillons et méthodes d'extraction, le LoD pour EBV a été mesuré à 900 copies/ml..

Sang total

MagNA Pure easyMag

copies/ml 900 698

LINÉARITÉ

La linéarité a été déterminée en utilisant des échantillons composés par l’ajout de quantités connues d'une souche d’EBV à des matrices de plasma et d'urine négatives, recueillies en clinique. Le panel comprenait 10 lots contenant un nombre connu de copies, couvrant la plage linéaire attendue. Parmi ces lots, au moins 3 concentrations étaient proches de la limite inférieure de quantification (LLOQ), 2 proches de la limite supérieure de quantification (ULOQ) et les lots restants étaient répartis à peu près équitablement entre la LLOQ et la ULOQ. Chaque échantillon a été analysé de façon aléatoire, avec au moins 3 réplicats. Le protocole pour déterminer la linéarité a été exécuté pour chaque type d'échantillon préparé en utilisant chacune des deux méthodes d'extraction. Les valeurs individuelles de plages linéaires mesurées sont indiquées dans le tableau ci-dessous.

Sang total

MagNA Pure easyMag

copies/ml 900 à 8,07×108 900 à 8,07×10

8

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ZONE DE VALEURS REPORTABLES

Les deux méthodes d'extraction étaient linéaires jusqu'à 8,07 × 108 copies/ml. La plage rapportable du test était basée sur la

méthode d’extraction avec la valeur la plus élevée pour la limite inférieure de la plage linéaire. Les échantillons inférieurs à la plage linéaire seront rapportés comme ayant < 900 copies/mL, les échantillons supérieurs à la plage linéaire seront rapportés comme ayant > 8,07 x 10

8 copies/mL.

RÉACTIVITÉ ANALYTIQUE/ RÉACTIVITÉ CROISÉE

Les études ont indiqué que les amorces étaient spécifiques de l'EBV et qu'il n'y avait pas de réaction croisée avec d'autres virus ou bactéries, y compris VHB, VHC, VIH-1, VIH-2, HSV-1, HSV-2, HHV-6, HHV-7, HHV-8, HTLV-1, JCV, Parvovirus, Toxoplasma gondii, VZV, CMV, et BKV. En outre, les bases de données de séquences d'acide nucléique ont indiqué que les amorces étaient spécifiques de l'EBV et ne présentaient pas d'homologie significative avec d'autres agents pathogènes ou de l'ADN humain.

INTERFÉRENCE

La performance de ce test n'a pas été évaluée avec des substances potentiellement interférentes. Le processus d'extraction automatisée de l'acide nucléique, au moyen du système MagNA Pure ou du NucliSENS easyMAG, élimine efficacement les impuretés des échantillons pendant l'isolement et les lavages des acides nucléiques au cours du processus d'extraction. Les contrôles internes alertent l’opérateur d'une possible inhibition de la PCR ; si toutes les cibles et le contrôle interne ne sont pas détectés, le test n'est pas valide.

CONTAMINATION PAR TRANSFERT

L'amplification d'une contamination par transfert a été évaluée pour l'instrument et l'Universal Disc au moyen d'autres tests. Les études ont recherché la présence de contamination dans des échantillons négatifs hauts. L'étude a été conçue en plaçant l'un à côté de l'autre, en alternance, un échantillon fortement positif et un échantillon fortement négatif sur chaque disque. L'effet de contamination par transfert a été évalué en comparant le taux observé de négatifs pour les échantillons hauts négatifs avec le taux théorique attendu dans les conditions de reproductibilité normale. Aucun effet de contamination par transfert n'a été observé au cours des tests précédents.

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RÉFÉRENCES

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2. Weiss LM, Movahed LA, Warnke RA, et al. Detection of Epstein-Barr virus genomes in Reed-Sternberg cells of Hodgkin’s disease. N Engl J Med 1989;320:502-6.

3. Herbert H, Steinbecher E, Niedobitek G, et al. Distribution and phenotype of Epstein-Barr virus-harboring cells in Hodgkin’s disease. Blood 1992; 80:484-91.

4. Khan G, Norton AJ, Slavin G. Epstein-Barr virus in Hodgkin’s disease. Relation to age and subtype. Cancer 1993; 1:3124-9. 5. Young LS, Dawson CW, Clark D, et al. Epstein-Barr virus gene expression in nasopharyngeal carcinoma. J Gen Virol 1988; 69:1051-65. 6. Hanto DW, Frizzera G, Gajl-Peczalska KJ, et al. The Epstein-Barr virus in the pathogenesis of post-transplant lymphoma. Transplant Proc

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Pathol 1992; 98:312-8. 9. Cinque P, Brytting M, Vago L, et al. Epstein-Barr virus DNA in cerebrospinal fluid from patients with AIDS-related primary lymphoma of the

central nervous system. Lancet 1993; 342:398-401. 10. Arribas JR, Clifford DB, Fichtenbaum CJ, et al. Detection of Epstein-Barr virus DNA in cerebrospinal fluid for diagnosis of AIDS-related

central nervous system lymphoma. J Clin Microbiol 1995; 33:1580-1583. 11. Gaillard F, Mechinaud-Lacroix F, Papin S, et al. Primary Epstein-Barr virus infection with clonal T-cell lymphoproliferation. Am J Clin Pathol

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88. 14. Au W-Y et al, Quantification of circulating Epstein-Barr virus (EBV) DNA in the diagnosis and monitoring of natural killer cell and EBV-positive

lymphomas in immunocompetent patients. Blood, 1 July 2004 _ Volume 104, Number 1; 243-249 15. Cornelissen J, Molecular monitoring of EBV-positive lymphoma. Blood, 1 July 2004 _ Volume 104, Number 1; 9 16. NCCLS H18-A2. Procedures for the Handling and Processing of Blood Specimens; Approved Guideline. 2nd Ed. (1999). 17. CDC-NIH Manual. (1999) Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. 4th ed. And National Committee for Clinical Laboratory

Standards (NCCLS). Protection of Laboratory Workers from Instruments, Biohazards and Infectious Disease Transmitted by Blood, Body Fluids and Tissue (NCCLS M29-A).

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Rév. G Date de rédaction: 24 mars 2017

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