Upload
surajit-bhattacharjee
View
69
Download
0
Embed Size (px)
DESCRIPTION
phage display basics
Citation preview
������� �
���� ���� �� ����� ��������� ����� �������
�������� ���� � ����������� ���������� ���� ���� ������ ��� ������� ������ ���
!���� " #��$��%�&���$��� �� '������ (�)�������)� *������� � +�� � � %�� ,������ ��� -�������� .� /0�1�� ���
��$ .��������+�% ' ��$��������� +�� � �2 #��33���� �������.�$4��3)�� �� ����/� ���
� ���� ����������� � ������ � � ����� � � ���� ���� ��������� ���������� �
�� ����� ������ ��� ��� ���� ���� ���������� ���� ����� �������� ��
� ������� ��� � ���� �������� � ����� ��� � � � � ���� �� ��� �� ����
� � ���� ���� ����� � ������ � � ���� �������� ���� ������� �� ����
����� � � �� ��� ��� � � ������� � � ����� �� � ��� �� ���� � �
� ����� ���� ������ ���� �������� �� � ��� ��� �� � ������ ��� !���
�� ��� ��������������"� � � ������ ��� � �� � �� ���� �� ��� �� �
� � �#���� �� ����� ��� �� � ������ � $� � �� � ����� ��������� � ��
�������� �� $���� !%"� �� ��� ���� ��������� �� � ������ ����� ��
�� ���� � ���������� ���� ��� ��������� � � ����� � �� �������� �
����� � � � !�� ������ � &'("�
)���� ���� ����� �� ���� � �� � ���� �� �� �� ��� � � ������ � � ��
������� � ����������� �� � �� �� ����� � � ������� � ����� � � �� � #
�� ���� ���� �* ��� � � � � ������� �� �������� �� ��������� �� �� �������
�� ������ ���� �� ��# � � �����#���� �� �+� !���+� � � ���+�"� � � �� ��
������������ � ����� �������#���� ������* ���� ����� � �� � ������ ����
�� ��� � � �������* ���� �� ��������� �� ���� ����� �� � ���� ���#
������ ��� �� ���� ����* � � ���� �������� �� ����� �� � ����� �� � �
��� ���� ������ �� ����� ��
���� ������ �� � � �� �� ������ �� �������� � �� �� � ����� � ����
������� ��� ��� , �� ���� ������ !$���� � & � � -"� �� �� ����� � ����� � �
%
���������� ������� � ���� ���� ����� �� �������.�� ���� � ���� � ������
���� �� ���� � �� ���� �������� / �� �� � �� ������ � ��� �� �����#
��� � �� � ��� �� ��������� � � � ���� ������� ��� ��� � ����� �
����� � ������� ������ ����� ��� ���� � � � ����� ������� !$���� �
0'1"� )� ����� �������� � ��������� ������ � ���� ������� ������� ����� � �
���� ���� ������� ������ �� ������� �� ���� ���� � ����� ���� ��� ��
�� ������ � ���#����� �� � ���������� !$���� � 2 � � 3"� 4����#�� �� ��
������� �� ���� ������� � �� ���� ���� ������ ������ ���������
� ������� �� �������� � �������� ����������)���� ���� ����� �� ������ � ���� ����� � �������� ������ ���� � �� �� �
����# ����� �������� ���� �� � � ������������� �� � ��������� ���+� � ��
���� � � �� �� ������� 5���� ��� ������� � ������ �� � ����� � �
�� �� �� �� ���� ����� � ���� � � �� �� ����� � �� �� ����� �� � �� ��
������� ��. �� �� ������ ����� � � � � � � ��� �� !,6" ���� ����
�� ��� � ��� �� ������ �� �+� ��������� � � ���������� � 7 ���
���� �������� ������� ���� ���� ����� �� ������� � � ����� ���
� ��� ������� ������� ��� ����� � �� ����� !���� �"� 8���� �� ���� ��
����� ���� � ����� � ���� ���� ���� !1'9" �� ��� ������ ���
� ������� � � ������� � � �� ������� �������� ��� �� ��� ���
:��� � ������� ����� ���� ���� ����� ����� ��� ���� ���� � ��
� ����; %<:%-<�� � � �� � ���� �� � ,=� ��� ����� �� ���������.� ��
� ����� ������� ���� ����� � ���� � ������ ���� ����� >���� %� :%-� � �
� �� ���� ���� ��� � ��� �� �������� ���� � ��� �� ��� ��� 93?
�� ����� � � ���� � �������� � ����� ����� � � �� ����� �� �������
���� �� ����������� �� ) ������ 7 ��� ������� �� �������� � ���� #
���� ���� ������� ���� �� �� ��� �������
��� ������ �� ��� ����� ��������)���� ���� ����� ��� � ��� ������ � ����� 1�( � � � � � ��� ���#
�� � �� �� ��. � ���� � ��� �� 10@@# ������� ���+� � ) �� �����#
���� � � 9-@ � �������� ���� � &&%# ������� AA���������BB ����� � �� (@ �
�� � !%@"� 4�� � � �+� � �� � � �� ���� ���� � �� � �� �� ����
�� �� ����� �������� �� �� �� ��� ��� �� ��� � ����� �� ��������
�� �� ������ !��� ��� ������ �"�
>��� �������� �� ������� � �� ���� ����� � !���� �"� �� ������ ���
���� ������ �� �� ���+� �� ������� � ����� ������ � ����� � ��
(@#����� �� �� ���� ����� � �C,,,� ��� �� �� � &@ � � �� ��� �� �������
���� � � �������� ��� ��� ����� �� ��� � �����#�� �� ���� !3"� �� ���� �
�� ��� ������ �� � ������� � ��� �� ����������� �������� � �
�� �� � ���� ���� D���� �� �� �����#����� +#���� �� ������� �C,,,
���� � �� ��� �� �� ���� �#����� �� ��� ��������� ������ ������ ��
���56�+( ����(# �� ��
&
�� 4#���� �� � �C,,, �� �� �� � � ����� � �� ��� � � � ����� ����
��������� � �� ����� ���+��
�� �� � �� ������� �� ����� �������� � ����� ������������ �� ��� �
� �� ��� � ����� !-'(" ����� ��� � �C,, � � �,E� ��� � �� �������
����������� ��� ����� ����� � � �� !-- � � -& ������� ���������"� +����
���� �������� �� ���������� � �� ������� �� � �� � F����� ���� ��������
��� � � ������ ���� �� ���� ��� � �,E �� ����� !%%" � � � ������ �������
���� � ��� � ���������� �������� � �� ��� � ���� � � �C,, � � �,E
!%&"� >��� ������� ��� � �� �� �C,,'�,E �� � � � �� ��� � � ����
����� � � ������� �� �����
�� ��� �� � � �� ������� �� ��� � ����� �� ����� ��� � �,,, � � �C,�
���� � ����� �� �� � ���� �� �� ���� �� ����� ��� �� ��� ��#
��� * �C, �� ������ � ���� ���� ���� �,,,� ����� ������� ���� ��� ����� �
Gene expression
ssDNA
dsDNA (RF)
TolAF pilus
Ff bacteriophage
PS
pIII + pVI
pV dimers
pVIII
pVII + pIX
pI/pXI + pIV
Thioredoxin
E.coli
��� �� � #��� ����� �� 7��$���� & �)� �� 8���9�3: ��;������ 4��3��) �� &+++ �� � � ��& ��
� � -<&�� ��3 � �� � � �� ��� &������ ��$&��= ���� �� 3�&���$���>����� �� � � & �)� ����
&������� � ��� 3�&������ �� � � ����&��$�� $�$4���� 8� ��� � �� ��� ������4�� ��� ��<
����>�����:� ��3 ����� �� � � %�� ���� � � ����&��$ � � %�� � ��������3 4� ��
��>�$� �� � 3�4��<����3�3 �-� � � ��$&���� ��� & �)� )��� �=&����� '��)��� %���
�����3 4� &? 3�$�� 8�=��&� ��� � � &����)��) �;���� ���&�� 8'�: � �� &����3� ���$ ���
��3:� � � � &������ �� � � ������ � $���$���� ��$&��= � �� &�� 4�� $�$4����@
��$&��3 �� &+� &A+� &+?� ��3 � � ����&��$�� �� &������ � ����3�=��@$�3���� ���������
�� � � &?B%�� ��$&��= �� ������ ��3 �������� �� ������ ���$ � � ���� � � &����
������� ��$���� �� &? 3�$�� ��3 � ��� ��&����$��� 4� � � 7�� ���� &������ � �� ����������
���3� �� � � ����&��$�� $�$4����
+���6%�.�+6� �6 '!�*( "+6#6*� ��% '!�*( %+�'#��
-
������ � �� ��� ����� ��� ���� � ���������� � �� ���� ��������
!%-"� ��� �� � ������� ��� ���� �� � ������ !%0"� �� ���������� � �C, �
�� ������� �� �� � �� � ��� �C, ���� ���� � �� �� 4#���� �� �� � � ���#
������ � �� ����� ������� � ���� ���� ������ � �� %%&#����� �C, ��� �
����� ����� !%-"�
:�� �� � �� ����� �� 0@1#����� �,,,� �� ���� ����� �� ��� ����
����� �� ������� !���� �"� ,�� +#���� �� ����� � ����� �� ������ ��
���� � �������� �� ����� ����� � � ���� �� ����� AA� ���BB ���� ��
�� � � �� �� �� ��� �� ��� �� � � �� ������� � ����� �����#
������� ��� �,,, ����� � ��� � �� �� �� ��� +#���� �� � ����� !+%
� � +&" �� ����� �� � ����� � �������������� ���� � ����������������
� ������ !%1� %2"� �� ��� ����� � �� ������� �� ��� �� �� ���������
5���� �� ��� ���������.� �� ����� � � ����� #���� ��� �� �� � ��
%-& ������ ����� �� 4#���� �� 4� ����� �� ������ � � ����� �
�� �,,, �� � � ��������� � �� �� ���� ������� � � �� ����� ���� ����
� ������� � � ���� � ���� ��� �� ���* ���� ����� �� ����� �� � �����
����� �� ������� !%-"�
�� �� ��#���� �� ���� � �� �� ��� �� ����� �� ���� �������� ,��
��� ����� �� ����� � �� �� ������� � ��� �� !>$"� ������ � �� � #���� �
,6 ���� � �� � ��� �� >$� � ������ ��� ������ ����� ������ � ��
������� � �� �� �C,,'�,E � � �� ������� � � �� ������ � � ����� � ��
��� � ���������� � �������� ���+� � �� ���� ��������� 4���� ��� � ����
II/X V VII IX VIII III VI I/IX IV
Replication Virion Assembly/export
��� �� � -���$���� & �)� �� 8���9�3: )��� ��3 )��� &��3�� ���� �� ����3� &++�
� �� 4��3 �� � � +* ��)��� 8������3 4������ )��� +? ��3 ++9AC ��� ���: �� 3%�� ��3
$��� � ���� �� � � � ����3� ���������) ��&�������� 4� �� &������ &A � ��;���3 ����� ��
��������� ��� � � ���� �� %�� ���$������ ���� ����3� � � %�� 4��3��) &������
&? ���� �� ��3 �� ����3� ��� $��� &������ ������3 �� � � ��& �� � � ��� � �� � 7�� ��
�$��)� ���$ � � ���� 3���) ��$4�� ���� ��� ����3� � � $���� ���� &������� ��3 ���� ���
��3 � ����3� &+++ ��3 &?+� � �� ��� ������3 �� � � ��3 �� � � ������ ��3 $�3���� ���$�������
�� ��$4��� ������ �� � � ������� ��3 ��������� ���� � ����3� ��� ��;���3 ����&��$��
$�$4���� &������� &+ ��3 &A+� ��3 ���� � ����3� &+?� � $���$���� ���� $�$4����
� ����� � ��) � �� � � & �)� �=�� � � 4������$ ���� � �� � � )���$� � �� ���� ��������
4� � ��� �� � ������ &���������� ��� ��� �������
���56�+( ����(# �� ��
0
����������� � � �C,,� �,E� � � �, !� ����" ��� �� �� ���� �� ���� ���� � >$
�� � ���������* �� �� �� � �� ����� �� �+� �� �� ����� ��� �� �
���� �������� �� � ��� ����� ����� ���� ���� �� � ��� ���� >$�
��� ������������ ���� ���� ����� ���� ��� � ���������.� �� ����� ����� �� �� � � �
�� �� ��� ����� ��� ���� ���� ����� �� ���� �������� �� ���#
����� ��� �� �� � ��� � �� �� � ����� � ���� ���� �� ��#��� �������� ����
���� ����� ��� �� � �� ������� ���� ���� ��� �� ����� � �������� )
���� �� � ) ����� � � ,= ��� + � � > ����� >��� �� � �� ���� ���� ����
���������� ����� ��� �� ������ �� ������ � ��� �* �� ��� �� ��
������� ��� �� ��� ����� � ��� ���� �� �� �� ���� �� � ���� ��
���� �� ������ ��� ���� � �� �� ��� ������ ���� �� 4�4�& � � �������#
� ������ !%3"�
, ���� ������� ��� � �� �� +& ����� � �,,, !���� �" �� �� �� �� ���
� � ����� !%9" !� ���� �"� �� ����� � ����� ��� �� ��� ��� �� � � ) ����
!� �� � � �� ���" � � �� ����� ����� ��. ���� ���� �� ��� �� �� ��� � �
��� �� � � ���� � � �������� ������ �� ������� �� ���� ������������ �
���� �� ��� � � ���� ��� � ����� F����� � ���� � ���� �� ������ ��
����� � ���� ���� ��� ���� !�� ������ �� �� � ����� � ��� � ���"� �����
������� �� ������ � � � ������� ����������� )��������� �� � ) ����
�� �� ������ �� ��� ���������� ��� � � ���� !� � ����� �����
������� " �� ) ������ � ������� �� �� ���� -0 �4�
>��� ������� ������ � � ��������� �� �� ������� � � ����� �������� ���#
������ �� ���� �� �� �� ��� �� �� ���� ���� �� �� ��� ������ 7�� �����
�� �� � �� +&� �� +% ����� �� ����� ��� ��� ����� � ������� ���� +&�
���� � �� �������� �� �� � �� �� ���� ���� ����� � ����� �� �� � �� ��
�������� ��� �� ����������� ����� !&@� &%"� ����� �� � ���� ������
������ �� �� ��� �� � ������� ���� � ����� � � ������ !)#�����" � � �
��#������ !����"� F�� �� ���� � ����� �� ���� ����� � � ��
257–406
Gly2249
Gly1
87–217N-terminal
N1
N2
198
1–68
CT
��� �� � %�$��� ������ �� &+++ ��3 ���� &����
��� 3�&��� � � � ��� 3�$��� �� &+++ ��� ���D
���$ �< �� .<���$��� � � ��� ��� ��3 .�
8.<���$����: 3�$��� ��� ��� �&�����3 4�
)������<��� ������ ��)��� 8*��� ��3 *���:
.� � 4���3 ��� �� � � & �)� &������� ��3 �
��;���3 ��� ������ ��$4�� � ��� &������ ��
� �� 3�&��� ���� ��� ��$$���� ������3 ���
��3�����3 84�=�3:C �$4�� ����� �� ���3� �� � �
$���� &������ �;���� ���� � �� ���� ��
&������ �/1 8�����&��3��) �� � ����������
��!+ ���������� ���: ����� �� �&����3
������� ���3� �� � � �� 3�$��� 8.���: � �� ���
��������� ��� 3�&��� 8�E:
+���6%�.�+6� �6 '!�*( "+6#6*� ��% '!�*( %+�'#��
(
� ����� � ����������� ���� �� �� � �� � ��� ��� ����� � !G � 8� � � �"� ���
� ����� ����������� ����� ����� �� �� ��������� ������ �� ���� � �#
��� !&&� &-"� ��� ����� ��������.���� � �� ���� ���� ����� � � �� ��
����������� ����� � � �� ��� �������� � �� ����� ���+� � �� �� �����#
��� ���������� �������� �� �������� ������ � ��� ���� �� ����������� ����
�� � ����� ��
��� �����������7�� ��� � �� ����� �� ��#���� �� ���� �+� !��� ���� �� ����� ��� ��
��� �������� �� �� �8+�"� ���� 8+� � � �+� ��������� � � �����������
�� ��� �� �� � �����#���� ��� ����#����� ������ ����� 8�������� )���
!8)* � ���� �"� �� 8) ���� �� ������ �� ���� � ������� � � � ����
������� �� ����������� �� ����� � �,,� � ���#������ ���� �'����� �
.����� ������ �� ����� ��������� � ������� � ����� � ����� ���� #
���� �,, ���� ��� ���� � � �� 8) �� � ������ ��� � �� � #���� � ,6 ����
� �� ���� � ��� � � �� -� � � �� ��� �� �� ���� �� ���� �+�
�������� ,,, ��� � ��� ���� � �� ������� �� ����� ��� ���� � �� ��������
�� 8� ������ �� �� �� ���� � �� �� ����.�� � � �� � ��� � � ������#
��� �� ������� �� ��������� ���� � �� ����������.� �� �� ���� �'����� �
�������� � �,, � � ���� �� ���� �� 8)� $� ����� � ��� ���� � ������ �
8+� ������ �� ����� �� � ���� �� 8+� ��������� ����� � ������ �� ��#
��� �� � � ����� ��� � �� ,6 ���� � ��� ���� � �� ����� � � ��� �� �� �
������ � ���� � ���� �������#��� �-( � � �%@ ����� ������� �� � �� ��#
���� �� ���� !&0"�
���� � �� ���� ���� � � ���� � �� �� �� � ������ � �� ����
���+�#�� �� � ����� !�C" �� ���� ��� �� ����.� �� �� ���� �� ��
��������� �� ���� �� 8)� � � ���� 8) � � ���� ����� � � ����
��� ������� �� ��� �� � ������ � ������ �C �� �� ����������� �� ���
pIII
N1
N2
F pilus F pilusTolA
N1
N2
��� �� � +�������� �� �� ���� 4� -�
4�������& �)� +�������� � ��������3 4�
����������� �� � � �� 3�$��� �� &+++ ��� ��
- &�� &��������) ���$ �� �� ���� ���� � �
����������� ������ � � �� 3�$��� ���$ ��
�����$������� ����������� ��� ���
�������) �� �� 4��3 �� � 3������ 3�$���
8%�: �� � � 4�������� ���� &������
�4�;��� ��& ��� ��� ���
� ��������>�3 � � 4�������� ����
$�$4���� � �$����3 ���$ � � 3��)��$ ���
�������@�� � ��� ��� ����� �� ��������)
& �)� &������� &�������� � � $�$4����
���56�+( ����(# �� ��
1
� ����� ���� �� !���� �"� ��� �� � �������� ����� � � ������ �
���� �� ����� �� 8)� �� ������ ����� �E� ����� �� �� ����� �� ��
�������#���� �� %%% ������ � �,,� �� ������ �� �� ����� �����������
� �� �� ���� �� �� ���� ����� ��� �� ���� ��� �� ����� �� ���� �� ��
� �� !&("� �C �� ������� ���� �� � ������� ����� � �� ���� ��� �������
�� �+�#�� �� � ������ ���� ��� �� �� �� �� ����#��#���� ���� �� � �
�� ����� �������� �� �������� �� �� ���� � � �� � ���#��� ��������� �� �+�
�� ��� �� � �� ������� ���� �� >$ ������ �������� � ��� � �� ��#
������� ����� �C �� � ���+� � �� ������ �� �C<���+� ������ �� ��
�������� �� ���� ��������
��� ����� �� ���� ������������ � 10@@ ������� ) � �� �� ��� � � ������ ����� � � !���� �"�
� � � �� �� � #���� � ���� !�� ,6" ����� �� ��� � �� ��������� ����� �
��� � �� ���� � �� ����� � � �� >$� ��� � �� ���� � � !, � � ,," ���
� �� �� ��� ������ �� � ������� ���� ��� ����� � #��� ������ ����� � ��
�������� , ��� ���� ���� �� ���#� ��� � � �� ������ ����� !����
��� � �� �� ����� �� �� ������� ���� �� ����� � �� ���#� ��� ����� "
�� ������ �� �������� ���� ��������� � H �� %% ����# ���� ����� ��
��� !�,,� �E� �C" �� ������ �� � ��� ���+�� ��� !�,� �E,� �,C" �� ������
�� ���� �������� � � �� !�,,,� �C,� �C,,� �C,,,� �,E" �� ����� �� � ��
���� ������� !���� �"�
��� ���� ����� � �� �� ����.� ������� ������ �������� ����� ���#
� ���� ��� ���� ��� �� ������� �� � ���������� ���� ��� �� ��� ��
� ������� � � ������� �� �� � ��� ��� ��� �� ������������� � ��� ���#
�� � � ���� ���� ��� �� �� �� ��� � � � � , ������ ��� ��� �������� �
� � �� ���� ���� � � ��� ��� ��� ���� � ����� ��� ��� � ��� ������ �
�� �� ���� � � �� �������� �������� � ��� ������� ��� �������
����� � -<&���7� 7��$���� & �)� )���9&������ ��3 &��&�����
��� ������ �� � !��" � ���� #������ $��� ��� �������%
+ + �01 ��$4�� +���� $�$4����� � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � �
A+ ��1 ��$4�� +���� $�$4����� � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � �
++ ++ 0�/ ��&�������� 8������: .���&��$� � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � �
A ��� ��&�������� .���&��$� � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � �
+++ +++ 0�2� ?����� ��$&����� ?����� ��& 8��3: �� 8�<���$:� � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � �
+? +? 0�E� ��$4�� 8�=�� � �����: 6��� $�$4����� � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � �
? ? 1F ��&�������� 8%�� 4&: .���&��$� � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � �
?+ ?+ ��� ?����� ��$&����� ?����� ��& 8��3: �� 8.<���$:� � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � �
?++ ?++ �� ?����� ��$&����� ?����� ��& 8����: �� 8�<���$:� � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � �
?+++ ?+++ E�I ?����� ��$&����� ?����� 7��$��� �� 8�< ��3 .<���$:� � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � �
+A +A �� ?����� ��$&����� ?����� ��& 8����: �� 8�<���$:
� ����� &������ ��� �� �)��� �;����
+���6%�.�+6� �6 '!�*( "+6#6*� ��% '!�*( %+�'#��
2
�������� !��� �� � �� ��� ���� �����" � � ������� 8+� ������� � � ��
� ���� �� ��� �� � � 8+�� �� �� � � ������ �� �� ���� ����� !&1"� ����
������ � ���� ���� � �C � � �C,,,� �� ����� � ���� �� ������ � �� ������
��� ������
�� ���� ���� ��� � ���� � �� ���� � ���� ����� � � �+� �� �����
���� �� ���� ������ �� �� ���� �� � ������ � �C ������� ��� ���� ��
� � ��� �� ���� �� ����� �� 8)� �� ������ �� � ������� � , �����#
�� � ���� �C �� �� �� � ������� �������� � �� � ,, � � � E �8+�� !&2"�
������ � ���� ��� ������ � � � �� ������� � �,, ���� ���� �� ���� ����
�� ���� � �� ����� !&(� &3"� �� ��� ���� �� ����� ����� � �����#���� ��� �
���� �������� �� ��� ��� � �� �� ������ � ���� � ���� � � �� ��
�� �� �� ������ � � ������� � �� � ��� ����� � � ���� ��������� �� #
�� �� �� � �� �� ����
��� ���������� �� ����� ����� ���� � ��� ����� � ���� ���� ���� ������� �� ���� �� �� � ������� �������
������� ������ � �� ����������� ����� � � � ��� � ����� �� �����
��� �� ��� �� ��� ������� ��� ���� � �� ����# ���� ����� � ���� ��
������� � ����� � ������� �� � ����� ����� ����� � !���� �"� ����
� ����� ��� � #����� ����� ���, � � ��� ������ ���� �� �E,� � �� ����#
������� ����� � � �,C � �� ���� ����� �� � �� �� ����� ����
����� �� ����� ���� � �� ����������� ����� ����� �� ���� � ����������
� �� ����� ��� !�,,, � � �C,,," �� �� ����.� �� ��������� � �� ��� ��� ��
��� � ������� ��� �� ����� ���� ���� 4#���� � � �� ����������
�� ��� ����� � �� ���� ���� ����� � �� �� � �� ���� ����� ��� �C, ��
������������ ����������� !(2? � ��� ������ �� �����������" � � ����� ���
�� ����� ��� ��� � ��
�� ���� ���� � ���� �������� ����� � �� ������ ���� ��� � �����
%@ �� ��� � ���� !�� -2 �4"� ���� ����� � ���� ��� ������ ��
����� 0@ �� � ��� ����� �� ��� ����� �� ��� ����� %@@@ ���� �� ���
�� ������� � �� ���� ����� 7 �� ������� �� ����� �� �� � ��� ���� ��
�� �� � �� ���� � � ������� � ������ ������ �� ����� >����� � � �#
��� �� ������� ����� �� �� ������ ����� � � � �� ����� �� �� ���� �� ��
����� ��� �� ��� !�� ������� � � ������ " �� � ��� ���� ����� ����
���� �� ������ � � ���#����������� � �� � #����� ����� � �� ��� ��
�� �� �C<�,, ��������� ���� � � �� ������� ������ � ��� �� �� �� ���
������ � � ������� � �� �� �� �� ������ � ����#������� � ���� !�� � ���
��� ���� ��� ���� ��� � � ��� �������" ����� �� �� �� ��������� � )
������� /� �� ������ �� ���� ����� ��� ������� �� � ��� ���� ��
�� � ������ ���� ������ �� ��� �� � ������ � ��� ����� � �� ��#
��� � � ���� �������� )�� ������ ���� ��� ) ���� ��� ���� ������ ��
-9 �4 !� � ��� ����� ������ �� 0& �4" ����� �� � ��� ��� ��������#� ��#
������ � �C ������ � ����� ����������� � ���+� � � ���� � ���� ��� �
���� ��������� � D� ����� ���������� � � �� ���� �� ���� �� ��� ��
�� � ���� ���� � � ��� ����� >��� � �� ����� ������� �� �+� ��� �
���56�+( ����(# �� ��
3
��� � �� ��� ��� �� ������ � �<�� ����� ������* ���� ��� � �� �� ��
������ � ����� �� �� � ����� �����.���� � �� �� ������� �� �� �� ����
����� � � ���� ���������
��! "�� ��������� �� ����� ����� ��>��� ������� �� � ������ � �� �� �����; ��� ������� � � ������� � �� ��#
��� � ������ ���� � � � ���� ���� � >�� ������� �� �� � �� �� �������
� � ������� ���� � ���� ������ �� ����� ���������� ��� �� ����#
������� � � ���� ����� � �� � ���� �� ���� !&9"� ������� ���� ��
������� � �� ��� ������� ��� ����� �� �,� �E,� � � �,C� ����� � �����
��� ���� ���������� ����� � !+#���� �� �� �,C � � 4#���� �� �� �, � ��
���������� �E,"* �� ���� ��� � �� � ��� � � � ���� ���� ����� ��
�,C �� � ���� ������ �������� ���� � � ���� ������ ����� 3 � � ������* �� ��
������� � %&'%0 �� ����� ���� ��� ���� � ����� � ���� � ����� 1@@ ���
!-@"� , �� ����#D: �������� � �,C !:8 � ���� � �������� ����"� ��� �� ���
� ���� ����� �� ������� ����� ��������� ����� � ��� �� ����� ���� �
�� �,C ��� � �� ������ 4���� ���� � ���� � �,C� ������ �� ��� ���
� � ����� ��� � ���� ������ �� � �� �� �������� �������� !-%� -&"� >���
���� ���� �,,, � � �� ���� � ��� �� � ����� ��� �� ��� ����� ���� ����
� ������ � ���� ���� �� ���� ������� �� �,C ��� � !--"� +���� � �� � ��
����� �� � ����� � �� �,C ��� �� ���� ���� �� �� ���������� ����#
������ �C,,, ��� ,= !-0"� �� ��� �� � ������� �� �C,,, ���� �� ������ � � ����
+#���� �� �� ��� �� �C,,, � ������ ���������� ���� ����� !1'3 �����" +#
���� �� �� ��� �� �� � ���� ������� !-(� -1"� �� ��� ��� � � �<�� ���#
����� � �� ��� � ��� � � ����� ������ � �� ��. � ���������� ���� ��
� �������� � �C,,,�
�, � � �E, ���� ��� � ��������� ������ ������� � ����� ('1 ����� �
���* ��� ���� � � ��� ��� � �� �� � �� ! J� +� ) �� >� :��� � � :�8��
� �������� ����"� , �� ��� � � �� ���� ���� ����� �� �,<�E, �����
����� �������.���� � ����� ������� ���� �� ������ ��� ���� � �
��� �� ���� �� ������� ��� ��� � � ������ ���� ��� � ���� �������
���� �������� ����� �� �� ����������� +#���� �� ����� � �, !��� �
��� �E," �� ��� � � �� ���� �������#�� �� � ����* �� � ���� ���� ��
�� ���� �� ���� ������� !-2"� � � ���� ������� ������ ��> ����������
!-3"� �, �� ����� �� � � ��>���
, ������� ���� ���� � �� � �� ������� ���� �� ��� �� �� ���� ����� �
!�C,, � � �,E" ������ �� �� ��� � � ��� � �� �������� � � �� ���+� ���#
����� �� ��� � !-2"� 6 ��� � ����� ������ ���� �C,, � � �,E !� �� ��#
��� " � ����� ���� �� >$� ����� �������� ��� � � � �� �C'���+�
������ !� �� ���������"� � � ���� �� >$ ��������� ���� �� �����������
����� � �,� F���# ���� ��������� � � ������ ����������� ����� � ��
�� � ��� � ������ � � ����� ��������� ���� � ������ ���� �,� �������� ����
������� ��� �� �����. ���� ���� ��������� ��������� ������ �� � ���� � ��
� ������� ������� � � ��� �� � ����������� �� �� �� ����� ������ �
+���6%�.�+6� �6 '!�*( "+6#6*� ��% '!�*( %+�'#��
9
D�� ����� � ����� �� �������� ������ � � �C ����� ���� ���� ��
����� �+� �� ����� #����� �C,,, � � ��� �������� � �� �+� ������ ��
����� � �� ������ �� �� �� � ��� �� � � �� ����� �+� ��� � �����
�� �C,,,� , ���� �,,, �� �C, �� ��� �� �� ������ ����������� ���� �������
���� � ����� �� �� ����������� ����� ��� �� ���� � ����� �
�� ���� �� ����� �� � ���� �C'���+� ������ ��� �� �������
���* ���������� ����� ���� ���� �� � ��� ��� %@ ���� � �� � ���
��������� !-9"� D� � ����� � ���� � �� �,,, � � �C, �� ��� ��
����� (? � ���� � ���� �������� �� ����� � ���� $��� ��� ���� ��� ��
� �� ����� �� �� ����� �� ������� ����+� ������� � >$ �� � ��� ���
� ��������� !0@"�
>����� ���� !%-" �� �� � ���������� � �� ����� #����� �,,,'�C,
������ �� �� ���� �� � � �� ��� � ���� �������� � ���� � �� ��� #
� � � �� �� 4#���� �� 3- ������ � �,,, �� ����� � �� ����� ���� ���� ���
�� �� �� ������ � � �� ���� ��� �� ���� ���� ���� �� ���� �
�� ����� ����� ������ � 9- ����� 4#���� �� ��� � � �,,,� ��� �
������� �� �� ���� � � �� ������� �� ��� � � �� �,,,'�C, ������ ����
������ �� ������ !� � �� ����" ��� �� ����������� ����� !%-"�
� ����� �� �� ������ � �,,, !�� %-& 4#���� �� ������" �� ������ �� ��
������� � ����� ����� ���������
� ���� ������� ��� ��� ���������� �� ������ ����� � ��� � ��� �� ������� ����� � �� ������� �� ����� �
���� !���� �"� H ����� ��� ������� �� ���� � � ������ ���� �� �� ��
��� � ���� � � ���� �C,, � � �,E� ����� �� ������ �� AA�����BB � � �� �����
��� !%&"� �� �C, ����� � ����� � ������ ���� �,,, �� �� AA �BB ����� ���� ��� ����
� ��� �� ������� ���������� ������� � �������#���� �� ���� �� ���
�� ��� �� � �� ��� �� ������� ���� ���� � � ���� ��� ����� ! !0%"* �
4����� %&"� 4#���� �� �� ��� �� ������������ ������� �� ������� � ����#
������ ���� �� ��+� ���� ��� �� � �� � ������ � �� ���� ����
�� �� � � �� ��+� ���� �� ��� � �������� F �� �C, ������� ��� �����
���� �� �� ������� ��� � � � ����� '����� � �������� ��� ��+�
��������� �� ������� � 4����� %&� F����� �� �� �� ���� ����� �� ���
����� ����� � �� ���� ������� �� �C,,, � � �,,,�
��� �#����C,,,� �� �� �� ���� ����� � �� ��� � � ����� ������ � ����� � ����
��������� $�� �� �� ������� �� ��������� � ���� �� �� +#���� ��� ���
�� ��� �� ��� � � � �� ��� � � � �� ����� ����� ���� � ��� ��
F����� � �� ����� ������ ��� �� !1'3 ������" �� � �������� � ���
���� � �C,,, � � ����� ������ ��.� ��� � ������� � � �� ��������� ����#
���� ����� � �� ��. ��������� � � �� �,C ��� � ������� ����� ���� ����
���� � ������� !� $���� &�2"� ������� � ����� ���������� � �C,,,
���56�+( ����(# �� ��
%@
������ ������� � �� ���� ����� ��� � ������� ������ ����� �
������ ����� � ���� � ��� �� ����#��� �C,,, !� $���� 0�&"�
� ���� � �� � !�� �C,,, ������� ��� ��� ������ ��� � �����" �� ��
�� � ����� �� �� � �� ����� �� ����� �� ����� �������������;
�� �� �C,,, ����� � ��� � ������� ���� ����� �� ������� �
���� ���������� �� ���� ���� ���� !0&"� �� �� ������� � ����� � ���
�� �� 4#���� �� � �� ����� !0-"�
��� �����,,,� ��� � � �� ����� �� �� AA �BB ��� � �� ����� � �� �� ����� � �����
�� ���� ���� ������� ���� � �� �� ��� ����� � �� ���� � ����� �� ��� ���#
���������� ���� �� ���� � ������� !� $���� 0�-"� � � �� ��� ������������ �
������� ������� �������� �,,, �� ��� ����� � ��� �C,,, �� ������ ���� � ��#
��� �� � ������� � �� ������ � ���� �� � ������ ������� �������������
�� ���� �C,,,� ���� �� � ������ �� ��� � ������� �� �������� ������ � �
�� ��������� � ������ ����� � ���� ���� ��� ����#��� �,,, !� $���� 0�&"�
$� � ���� ����� � � �� �� ��� � �� � ������� � �� �,,, ���� ����� �
����� � �� � ���� � ��� �� ��� ���� �,,,� ���� � ���� �� �������� � ��
����� � �� � !���� �"� ��� �� �� � ��� ��� � �������� �� ����� � ��
���� ��� � ���������� � �� ���� ����� � �� ��� �� ����� � �� ��. � ��
������� ������ >�� ���� ������� ���� � ���� �� ����������� � ���������
�� ��� � ����� �� �� �������� ����� � )���� � ��� � ������ �� �,,,
����� %93 !00"� ����� ���� �� +% ����� � � ��� � +&� �� �� ����� &09
!0("� ����� ���� +% � � +& � � ��� �� �������� ����� �� � ����� ������
� �� ��� � ����� #���� �� ��� 4#���� �� �,,, ������� ������� ���� �� �
�� �� �� �� 4#���� �� � �� �,,, �� ���� ������� !01"�
� ������� � ����� ������� ���&������ $���� ����� �� �������� ���� ��� � � ���� ������� ��� �� �� ��������� � ���� ������� � �� ����#
����� � � ���� �� ������ , �� ���� ���� � ���� �������� ��� ��
������ ���� �� ��������� � � ����� ������� � � � ���� ����� �������
������� �� ����� ������ � � ����� �� � � �������� ���� � �� ����� �
���� �� ������� ����������� ����� � �������� �� � ������� � ����� ���#
��� � �� ���� ����� � �� �� �����.� � ���� � � � �� �������� ���#
������ K��� �� �� � ��� ����� ���� � � � ���������� � � �����������
����� � � � ��� �� � � ��.� � � ��������� ��� � � ���� ���� ��������
!� ���� �"� �������� ��� ����� � ��� � ��������� � �� ������� �� �� � ��#
������ �������� !���� �� �������� �� � ����� �� � ��� � ���� ���� ������#
��� "� ��. ��� ��� �� ����� �� � � �� �� ������ � � ������� � ���� ����� �
������ � ������
)�� ����� � ���� �� ������� � ����������� �������� � �� � ��� �� ��� ��
����� �� ���� �������� � �� ��������� ������ ������� � .� �
+���6%�.�+6� �6 '!�*( "+6#6*� ��% '!�*( %+�'#��
%%
���� � ��������� � ���� �������� � .� � � �� ����� � !� 4����� 9"� )��
����� � ���� �� ����� ������� ���� �� )=K>%&� ������ � �� � ��#
���� � �� ��� � � ������������� !���" !�� ����� ���� �������� ��
������� $���� (�&" �� ��� ��� � ����� � ���� � � !��4�� � ��������
����"� , ������� �������� ����� � �� � � ����� ����� �� ������ ��
������ � �� �������� �� � ����� �� ������ �� �������� !13"�
,� ��� ���� ����� ����� �� ������� �����#���� �� ����� �� �� � ������ �
������ !���� �"� )�� ���������� ���� �� � ������ )�� ���� ��� � ����
����� � (=�$&�� �� &������ 3�&����3 �� 7��$���� & �)��
������ ��������� '���� ���
(����� !)*�"
������ +�������
�������� ������
G<3�$��� 8'������ �: 2 E &+++ 80F:� � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � �
����3 ���&�� �� �4���� 8��+<�: F &+++ 801:� � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � �
.E� 1 &+++ 8-�B5�: 80/� E�:� � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � �
+����<���� )���� ������ 8+*-:<� �0 E &+++ 8E�:� � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � �
#�&������ �F E &+++ 8E�:� � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � �
*! �� &+++� &?+++�&?+++ 8.<���$����:
80�B00:
� � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � �
���&�� �0 &+++� &?+++ 8E�:� � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � �
����4�3� �-� ���)$��� �E &+++� &?+++ 48E0:� � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � �
�4������ �1 &+++� &?+++ 8EE� E2:� � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � �
+����<���� )���� ������4��3��) &������ 8+*-"':<�
�� &+++ 8EF:
� � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � �
'�&��3�B��$B�!. ��$&��= 0� &+++ 8E1:� � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � �
?����� ��3�� ����� )���� ������ 8?(*-:
���� E &+++ 8E/:
� � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � �
����4�3� -�4 ���)$��� ���E &+++� &?+++ 82�:� � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � �
�������� & �& ���� ��2� &+++ 82�:� � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � �
����&����3�� 0��E &?+++ 80�:� � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � �
��� ������ � ������
,, 3�$��� 0 &+++ 82�:� � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � �
��� !�$���)� � 8�!�: 3�$��� 2 E &+++ 82�:� � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � �
-��'9$�6� -�" 3�$��� / E &+++ �
� � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � �
G���21 >��� 7�)�� �� &+++ 320� � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � �
.���� ��$� 4E2� �� &+++ 82E:� � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � �
-HE�2 4��3��) &������ 8-H"':�� �� &+++� �F 3�&��� �822:� � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � �
*���� ���� �<��������� 8*��: ���E E &+++ 82F:
� � � ��4�� � �����3�3 �� ��3����� � � ���)� �� &������ � �� ��� 4� 3�&����3� 4� � ���� �� ��$&���� ���
�= ����� �33������� �=�$&�� ��� 4� ���3 �� 8�: 4 ��� . �&��� �� ��� �33������� ��������� � � .������� �&4�� �3 3��� 3 ��� . �&��� / ��� �33������� ���������
���56�+( ����(# �� ��
%&
�� � �������� � � � ���� ������� �� � ������ ����� ������� � �� ��
�������� !1@"� F���#��������� ����� � �� ���� � �������� �� ���� � �
���������� � �� �������� ���� ����� �� ���� ����� � ������ ����� � ��
�� � ���� � � ������� � ��� �������� ����� �� ���� � ��# �� � ���#����
!��� � 1%"�
��� ����� �� ������� %�����&>���� � �� � �������� ��� � ������ ���� � �� ������ ) ���� ��� ��
���� ��������� ��� � �������#���� AA�������BB ������ ���� �� ��� � �� ��
���� ����� � � � � � ���� ���� � � !�� � ����� � -"� �� ���
���� ����� �� ���������� � ���� � �� ������� � �,,,� �������� ������� ��� #
����� ����� �� ������� � ���� ����� �� , ���� ������� �� ����������
��� � �� ������� �� � ���� ������� � �� �� ���� � ��� � �� �,,, ��
E. coli E. coli
Polyvalentphage
Monovalent phage
Ff ori Ff ori
pBR322 ori
Antibiotic resistance gene–optional
Phage vector
Phagemid vector
Antibiotic resistance gene
Add helper phage
Gene III Gene IIISig. Sig.
Displayed sequence
Displayed sequence
(DefectiveFf ori)
TAG
��� �� , *������ � �$� ��� & �)� 3�&��� ��) & �)� �� & �)�$�3 ������ � � 3���������
4������ & �)� ��3 & �)�$�3 ������ � ��������3 ��� &+++ 3�&��� ��;���� ��� 3�&��� ���
������3 4������ � �������� �)��� �;���� 8II�) JJ: ��3 )��� +++ "�� & �)� ��3 & �)�$�3
������ ����� �� -� ���)�� �� ��&�������� �� &��$�� &��3����� �� %�� ��3 ���� ������
' �)�$�3 ������ ��� ��� � &��$�3 ���)�� 8 ��� &"����: ��3 �� ����4����� ��������
$����� �� ����� &��&�)����� � &��$�3 �� �� ���� ' �)� ������ ��� ��� ����� $�3�7�3 ���
����4����� �������� $����� ��� ������������ � ��������3 ��� +� $��� & �)�$�3 �������
�� �$4�� ��& ��3�� 8��*: � �����&��3 4������ � � 3�&����3 �;���� ��3 )��� +++� ��
����� ��4�� &������ �=&����� 4� ����������) � � ������ ���� � ���<��� &&���� �����
+���6%�.�+6� �6 '!�*( "+6#6*� ��% '!�*( %+�'#��
%-
� ���� ���� ����� � /� � ������� � �� � ����� ���� ���� � ������� �
����� ��� ����� � �� ���� ����� ������� �� ���������� ����� !��� ��
����� �� �������� ������� ���"� D������ � �,,, ���� ������� ������ � ����
�� 7$D ������ �� ������� �� $���� � � �������� !19"� � � �� :%-=D
������ ����������� �������� ��� +� D ��� � K������ !� $���� 3"�
, ������� ������� �� �������� ����� ���� � �� ��� � � �� � �����
������� � �� �� �� ���� � � ��� �������� , ������� �� � ������� ����� �
��������� � �� ����� ���� ��� � ) ����� �� ����� ��������� � �� ��#���� ��
����� � � ������ � ���������� � �� ���� ��������� �� ������ ���� ���#
������ � ���� ���� ������� � �� ������� �� � ��� ���� ���� ����� ����� ��
� ) ���� ���� � ���������� ����� ���� ���� �� ��� � ��� � ������� � !�
$���� 0�0"� �� � ��� ���� ����� ��� �� ����#��� ���� ����� � ��� ��
���� ���� � ��� �� ��� �� � ����� ���� � � �� ���� ����� ���� ��
�� �������� �� ���� ���� �������� �� ������ �� �� ���� ���� �� ��� ����
����� �� ������� ���� �� ����#��� � �� ������� ����� K���� �� ����
���� � �� �� ������ �������� ���� ��� �� ���� �������� �� ��� ��
������� � ��� ������ � �� �� ��� ��� �� �������� ����� � �
��� � �
>������ ������ ��� � ������� �� ���� �,,, � � �C,,, �������� ��������
�,,, �� ��� ����� � �,,, ������� ������ �� ������� � ��� ����� �
4����� 0� � �� �� ���� ��� � ������� ������ �� ���� ������ ��. � �
�� � ��� � �� ������� �� �� ��������� � ��� � � � ���� ������ �������
�������� � �� ������ �������� � �������� � � �� ��������� � � ��#
�� ������ ���� � ����� ��� ����� � �� ���� ����� ������� ��.� �� �������
������� , ������� � �� ������� �������� ���� � ��� � �� ���� � �������
�� ����� � ���� �� ����� ������ ���� � ��� �� �� � �� ��� !� $����
0�-"� )�� �C,,, �������� �� � �������� �� � ����� ������ �� ����� ������� �
��� �� �� �� ��� 1'3 ��� � ������ >������� ��� ���� � ��� �� �C,
������� !� 4����� %&"�
��� ����%����� �� ����%����� ������&�� ����� � ������� � �� �� ���� � ������� �� ����� �� �� ����� � �����
���� 4� � ��� �� ���� ������ ���� ������ ���� �������� ���� � �����
������ ������� � ������� � ��� ��� �� �� ��� ���������� � �� ��������
����� �� , ������� � ������� ������ �� �C,,, �������� � ����� � �� � ������
� �� � &2@@ ����� �� ���� ����� �� ���� ��������� ����� ������� ������� ����
H �� ���� �� �� �� � ������� ������ �� ������� ����� � �,,, � �� ��
�� ���� � � ��� !�� � � ����" ������� ���� ��������� ��� �� ���� �� ����
�� �� AA�� ���� � �������BB !-� 00"�
,� �� ������� � �� � ����� � �� ���� � �� ���� � �������� � �������
��������� � ���� �������� ������ ��� � ���� ������� � � �,,, �������
������� ����� � � � ��� ���� ���� ���� ���� ������ � >����� �����������
� ���� ����� ������� ; %@? �� ��� � �� �������� ���� ������� � ���� �
�� ���� * � ��� ����� ��� ��� ���� ������� ��� �����* � � �� ���� � �
���56�+( ����(# �� ��
%0
�� ����� � �� �������� ���� �������� �� ����#��� �,,,� ����� �� �� �� �������� �
����� �� �� ���� �� ��� ���� �������� �� �� ������� �� ����
�� ��� �� � ������� �� ������� � ��� ������� ����� � ��� ������ � ��
������� �� �������� �� �� ��� � ���� � �� ���� !� 4����� 0� $���� &�%"�
D���� ���� !00" ����� ���� ������� � ������� ��� �� �� ������#�� ���
��� � � � ������ ��� �� � �� ����� ����� �������� �� �� ��� �
���� ����� � �� ��� !�������" � ���#�� �� � ��� �� :� ���� � �������
������ ������ ���� � ��� �� ���� � � �� ����� � ����� �����
�� �� �� � ������ ��� �� ��� �� �� �� ��� �� ������� �� �� � ����� �!�"
��� � �������� 4� ������ � ���������� � ��� �� � ����� ����� �� �� � ���
��� �� ������ ������ �� � ���� ������ � ������ ���� �� � � ���
������������� �� � ����� �� ��� �� � ������� � ��� � � ����� �� �� �
��� �� � ��� � ����� ��� ������� � ���� ��� ��� �� �� ����� ����
������� � �������� � � �� ��� �� �� ���� � ������� �� �� �� ��� �
�� �������� ��������� ������ !� 4����� 1"�
��� '����� ������ ���� � ��� � ���� ���� �� ������� ��������� ��� � ���#
��� � � �� ����������� ��������� � ����� � 80@3 !2@" !$������ "� :%- =@2
!2%" !+� D ��� � K������� ������� >�������� K�����"� � � C4$:%- !$�����#
� "� , � ���� ��� �� � ��� � ����� ������ ��� ��� ������� � ����
���� ������� � ��� �� !�� ��� ������� � ��� �� ��� ������
�������"� � � ������� � ���� ����� ��������� � ���� � ������� ������� �
�������� ���� ) ����� � � ��������� !AA� ��� �#������ �BB"� :%- =@2 � �
��� �������� C4$:%- ����� � �� ����� ������ � � �� ����� � ��������
������ � ����#� ��� ����� � ������� �� ������ � � ���� ����
����� ������ � ���� � ��������� ����� �� ������� � 4����� &� �������� ��
��� ������� ��������� ��� ����� ����������� ��(����������:��� ���� ������� ��� ��� � ���� �� ����� �������� � ������ � ������ �
���� �� ������� �������� ��� � ��� ������� !���������� "� � � ����� �
���� ������ �� ����� �� �� � ������ � � ������ ��������� )�� ����
������ !� � ���� ����"� ����� � � �� �� � ������ � ����� ��������
� ����� ��� �� � ���� ������ � � ��� � ���� �������� � � ��� �������
�� ���������� � � ����� � � ���� ������ �� ������� � �������� �� ,� �� ����#
���� �� ����� ���� ������� �� ����� �������� �� �� ��������� � ����
������ ������� � ���� �� ��� ���� ���� ������ � ����� ���� �� ����� ��
)�� ������� ������� �������� � �������� � ����� � ���� � ������� � �
��� �� � � ������ � � ��������#������ � ���� ��� � ����� ������� �� �����#
��� � ������� �������� �� ��� � 4����� 0� �������� �� � � � ������� ��
������� ���������� �� ��� � 4����� 0� �������� ��
� �� � � � ���� ���� �� ����� �� � ������� � ���� �� �������
��������� � �� �������� � �� � ������ � �� ������� �� �� ��� ����
+���6%�.�+6� �6 '!�*( "+6#6*� ��% '!�*( %+�'#��
%(
����� � �� �� � �� ��. � ���� ��������� ����� � ��� �� �� � ��
��. � �� � �� !� $���� &�&"� , � ���� �� � ���� ���� ���� ��
C4$:%-� % H�&2@� (� %@%& ��������<��� � � �� � ( �� �������� % H�&2@�%�%� %@%- ��������<��� F����� ���������� � ���� � ������� � ��� ���#
������ �� �� � ������ � ������ � ���� ���������
�������� �
������� �� ���������� ���- �.� ������ �������� �������
/- ����� �� �������
� >��� ����� ������� �� � ����� !��� � ���������� ���� ������ �� C4$:%-���� ���� !$������ " "
� &L� ���� !%@ � �����#���� ������� %1 ������#������ � ( � +�4�* ��� ���� �� % M��F 2�@ ���� +�HF* �������� � � ����"
� &L� <�� ���� !&L�� %( ��<�� ��������� "
� � ���� EM%#K�� ����� !$������ * ��8"
� M����'K��� � !MK" ���� ����� !( � �����#���� ������� %@ � �����#������ � %@ �+�4�* ��� ���� �� % M� �F 2�@ ���� +�HF�
%( � ����* �������� � � ���� �� (( �4*���� � �� ���� �����"
� &L� ��� ���� !%1 � �����#������ * %@ ������#���� ������* ( � +�4�* 2�( � ����*��� ���� �� % M� F�� �� ������� �� ����� � ���������"
� $���� %@ �� ������ ����
� $���� >����� ������ !�� ���������� "
� :�������
� 0( �4 � ������� �� ���� ���� !����� ��"
'�����
01 �������� �� ���- � � ���������
� , �� MK ���� ����� �� ����� �� 0 �4� ������ ��� �� ���� ���������
, ���� ��� �� ��� ���� � ����� �� ����� ��� �� ��� ��� ���� ���� ���� �
�����
� >��� � �� �� ���� � � EM%#K�� ���� � �� ('&( �� � &L�<�� ����� � �
� ����� �� ������ �� -2 �4 ���� ����� � �� ������� �� � � ���� � �����
% H�((@�
� >���� %@#��� ����� ������� � � �� ���� ����� � �������� � @�% �� �������� �
&L� ���� �� ���� ������� �� � ������ � � %@-'%@( ����<�M��
� :�� �� &L� ��� ���� !�� ���� - �� �� ���� ������� " �� ��������� �� � � ���� ��
0( �4� �� ����� � � ���� ���� �� � ��������
� )�� ��� ���� ������� � ��� @�@% �� � ���� ���� @�( �� � ��� EM%#K�� ���� �
� %@ �� ������ ����
���56�+( ����(# �� ��
%1
�������� � �������3
� �� ��� ���� ��� - �� � ��� ����� ����� � �� ��� ������� �� ����
� ,�������� ���� �� ��� ���� ������ � �� �� ����� � � MK ���� �����
������ � �� ���� �� ����� �� ��� ���� ������� � � � �� ������ �� ������ ,
�� ��� ���� �� ��� ����� ����� ���� ���� ���� � ������ ������� �� ��� ��
� ����� �� ��� ���� �� �������� �� � ����� �� ����� �� -2 �4 ��� �����
>����� ������ ����� �� �������� ���� ����� ���� �� � �������� � ��� � �����
� 4������� �� ���� �� � ������ � �� ����� �� ����� ������� !�����#���� �
� ���<��* ��<��" �� ��������� � �� ���� � ������ �� ���� �� %@@ !�����
@�@% �� � ������ ���� �� ��� �� ����" � � �� �� ���������� ����� �������
������
�1 ����������
� �� �������� ����� ���� ��� EM%#K�� ���� �� ����� � � ���� � �� �� �������
����� ��� � � >����� ����� �� ����� � � � �� ��� �� �� ����� � ���
� ���� � �� ������� � ����� � �� �� �����
� 7�� � � ����� ����� ��� �� ���� ���� � �� % �M � ��� EM%#K�� �����
�� , ����� �� % � �� -2 � ���� ����� � �� ������� �
�� ����� �� ���� � �� &('%@@@ �� � &L� ���� �� ��� � � � ���������� � ��������
!��� %@ ��<�� �� ����� �� :%-=@2 �� :%-C4$ ���� ����"�
� , ����� �� ������ �� %&'%( � �� -2 �4 ���� ����� �� >��� ��� � ������� � �
������ �� ������� � 4����� &� �������� ��
� ���� ������� �� � ���������� � ���� ������� �� $������� � ��� !2&" �� ����� � :%-�����
� � ������� ���� ��� EM%#K�� ���� ������� ���� � &L� ����� � %@%%'%@%& ����<���
, ������ ��������� �� � ����� ������� ���&����� �������� � � � ��� ���� ������� ��� �� �� ������ � ���� �� , � ����
�� ������� �� � ������ � �� ��� �����; ����� � !�� ����� � �" � ������� �
!����"����� ����� ��* ������ * � � � ������ � �� ����� ��� �� )���� 1 � �
�� ��� ���� � ���� �����#�� �� �� ������� � �� ���� �� ��������� ��
���� ���� ��������� ���� �� � ��� �� ��� �����
��� )�*��� � �� ����)�� ����� � ���� ��� �� ��������� � ��������� �� ���� ���� �� ��
�� ������ � ������� ����� � � �� ��� � ���� �� �������� )������ � ����� �
��� ������ � �������� ������� ��� ���� �� � ������ �� � ������ ����#
���� � �� �� �������� ����� � )�� ������ � ��������� � ��������� �����#
�������#������ ����� ��� �� � ������ � � ������� ��� ���� � �
+���6%�.�+6� �6 '!�*( "+6#6*� ��% '!�*( %+�'#��
%2
�� � ���� �� ��� ������� ����� �������� � %@%@'%@%% ��� � ����� ���
���� !� 4����� &"� �� �������� � ������� �� � ���� ������ !AA����BB"
�� ����.���� � ������� ������� !AA���BB" �� ����.���� � ����� �� ����#���
����� �� ���� � � ��� ��������� � �� AA�������BB �� ����.���� � � �����
� �� � �� � ����� � ��� � ����� �� ������ !� 4����� &� $���� &� � �
4����� 0� $���� -* �� � ����� � ������� �� ����.���� � � 4����� 3"� ,
��� ������ ��������� �� �� ������� � �� ��� � �� � �� ���������� � � �������
��. ��������� � � �� ����� ���� � � �������� ���� �� � ������ � �
������� !� 4����� &� $���� &"� ���� ������� � ��������� � �� ��� ��� ��
���������� � ��� � �� � ����������� �� �� ����� ������ ���� !4����� -"�
+������ ���� ���� ��������� �� � ������� � ������ �������� ��
������� � ���� ������� ���������� �� ����� �� � ������ � ���� ��
$�� �������.� ���� ������� ���������� � � ���� �� ������ � ��������
��� �������� � � � � �� ������ �� �������� � � �� �� � � D������
Select
Construct vector and confirm functional display
Randomize targeted regions
Analyse selectedclones
Obtain or create random
gene library
General principles: Ch. 4
General principles: Ch. 4 Oligo-directed mutagenesis: Ch. 2
In vitro recombination: Ch. 3 Oligo cassette: Ch. 6 Recursive PCR: Ch. 8
Oligo-splinted assembly: Ch. 9 Error-prone PCR: Ch. 11
PCR with randomized primers: Ch. 14
Premade peptide libraries: Ch. 1 sect. 7 Gene fragment libraries: Ch. 11
cDNA libraries: Ch. 12 Antibody V-region libraries: Ch. 13
General principles: Ch. 4 In vitro binding: Chs 4, 6, 9, 11, 12, 13
Enzymatic selection: Chs. 7, 8 In vivo binding: Ch. 10
Sequencing: Ch. 4 sect. 7 PCR fingerprinting: Ch. 13
Binding, by phage ELISA: Ch. 5 (also see Chs. 6, 9, 11, 12, 13)
Test soluble proteins: Chs. 4, 6, 13, 14
��� �� 2 -��� 3��)��$ ���������) � )������ & �)� 3�&��� &������� ��3 �=�$&�� ��
��� ��;� � �� ��� 4� �3 �� ��� ��)� 84�=�3:
���56�+( ����(# �� ��
%3
� ���� ��+� �������� !4����� %&" � � � ������ C#���� �������� !4����� %-"�
, ��� ����� ������ ��������� ��� � ������ �� ���� ��� ���������
�� ������ � � ������� �� � �������� ������� �� � ��� ���� ��
����� � � � ���������� ��#��� ���� ������� �������� >�#��� �����
������� �������� �� �� ����������� �������� !� $���� 3"�
��� ���������� ���� ����� �� � � ������ � ����� ��� � �� ������� � �� �����
�� �� � � ������� � � ����� �� ���� ������� �� ��� � �� � ������ ������ � �
�� ���� � ���� �� ����� ���� ������ �� ���� ���� �� �� AA����� �BB ��
AA����� � ��BB �� ��� ����� � � ���� ����� �� ������ � ���� � �� �����
�� �� � �� ������� � ����� � 4����� 0� $���� � 0 � � (� � ��� ������
� ����� � � � ����� �� ����� � ��� � ���� ������� � �� �������� ���
��������� � �� ) ���� ����� �� ����� � �F� �� �� ��� ���� � ����� �� � �
� ���� ������� !���� �� ������ � ��������� " !� ���� �"� ���� ���������
�� � ���� ������ ��������� �� �� ������ ������ � �� �� �� ����� ����
� �� � ���������; �� ������ ������ �� � ������� ���� � �� �� � ��
������ �� ���� ��� � ���� � ���� �������� � �� ���� � ����� !� 4����� %@"�
�� ����� � �� �� �� � ��� � ��� � �� ��� �� ��� �� � �� ��
��� � � ������ �� ���� ������ ��� ���#��� �� ��� ��� � %@@@#����
�������� �� ���� %@#��� �� ������� �� � �� ����� �� �� � ������ � , ����
����� �� ���� ���� �� ��� �� �� �� � ���� �� ��������� � �
���� !AA�������BB"� �� ����� ����� ��� �� � ������ � D ����� � �� ���������
�� ����� �� ��� ���� �� ������ �� ���� ����� � � � ����� � ���.� � ��� ��
��� +������� �� ������, ���� ���� ������� ������� � �� � ����� � ����� � � �� �� ���� �
�� ��� � ���� ��� � ������ � � �� �������� � �� �������� ����� ��
�� ���� ����� ��� ��� �� �� ���� � ����� ��� � �� ������ ��
��� � ���� �� ��� ����� � ��� � � ������ � ����#����� ��� ��
����� � (=�$&�� �� ���3����� �3 ��� ������ �� ���)��<4��3 & �)�
/� ��� � ���� +�������
� � � !.�� &! � � ��� )������C $�� ��$$�� 8�:� � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � �
��B��� $� !.� 82E� F�:� � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � �
EBFE $� %�� 8��� ��3��4�� ������: 8EE� F0� FE:� � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � �
��� $� ����� ���$��� 8F2:� � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � �
2 � ���� &! � 8FF:� � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � �
E� $� �3�$ �������� &! �B2 8F1:� � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � �
E�� $� H.�� �� $� !.�� &! � 8F/:� � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � �
0 � �).�� 81�:� � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � �
�&���7� ��)��3 80E� 1�:� � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � �
%����� ��������� �� �� ���� �� 81�� 1�� 1�:
+���6%�.�+6� �6 '!�*( "+6#6*� ��% '!�*( %+�'#��
%9
� � �� �������� � �� �� �� ���� ����� � � � ����� � ���.� �� �� �������
� 4����� 0� $���� 2� � ���� ���� � � ����� �������� �� ��� �� �����#
��� �� >48 AA� ����� �� ��BB � ����� �� � ��� ���� � �� �������� �����
�� ������� �� >48� � � �� ������ ���� � ��� �#����� � ��������� .��
!� 4����� %-� �������� ��"� � ������ � �� ������� �������� ���� � ����� �
�� �� ���� ��� � � ��� �� ���� ��� � >48 � ����� �� � ��� ���� ��
������������ ���� � ���������� � ���� �� ��+� ������� �� ���� � ������ ���#
��� �� ��� ��� ��� �� ����� �� ��� � ��� � ��������� ����� �
�� ���� ������� � � ������� ��� ��� �� � ����� ���������.���� � ��
�������� � ����� ��� �� ������������ �� �� �� ����� � ������ ���� �
�� �� � ������ �� �� �� ���� DM,$�� , ���� ������ �� ����� � � ���� ��
��������.� � ���� � � 91#��� ����� � �������� ���� ���� ��� �� ������
��� ����� ��� � �� ����� � � ������ �� �� � �� ����� �� �� � �
� ��#���� � ������� , ������� �� ���� � AA��' �BB � ������� �� �� ����� �
��� ��� �� �� �� ������ �� ����� �� � ��� � � ��������� ����� ��
����� �� ������ �� �� � �� ���� � ��� �� �� ������� � 4����� (�
)������ � ���������.���� � �� �������� ��������� AA�� ���BB � �����
�� �� ��� �� �� �� ��������� � ������ !� ��������" ����� ��
��� � #���� � ������� )�� ���� �� ���� � ������� ������ ���� �� ���������
�� �� ��� � � � ���� ���� ���� ��� �� �������� ����� � �
�,,,� ������ � ������ � #���� ����� �� � ������ ��� �� ��� �� ��
� � #��������� ����� � � ���� !0(� 1@" !� ���� �"� H� �� ������� � �
������ � �� �� � � ������ �� � ������ �� ����� ���� � 91#��� �����
!��� � 4����� %-"� )�� ������ ����� ��� ��� ������� �� ���� � �� ���#
���������.� �� ��� ����� � ���� �� ������ �� �� � ����� !:K>" �� �����
�� ������� � �� �������� ������ �� �� �������� ����� !� 4����� 1"�
/��� ��� � �������� �������� �� ������� � ����� � � ������ � ��� #
����� � ������ � ��� � �� ��� ��� � �� ���#������ � ��� � � ����
������� ��� ��� ���� �� ���� � �� �� � ����� � �� � ��������� � � ���
�� ������ ����������; �� ������ �� �� � G#��� � � G#��� ������ �� ���� �
����� � �� ������� � 4����� %%�
2 ����� ��������:� � ������� � ���� ���� �� ��� ������������ � �� �� �� ������ ������ �
���� �������� �� �� ���������� ���������� �; �� ������ � ���� �� ����
������� �� �� � ������ � �� ������� � 4����� 0 !���� �"� F����� ���
�� ����� ��� � ��� ��� ���� ������� � � ������� �� ����� ���� �� �
�� �����
��� ,� ���� (������ �� ��� ���� � ���� ������� �� ���� �� ������� �� ���� ��� � ���� �����
�������� �� ������ �� � � � �� ������� � �� � ����� ��������� ������� ����
�� � � ����� � ��.� ���� �� � ���������� ��������� �� 5��� ���� �� � �����
���56�+( ����(# �� ��
&@
�� ��� �� ������� ,� �� ����� � ���� � �� ��� �� ��� � � �� �� ���
�� ������� � � �������� � �� ������ � ���������� ������ �� ��� � �
������ ���� � � � ����� ����� �� ����� � � ������� ��� � �����#
�������#������ ����� ��� !� 4����� &� $���� -�-"�
��� -��������� ������� ��������� ��� �� � �������� ������� �� ����� �� ���� ������� ��
���� ��� ��� � ���� ������� ���� ������� ��� ��� , ���� ��� ��� �� ���� �
�������� �� ������� � � ����� � ������ �� � �� �������� ���������
�� ����� �� ������� ��� !��� �� � ���� ������ �� ���" ��� �� �
������� ����� �� ���� �� �������� )�� ������ � ����� ��������� �����
������ �� �� ���� ��� ����� ���� � �������� � � �� ��� ��� ����
��� � ��������� �� ����� ������� �� �� ������� � � ����������
������� �� �� !� 4����� 2� $���� &�&"� H��� ��� �� ��� � ����� ��
� ���� �� � ��� ���� ���� �������� �� � � ����� �� �������� ��������
���� AA������� ���� �BB �� � ���� � �� �� ����� ���� ��� ��� �����#
������ �� ��� � ����� � ������� ��� � �� � ������ � � �� �� �
������ �
��� .%��/���������� ����� ��������� � �� ���� � �������� ��� � ���� � ����� �����
�� ���� �� ����� � ���������� �� �� ���� ����� ��� �������� ������ �
�� �� ���� ��� � ���� ���� � � � � ����� ���������� �� ���� ����
��� � ������ �� �� ��� �� ������� ����� �� !��� ����� �� ���"�
, �� � ���� ��� ������� �� � ��������� �� ���#������ � �� �������
��� � �� ��� �� �� ����� �� ����� ��� � �� ���� � �� 7 �� ��� �� #
����� �� �� ������ ������ ������ �� �� �� � �� ��� !�� �����" �����
� ����� �� � ���� ��� ��� � �� ���� ���� ���� � � ������ � �� ���� � �
������ ���� �� ������� ��� � � ��� �� ����� �� ���� ������ � �� ����� ��
�� ���� ��.��� ��� � �� �������� ����� ���� ���� � �� �� �������#
��� � ���� ��� �� ����� ��� �� ���� � ��� �� ��� ��� ����� �� �������� ��
��� ���� ����� $��� ��������� � �� � ������ � �� �� ���� � ������
��� ����� ��� ������. ���� ������ � ������ � ������� �� ������ � �
������ ��� ��� ��� � � ������ ������ �� ���� � �������
3 0�������4� ������� �������� ���� � �������� � � ��������� ���� ���� ���� ������� ��� �
�������� ��� �� �� � ����� ����� � ���� ����� �������� �� � � ��
��� ����� � � ��������� ��� � ���������� )��'J� ���� ������� ��� ������
�� � ���� � � ���� ������� �� �� ������ � ��� �� ������� ����� �
4#���� ���� !30"� �� J� ���� .���� ��� � �� �������� �� � ��� ����
� �,,,* � ��� � ����� �� ��#����� ���� �������� �� )�� ���� .���� ����
�� �������� ����� ��� �� ��� 4#���� ��� )��'J� � ������� � � ������ �
+���6%�.�+6� �6 '!�*( "+6#6*� ��% '!�*( %+�'#��
&%
������� ������� ������� � 4#���� ���� �������� ����� ����� ���� ���
� ���� �� ��+� � ������� ��� � �� � ��� � ��� ���� ����
��������#� ���� ���� !$,>"� ������� �� ���������� � �,,, !� ���� �" ��
�������� � AA���#������BB#����� ����� � ����� �,,, �� ����� � �� ��� �����
� ��� � �� ���� � � ������� � ����#�� ��� � ������� ��� ����� �
��� �� �� �,,, ����� � ����� � �������� ������ � �� �������� � �� �� �
���� �� ������� �� � �� �� ��� ������ !3("�
, ������� � ������������ ���� ��� �� ) ����� ��� � ��� �� �������
� ����������� � ����� � �� ������ !31"� �0 !32"� � � �2 ����� !��� � !33" "�
������� �� 4#���� �� ���� � �� �� � %@ ������ ����� � ���� �2� �
����������� �� �� � � ����� ��� ��� �� �� �� ������������ � ���������
���� � � �������� !� $���� 3"� K���� ��� ���� �� ������ � �� � ����
������� ��� �� � ���� �� ������ � �� ���� ����� �� ��� ������ �� #
��� � � ���� ��� �� ������� � ��� ������� � ���������� ����� �
!�������� � $���� 0�%"� � ���������� � �2 ������� ���� �� ������� �
4����� %@� M���� ���� �� ���� ���� �� ��+� ������� !� 4����� %&� $���� &�&"�
)� ����� ���� ���� �������� �� �� ����� ������ ������ � ���� �������
� ���� ������� � �������� ������ � ����� � ��� ������ � � � ������� �
�+� �� �� � ����� � ���� �� �� ��� ������� !�� � ����� � !39""� ,
��� ���� ��� ��� ���� ��� � ��� ������ ���� ���� ������� � �
�� �� ��� �� ���� �� �������� � � � �� ������� � � �� �� � �������
!� 4����� 1"�
5 ���������� �� ���� �� ����� ���������������� �� )���� ���� � ������� ��������� � � ������ ������ �� ���� ������� �� ��
�������� ������������ �� � ������ � ���� �� +� D ��� � K������ ������� �
���� � ��#��� ������� � �,,, �������� �������� � �� �� �� �������#
�� ����� � ������� � � ��� �� � � ���� � � ��� � ������ � ��� � ��
� ���������� ������ � �� ����� ����� ���� ��� M������� �� ������� � ��
��� � ���� ���� � ���� ���������� � ���� ����� �� �� ���� ��� ��� ��� �� �
������� � � ���������� � ������ � ����� �� ���� �������� �� �� �������� �
������ ������� � ������� ���������
������� K����� �� ������� �� 8>�$ ����� �� ������ � �������� �
�� ��#���� )� � ������ ���� �� �������� �� ���� ��� � �,,, !��� � �������
��� ����� � � ��������� �� ���� ����� � � 4����� %-"� >���� �������� ��
�� �������� ��� � ���� � ������ �� �������� �� �� ������� � ���������
������ � ������ �� � � ������ � �� ����� � �������� �� 8>�$ �����
���� ���� �� � ��������� ����� �� � �,,, ������� ������� ����� �� ��
�� �������� � ������ �� ���� � ������� ���������
+���� ����������.� � ���� � ���� �� �� ������ � ������� �� � �
������ � �������� �� ������� � ����������� �2� $���� ��#��� ��+�
������� �������� �� ���� ��������� �� ��� �� ������ � ������ �� �� ������ �
������ �������� �������� �� � �� � � ��� ����
���56�+( ����(# �� ��
&&
�����
�.
�$
$���
���
&&���
���
& �)�
3�
&��
���
���
���3
��4��
���
'� ��
�� ��
���������
6�����
+������
�4�
������
7������
���
(�)��
�3
"��
��4
' %
��
& �)�
3�
&��
��
��$
���H
(&+++
& �)�
�����
�'
��<$
�3�
&�&��
3�
��4��
���
���
�����
��
���)
��
��3
��
���C
����
��)
& �)�
�����
�
��
� �
�4 �
�$
��������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������
�$
��
�$
"��
���
���
����$
4��
���
' �)�
����
4�3�
��
��$
8�'
��:
&.
��
��
"<E
(&++
+& �)�$
�3��
���
�H
��
���
��4��
������
����
���
���
���
���
& �)�
��>�
$�<��
���3
�$$
���
�4���
�
��
8(#+
��
:�
��3
�=&��
��
���
��
4��
&��
����
C�
���
��)
& �)�$
�3��
���
�
��
� �
$��
�$
4��
���
���
��$
��������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������
����
)��
�F����
���
��
��$
�F����
��
�����
�D
���
.<�
��$
����3�
&��
���
)���
��
��&�
3&��
����
��
�F
& �)�
H��
��
���4��
������
����
���
& �)�
�������
&����)��
)�
��3
���
���
��C
&��
<$�3�
�%
��
3�
&��
���4��
���
��
� �
���
)�� �
�$
&-
����������%� $����� 6� >� !%93("� ������ ���� %-%(�
&� 4������ � �� � � /���� J� �� !%990"� ����� ��������� � ��� %2-�
-� M���� � F� K� !%992"� ��� � ���!�"� ���#�� ����� � ��� 0@%�
0� $����� 6� >� � � >�� ��� C� �� !%992"� $�# � � �� -9%�
(� $����� $� $� !&@@@"� $�� %!�� ��������� � ��� 1%@�
1� /����� 8� !%991"� , ���� ���!��" �& !!���� ��� !������ !�� K� =��� J� /� ��� � �J� :�4����"� �� %� ������� >���� +� L����
2� :�������� M� � � 8����� :� !%992"� , �������� ������" �& ����� !�� /� 4����8� :� K�� ��� � � 8� M� 6����"� �� -(&� H���� 7 ������� >���� +� L����
3� :���� � �� �� !%993"� $�� %!�� ����� ���� � �� %(@�
9� :���� >� � � 8����� :� !%933"� , �� �������!���� !�� 8� 4�� ���"� �� -2(� >� ��>������� �� +� L����
%@� $������� M�� K������� D�� F�������� =�� :���� >�� 8����� :�� � � :�������� M� !%99&"�' (�� ���� � ���� 2&@�
%%� D ��� � F� � � :���� >� !%99("� ' (�� ���� � ��� 091�
%&� 6��� 4�� :��� $�� M�� 4� F�� /������ �� >�� M� �� 8� ��� � � J� ��� =� �� !%999"� ���� )��� ���� ��� *��� �� 1@&(�
%-� 8��� ��� J�� ) �� J� +�� � � :���� >� !%999"� ' (�� ���� � ��� %&(-�
%0� 6������ C� � � 8������ ,� !%990"� �� ' �����# � ���� 9&2�
%(� 4� � ����� K� 4�� M��� �� 6�� M�� K�� K ��� K� ��� � � /���� J� �� !%990"� �(�% ' ���� &(@3�
%1� F������� >� � � 8����� � M� !%992"� ������� �� &1(�
%2� M��������� J�� F ��� )�� >������� � ��� � � /������� �� !%993"� )��� ����� ���� ��� %0@�
%3� 8����� :�� /������� F�� $� � �� >�� � � /����� 8� D� !%933"� ' �������� � ��� (-%&�
%9� � �� M� /�� :����� >�� � � >����� 8� +� !%999"� +������"� ���� &2%�
&@� 8����� � M� � � F������� >� !%992"� $��� � -(%�
&%� M��������� J�� F ��� )�� >������� � ��� � � /������� �� !%999"� ������� �� 2%%�
&&� 4����� D� :� � � /����� 8� D� !%992"� ' �������� � ��� 1010�
&-� 4����� D� :� � � /����� 8� D� !%993"� ' �������� � ��� %2&-�
&0� F�������� =� !%992"� ,�� $���� �� 0&(�
&(� )������ /� � � :���� >� !%933"� ' (�� ���� � ��� 09�
&1� 6�������� �� )� � � $��� �� �� !%999"� )�� �� 92&�
&2� H����� �� /�� K������ �� ,�� $������� D�� ������� ,� ��� � � = ��� 6� 6� !&@@@"� ' (�� ���� � ��� (2(�
&3� )������ /� � � :���� >� !%933"� ' (�� ���� � ��� -9�
&9� M��.� J� � � /����� 8� D� !%93("� ' �������� � ���� %&2@�
-@� M� ������ +� ��� $��� � :� +�� � � 8����� :� !%992"� ������ ���� %1-(�
-%� 8����� :�� M� ������ +� ��� � � $���� �� !%992"� ,�� ��� &-�
-&� :����� �� �� =�� 8����� :�� � � $��� � $� :� !%999"� ������ ���� %(%1�
--� :����� �� �� =�� 8����� :�� � � $��� � $� :� !&@@%"� ���� )��� ���� ��� *��� �� 9-(9�
-0� 8����� :� !%99&"� ' (�� ���� � ���� 0(-�
-(� 6� ����� J�� /������ �� D�� � � >����� 8� +� !%99%"� '(�� ��� 3&%�
-1� ,� ���� 6�� :� ����� H�� >���..���� 8�� � � 4��� �� 6� !%99("� ' (�� ���� � ���� 3-(�
-2� ) �� J� +�� :���� >�� � � 8����� :� !%999"� (�� (�������� � ��� 20(�
-3� ) �� J� +�� 8����� :�� � � :���� >� !%992"� ���� )��� ���� ��� *��� �� 0@13�
-9� 8��� ��� J� � � :���� >� !%993"� ' (�� ���� � ���� &(�
0@� 8����� :� � � :���� >� !%939"� ' +���� � ��� -&30�
���56�+( ����(# �� ��
&0
0%� J����� M� $�� :�� �� J� F�� � =���� ��� D������� ��� C� � K�� �� ,�� 6� ��� ��L� 6� � ��� !%99("� �����������"� ��� -23�
0&� $����� $� $�� /���� 6� ��� � � /���� J� �� !&@@@"� ' (�� ���� � ��� 032�
0-� /���� 6� �� � � $����� $� $� !&@@@"� ' (�� ���� � �� &%-�
00� K���� $�� 6� � 8�� � � /���� J� �� !%99@"� �������� �� -@9�
0(� M���� � F� K�� K���� $� F�� $����� � +�� � � /���� J� �� !%99%"� �����#����"� �� %@3-&�
01� )��� 6� � � $����� $� $� !&@@@"� ���� -�� � ��� &-%�
02� +���� =�� +����� � J�� +����� � K�� 7�� � :�� � � +��� � >� �� !%99("� ������ ��� � �� 1@%�
03� C��������� :�� 4��� M� 8�� 6����� �� 8�� J� ����� :� ��� � � K������� J� !&@@%"������# ���!�"� � $�##� � ��� 3%-�
09� F ��� :�� H���� ��� K� ���� :�� =���� ��� K������� /�� =���� �� � ��� !%993"� �� ' �����# � ���� -1�
(@� 4�� � $� ��� /�������� �� :�� F������ C�� � � :� �� >� +� !&@@%"� ������ ��� � ��� %39�
(%� �������� L� � � M���� � F� K� !%999"� �����#����"� ��� 1-31�
(&� K��� 6�� $������� )� $�� $������� ��� � � $����� �� !%999"� ���� )��� ���� ��� *��� ��%393�
(-� 4���� �� 8�� $����� �� =�� L� �� G�� J� ������ K� ��� � � 4����� 4� $� !%99-"� ,�� ���� %&9�
(0� :�4����� J�� 6������� �� ��� /� ��� 6�� � � 4������� �� J� !%99@"� )���� ���� ((&�
((� 8�� � K�� F���� �� J�� /� �� M�� � � K��� � >� +� !%993"� ������ ��� � �� &-0(�
(1� ������ $� � � /���� J� �� !%999"� ���� )��� ���� ��� *��� �� 9092�
(2� M����� :� 8�� )����� K� D�� 6���� ��� $� D�� 4���� J� :�� /������ J� 4�� � � )������� 6�!%993"� ' ��������� � ��� 9(�
(3� C�� F� � � +�� H�������� >��� � M�� $���� � ��� � � K���� $� !&@@%"� �� ' .##��� ���� -&�
(9� :����� L� ��� M�� K�� 4������ ��� F� /�� /���� J� ��� 4� � ����� K� 4�� � � � C��� �� :�!%992"� ���� )��� ���� ��� *��� �� 2%9&�
1@� F��� ����� F� 8�� 6������� �� ��� J�� �� � =� $�� 4������� �� J�� F���� � >�� � �/� ��� 6� !%99%"� )�� ����� �� �� 0%--�
1%� :�4����� J�� J����� � 8� F�� � � 4������� �� J� !%99%"� ������ ���� �� 9((�
1&� ������ >� ��� F���� 8� F�� � � �6����� /� )� !&@@@"� ������ ��� � � &-11�
1-� F�������� :�� >���� � =�� � � $������ =� !%999"� ' (�� ���� � ��� %@92�
10� 8���� D� J� � � >���� 4� H� !%990"� ������ ���� 12%�
1(� =�� J� � � $�����.� >� 6� !%99("� ���� )��� ���� ��� *��� �� 1((&�
11� $��� >� >�� :�= .�� =� :�� /���� J� ��� � � ����� � �� J� !%999"� $�# ���� � �� 2@2�
12� /����� � :� � � :� ����� K� !%99("� ' (�� ���� � ��� %%(�
13� )��� �� :�� :����� J� ��� /� ��� 6�� � � 6������� �� �� !%990"� ' (�� ���� � ��� 13�
19� >������ $� )� � � $����� 6� >� !%933"� ,�� ��� -@(�
2@� 8����� :�� =���� $�� � � =���� :� 8� !%931"� ,�� ��� ---�
2%� C����� J� � � :��� �� J� !��" !%932"� , (����� �� �/"#����"� C��� %(-� !�� "� �� -�������� >���� M� �� �
2&� $�������� ,�� )������� D�� � � :� ������ �� !��" !%939"� (������ �������0 � ���������"#����� & � � �� �� 0�&&� 4��� $��� � F����� >���� +� L����
2-� 4� � L�� /���� � 4�� )��� 6�� M�� K�� 4������ ��� F� /�� :�=��� >� � ��� !%999"� ' (�� ���� � ��� 31(�
20� )���������� /� J�� 4������ ��� F� /�� 4����� � �� 6�� )��� 6�� = � � 4� J�� G�� � 4�� ��� !%993"� �����#����"� ��� %22(0�
2(� M���� � F� K�� 4� � L� :�� $���� � +� J�� :��� � � �� M�� ����� �� � D� D��$������ :� �� � ��� !%993"� �����#����"� ��� 332@�
21� F���� �� 8� D�� 8������ $� J�� � � /� ��� 6� !%99&"� ' (�� ���� � ���� 339�
+���6%�.�+6� �6 '!�*( "+6#6*� ��% '!�*( %+�'#��
&(
22� 6����� � 8� J�� ����� :� C�� =���� � $� D�� � � 8�� ���� $� !%990"� ���� )��� ���� ��� *��� �� 2%&9�
23� 8������ K� M�� :����� �� /�� M�� �� 4�� = �� 8� K�� /���� �� /�� 6����� � $� =� � ���!%99&"� ���� )��� ���� ��� *��� �� &0&9�
29� � ��� :� $�� D�� ����� 4�� $���� � +� J�� 7������ :� F�� $� ���� M�� ����� :� �� � ���!&@@@"� )���� ��� 01(�
3@� =���� K�� 8���� ����� 8�� 8���� $�� 8���� 4�� ����� :�� ������� � D� � ��� !&@@%"�' .##��� (������ ���� 12�
3%� H�� ����� =� 8�� M��� ���� � ��� 6������ � ,� J�� $�����.� >� 6�� � � 6������ :� �� !%99&"����� )��� ���� ��� *��� �� (-9-�
3&� /� ��� >�� M�� �� :�� :������� >�� � � 8��� K� !&@@%"� ' ���� $�# � ���� &@&@1�
3-� /� �� ��� $�������#6�� � K�� = ��� $�� =�� �� M�� J � � =� F�� � � 4����� K� )� !%992"�' .##��� (������ �� 2(�
30� 4������ 8� � � $���� :� !%99-"� ,�� ���� 19�
3(� =����� 4�� $����� $�� ����� ��� ��� � � >������� � �� !%99("� ���� -�� � ���� &&2�
31� F���� 8� F� !&@@&"� $�� ����# ��������� � �� &-�
32� 8 � N� J�� M���� 6� =�� /� ����� >� ��� M���� D� 6�� $�� � �� 4�� � � K����� M� /� !%991"������� ��� � �� %3--�
33� �� �� $� � � K������ J� 6� !&@@%"� ���� )��� ���� ��� *��� �� %&9(0�
39� ����� /� J� � � :��������� M� 4� !&@@&"� $�� %!�� $�# ���� � �� -9@�
���56�+( ����(# �� ��
&1