PCR (polymerase chain reaction)

PCR

•Scelta dello stampo

•Scelta dei primer

PCR da DNA genomico

PCR da mRNA (RT-PCR)

Uso dei “linkers”

Vettori dA:dT

3’3’5’5’

3’5’3’

5’

PCR da DNA genomico

EcoRIBamHI

BamHI EcoRI

Elettroforesi di acidi nucleici

•Gel di agarosio

•Gel di acrilammide

PREPARAZIONE GEL DI AGAROSIO

GEL DI AGAROSIO

Elettroforesi su gel di agarosio

CARICAMENTO GEL DI AGAROSIO

CARICAMENTO GEL DI AGAROSIO

CARICAMENTO GEL DI AGAROSIO

GEL DI AGAROSIO

Tamponi di elettroforesi

Soluzioni di caricamento

Soluzioni di caricamento

•Aumentano la densità del campione

•Colorano il campione

•Rendono visibile la corsa elettroforetica

Migrazione del DNA su gel

Fattori che influenzano la migrazione

•Peso molecolare

•Concentrazione di agarosio

•Conformazione DNA

•Voltaggio applicato

•Intercalanti

•Tampone di elettroforesi

Visualizzazione del DNA

GEL DI AGAROSIO

Marcatori di peso molecolare

HindIII

DNA circolare consuperavvolgimento = 0

DNA superavvoltonegativamente

Fotodocumentazione

Recupero DNA da gel

•Elettroeluizione

•Agarosio “low melting”

•Solubilizzazione agarosio

Gel di acrilammide

Apparato per gel di acrilammide

Gel di poliacrilammide di sequenza

Descrizione generale esercitazioni di laboratorio

Studio della localizzazione intracellulare della proteina SEC4 del lievito Saccaromyces cerevisiae

A) Clonaggio di SEC4 in vettore per l'espressione in lievito di proteine di fusione con "tag" (GFP)

B) Espressione di SEC4 in lievito e analisi della sua localizzazione mediante western

blot di estratti frazionati

Parte A

I) 1. PCR su DNA genomico (preparazione frammento da clonare)2. Preparazione di DNA plasmidico (vettore di clonaggio) con colonnina3. Digestione DNA (vettore e frammento) con enzimi di restrizione

 II) 1. Reazione con enzima "ligasi"

2. Analisi su gel di agarosio3. Analisi spettrofotometrica del DNA preparato 4. Trasformazione batterica5. Preparazione piastre di agar

 III) 1. Analisi risultati trasformazione

2. Minipreparazione DNA plasmidico3. Analisi su gel di agarosio

Clonaggio con doppia digestione

GAATTCCTTAAG

GCTTAA

AGCTT A

EcoRIBamHI

AAGCTT

TTCGAAG

AATT

CCTT

AAG

DNA ligasi

EcoRI

BamHI

BamHI EcoRI