7/29/2019 PNAS-1952-Briggs-455-63

1/9

ZOOLOGY: BRIGGS AND KING2 S t e i n b a c h , H . B . , Am. J . P h y s i o l . , 1 6 7 , 2 8 4 ( 1 9 5 1 ) .3 L o r e n t e d e N o , R . , J . C e l l . & C o m p . P h y s i o l . , 3 3 , s u p p l . ( 1 9 4 9 ) .4 T o b i a s , J . M . , I b i d . , 3 6 , 1 ( 1 9 5 0 ) .L e v i , H . , a n d U s s i n g , H . H . , A c t a P h y s i o l . S c a n d . , 1 6 , 2 3 2 ( 1 9 4 8 ) .

TRANSPLANTATION OF LIVING NUCLEI FROM BLASTULACELLS INTO ENUCLEA TED F R O G S ' EGGS*By ROBERT BRIGGS A ND THOMAS J . KING

I N S T I T U T E FOR CANCER RESEARCH A ND LANKENAU HOSPITAL RESEARCH I N S T I T U T E ,P H I L A D E L P H I A , PENNSYLVANIAC o m m u n i c a t e d by C . W. M e t z , March 1 5 , 1 9 5 2

I n t r o d u c t i o n . - T h e r o l e o f t h e n u c l e u s i n e m b r y o n i c d i f f e r e n t i a t i o n h a sb e e n t h e s u b j e c t o f i n v e s t i g a t i o n s d a t i n g b a c k t o t h e b e g i n n i n g s o f e x p e r i -m e n t a l e m b r y o l o g y . At f i r s t i t was s u p p o s e d b y R o u x , W e i s m a n n a n do t h e r s t h a t d i f f e r e n t i a t i o n i s t h e r e s u l t o f q u a l i t a t i v e n u c l e a r d i v i s i o n s ,d i f f e r e n t b l a s t o m e r e s t h e r e b y r e c e i v i n g t h e d i f f e r e n t k i n d s o f n u c l e i w h i c hd e t e r m i n e t h e i r s u b s e q u e n t d i f f e r e n t i a t i o n . L a t e r o n t h i s t h e o r y wasd i s p r o v e d b y n u m e r o u s e x p e r i m e n t s s h o w i n g t h a t , d u r i n g e a r l y c l e a v a g ea t l e a s t , t h e d i s t r i b u t i o n o f t h e n u c l e i c a n b e c h a n g e d a t w i l l w i t h o u ta l t e r i n g t h e p a t t e r n o f d e v e l o p m e n t . The c l e a v a g e n u c l e i h a v e , t h e r e f o r e ,b e e n r e g a r d e d a s i d e n t i c a l , a n d d i f f e r e n t i a t i o n h a s b e e n a s c r i b e d p r i m a r i l yt o t h e w e l l - k n o w n l o c a l i z a t i o n s i n t h e e g g c y t o p l a s m .

T h i s e v i d e n c e , i t s h o u l d b e e m p h a s i z e d , r e l a t e s o n l y t o t h e e a r l y p h a s e so f d e v e l o p m e n t . D u r i n g t h i s t i m e i t i s d e f i n i t e l y t r u e t h a t t h e n u c l e i i nt h e v a r i o u s b l a s t o m e r e s a r e e q u i v a l e n t . H o w e v e r , w h e t h e r t h e y r e m a i ne q u i v a l e n t o r b e c o m e d i f f e r e n t i a t e d a s t h e v a r i o u s p a r t s o f t h e e m b r y od i f f e r e n t i a t e h a s n e v e r b e e n t e s t e d . Th e p o s s i b i l i t y t h a t n u c l e i m i g h td i f f e r e n t i a t e i n r e s p o n s e t o r e g i o n a l d i f f e r e n c e s i n t h e c y t o p l a s m , a n d t h a ts u c h n u c l e a r c h a n g e s m i g h t h a v e r e c i p r o c a l e f f e c t s o n t h e c y t o p l a s m d u r i n gc e l l d i f f e r e n t i a t i o n , was s u g g e s t e d b y M o r g a n . ' More r e c e n t l y S c h u l t z 2 - 4h a s d i s c u s s e d t h e p r o b l e m more f u l l y , i n d i c a t i n g t h e known c y t o g e n e t i c a lm e c h a n i s m s t h a t c o u l d a c c o u n t f o r n u c l e a r d i f f e r e n t i a t i o n , a n d W e i s z 5h a s r e v i e w e d i t i n r e l a t i o n t o c i l i a t e m o r p h o g e n e s i s .

O b v i o u s l y t h i s p r o b l e m c a n b e s o l v e d o n l y b y t h e d e v e l o p m e n t o f am e t h o d f o r t e s t i n g d i r e c t l y w h e t h e r n u c l e i o f d i f f e r e n t i a t i n g e m b r y o n i cc e l l s a r e o r a r e n o t t h e m s e l v e s d i f f e r e n t i a t e d . T h i s s o r t o f t e s t c o u l d b eo b t a i n e d , a s s u g g e s t e d t o u s s e v e r a l y e a r s a g o b y S c h u l t z , i f i t w e r e p o s s i b l et o t r a n s p l a n t n u c l e i . I d e a l l y , t h i s t y p e o f e x p e r i m e n t s h o u l d b e c a r r i e do u t b y t r a n s p l a n t i n g t h e n u c l e u s f r o m a n i r r e v e r s i b l y d i f f e r e n t i a t e d c e l li n t o a n e n u c l e a t e d e g g . The e g g c y t o p l a s m when n o r m a l l y n u c l e a t e d i s .

V O L . 3 8 , 1 9 5 2 4 5 5

7/29/2019 PNAS-1952-Briggs-455-63

2/9

ZOOLOGY: BRIGGS AND KINGo f c o u r s e , c a p a b l e o f g i v i n g r i s e t o t h e c o m p l e t e r a n g e o f d i f f e r e n t i a t e d c e l lt y p e s , w h i l e i n t h e a b s e n c e o f t h e n u c l e u s i t m a y c l e a v e b u t f a i l s c o m p l e t e l yt o d i f f e r e n t i a t e . 6 - 8 I n o t h e r w o r d s , i t s d i f f e r e n t i a t i o n , w h i l e p o t e n t i a l l y 'c o m p l e t e , i s s t i l l n u c l e u s - d e p e n d e n t . T h e r e f o r e , i f t h e e g g n u c l e u s c o u l db e r e p l a c e d b y o n e f r o m a d i f f e r e n t i a t e d c e l l , t h e n a t u r e o f t h e e n s u i n gd e v e l o p m e n t s h o u l d r e v e a l t h e c h a r a c t e r o f t h e t r a n s p l a n t e d n u c l e u s -c o m p l e t e d i f f e r e n t i a t i o n w o u l d i n d i c a t e t h a t i r r e v e r s i b l e n u c l e a r d i f f e r e n t i a -t i o n h a d n o t o c c u r r e d , w h i l e l i m i t e d d i f f e r e n t i a t i o n w o u l d i n d i c a t e t h a t i th a d .

I n o r d e r t o make s u c h t e s t s o f n u c l e a r d i f f e r e n t i a t i o n i t i s f i r s t n e c e s s a r yt o d e v e l o p a m e t h o d o f t r a n s p l a n t a t i o n t h a t l e a v e s b o t h t h e t r a n s p l a n t e dn u c l e u s a n d t h e r e c i p i e n t e g g c y t o p l a s m i n u n d a m a g e d c o n d i t i o n . Theo n l y w ay t o d e t e r m i n e i f t h i s c a n b e d o n e i s t o w o r k f i r s t w i t h n u c l e i f r o mu n d i f f e r e n t i a t e d c e l l s w h i c h , i f t r a n s p l a n t e d p r o p e r l y , s h o u l d g i v e r i s e t on o r m a l e m b r y o s . I n t h e A m p h i b i a t h e c e l l s o f c h o i c e f o r t h i s p u r p o s e a r et h o s e o f t h e l a t e b l a s t u l a . They a r e a l m o s t a s s m a l l a s t h e d i f f e r e n t i a t e dc e l l s o f s l i g h t l y o l d e r e m b r y o s a n d s o p r e s e n t t h e s a m e t e c h n i c a l p r o b l e m s .At t h e s a m e t i m e t h e y a r e , w i t h t h e e x c e p t i o n o f t h e f u t u r e d o r s a l l i p c e l l s ,s t i l l u n d e t e r m i n e d a n d t h e r e f o r e t h e i r n u c l e i c a n n o t b e i r r e v e r s i b l y d i f f e r -e n t i a t e d . F o r t h e s e r e a s o n s w e h a v e w o r k e d o u t a m e t h o d f o r t r a n s -p l a n t i n g n u c l e i f r o m t h e s e c e l l s i n t o e n u c l e a t e d f r o g s ' e g g s . T h e s e e g g sc l e a v e a n d i n a s i g n i f i c a n t p r o p o r t i o n o f t h e c a s e s d e v e l o p i n t o c o m p l e t ee m b r y o s .M e t h o d . - T h e t r a n s p l a n t a t i o n o f n u c l e i i s c a r r i e d o u t i n t h e f o l l o w i n gs t e p s : F i r s t t h e r e c i p i e n t e g g i s p r i c k e d w i t h a c l e a n g l a s s n e e d l e . T h i sa c t i v a t e s t h e e g g a n d c a u s e s i t t o r o t a t e s o t h a t t h e a n i m a l p o l e i s u p p e r -m o s t a n d t h e e g g n u c l e u s c a n b e t a k e n o u t w i t h a g l a s s n e e d l e b y P o r t e r ' s 9t e c h n i q u e . T h e o u t e r j e l l y c o a t s a r e t h e n r e m o v e d a n d t h e e g g i s p l a c e di n a d e p r e s s i o n i n a w a x - b o t t o m e d d i s h i n N i u - T w i t t y ' s ' 0 s o l u t i o n . Ab l a s t u l a o r e a r l y g a s t r u l a ( S t . 8 t o 1 0 , S h u m w a y 1 1 ) , p l a c e d i n t h e sam ed i s h , i s t h e n o p e n e d up a n d o n e o f t h e s u b s u r f a c e a n i m a l p o l e c e l l s i s d i s -s e c t e d f r e e f r o m i t s n e i g h b o r s . The c e l l i s n o w d r a w n up i n t o t h e m o u t ho f a t h i n - w a l l e d g l a s s m i c r o p i p e t t e , t h e l u m e n o f w h i c h i s s o m e w h a ts m a l l e r t h a n t h e d i a m e t e r o f t h e c e l l . The p i p e t t e i s h e l d i n a L e i t z -C h a m b e r s h o l d e r c o n n e c t e d v i a r u b b e r p r e s s u r e t u b i n g t o an o r d i n a r y5 - m l . s y r i n g e . A l l o f t h e s y s t e m e x c e p t t h e t i p o f t h e n e e d l e i s f i l l e d w i t ha i r . The t i p c o n t a i n s t h e c o l u m n o f s o l u t i o n d r a w n up w i t h t h e c e l l .P r o v i d e d t h e n e e d l e i s r e a l l y c l e a n t h e movements o f t h e c o l u m n c a n b ec o n t r o l l e d a c c u r a t e l y . N o w , a s t h e c e l l i s d r a w n u p i n t o t h e n e e d l e i t i sc o m p r e s s e d a n d d i s t o r t e d i n s u c h a w a y a s t o b r e a k t h e c e l l s u r f a c e w i t h -o u t d i s p e r s i n g t h e c e l l c o n t e n t s . Th e n e e d l e i s t h e n i n s e r t e d i n t o t h ee n u c l e a t e d e g g a n d t h e b r o k e n c e l l i s i n j e c t e d , t h u s l i b e r a t i n g t h e n u c l e u sw i t h i n t h e e g g . The i n j e c t i o n c a n b e c o n t r o l l e d b y w a t c h i n g t h e m e n i i s c u s

4 5 6 P R O C . N . A . S .

7/29/2019 PNAS-1952-Briggs-455-63

3/9

ZOOLOGY: BRIGGS AND KINGo f t h e f l u i d c o l u m n w i t h i n t h e n e e d l e , t h i n g s b e i n g a r r a n g e d s o t h a t t h eb r o k e n c e l l i s k e p t n e a r t h e t i p o f t h e n e e d l e w h i l e t h e m e n i s c u s o f t h ec o l u m n i s h i g h e r u p b u t s t i l l w i t h i n t h e f i e l d o f t h e m i c r o s c o p e . F o l l o w i n gt h e i n j e c t i o n t h e n e e d l e i s s l o w l y w i t h d r a w n . U s u a l l y a s i t i s w i t h d r a w ni t p u l l s t h e s u r f a c e c o a t u p a g a i n s t t h e v i t e l l i n e membrane s o t h a t a s m a l lc a n a l i s f o r m e d t h r o u g h w h i c h t h e e g g s u b s t a n c e m a y s u b s e q u e n t l y l e a k .T h i s c a n b e p r e v e n t e d b y c u t t i n g t h e c o n n e c t i o n b e t w e e n t h e e g g s u r f a c ea n d t h e v i t e l l i n e membrane w i t h g l a s s n e e d l e s . Th e e g g i s t h e n r e m o v e df r o m t h e o p e r a t i n g d i s h a n d p l a c e d i n a s m a l l S t e n d e r d i s h i n s p r i n g w a t e r .R e s u l t s . - W h e n e g g s ( R . p i p i e n s ) a r e s i m p l y p r i c k e d w i t h a c l e a n g l a s sn e e d l e t h e y r o t a t e , f o r m t h e e p h e m e r a l " b l a c k d o t s " l o c a l i z i n g t h e s e c o n dm a t u r a t i o n d i v i s i o n s p i n d l e , a n d w i t h i n a f e w h o u r s s h o w p u c k e r i n g o f t h es u r f a c e o r a b o r t i v e a n d i r r e g u l a r c l e a v a g e f u r r o w s . T h e r e i s n o g e n u i n ec l e a v a g e o r b l a s t u l a f o r m a t i o n . I n o u r e x p e r i m e n t s 9 9 % ( 2 8 3 1 o u t o f2 8 5 3 ) o f t h e p r i c k e d e g g s b e h a v e d i n t h i s w a y . By c o n t r a s t , e g g s w h i c ha r e p r i c k e d a n d e n u c l e a t e d f a i l t o g i v e a n y s i g n s o f c l e a v a g e . W h e n o b -s e r v e d a f e w h o u r s a f t e r a c t i v a t i o n t h e s e e g g s s h o w n o n e o f t h e p u c k e r i n g s ,e t c . , w h i c h a r e p r e s e n t i n p r a c t i c a l l y a l l o f t h e p r i c k e d e g g s a t t h i s t i m e .T h u s , 6 3 1 o u t o f 6 3 8 e n u c l e a t e d e g g s b e h a v e d i n t h i s w a y , i n d i c a t i n g t h a t99% o f t h e o pe r a t i o n s f o r r e m o v a l o f t h e e g g n u c l e u s w e r e s u c c e s s f u l .A c t u a l l y , t h e 7 e g g s w h i c h d i d s h o w p u c k e r s w e r e o n e s i n w h i c h t h e e x o -v a t e , w h i c h f o r m s w h e n t h e e g g i n e n u c l e a t e d a n d w h i c h c o n t a i n s t h e e g gn u c l e u s , s t i l l r e t a i n e d a c o n n e c t i o n w i t h t h e e g g . I n t h e s e t h e e g g p r o p e rm a y h a v e b e e n e n u c l e a t e d , t h e p u c k e r s f o r m i n g t h r o u g h t h e i n f l u e n c e o ft h e n u c l e u s i n t h e a t t a c h e d e x o v a t e .

I n o r d e r t o c h e c k f u r t h e r o n t h e s u c c e s s o f t h e o p e r a t i o n f o r e n u c l e a t i o nwe a l w a y s e n u c l e a t e d s o m e n o r m a l l y i n s e m i n a t e d e g g s a t t h e e n d o f e a c he x p e r i m e n t . From t h e s e we s h o u l d o b t a i n a n d r o g e n e t i c h a p l o i d s w h e nt h e o p e r a t i o n i s s u c c e s s f u l , a n d n o r m a l d i p l o i d s w h e n i t i s n o t . O u t o f3 5 8 o p e r a t i o n s , r e g a r d e d a t t h e t i m e a s s u c c e s s f u l , w e o b t a i n e d 3 3 7 e m b r y o s ,a l l o f t h e m h a p l o i d s . A n a d d i t i o n a l 1 6 9 o p e r a t i o n s , r e g a r d e d a s n o t a b s o -l u t e l y c e r t a i n , g a v e 1 6 1 e m b r y o s o f w h i c h 1 6 0 w e r e h a p l o i d s .From t h e s e r e s u l t s we c a n s a y t h a t e g g s w h i c h a r e p r i c k e d a n d t h e ne n u c l e a t e d w i l l p r a c t i c a l l y n e v e r r e t a i n t h e e g g n u c l e u s b y m i s t a k e , a n dw i l l n e v e r d e v e l o p . W h e n t h e s e e g g s a r e n ow e a c h i n j e c t e d w i t h a d i p l o i db l a s t u l a c e l l n u c l e u s m o r e t h a n h a l f o f t h e m c l e a v e , g i v i n g r i s e t o p a r t i a la n d c o m p l e t e b l a s t u l a e a s s u m m a r i z e d i n t a b l e 1 . S o m e o f t h e s e b l a s t u l a ew e r e f i x e d . The r e m a i n d e r d e v e l o p e d a s s h o w n i n t a b l e 2 . O f t h e c o m -p l e t e b l a s t u l a e t h e m a j o r i t y ( 7 4 % ) g a s t r u l a t e d n o r m a l l y a n d f o r m e d c o m -p l e t e e m b r y o s . A p p r o x i m a t e l y h a l f o f t h e s e w e r e n o r m a l i n a p p e a r a n c ew h e n f i x e d a t s t a g e s r a n g i n g f r o m s t a g e 1 9 ( 5 - m m . e m b r y o ) t o t h e t a d p o l es t a g e . Th e r e m a i n d e r f o r m e d c o m p l e t e n e u r u l a e b u t l a t e r on d i s p l a y e ds l i g h t t o m o d e r a t e a b n o r m a l i t i e s s u c h a s g r o w t h r e t a r d a t i o n , m i c r o c e p h a l y

V O L . 3 8 , 1 9 5 2 4 5 7

7/29/2019 PNAS-1952-Briggs-455-63

4/9

4 5 8 ZOOLOGY: BRIGGS AND KING P R O C . N . A . S .i n s o m e c a s e s , l a r g e r t h a n n o r m a l h e a d s i n o t h e r s a n d s o o n . O f t h e 1 5a b n o r m a l e m b r y o s l i s t e d i n t a b l e 2 , 1 4 w e r e d i p l o i d s a n d 1 w a s p o l y p l o i da s j u d g e d f r o m t h e e c t o d e r m a l c e l l s i z e . A m o n g t h e 1 5 n o r m a l e m b r y o st h e r e w e r e 7 d i p l o i d s a n d 8 p o l y p l o i d s . Th e o n l y o t h e r e m b r y o s t h a td e v e l o p e d f a r e n o u g h t o g i v e c l e a r i n d i c a t i o n s o f c h r o m o s o m e n u m b e rw e r e 4 o f t h e 5 a b n o r m a l n e u r u l a e l i s t e d i n t h e t a b l e . T h e s e a l s o w e r ed i p l o i d ( 2 c a s e s ) o r p o l y p l o i d ( 2 c a s e s ) . T h u s , among t h e 3 5 e m b r y o s

TABLE 1CLEAVAGE O F ENUCLEATED EGGS I N J E C T E D WITH BLASTULA CELL NUCLEI

N o . o f e g g s i n j e c t e d ................................... 1 9 7C l e a v a g eNone ............................................. 4 5A b o r t i v e .......................................... 4 8C l e a v e d ........................................... 1 0 4

B l a s t u l a eP a r t i a l< 1 / 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . : ......................... 1 2>1 / 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9C o m p l e t e .......................................... 6 3

N O T E S : E a c h e g g w a s a c t i v a t e d , e n u c l e a t e d a n d t h e n i n j e c t e d w i t h a d i p l o i d n u c l e u sf r o m a n a n i m a l h e m i s p h e r e c e l l o f a n a d v a n c e d b l a s t u l a o r e a r l y g a s t r u l a . O f t h eb l a s t u l a e o b t a i n e d f r o m t h e i n j e c t e d e g g s , 1 3 o f t h e c o m p l e t e o n e s a n d 1 7 o f t h e p a r t i a lo n e w e r e f i x e d d u r i n g t h e f i r s t d a y o f d e v e l o p m e n t . The r e m a i n d e r w e r e a l l o w e d t od e v e l o p a n d g a v e r i s e t o e m b r y o s a s s h o w n i n t a b l e 2 .

TABLE 2DEVELOPMENT OF BLASTULAE DERIVED FROM ENUCLEATED EGGS I N J E C T E D WITHBLASTULA CELL NUCLEI

1 2 3 4 . 5 6POST-GASTRULA DEVELOPMENTEFFECTIVE TOTAL ABN. POST-NBURULA

TYPE OF TOTAL ARRESTED -GASTRULAB- e-GASTRULAE----' NEU- e-EMBRYOS--BLASTULA NO. BLASTULAE NORMAL ABN. NORMAL ABN. RULAB NORMAL S L . ABN.C o m p l e t e 5 0 3 3 7 1 0 3 0 2 2 1 5 1 5> 1 / 2 2 0 7 0 1 3 0 3 3 0 0< l / 2 4 4 0 0 . . . .

N O T E S : O f t h e t o t a l number o f g a s t r u l a e o b t a i n e d ( c o l . 4 ) s o m e w e r e f i x e d , l e a v i n gt h e n u m b e r s g i v e n i n c o l u m n 5 . T h e s e w e r e d e v e l o p e d i n t o e m b r y o s a s l i s t e d i n c o l u m n6 .o b t a i n e d t h e r e w e r e n o h a p l o i d s . Ha d t h e y o c c u r r e d t h e y w o u l d h a v e b e e nh a r d t o a c c o u n t f o r i n t h e s e e x p e r i m e n t s , s i n c e t h e i n j e c t e d n u c l e u s w a sd i p l o i d . The p o l y p l o i d s , o n t h e o t h e r h a n d , m a y b e e x p l a i n e d . Th eb l a s t u l a c e l l n u c l e i a r e u n d o u b t e d l y i n v a r i o u s s t a g e s o f m i t o s i s w h e nt r a n s p l a n t e d , a n d t h e r e s h o u l d b e a m p l e o p p o r t u n i t y f o r a d o u b l i n g o fc h r o m o s o m e s t o o c c u r a f t e r t h e n u c l e u s h a s b e e n t r a n s p l a n t e d a n d b e f o r et h e e g g c y t o p l a s m i s p r e p a r e d t o c l e a v e .

7/29/2019 PNAS-1952-Briggs-455-63

5/9

ZOOLOGY: BRIGGS AND KINGI n o r d e r t o g e t c y t o l o g i c a l e v i d e n c e o f t h e r e m o v a l o f t h e e g g n u c l e u s 2 2

o f t h e i n j e c t e d e g g s w e r e f i x e d a t s t a g e s r a n g i n g f r o m m o r u l a t o g a s t r u l a ,a n d w e r e s e c t i o n e d a n d s t a i n e d w i t h t h e F e u l g e n r e a g e n t . I n 2 1 o f t h e s ee g g s t h e e x o v a t e c o u l d b e s e e n t r a p p e d i n t h e i n n e r j e l l y l a y e r b u t s e p a -r a t e d f r o m t h e e g g p r o p e r . I n 9 c a s e s t h e e g g n u c l e u s w a s f o u n d i n t h ee x o v a t e , w h i l e t h e e g g p r o p e r c o n s i s t e d o f c e l l s c o n t a i n i n g n o r m a l n u c l e iw h i c h c o u l d o n l y h a v e b e e n d e r i v e d f r o m t h e t r a n s p l a n t e d n u c l e u s . I n 6a d d i t i o n a l c a s e s F e u l g e n p o s i t i v e m a t e r i a l w a s s e e n i n t h e e x o v a t e , b u t i tc o u l d n o t b e d e f i n i t e l y r e c o g n i z e d a s t h e e g g n u c l e u s . T h e r e m a i n i n g 6c a s e s s h o w e d n o F e u l g e n p o s i t i v e m a t e r i a l . I n t h e s e t h e e g g n u c l e u s m a yh a v e b e e n l o s t f r o m t h e e x o v a t e , o r i t c o u l d h a v e b e e n o b s c u r e d by t h ep i g m e n t o f t h e s u r f a c e c o a t s u r r o u n d i n g t h e e x o v a t e .

The e v i d e n c e s u m m a r i z e d a b o v e s h o w s q u i t e c o n c l u s i v e l y t h a t l i v i n gn u c l e i c a n b e t r a n s p l a n t e d f r o m b l a s t u l a c e l l s i n t o e n u c l e a t e d e g g s . How-TABLE 3

DEVELOPMENT OF ENUCLEATED P i p i e n s EGGS I N J E C T E D WITH C a t e s b e i a n a NUCLEI1 2 3 4 5

ARRESTED ARRESTEDNO . OF ,- CLEAVAGE ---BLASTULAE--- IN IN EARLYTYPE OF EGGS ABORTIVE .-PARTIAL- BLASTULA GASTRULANUCLEUS INJECTED NONE CLEAVAGE CLEAVED 1/2 COMPLEITE STAG1E STAGE

C a t e s b e i a n a( h a p l o i d ) 1 1 9 2 7 2 6 6 6 1 2 3 1 2 3 6 6 0C a t e s b e j a n aX p i p i e n s( d i p l o i d ) 4 6 1 7 7 2 2 1 7 1 4 1 1 1 1

N O T E S : T h e n u c l e i u s e d f o r t r a n s p l a n t a t i o n w e r e t a k e n f r o m a n i m a l h e m i s p h e r ec e l l s o f h y b r i d b l a s t u l a e 1 7 - 1 8 h r s . o l d ( 1 8 C . ) . T h e d i p l o i d h y b r i d n u c l e i w e r e f r o mt h e c r o s s , p i p i e n s 9 X c a t e s b e i a n a d . T h e c a t e s b e i a n a h a p l o i d n u c l e i w e r e f r o m t h ea n d r o g e n e t i c h a p l o i d h y b r i d , p i p i e n s ( 9 ) X c a t e s b e i a n a d ' .e v e r , i n o r d e r t o g e t an a d d i t i o n a l p r o o f o f t h e s u c c e s s o f t h e t e c h n i q u ewe h a v e t r a n s p l a n t e d R . c a t e s b e i a n a n u c l e i i n t o R . p i p i e n s e n u c l e a t e de g g s . I t i s known f r o m h y b r i d i z a t i o n e x p e r i m e n t s 8 1 2 , 1 3 t h a t t h i s com-b i n a t i o n i s l e t h a l . The d i p l o i d h y b r i d i s a r r e s t e d i n l a t e b l a s t u l a o r e a r l yg a s t r u l a s t a g e a n d d i e s i n a b o u t 3 d a y s , w h i l e t h e a n d r o g e n e t i c h a p l o i dh y b r i d i s a l w a y s a r r e s t e d i n l a t e b l a s t u l a s t a g e b u t d i e s l a t e r - a t a b o u t4 t o 5 d a y s . T h u s , i f t h e t r a n s p l a n t a t i o n o f t h e f o r e i g n n u c l e u s i s s u c c e s s -f u l w e s h o u l d o b t a i n a u n i f o r m a r r e s t o f d e v e l o p m e n t f o l l o w e d a t t h e a p p r o -p r i a t e i n t e r v a l b y t h e d e a t h o f t h e e m b r y o .Th e e x p e r i m e n t s w e r e d o n e a s f o l l o w s : Donor b l a s t u l a e w e r e p r o d u c e db y i n s e m i n a t i n g p i p i e n s e g g s w i t h c a t e s b e i a n a s p e r m . The e g g n u c l e u swas r e m o v e d f r o m some o f t h e s e , g i v i n g u s a n d r o g e n e t i c h a p l o i d h y b r i d s .The r e s t o f t h e e g g s w e r e a l l o w e d t o d e v e l o p a s d i p l o i d h y b r i d s . A f t e r

V O L . 3 8 , 1 9 5 2 4 5 9

7/29/2019 PNAS-1952-Briggs-455-63

6/9

ZOOLOGY: BRIGGS A N D F KINGa b o u t 1 8 h o u r s a t 1 8 0 b o t h t y p e s o f h y b r i d s h a d d e v e l o p e d t o s t a g e 8( m i d t o l a t e b l a s t u l a ) , a n d w e r e u s u a l l y u s e d t o p r o v i d e n u c l e i f o r t r a n s -p l a n t a t i o n a t t h i s t i m e . The h y b r i d s a r e , o f c o u r s e , a r r e s t e d s h o r t l y

e x p . Io d i p . h y b r i d c o n t .o h o p . h y b r l d c o n t .a h o p , h y b r i d - t r a n s p l a n t e dn u c l eu s

o d i p . h y b r i d c o n t .0 h a p . h y b r i d c o n t .* d I p . h y b r i d - t r o n s p l a n t e dnucleus

60 80 1 0 0 1 2 0

a ge - h o u r sFIGURE 1

E x p . 1 . - M o r t a l i t y c u r v e s f o r ( 1 ) h a p l o i d h y b r i d c o n t r o l s , p i p i e n s ( 9 ) Xc a t e s b e j a n a d; ( 2 ) e n u c l e a t e d p i p i e n s eggs i n j e c t e d w i t h h a p l o i d c a t e s b e i a n an u c l e i ; a n d ( 3 ) c o n t r o l d i p l o i d h y b r i d s , p i p i e n s 9 X c a t e s b e i a n a c.B a s e d on 5 5 h a p l o i d h y b r i d c o n t r o l s , 2 8 e x p e r i m e n t a l h a p l o i d h y b r i d s , and1 4 7 d i p l o i d h y b r i d c o n t r o l s .

E x p . 2.-As f o r e x p e r i m e n t 1 , e x c e p t f o r t h e e x p e r i m e n t a l e m b r y o s w h i c hi n t h i s e x p e r i m e n t a r e d e r i v e d f r o m e n u c l e a t e d p i p i e n s eggs i n j e c t e d w i t hdiploid (pipiens 9 Xcatesbeiana d ' ) hybrid nuclei.

B a s e d on 1 1 9 d i p l o i d h y b r i d c o n t r o l s , 2 1 e x p e r i m e n t a l d i p l o i d h y b r i d s , and7 3 h a p l o i d h y b r i d c o n t r o l s .t h e r e a f t e r a n d we h a v e e v i d e n c e , n o t p r e s e n t e d h e r e , t h a t n u c l e i t a k e nf r o m o l d e r b l a s t u l a e ( s t a g e 9 ) g e n e r a l l y w i l l n o t c a u s e e n u c l e a t e d eggs t oc l e a v e .

l i v i n g1 0 0806040200

1 0 08 06040200

4 6 0 P R O C . N . A . S .

7/29/2019 PNAS-1952-Briggs-455-63

7/9

ZOOLOGY: BRIGGS AND KINGThe r e s u l t s o f t h e t r a n s p l a n t a t i o n s o f n u c l e i f r o m h y b r i d b l a s t u l a e a r e

s u m m a r i z e d i n t a b l e 3 . About h a l f o f t h e e n u c l e a t e d e g g s w h i c h w e r ei n j e c t e d w i t h t h e c a t e s b e i a n a h a p l o i d n u c l e u s c l e a v e d a n d d e v e l o p e d i n t op a r t i a l o r c o m p l e t e b l a s t u l a e , a s i n d i c a t e d i n t h e t a b l e . Th e c o m p l e t eb l a s t u l a e , i t s h o u l d b e e m p h a s i z e d , l o o k e d p e r f e c t l y n o r m a l . Y e t n o n eo f t h e m s h o w e d a n y s i g n s o f g a s t r u l a t i o n . They w e r e a l l a r r e s t e d i n l a t eb l a s t u l a s t a g e , a s w e r e t h e a n d r o g e n e t i c h a p l o i d h y b r i d c o n t r o l s , a n d l a t e ro n t h e y a l l d i e d a t a p p r o x i m a t e l y t h e s a m e t i m e a s d i d t h e c o n t r o l s( F i g . 1 ) .E n u c l e a t e d e g g s i n j e c t e d w i t h d i p l o i d h y b r i d n u c l e i a l s o c l e a v e d a n dg a v e r i s e t o b l a s t u l a e , a s s h o w n i n t a b l e 3 . T h e s e c o r r e s p o n d e d t o t h ed i p l o i d h y b r i d c o n t r o l s i n t h e i r d e v e l o p m e n t . That i s , t h e y w e r e a l la r r e s t e d e i t h e r i n l a t e b l a s t u l a o r e a r l y g a s t r u l a s t a g e s , a n d d i e d whent h e i r c o n t r o l s d i d . ( F i g . 1 . )

I n o r d e r t o s e e w h e t h e r t h e n u c l e a r p h e n o m e n a a s s o c i a t e d w i t h t h e a r r e s ta n d d e a t h o f t h e b l a s t u l a e w e r e o c c u r r i n g i n t h e s a m e w ay i n t h e e x p e r i -m e n t a l a n d c o n t r o l b l a s t u l a e w e f i x e d s e v e r a l o f e a c h a t a g e s o f 4 2 t o 7 2h o u r s . The c o n t r o l s c o n s i s t e d o f 9 a n d r o g e n e t i c h a p l o i d h y b r i d s[ p i p i e n s ( 9 ) X c a t e s b e i a n a c i ] ; t h e 1 7 e x p e r i m e n t a l b l a s t u l a e w e r e a l ld e r i v e d f r o m e n u c l e a t e d p i p i e n s e g g s i n j e c t e d w i t h h a p l o i d c a t e s b e i a n an u c l e i t a k e n f r o m a n d r o g e n e t i c h a p l o i d h y b r i d b l a s t u l a e .A s t u d y o f t h e a r r e s t e d c o n t r o l b l a s t u l a e r e v e a l e d a v a r i e t y o f n u c l e a ra b n o r m a l i t i e s . T h e m a j o r i t y o f t h e n u c l e i w e r e i n a n a b n o r m a l i n t e r p h a s e

c o n d i t i o n c h a r a c t e r i z e d b y a n a c c u m u l a t i o n o f c h r o m a t i n a r o u n d t h ep e r i p h e r y o f t h e n u c l e u s i n t h e f o r m o f t h i c k t h r e a d s , l e a v i n g t h e c e n t r a lp o r t i o n f r e e o f F e u l g e n - p o s i t i v e m a t e r i a l . I n a d d i t i o n t h e r e w e r e a r r e s t e da n d a b n o r m a l m e t a p h a s e s , a n d a f e w a n a p h a s e s w h i c h a l w a y s s h o w e db r i d g e s . I n some o f t h e s e f i g u r e s t h e c h r o m o s o m e s w e r e c l u m p e d . F i n a l l y ,some c e l l s c o n t a i n e d s m a l l g r o u p s o f c h r o m o s o m e s , o r s m a l l p y c n o t i cn u c l e i , p r e s u m a b l y d e r i v e d f r o m i r r e g u l a r d i v i s i o n s t h a t h a d o c c u r r e de a r l i e r .

I n t h e m a j o r i t y ( 1 4 o u t o f 1 7 ) o f t h e e x p e r i m e n t a l b l a s t u l a e t h e n u c l e a ra b n o r m a l i t i e s w e r e e x a c t l y t h e sam e a s t h o s e d e s c r i b e d a b o v e f o r t h ec o n t r o l s . I n 3 c a s e s , h o w e v e r , t h e c o n d i t i o n was d i f f e r e n t , w i t h t h e n u c l e ia l l i n a n a b n o r m a l i n t e r p h a s e c o n d i t i o n c h a r a c t e r i z e d b y a r a t h e r d i f f u s eF e u l g e n s t a i n i n g . We d o n o t know y e t h ow t o a c c o u n t f o r t h e s e e x c e p -t i o n a l c a s e s . I t m a y b e t h a t i n a l a r g e r s e r i e s o f c a s e s t h e same t y p e o fn u c l e a r p h e n o m e n o n m i g h t a p p e a r among t h e c o n t r o l s , o r o c c a s i o n a l l yt h e r e m a y b e some e f f e c t o f t h e t r a n s p l a n t a t i o n on t h e s u b s e q u e n t b e -h a v i o r o f t h e n u c l e i . I n a n y c a s e , i n t h e l a r g e m a j o r i t y o f t h e e x p e r i m e n t a lb l a s t u l a e t h e a p p e a r a n c e o f t h e n u c l e i i s t h e sam e a s i t i s i n t h e c o n t r o l s .T h i s f a c t , t a k e n t o g e t h e r w i t h t h e f a c t t h a t t h e e x t e n t o f d e v e l o p m e n t a n dt h e t i m e o f d e a t h a r e a l s o t h e sam e i n t h e e x p e r i m e n t a l a n d c o n t r o l b l a s t u l a e

V O L . 3 8 , 1 9 5 2 4 6 1

7/29/2019 PNAS-1952-Briggs-455-63

8/9

ZOOLOGY: BRIGGS AND KINGp r o v i d e s c o n v i n c i n g e v i d e n c e o f t h e s u c c e s s f u l t r a n s p l a n t a t i o n o f t h ef o r e i g n n u c l e u s .D i s c u s s i o n . - N u c l e a r t r a n s p l a n t a t i o n h a s b e e n a c c o m p l i s h e d p r e v i o u s l yi n a m o e b a e , ' 4 ' 1 5 b u t t o o u r k n o w l e d g e h a s n o t b e e n r e p o r t e d f o r o t h e rf o r m s . The e v i d e n c e s u m m a r i z e d i n t h i s p a p e r s h o w s t h a t b l a s t u l a c e l ln u c l e i m a y n ow b e t r a n s p l a n t e d i n t o e n u c l e a t e d f r o g s ' e g g s , g i v i n g r i s e t on u c l e a t e d e m b r y o s w h i c h d i f f e r e n t i a t e n o r m a l l y . T h i s m e a n s t h a t t h en u c l e i a r e n o t s i g n i f i c a n t l y d a m a g e d , a n d i n d i c a t e s t h a t t h e t e c h n i q u e o fn u c l e a r t r a n s p l a n t a t i o n m a y n ow b e u s e d i n t e s t i n g n u c l e i f r o m v a r i o u sd i f f e r e n t i a t e d p a r t s o f t h e A m p h i b i a n e m b r y o . Th e a d v a n t a g e s o f b e i n ga b l e t o s t u d y t h e p r o b l e m o f n u c l e a r d i f f e r e n t i a t i o n w i t h t h i s e m b r y o a r ec o n s i d e r a b l e . I t i s o n e o f t h e c l a s s i c a l o b j e c t s o f e x p e r i m e n t a l e m b r y o l o g ya n d t h e r e b y p r o v i d e s u s w i t h t h e o p p o r t u n i t y o f c o r r e l a t i n g t h e p r o p e r t i e so f t h e n u c l e i , a s t h e y m a y b e r e v e a l e d b y n u c l e a r t r a n s p l a n t a t i o n , w i t ht h e known p r o p e r t i e s o f t h e d i f f e r e n t p a r t s o f t h e e m b r y o a s d e m o n s t r a t e db y t h e n u m e r o u s t r a n s p l a n t a t i o n a n d e x p l a n t a t i o n e x p e r i m e n t s r e c o r d e di n t h e l i t e r a t u r e .Th e m e t h o d o f n u c l e a r t r a n s p l a n t a t i o n , d e s c r i b e d i n t h i s p a p e r , i n v o l v e st r a n s f e r r i n g t h e c y t o p l a s m a s w e l l a s t h e n u c l e u s o f t h e b l a s t u l a c e l l i n t ot h e e n u c l e a t e d e g g . T h i s d o e s n o t , h o w e v e r , b r i n g a b o u t a s i g n i f i c a n td i l u t i o n o f t h e e g g c y t o p l a s m . The t o t a l v o l u m e o f t h e d o n o r b l a s t u l ac e l l i s a b o u t 2 X 1 0 - 4 C U . m m . , w h i l e t h e a v e r a g e v o l u m e o f t h e p i p i e n se g g i s a b o u t 3 . 4 c u . mm.- g i v i n g a r a t i o o f 1 : 1 7 , 0 0 0 . We h a v e n o t c a l c u -l a t e d t h e v o l u m e o f t h e b l a s t u l a c e l l c y t o p l a s m b u t i t w o u l d b e s i g n i f i c a n t l ys m a l l e r t h a n t h a t o f t h e w h o l e c e l l a n d t h e r a t i o o f i t t o t h e e g g c y t o p l a s mv o l u m e i s t h e r e f o r e p r o b a b l y s m a l l e r t h a n 1 : 2 0 , 0 0 0 . None t h e l e s s , somec y t o p l a s m i s t r a n s f e r r e d a l o n g w i t h t h e n u c l e u s b y t h i s m e t h o d . R e f i n e -m e n t s m a y make i t p o s s i b l e t o e l i m i n a t e most o f t h e c y t o p l a s m , b u t i tw i l l b e e x t r e m e l y d i f f i c u l t i f n o t i m p o s s i b l e t o d e v i s e a m e t h o d f o r o b t a i n i n gn u c l e i w h i c h c a n b e s a i d t o b e c o m p l e t e l y f r e e o f c y t o p l a s m . H o w e v e r ,t h i s i s n o t i m p o r t a n t a t p r e s e n t . The m e t h o d a s i t s t a n d s s h o u l d a l l o wu s t o d e t e c t s u c h i r r e v e r s i b l e c h a n g e s i n n u c l e i a s m a y b e l i m i t i n g w i t hr e s p e c t t o d i f f e r e n t i a t i o n . A nd i n t h e f u t u r e t h e r o l e o f t h e c y t o p l a s mm a y b e e x p l o r e d b y c o m b i n i n g i n t r a n s p l a n t a t i o n n u c l e i a n d c y t o p l a s mf r o m d i f f e r e n t t y p e s o f c e l l s , o r f r o m t h e same t y p e a t d i f f e r e n t s t a g e s o fd i f f e r e n t i a t i o n .

A l t h o u g h t h e m e t h o d o f n u c l e a r t r a n s p l a n t a t i o n s h o u l d b e v a l u a b l ep r i n c i p a l l y f o r t h e s t u d y o f n u c l e a r d i f f e r e n t i a t i o n , i t m a y a l s o h a v e o t h e ru s e s . I n p a r t i c u l a r , i t c a n p r o v i d e u s w i t h a t e s t o f w h e t h e r n u c l e i w h i c hh a v e b e e n t r e a t e d i n v a r i o u s w a y s s t i l l r e t a i n t h e i r c a p a c i t y f o r m i t o s i s .T h i s i s t h e b e s t i f n o t t h e o n l y t e s t o f a n o r m a l n u c l e u s , a n d w e h o p e t h a ti t m a y e v e n t u a l l y b e a p p l i e d t o t h e p r o b l e m o f d e v e l o p i n g a n o p t i m a ln u c l e a r medium-a m a t t e r w h i c h s h o u l d h a v e r e a l i m p o r t a n c e f o r f u t u r es t u d i e s o f n u c l e a r b i o c h e m i s t r y .

4 6 2 P R O C . N . A . S .

7/29/2019 PNAS-1952-Briggs-455-63

9/9

Z O O L O G Y . : BRIGGS AND KINGSummary.-In t h i s p a p e r a m e t h o d i s d e s c r i b e d f o r t r a n s p l a n t i n g n u c l e i

f r o m a d v a n c e d b l a s t u l a c e l l s i n t o e n u c l e a t e d e g g s o f Rana p i p i e n s . W h e nt h e n u c l e u s i s f r o m t h e s a m e s p e c i e s a s t h e e g g c y t o p l a s m t h e e g g t h e nc l e a v e s a n d c a n d e v e l o p i n t o a n o r m a l e m b r y o . W h e n t h e n u c l e u s i s f r o ma d i f f e r e n t s p e c i e s ( R . c a t e s b e j a n a ) t h e e n u c l e a t e d p i p i e n s e g g w h i c h r e -c e i v e s i t f o r m s a b l a s t u l a w h i c h i s t h e n a r r e s t e d a n d s u b s e q u e n t l y d i e s ,e x a c t l y a s d o t h e n o r m a l l y p r o d u c e d h y b r i d s b e t w e e n t h e t w o s p e c i e s .T h e s e a n d o t h e r e x p e r i m e n t s p r o v e t h a t t h e b l a s t u l a c e l l n u c l e u s c a n b et r a n s p l a n t e d i n u n d a m a g e d c o n d i t i o n , i n d i c a t i n g t h a t t h e t e c h n i q u e o fn u c l e a r t r a n s p l a n t a t i o n i s n ow s u f f i c i e n t l y w e l l d e v e l o p e d s o t h a t i t m a yb e u s e d i n s t u d i e s o f n u c l e a r d i f f e r e n t i a t i o n a n d p o s s i b l y i n o t h e r s t u d i e so f n u c l e a r f u n c t i o n a s w e l l .A c k n o w l e d g m e n t . - W e w i s h t o t h a n k M i s s M a r i e D i B e r a r d i n o f o r h e rs k i l f u l a s s i s t a n c e i n t h i s w o r k .

* T h i s i n v e s t i g a t i o n was s u p p o r t e d i n p a r t b y a r e s e a r c h g r a n t f r o m t h e N a t i o n a lC a n c e r I n s t i t u t e , o f t h e N a t i o n a l I n s t i t u t e s o f H e a l t h , P u b l i c H e a l t h S e r v i c e ; a n d i np a r t b y a n i n s t i t u t i o n a l g r a n t f r o m t h e A m e r i c a n C a n c e r S o c i e t y .1 M o r g a n , T . H . , E m b r y o l o g y a n d G e n e t i c s , C o l u m b i a U n i v . P r e s s ( 1 9 3 4 ) .

2 S c h u l t z , J . , P r o c . S e v e n t h I n t e r n a t . G e n e t . C o n g r e s s , 2 5 7 ( 1 9 3 9 ) .3 S c h u l t z , J . , C a n c e r R e s e a r c h , 7 , 4 1 ( 1 9 4 7 ) .4 S c h u l t z , J . ( i n p r e s s ) .5 W e i s z , P . B . , Am. N a t . , 8 5 , 2 9 3 ( 1 9 5 1 ) .6 F a n k h a u s e r , G . , J . E x p . Z o o l . , 6 7 , 3 4 9 ( 1 9 3 4 ) .7 H a r v e y , E . B . , B i o l . B u l l . , 7 1 , 1 0 1 ( 1 9 3 6 ) .8 B r i g g s , R . , G r e e n , E . U . , a n d K i n g , T . J . , J . E x p . Z o o l . , 1 1 6 , 4 5 5 ( 1 9 5 1 ) .9 P o r t e r , K . R . , B i o l . B u l l . , 7 7 , 2 3 3 ( 1 9 3 9 ) .1 0 R e f e r r e d t o i n F l i c k i n g e r , R . A . , J r . , J . E x p . Z o o l . , 1 1 2 , 4 6 5 ( 1 9 4 9 ) .1 1 S h u m w a y , W . , A n a t . R e c . , 7 8 , 1 3 9 ( 1 9 4 0 ) .1 2 R u g h , R . , a n d E x n e r , F . , P r o c . A m. P h i l . S o c . , 8 3 , 6 0 7 ( 1 9 4 0 ) .1 3 M o o r e , J . A . , J . E x p . Z o o l . , 8 6 , 4 0 5 ( 1 9 4 1 ) .1 4 C o m a n d o n , J . , a n d d e F o n b r u n e , P . , C o m p t . r e n d . s o c . b i o l . , 1 3 0 , 7 4 4 ( 1 9 3 9 ) .6 5 L o r c h , I . J . , a n d D a n i e l l i , J . F . , N a t u r e , 1 6 6 , 3 2 9 ( 1 9 5 0 ) .

V O L . 3 8 , 1 9 5 2 4 6 3