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PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
MAESTRÍA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
CULTIVO DE CÉLULAS TRONCALES DE MÉDULA ÓSEA DE RATA (rCTMO)
EN MATRICES DE COLÁGENO TIPO I, PARA SU USO EN
PROTOCOLOS DE REGENERACIÓN DE TEJIDOS
LUIS FELIPE TANGARIFE TOBÓN
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito para optar al título de
Magister en Ciencias Biológicas
MAESTRÍA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
Bogotá D. C., Julio de 2014
1
NOTA DE ADVERTENCIA
"La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus
alumnos en sus trabajos de tesis. Sólo velará por que no se publique nada
contrario al dogma y a la moral católica y porque las tesis no contengan ataques
personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar
la verdad y la justicia". Artículo 23 de la Resolución No13 de julio de 1946.
2
3
CULTIVO DE CÉLULAS TRONCALES DE MÉDULA ÓSEA DE RATA (rCTMO)
EN MATRICES DE COLÁGENO TIPO I, PARA SU USO EN
PROTOCOLOS DE REGENERACIÓN DE TEJIDOS
LUIS FELIPE TANGARIFE TOBÓN
______________________ _____________________________
Concepción Puerta B. Ph.D. Manuel Antonio Franco Cortés MD., Ph.D.
Decana Director de Posgrado
Facultad de Ciencias
4
DEDICATORIA
Quiero dedicar este trabajo a mi esposa Ángela y a mis hijos Samuel y Juan
Esteban, quiénes son el motor y el eje de mi quehacer diario.
A mis padres Sorany y Enrique, por su amor incondicional y su labor de
maestros en mí caminar.
A mis hermanas Natalia y Diana, mis compañeras de debates por la vida.
A mi sobrina Salomé, por su amor constante.
5
AGRADECIMIENTOS
A Dios, por su infinita bondad para conmigo y mi familia.
A mi esposa y mis hijos, por soportarme en todos los momentos que tuve que
ausentarme
A mis padres, hermanos y amigos, por su cariño, apoyo y ayuda incondicionales.
A la doctora Lorenza Jaramillo por su dirección y las incansables horas de
acompañamiento para la realización de este trabajo.
Al doctor Camilo Durán, por su compañía y apoyo durante el proceso de
elaboración de este proyecto.
A Lorenza Jaramillo y Camilo Durán, mis maestros y amigos.
A la doctora Nelly Roa, por su dedicación y asesoría durante el
desarrollo de este trabajo
A la doctora Margarita Cháves y las demás personas maravillosas del CIO
quiénes de una u otra forma estuvieron brindándome su ayuda
A la Técnica de la sala de experimentación Dora Bohorquez por su valiosa y
constante colaboración
A la Ingeniera Dery Corredor por su asesoría y su acompañamiento
A la Pontificia Universidad Javeriana por abrirme sus puertas y permitirme vivir
una valiosa experiencia en el mundo científico.
6
TABLA DE CONTENIDO
Pág.
INTRODUCCIÓN……………………………………………………………………… 14
1. MARCO TEÓRICO
1.1. GENERALIDADES DE LA INGENIERIA DE TEJIDOS………………….. 17
1.2. LAS CELULAS TRONCALES………………………………………………. 19
1.3. BIOMATERIALES SOPORTES……………………………………………... 30
2. OBJETIVOS………………………………………………………………………... 34
3. METODOLOGIA
3.1. Cultivo de células troncales de rata………………………………………… 35
3.1.1. Extracción de médula ósea…………………………………………… 35
3.1.2. Cultivo celular………………………………………………………..… 36
3.1.3. Inmunofenotipificación celular…………………………..…………… 36
3.2. Fabricación y caracterización de la matriz……………………………...…. 37
3.2.1. Preparación de la esponja de colágeno………………………..…… 37
3.2.2. Caracterización de la matriz……………………………………..…… 38
3.2.2.1. Análisis Infrarrojo. ………………………………..…………… 38
3.2.2.2. Análisis MEB. ……………………………………..…………… 38
3.2.2.3. Tamaño, forma, área e interconectividad de los poros……. 39
3.2.2.4. Porosidad……………………………..………………………… 39
3.2.2.5. Rugosidad de la superficie…………………………………… 39
3.3. Caracterización, siembra y cultivo celular en matrices in vitro……..…… 40
3.3.1. Siembra celular………………………………………………………… 40
3.3.2. Viabilidad celular y observación MEB………………….…………… 40
4. RESULTADOS
4.1. Cultivo de células troncales de rata………………………………………… 42
4.1.1. Inmunofenotipificación celular…………………………………..…… 43
4.2. Fabricación y caracterización de la matriz………………………….……… 51
4.2.1. Preparación de la esponja de colágeno………………..…………… 51
7
4.2.2. Caracterización de la matriz……………………..…………………… 52
4.2.2.1. Análisis Infrarrojo. ………………………………..…………… 52
4.2.2.2. Análisis MEB: Tamaño de los poros. ………….……….…… 53
4.2.2.3. Análisis MEB: Forma y área de los poros…...………….….. 56
4.2.2.4. Interconectividad de los poros……………….…………….… 57
4.2.2.5. Porosidad …………………….….…………………………..… 58
4.2.2.6. Rugosidad de la superficie…………………………………… 58
4.3. Caracterización, siembra y cultivo celular en matrices in vitro…..….…… 59
4.3.1. Siembra celular………………………………………………………… 59
4.3.2. Viabilidad celular y observación MEB……………………..………… 60
5. DISCUSIÓN……………………………………………………………...………… 63
6. CONCLUSIONES ………………………………………………………………… 73
7. RECOMENDACIONES…………………………………………….. ……………. 74
8. BIBLIOGRAFÍA………………………………..…………………………………… 75
9. ANEXOS
8
ÍNDICE DE TABLAS
Pag.
Tabla 1. Análisis de la expresión de los marcadores CD29 y CD90
con CD71 y CD106 por pasaje……………………………………..…… 49
Tabla 2. Parámetros estadísticos de la determinación del perímetro
de poro de la matriz de colágeno………………………………………… 54
Tabla 3. Frecuencia de ocurrencia y desviación estándar del perímetro
de poro en las esponjas de colágeno tipo I……………………………… 54
Tabla 4. Parámetros estadísticos de la determinación del diámetro de Feret
de los poros de la matriz de colágeno…………………………………… 55
Tabla 5. Frecuencia de ocurrencia y desviación estándar del diámetro
de Feret de los poros en las esponjas de colágeno tipo I……………… 55
Tabla 6. Parámetros estadísticos de la determinación del área de poro
de la matriz de colágeno…………………………………………………... 56
Tabla 7. Frecuencia de ocurrencia y desviación estándar de circularidad
de poro en las esponjas de colágeno tipo I……………………………... 56
9
ÍNDICE DE FIGURAS
Pag.
Figura 1. Evaluación microscópica de la morfología de cultivos de
células derivadas de médula ósea…………………………………... 42
Figura 2. Pureza de la selección negativa de células CD45……………………... 43
Figura 3. Expresión comparativa de CD45+ en células de cultivo Primario
y primer pasaje…………………………………………..……………... 44
Figura 4. Expresión comparativa de CD45+ en células de cultivo en primer
pasaje, purificadas separación inmunomagnética………………… 45
Figura 5. Expresión comparativa de CD45+ en células de cultivo en segundo
y tercer pasaje…………………………………………………………. 46
Figura 6. Caracterización fenotípica de células Mesenquimales de rata en
diferentes pasajes de cultivo por Citometría de flujo……………… 47
Figura 7. Análisis de la expresión de CD71, CD106, CD29 y CD90 en
células MSC de rata…………………………………………………… 48
Figura 8. Proliferación y Viabilidad de células MSC de rata……………………… 50
Figura 9. Microfotografías MEB de esponjas de colágeno tipo I sin células…… 51
Figura 10. Espectro de ATR-FTIR de una muestra de colágeno tipo I extraído
de cola de rata………………………………………………………….. 52
Figura 11. Interconectividad de poros en la esponja de colágeno tipo I mostrada
mediante microfotografías MEB……………………………………… 57
Figura 12. Análisis de la rugosidad en las paredes de la matriz de colágeno…. 58
Figura 13. Cultivo celular tridimensional de rCTMO en esponjas de colágeno... 59
Figura 14. Microfotografías MEB de la proliferación de rCTMO a diferentes
tiempos de cultivo……………………………………………………… 61
Figura 15. Análisis de viabilidad celular mediante inmunofluorescencia……….. 62
10
ÍNDICE DE ANEXOS
ANEXO 1
Protocolo de obtención de cultivos primarios de médula ósea
ANEXO 2
Protocolo de separación de rCTMO por inmunomagnetismo
ANEXO 3
Preparación de colágeno tipo I de colas de rata Lewis
ANEXO 4
Protocolo de siembra de rCTMO en esponjas de colágeno tipo I
ANEXO 5
Protocolo de fijación de esponjas de colágeno sembradas con rCTMO
11
EQUIPOS Y REACTIVOS
EQUIPO REFERENCIA
Incubadora Thermo Scientific, Napco 5420-0
Citómetro Becton Dickinson FACSCANTO II
Liofilizador Labconco, Cat 77500-00;
Bomba de vacío Labconco model 117
Ultracentrífuga Beckman coulter, Optima L-70
Membrana de diálisis Spectrum labs, 133478
UV de 254 nm Labconco, 37450-01
Espectrómetro Thermo Scientific, Nicolet is10
Metalizador LabTeam, Denton Vaccum, Desk IV
Microscopio electrónico JEOL, JSM 6490-LV
Microscopio invertido de campo claro Carl Zeiss Axiovert 25C,
Microscopio de fluorescencia Nikon, Eclipse Ni-U
Secador de punto crítico Tousimis, samdri-795
Columna de separación magnética Biotech, LS-MACS Columns 120-000-472
SUSTANCIA REFERENCIA
Medio de cultivo (α-MEM) Gibco 12000-014
Marcador PE-RCD45 Monoclonal 554878, Clone OX-1
Buffer de Fosfato Salino (PBS) Sigma, P-3813
Acetona Sigma, 320110
Isopropanol Mallinckrodt chemicals, 3032-06
Ácido acético Merck, 1.00063.2500
NaOH Sigma, 221465
Hidrogel PEGDA Nektar Therapeutics, MW 3400
Kit viabilidad/citotoxicidad LIVE/DEAD® Molecular Probes 03224
Glicerol Merck, 104095
Glutaraldehído 2,5% Sigma, G5882
Etanol Merck, 1.00983.2500
tripsina y EDTA Sigma, T-4049
Nota: En todos los casos en que se menciona el medio de cultivo se refiere al medio α-MEM,
suplementado al 10% con suero fetal bovino (Gibco 16000-044), con una solución comercial (Gibco
15240-062) al 1% de dos antibióticos (penicilina y estreptomicina) y un antimicótico (anfotericina B),
con Glutamax I al 1% (Gibco 35050-061) y 2.2 g de bicarbonato de sodio (Merck 106329).
12
RESUMEN
La regeneración de tejidos ha sido motivo de estudio durante los últimos años,
como una alternativa más adecuada que las tradicionales, para el remplazo de los
tejidos perdidos; para su avance y desarrollo es de especial importancia el estudio
de materiales que permitan su uso como matrices guías del crecimiento celular. La
búsqueda de biomateriales con características estructurales adecuadas es objeto
de intensa investigación a nivel mundial. El objetivo del presente estudio es
determinar si una matriz de colágeno tipo I en forma de esponja, permite el
establecimiento de un microambiente tridimensional que promueva la proliferación
de células troncales derivadas de médula ósea de ratas (rCTMO), para usarla en
protocolos de regeneración de tejidos. La matriz se obtiene a partir de un
procedimiento de extracción de colágeno tipo I de tendones de colas de ratas y en
ella se siembran rCTMO, cuyo inmunofenotipo ha sido previamente caracterizado
mediante citometría de flujo, estas se mantienen en condiciones de cultivo celular
por varios periodos, al cabo de los cuales por medio de microscopía electrónica de
barrido (MEB) y microscopia de fluorescencia se evalúa el crecimiento celular en
las esponjas de colágeno tipo I sembradas; además se evalúa la pureza de la
solución de colágeno extraída mediante espectroscopia infrarroja en modo de
reflectancia total atenuada (ATR-FITR). Los resultados muestran que las esponjas
de colágeno permiten el establecimiento de un microambiente adecuado para la
proliferación de rCTMO.
Palabras clave: regeneración de tejidos, células troncales de rata, biomateriales,
colágeno tipo I.
13
ABSTRACT
In recent years tissue regeneration has been widely investigated and is now
considered a more appropriate alternative for the replacement of lost tissues when
compared to traditional protocols. Intense worldwide research in biomaterials with
appropriate structural features that can be used as scaffolds or matrices favoring
cell growth is particularly important for the advancement and development of this
discipline. The purpose of this study is to determine whether a type I collagen
sponge matrix allows the formation of a three dimensional microenvironment that
promotes proliferation of stem cells derived from rat bone marrow (rCTMO), to be
used in tissue regeneration protocols. Type I collagen sponge matrix is obtained
by means of a extraction process from rat’s tails tendons, and rCTMO whose
immunophenotype has been previously characterized by flow cytometry are
seeded therein and maintained under cell culture conditions of for several periods.
The pureness of the extracted collagen solution is assessed by attenuated total
reflectance Fourier transform infrared spectroscopy (ATR-FTIR), and cell
proliferation within the type I collagen sponge is evaluated by means of scanning
electron microscopy (SEM) and fluorescence microscopy. The results show that
collagen sponges allow the establishment of a suitable microenvironment for the
proliferation of rCTMO.
Keywords: tissue regeneration, rat stem cells, biomaterials, collagen
14
INTRODUCCIÓN
Una condición innata del ser humano es la vulnerabilidad a padecer
enfermedades, las cuáles deterioran su calidad de vida bien sea porque son
incurables o porque afectan directamente su bienestar, las enfermedades
asociadas a la salud oral no son ajenas a este grupo, ya que si bien los dientes no
son vitales para vivir, su detrimento si puede afectar la calidad de vida de los
pacientes. Muchas de estas enfermedades comprometen tejidos que pueden
presentar daños parciales o totales, en este caso, son atendidas reemplazando
dicho tejido por uno artificial que simule sus funciones. Actualmente se ha
avanzado en la regeneración de diferentes tejidos del cuerpo, entre éstos
podemos citar, la recuperación de tejidos epidérmicos en personas con
quemaduras u otros accidentes, también la regeneración de huesos o tejidos
calcificados perdidos por traumas y la regeneración total o parcial de órganos
como el hígado, los riñones y la retina. Los tejidos artificiales utilizados en la
actualidad no pueden reproducir todas las funciones de los tejidos naturales,
adicionalmente, algunos de éstos no se integran con los tejidos del huésped
resultando en un problema en el momento de asumir un tratamiento (Chapekar,
2000).
La pérdida de dientes generalmente es producida por enfermedades orales como
la caries dental y la enfermedad periodontal, además puede producirse por
traumas, desórdenes genéticos y el envejecimiento; estos factores pueden llevar a
un padecimiento físico y mental que disminuye en gran medida la calidad de vida
de los individuos afectados (Kim y Amar, 2006). Los profesionales de la
odontología, corrigen estos problemas a través del uso de materiales metálicos,
cerámicas y resinas (Ferreira y col., 2007). Sin embargo, en muchas ocasiones,
estos materiales han generado complicaciones para los pacientes, entre las que
se encuentran, la incomodidad para la masticación, el desplazamiento de la
prótesis al hablar, el cariado de los dientes contiguos al tratado, un bajo rango en
el tiempo de uso, la pérdida del ligamento periodontal y los rechazos
inmunológicos al material usado; por lo tanto, los investigadores han enfocado sus
esfuerzos en encontrar soluciones alternativas que puedan reducir o eliminar estos
problemas. En la actualidad el avance en el campo de la rehabilitación oral y la
implantología ha permitido la corrección de algunos de estos problemas, sin
embargo, persisten algunos como la durabilidad limitada y el rechazo
15
inmunológico, para lo cual se han orientado esfuerzos hacia el uso de terapias con
células, bajo los principios de la Ingeniería de tejidos (IT).
La Ingeniería de tejidos, es un campo emergente que se ha convertido en la
alternativa actual más apropiada para abordar estas complicaciones, el objetivo de
esta disciplina es obtener tejidos vivos que puedan reemplazar estructuras
perdidas o dañadas (Atala, 2004; Syková y col., 2006). En esencia esta disciplina
consiste en inducir la formación de un nuevo tejido vivo funcional mediante la
utilización de un soporte en el que se siembran células madre, que pueden
provenir del propio paciente, reduciendo de esta manera los problemas de rechazo
inmunológico (Arosarena, 2005). Para lograrlo se construyen modelos
equivalentes a órganos o tejidos, en los que es necesario que las células se
organicen y se comporten como sí formaran parte del tejido original y conseguir
así la reconstrucción final deseada.
Los soportes, andamios, matrices o estructuras tridimensionales (3D),
desempeñan un papel importante en la IT, ya que regulan la adhesión, la
proliferación, la migración y la diferenciación celular mediante sus propiedades
biológicas y su arquitectura contribuye a la difusión de nutrientes y metabolitos.
Para obtener una estructura 3D que funcione como análogo de la matriz
extracelular, es necesario que el material sea biocompatible, biodegradable y
funcional con las células, además debe poseer características estructurales que
permitan el transporte de sustancias. Entre estos biomateriales naturales o
sintéticos, el colágeno ha recibido gran interés, ya que es la proteína estructural
más abundante e importante de la matriz extracelular y en diversos estudios de
regeneración se ha demostrado que el colágeno tiene un papel activo en la
adhesión y migración celular (Sumita y col., 2006).
Otro componente importante en la IT son las células a utilizar, actualmente las
más usadas son las células madre o células troncales (Shilpa y col., 2013), que se
caracterizan por ser indiferenciadas, tener capacidad de autorenovarse y ante
determinadas señales, especializarse para realizar una función concreta (Aranda y
col., 2009). Las células troncales se clasifican en dos grandes grupos,
embrionarias y adultas; la diferencia principal entre ambas radica en que las
células embrionarias tienen mayor capacidad de proliferación y diferenciación,
aunque su uso sigue siendo motivo de debate ético dado su origen, lo que a su
vez las hace menos disponibles. Las células embrionarias son totipotenciales y
pluripotenciales, lo cual les permite diferenciarse y desarrollar tejidos de cualquiera
de las tres capas embrionarias. Las células adultas son pluripotenciales,
16
multipotenciales y unipotenciales, esto es, pueden dar origen a tejidos
relacionados de la misma o de otra capa germinativa (Rojas y Meruane, 2012) y
se han obtenido principalmente de sangre periférica, de tejido nervioso, de tejido
adiposo y de la médula ósea; de esta última, se pueden separar dos tipos de
células, las hematopoyéticas y las mesenquimales (Avital y col., 2001).
En el presente estudio se buscó implementar elementos básicos de la IT, para
obtener el desarrollo de un cultivo tridimensional con el fin de usarlo en protocolos
de regeneración de tejidos. El primer paso fue analizar el crecimiento in vitro en
cultivo bidimensional de células troncales derivadas de la médula ósea de ratas,
seguido de su traslado a una matriz de colágeno tipo I, elaborada a partir de los
tendones de la cola de ratas y de su evaluación.
17
MARCO TEÓRICO
1. GENERALIDADES DE LA INGENIERIA DE TEJIDOS
La necesidad de mejorar los tratamientos clínicos actuales basados en terapias
reparadoras ha motivado la investigación en ingeniería de tejidos (IT), una nueva
disciplina que ha surgido hacia el final del siglo XX y que se ha convertido en una
alternativa potencial para el trasplante de órganos. Aunque la definición que ha
sido más aceptada es la de Langer y Vacanti (Khademhosseini y col., 2009), dos
investigadores pioneros en este campo, que la definieron como “la aplicación de
principios y métodos de la ingeniería y las ciencias biológicas para el desarrollo de
sustitutos biológicos que permitan restaurar, mejorar o mantener la función de un
órgano o tejido”. También es posible encontrar aproximaciones desde una
perspectiva tal vez más orientada a la medicina regenerativa, como en el caso de
la definición dada por Williams (2009) en la cual la IT es "la creación o formación
de tejido nuevo para la reconstrucción terapéutica de un órgano o tejido, por la
estimulación intencionada y controlada de un tipo de células especificas a través
de una combinación sistemática de señales moleculares y mecánicas"; con la
aspiración de entender el origen y funcionamiento de esta disciplina es favorable
recordar que ella se nutre con los conocimientos de algunas ciencias y disciplinas
como la medicina, la biología, la química, la ingeniería, la física, la ciencia de los
materiales, entre otras. Así, mediante los aportes fundamentales del trabajo
interdisciplinario, la ingeniería de tejidos está ofreciendo novedosas estrategias de
implementación de sustitutos biológicos en distintas especialidades de la
medicina. Avances científicos importantes en el campo de los biomateriales, las
células troncales, los factores de crecimiento, los factores de diferenciación y el
conocimiento del microambiente tisular, han generado la posibilidad de “fabricar”
tejidos en el laboratorio, mediante la combinación de matrices extracelulares
(scaffolds en inglés), células y factores bioquímicos y físico-químicos
(Khademhosseini y col., 2006).
En resumen, se considera la IT como un campo interdisciplinar que involucra la
comprensión de la biología celular, la ciencia de los materiales y la ingeniería de
reacción, con el objetivo de crear tejidos y órganos nuevos de aplicación clínica; la
IT busca fundamentalmente promover un ambiente que permita la integración y
diferenciación celular y con ello el desarrollo de tejidos nuevos; este desarrollo se
logra a partir de un pool de células, que en muchas ocasiones pueden provenir de
18
los mismos pacientes con el fin de controlar la reacción inmunológica y lograr una
mayor compatibilidad además de obtener una fuente disponible de células con
relativa facilidad (Arosarena, 2005). Aparte de estos atributos, la IT puede
proporcionar un recurso estable de tejido con determinadas características para
uso in vitro por los investigadores en diferentes líneas (Nerem, 2007).
La medicina regenerativa es una especialidad de la ingeniería de tejidos que
busca el desarrollo de terapias novedosas, capaces de inducir la regeneración de
un órgano o tejido, basadas en el uso de células que a su vez están influenciadas
por el microambiente que las recibe (Wagers, 2012). Gracias al avance en los
diversos componentes que integran la IT, este tipo de medicina se ha desarrollado
rápidamente durante la última década, abriendo además un nuevo camino que
sirva de respuesta a una de las problemáticas actuales respecto al trasplante de
órganos y tejidos, como lo es la disponibilidad de dichos órganos o la pérdida de
pacientes ocasionada por la falta de donantes (Schwartz y col., 2012). Uno de los
componentes fundamentales de esta medicina es el uso de células y entre ellas
las células madre o células troncales han llamado la atención considerablemente,
ya que tienen la capacidad única para diferenciarse en el linaje celular deseado al
mismo tiempo que poseen la capacidad de autorrenovarse. Por ejemplo, las
células troncales han sido ampliamente estudiadas para reparar tejidos
defectuosos o dañados, tales como el cartílago (Johnson y col., 2012), corazón
(Leri y Anversa, 2013) y los tejidos neuronales (Wallingford y col., 2013). Otros
estudios, revelan que aparte de los trasplantes de órganos, los linajes celulares
específicos derivados de células troncales, también proporcionan fuentes de
células que pueden ser utilizadas con alto grado de confianza, dadas sus
características y comportamientos, en el descubrimiento y desarrollo de fármacos,
por ejemplo Hannan y col. (2013), dirigió la diferenciación de células troncales
pluripotentes humanas hacia una población homogénea de células parecidas a los
hepatocitos que incluso expresaron genes de una manera cronológica similar a la
descrita durante el desarrollo hepático in vivo. Sin embargo, aunque se han
obtenido logros importantes en la regeneración de ciertos órganos, es necesario
desarrollar investigaciones en las que se obtengan células troncales
indiferenciadas susceptibles de diferenciación en linajes celulares específicos.
Las razones expuestas anteriormente son algunos de los ejemplos por los cuáles
las células troncales han adquirido gran importancia en el desarrollo de terapias
regeneradoras y varios grupos de investigación a nivel mundial están avanzando
en su caracterización y en la descripción de los mecanismos por los cuales ellas
funcionan.
19
2. CELULAS TRONCALES
El término de células troncales se propuso a finales del siglo XIX en el contexto de
dos cuestiones fundamentales en la embriología: la continuidad del plasma
germinal y el origen del sistema sanguíneo. Theodor Boveri y Valentin Häcker
utilizaron el término “célula troncal” para describir células comprometidas a dar
lugar a una línea germinal. Paralelamente, Artur Pappenheim, Alexander
Maximow, Ernst Neumann, y otros lo usaron para describir un posible progenitor
del sistema sanguíneo (Ramalho-Santos y Willenbring, 2007).
Una célula troncal o célula madre, se define como una célula clonogénica, con un
amplio potencial de auto renovación (definida como la capacidad de generar al
menos una célula hija con características similares a la célula de origen,
manteniéndose al mismo tiempo en un estado indiferenciado), así como la elevada
capacidad de proliferación (posibilidad de la célula para dividirse sin cambiar su
fenotipo celular indiferenciado) y su potencial de diferenciación (potencial para
modificar el fenotipo de la célula de origen en distintos tipos celulares diferentes al
tejido embrionario original, como medula ósea, sangre periférica, cerebro, piel,
pulpa dental y ligamento periodontal, entre otros) (Aranda y col., 2009).
Las células troncales son células no diferenciadas que pueden dividirse
asimétricamente produciendo dos hijas, una idéntica a la original y la otra
diferenciada con un destino celular concreto; también se pueden dividir
simétricamente para aumentar la cantidad de ellas o para generar más células
diferenciadas que están involucradas en el formación y mantenimiento de tejidos
(Januschke y col., 2014). Esta peculiar estrategia de división les permite
renovarse, y producir a la vez grandes cantidades de tejido o regenerar aquellos
tejidos que han sido dañados. Cuando estas divisiones no se producen
correctamente se pueden generar tumores, por lo que el estudio de estos
procesos puede ser de gran ayuda para entender las bases moleculares de
algunas enfermedades (Hwang y Rose, 2010; Powell y col., 2010).
La biología, las propiedades, clasificación, fenotipos, mecanismos celulares y/o
moleculares, bioquímicos, de señalización y las probables aplicaciones
terapéuticas de las células troncales se han estudiado durante décadas.
Podemos clasificar las células troncales según su capacidad de proliferación y
diferenciación en (Ma y col., 2005, Prindull, 2005):
20
Totipotenciales: células que tienen el potencial de dar origen a un
organismo completo incluyendo el tejido germinal.
Pluripotenciales: células que pueden dar origen a células de las tres capas
germinativas: ectodermo, mesodermo y endodermo.
Multipotenciales: células que dan origen a tipos celulares de su misma capa
germinativa o de otra capa germinativa.
Oligopotenciales: células que dan origen a dos o más tipos celulares en un
tejido.
Unipotenciales: células que pueden dar origen a un único tipo celular.
Las células troncales totipotenciales son capaces de producir tejido embrionario y
extraembrionario; un óvulo fertilizado se acepta como una célula totipotencial que
tiene la capacidad de generar todas las células de todos los tejidos que forman
parte del embrión y aquellos que dan soporte al desarrollo del mismo dentro del
útero, como la placenta. Los mamíferos adultos (incluyendo al hombre) poseen
más de 200 tipos diferentes de células que proceden de la misma célula
totipotencial: el cigoto (Li y col., 2010).
Las células troncales pluripotenciales, poseen la habilidad de diferenciarse a
tejidos procedentes de cualquiera de las tres capas embrionarias, capaces de
producir todos los tipos celulares presentes en un organismo superior incluyendo
la línea germinal. Han sido aisladas de tres líneas celulares: células cancerosas
embrionarias, células embrionarias pluripotentes, y células embrionarias
germinales. Poseen varias características en común, entre ellas, algunos
marcadores moleculares como la isoenzima de la fosfatasa alcalina, un dominio
del factor de transcripción denominado Oct4, alta actividad de la telomerasa, y
varios marcadores de membrana reconocidos por anticuerpos monoclonales (Li y
col., 2010). Para que una célula troncal, pueda considerarse pluripotencial tiene
que cumplir tres condiciones: en primer lugar debe ser capaz de diferenciarse a
células especializadas procedentes de cualquier capa embrionaria; segundo,
demostrar la funcionalidad in vitro e in vivo de las células a las que se ha
diferenciado y finalmente, producir un asentamiento claro y persistente de estas
células en el tejido diana, tanto en presencia o ausencia de daño en los tejidos en
los cuales se injerta, algunos trabajos indican de manera bastante evidente la
posible existencia de células madre adultas pluripotenciales (Mathur y col., 2014).
21
Las células troncales multipotenciales, son capaces de diferenciarse a distintos
tipos celulares procedentes de la misma capa embrionaria. Son aquellas que
pueden dar origen a precursores relacionados solamente con una de las tres
capas embrionarias; por ejemplo, células troncales que dan origen a tejidos
derivados exclusivamente del endodermo como tejido pancreático o pulmonar
(Screven y col., 2014). Los diferentes tipos de troncales multipotenciales
identificados, con las características mencionadas anteriormente expresan
diferentes fenotipos, entre ellos están las células troncales de la pulpa dentaria
adulta (DPSCs), células madre del ligamento periodontal (PDLSCs), células
troncales de la pulpa dentaria de dientes deciduos exfoliados (SHEDs), células
troncales de la papila apical (SCAPs), células madre del folículo periapical
(PAFSCs), células troncales mesenquimatosas derivadas de tejido adiposo
(ADMSCs), células troncales hepáticas, entre otras, además se encuentran las
células hematopoyéticas (HSCs) y mesenquimales (MSCs) las cuales también
expresan pluripotencialidad (Gimeno y col., 2005; Peng y col., 2009; Inanç y Elçin,
2011; Mathur y col., 2014)
Las células troncales embrionarias tradicionalmente se han considerado como
células pluripotenciales. Pueden ser obtenidas a partir de las primeras etapas de
formación del embrión cuando el óvulo fecundado es una esfera compacta o
mórula (Li y col., 2010); siendo entonces precursores totipotenciales con
capacidad de proliferar indefinidamente in vitro. El primer reporte acerca del
aislamiento de células troncales embrionarias provenientes de blastocistos
humanos se hizo en 1994, cuando se determinó que estas células in vitro se
diferencian espontáneamente en estructuras multicelulares conocidas como
“cuerpos embrionarios”, que contienen elementos de las tres capas germinales a
partir de las cuales se pueden forman varios tipos de células como cardiomiocitos,
neuronas y progenitores hematopoyéticos entre otros (Ratajczak y col., 2014).
Las células troncales embrionarias (derivadas del blastocisto) y las células
embrionarias germinales (derivadas postimplantación del blastocisto) son similares
en muchos aspectos, ambos tipos de células son capaces de replicarse y dividirse
en cultivos por largos períodos de tiempo sin mostrar alteraciones cromosómicas,
además expresan una serie de marcadores característicos de progenitores
totipotenciales que facilitan su identificación; sin embargo, las células troncales
embrionarias derivadas del blastocisto y las células germinales, difieren del tejido
de donde provienen y de su comportamiento in vivo ya que las células troncales
embrionarias son capaces de generar teratomas mientras que las células
germinales humanas no (Ratajczak y col., 2014). La principal ventaja del uso de
las células troncales embrionarias en investigación es su habilidad de proliferar
22
indefinidamente ya que son capaces de generar una gran variedad de grupos
celulares, lo que permite que bajo ciertas condiciones puedan ser manipuladas in
vitro con el fin de producir precursores de un linaje específico y contribuir así al
tratamiento de enfermedades como la diabetes y el Parkinson; además, pueden
ser utilizadas para estudios sobre enfermedades producidas durante el desarrollo
embrionario y contribuir a identificar sus bases genéticas (Li y col., 2010). Sin
embargo, al tratarse de células muy indiferenciadas, éstas pueden inducir la
formación ciertas neoplasias como teratomas y las implicaciones éticas generadas
por su uso son un punto muy importante a tener en cuenta en la investigación
(Ratajczak y col., 2014).
Según el tejido de origen las células troncales también pueden ser adultas, que se
han caracterizado como multipotenciales. Sin embargo, algunos trabajos
publicados han demostrado que algunas células troncales adultas tienen una
potencialidad mayor de la esperada, existiendo células troncales adultas
pluripotenciales en algunos órganos adultos con capacidad de diferenciarse en
tejidos derivados de cualquiera de las capas embrionarias (Mathur y col., 2014).
Las células troncales adultas se pueden encontrar en la mayoría de los tejidos de
un individuo totalmente desarrollado como la médula ósea, el sistema neuronal, el
sistema gastrointestinal, el músculo esquelético, el músculo cardiaco, el hígado, el
páncreas y el pulmón. En un principio se pensó que estas células estaban
predeterminadas a diferenciarse a un tipo celular procedente de su mismo tejido
de origen o al menos de su misma capa embrionaria; sin embargo, esta idea ha
sido reevaluada por varios grupos de investigadores cuyos estudios sugieren que
las células madre adultas son capaces de diferenciarse funcionalmente a células
especializadas procedentes de capas embrionarias distintas a las de su origen;
incluso, algunos de estos grupos han sido capaces de probar la pluripotencialidad
de las células troncales adultas procedentes de la médula ósea o del sistema
nervioso central (Mathur y col., 2014). La “habilidad biológica”, propia de estas
células adultas, se fundamenta en la capacidad que tienen de alterar
drásticamente su fenotipo en respuesta a los cambios del microambiente donde se
desarrollan, y se le conoce en la actualidad como “plasticidad” (Baksh y col.,
2004). Tanto in vivo como in vitro, se ha obtenido evidencia que muestra que las
células troncales adultas, originadas en un tejido determinado, tienen la capacidad
de producir células con una expresión fenotípica característica de otros tejidos
cuando se transfieren a un microambiente diferente al original.
De una forma muy particular se ha prestado atención a la capacidad de las células
troncales adultas de la médula ósea de producir células con propiedades muy
similares a hepatocitos, neuronas y cardiomiocitos (Körbling y col., 2003). Las
23
células troncales adultas más estudiadas hasta el momento son las que se derivan
de la médula ósea; la médula ósea se encuentra en las cavidades central y axial
de los huesos largos, consiste en islas de tejidos hematopoyéticos y células
adiposas rodeadas de senos vasculares interceptados por el hueso trabecular.
Corresponde aproximadamente al 3% del peso total de ratas adultas y
aproximadamente un 5% en humanos; es el órgano hematopoyético más grande y
tejido linfático primario responsable de la producción de múltiples células. En
huesos largos, uno o más nutrientes pasan por los canales a través del hueso
cortical y entran a la cavidad medular; en huesos planos, la médula trabaja gracias
a muchos vasos de varios diámetros que entran a esta. Luego que están dentro, la
arteria se divide en dos canales; rama ascendente y descendente que viajan de
manera paralela a un eje largo desde la porción central de la médula ósea
(Schmitz y Hollinger, 2001). La inervación de la médula ósea está dada por
nervios mielinizados y no mielinizados que entran a través de los canales de
nutrientes. Luego para que ocurra la hematopoyesis debe estar en un medio
ambiente que sea capaz de reconocer y retener la células madres
hematopoyéticas y que provean los factores requeridos para ayudar a la
proliferación, diferenciación y maduración de estas células madres y sus linajes;
por lo tanto se ha encontrado que las MSC juegan un rol como organizadoras del
nicho de HSC in vivo (Mendez-Ferrer y col., 2010).
Se han identificado dos grupos celulares importantes en la médula ósea, las
células troncales mesenquimales (MSCs) y las células troncales hematopoyéticas
(HSCs). Las primeras se han identificado por poseer marcadores de superficie que
han permitido su aislamiento como SH2, SH3, CD29, CD44, CD71 y CD90 y no
expresan antígenos de superficie típicos de las células troncales hematopoyéticas
como el CD34 y CD45; además, pruebas recientes han demostrado que las
células troncales estromales son capaces de diferenciarse in vitro a diversos
linajes bajo ciertas condiciones físicas y de cultivo (Ahmed y col., 2006).
Las HSCs, son responsables de la renovación constante de las células
sanguíneas, es decir, de la producción de billones de nuevas células cada día
(Kunisaki y Frenette, 2014). Las células troncales hematopoyéticas aparecen en el
embrión entre la tercera y cuarta semana de gestación, éstas migran desde el
saco vitelino hasta el hígado y el bazo y por último llegan a la médula ósea a
través de la circulación fetal durante el segundo y tercer trimestre de gestación.
Han sido aisladas de sangre periférica y de médula ósea; tienen la capacidad de
autorrenovarse y diferenciarse en dos grupos de progenitores hematopoyéticos:
progenitor mieloide y progenitor linfoide, los cuales a su vez se diferencian hacia
linajes de células sanguíneas especializadas (Kunisaki y Frenette, 2014). El
24
proceso de movilización de las células troncales hematopoyéticas está
caracterizado por la migración y la tendencia selectiva de estas células para
retornar a la médula ósea. La capacidad de autorrenovación, proliferación y
diferenciación de estas células está regulada por un complejo mecanismo en el
cual se encuentran involucrados el microambiente medular, citoquinas
estimuladoras e inhibidoras, así como también las interacciones célula - célula y
célula - nicho. Estas interacciones están mediadas por moléculas de adhesión
celular las cuales se expresan en las células madre hematopoyéticas, células
endoteliales y células del estroma medular (Frenette y col., 2013).
Células troncales mesenquimales (MSCs)
Las células troncales mesenquimales (MSCs) son células multipotenciales y
pluripotentes que están presentes en la médula ósea adulta, pueden replicarse
como células indiferenciadas y tienen el potencial de diferenciarse a linajes de
tejidos mesenquimales incluyendo hueso, cartílago, tejido adiposo, tendón,
músculo, y estroma de médula ósea (Pittenger y col., 1999; Ulmer y col., 2010). Se
considera que las células troncales mesenquimales son una fuente potencial de
células regeneradoras, ya que han sido probadas en terapias para el tratamiento
de osteogénesis imperfecta en niños y diferentes estrategias de regeneración de
tejido óseo (Baksh y col., 2004). En los seres humanos generalmente se aíslan a
partir de médula ósea obtenida a partir de la cresta ilíaca de la pelvis (Pittenger y
col., 1999) y también de la médula de la tibia y el fémur, así como de columna
torácica y lumbar (Barry y Murphy, 2004). En ratas las MSC han sido
rutinariamente aisladas de la médula ósea tibio-femoral por su adherencia a las
superficies plásticas de los frascos de cultivo (Ahmed y col., 2006).
La utilización de MSCs con fines regenerativos y en enfermedades inmunológicas
va en aumento, ante lo cual es necesario citar los criterios de Gimble y col. (2007),
quien sugiere cualidades que debe tener una célula troncal para ser utilizada con
fines médicos, estas son:
1. Presencia en cantidades muy abundantes (millones a billones de células)
2. Aislables con procedimientos mínimamente invasivos.
3. Diferenciables en múltiples linajes celulares de manera regulable y
reproducible.
4. Transplantables en forma autóloga o alogénica.
5. Manipulables de acuerdo a las actuales Guías de Buena Práctica.
Una célula es identificada por consenso internacional como célula troncal o Stem
cell cuando se detecta la expresión de varios marcadores fenotípicos específicos
25
que reflejan la presencia (+) y/o ausencia (-) de antígenos característicos en esa(s)
célula(s) (Dominici y col., 2006). En efecto, estudios realizados en humanos han
demostrado que las MSCs se caracterizan por expresar marcadores positivos para
CD29, CD44, CD59, CD73, CD90, CD105, CD117 (c-kit), CD166 y STRO-1 y
negativos para CD11a, CD11b, CD14, CD33, CD34, CD28, CD45 (Martin-Rendon
y Watt, 2003). Estos criterios están claramente definidos para las MSCs humanas
y también se han investigado en MSCs derivadas de diferentes cepas de ratones;
sin embargo, pocos estudios han investigado las características de las MSCs de
rata (Barzilay y col., 2009). Adicionalmente, estos estudios describen el efecto de
la densidad de siembra en la tasa de proliferación, el efecto de la edad sobre el
rendimiento de las MSCs y la comparación de MSCs derivadas de diferentes
tejidos (Barzilay y col., 2009). Por lo tanto, algunos autores coinciden en que las
MSCs en ratas, se caracterizan por expresar de forma positiva los marcadores
CD90 y CD29 y de forma negativa el CD45 (Karaoz y col., 2009; Park y col.,
2013).
Nichos células troncales mesénquimales
Las célula troncales mesénquimales han sido aisladas y caracterizadas
principalmente de la médula ósea (CTMO), las cuales son capaces de
diferenciarse en varios linajes de células cuando se cultiva en condiciones
definidas in vitro, tales como osteogénico, condrogénico, adipogénico, miogénico y
linajes neurogénicos (Gronthos y col., 2003), característica manifestada también
en murinos (Anjos-Afonso y col., 2004). Debido a ciertas dificultades en la
obtención de las CTMO, incluyendo el dolor, la morbilidad y el número de células,
se han buscado fuentes alternativas entre las que se incluyen las células troncales
derivadas de tejido adiposo obtenido por lipectomía asistida por succión
(liposucción) (Mizuno y col., 2002) y células troncales de las poblaciones de
sangre del cordón umbilical (Mareschi y col., 2001). Estudios han revelado que
tanto las células mesenquimales de médula ósea, como las de tejido adiposo, y
las de la sangre del cordón umbilical son morfológicamente e
inmunofenotípicamente similares, pero no idénticas (Kern y col., 2006)
Las células troncales para uso en regeneración de tejidos dentales pueden
provenir de diversas fuentes, además de las ya mencionadas, entre ellas
encontramos, las células madre de Pulpa Dental (CMPD), las cuales pueden ser
inducidas in vitro para diferenciarse en células con fenotipo de odontoblastos,
caracterizado por cuerpos de células polarizadas y acumulación de nódulos
mineralizados (About y col. 2000;. Couble y col. 2000); las células troncales de
dientes deciduos exfoliados (CTDE o SHED en inglés) las cuales muestran
26
capacidad de diferenciación osteogénica y adipogénica, incluso expresan
fácilmente una variedad de marcadores de células neuronales si se estimulan con
medio neurogénicos (Miura y col., 2003); células troncales de papila apical (CTPA)
las cuales tienen la capacidad de experimentar diferenciación adipogénica
después de la inducción in vitro (Abe y col., 2007) Células troncales de ligamento
periodontal (CTLP), las cuales pueden diferenciarse en cualquiera de las células
formadoras de cemento o de hueso (osteoblastos) manteniendo la homeostasis
del tejido y la regeneración de tejido (Isaka y col., 2001) y las células precursoras
del folículo dental (CPFD), las cuales son células progenitoras que forman el
periodonto, es decir, cemento, ligamento periodontal y el hueso alveolar. Las
células precursoras se han aislado de los folículos dentales humanos de los
terceros molares. De manera similar a otras células troncales dentales, estas
células forman un bajo número de colonias clonogénicas adherentes cuando se
liberan del tejido después de la digestión enzimática (Morsczeck y col., 2005).
La plasticidad de las células troncales
El potencial de las células troncales para generar tejidos de diferentes capas
embrionarias podría facilitar el acceso a estas células con fines experimentales y
terapéuticos. Así, las células troncales del tejido de la epidermis que se
encuentran distribuidas a lo largo del órgano más extenso del cuerpo humano,
facilitarían su selección y cultivo posterior. Además, el uso de células madre
somáticas para transplantes autólogos de cualquier tejido permitiría eliminar el uso
de células madre embrionarias pluripotenciales, disminuyendo los problemas
éticos y técnicos relacionados con el uso de las células de embriones humanos
(Fernández y col., 2013 ).
La plasticidad de las células troncales ha sido estudiada en la etapa de blastocisto,
en el embrión de los roedores, encontrándose dos tipos de células troncales, las
células embrionarias procedentes de la masa celular interna y las células del
trofoectodermo. Las células troncales embrionarias de la masa celular generan
todos los tejidos del feto, mientras que las células troncales del trofoectodermo se
restringen a la generación de la capa de células trofoblásticas de la placenta.
Estos dos tipos celulares dependen de dos nichos totalmente diferentes, sin
embargo las células troncales embrionarias pueden cambiar hacia el destino
trofoblástico por medio de la alteración de las condiciones de cultivo, incluyendo la
alteración de los niveles en la expresión del factor Oct4, un determinante clave de
la pluripotencialidad (Li y col., 2010; Ratajczak y col., 2014).
27
El microambiente de las células troncales
Para el uso de las células troncales en investigación, es necesaria la creación de
subcultivos de éstas en las cuales permanezcan indiferenciadas como ocurre
naturalmente en el nicho o en el microambiente en el cual se encuentran
originalmente. Por eso el estudio del microambiente o nicho particular que rodea a
las células madre, es de gran importancia (Han y col., 2014).El nicho les permite
permanecer en su estado indiferenciado y de autoperpetuación, aunque las
células troncales que contiene desaparezcan, éste se mantiene y el destino de
ellas será irrelevante para el mismo. Además el nicho específico de cada linaje
definirá de manera precisa la forma de dividirse de la célula madre y el destino que
las células hijas tendrán; por ejemplo, los nichos pueden orientar la división de sus
células multipotentes haciendo que sólo una de las células hija herede las
moléculas de unión a las membrana basal de nicho, permitiendo que la otra célula
hija se libere del nicho y proceda a diferenciarse; por el contrario si el nicho
permite que las dos células hijas hereden las moléculas de contacto entonces la
población de células madre no se mantendrá estable. Estos tipos de divisiones en
un nicho son divisiones asimétricas, que han sido denominadas asimetría
invariable y asimetría poblacional respectivamente. Durante una división celular
asimétrica cada una de las células hijas puede adquirir un potencial diferente de
desarrollo, posiblemente el nicho de las células madre en la mayoría de los tejidos
de los mamíferos presente un tipo de división asimétrica poblacional, esta división,
a diferencia de la división invariable permite la generación de un continuo de
células madre y progenitoras permitiendo que la asimetría se alcance a partir de la
población y no de divisiones celulares individuales. El nicho también ejerce control
sobre la célula madre mediante factores secretados. La secreción de factores de
crecimiento y mantenimiento fue descrita inicialmente en la hematopoyesis, en
éste sistema la función de los factores secretados parece ser selectiva, mientras
que en las células madre de la cresta neural los factores pueden jugar un papel
instructivo en la diferenciación, existe dos familias de factores que presentan una
función conservada entre especies y tejidos, que son el factor transformante de
crecimiento β (TGF-β) y el factor Wnts (Li y col., 2010; Yagi y col., 2010).
La matriz extracelular (ECM) y la importancia de las interacciones célula-
matriz
Las células troncales, y de hecho cualquier célula del organismo, responden a
diferentes estímulos presentes en la matriz extracelular, un importante
componente regulador y estructural de los tejidos, el cual está conformado por
28
proteínas fibrosas, proteoglicanos y glicoproteínas (Mason y col., 2013). Las
proteínas de la matriz retienen moléculas de agua para dar turgencia a los tejidos
blandos, o de sustancias minerales capaces de dar rigidez a los tejidos
esqueléticos y forman un reservorio para los factores del crecimiento que regulan
la proliferación celular, también proporciona un sustrato para que las células se
adhieran, emigren y proliferen (Han y col., 2014). En consecuencia, uno de los
principales temas de investigación en ingeniería de tejido ha sido el desarrollo y
creación de matrices extracelulares sintéticas que presentan características
análogas a las naturales (Xu y col., 2013). El microambiente extracelular tiene
profundos efectos en diferentes funciones celulares, incluyendo diferenciación,
apoptosis y proliferación. Descubrimientos recientes han indicado que el destino
de las células troncales se ve afectado por el microambiente (también llamado
nicho), donde se encuentran ubicadas. En el medio fisiológico, las células
troncales se encuentran con estímulos complejos (físicos, químicos y biológicos
por ejemplo) a partir de las células que las rodean y de la ECM, las cuales tienen
efectos significativos en la determinación del destino que toman (Chakkalakal y
col., 2012; Wagers, 2012). Por ejemplo, el factor de células troncales (SCF, siglas
en inglés) expresado por las células vecinas es un componente clave que
mantiene la pluripotencia de las células troncales hematopoyéticas (Ding y
Saunders, 2012). Por lo tanto, la ingeniería del microambiente de las células
troncales debe beneficiar la producción de células troncales y la posterior
diferenciación de estas en otras células de interés para aplicaciones biomédicas y
clínicas.
A pesar de que muchos estudios han demostrado que la liberación local de
señales biológicas y químicas (por ejemplo, hormonas, factores de crecimiento y
los pequeños productos químicos) pueden influir de manera significativa en las
funciones celulares (Gancz y Gilboa, 2013; Cheng y col., 2013), otras evidencias
han mostrado que las señales físicas, como por ejemplo las propiedades
mecánicas del sustrato de crecimiento (Swift y col., 2013), las señales topográficas
(Stevens y col., 2005), la fuerza de tensión (Vincent y Engler, 2013) y la
composición de la matriz extracelular igualmente ayudan a direccionar el
comportamiento celular (Coyac y col., 2013; Discher y col.,. 2005;. Assoian y Klein,
2008) desempeñando una función importante en el control del destino de las
células troncales (Han y col., 2014).
El desarrollo de sustitutos tisulares necesita dos “ingredientes” fundamentales: las
células y los biomateriales, entendiendo además que estos pilares están
íntimamente interrelacionados a través de complejas interacciones célula-célula,
29
célula-matriz extracelular, a lo cual se agrega la acción de factores solubles, tanto
de origen local como sistémico, que también participan en estas interacciones.
Uno de los grandes desafíos que enfrenta la Ingeniería de Tejidos es la necesidad
de lograr que los sustitutos tengan la suficiente funcionalidad, así como la
estabilidad biomecánica para que puedan insertarse en el medio ambiente donde
serán trasplantados.
Recientes estudios han demostrado la relación directa entre la arquitectura de la
matriz y la diferenciación celular (Indolfi y col., 2012), los investigadores han
encontrado que las características de la matriz como la forma, el área, el tamaño
del poro, el poder inhibitorio, el tiempo de degradación, la rigidez (Gilchrist y col.,
2011) y la composición química (Kolodziej y col., 2012) determinan la cantidad, la
calidad y las funciones que las células adquirirán en su crecimiento.
Se han investigado diferentes fuentes para la elaboración de matrices en un
esfuerzo por crear nuevos materiales y técnicas de fabricación viables a la vez que
se ajustan propiedades como fuerza mecánica, interconectividad y porosidad
(Lutolf y Hubbell, 2005; Gauvin y Khademhosseini, 2011; Khademhosseini y col.,
2006). Otras investigaciones se han enfocado en definir el tipo de células más
apropiado para cada aplicación en estudio. La combinación ideal entre tipo de
matriz y células varía de acuerdo al tipo de tejido que se desee desarrollar. Es
precisamente ahí donde radica la importancia de investigar las interacciones entre
células y matrices. Dicha interacción influye tanto en la funcionalidad celular como
en las propiedades globales de la matriz (Dado y Levenberg. 2009).
La interacción entre las células y su ambiente es influenciada ampliamente por la
arquitectura de la matriz, y por sus propiedades mecánicas y bioquímicas. Las
matrices poliméricas proveen el soporte requerido para la adhesión celular y
posterior crecimiento dentro de un ambiente tridimensional, conllevando
eventualmente a la formación de tejido. La influencia mecánica de la matriz es
derivada de propiedades que incluyen su material, tamaño de poro, velocidad de
degradación y estructura. Evidentemente, matrices poliméricas con diferentes
propiedades influirán de manera diferente el comportamiento celular y la calidad y
naturaleza del producto final. (Downing y col., 2005; Ingber, 2005)
En resumen, las matrices tridimensionales proveen un soporte a las células mucho
más adecuado que el cultivo bidimensional (Indolfi y col., 2012) y sirven como
sustratos temporales para soportar y guiar la formación de tejido en varios
escenarios de regeneración de tejidos in vivo e in vitro. En los últimos años se ha
visto el surgimiento de matrices diseñadas para controlar de forma explícita los
diversos aspectos del proceso de formación de tejidos. El control espacio-temporal
de las propiedades bioquímicas y físicas de la matriz ha sido investigado a través
30
de la incorporación de bio- mecanismos moleculares y celulares fundamentales en
los andamios. Como las células y tejidos vivos son sistemas muy complejos, un
tema central en el diseño de matrices en ingeniería de tejidos es la comprensión
de cómo se correlacionan las estructuras de matrices, propiedades y funciones.
En este sentido, las variables de diseño fundamental en una matriz (es decir, el
transporte de masas, la mecánica, la conductividad eléctrica, la química de la
superficie y la topología) deben ser analizadas en cuanto a que han sido
diseñados para controlar el comportamiento celular a través de diferentes
biomateriales constituyentes y estructuras arquitectónicas.
3. BIOMATERIALES SOPORTE
Las células son frecuentemente implantadas o “sembradas” en una estructura
artificial capaz de soportar la formación de un tejido tridimensional. Estas
estructuras, llamadas andamios o matrices (scaffolds en inglés), son críticas, tanto
en su comportamiento in vitro como in vivo, dado que deben ser capaces de
recapitular el medio ambiente existente in vivo y permitir a las células ejercer su
influencia sobre dicho microambiente, de esta manera se define biomaterial como
cualquier sustancia o combinación de sustancias, de origen natural o sintético,
diseñadas para actuar interfacialmente con sistemas biológicos con el fin de
evaluar, tratar, aumentar o sustituir algún tejido, órgano o función del organismo
(Baillargeon y Mequanint, 2014)
En teoría, un biomaterial soporte deben permitir la adhesión y migración celular,
además de un desarrollo temporo-espacial controlado en el que se incluyen
funciones tales como difusión de nutrientes vitales, vascularización y soporte de
funciones mecánicas y biológicas (Scheller y col., 2008).
Los biomateriales utilizados en Ingeniería de Tejidos pueden ser de variados
orígenes y estructuras químicas. Su elección dependerá del destino final, del tipo
de célula, el tipo de tejido que se pretende restaurar, del tiempo de permanencia
(uso temporario o definitivo), entre otros factores. Podrían agruparse los
biomateriales como naturales, que son los componentes de la matriz extracelular
(colágeno, elastina, fibronectina, glicosaminoglicanos), sintéticos (metales,
cerámicas, polihidroxiácidos, poliacrilatos), o híbridos (materiales compuestos,
conteniendo estructuras naturales y sintéticas, o estructuras naturales modificadas
químicamente). Además de su origen, deben tenerse en cuenta otras
características de los biomateriales, siendo una de ellas fundamental, la
biocompatibilidad. Otras características, que deben ser analizadas en cada
31
situación particular, son la biodegradabilidad, la toxicidad, la immunogenicidad,
entre otras. (Sumita y col., 2006). Otros estudios han evaluado algunos de los
materiales en que se pueden fabricar dichas matrices, tales como el ácido
poliglicólico (PGA) (Young ycol., 2002; Honda y col., 2005), el diacrilato de
polietilenglicol (PEGDA) (Jaramillo y col., 2012), polímeros de hidroxiapatita (Hong
y col., 2005. Kothapalli y col., 2005) y el colágeno (COL) (Teixeira y col., 2010)
entre otros, siendo éste último uno de los que permite mayores ventajas por su
naturaleza, ya que permite recrear el ambiente embrionario según lo han
demostrado estudios previos (Sumita y col., 2006; Teixeira y col., 2010; Indolfi y
col., 2012)
Dentro del área de los biomateriales existen dos tendencias principalmente, la
primera consiste en el desarrollo de andamios tridimensionales acelulares, que
servirán para alojar las diferentes células una vez implantados in vivo. La segunda
tendencia consiste en el desarrollo de andamios tridimensionales, que inicialmente
son colonizados por las células progenitoras bajo condiciones in vitro, y luego son
implantados en el paciente para reemplazar el tejido dañado. (Hubbell, 1995)
Como se ha dicho antes, el principio básico de la ingeniería de tejido es la
combinación apropiada de células con un determinado material bajo ciertas
condiciones que puedan llevar a la formación de tejido. La naturaleza del material
así como sus propiedades físicas y químicas son de vital importancia a la hora de
establecer condiciones, por ejemplo, las propiedades mecánicas de los metales
cerámicos junto con la bioactividad de algunos de estos, como la hidroxiapatita, ha
permitido su empleo en aplicaciones ortopédicas. Por otro lado, los materiales
poliméricos tienen propiedades similares a las de los tejidos biológicos y por esta
razón han sido extensamente estudiados en ingeniería de tejido.
Tanto los polímeros naturales como sintéticos han sido ampliamente utilizados
para aplicaciones en ingeniería de tejidos. Materiales naturales como el colágeno
y alginatos han sido empleados en la fabricación de matrices, con resultados
prometedores al permitir la adhesión celular y el desarrollo de diversos linajes
celulares (Marijnissen y col., 2002).
COLÁGENO
El colágeno es un componente principal del tejido conectivo y la proteína más
abundante en los tejidos de los mamíferos. Se utiliza ampliamente en aplicaciones
biomédicas en las que pueden incluirse la ingeniería tisular, matrices y materiales
32
para el vendaje de heridas. El amplio interés en el colágeno se deriva de su
biodegradabilidad, su facilidad de extracción, purificación y transformación, y su
excelente biocompatibilidad (Schuetz y col., 2013).
El colágeno está formado por una triple espiral de cadenas α de tres polipéptidos,
que tienen una secuencia repetida de Glu-X-Y. Se conocen unas 21 clases
distintas de colágeno. Los tipos I, II y III son los colágenos intersticiales o fibrilares,
que son los más abundantes. Los tipos IV, V y VI son formas no fibrilares (o
amorfas) y se encuentran en el tejido intersticial y en las membranas basales
(Myllyharju y Kivirikko, 2001). Dado las bajas cantidades que han sido posibles de
obtener de los demás colágenos, estos no han tenido mucho interés para su
estudio.
El colágeno tipo I es la proteína más abundante de la matriz extracelular. El
colágeno está ensamblado en una estructura de triple hélice la cual permite formar
una red fibrilar, exhibe un patrón de bandas característico, sus disposiciones supra
fibrilares forman densas jerarquías que van desde lo nano a lo macro, se combina
con NCP (proteínas no colágenadas) y GAG (glucosaminoglicanos: biomoleculas
estructurales presentes en el tejido óseo como heparina, condroitina, ácido
hialuronico, las cuales atraen y retienen agua) biomoleculas que pueden estar
involucradas en procesos de mineralización y formación de ACP (fosfato de calcio
amorfo) (Avery y Bailey, 2006).
El colágeno es precursor de fase, crecimiento e inhibición y ha sido considerado
como agente de nucleación dado que puede esterificar fosfato, con los grupos
hidroxi de la hidroxiprolina y atraer calcio, que interaccionaría con los grupos
carboxilo libres, además tiene la capacidad de auto-ensamblarse a altas
concentraciones (Wang y col., 2012). Las fibras de colágeno proporcionan una
matriz en la que precipitan constituyentes minerales, también constituyen una
porción importante de los tendones y están en la piel en forma reticular, puede
formar superficies macro porosas y microporosas (Teixeira y col., 2010) que le dan
a las células soporte y les permite adherirse con facilidad, sin embargo este
mecanismo aún es desconocido (Sumita y col., 2006; Indolfi y col., 2012); el
colágeno también induce el desarrollo de vasos sanguíneos (Teixeira y col., 2010)
que provee de nutrientes y oxigeno las células en crecimiento. Las fibras
colágenas son flexibles, pero ofrecen gran resistencia a la tracción (Lehninger y
col., 2009), también presenta ciertas ventajas sobre otros materiales poliméricos
de gran uso como el ácido poliglicolico (PGA), ya que permite en mayor porcentaje
la producción de tejido calcificado, mantiene una composición igual a la matriz
33
extracelular, presenta baja inmunogenicidad, baja citotoxicidad y permite una
adherencia celular alta (Sumita y col., 2006), además, el colágeno glicosilado
permite evaluar el efecto de las restricciones mecánicas sobre el comportamiento
celular (Mason y col., 2013).
La formación de tejidos conectivos duros, como el hueso, dentina y cemento,
implican la deposición de fosfato de calcio dentro de una matriz de colágeno, que
forma un bloque común para la construcción de estos tejidos. Mientras que la
estructura del colágeno mineralizado ha sido estudiada y comprendida, la manera
como el mineral precipita, con el orden espacial y jerárquico que se encuentra en
los tejidos autóctonos, sigue siendo en gran parte desconocida. De hecho,
mientras que la exploración in vivo de la biomineralización es compleja, modelos
simplificados in vitro se pueden utilizar para examinar sistemáticamente los
aspectos específicos de la mineralización del colágeno (Nudelman y col., 2013).
El colágeno ha sido utilizado en la regeneración de diversos tejidos desde hace
algunos años, ente estos trabajos podemos citar los adelantos realizados por el
grupo de Tsuji (Nakao y col., 2007; Oshima y Tsuji, 2014), quienes han
desarrollado tejidos dentales completos mediante la disgregación de germen de
dientes incisivos en células simples sembradas en gotas de colágeno, en ese
mismo sentido, se encuentran estudios en los que se han obtenido pequeñas
estructuras de esmalte, dentina y corona utilizando soportes de colágeno en fibras
(Honda y col., 2006); de otro lado, encontramos estudios encaminados a otros
órganos como la curación del tejido cicatrizado después de una cirugía de
manguito rotador en el que una membrana de colágeno permitió el desarrollo y
proliferación de MSC derivadas de médula ósea en un modelo con ratas (Gulotta y
col., 2011), también podemos citar estudios que involucran enfermedades como el
cáncer (Kim y col., 2014), en estos, el colágeno tipo I que es secretado por los
fibroblastos del estroma, puede aumentar las características agresivas de las
células de cáncer de mama a través de la inducción de la MMP-9 mRNA,
indicando que permite la proliferación celular sin importar el tipo de célula
presente.
34
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
Determinar si una matriz de colágeno tipo I, permite el establecimiento de un
microambiente tridimensional que promueva la proliferación de células troncales
derivadas de médula ósea de ratas (rCTMO), para su uso en experimentos de
regeneración de tejidos.
OBJETIVOS ESPECIFICOS
1. Extraer, caracterizar e inmunofenotipificar rCTMO.
2. Extraer colágeno tipo I para usarlo como biomaterial soporte de rCTMO.
3. Implementar un sistema de cultivo de rCTMO sembradas en colágeno tipo I.
4. Establecer la micro y macroarquitectura de las esponjas de colágeno tipo I
sembradas con rCTMO.
35
METODOLOGIA
Este estudio fue aprobado por el comité de Ética e Investigación de la Facultad de
Odontología de la Pontificia Universidad Javeriana. Como ejecución parcial del
proyecto: “Evaluación de la proliferación celular y la angiogénesis en constructos
(andamios/células) implantados en cuatro sitios receptores en ratas Lewis.” con
número de aprobación Vicerrectoría Académica ID 004047
Se usaron ratas entre 2 y 4 meses de edad de la cepa Lewis alojada en la Sala de
Experimentación Animal de la Facultad de Odontología de Pontificia Universidad
Javeriana (SEA FOUJ), de las cuales se tomaron las extremidades posteriores y
las colas. Las colas fueron usadas para hacer la extracción ácida del colágeno y
las extremidades aportaron el componente celular requerido, de esta manera la
metodología usada en este estudio fue la siguiente:
1.Cultivo de células troncales de rata
1.1.Extracción de médula ósea. Se disecaron asépticamente las extremidades
posteriores de las ratas sacrificadas con la disección inmediata de la piel, del tejido
muscular y del periostio para exponer los huesos. Se separaron el fémur, la tibia y
el peroné de cada extremidad y se almacenaron en suero fisiológico para ser
trasladados inmediatamente al laboratorio.
En el laboratorio se procesaron los huesos para la obtención de la porción
medular; el procedimiento usado se explica brevemente de la siguiente manera:
en la cabina de flujo laminar y con la ayuda de instrumental quirúrgico se tomaron
cada uno de los huesos y se les rompieron las epífisis y por una de éstas se
introdujo una jeringa cargada con 2 ml de medio de cultivo, se vació lentamente su
contenido para lavar el interior del hueso y el volumen de lavado eluído se recogió
en un tubo de centrifugación y dentro de él, los subgrupos celulares fueron
disgregados por medio de pipeteos sucesivos, seguidamente el eluído fue
centrifugado a 650xg durante 5 minutos, se descartó el sobrenadante y al botón
formado se le resuspendió nuevamente en 1 ml de medio de cultivo para
determinar el número de células totales por ml, haciendo el conteo con la cámara
de Neubauer. (Anexo 1)
36
1.2.Cultivo celular. El total de células obtenidas fueron sembradas en frascos de
cultivo a una concentración de 5x105 células/ml por cada frasco y cada uno de
éstos fue puesto en condiciones de incubación de 37°C y 5% CO2 con cambio de
medio fresco cada dos días, hasta alcanzar el 90% de la confluencia celular,
momento en el cual se consideró establecido el cultivo primario, denominado P0
por ser el cultivo directo del tejido sin pasajes o sin subcultivos.
Separación por inmunomagnetismo. Las células en P0 se desprendieron por
medio del tratamiento enzimático con una solución al 0.25 %p/v de tripsina y al
0.02% EDTA para formar una suspensión de células, caracterizada por contener
grupos celulares heterogéneos distinguidos en dos grandes grupos las CD45+ y
las CD45-. Para obtener la fracción de interés, se purificó de la suspensión
heterogénea la fracción CD45-, con el uso de un anticuerpo CD45. El
procedimiento usado fue el siguiente: cuando P0 alcanzó el 90% de confluencia,
las células fueron disgregadas y recogidas por centrifugación contadas e
incubadas con antiCD45PE durante 20 minutos a 4°C a una concentración de 10µl
del antiCD45PE por cada 1x106 células, después de lavadas fueron sometidas a
una segunda incubación con un anticuerpo secundario acoplado a perlas
metálicas durante 20 minutos a 4°C y esta solución fue pasada por una columna
de separación colocada en un campo magnético, mientras que las células
marcadas se acoplaron a la columna, la fracción con las células no marcadas que
contenía la fracción celular CD45- eluyó a través de la columna y fue subcultivada
en frascos de cultivo para avanzar hacia el primer pasaje (P1)(Anexo 2). En el
momento en que P1 alcanzó el 90% de confluencia, las células fueron
disgregadas, recogidas por centrifugación, contadas y subcultivadas
sucesivamente hasta el sexto pasaje (P6). Se realizó supervisión de los cultivos
por medio de microscopía de campo claro con microscopio invertido.
1.3.Inmunofenotipificación celular.
Determinación de marcadores de expresión. En este estudio, se examinaron
las características inmunofenotípicas por Citometría de flujo de los cultivos
celulares, usando anticuerpos específicos acoplados con fluorocromos PE, APC y
FITC y dirigidos a las moléculas CD45, CD29, CD90, CD71 y CD106. Las células
de los diferentes cultivos se recogieron y se incubaron por 30 minutos con el
respectivo marcador, se centrifugó, se resuspendió y se fijó en paraformaldehído
4%. Los títulos de los anticuerpos en la marcación de los cultivos fueron CD90:
1/100, CD29: 1/200, CD45: 1/200, CD71:1/100 y CD106:1/200.
37
Citometría de flujo. Se evaluó por citometría de flujo la expresión de los
marcadores CD45, CD90, CD29, CD71 y CD106 de una porción de células CD45-
recogidas. A otra de las porciones se le permitió el avance del cultivo hasta el
siguiente pasaje.
Proliferación. A partir de una solución stock de la tinción diacetato de
caboxifluoresceina succinimidil éster ,CFSE (Molecular Probes C34554), con una
concentración de 10 µM, se hizo la marcación de las células que se encontraban
en el segundo pasaje (P2) de cultivo celular, de acuerdo con las instrucciones del
fabricante. Las células fueron desprendidas del cultivo confluente con una solución
de tripsina-EDTA, recogidas en un tubo y contadas como células simples con
cámara de Neubauer; a través de ensayos preliminares se determinó que la
concentración ideal de CFSE para la marcación de las células es 10 µM.
Se incubaron 1x106 células con la solución de CFSE 10 µM durante 30 minutos a
37°C, después de los cuales se frenó la reacción con la adición de 5 ml de medio
de cultivo a 4°C, se esperaron 5 minutos más y las células se recogieron en un
botón por medio de centrifugación a 650 xg, las células fueron resuspendidas por
pipeteo y fijadas con la adición de 300 μl de solución de paraformaldehído al 4% y
así fueron leídas en un Citómetro de Flujo. Fueron capturados 20000 eventos por
condición y mediante gráficos tipo “dot-plot” e histogramas se analizaron los datos
bajo el programa Flow jo 8,7.
2.Preparación y caracterización de la matriz
2.1.Preparación de la esponja de colágeno. Para preparar las esponjas de
colágeno tipo I, se realizó la extracción ácida de colágeno de tendones de colas de
ratas de 2 a 4 meses de edad, de acuerdo con el procedimiento desarrollado por
el grupo de Mantovani (Rajan y col., 2006). Se tomaron 5 colas de ratas
sacrificadas con anterioridad para otros experimentos y que se tenían
almacenadas a -70°C, se dejaron a 4°C 24 horas antes de la extracción para
permitir su descongelamiento natural, luego se lavaron dos veces con agua
destilada, se procedió a extraer los tendones tirando con fuerza de ellos con el uso
de pinzas mosquito rectas y estos se fueron depositando en un Beaker con Buffer
de Fosfato Salino (PBS) a pH 7,4, luego se pasaron por acetona 99% e
isopropanol 70%, 5 minutos en cada uno, y se depositaron en otro vaso de
precipitados que contenía ácido acético 0,02N dejándose en agitación constante a
38
4°C por 48 horas, al cabo de las cuales se retiró la solución y se homogenizó
mediante el uso de una licuadora doméstica en el modo por pulsos para evitar la
desnaturalización de la proteína por sobrecalentamiento, la solución resultante fue
congelada a -20°C durante 72 horas y liofilizada a -50°C y 2x10-3 mBar de presión
de vacío durante 48 horas, las esponjas allí obtenidas se reconstituyeron en ácido
acético 0,02 N a una concentración de 4 g/L y esta solución fue ultra centrifugada
a 30000 x g, 4°C por 45 minutos; el sobrenadante fue recogido y sometido a
diálisis utilizando una membrana Spectrapor de 6-8 KDaltons, de allí se obtuvo
una solución semigelificada que se almaceno a 4°C. La solución anterior fue
neutralizada mediante la adición de pequeños volúmenes de NaOH 0,5N hasta un
pH entre 6,8–7,0 y se tomaron alícuotas en micro tubos de PCR en volúmenes
entre 80µl y 100 µl, estos fueron congelados a -20°C por 72 horas y
posteriormente liofilizados durante 48 horas obteniendo de esta manera las
esponjas de colágeno tipo I, estas esponjas fueron sometidas por 6 horas a
radiación UV de 254 nm con el fin de entrecruzar las fibras de colágeno (Anexo 3).
2.2.Caracterización de la matriz
Análisis Infrarrojo. Se evaluó la pureza de la solución semigelificada de
Colágeno tipo I mediante espectroscopia Infrarroja (IR). Los espectros IR se
tomaron en un espectrómetro Nicolet is10 equipado con un detector de sulfato de
triglicina deuterado (DTGS) con ventana de CsI y un Smart ITR de placa de
diamante. El espectro fue registrado en el modo de transmitancia con una
acumulación de veinte escaneos, con una resolución espectral de 4 cm-1 y un
rango espectral de 4000 a 500 cm-1. Se empleó el modo de reflexión total
atenuada (RTA o ATR, en sus siglas inglesas).
2.2.1.Análisis MEB. Para la evaluación de las matrices sin rCTMO, estas
esponjas se sometieron a recubrimiento con oro en condiciones de baja presión
10-4 Torr, luego se observaron bajo el microscopio electrónico, en el que pudo
observarse tanto la Macroarquitectura (Tamaño del poro, forma y área de sus
poros, interconectividad de los poros y porosidad) como la Microarquitectura
(rugosidad de la superficie)
Tamaño del poro. Consta de características como el perímetro promedio
de los poros y el diámetro promedio de Feret. El diámetro de Feret, es el
valor medio de la distancia entre pares de líneas paralelas tangentes al
perímetro proyectado de la partícula; el análisis de tamaño de poro se llevó
a cabo utilizando ImageJ, un programa de procesamiento de imagen digital.
39
El programa convierte las imágenes digitales en forma binaria y calcula el
tamaño de poro promedio basado en las mejores longitudes elípticas de
ajuste generadas por el software. Una conveniente clasificación de los
poros de acuerdo a su dimensión transversal (w) fue propuesta
originalmente por Dubinin en 1960 y posteriormente adoptada oficialmente
por la Unión Internacional de Química Pura y Aplicada (IUPAC)(IUPAC.
1972)
Dimensión transversal w: Microporo Menor a ≈ 20 Å
Mesoporo Entre ≈ 20 Å y ≈ 500 Å
Macroporo Mayores que ≈ 500 Å
Forma y área de sus poros. Área promedio de los poros, utilizando
ImageJ. El programa convierte las imágenes digitales en forma binaria y
calcula el área promedio de poro y la circularidad, en la circularidad un valor
de 1,0 indica un círculo perfecto. A medida que el valor se aproxima a 0,0,
indica una forma cada vez más alargada.
Interconectividad de los poros. Se consideró como una apreciación visual
según las imágenes tomadas en el microscopio electrónico.
Porosidad. La porosidad de las esponjas de colágeno se midió de acuerdo
con el principio de Arquímedes (Zreiqat y col., 2010), de este modo, la
porosidad se calculó según la siguiente fórmula:
Porosidad = ((W2-W1) / (W2-W3)) x 100%
Donde W1 es el peso seco de la matriz, W2 es el peso húmedo de la matriz,
y W3 es el peso de la matriz suspendida en agua. Se utilizó agua tipo I
como medio líquido de este cálculo.
Rugosidad de la superficie. El análisis de rugosidad se llevó a cabo
utilizando el plugin SurfCharJ desarrollado para ImageJ (Chinga y col.,
2007). El programa convierte las imágenes digitales en forma binaria y
calcula la rugosidad promedio, se tomó en cuenta el valor de Rc
correspondiente a la altura promedio de las irregularidades.
40
3.Caracterización, siembra y cultivo celular in vitro en matrices de colágeno
tipo I
3.1.Siembra celular. Los resultados obtenidos en la inmunofenotipificación de las
rCTMO, indicaron que el segundo pasaje, puede ser considerado el momento
ideal para sembrarlas en matrices tridimensionales, con resultados más
confiables. Para la inclusión de las células en la esponja de colágeno se diseñó un
sistema de siembra de células que consiste en unos discos de acrílico con pozos
sobre los cuales se coloca la esponja de colágeno, los pozos a su vez están
contenidos en placas multipozos de 12 pozos cada una. A la esponja inmersa en
el pozo se le adicionó la suspensión de rCTMO en P2 con una concentración de
400.000 células diluídas en 7l de medio de cultivo y se dejó en reposo durante 1
hora a 37°C y 5% de CO2 para permitir la difusión celular a través de la esponja de
colágeno, transcurrido el tiempo de difusión se trasladó la esponja de colágeno
sembrada con rCTMO al sistema de cultivo celular. Para el cultivo celular de la
esponja de colágeno sembrada con las CTMO, se usó la técnica de Trowell
modificada por Saxen (Honda y col., 2006) que consiste en poner el constructo
sobre mallas metálicas perforadas que a su vez están inmersas en medio de
cultivo y que permiten la difusión de este medio por capilaridad hacia el constructo,
en una interfase líquido-gas; para proteger los constructos se depositaron en
reservorios hechos con hidrogel PEGDA, de acuerdo con el método modificado
por el grupo de investigación de Biología de tejidos dentales y Bioingeniería de la
PUJ. El conjunto fue depositado en una caja de Petri agregando suficiente medio
de cultivo α- MEM hasta que las esponjas quedaron sumergidas en él, este cultivo
se mantuvo en incubación a 37°C y 5% CO2 por tiempos determinados. Su
desarrollo fue supervisado mediante microscopía de campo claro, con cambio
permanente de medio de cultivo cada 2-3 días (Anexo 4).
3.2.Viabilidad celular y observación MEB. La viabilidad celular se detectó
mediante microscopia de fluorescencia, las esponjas fueron retiradas del cultivo,
puestas en una lámina portaobjetos en donde se les agregó la tinción con el kit de
viabilidad Live/Dead®; esta prueba se basa en la determinación simultánea de
células vivas y muertas, mediante sondas que reconocen dos parámetros de
viabilidad celular, la actividad de esterasa intracelular (Calceína AM) y la integridad
de la membrana celular (EthD-1). Se ha encontrado que la calceína AM y el
homodímero de etidio (EthD-1) son los colorantes óptimos para este aplicación
(Hayes, 1994; Wang y col., 1993). Las muestras fueron distribuidas de tres formas:
una placa con calceína para identificar células vivas, otra placa con fluorocromo de
EthD-1 para identificar células muertas y la última que contenía ambos, las
41
muestras fueron inmersas en Glicerol antes de colocarles la laminilla cubreobjetos
con el fin de dar mayor nitidez; las observaciones se realizaron en el microscopio
de fluorescencia.
La morfología de las células troncales y las características de la matriz después de
0 días, 7 días, 14 días y 21 días de sembradas fueron observadas mediante MEB,
las muestras fueron retiradas de la malla metálica y el reservorio de cultivo, se
lavaron dos veces en PBS y fueron fijadas en solución de Glutaraldehído 2,5% en
PBS pH 7,4 por 3 horas a 4°C, luego fueron lavadas dos veces en PBS y
posteriormente deshidratadas haciéndolas pasar por una serie de etanol a
diferentes concentraciones (50%, 70%, 90% y 100%). Luego fueron sometidas a
secado en punto crítico en condiciones de CO2 a 31°C y 73.8 bar y metalizadas
esparciéndoles oro. La observación se realizó en el microscopio electrónico en
aumentos entre 100x y 10000x con observaciones casuales por fuera de este
rango.
4.Análisis estadístico. Todos los experimentos fueron repetidos como mínimo
tres veces. Los datos se presentaron como la media ±SD. Comparaciones
múltiples entre los grupos fueron analizados por ANOVA seguido de una prueba T-
Student. Se realizaron pruebas de Shapiro-Wilk para normalidad y de Levene para
la homogeneidad de las varianzas. La diferencia fue considerada significativa
cuando el valor de p <0,05. Se usó SPSS v.19 software y Prisma 4.0 para analizar
los datos.
42
RESULTADOS
1. Cultivo de células troncales de rata
Como resultado del procesamiento de la médula ósea de los huesos de las
extremidades posteriores de ratas adultas, se logró establecer el cultivo primario
de células derivadas de médula ósea denominado P0, después de la separación
de las células CD45+ de los estadíos P0, se logró el avance de los cultivos desde
P1 hasta P6. Se establecieron 42 cultivos desde P0 hasta P6 para obtener las
células necesarias, que permitieron hacer la determinación de la expresión de los
marcadores seleccionados, con un número mínimo de 3 repeticiones. Las
imágenes microscópicas obtenidas son presentadas en la figura 1.
Figura 1. Evaluación microscópica de la morfología de cultivos de células derivadas de
médula ósea en P0 a P3. A. Cultivos en P0. B. Cultivos en P1. C. Cultivos en P2. D.
Cultivos en P3. Todas fueron observadas con el objetivo de 10x.
La evaluación por microscopía de campo claro de los cultivos de células derivadas
de médula ósea con medio de cultivo permitió la observación de poblaciones
A
C
B
D
43
celulares heterogéneas, se observaron células alargadas parecidas a fibroblastos,
células redondeadas y células aplanadas; la depuración de las células no
adherentes se realizó por los cambios de medio cada tres días y a través de los
pasajes desde P0 hasta P6.
Las células MSC CD45- fueron obtenidas mediante separación por
inmunomagnetismo, como se describió en materiales y métodos, y la pureza
obtenida fue del 95% (Figura 2).
Figura 2. Pureza de la selección negativa de células CD45. Se representa las figuras en
puntos obtenidos por el análisis en Citometría de flujo, de las células purificadas por
separación inmunomagnética (MACS) con anticuerpos específicos para CD45. La gráfica
de puntos superior izquierda, representa las células sin teñir como control, la superior
derecha, las células CD45 totales y las de abajo, las células CD45+ (izquierda) y las
CD45- a la derecha, después de la separación inmunomagnética. La pureza fue del 95%.
44
Para validar la importancia de la separación por inmunomagnetismo y obtener un
alto porcentaje de pureza en los cultivos, por la menor expresión de CD45+; se
realizaron comparaciones entre las células purificadas y no purificadas desde el
pasaje P0 al P6. En la figura 3 se observa la expresión de CD45+ presente en el
cultivo primario (P0) y en las células en cultivo sin purificar en primer pasaje (P1)
(Figura 3A); y la misma expresión, en el cultivo primario (P0) y en las células en
cultivo purificadas en primer pasaje (P1) (Figura 3B). En éstas figuras se observa,
que la expresión de CD45+ permanece en las células cultivadas en P1 no
purificadas (Figura 3A), pero al realizar la separación por inmunomagnetismo, hay
una tendencia a disminuir dicha expresión en las células purificadas (Figura 3B);
así como al comparar la expresión de CD45 en las células en el mismo pasaje
(P1), purificadas o no (p= 0,0784) (Figura 4).
Figura 3. Expresión comparativa de CD45+ en células de cultivo Primario y primer
pasaje, que han sido purificadas o no por separación inmunomagnética. En la figura
se puede observar la Intensidad Media de fluorescencia (IMF) comparativa de la
expresión de CD45+ por Citometría de flujo de células en cultivo primario (P0) vs
primer pasaje (P1) no purificadas (A), y células en P0 vs P1 purificadas (B). Las
barras representan el promedio error estándar de n=3 y los resultados fueron
analizados estadísticamente por la prueba T student.
45
Al avanzar el cultivo, la pureza incrementa, dado que la expresión de CD45 sigue
disminuyendo hasta máximo, una intensidad media de flurescencia del 0,5 en P3;
al realizar la prueba de T student, se observaron diferencias estadísitcamente
significativas en P2 (p=0,05) y P3 (p=0,0062) (Figura 5A y 5B respectivamente)
cuando se comparó la expresión de CD45 en las células en cultivo purificadas o
no por separación inmunomagnética, y en los demás pases hasta P6 (datos no
mostrados).
Figura 4. Expresión comparativa de CD45+ en células de cultivo en primer pasaje,
purificadas o no por separación inmunomagnética. En la figura se puede observar la
Intensidad Media de fluorescencia (IMF) de la expresión de CD45+ por Citometría de
flujo de células en cultivo en primer pasaje purificadas o no. Las barras representan el
promedio error estándar de n=3; los resultados fueron analizados estadísticamente
por la prueba T de student.
46
Posterior al análisis de la pureza de cultivo por la expresión de CD45, se quizo
analizar si la expresión de los demás marcadores como el CD71, CD106, CD29 y
CD90 variaba cuando las células eran purificadas o no bajo el marcador de CD45,
y no se encontraron diferencias estadísticamente significativas en cuanto la
expresión de cada marcador, entre el grupo de células purificadas o no, y en cada
pasaje de cultivo de P1 a P6 (datos no mostrados).
Como la menor expresión de CD45+ es muy importante para la pureza de los
cultivos de las células indiferenciadas, y ésta, se obtiene como producto de la
purificación de células por el marcador CD45+, todos los resultados presentados
en adelante, serán de células purificadas mediante separación por
inmunomagnetismo. En la figura 6 se representa la caracterización fenotípica de
las células mesenquimales de rata en los diferentes pasajes de cultivo, obtenida
por citometría de fujo como se describió en materiales y métodos.
Figura 5. Expresión comparativa de CD45+ en células de cultivo en segundo (P2) (A) y
tercer (P3) pasaje (B), que han sido purificadas o no por separación inmunomagnética. En
la figura se puede observar la Intensidad Media de fluorescencia (IMF) comparativa de la
expresión de CD45+ por Citometría de flujo, las barras representan el promedio error
estándar de n=3 y los resultados fueron analizados estadísticamente por la prueba T
student. El * representa las diferencias estadísticamente significativas cuando el valor de p
fue < 0,05.
47
Figura 6. Caracterización fenotípica de células Mesenquimales de rata en
diferentes pasajes de cultivo por Citometría de flujo. Las células CD45- separadas,
fueron cultivadas y teñidas en diferentes pasajes de cultivo, para su caracterización
con anticuerpos monoclonales específicos para marcadores de superficie como
CD90 FITC, CD29 APC, CD106 PE y CD71 PE, adquiridas y analizadas por
Citometría de flujo. Los histogramas representan la expresión de superficie de cada
molécula y los números dentro de ellos, el porcentaje de células con dicha
expresión. Cada línea corresponde a cada pasaje (P) y el número (1, 2, 3, 4, 5 y 6)
es el equivalente a cada pasaje. Se muestra un histograma representativo por cada
condición.
48
Al analizar la expresión de los marcadores por pasaje (Figura 7), se pudo
identificar que CD29 y CD90 son los que más se expresan en todos los pasajes
(Tabla 1), sin diferencias para cada uno (CD29 y CD90) a medida que avanza el
cultivo, ni al compararse entre ellos, excepto en P6 (p=0,008). El CD106 y CD71,
son los de menor expresión; al examinar cada marcador, el CD106 tiende a
incrementarse a medida que avanza el cultivo de P1 a P3, y posteriormente
desciende; se observa que CD71 tiene un comportamiento similar, con diferencias
estadísticamente significativas de P1 a P2 (p=0,039) y de P2 a P3 (p=0,00064).
Al comprobar la diferencia estadística entre ellos, solo se observó en P1
(p=0,0021), P3 (p=0,00091) y P6 (p=0,045), siendo menor en todos los pasajes
CD71.
Figura 7. Análisis de la expresión de CD71, CD106, CD29 y CD90 en células MSC de
rata en cultivo posterior a la separación inmunomagnética de CD45. Análisis y
representación del promedio y el error estándar de la media del porcentaje de
Intensidad media de fluorescencia (IMF) de marcadores de expresión CD71, CD106,
CD29 y CD90. El símbolo representa las diferencias significativas entre los grupos:
entre marcadores por pasaje (comparación identificada por el símbolo del mismo
color), corchete entre los pasajes, cuando el valor de p fue menor a 0,05, por la
prueba T de student. n=3
49
Tabla 1. Análisis de la expresión de los marcadores CD29 y CD90 con CD71 y CD106 por
pasaje
CD29 vs CD71 CD29 vs CD106
CD90 vs CD71 CD90 vs CD106
P1 (p=0,0001) P2 (p=0,022) P3 (p=0,004) P4 (p=0,00019) P6 (p=0,0037)
P2 (p=0,023) P3 (p=0,0054) P4 (p=0,00053) P6 (p=0,0037)
P3 (p=0,026) P5 (p=0,02) P6 (p=0,003)
P3 (p=0,033) P5 (p=0,017) P6 (p=0,003)
Dada la importancia de la separación inmunomagnética, y pensando en que dicho
procedimiento, pudiera afectar la vitalidad y el crecimiento celular, se quiso
analizar la proliferación y viabilidad celular en el cultivo. Las células teñidas con
CFSE fueron cultivadas en medio de cultivo y pasadas las 24, 48, 72 y 96 horas se
recogieron y fijaron para ser adquiridas por Citometría de Flujo, como se describió
en materiales y métodos. El tiempo 0 fue tomado de las células teñidas antes de
ponerlas en cultivo e inmediatamente fijadas con paraformaldehído.
El análisis de proliferación se hizo con los valores del porcentaje de células en
división arrojados por el programa Flowjo, y luego de la estadística, se encontraron
diferencias estadísiticamente significativas entre los tiempos posterior a la prueba
estadística de ANOVA, con un valor de p=0,0001 en la división celular y de
p=0,024 cuando se analizó la viabilidad (n=3 para cada condición). Para observar
la diferencia de proliferación y viabilidad entre cada tiempo, se analizó por pares,
bajo la prueba de T student. El porcentaje de células en división fue diferente
posterior a las 24 horas, solo al comparar los valores dados entre las 24 con las 48
horas (p= 0,0023); por el contrario fue similar entre los otros tiempos (Figura 8A).
El porcentaje de viabilidad de la células en cultivo fue tomado de los datos de
citometría, del porcentaje de células que expresaban el colorante CFSE; con un
promedio entre el 88.3 al 91.7%, y al comparar dicha viabilidad entre los tiempos,
se encontró diferencia estadísticamente significativa entre los tiempos 72 y 96
(p=0,05). (n=3 para cada condición) (Figura 8B)
50
Figura 8. Proliferación y Viabilidad de células MSC en cultivo posterior a la separación
inmunomagnética. Análisis y representación del promedio y el error estándar del
porcentaje de células en división (A) y el porcentaje de viabilidad (B) de las células
cultivadas posterior a la purificación en los diferentes tiempos: 0, 24, 48,72 y 96 horas.
El (*) representa las diferencias significativas entre los grupos cuando el valor de p fue
menor a 0,05, por la prueba T de student. n=3
51
2. Fabricación y caracterización de la matriz
2.1. Preparación de la esponja de colágeno
Se extrajo un total de 510 ml de solución de colágeno tipo I en gel, en
proporción de 102 ml por cada 5 colas. Se obtuvieron esponjas de colágeno
tipo I por la liofilización de alícuotas del colágeno en gel neutralizado de 80µL,
cuya inspección preliminar permite deducir que es una estructura consistente,
porosa y absorbente.
Figura 9. Microfotografías MEB de esponjas sin células. A) Esponja de colágeno tipo I obtenida
después del proceso de extracción y purificación de la solución de colágeno de los tendones
de cola de rata. B) Apariencia estructural de esponja resultante de solución neutra. C y D)
Apariencia estructural y de las paredes a pH 5. E y F) Apariencia estructural y de las paredes a
pH 11.
F
B A
C
E
D
52
Durante los ensayos de preparación de las esponjas se pudo observar que
tanto la temperatura como el pH de la solución afectan la estructura de la
esponja, ya que pierde características como la consistencia, la degradación de
las paredes y la resistencia mecánica; estos efectos pueden ser debidos a la
desnaturalización de la proteína. Sin embargo a pH 11 puede observarse una
mayor consistencia de las fibras de colágeno (Figura 9).
2.2. Caracterización de la matriz
2.2.1. Análisis Infrarrojo (FTIR-ATR)
Los espectros IR de las proteínas exhiben varios rasgos característicos
sobre la organización molecular. En términos generales, los aminoácidos
están unidos entre sí a través de los enlaces peptídicos que dan lugar a
varios modos de vibración IR. El grupo amino tiene una banda de absorción
característica en la región de 3300-3500 cm-1(cerca de 3330 cm-1), que está
cubierta por la amplia banda de absorción del grupo –OH.
El colágeno muestra bandas a 1658, 1554 y 1240 cm-1, que son bandas
características de la amida I, II y III de colágeno. La absorción de amida I
principalmente se debe a las vibraciones de estiramiento del grupo C=O de
la amida de la proteína (Sionkowska y col., 2004) (Figura 10).
Figura 10. Espectro de ATR-FTIR de una muestra de colágeno tipo I extraído de cola de
rata, con bandas de asignaciones.
Amida I
Tensión N-H
53
Varios estudios han demostrado que la forma espectral de la amida I se
puede utilizar para determinar la estructura secundaria de las proteínas, ya
que la vibración amida casi no se ve afectada por la naturaleza de las
cadenas laterales (Barth, 2007). Este amplio componente espectral surge
principalmente de vibraciones de estiramiento de los grupos C=O en los
péptidos, este se compone de varias características inferiores, cada una de
ellas de una proteína particular en la estructura secundaria. Sin embargo, la
asignación de picos de IR del componente de amida I en el espectro de
colágeno es algo diferente debido a la estructura triple helicoidal de esta
proteína, este componente IR observado cerca de 1660 cm-1 se asigna a la
tensión asimétrica del hidrógeno triple helicoidal unido a las cadenas de
colágeno (Anagnostopoulos y col., 1993). El colágeno obtenido describe
este patrón de bandas característico. Varios estudios se han realizado con
el fin de establecer la relación entre la estructura secundaria del colágeno y
la forma de la banda IR de la amida I (Chang y Tanaka, 2002).
2.2.2. Análisis MEB.
Para la caracterización por MEB, se analizaron 45 esponjas de
colágeno tipo I libres de rCTMO.
2.2.2.1. Tamaño del poro
Para determinar el tamaño de poro se tomaron en cuenta dos
características, el perímetro y el diámetro de Feret.
Perímetro. El análisis estadístico indica que la matriz posee un perímetro de
poro promedio de 163 µm (Tabla 2), con un coeficiente de asimetría
levemente positivo (0,884) lo que indica una distribución homogénea a
ambos lados de la media con algunos valores inclinados hacia la derecha
de ésta. El coeficiente de curtosis (0,311), nos indica una distribución de
operaciones levemente leptocúrtica que, junto a la mediana positiva 157,2
(dato no mostrado), indica que hay una alta concentración de valores en
torno a un valor central y por tanto el comportamiento del sistema es
predecible.
54
Tabla 2. Parámetros estadísticos de la determinación del perímetro de poro de la matriz de
colágeno. Estadístico (µm)
Media 162,929
Intervalo de confianza para la media al 95% 149,818 - 176,040
Desviación estándar 43,640
Asimetría 0,884
Curtosis 0,311
La distribución de los perímetros de poro permite determinar que el mayor
porcentaje de frecuencia (42,2%) se encuentra ubicado entre 155 – 200 µm
(Tabla 3), lo cual indica que se puede hablar de macroporos que facilitan la
migración celular, la entrada y la distribución de los nutrientes.
Tabla 3. Frecuencia de ocurrencia y desviación estándar del perímetro de poro en las
esponjas de colágeno tipo I. Los datos han sido agrupados en rangos de 45 µm cada uno
Diámetro de Feret. El análisis indica que los poros presentan un diámetro
promedio de 64 µm (Tabla 4); con un coeficiente de asimetría positivo
(0,978) lo que indica una distribución homogénea a ambos lados de la
media con algunos valores inclinados hacia la derecha de ésta. El
coeficiente de curtosis (0,699), nos indica que estamos ante una
distribución de operaciones leptocúrtica, tomando en cuenta la mediana
positiva 63,75 (dato no mostrado), podríamos indicar que hay una alta
concentración de valores en torno a un valor central siendo de este modo,
predecible el comportamiento del sistema.
Grupos Perímetro de poro
(µm)
Frecuencia de
ocurrencia
(%)
Desviación
estándar
1 ≤ 110,00 6,7 1,329
2 110,01 - 155,00 35,6 13,663
3 155,01 - 200,00 42,2 14,362
4 200,01 - 245,00 11,1 15,939
5 245,01 ≥ 4,4 0,494
55
Tabla 4. Parámetros estadísticos de la determinación del diámetro de Feret de los poros de
la matriz de colágeno
Las frecuencias para el diámetro de Feret nos indican que el mayor
porcentaje se encuentra entre 45,01 y 65,00 µm (37,8%), sin embargo,
valores por encima de 65,00 µm y hasta 85,00 µm (Tabla 5), podrían ser
tomados en cuenta indicando cierta macroporosidad acorde con el
perímetro
Tabla 5. Frecuencia de ocurrencia y desviación estándar del diámetro de Feret de los poros
en las esponjas de colágeno tipo I. Los datos han sido agrupados en rangos de 20 µm
cada uno
Estadístico (µm)
Media 64,565
Intervalo de confianza para la media al 95% 58,820 - 70,309
Desviación estándar 19,119
Asimetria 0,978
Curtosis 0,699
Grupos Diámetro de Feret
de poro (µm)
Frecuencia de
ocurrencia
(%)
Desviación
estándar
1 ≤ 45,00 20,0 1,972
2 45,01 - 65,00 37,8 6,449
3 65,01 - 85,00 31,1 5,818
4 85,01 - 105,00 6,7 2,815
5 105,01≥ 4,4 6,717
56
2.2.2.2. Forma y área de los poros de la esponja de colágeno tipo I
La matriz presenta áreas promedio de 1984 µm2 (Tabla 6), con una
desviación estándar elevada y un asimetría positiva (1,461) indicando que
las áreas se encuentran ubicadas hacia la derecha de la media, el
coeficiente de curtosis indica una distribución leptocúrtica.
Tabla 6. Parámetros estadísticos de la determinación del área de poro de la matriz de
colágeno.
En el análisis de circularidad (Tabla 7) puede apreciarse que su mayor
frecuencia se encuentra en valores entre 0,88 y 0,98 (46,7%); teniendo en
cuenta que 1,0 representa un círculo perfecto y que a medida que decrece
este valor corresponde a formas más alargadas, podría deducirse que los
poros de la matriz presenta formas cercanas a elipses.
Tabla 7. Frecuencia de ocurrencia y desviación estándar de la circularidad de poro en las
esponjas de colágeno tipo I. Los datos han sido agrupados en rangos de circularidad de
0,06 cada uno Grupos Circularidad de poro
Frecuencia de
ocurrencia
(%)
Desviación
estándar
1 ≤ 0,75 4,4 0,056
2 0,76 – 0,81 2,2 -
3 0,82 – 0,87 26,7 0,016
4 0,88 – 0,93 46,7 0,016
5 0,94 ≥ 20,0 0,015
Estadístico (µm)
Media 1983,7060
Intervalo de confianza para la media al 95% 1669,2870 - 2298,1250
Desviación estándar 1046,5517
Asimetría 1,461
Curtosis 2,382
57
2.2.2.3. Interconectividad de los poros
Las imágenes adquiridas con el microscopio electrónico de barrido permiten
observar que la matriz posee una alta comunicación entre sus poros (Figura
11), lo que supone que es posible el tránsito de nutrientes y gases
necesarios para la viabilidad y proliferación celular. Se presentan poros
interconectados con otros en varias direcciones, sin embargo esto no
presenta efectos adversos ya que estudios han revelado que la dirección
del poro no afecta la estructura de la matriz puesto que estos son
microestructuralmente isotrópicos (Harley y col., 2007).
Figura 11. Interconectividad de poros. Imágenes MEB de esponja de colágeno tipo I en la
que puede observarse la forma en que los poros se encuentran interconectados. A) x100.
B) x300. C) x750. D) x2000 aumentos.
A
C D
B
58
2.2.2.4. Porosidad
Porosidad = ((W2-W1) / (W2-W3)) x 100%
Debido a que la matriz elaborada tiene una masa muy baja, se elaboró una
esponja de mayor masa siguiendo las mismas condiciones de preparación
para que se asemejara a las características de la matriz utilizada en los
experimentos definitivos. Los datos presentados corresponden a los
promedios obtenidos para cada variable después de tres repeticiones de
cada medición, estás masas son:
W1: 7,2 mg; W2: 71,4 mg; W3: 5,8 mg
Aplicando la formula tenemos:
Porosidad = ((74,4 mg – 7,2 mg) / (74,4 mg – 6,5 mg)) x 100%
Porosidad = 98,97 %
2.2.2.5. Rugosidad de la superficie
Los resultados cuantitativos de rugosidad superficial presentan
valores para Rc de (Rc=0,0238), además es posible observar
en la Figura 12 una serie de desigualdades en las paredes del
colágeno lo que supone que esta superficie puede permitir la
adhesión celular y por ende la proliferación celular que se
requiere en la generación de algún tejido.
Figura 12. Rugosidad. A) Imagen MEB de la microestructura de una esponja de colágeno
tipo I B) Imagen azimutal de la imagen A generada en ImageJ en la que se puede observar
la rugosidad en la superficie
A B
59
3. Caracterización, siembra y cultivo celular en matrices in vitro
3.1. Siembra celular.
Se usaron rCTMO en segundo pasaje, en los que la expresión de los
marcadores de células troncales CD90 y CD29 era mayor al 90%. Para la
siembra de las rCTMO en las esponjas se diseñó un sistema de carga de las
células con discos contenedores de las esponjas que permiten la estabilización
celular y después su traslado a un sistema de cultivo tridimensional en una
interfase líquido-gas. Por ensayos de capacidad de carga de las esponjas, se
determinó la concentración celular en 4x105/7µl y las esponjas sembradas
fueron evaluadas en diferentes tiempos de cultivo in vitro: 0, 7, 14 y 21 días.
Se logró observar que las esponjas de colágeno mantienen su estructura,
incluso adquieren una forma hinchada o esférica, durante las primeras
semanas de cultivo, sin embargo, al acercarse a la tercer semana (día 18 a 21
aproximadamente) las esponjas colapsan desintegrándose y convirtiéndose en
una masa blanda que no puede ser apresada con facilidad (figura 13).
Figura 13. Imágenes de cultivo celular tridimensional de rCTMO en esponjas de colágeno
tipo I en los que puede observarse un secuencial decrecimiento en el tamaño de las
esponjas a medida que pasa el tiempo. A) 0 días; B) 7 días; C) 14 días; D) 21 días.
B
B
C
A
D
60
3.2. Viabilidad celular y observación MEB.
La evaluación por medio de microscopia electrónica de barrido y la
determinación de la viabilidad celular con microscopia de fluorescencia (kit
Live/Dead®), permitieron establecer que las rCTMO sembradas en esponjas de
colágeno tipo I, colonizan, proliferan y conservan la viabilidad durante el cultivo
in vitro tridimensional en una interfase liquido-gas hasta 14 días.
Las imágenes (Figura 14) muestran que las rCTMO después de cultivo
comienzan a propagarse en la matriz, dividiéndose y agrupándose hasta
colonizarla. Se pudo apreciar una morfología esférica en estas células cuando
se encuentran en contacto con la matriz, se logró determinar que la matriz
provee soporte a estas células hasta los 14 días, tiempo en el cuál se observa
un desplome de la estructura. Se realizó una prueba para determinar si la
esponja sin rCTMO colapsaba o se degradaba por el paso del tiempo, sin
embargo después de 42 días se encontraba en condiciones similares al
momento inicial (resultados no mostrados) lo que nos permite deducir que la
interacción célula –matriz está relacionada con el colapso de la esponja.
Las células vivas se distinguen por un amplia presencia de la actividad
esterasa intracelular, la Calceína AM, que no es fluorescente, penetra en
células vivas y es convertida, por la actividad de esterasa intracelular, en el
colorante polianiónico Calceína, que es retenido por las células vivas y
fluoresce intensamente en verde (ex/em. ~495 nm/ ~515 nm). El homodímero
de etidio (EthD-1) entra en las células con membranas dañadas y tras la unión
a ácidos nucleicos produce una fluorescencia de color rojo brillante en las
células muertas (ex/em ~495 nm/ ~635 nm). Mediante el kit de células vivas y
muertas (Live/Dead®) pudo determinarse que las matrices de colágeno tipo I
mantienen la viabilidad celular durante los diferentes días de cultivo, es decir,
en los tiempos indicados la matriz no sólo provee de soporte a las células sino
que además permite el transporte de sustancias y gases hacia la célula y
desde ella.
61
Figura 14. Imágenes del microscopio electrónico de barrido (MEB) donde pueden
observarse las rCTMO colonizando y proliferando a diferentes tiempos 0 días A y B; 7 días
C y D; 14 días E y F; 21 días G y H.
A B
C D
E F
G H
62
Figura 15. Imágenes de inmunofluorescencia en las que se aprecia la viabilidad celular a
diferentes tiempos de cultivo. Verdes: vivas, Rojas: muertas. A) 0 días; B) 7 días; C) 14
días; D) 21 días. Observación con objetivo de 40x.
En la figura 15 puede apreciarse como las células permanecen viables
hasta los 14 días, luego comienza a aumentar el número de células
muertas, debido a la saturación de la estructura de colágeno y a un posible
solapamiento de las superficies de adhesión que les cierra el paso a los
nutrientes y gases vitales para la célula.
C D
A B
63
DISCUSIÓN
Cada día aumenta la necesidad de implementar terapias que permitan solucionar
problemas clínicos de una manera diferente o alternativa a las terapias
convencionales. Un buen ejemplo de esto es el restablecimiento de tejidos
afectados por medio del uso de las células madre o células troncales, esta
alternativa busca disminuir las limitaciones que tienen los procedimientos clínicos
convencionales. Para la aplicación de terapias de este tipo, se busca en primera
instancia la producción de cultivos de células indiferenciadas que por medio de
procedimientos de laboratorio sean inducidas a diferenciarse hacia un linaje de
interés y que posteriormente puedan ser sembradas en biomateriales soporte que
permitan su prolifereción y adicionalmente su implantación en los sitios que
requieren el sometimiento a un proceso de regeneración.
Los adelantos tecnológicos alcanzados durante los últimos años, han permitido
avanzar en el entendimiento de las células troncales y en cómo su uso podría
mejorar las posibilidades de los implantes autólogos, siendo un avance importante
para la medicina regenerativa (Mathur y col., 2014). A nivel mundial muchos
grupos de investigación están intresados en el trasplante de células madre
derivadas de tejidos adultos para el tratamiento de enfermedades como la
osteoporosis, la artritis, las distrofias musculares, la cardíaca, la periodontal y las
enfermedades degenerativas de los nervios (Zhao y col., 2010), entre otras.
En Colombia hay varios grupos de investigación que están enfocados en el
estudio de los diversos componentes de la ingeniería de tejidos y su utilización
terapeútica, por ejemplo en el ámbito de las células troncales podemos mencionar
el Grupo de Investigación en Biología de Células Madre de la Universidad
Nacional de Colombia (UNAL) sede Bogotá, que ha trabajado proyectos como la
proliferación y diferenciación osteogénica de células madre mesenquimales en
hidrogeles de plasma sanguíneo humano, al igual que el Grupo de investigación
en Ingeniería Biomédica de la Universidad CES de Medellín y la Escuela de
Ingeniería Ambiental que ha trabajado en obtención de células madre del tejido
adiposo y su potencial de diferenciación osteogénico, además deben mencionarse
los trabajos adelantados por el Grupo de Ciencias Básicas Médicas de la
Universidad del Rosario quienes se han enfocado en estudiar los aspectos
biológicos y moleculares de la expansión y diferenciación de las células madre
mesenquimales en cultivo; en la Universidad Javeriana se encuentra el grupo de
Inmunología y Biología Celular que ha trabajado sobre células estromales
64
mesénquimales de médula ósea, el aislamiento y caracterización de células stem
mesenquimales de medula ósea y células hematopoyeticas derivadas de sangre
de cordón umbilical, entre otros, y el Centro de Investigaciones Odontológicas que
ha presentado avances en la caracterización de células troncales de humanos y
nuestro grupo que trabaja en la caracterización de células troncales de origen
animal.
De otro lado se encuentran grupos de estudio en biomateriales, propiamente en
colágeno encontramos los trabajos en Ingeniería de tejidos de la Universidad
Nacional de Colombia que en sus primeras investigaciones obtuvo un sustituto
dérmico a partir de soportes de colágeno tipo I y fibroblastos aislados de dermis.
Después utilizando el mismo tipo de soportes y fibroblastos de mucosa oral de
conejo se elaboró un sustituto de tejido conectivo de mucosa oral, que mostró
características de tejido los cuáles aseguran son los únicos reportados en
Colombia, actualmente también trabajan en la elaboración y caracterización de
soportes de colágeno tipo II y en la evaluación de reparación de heridas cutáneas
con soportes de colágeno que contienen extracto de caléndula; además
encontramos el grupo de Investigación de la Universidad de los Andes quiénes
adelantan trabajos en la estandarización de un protocolo de extracción y
caracterización del material proteico del esmalte dental erupcionado, en el cuál
identificaron colágeno tipo I y III. La Universidad Pontificia Bolivariana (UPB)
Seccional Bucaramanga ha trabajado en la evaluación de la adsorción de
colágeno sobre matrices de PLA-PGA-biocerámico-quitosano mediante
espectroscopia de impedancia electroquímica; en la Universidad Javeriana nuestro
grupo ha logrado avances en el estudio de diversos materiales como el diacrilato
de polietilenglicol (PEGDA) y el colágeno.
El presente estudio hace parte de una línea de investigación, en la cual se busca
el trasplante de células de una rata en otra, lo cual motivó el uso de un modelo
animal y dentro de la selección de éste se escogieron ratas del linaje Lewis. Este
linaje, es endocriado por lo cual sus individuos se pueden considerar singénicos y
por lo tanto el trasplante de células entre ellas, es análogo a un trasplante
autólogo, por lo cual puede limitarse el riesgo de rechazo al injerto (Guo y col.,
2011). En este trabajo se logró aislar células troncales de médula ósea de rata, las
cuáles presentan características de acuerdo con los parámetros propuestos por la
Sociedad internacional de terapia celular, que incluyen que cuando están en
cultivo deben ser adherentes al plástico, deben ser positivas para los antígenos de
superficie CD90 y deben perder el marcador CD45 y por último que deben tener el
65
potencial para diferenciarse a osteoblastos, adipocitos y condrocitos, bajo
condiciones de diferenciación estándar in vitro (Pittenger y col., 1999).
Resultados simultáneos que pertenecen al mismo grupo de investigación
permitieron evaluar la plasticidad de los cultivos comprobando la capacidad de
diferenciación de estas células hacia el linaje osteogénico (en proceso de
publicación). En cuanto a la morfología celular encontrada, se pudo identificar que
en el cultivo primario coexisten subpoblaciones celulares con diversidad de
morfologías entre ovaladas, alargadas, cúbicas, estos resultados son similares a
los obtenidos por Karaoz que caracterizó la morfología de células en cultivos
primarios después de siete días de cultivo, como poco homogénea (Mathur y col.,
2014; Karaoz y col., 2009). En general en los cultivos primarios se observaron
poblaciones celulares heterogéneas, resultados consistentes con los encontrados
por el grupo del doctor Zhao (Zhao y col., 2010), con abundancia de células
redondeadas más características de subpoblaciones de células hematopoyéticas
(Yamachika y col., 2013), razón por la cual se decidió hacer la separación de la
fracción CD45+ de este pasaje y así se obtuvieron células con un 95% de pureza
con respecto a la población de células hematopoyéticas; la mayoría de los
estudios hacen la depuración de las poblaciones celulares CD45+, por medio de
los cambios sucesivos de medio de cultivo y a través de la eliminación natural que
se hace de células no adherentes cuando el cultivo avanza en los pasajes
sucesivos. La eliminación (supresión) de la fracción CD45+, y de las células CD45-
no mesenquimales (como las pertenecientes al linaje eritroide), supone un
ambiente con mayor disponibilidad de sustrato y espacio para la proliferación de
las poblaciones celulares deseadas (CD45-), es así, como en estos cultivos la
evaluación de la presencia de células CD45+ se redujo paulatinamente hasta
alcanzar valores de 0.5 en el tercer pasaje, valores consistentes a los reportados
por otros autores (Ding y col., 2014).
Las células recuperadas después de la depuración de las poblaciones CD45+ y
que fueron equivalentes al 10% de las células obtenidas en el cultivo primario,
fueron subcultivadas hasta alcanzar el sexto pasaje. Durante los pasajes uno a
seis, se observaron resultados muy consistentes, con respecto a la morfología las
células se establecieron en forma de husos, algunas más alargadas que otras, tal
como lo reportan otros grupos (Mabuchi y col., 2013) y en cuanto a la expresión de
los marcadores, otros estudios plantean que la estrategia general para identificar
rCTMO cultivadas in vitro es la expresión de marcadores de superficie celular tales
como CD29, CD44, CD90 y CD106 (Yu et al. 2007; Karaoz y col., 2009). En el
presente estudio, en todos los pasajes evaluados se encontró que CD90 y CD29
son los que más se expresan y que CD71 y CD106 con algunas diferencias
66
estadísticas por pasajes poseen intensidades de fluorescencia muy bajas,
pudiéndose determinar que el fenotipo de las células troncales de médula ósea de
rata está definido como CD90alto, CD29alto, CD71bajo, CD106bajo. La mayoría de los
estudios en los cuales se evalúan marcadores de expresión en células troncales
de médula ósea han reportado la alta positividad de CD90 en sus cultivos y muy
baja positividad, cerca del 1% para el CD45+ (Yu y col., 2007; Polisetti y col., 2010;
Guo y col., 2011; Pavlichenko y col., 2008; Carr y col., 2008; Ding y col., 2014). En
general las células troncales, están definidas por un panel de marcadores de
superficie positivos y negativos (Dominici y col., 2006). En otro estudio en el cual
se obtuvieron células mesenquimales del compartimiento estromal de la médula
ósea de rata para usarlas en la regeneración de tejidos endometriales encontraron
que estas células son positivas para CD90 y para CD29 y negativas para CD45
(con valores de 0.04%) (Ding y col., 2014).
El creciente interés por el MSC como actores clave en la medicina regenerativa
con células madre, y el hecho de que no hay un marcador "gold standard" para
estas células, ha instado a los investigadores a definir criterios estrictos para la
caracterización de estas células (Barzilay y col., 2009); aunque el fenotipo de las
MSC está muy bien definido en humanos (Barzilay y col., 2009) y en ratón (Ooi y
col., 2013; Rostovskaya y Anastassiadis, 2012), se hipotetizaba que las moléculas
homólogas en rata se comportaran de la misma manera como se ha descrito en
dichas especies; pero se puede decir, a partir de los distintos estudios reportados
con este tipo de células MSC en rata, que no existe uniformidad en cuanto a la
selección de los marcadores de superficie y aún más se presentan resultados
controversiales en cuanto a la expresión positiva o negativa de estos marcadores.
Las diferencias encontradas posiblemente se deben, a que cada grupo de
investigación tiene o utiliza elementos experimentales muy distintos, los cuales,
dependen del alcance que cada grupo tiene a los componentes comerciales que
facilitan estos estudios. Sin embargo, lo que queda claro es que se puede
determinar como producto de éste estudio, que el fenotipo de las células troncales
de médula ósea de rata puede estar definido como CD90alto, CD29alto, CD71bajo,
CD106bajo.
Aunque las células troncales de médula ósea se han considerado bastante
promisorias, antes de determinar su uso en estudios in vitro e in vivo, es necesario
desarrollar más estudios que conduzcan a la determinación de la pureza de éstas,
de las ya diferenciadas (Ladak y col., 2011). En el caso de células troncales
derivadas de médula ósea en humanos, la mayoría de los autores muestran que
algunas siembras de éstas, resultan en la formación de unas colonias iniciadas
67
por células simples, llamadas unidades formadoras de colonias de fibroblastos
(CFU-Fs), sin embargo en el modelo murino las CFU-Fs son altamente
contaminadas con células redondeadas por lo menos en los cultivos iniciales, por
lo cual esta característica no puede ser tenida en cuenta como un factor de
predicción de la calidad y crecimiento de estas células y más bien debe evaluarse
que la mayoría de las células en cultivo muestren una morfología en forma de
husos y con núcleos redondeados que son consistentes con los resultados
encontrados en células de murino por Pittenger y col. (1999) y Crisostomo y col.
(2008).
La capacidad de expandir las células troncales en cultivo es un paso indispensable
para la medicina regenerativa, y se ha hecho un esfuerzo considerable para
evaluar las consecuencias del cultivo sobre el comportamiento celular (Bluteau y
col., 2008), en este estudió se obtuvo que las células pueden mantener el fenotipo
CD90alto, CD29alto, CD71bajo, CD106bajo en todos los pasajes, resultados
concordantes con los descritos por Romagnoli y Brandi en 2014 y que hasta lograr
la confluencia en cada uno de los pasajes las células mantienen un porcentaje de
viabilidad de alrededor del 90%, conservando valores de proliferación que van en
aumento, hasta alcanzar el 90% de confluencia por pasaje, en donde son
removidas para evitar la senescencia de los cultivos, minimizando la posibilidad de
que se den cambios genotípicos durante el cultivo, hallazgos encontrados en otros
estudios que han mostrado que las células troncales derivadas de médula ósea de
humano pierden su múltiple capacidad de diferenciación cuando son cultivadas
por periodos prolongados (Guo y col., 2011).
Los cultivos bidimensionales de rCTMO mantienen su estado de indiferenciación
(Schmitz y Hollinger, 2001) en los cuales la expresión de los marcadores
evaluados CD90 y CD29 se incrementan durante el segundo y el tercer pasaje y
es precisamente durante estos pasajes cuando también se encuentra mayor la
expresión de CD71 y CD106. Así caracterizadas, se asume que en este momento,
entre P2 y P3, las células se encuentran capacitadas para establecerse como
células indiferenciadas en un cultivo tridimensional o para ser sometidas dentro del
mismo sistema de cultivo a factores de diferenciación.
Para permitir un mayor avance en la comprensión del potencial terapéutico de
estas células, es igual de importante el conocimiento y desarrollo de biomateriales
soporte que proporcionen un microambiente a las rCTMO. Para varios grupos de
investigación a nivel mundial el uso de matrices de colágeno ha representado una
opción importante como biomaterial soporte ya que el colágeno es un polímero
68
natural y usado en modelos animales, por ejemplo, tiene un comportamiento de
material autólogo que podría evitar reacciones de rechazo inmunológico que
influyen en el porcentaje de fracasos del uso de este tipo de terapia. En nuestro
grupo de investigación se comprobó que el uso de un colágeno comercial extraído
de tejidos de pollos generó una respuesta de rechazo cuando se usó como matriz
o biomaterial soporte de células troncales derivadas de médula ósea y fue
implantado in vivo en ratas (datos en proceso de publicación), por lo cual se
decidió hacer la extracción del colágeno tipo I de los propios sujetos de
experimentación, ratas Lewis en nuestro caso y se encontró que matrices de éste,
presentan ventajas significativas sobre otros materiales, que sugieren su uso para
experimentos de regeneración en la gran mayoría de tejidos; por ejemplo en el
estudio de Sumita y col. (2006), se demostró que el colágeno permite en mayor
porcentaje la producción de tejido calcificado y diente que el PGA (73% contra
53%), además que presenta multiporos que permiten la adhesión celular, que
tiene una baja citotoxicidad y permite la diferenciación de tejidos, convirtiéndose
así, en una opción de interés en el campo de la regeneración de tejidos.
Para la extracción de colágeno con miras a ser usado como matriz o biomaterial
soporte de células, se han utilizado varios métodos, entre los que se incluyen la
extracción ácida y la extracción con urea (Xiong y col., 2009). Los resultados de
este estudio demuestran que el método de extracción ácida del colágeno usado,
permite que éste, no experimente cambios en su estructura, ni siquiera cuando es
sometido a procesos repetitivos de congelación, liofilización, reconstitución en
ácido y mezclado por medios mecánicos, resultados concordantes con los
encontrados por Rajan y col. (2006), además el gel de colágeno obtenido presenta
propiedades físicas y químicas que le permiten ser adaptado a un uso específico y
ser sembrados con diferentes tipos de células madre para crear constructos:
polímero-células tal como lo demuestra en su estudio Syková y col. (2006),
además estos constructos pueden servir como portadores de células que puestos
dentro del sitio que tiene la lesión pueden facilitar la regeneración del tejido.
Los resultados de la evaluación por microscopía electrónica, dejaron observar que
la extracción del colágeno conduce a la formación de fibras, siendo estas más
estables y con propiedades de tracción superiores cuando se liofilizan a un pH
más alto que el neutro, resultados coherentes con los reportados por Usha y
Ramasami (2005). Sin embargo, en este estudio al evaluar la viabilidad celular en
las estructuras de colágeno formadas a un pH mayor que el neutro, mostraron
claramente que no favorecieron la adhesión y la supervivencia de las células
sembradas, lo cual confirma la necesidad de neutralizar las soluciones de
69
colágeno antes de sembrar las células; en las esponjas cuyo pH fue
perfectamente neutralizado se hizo evidente el desarrollo de un microambiente
celular, determinado cualitativamente a través de la evaluación por microscopía de
fluorescencia de las células vivas que fueron en aumento durante el transcurso de
los días de evaluación.
Por otro lado, la radiación con UV de las esponjas antes de ser sembradas con las
células, también resultó siendo un componente clave en el uso del colágeno como
matriz, en el presente estudio se usaron 3 h de radiación con UV, basados en el
estudio realizado por Sionkowska y Wess (2004), en el que se evaluó la influencia
de la radiación UV sobre las propiedades mecánicas del colágeno a diferentes
tiempos de exposición (0, 2, 4, 6 y 8 horas), estos investigadores demostraron que
a medida que pasa el tiempo la resistencia a la tracción del colágeno disminuye, la
elongación aumenta a las 2 horas pero disminuye drásticamente a las 4 horas,
mientras que el módulo de Young disminuye a las 2 horas y aumenta al cabo de 4
horas; todas éstas pérdidas de las propiedades mecánicas del colágeno después
de la irradiación UV, pueden estar relacionadas con las divisiones inter e intra-
moleculares de los enlaces de hidrógeno y liberación de agua que controla los
enlaces H-O-H del colágeno. Estos resultados son comparables con los del
presente estudio, en el cual el uso de 3 horas de radiación UV fueron suficientes
para demostrar que las matrices de colágeno adquirieron una microestructura
rugosa que permite la adhesión y la proliferación celular de las rCTMO,
contrariamente las esponjas que no fueron irradiadas con UV, presentaron
paredes lisas por lo tanto la adhesión celular se vio comprometida; otros estudios
demuestran que la rugosidad y el entrecruzamiento de las moléculas de colágeno
tienen un efecto directo sobre el desarrollo de las MSC (Beitzel y col., 2014).
La espectroscopia de IR es uno de los métodos más potentes para el estudio de la
estructura de las proteínas y la conformación de las cadenas polipeptídicas,
algunos estudios han demostrado como métodos espectroscópicos permiten
analizar la estructura del colágeno (Guilbert y col., 2013). La espectroscopia FT-IR
en el modo de reflexión total atenuada (ATR) permitió la caracterización de la
estructura secundaria de las muestras de colágeno que obtuvimos a partir de
tendones de cola de rata. Nuestros resultados sugieren que el colágeno obtenido
mantiene las características propias del colágeno nativo cuyos entrecruzamientos
intermoleculares podrían ser investigados gracias a la descomposición de la
banda amida I. Como describe Paschalis y col. (2004), estos entrecruzamientos
proporcionan a las matrices de colágeno fibrilar propiedades como resistencia a la
tracción y viscoelasticidad, el análisis espectral realizado usando ATR-FITR, ha
70
mostrado que el colágeno tipo I extraído presenta bandas de amida I (1660 cm-1) y
tensión N-H (3330 cm-1) concordante con diversos estudios (Guilbert y col., 2013,
Chadefaux y col., 2008), Roy y col. (2010) han demostrado previamente que la
transformada de Fourier de infrarrojos (FT-IR) utilizado en el modo de reflexión
total atenuada (ATR) permite cuantificar la glicación in vitro de geles de colágeno.
Algunos autores han comprobado porque el colágeno tipo I, es una de las
proteínas más utilizadas en la elaboración de matrices y han explicado su utilidad
debido a que cumple con los criterios mínimos aceptados para usar un biomaterial
como matriz, entre estos autores se puede citar a Texeira y col., (2010), quienes
plantean que una matriz debe tener una macroporosidad que permita la migración
celular y una microporosidad, que como ya se mencionó permita la adhesión
celular. Adicionalmente debe presentar poros conectados entre sí, que provea
condiciones para el transporte de nutrientes, la infiltración de tejidos y la
vascularización y tiene que permitir la adhesión, la diferenciación y la formación de
tejido. Incluso Syková y col. (2006) plantean que la red macromolecular de los
hidrogeles proporciona un espacio libre para la difusión de los fluidos
extracelulares que contienen los factores de crecimiento y tróficos (o
nutricionales) liberados por las células vecinas.
En el presente estudio se encontró que la esponja de colágeno tipo I obtenida por
liofilización de una solución neutra de colágeno extraída de tendones de cola de
rata, presenta macroporos con perímetro promedio de 163 µm cuyo porcentaje de
frecuencia dentro de la estructura es de 42,2%, también presentan un diámetro de
Feret promedio de 64 µm, áreas promedio de 1983 µm2 y una porosidad de
98,97%, lo que indica que puede ser usado como matriz favoreciendo la migración
de las células, la circulación de nutrientes y gases necesarios para el metabolismo
celular y la proliferación celular, resultados que son comparables con estudios
anteriores en los que se han observado alta interconectividad, porosidad mayor al
95%, diámetro de poro alrededor de 126 µm y adhesión celular (Levingstone y
col., 2014; Xu y col., 2014, Wang y col., 2012), además Zhang y col. (2014),
concluyen que controlar las características del poro es un factor que afecta la
eficiencia en la regeneración tisular; si los poros de la matriz son demasiado
pequeños, se puede producir la oclusión de los poros, lo que a su vez impide la
penetración celular, la producción de ECM y la neovascularización de las áreas
internas de la matriz, como lo reportan otros estudios (Ferreira y col., 2010,
Murphy y O'Brien, 2010). En el presente estudio los poros presentan forma de
elipses con circularidades comprendidas entre 0,88 y 0,98, además de una
adecuada interconectividad en la que sus poros se abren paso en diversas
direcciones, sin embargo este factor no afecta la estructura ya que son
71
microestructuralmente isotrópicos, como lo demuestra en su estudio Harley y col.
(2007). La matriz obtenida presenta una microestructura compuesta por una
superficie con un índice de rugosidad Rc=0,0238 lo que permite la adhesión de las
células estableciendo una interacción célula-matriz para el desarrollo de cualquier
tejido por vía de ingeniería de tejidos, tal como lo demostraron en su estudio
Boyan y col. (2001) en el cuál concluyeron que las células sembradas sobre
superficies lisas se sueltan con mayor facilidad que aquellas que crecen sobre
superficies rugosas.
La caracterización de la matriz reveló una alta porosidad, esta estructura porosa
proporciona un entorno 3D favorable para acomodar células troncales de médula
ósea de rata en una densidad de siembra de 4x105 células/7µl de medio de cultivo
y promover la condensación celular requerida para la formación de tejidos. Esta
porosidad proporciona el microambiente ideal para el intercambio de nutrientes de
células, la deposición de ECM y para reducir al mínimo la efectos nocivos de los
productos de desecho a través de los gradientes de difusión (Patel y col., 2013).
Este estudio permitió comprobar que las células dentro de la matriz de colágeno,
adquieren una forma redondeada diferente a la forma alargada que presentan
cuando se encuentran en cultivo bidimensional, pero el alcance de este trabajo no
permite dar una explicación a este comportamiento celular, ya que no es posible
desprenderlas sin afectar su viabilidad o alterar su comportamiento. En este
mismo sentido encontramos que la matriz de colágeno permite la viabilidad celular
durante 14 días de cultivo in vitro, tiempo en el cuál es posible trasladar la matriz
sembrada a otro sistema de cultivo o implantarla para permitir su desarrollo in vivo.
Se pudo observar que al momento de la siembra celular, la matriz de colágeno
experimenta un hinchamiento debido posiblemente a una hidratación del colágeno
con el medio de cultivo, sin embargo esto no afecta el componente celular ya que
la microscopia de fluorescencia permitió observar que las células permanecen
viables en el momento de la siembra; dentro de los 7 días posteriores a la siembra
de rCTMO en la matriz de colágeno, se pudo observar que la matriz adquiere
gradualmente una coloración blanquecina debida tal vez a la proliferación celular y
al aumento en el número de células según lo observado mediante MEB y a la
viabilidad indicada en la microscopia de fluorescencia para este tiempo; a los 14
días se observa un decrecimiento progresivo del volumen de la esponja sembrada
y una disminución en la viabilidad celular, sin embargo, la MEB mostró que las
células continúan proliferando y han colonizado la mayor parte de la matriz. Estos
resultados pueden estar indicando, que este es el momento ideal de
72
establecimiento del cultivo tridimensional que permitiría completar dentro de este
procedimiento, los elementos básicos de la ingeniería de tejidos, como la adición
de factores de crecimiento y de diferenciación y la implantación in vivo, que es
objetivo final de la regeneración de tejidos; adicionalmente la matriz colágeno-
rCTMO obtenida no se disgrega al contacto con medio líquido y por lo tanto no
requiere de la combinación con otros materiales para poder ser transportado e
implantado.
Contrariamente a los 21 días de cultivo se encontró un decrecimiento casi total del
volumen de la matriz y una viabilidad celular muy baja, debido al debilitamiento de
las paredes de la matriz, tal vez por efecto del peso de la cantidad de células que
debe soportar al pasar los días, lo que podría causar un amontonamiento o
superposición celular que no permita el correcto desarrollo morfológico y también
un posible solapamiento de las paredes obstruyendo los poros de transporte de
los nutrientes y oxígeno, lo que daría como resultado la muerte celular y que se
encuentra descrito en otros estudios como el colapso de la estructura de colágeno
(Ding y col., 2014; Chen y col., 2014).
73
CONCLUSIONES
La médula ósea es una fuente de células troncales, que en cultivo bidimensional y
hasta el sexto pasaje, conservan una caracterización definida por la ausencia de
células CD45+ y la expresión alta de los marcadores de superficie CD90 y CD29 y
baja de CD71 y CD106. Estas células conservan una relación de proliferación que
va en aumento hasta alcanzar la confluencia celular, momento en el cual el 90%
permanecen viables.
Se logró estandarizar un procedimiento de extracción de colágeno tipo I puro a
partir de los tendones de colas de rata, que puede ser usado como un gel, o como
una esponja cuando el gel es liofilizado.
El colágeno extraído permitió el diseño de una matriz tridimensional, cuya forma y
tamaño pueden ser adaptados a usos específicos, proporcionando un andamiaje
con micro y macroarquitectura, que permiten la difusión de los fluidos y gases, al
interior de ellas.
El colágeno tipo I, usado como esponja permitió la adhesión celular de las células
troncales de médula ósea y las interacciones necesarias colágeno-células para
obtener el desarrollo de una estructura controlada a nivel espacial y temporal, que
no se disgregó durante el cultivo in vitro.
El método de siembra y cultivo en 3D desarrollado, permitió establecer un sistema
de cultivo para el constructo colágeno-células, que promovió la proliferación
celular en su interior, posibilitando su implantación.
Las esponjas de colágeno tipo I pueden servir como un biomaterial soporte de
células troncales hasta por un periodo de 14 días, después de los cuales puede
ser usada para protocolos de regeneración de tejidos.
74
RECOMENDACIONES
El presente estudio presenta limitaciones, en primer lugar no existe uniformidad en
cuanto a la expresión de marcadores de superficie de células troncales derivadas
de tejidos animales; en humanos hay controversia en cuanto a la expresión
positiva o negativa de algunos marcadores. Sin embargo en todos los estudios
hechos con animales y que fueron analizados durante la elaboración de este
trabajo, los marcadores CD90 y CD29 están definidos con alta expresión tal como
lo encontrado en este estudio. Al no existir un panel exacto de caracterización de
células troncales, actualmente los distintos grupos a nivel mundial que están
interesados en uso de células troncales como una alternativa terapéutica, han
terminado caracterizando los cultivos puros de éstas con base en su capacidad de
diferenciación a osteoblastos, condroblastos y a adipocitos. En el presente estudio
no se realizaron ensayos de diferenciación de las células cultivadas, determinado
el fenotipo celular como negativo para CD45, con positividad alta para CD90 y
CD29 y baja para CD71 y CD106, se consideraron aptas para establecer un
cultivo tridimensional de células troncales. Sin embargo, resultados simultáneos de
otros estudios que pertenecen al mismo grupo de investigación, han mostrado la
capacidad de diferenciación de estas células hacia el linaje osteogénico. Por lo
anterior se recomienda completar la caracterización de los cultivos de estas
células con la inducción de su diferenciación hacia otros linajes.
El método de extracción del colágeno es dispendioso y de larga duración, implica
pasos repetitivos de ultracongelación, reconstitución, mezclado por medios
mecánicos y liofilización; por lo tanto se recomienda un estricto rigor en el
procedimiento usado, ya que la inclusión de cambios pueden conducir a cambios
en la calidad del colágeno, por ejemplo, el sobrecalentamiento de las soluciones
de éste durante alguna parte del procedimiento puede conducir a la
desnaturalización de la proteína, lo cual se representa en cambios en la micro y
macroarquitectura de las matrices que finalmente podrían afectar el desarrollo del
constructo colágeno-células. En este estudio, no se pudo comprobar la
conservación del fenotipo celular de las células en el cultivo tridimensional, aunque
por medio de la microscopía electrónica de barrido se demostró la proliferación
celular al interior de la matriz; no es claro, sí el cambio en la morfología celular
observado está relacionado con las interacciones con la matriz, por lo cual
recomendamos el uso de los mismos marcadores definidos en el cultivo
bidimensional, pero que puedan ser usados in situ para completar su
caracterización en el cultivo 3D.
75
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86
ANEXOS
ANEXO 1
PROTOCOLO DE OBTENCIÓN DE CULTIVOS PRIMARIOS DE
MÉDULA ÓSEA DE RATA
Reactivos e Instrumentos
Tijeras de tejidos
Pinzas de tejidos con garra
Pinzas de tejidos sin garra
Mango de bisturí
Bisturí
Pinzas mosquito
Tubos Falcon
α-MEM
Suero fisiológico
Protocolo
1. Realice un corte subcostal en la piel de la parte ventral y sobre la
extremidad posterior que se desea diseccionar
2. Proceda a levantar la piel con el bisturí (mango N°4 hoja N°21) y la pinza
con garra, hasta poder quitar la piel, de esta forma, comenzar a tratar los
músculos y las diferentes estructuras que se encuentran allí
3. Separe las extremidades posteriores del animal con cuidado de no partir
ningún hueso de ellas
4. Limpie los huesos del tejido muscular que los recubre, dejándolos
completamente libres
5. Deposite los huesos procesados en suero fisiológico para evitar su
resequedad
6. Con ayuda de un pinza mosquito, retire las epífisis del hueso y corte en las
metáfisis, de ésta manera quedará expuesta la médula ósea; en el caso de
87
la tibia se debe cortar la metáfisis superior y sobre la pinza tibioperonea
(unión de tibia con peroné) en la parte inferior.
7. En una jeringa estéril tome suficiente α-MEM (medio de cultivo) e introduzca
la aguja dentro del hueso recién cortado, presione para salga medio y
arrastre médula a su paso, deposítelo en un tubo Falcon de 15 mL
8. Repita el proceso con el número de huesos que se tengan y usando el
número de tubos Falcon que estime conveniente
9. Luego centrifugue a 650 xg a 4°C por 5 minutos
10. Descarte el sobrenadante y resuspenda el pellet en 5 mL de α-MEM
11. Proceda a sembrar en cajas de cultivo y guárdelas en incubadora a 37°C y
5% de CO2
88
ANEXO 2
PROTOCOLO DE MARCACIÓN Y SEPARACIÓN MAGNÉTICA CON
MICROPERLAS Anti- PE
Reactivos e Instrumentos
1. Buffer de separación: Realice una dilución 1:20 con la solución MACS BSA
Stock Solution (#130-091-376) con autoMACS Rinsing Solution (# 130-091-
222). La solución resultante manténgala de 2-8°C.
2. Columnas MACS de separación magnética
3. MicroPerlas anti-PE
4. Magneto con su base
Protocolo
1. Recoja las células que van a ser sometidas, de acuerdo al método
convencionalmente usado.
2. Proceda a hacer la marcación magnética
a. Trabaje rápido, mantenga las células en frio, y use las soluciones
previamente frías (esto prevendrá una marcación inespecífica o
deterioro de los anticuerpos).
b. El volumen celular para la marcación con las células magnéticas debe
estar por debajo de 107 células totales. En caso de tener menor número
celular use los mismos volúmenes indicados. Cuando trabaje con
número de células más altos, ajuste de acuerdo a los volúmenes
respectivos.
c. Para una óptima separación, antes de realizar la tinción con las perlas
magnéticas obtenga una suspensión simple de células, sin agregados.
En caso de tener grupos celulares, pase las células por un filtro de nylon
(alrededor de 30 µm) con suficiente buffer.
d. Tenga en cuenta que la fuerza de centrifugación sea la adecuada para
cada tipo celular.
e. Titule el anticuerpo acoplado a PE, evitando una sobre tinción de la
población negativa.
f. Determine el número de células, en cámara de Neubauer y teñidas con
azul Tripán (distribúyalas en eppendorf)
89
g. Centrifugue la suspensión celular a 650xg por 5 minutos. Aspire el
sobrenadante completamente.
h. Resuspenda el botón celular y tiña con el anticuerpo primario conjugado
con PE, de acuerdo a las especificaciones del fabricante. Para los
anticuerpos conjugados con PE MACS (CD45 PE), resuspenda para un
total de 107 células en 200 µl de buffer de separación y adicione 10 µl
del conjugado PE.
i. Mezcle muy bien e incube por 20 minutos en oscuridad en el
refrigerador (2-8°C), o de acuerdo a las especificaciones del fabricante.
Se recomienda realizar la incubación en rotación.
j. Lave las células para remover el anticuerpo primario no unido, mediante
la adición de 1,5 ml de buffer por 107 células y centrifugue a 650xg por 5
minutos.
k. Repita el lavado
l. Aspire completamente el sobrenadante y resuspenda el botón celular en
160 µl de buffer para un total de 107 células.
m. Adicione 20 µl de MicroPerlas Anti-PE por un total de 107 células
n. Mezcle bien e incube por 20 minutos en el refrigerador (2-8°C). (En este
tiempo se puede ir preparando la columna)
o. Lave las células por adición de 1,5 ml de buffer de separación por 107
células y centrifugue a 650xg por 5 minutos.
p. Aspire el sobrenadante completamente
q. Resuspenda hasta 108 células en 500 µl de buffer de separación. Si
tiene más células a éste número aumente proporcionalmente.
r. Proceda a la separación magnética
3. Separación magnética con columnas MS:
a. Ubique la columna en el magneto
b. Prepare la columna por dos lavados con 500 µl de buffer de separación.
c. Ubique la suspensión celular dentro de la columna
d. Colecte las células no marcadas (CD45-) que pasan a través de la
columna, y lave la columna con cantidad apropiada de buffer de
separación. Realice 3 veces el lavado por la adición de buffer.
Únicamente adicione nuevo buffer, cuando el reservorio de la columna
esté vacío. (3x500µl)
e. Remueva la columna del campo magnético y ubíquela en un tubo de
recolección adecuado.
90
f. Pipetee 1 ml de buffer dentro de la columna e inmediatamente por
medio del émbolo, empuje con firmeza dentro de la columna. Así
obtendrá las células marcadas (CD45+)
g. Opcional: para incrementar la pureza de las células marcadas
magnéticamente, la fracción eluída (1ra población), puede ser pasada
por una segunda columna o marcar nuevamente con los anticuerpos
con perlas. Repita el procedimiento.
91
ANEXO 3
PREPARACIÓN DE COLAGENO TIPO I DE COLAS DE RATA LEWIS
REACTIVOS DE PARTIDA
REACTIVO CONCENTRACIÓN CANTIDAD
Agua ultra pura 8 Litros
PBS 1 Litro
Acetona pura 99% 1 Litro
Alcohol isopropílico 99.9% 1 Litro
Cloroformo en solución 99% 40 mL
Ácido acético glacial 99% 24 Litros
Cubos de hielo de agua ultra
pura
0.5 Litros
PREPARACION DE SOLUCIONES
SOLUCION DE ÁCIDO ACÉTICO
El ácido acético comercial tiene una concentración al 99% correspondiente a
17,48 N
Para preparar 1 Litro de solución de ácido acético al 0,02 N:
C1xV1=C2xV2; 0,02Nx1L=17,48xV2; V2=0,001144L, es decir, 1,144mL ó 1144µL de
ácido acético al 99%.
Se mide la cantidad de ácido acético expresada anteriormente y se afora hasta 1
L con agua ultra pura
SOLUCIÓN DE ALCOHOL ISOPROPILICO 70%
Se toman 700 mL de alcohol isopropílico y se mezclan con 300 mL de agua
destilada obteniendo así 1 Litro de una solución de alcohol isopropílico al 70%
SOLUCIÓN DE CLOROFORMO 1%
Se toman 10 mL de cloroformo 99% y se mezcla en 990 mL de agua ultra pura
con ayuda de un magneto
92
DÍA 1
TIEMPO: 24 Horas
PROCEDIMIENTO: Saque las colas de rata y manténgalas a 4°C, 24h antes de
iniciar la extracción en bolsas bioseguras.
DÍA 2
INSTRUMENTAL: 1 L de PBS; 1 L agua ultra pura, 1 L acetona, 1 L isopropanol
70% (v/v), 4 L de ácido acético 0.02 N, agitador magnético y magneto; papel
aluminio.
PROCEDIMIENTO: Lave las colas de rata y séquelas, tome el extremo delgado de
la cola con las pinzas quirúrgicas y su mano derecha, con la izquierda tome el otro
extremo; dé varios giros a las pinzas y luego tire con fuerza. Verá las fibras de
colágeno salir de la cola (apariencia blanquecina como seda dental). Deposítelas
en el Beaker con PBS cortando la parte muscular atrapada en la pinza. (Repita
hasta agotar la cola)
Transfiera los tendones recolectados del PBS al Beaker con acetona al
99% por 5 minutos
Transfiera los tendones del Beaker con acetona al Beaker con isopropanol
70% por 5 minutos
Transfiera los tendones recolectados del Beaker con isopropanol a un
Beaker de 1 L y agregue suficiente ácido acético (para tendones de 5 colas
500 mL aprox.)
Introduzca el magneto y coloque el Beaker en el agitador magnético durante 48 h
a 4°C. Tape la boca del Beaker con papel aluminio para evitar el ingreso de
contaminantes.
DÍA 3
Observe la solución que debe comenzar a tornarse viscosa
DÍA 4
INSTRUMENTAL: Licuadora casera, ácido acético 0,02N, hielo de agua ultra
pura, recipientes pequeños de plástico.
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PROCEDIMIENTO: Deposite la solución viscosa en la licuadora doméstica y licue
mediante pulsos (para evitar desnaturalización), agregue hielo de agua ultra pura
para evitar el sobrecalentamiento.
Ponga la solución en contenedores metálicos o plásticos en películas de 5 cm de
grosor aproximadamente. Enfríe los recipientes a -20°C por 3 días para liofilización
(Día 5, Día 6, Día 7). En el laboratorio se cuenta con recipientes pequeños de
plástico que después pueden llevarse a liofilización
PUNTO DE PAUSA: los recipientes a -20°C pueden guardarse por varios días
DÍA 8
INSTRUMENTAL: Bisturí,
PROCEDIMIENTO: Corte pequeños bloques de colágeno congelado, póngalos en
un recipiente y liofilícelos entre 24-48 h o más, hasta que el agua desaparezca
completamente de la solución.
Verifique que la temperatura está en -20°C o menor.
PUNTO DE PAUSA: El colágeno liofilizado (en forma de esponja) puede
guardarse en bolsas ziploc a -80°C por 12-18 meses.
DÍA 9
INSTRUMENTAL: Dos recipientes ámbar de 4 L; 2 Beaker de 4 L; Papel aluminio;
vaso de licuadora; rotor de ultracentrífuga.
PROCEDIMIENTO:
Prepare 8 L de ácido acético y guárdelo a 4°C por 24 h antes de seguir
Prepare 4 L de ácido acético, esterilícelo en un autoclave y guárdelo a
4°C por 24 h antes de seguir
Esterilice un Beaker de 4 L y un magneto, cúbralo con papel aluminio y
guárdelo a 4°C por 24 h antes
Guarde 4 L de agua ultra pura a 4°C por 24 h antes de iniciar el proceso
Guarde las botellas de centrifugación a 4°C por 24 h antes
Guarde el vaso de la licuadora estéril a 4°C por 24 h antes de iniciar el
proceso
Mantenga el rotor a 4°C por 24 h antes de iniciar el proceso
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DÍA 10
INSTRUMENTAL: Ultracentrífuga, bomba de vacío, instrumental preparado el día
anterior. Erlenmeyer con acceso lateral. (Todos los materiales deben estar
fríos)
PROCEDIMIENTO: Encienda la ultracentrífuga a 4°C al menos 2 horas antes,
encienda la bomba de vacío 1 hora antes para permitir la desgasificación de la
solución de colágeno
Pese la esponja de colágeno y reconstituya mediante la licuadora (por pulsos) con
ácido acético 0.02N hasta obtener una solución de 4 g L-1(puede medir la
concentración inicial y final para estimar el error estándar) Obtendrá una solución
viscosa. (Además la concentración puede medirse por ensayo de BRADFORD,
Bio-Rad o ensayo de Biuret.)
Ponga cantidades iguales de solución en los tubos de ultra centrifugación
(Nalgene), péselos y colóquelos en la ultracentrífuga balanceadamente.
Centrifugue a 4°C por 45 min. y 30000xg.
Recoja el sobrenadante en un Beaker y manténgalo en hielo. En los tubos de
ultracentrífuga debe observarse un depósito de impurezas. Típicamente
compuesto de otros tipos de colágeno.
Derrame pequeñas cantidades (100 mL) en un Erlenmeyer con acceso lateral a
bomba de vacío y de-aire por 15 min. (Es fundamental si planea hacer películas
delgadas de colágeno)
Guarde la solución de colágeno de gasificada en un Beaker en hielo o cuarto frío.
DÍA 11
INSTRUMENTAL: Bolsas de diálisis de 6-8 KDaltons, frasco de vidrio estéril, seda
o nylon, ácido acético 0.02 N, magneto, agitador magnético; tijeras estériles; agua
ultra pura; solución de cloroformo
PROCEDIMIENTO: Corte 12 cm de bolsa de diálisis, lávela por fuera con agua
ultra pura
Haga un nudo fuerte en uno de los extremos y enjuague el interior de la
membrana.
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Llene la bolsa con solución de colágeno hasta un 80 % de la bolsa.
Coloque la bolsa amarrada en un recipiente con suficiente ácido acético 0.02 N,
agregue el magneto y déjela en agitación magnética durante 1 h en un cuarto frio
a 4°C.
Mientras prepare una solución 1% de cloroformo en 4 L de agua ultra pura en un
Beaker con un magneto dentro.
Después de 1 h transfiera la bolsa del ácido acético al Beaker con cloroformo y
déjela por 1 h en agitación magnética en un cuarto a 4°C.
Después transfiera la bolsa de diálisis al Beaker estéril en la cabina y ponga ácido
acético estéril, cierre con papel aluminio y colóquelo a 4°C con agitación
magnética permanente por 1 semana.
“cambie el ácido acético cada 2 días”
DÍA 12
INSTRUMENTAL:
Esterilice frascos de 100 mL donde depositará la solución de colágeno
dializado
Esterilice Beaker de 4 L, tápelos con papel aluminio y guárdelos en cuarto
frío
DÍA 19
INSTRUMENTAL:
PROCEDIMIENTO: Saque la bolsa de diálisis con cuidado y deposítelo en un
Beaker (o frasco) estéril, córtela y deje que la solución fluya en el recipiente.
Almacene la solución a 4°C
Chequee la pureza del colágeno mediante ensayos como análisis de amino-
ácidos, SDS-PAGE después de digestión con pepsina para mirar las bandas de
las cadenas α, β y γ de colágeno tipo I. TEM y AFM puedan usarse para observar
las características de periodicidad de fibras de colágeno y su proporción
comparada con el colágeno desnaturalizado que perdió esta periodicidad.
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DÍA 20
INSTRUMENTAL: pH metro; micro tubos de PCR; NaOH 0.1 N;
PROCEDIMIENTO: Puede neutralizar la solución de colágeno agregando
pequeñas cantidades de solución NaOH 0.1 N hasta llevarla a pH 6.5-7. Este pH a
37°C lleva a la gelificación de colágeno y auto ensamblaje de sus fibras. Puede
controlar aleatoriamente el pH y testear la esterilidad con cultivos en cajas Petri
durante 1 semana.
Tome alícuotas de 80-160 µl, deposítelas en micro tubos de PCR y liofilícelos por
48 h.
DÍA 22
INSTRUMENTAL: UV de 254 nm
PROCEDIMIENTO: retire los micro tubos de PCR del liofilizador y observe la
formación de las esponjas de colágeno dentro de ellos, organícelos bajo la luz UV
de 254 nm e irrádielos con ella 3 h por cada lado.
Después retírelos y almacénelos a temperatura ambiente.
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ANEXO 4
PROTOCOLO DE SIEMBRA DE rCTMO EN ESPONJAS DE COLAGENO TIPO I
Protocolo
1. Extraiga el α- MEM de la caja de cultivo y deséchelo
2. Lave agregando PBS
3. Agregue 1,5 a 2 mL de tripsina EDTA y deje la caja a 37°C durante 3
minutos
4. Agregue 2 mL de α- MEM para neutralizar la tripsina y verifique con el
microscopio óptico que las células ya no se encuentran adheridas a la caja
5. Centrifugue a 640 xg por 5 min a 4°C, se obtiene un pellet de rCTMO
6. Deseche el sobrenadante y resuspenda el pellet en 400 µL de α- MEM y
alicuótelo en microtubos de PCR, teniendo en cuenta una población de
aproximadamente 4x105 células
7. Centrifugue a 640 xg por 5 min a 4°C, se obtiene pellet en cada microtubo
8. Deseche el sobrenadante y resuspenda el pellet en 5 µL en el microtubo
9. Deposite en un botón de siembra una esponja de colágeno tipo I e inyecte
el pellet de rCTMO del paso anterior dentro de ella (repítalo el número de
esponjas que quiera sembrar) y coloque los botones en una caja de Petri
estéril con suficiente α- MEM a 37°C y 5%CO2 por 1 Hora
10. Mientras tanto prepare en una caja de Petri estéril una rejilla metálica
depositando un reservorio de PEGDA en cada uno de sus agujeros y
agregue α- MEM para evitar la deshidratación
11. Cuando se cumpla el tiempo retire la esponja con CTMO del botón y
trasládela al reservorio de PEGDA dentro de la rejilla
12. Agregue suficiente α- MEM y guarde la caja de Petri a 37°C y 5%CO2
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ANEXO 5
PROTOCOLO DE FIJACIÓN DE ESCPONJAS DE COLÁGENO
SEMBRADAS CON rCTMO
Reactivos e Instrumentos
Glutaraldehído
Alcohol etílico
Pinzas
PBS
Micro tubos de PCR
Protocolo
1. Retire la caja de Petri de la incubadora con cuidado de no hacer volcar las
esponjas de su reservorio
2. Retire el medio en el que se encuentran sumergidas las esponjas.
3. Deposite las esponjas en micro tubos de PCR en los que se ha agregado
con antelación 200 µl de PBS o el buffer que se ha utilizado durante la
experimentación y déjelo 10 minutos, esto con el fin de lavar los residuos de
medio de cultivo. Repita esta operación 2 veces.
4. Mientras las esponjas se encuentran en PBS, agregue entre 150 µl y 200 µl
de glutaraldehído 2,5% en PBS, en micro tubos de PCR.
5. Al terminar el tiempo de lavado traslade las esponjas a los tubos con
glutaraldehído y déjelos por 3 horas a 4 °C.
6. Pasadas las 3 h, retire las esponjas de los micro tubos y lávelas como en el
paso 3, con el fin de retirar los residuos de glutaraldehído.
7. Prepare soluciones de alcohol etílico al 50%, 70% y 90%.
8. Deposite en micro tubos 150 µl de alcohol etílico al 50% y traslade allí las
esponjas con el fin de deshidratarlas, déjelo reposar por 10 minutos.
9. Repita el paso 8 para los alcoholes al 70%, 90% y alcohol absoluto.
10. Deje las muestras en alcohol absoluto para ser llevadas a secado en punto
crítico. Recuerdo que solo pueden permanecer en este alcohol por 48
horas.
