UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE DIN CRAIOVA

Drd. THEODOR DUMITRESCU

POLIMORFISMUL GENETIC AL UNOR INTERLEUKINE IMPLICATE ÎN

RELAŢIA INFLAMAŢIE – CANCER COLO-RECTAL

REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT

Conducător Ştiinţific

Prof. Univ. Dr. ION GEORGESCU

CRAIOVA

2011

2

LISTA DE ABREVIERI

ADN – acid dezoxiribonucleic

AJCC – American Joit Commitee on Cancer

APC – gena polipozei adenomatoase colonice

CI – interval de încredere

CRC – cancer colo-rectal

IBD – Inflamatory Bowel Disease (bolile inflamatorii intestinale)

OR – odds ratio (rata şanselor)

RR – relative risk

RT-PCR – reacţia de polimerizare în lanţ în timp real

SD – abaterea standard

SNP – single nucleotide polymorphism

TNM – stadializarea tumor-nods-metastasis

UICC – International Union Against Cancer

VNTR – variable number of tandem repeats

3

INTRODUCERE

Cancerul colorectal (CRC) este o problemă de sănătate mondială, fiind cea mai comună formă de cancer şi a

doua cauză de deces în Europa, cu cea mai mare rată a mortalităţii a ambelor genuri, atât în Europa Centrală cât şi de

Est. Deşi mortalitatea a fost în scădere în ultimele două decenii, prognosticul este strâns legat de stadiul tumoral la

diagnosticare, pacienţii depistaţi într-un stadiu incipient având un prognostic favorabil.

Marea majoritate a cazurilor de cancer colorectal apare sporadic, deşi se pare că există o susceptibilitate

moştenită ce pare responsabilă pentru 35% din cazurile de cancer colorectal. Sindroamele familiale moştenite (polipoza

adenomatoasă familială şi cancerul colorectal ereditar non-polipozic) reprezintă aproximativ 5% din totalitatea cazurilor

de CRC.

În mod normal, CRC rezultă din acumularea unor evenimente genetice şi epigenetice ce modulează procesul de

transformare al epiteliului normal glandular într-unul adenocarcinomatos.

Afecţiunile inflamatorii ca boala Crohn şi colita ulcerativă cresc riscul de CRC. Legătura dintre inflamaţie şi

cancer este general acceptată, iar dovezile în acest sens confirmă faptul că boala neoplazică apare pe inflamaţii cronice

ale ţesuturilor. Celulele inflamatorii şi tumorale produc citokine şi chemokine pentru a uşura promoţia şi progresia

tumorală. Acest lucru este în mod particular observat şi în cazul tractului gastro-intestinal.

Variabilitatea inter-individuală a intensităţii şi magnitudinii răspunsului inflamator ar putea fi influenţată de

polimorfismul unei singure nucleotide, polimorfism localizat pe genele şi receptorii citokinelor, în special în regiunea

promotorie. Variaţiile genetice determină modificări ale microclimatului celular, ce pot duce la o susceptibilitate

crescută şi/sau la un prognostic rezervat în cazul tumorilor gastro-intestinale, incluzând CRC.

Dezvoltarea tehnologiei moleculare a determinat o mai bună cunoaştere a mecanismelor de dezvoltare şi

progresie tumorală. Informaţiile actuale sunt însă incomplete şi uneori divergente. Multiple molecule precum

oncogenele, factorii de creştere, genele supresoare tumorale, citokinele şi alte gene şi proteine reglatorii sunt implicate

în dezvoltarea cancerului colo-rectal.

În acest context, lucrarea de faţă îşi propune să prezinte iniţial un studiu clinico-statistic pe baza parametrilor

neoplasmului colo-rectal. Apoi este analizată în detaliu corelaţia între opt variante polimorfice a şase interleukine: IL-

1B, IL-1RN, IL-4R, IL-8, IL-10 şi TNFα (IL-1B: 31T>C - rs1143627; IL-1B: 511C>T – rs16944; IL-1B: 3954C>T -

rs1143634; IL-1RN: 2018T>C - rs419598; IL-4R: 3223C>T - rs2057768; IL-8: 251T>A - rs4073; IL-10: 1082A>G -

rs1800896; TNFα: 308G>A - rs1800629) şi cancerul colo-rectal.

Pentru evaluarea celor 8 polimorfisme am utilizat tehnologia Real –Time PCR cu sonde TaqMan (Applied

Biosystem) specifice transcripţei genelor corespunzătoare citokinelor studiate. Rezultatele studiului vor contribui în

perspectivă la stabilirea riscului de a dezvolta cancer colo-rectal, diagnosticului precoce, estimarea eficienţei măsurilor

terapeutice şi perfecţionarea mijloacelor de evaluare a prognosticului.

Cuvinte cheie: cancer colo-rectal, citokine, polimorfisme, Real-Time PCR

4

I. STADIUL CUNOAŞTERII

CAPITOLUL 1. EPIDEMIOLOGIE ŞI ETIOLOGIE ÎN CANCERUL COLO-RECTAL prezintă date referitoare

la incidenţa cancerului colo-rectal în România şi la nivel mondial, patologia reprezentând o problemă majoră de

sănătate publică. (figura 1)

Figura 1. Incidenţa şi mortalitea neoplaziilor în lume, la ambele sexe (după www.globocan.iarc.fr;

International Agency for Research on Cancer 2008)

Se tratează epidemiologia bolii, factorii de risc clinici, factorii protectivi şi leziunile precursoare neoplasmului

colo-rectal, subliniind rolul major al factorilor de mediu.

CAPITOLUL 2. ANATOMIA PATOLOGICĂ A CANCERULUI COLO-RECTAL face o sinteză a clasificărilor

cancerului colo-rectal după tipul celular, aspectul structural, modul de creştere şi invazie. Se insistă pe descrierea

detaliată a stadializării TNM, după AJCC-UICC.

CAPITOLUL 3. IMPLICAREA CITOKINELOR ÎN NEOPLASME tratează, pe de o parte, teoria că inflamaţia

constituie un precursor al cancerului colo-rectal, iar pe de altă parte, pune în evidenţă implicarea citokinelor în evoluţia

cancerului, cu implicaţiile lor patologice şi realizează o descriere detaliată a celor şase interleukine al căror polimorfism

genetic a fost investigat de noi în relaţia cu neoplasmul colo-rectal.

II. CONTRIBUŢII PROPRII

CAPITOLUL 4. CANCERUL COLO-RECTAL, STUDIU CLINICO-STATISTIC

Cancerul colorectal reprezintă la ora actuală cea mai frecventă localizare a cancerului de tub digestiv, cu o

frecvenţă în creştere în toate statele lumii. Deşi este o tumoră de o extremă gravitate, cancerul colo-rectal poate evolua

mult timp asimptomatic. Semnele clinice sugestive ale bolii apar tardiv, cancerele de colon fiind avansate din punct de

vedere morfologic atunci când devin simptomatice. Aceasta înseamnă că procesul de diagnostic trebuie demarat înainte

de apariţia simptomelor prin ceea ce se înţelege şi cunoaşte sub numele de screening.

În ţara noastră, chirurgia neoplasmului colo-rectal se însoţeşte încă de rate relativ crescute ale morbidităţii şi

mortalităţii postoperatorii, cu posibilităţi de perfecţionare în viitorul apropiat.

Material şi metode

Studiul s-a desfăşurat pe un lot de 136 de pacienţi diagnosticaţi cu neoplasm colo-rectal, internaţi în Clinica II

Chirurgie a Spitalului Clinic Judeţean de Urgenţă din Craiova, pe o perioadă de aproape 3 ani (01 octombrie 2008 – 31

august 2011).

Toţi pacienţii au suferit o intervenţie chirurgicală, practicându-se rezecţii în toate cazurile, cu viză radicală sau

paleativă. Au fost efectuate hemicolectomii drepte şi stângi, colectomii segmentare, subtotale sau totale, rezecţii recto-

sigmoidiene şi amputaţii de rect pe cale abdomino-perineală.

Au fost urmăriţi mai mulţi parametri, dintre care: sexul, vârsta, localizarea tumorii, tipul de intervenţie

chirurgicală, diagnosticul anatomopatologic şi stadializarea pTNM, complicaţii postoperatorii şi prezenţa sau absenţa

invaziei marginilor de rezecţie.

Rezultate şi discuţii

În cele mai multe cazuri procesul neoplazic s-a localizat distal, la nivelul rectului, cu un număr de 46 de cazuri,

adică 33,82 procente. Următoarea frecvenţă, pe pantă descendentă, o înregistrează localizarea sigmoidiană, cu o valoare

absolută de 28 de cazuri, respectiv 20,58% şi localizarea la nivelul joncţiunii recto-sigmoidiene cu un număr de 18

5

cazuri, adică 13,23%. De notat că, în lotul nostru, următoarea localizare ca frecvenţă este cea de la nivelul colonului

transvers (15 cazuri – 11,03%), dintre aceste cazuri doar 2 fiind situate la stânga arterei colice medii, în jumatatea

stângă a colonului transvers. (figura 2).

Figura 2. Localizarea cancerului colo-rectal

Din perspectiva stadiului avansat al bolii în momentul diagnosticului derivă şi caracterul intervenţiei chirurgicale.

Astfel, majoritatea bolnavilor în studiul nostru s-au prezentat în stadiul II şi III (59 cazuri în stadiul II, adică 43,38% şi

55 cazuri în stadiul III, adică 40,44%). Din fericire, a existat un număr de 11 cazuri aflate în stadiul I (reprezentând

8,08%), dar, din nefericire, un număr egal de cazuri s-a aflat în stadiul IV. Astfel, înregistrăm o tendinţă de a

diagnostica boala în stadii mai bune, progresele fiind nesatisfăcătoare atât timp cât numărul cazurilor aflate în stadiul IV

este egal cu numărul cazurilor aflate în stadiul I, iar stadiul II este sensibil egal cu stadiul III ca şi număr de pacienţi.

(figura 3)

Figura 3. Repartiţia pe stadii a cazurilor

Tabelul 1. Morbiditatea postoperatorie generală

Complicaţii postoperatorii Nr. cazuri

Supuraţii ale plăgii 18 13,23%

Fistule anastomotice 12

12,24% din

totalul

anastomozelor

Abces peritoneal 3 2,2%

Peritonită 3 2,2%

Infecţie urinară 15 11,03%

Complicaţii trombo-embolice 5 3,67%

Sepsis (MODS) 2 1,47%

Mortalitate 2 1,47%

6

Cele 3 complicaţii postoperatorii (fistula anastomotică, abcesul peritoneal şi peritonita postoperatorie) reprezintă

modalităţi evolutive diferite ale dehiscenţei anastomozei, care la rândul ei reprezintă cauza cea mai frecventă a

morbidităţii şi mortalităţii postoperatorii în chirurgia colo-rectală. Modificările aduse de-a lungul timpului tehnicii

chirurgicale (părăsirea anastomozei în dublu strat în favoarea celei monostrat, folosirea aparatelor de sutură mecanică)

au avut ca scop principal scăderea incidenţei dehiscenţelor anastomotice (a fistulelor intestinale în primul rând, pentru

că este modalitatea evolutivă cel mai frecvent întâlnită). (tabelul 1).

Concluzii

Neoplasmul colo-rectal este pe primul loc în rândul cancerelor digestive, cu o tendinţă de creştere a incidenţei în

ţara noastră în ultimii ani. Tratamentul de bază al acestei maladii rămâne intervenția chirurgicală, răspunsul la

tratamentul oncologic fiind foarte scăzut.

Screeningul cancerului de colon constituie o altă problemă de primă importanţă. Ar fi necesară introducerea

obligativităţii depistării precoce a bolii, care trebuie făcută într-un stadiu în care tratamentul chirurgical poate

asigura vindecarea.

Subliniem necesitatea unui serviciu de anatomie patologică care să fie disponibil pentru examenul extemporaneu

prompt în vederea studierii marginilor de rezecţie, mai ales în cazul rezecţiilor joase rectale, in operaţiile “sfincter-

saving”, dar şi pentru examinarea amanunţită a piesei rezultate în urma rezecţiei colo-rectale (examinarea a minim

12 ganglioni limfatici, detalii despre infiltratul inflamator, invazia venoasă).

CAPITOLUL 5. INVESTIGAREA CORELAŢIEI ÎNTRE VARIANTELE POLIMORFICE ALE

CITOKINELOR IL-1B, IL-1RN, IL-4R, IL-8, IL-10 ŞI TNF-ALFA ŞI CANCERUL COLO-RECTAL

Acest capitol reprezintă fundamentul acestei teze.

Studiul nostru îşi propune investigarea corelaţiei între opt polimorfisme a şase citokine (IL-1B, IL-1RN, IL-4R,

IL-8, IL-10 şi TNFα ) şi cancerul colo-rectal, în sensul determinării riscului de apariţie a acestei maladii în populaţia

României în funcţie de SNP-ul cercetat. (tabelul 2)

GENA FUNCŢIE POLIMORFISM SNP

(database)

LOCALIZARE

IL-1B Proinflamator,

iniţiator primar al

răspunsului

inflamator

-31T>C rs1143627 promotor

IL-1B Proinflamator -511C>T rs16944 promotor

IL-1B Proinflamator +3954C>T rs1143634

IL-1RN Proinflamator

+2018T>C rs419598

IL-4R Antiinflamator,

reglează producţia de

anticorpi

-3223C>T rs2057768 promotor

IL-8 Proinflamator,

activează

neutrofilele

-251T>A rs4073 promotor

IL-10 Antiinflamator,

reglează funcţia

celulelor T şi a

macrofagelor

-1082A>G rs1800896 promotor

TNFα Proinflamator,

imunomediator

“cheie”

-308G>A rs1800629 promotor

Tabelul 2. Polimorfismele SNP ale citokinelor investigate în studiul nostru

7

Material si metode

Un total de 377 subiecţi români au fost incluşi în acest studiu: un lot de 144 pacienţi cu cancer colorectal

sporadic şi un lot control de 233 pacienţi sănătoşi. (tabelul 3) Cazurile cu cancer colorectal au fost diagnosticate

conform procedurilor standard (examen obiectiv, tuşeu rectal, teste de sângerare ocultă în materiile fecale,

colonoscopie, irigografie, computer-tomografie) şi toate au fost confirmate histopatologic în Spitalul Clinic Judeţean

nr1 din Craiova. Subieţii-control au fost aleşi aleator din rândul voluntarilor internaţi în acelaşi spital şi în aceeaşi

perioadă, având aceeaşi etnie şi origine geografică. Subiecţii-control cu un istoric medical tumoral, infecţios, de boală

inflamatorie cronică sau boală autoimună au fost excluşi. Probe de sânge au fost recoltate de la ambele loturi, iar

informaţiile demografice, vârsta, sexul şi istoricul familial de boli neoplazice au fost înregistrate pentru fiecare pacient

în parte. Comisia de Etică a Universităţii de Medicină si Farmacie din Craiova a aprobat acest studiu şi s-a obţinut un

acord scris din partea tuturor subiecţilor.

Tabelul 3. Caracteristicile lotului studiat

Variabile Cancer colo-rectal Control

N 144 233

Bărbaţi/Femei 87/57 143/90

Vârstă (ani), medie ± SD 65,91±7,71 63,69±7,94

Localizare

- cec

- sigmoid

- descendent

- transvers

- ascendent

- rect

13

48

10

8

19

46

Stadiul tumoral –Stadiul Dukes

- A + B

- C + D

- Necunoscut/Nedefinit

75

64

5

Gradul de diferenţiere

- G1- bine

- G2- moderat

- G3- slab

37

80

27

Probele au fost prelevate în soluţie de stabilizare a ARN-ului (RNA Later Solution, Ambion) şi stocate la 4 grade

C pentru 12-24 de ore, fiind transferate apoi la -80 grade C. Probele au fost codificate cu numere stabilite în ordinea

recoltării, urmate de litere care indică tipul probei (A – tumoră, B – margine de rezecţie chirurgicală, S - sânge). Din

toate probele recoltate s-a izolat ADN genomic în vederea analizării polimorfismelor citokinelor IL-1B, IL-1RN, IL-4R,

IL-8, IL-10 şi TNFalfa, comparativ în ţesut şi sânge.

Pentru izolarea ADN-ului genomic din probele de ţesut recoltate şi sânge am utilizat kit-ul Wizard® Genomic

DNA Purification Kit (Promega, Madison, WI).

Reacţia de polimerizare în lanţ în timp real (RT- PCR) pentru genotipare

Pentru evidenţierea polimorfismelor unui singur nucleotid (SNP – single nucleotide polymorphisms) am utilizat

TaqMan® Universal Master Mix şi TaqMan

® SNP Genotyping Assays (Applied Biosystems, Foster City, CA) specifici

pentru fiecare dintre polimorfismele studiate.

TaqMan® Genotyping Assays genotipează polimorfismul unui singur nucleotid (SNP) prin utilizarea activităţii 5’

nucleazice pentru amplificarea şi detectarea alelelor SNP specifice în probe de ADN genomic. TaqMan® SNP

Genotyping Assays este alcătuit din:

- primeri sens şi antisens specifici pentru amplificarea secvenţei de interes;

- două sonde TaqMan® MGB; fiecare sondă este alcătuită din:

o un colorant reporter legat la capătul 5’ al sondei:

-colorantul VIC® care detectează secvenţa alelei 1;

8

-colorantul 6FAM™

care detectează secvenţa alelei 2;

o un ligand la scobitura mică a ADN (MGB – minor groove binder), care creşte temperatura de topire

(Tm) fără a creşte lungimea sondei;

o un colorant non-fluorescent de anihilare a reporterului (nonfluorescent quencher) localizat la capătul 3’

al sondei.

Interpretarea rezultatelor s-a făcut coform tabelului 4.

Tabelul 4. Corelaţia între semnalele fluorescente şi secvenţa alelei

Fluorescenţa Rezultat

Numai fluorescenţa colorantului VIC Homozigozitate pentru alela 1

Numai fluorescenţa colorantului

6FAM

Homozigozitate pentru alela 2

Semnale fluorescente pentru ambii

coloranţi

Heterozigozitate pentru alelele 1 şi 2

Analiza statistică a testat devierea de la echilibrul Hardy-Weinberg folosind „Pearson's chi-square test”,

calculându-se coeficientul de înrudire pentru populaţia din cele două loturi. Au fost calculate apoi Odds Ratio (OR) şi

intervalele de încredere (confidence interval - CI) 95% pornind de la tabelele de contingenţă, pentru a evalua asocierea

dintre genotipuri şi neoplasmul colo-rectal. În toate cazurile, genotipul homozigot pentru cea mai frecventă alelă în

cadrul populaţiei caucaziene a fost folosit drept categorie de referinţă. Valorile p considerate semnificative statistic au

fost < 0,05. Toată analiza datelor a fost făcută folosind SPSS v.17.0 statistical software package (SPSS Inc., Chicago,

IL, USA).

Rezultate şi discuţii

Pentru fiecare polimorfism din cele opt studiate am procedat într-un mod asemănător. În prima etapă am realizat

genotiparea subiecţilor (atât a lotului cu cancer colo-rectal, cât şi a lotului control), apoi, în etapele următoare, am

analizat statistic rezultatele căutând eventualele asocieri între un anumit genotip şi riscul de cancer colo-rectal. În plus

faţă de analiza asocierilor polimorfismelor cu toate cazurile de cancer colo-rectal luate în ansamblu (pornind de la

tabelele de contingenţă şi calculând apoi Odds Ratio (OR) şi intervalele de încredere (confidence interval - CI) 95%),

am făcut o analiză stratificată în funcţie de stadiul tumoral, grading-ul histologic şi localizarea tumorii pentru a explora

mai amănunţit asocierea dintre diferitele genotipuri ale citokinelor şi riscul de cancer colo-rectal (CRC) în fiecare

subgrup.

În toate cazurile, genotipul homozigot pentru cea mai frecventă alelă în cadrul populaţiei caucaziene (în cazul

nostru genotipul wild) a fost folosit drept categorie de referinţă.

Tabel 5. Asocierea dintre polimorfismele studiate şi cancerul colo-rectal (totalitatea cazurilor)

Polimorfism

Cancer colo-rectal

(n=144)

Control

(n=233)

OR (95%CI) p valoare

IL-1B -31 T>C

TT

TC

CC

C purtători

64 (44.44%)

64 (44.44%)

16 (11.12%)

80 (55.56%)

107 (45.92%)

105 (45.07%)

21 (9.01%)

126 (54.02%)

Referinţă

1.02 (0.65 - 1.58)

1.27 (0.62 - 2.62)

1.06 (0.69 - 1.61)

-

0.93

0.51

0.78

IL-1B +3954C>T

CC

CT

TT

T purtători

87 (60.42%)

46 (31.94%)

11 (7.64%)

57 (39.58%)

122 (52.36%)

93 (39.91%)

18 (7.73%)

111 (47.64%)

Referinţă

0.71 (0.44 - 1.09)

0.86 (0.39 - 1.91)

0.72 (0.47 – 1.01)

-

0.11

0.71

0.13

9

IL-1B -511 C>T

CC

CT

TT

T purtători

65 (45.14%)

63 (43.75%)

16 (11.11%)

69 (54.86%)

108 (46.35%)

99 (42.49%)

26 (11.16%)

125 (54.85%)

Referinţă

1.06 (0.68 - 1.64)

1.02 (0.51 - 2.05)

1.05 (0.69 - 1.60)

-

0.80

0.95

0.82

IL-1RN +2018T>C

TT

TC

CC

C purtători

75 (52.08%)

54 (37.50%)

15 (10.42%)

69 (47.92%)

133 (57.08%)

89 (38.20%)

11 (4.72%)

100 (42.92%)

Referinţă

1.08 (0.69 - 1.67)

2.42 (1.06 - 5.53)

1.22 (0.81 – 1.86)

-

0.75

0.034

0.34

IL-4R -3223C>T

CC

CT

TT

T purtători

79 (54.86%)

51 (35.42%)

14 (9.72%)

65 (45.14%)

134 (57.51%)

85 (36.48%)

14 (6.01%)

99 (42.49%)

Referinţă

1.02 (0.65 - 1.59)

1.70 (0.77 - 3.74)

1.11 (0.73 - 1.69)

-

0.94

0.19

0.61

IL-8 -251T>A

TT

TA

AA

A purtători

50 (34.72%)

67 (46.53%)

27 (18.75%)

94 (65.28%)

81 (34.76%)

106 (45.49%)

46 (19.75%)

152 (65.24%)

Referinţă

1.02 (0.64 - 1.63)

0.95 (0.53 - 1.72)

1.01 (0 .65 - 1.55)

-

0.92

0.86

0.99

IL-10 -1082 A>G

AA

AG

GG

G purtători

65 (45.14%)

60 (41.67%)

19 (13.19%)

79 (54.86%)

80 (34.33%)

118 (50.64%)

35 (15.03%)

153 (65.67%)

Referinţă

0.63 (0.40 - 0.98)

0.67 (0.35 - 1.28)

0.64 (0 .42 - 0.97)

-

0.041

0.22

0.036

TNF-A -308 G>A

GG

GA

AA

A purtători

115 (79.86%)

26 (18.06%)

3 (2.08%)

29 (20.14%)

189 (81.12%)

42 (18.02%)

2 (0.86%)

44 (18.88%)

Referinţă

1.02 (0.59 - 1.75)

2.47 (0.41 - 14.97)

1.08 (0 .64 – 1.83)

-

0.95

0.32

0.76

La analiza datelor rezultate (tabelul 5) observăm că există o asociere statistică numai pentru polimorfismele IL-

1RN +2018T>C şi IL-10 -1082 A>G şi riscul de cancer colo-rectal, în sensul că, pentru polimorfismul IL-1RN

+2018T>C, purtătorii genotipului CC sunt de 2,42 de ori mai predispuşi să dezvolte această maladie decât purtătorii

genotipului TT (OR 2,42, 95% CI:1,06-5,53, p=0.034), iar pentru polimorfismul IL-10 -1082 A>G subiecţii care

posedă genotipul AG au un risc mai scăzut de cancer colorectal (OR 0.63, 95% CI:0.40-0.98, p=0.041), comparativ cu

genotipul mult mai frecvent AA. Mai mult, într-un model dominant, purtătorii alelei G sunt protejaţi de cancerul

colorectal (OR 0.64, 95% CI: 0.42 - 0.97, p=0.036).

Având aceste rezultate, am vrut să cercetăm dacă mai există vreo asociere statistică între aceste SNP-uri ale

citokinelor şi neoplazia colo-rectală în funcţie de stadiul tumoral, gradul de diferenţiere celulară şi localizarea tumorii.

10

Tabel 6. Asocierea dintre polimorfismele studiate şi stadiul TNM al cancerului colo-rectal

Polimorfism

Stadiul

tumoral

I + II (n %)

OR (95%CI); p

Stadiul tumoral

III + IV (n %)

OR (95%CI); p

IL-1B -31 T>C

TT

TC

CC

C purtători

37 (49.33%)

31 (41.33%)

7 (9.34%)

38 (50.67%)

Referinţă

0.85 (0.49 – 1.48); 0.57

0.96 (0.38 – 2.45); 0.94

0.87 (0.52 – 1.47); 0.60

25 (39.06%)

30 (46.88%)

9 (14.06%)

39 (60.94%)

Referinţă

1.22 (0.67 - 2.20); 0.51

1.83 (0.75 - 4.48); 0.18

1.32 (0.75 – 2.33); 0.33

IL-1B +3954C>T

CC

CT

TT

41 (54.67%)

27 (36.00%)

7 (9.33%)

Referinţă

0.86 (0.50 – 1.51); 0.61

1.16 (0.45 – 2.97); 0.76

42 (65.63%)

18 (28.13%)

4 (6.25%)

Referinţă

0.56 (0.30 - 1.04); 0.06

0.65 (0.21 - 2.02); 0.45

IL-1B -511T>C

TT

TC

CC

37 (49.33%)

31 (41.33%)

7 (9.34%)

Referintă

0.91 (0.53 – 1.58); 0.75

0.79 (0.32 – 1.96); 0.60

26 (40.63%)

29 (45.31%)

9 (14.06%)

Referinţă

1.22 (0.67 - 2.21) ; 0.52

1.44 (0.60 - 3.43) ; 0.42

IL-1RN +2018T>C

TT

TC

CC

40 (53.33%)

26 (34.67%)

9 (12.00%)

Referinţă

0.97 (0.55 – 1.70); 0.92

2.72 (1.05 – 7.03); 0.033

31 (48.44%)

27 (42.19%)

6 (9.38%)

Referinţă

1.30 (0.73 - 2.33) ; 0.38

2.34 (0.80 - 6.81) ; 0.11

IL-4R -3223C>T

CC

CT

TT

T purtători

42 (56.00%)

26 (34.67%)

7 (9.33%)

33 (44.00%)

Referinţă

0.98 (0.56 – 1.71); 0.93

1.60 (0.60 – 4.21); 0.34

1.06 (0.63 – 1.80) ; 0.82

34 (53.12%)

23 (35.94%)

7 (10.94%)

30 (46.88%)

Referinţă

1.07 (0.59 - 1.93); 0.83

1.97 (0.74 - 5.26); 0.17

1.19 (0.69 -2.08); 0.53

IL-8 –251T>A

TT

TA

AA

A purtători

30 (40.00%)

33 (44.00%)

12 (16.00%)

45 (60.00%)

Referinţă

0.84 (0.47 – 1.49); 0.55

0.70 (0.33 – 1.51); 0.36

0.80 (0.47 – 1.37); 0.41

19 (29.69%)

32 (50.00%)

13 (20.31%)

45 (70.31%)

Referinţă

1.29 (0.68 - 2.43); 0.44

1.21 (0.55 - 2.66); 0.64

1.26 (0.69 - 2.30); 0.45

IL-10 –1082 A>G

AA

AG

GG

G purtători

34 (45.33%)

30 (40.00%)

11 (14.67%)

41 (54.67%)

Referinţă

0.60 (0.34 – 1.06); 0.08

0.74 (0.34 – 1.63); 0.45

0.63 (0.37 – 1.07); 0.09

29 (45.31%)

27 (42.19%)

8 (12.50%)

35 (54.69%)

Referinţă

0.63 (0.35 - 1.15); 0.13

0.63 (0.26 - 1.52); 0.30

0.63 (0.36 – 1.11); 0.11

TNF A –308 G>A

GG

GA

AA

A purtători

65 (86.67%)

9 (12.00%)

1 (1.33%)

10 (13.33%)

Referinţă

0.62 (0.29 – 1.35); 0.23

1.45 (0.13 – 16.3); 0.76

0.66 (0.32 – 1.39); 0.27

46 (71.88%)

16 (25.00%)

2 (3.13%)

18 (28.13%)

Referinţă

1.57 (0.81 - 3.03); 0.18

4.11 (0.56 - 29.9); 0.13

1.68 (0.89 – 3.17); 0.11

O asociere pozitivă cu cancerul colo-rectal a fost găsită decât în cazul genotipului CC al IL-1RN +2018 şi care

se limitează decât la stadiile I şi II (OR 2.72, 95% CI: 1.05-7.03) (Tabelul 6). Subclasificarea cancerului colo-rectal în

funcţie de stadiul TNM nu a arătat nicio legătură între riscul acestuia şi restul SNP-urilor studiate.

11

Tabel 7. Analiza comparativă dintre frecvenţele genotipurilor şi riscul de cancer colo-rectal în funcţie de gradul

de diferenţiere histologică

Polimorfism G1

N=37

OR (95%CI); p

G2

N=80

OR (95%CI); p

G3

N= 27

OR (95%CI); p

IL-1B -31 T>C

TT

TC

CC

C purtători

23

12

2

14

Referinţă

0.53 (0.25 – 1.11); 0.09

0.44 (0.10 – 2.02); 0.28

0.52 (0.25 – 1.05); 0.07

30

40

10

50

Referinţă

1.36 (0.79 - 2.34) ; 0.27

1.70 (0.72 - 3.99) ; 0.23

1.42 (0.84 – 2.38) ; 0.19

11

12

4

16

Referinţă

1.11 (0.47 - 2.63) ; 0.81

1.85 (0.54 - 6.38) ; 0.32

1.24 (0.55 – 2.78) ; 0.61

IL-1B +3954C>T

CC

CT

TT

20

15

2

Referinţă

0.98 (0.48 - 2.03) ; 0.96

0.68 (0.15 - 3.15) ; 0.62

51

24

5

Referinţă

0.62 (0.35 - 1.07) ; 0.09

0.66 (0.23 - 1.89) ; 0.44

16

7

4

Referinţă

0.57 (0.23 - 1.45) ; 0.24

1.69 (0.51 - 5.64) ; 0.39

IL-1B -511 C>T

CC

CT

TT

23

12

2

Referinţă

0.57 (0.27 – 1.20); 0.14

0.36 (0.08 – 1.63); 0.17

30

40

10

Referinţă

1.46 (0.84 - 2.51) ; 0.18

1.39 (0.60 - 3.19) ; 0.44

12

11

4

Referinţă

1.00 (0.42 - 2.37) ; 0.99

1.04 (0.27 - 3.95) ; 0.96

IL-1RN +2018T>C

TT

TC

CC

20

13

4

Referinţă

0.97 (0.46 - 2.05) ; 0.94

2.42 (0.70 -8.33) ; 0.15

42

30

8

Referinţă

1.07 (0.62 - 1.83); 0.81

2.30 (0.87 - 6.10); 0.08

13

11

3

Referinţă

1.26 (0.54 - 2.95) ; 0.59

2.79 (0.69 - 11.29) ; 0.14

IL-4R -3223C>T

CC

CT

TT

T purtători

15

18

4

22

Referinţă

1.89 (0.91 - 3.95) ; 0.09

2.56 (0.74 - 8.76) ; 0.13

1.99 (0.98 – 4.02) ; 0.06

48

24

8

32

Referinţă

0.79 (0.45 - 1.38) ; 0.40

1.60 (0.63 - 4.04) ; 0.32

0.90 (0.54 – 1.51) ; 0.70

16

9

2

11

Referinţă

0.89 (0.38 - 2.10) ; 0.78

1.19 (0.25 - 5.75) ; 0.82

0.93 (0.41 – 2.09) ; 0.86

IL-8 -251T>A

TT

TA

AA

A purtători

12

16

9

25

Referinţă

1.02 (0.46-2.27) ; 0.96

1.32 (0.52 -3.37) ; 0.56

1.11 (0.53 – 2.33) ; 0.78

32

34

14

48

Referinţă

0.81 (0.46 - 1.43); 0.47

0.77 (0.37 - 1.59); 0.48

0.80 (0.47 – 1.35) ; 0.40

6

17

4

21

Referinţă

2.17 (0.82 - 5.74) ; 0.11

1.17 (0.32 - 4.38) ; 0.81

1.86 (0.72 - 4.81) ; 0.19

IL-10 -1082 A>G

AA

AG

GG

G purtători

17

13

7

20

Referinţă

0.52 (0.24 – 1.13); 0.09

0.94 (0.36 – 2.47); 0.90

0.62 (0.31 – 1.24) ; 0.17

32

39

9

48

Referinţă

0.83 (0.48 - 1.43); 0.49

0.64 (0.28 - 1.49); 0.30

0.78 (0.46 – 1.32) ; 0.36

16

8

3

11

Referinţă

0.34 (0.14 - 0.83) ; 0.014

0.43 (0.11 - 1.57) ; 0.19

0.36 (0.16 -0.81) ; 0.011

TNF A -308 G>A

GG

GA

AA

A purtători

30

6

1

7

Referinţă

0.90 (0.35 – 2.30); 0.83

3.15 (0.28 – 35.8); 0.33

1.01 (0.41 – 2.43) ; 0.99

65

13

2

15

Referinţă

0.90 (0.46 - 1.78); 0.76

2.91 (0.40 - 21.1); 0.27

0.99 (0.52- 1.90) ; 0.98

20

7

0

7

Referinţă

1.58 (0.63 - 3.97) ; 0.33

/

1.50 (0.59 – 3.78) ; 0.38

În cadrul analizei stratificate în funcţie de grading-ul histologic se remarcă încă o dată o asociere între cancerul

colo-rectal şi polimorfismul citokinei IL-10 în cazul purtătorilor genotipului IL-10 -1082AG şi a purtătorilor alelei G

într-un model dominant şi care a fost restricţionată la subtipurile slab diferenţiate (OR 0.34, 95% CI: 0.14-0.83,

p=0.014 respectiv OR 0.36, 95% CI: 0.16-0.81, p=0.011) (Tabelul 7). Nu au fost observate diferenţe semnificative

între diferitele grade de diferenţiere celulară şi martori în cazul celorlalte SNP-uri studiate.

12

Tabel 8. Asocierea dintre polimorfisme şi cancerul colo-rectal în funcţie de localizarea tumorii

Polimorfism Proximal CRC Distal CRC Rectal CRC

N= 40 OR (95%CI); p N= 58 OR (95%CI); p N= 46 OR (95%CI); p

IL-1B

+3954C>T

CC

CT

TT

24

11

5

Referinţă

0.60 (0.28 - 1.29) ; 0.19

1.41 (0.48 - 4.17) ; 0.53

37

18

3

Referinţă

0.64 (0.34 - 1.19) ; 0.16

0.55 (0.15 - 1.97) ; 0.35

26

17

3

Referinţă

0.86 (0.44 - 1.67) ; 0.65

0.78 (0.22 - 2.85) ; 0.71

IL-1B

-511 C>T

CC

CT

TT

15

20

5

Referinţă

1.46 (0.71 – 2.99); 0.31

1.39 (0.46 – 4.16); 0.56

24

27

7

Referinţă

1.23 (0.66 - 2.27) ; 0.51

1.21 (0.47 - 3.12) ; 0.69

26

16

4

Referinţă

0.67 (0.34 - 1.33) ; 0.25

0.64 (0.21 - 1.99) ; 0.44

IL-1RN

+2018T>C

TT

TC

CC

20

16

4

Referinţă

1.19 (0.59 - 2.43) ; 0.62

2.42 (0.70 -8.33) ; 0.15

30

22

6

Referinţă

1.09 (0.59 - 2.02); 0.77

2.42 (0.83 - 7.06); 0.09

25

16

5

Referinţă

0.96 (0.48 - 1.89) ; 0.90

2.42 (0.77 - 7.56) ; 0.12

Nici în cadrul analizei stratificate în funcţie de localizarea tumorii nu se remarcă vreo asociere între cancerul

colo-rectal şi polimorfismele citokinice studiate.

13

CAPITOLUL 7. CONCLUZII

• Neoplasmul colo-rectal este pe primul loc în rândul cancerelor digestive, cu o tendinţă de creştere a incidenţei

în ţara noastră în ultimii ani.

• Intervenția chirurgicală rămâne tratamentul de bază al cancerului colo-rectal, răspunsul la tratamentul

oncologic fiind foarte scăzut.

• Ar fi necesară introducerea screeningul cancerului de colon, în vederea depistării precoce a bolii, tratamentul

chirurgical asigurând în acest stadiu vindecarea.

• Serviciul de anatomie patologică are un rol foarte important în efectuarea examenului extemporaneu prompt al

marginilor de rezecţie, mai ales în cazul rezecţiilor joase rectale, dar şi pentru examinarea amanunţită a piesei rezultate

în urma rezecţiei colo-rectale (examinarea a minim 12 ganglioni limfatici, detalii despre infiltratul inflamator, invazia

venoasă).

• Prin studiul asupra SNP-urilor IL-1, una dintre cele mai importante citokine proinflamatorii, am pus în

evidenţă faptul că polimorfismul IL1-RN +2018T>C este asociat cu un risc crescut al cancerului colorectal. Nu am

putut detecta vreun efect al variantelor genetice ale IL-1B (IL-1B -31T>C, IL-1B -511C>T şi IL-1B +3954C>T) asupra

riscului cancerului colorectal.

• Am observat o asociere semnificativă pentru polimorfismul IL-1RN +2018T>C, pacienţii purtători ai

genotipului CC având un risc de 2,4 ori mai mare pentru a dezvolta cancer colorectal faţă de pacienţii cu genotipul TT,

întâlnit mult mai frecvent. Cea mai puternică asociere a fost descoperită între purtătorii genotipului CC şi stadiile I şi II

ale cancerului colorectal. Din ceea ce cunoaştem până acum, acesta este primul studiu care susţine o asociere între

polimorfismul IL-1RN +2018T>C şi susceptibilitatea cancerului colorectal.

• În ceea ce priveşte celelalte patru citokine studiate (două cu rol proinflamator – IL-8 şi TNFα şi două cu rol

antiinflamator – IL-4R şi IL-10), am evaluat dacă polimorfismul a patru promotori ai acestora (câte unul pentru fiecare

interleukină: IL-8 -251T>A, TNF-A -308G>A şi respectiv IL-4R -3223C>T şi IL-10 -1082A>G) influenţează

dezvoltarea şi progresia cancerului colorectal sporadic în populaţia din România şi am ajuns la concluzia că SNP-ul IL-

10 -1082A>G este asociat cu un risc scăzut al cancerului colo-rectal.

• Am descoperit că polimorfismul IL-10 -1082A>G influenţează susceptibilitatea CRC, purtătorii genotipului

AG şi al alelei G (AG+GG) într-un model dominant fiind mai protejaţi împotriva CRC decât purtătorii genotipului AA,

întâlnit mult mai frecvent. Aceasta asociere a fost observată cu preponderenţă în cazul pacienţilor cu CRC slab

diferenţiat. Rezultatele noastre sunt puternic legate de ipoteza că o producţie mai mare de IL-10 în mucoasa colonică s-

ar solda, teoretic, cu un răspuns antiinflamator crescut şi cu o reducere a inflamaţiei, ducând, în final, la un risc în

scădere al CRC. Aşadar, genotipurile IL-10 ce cresc nivelul de citokine ar putea fi considerate factori protectori

împotriva dezvoltării cancerului colorectal sporadic.

• În ceea ce priveşte polimorfismele celorlalte 3 citokine studiate (IL-8 -251T>A, IL-4R -3223C>T şi TNF-A -

308G>A), nu s-a găsit nicio asociere statistică cu neoplasmul colo-rectal în lotul nostru de pacienţi.

• Rezultatele cercetării obţinute pot şi trebuie să constituie un punct de plecare în validarea unor noi markeri

biologici incluşi în protocoale de screening complexe ale cancerului colorectal, vizând detecţia precoce, evaluarea

tratamentului şi estimarea mai exactă a prognosticului acestei patologii.

14

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

1. Lisa M. Coussens, Zena Werb - Inflammation and cancer. Nature. 2002 December 19; 420(6917): 860–867.

2. Shacter E, Weitzman SA. - Chronic inflammation and cancer. Oncology. 2002;16:217–226.

3. Bidwell J, Keen L, Gallagher G, et al. - Cytokine gene polymorphism in human disease: on-line databases. Genes

Immun 1999; 1:3-19.

4. Ferlay J, Parkin DM, Steliarova-Foucher E. - Estimates of cancer incidence and mortality in Europe in 2008. Eur

J Cancer 2010; 46: 765-81.

5. Bosetti C, Levi F, Rosato V, Bertuccio P, Lucchini F - Recent trends in colorectal cancer mortality in Europe.

Int J Cancer 2011; 129: 180-191.

6. Lichtenstein P, Holm NV, Verkasalo PK, et al. - Environmental and heritable factors in the causation of cancer--

analyses of cohorts of twins from Sweden, Denmark, and Finland. N Engl J Med 2000; 343: 78-85.

7. de la Chapelle A. - Genetic predisposition to colorectal cancer. Nat Rev Cancer 2004; 4: 769-80.

8. Jasperson KW, Tuohy TM, Neklason DW, Burt RW - Hereditary and familial colon cancer. Gastroenterology

2010; 138: 2044-2058 .

9. Vogelstein B, Fearon ER, Hamilton SR, et al. - Genetic alterations during colorectal-tumor development. N Engl

J Med 1988; 319: 525-32.

10. Bernstein CN et al. - Cancer risk in patients with inflammatory bowel disease: a population-based study. Cancer

2001; 91: 854-62.

11. Potack J, Itzkowitz SH - Colorectal cancer in inflammatory bowel disease. Gut Liver 2008; 2:61-73.

12. Dalgleish AG, O'Byrne K - Inflammation and cancer: the role of the immune response and angiogenesis.

Cancer Treat Res 2006; 130:1-38.

13. Moss SF, Blaser MJ - Mechanisms of disease: Inflammation and the origins of cancer. Nat Clin Pract Oncol

2005; 2: 90-97 .

14. Kundu JK, Surh YJ - Inflammation: gearing the journey to cancer. Mutat Res 2008; 659:15-30.

15. Dinarello CA - The paradox of pro-inflammatory cytokines in cancer. Cancer Metastasis Rev 2006; 25:307-313.

16. Akagi Y, Liu W, Xie K, Zebrowski B, Shaheen RM, Ellis LM - Regulation of vascular endothelial growth factor

expression in human colon cancer by interleukin-1beta. Br J Cancer 1999; 80:1506-1511.

17. Ito H, Kaneko K, Makino R, et al. - Interleukin-1beta gene in esophageal, gastric and colorectal carcinomas.

Oncol Rep 2007; 18:473-81.

18. Li M, You Q, Wang X. - Association between polymorphism of the tumor necrosis factor alpha-308 gene

promoter and colon cancer in the Chinese population. Genet Test Mol Biomarkers 2011; 15:743-7.

19. Van Dyke AL, Cote ML, Wenzlaff AS, Land S, Schwartz AG - Cytokine SNPs: Comparison of allele

frequencies by race and implications for future studies. Cytokine 2009; 46:236-244