-
8/12/2019 PCR - Patent - 1986
1/36
United
S t a t e s
Patent
[ 1 9 ]
M u l l i s e t a 1 .
[ 5 4 ] PROCESS
FOR
AMPLIFYING,
DETECTING,
AND/OR-CLONING NUCLEIC ACID
SEQUENCES
[ 7 5 ]
I n v e n t o r s : K a r y B . M u l l i s ,
K e n s i n g t o n ;
H e n r y
A . E r l i c h ,
O a k l a n d ; Norman
A r n h e i m ,
Woodland
H i l l s ;
G l e n n
T .
H o r n , E m e r y v i l l e; R a n d a l l
K .
S a i k i ,
R i c h m o n d ; S t e p h e n
J . S c h a r f
B e r k e l e y , a l l o f C a l i f .
[ 7 3 ]
A s s i g n e e :
C e t u s
C o r p o r a t i o n , E m e r y v i l l e ,
C a l i f .
[
* ]
N o t i c e :
The
p o r t i o n o f t h e
t e r m
o f
h i s
p a t e n t
s u b s e q u e n t
t o
J u l . 2 8 , 2 0 0 4 h a s b e e n
d i s c l a i m e d .
[ 2 1 ] A p p l . N o . :
8 2 8 , 1 4 4
[ 2 2 ]
F i l e d :
F e b .
7 ,
1 9 8 6
R e l a t e d
US.
A p p l i c a t i o n D a t a
[ 6 0 ]
C o n t i n u a t i o n - i m p a r t o f e r .
N o .
8 2 4 , 0 4 4 ,
J a n .
3 0 ,
1 9 8 6 ,
a b a n d o n e d ,
which
i s a d i v i s i o n
o f
S e r . No. 7 9 1 , 3 0 8 ,
O c t .
2 5 ,
1 9 8 5 ,
which
i s a c o n t i n u a t i o n - i n - p a r t o f S e r .
N o . 7 1 6 , 9 7 5 ,
M a r .
2 8 , 1 9 8 5 , a b a n d o n e d .
[ 5 1 ] I n t . C l . 4
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C12Q / 6 8 ; C12P 1
9 / 3 4 ;
C12N
1 / 0 0 ; C12N 1 5 / 0 0 ; GOlN 33/48;G01N
3 3 / 0 0 ;
G01N
3 3 / 5 6 6 ;
GOIN
3 3 / 5 6 4 ; CO7H
2 1 / 0 2 ;
CO7H
2 1 / 0 4
[ 5 2 ]
US. l . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . .
. .
435/6; 435/91;
4 3 5 / 1 7 2 . 3 ; 4 3 5 / 3 1 7 ; 4 3 6 / 6 3 ; 4 3 6 / 9 4 ;
4 3 6 / 5 0 1 ;
4 3 6 / 5 0 8 ; 5 3 6 / 2 7 ; 5 3 6 / 2 8 ; 5 3 6 / 2 9 ;
9 3 5 / 1 7 ;
9 3 5 / 1 8 ; 9 3 5 / 7 6 ; 9 3 5 / 7 7 ;
9 3 5 / 7 8
[ 5 8 ] F i e l d
o f
Search . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 435/91, 1 7 2
. 3 , 3 1 7 ,
4 3 5 / 6 ;
5 3 6 / 2 7 ,
2 8 , 2 9 ;
9 3 5 / 1 7 , 1 8 ,
7 8 ,
7 7 , 7 6 ;
4 3 6 / 6 3 ,
9 4 ,
5 0 1 ,
5 0 8
[ 5 6 ]
R e f e r e n c e s
C i t e d
U . S .
PATENT
DOCUMENTSv
4,395,486
7/1983 Wilson e t a 1 .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4 3 5 / 6
OTHER
PUBLICATIONS
G o r s k i
e t
a l ,
M o l e c u l a r
o r g a n i z a t i o n o f t h e HLA-SB
R e g i o n o f t h e
Human M a j o r
H i s t o c o m p a t i b i l i t y
Co m
4 , 6 8 3 , 1 9 5
*
J u l .
2 8 , 1987
[ 1 1 ] P a t e n t Number:
[ 4 5 ] Date o f P a t e n t :
p l e x
a n d
E v i d e n c e
f o r
Two SB B e t a - c h a i n G e n e s ,
P r o c . N a t l . A c a d .
S c i .
USA 1 : 3 9 3 4 ( 1 9 8 4 ) .
B o s s e t a 1 ,
C l o n i n g a n d
S e q u e n c e A n a l y s i s
o f
t h e
Human
M a j o r
H i s t o c o m p a t i b i l i t y
C o m p l e x
Gene DC
3 b e t a , P r o c . N a t .
A c a d . S c i .
USA 1 :
5 1 9 9 ( 1 9 8 4 ) .
Okada t a l , Gene
O r g a n i z a t i o n o f
DC n d DX u b r e
g i o n s
o f
t h e Human M a j o r H i s t o c o m p a t i b i l i t y Co
m
p l e x , P r o c .
N a t l .
A c a d .
S c i .
USA 2 :
3 4 1 0 ( 1 9 8 5 ) .
S a l s e r ,
C l o n i n g cDNA s e q u e n c e s : A g e n e r a l Tech
n i q u e
f o r
P r o p a g a t i n g
E u k a r y o t i c
G e n e
S e q u e n c e s i n
B a c t e r i a l C e l l s ,
i n
G e n e t i c E n g i n e e r i n g ,
1 9 7 8 , C h a r
r a b a r t y ( e d . ) ,
CRC
r e s s , I n c .
Boca
R a t o n ,
F l a . ,
p p .
5 3 - 8 1 .
G a u b a t z
e t
a 1 , S t r a t e g i e s f o r
C o n s t r u c t i n g
C o m p l e
m e n t a r y
DNA
f o r
C l o n i n g ,
J .
T h e o r . B i o l .
9 5 :
6 7 9
( 1 9 8 2 ) .
R o s s i
e t
a l . ,
J .
B i o l .
Chem,
2 5 7 ,
9 2 2 6 - 9 2 2 9
( 1 9 8 2 ) .
P r i m a r y Examiner-James
M a r t i n e l l
A t t o r n e y , A g e n t ,
o r Firm-Janet E .
H a s a k ;
A l b e r t
P .
H a l l u i n
[ 5 7 ] ABSTRACT
The
p r e s e n t
i n v e n t i o n
i s d i r e c t e d t o a p r o c e s s
f o r
a m p l i
f y i n g
a n d
d e t e c t i n g
a n y
t a r g e t n u c l e i c a c i d
s e q u e n c e
c o n t a i n e d i n a n u c l e i c a c i d
o r mixture t h e r e o f . The
p r o c e s s
c o m p r i s e s
t r e a t i n g s e p a r a t e c o m p l e m e n t a r y
s t r a n d s of t h e n u c l e i c a c i d with a molar e x c
e s s of
t wo
o l i g o n u c l e o t i d e p r i m e r s , e x t e n d i n
g
t h e
p r i m e r s t o
f o r m
c o m p l e m e n t a r y
p r i m e r e x t e n s i o n
p r o d u c t s
w h i c h a c t
a s
t e m p l a t e s
f o r
s y n t h e s i z i n g t h e d e s i r e d n u c l e i c a c i
d
s e
q u e n c e , a n d d e t ec t i n g t h e s e q u e n c e s o a
m p l i ? e d . The
s t e p s
o f t h e
r e a c t i o n
may b e
c a r r i e d
o u t s t e p w i s e o r
s i m u l t a n e o u s l y and can be
r e p e a t e d
a s
o f t e n
a s d e s i r e d .
I n a d d i t i o n , a s p e c i ? c n u c l e i c a c i d s e
q u e n c e may b e
c l o n e d
i n t o a
v e c t o r
by u s in g p r i m e r s
t o
a m p l i f y t h e
s e q u e n c e , which c o n t a i n
r e s t r i c t i o n s i t e s
on t h e i r non
complementary e n d s , a n d a n u c l e i c a c i d f r a g m
e n t may
b e p r e p a r e d f r o m a n
e x i s t i n g
s h o r t e r f r a g m e n t u s in g t h e
a m p l i ? c a t i o n p r o c e s s .
2 6
C l a i m s , 1 2 D r a w i n g F i g u r e s
-
8/12/2019 PCR - Patent - 1986
2/36
US. Patent J u l . 2 8 , 1 9 8 7
S h e e t 1 0 f 1 2 4,683,195
F I G . 1
D Q u b I e - S t r a n d e d 9 4 - b p S e q u e n c e
TTTGC TTCTGACACA ACTGTGTTCA CTAGCAACCT
->'
A A A C G AAGACTGTGT TGACACAAGT G A T C G T T G G A
CAAACAGACA
J
G T T T G T C T G T
C T G C C G T T A C
GACGGCAATG
N c o I
H i n f I
M s t l I
V
V V
CCATGG TGCA CC G A C TCCT GAGGAGAAGT >
G G T A C C A C G T
G G A C T G A G G A C I C C T C T T C A
A 1 1 e ] i c
base
p a i r
D N A
p o l y m o r p h i s m
TGCCC TGTG
ACGGGACAC
-
8/12/2019 PCR - Patent - 1986
3/36
US. Patent
J u l .
2 8 ,
1 9 8 7
S h e e t 2 0 f
1 2
4,683,195
b p
188
181
41
F I G Z
-
8/12/2019 PCR - Patent - 1986
4/36
US. Patent J u l . 2 8 , 1 9 8 7
S h e e t 3 o f
1 2
4,683,195
8 1
8
1
141
78
6 2
4 8
4 5
F I G . 3
-
8/12/2019 PCR - Patent - 1986
5/36
US. Patent J u l . 2 8 ,
1 9 8 7
S h e e t 4 0 f
1 2 4,683,195
D
F m z uu w n a u e z o m
---->
N O U L
U a G Q O F U F P U O T E .
o
-
8/12/2019 PCR - Patent - 1986
6/36
-
8/12/2019 PCR - Patent - 1986
7/36
U.S. Patent
J u l . 2 8 , 1 9 8 7
S h e e t 6 0 f
1 2
4,683,195
O P O O F F U <
_
u Q G E
.
T 2 1 2 5 3 5 :
O h h h
E L L .
Z
-
8/12/2019 PCR - Patent - 1986
8/36
US.
Patent J u l . 2 8 , 1 9 8 7 S h e e t
7
o f 1 2
4,683,195
78
6 2
4 8
4 5
F I G . 5
-
8/12/2019 PCR - Patent - 1986
9/36
US. P a t e n t J u l . 2 8 ,
1 9 8 7
S h e e t 8 0 f 1 2
4 , 6 8 3 , 1 9 5
F 1 6 5
B A
C A T G G T G C A C C T G A C T C C T G A G G A G A A G T C T G
C C G T T A C T G C C C T G T G G G G C A A G G T G A A
G T A C C A C G T G G A C T G A G G A C T C C T C T T C A G A C
G G C A A T G A C G G G A C A C C C C G T T C C A C T T
B S C A T G G T G C A C C T G A C T C C T G T G G A G A A G T C
T G C C G T T A C T G C C C T G T G G G G C A A G G T G A A
G T A C C A C G T G G A C T G A G G A C A C C T C T T C A G A C
G G C A A T G A C G G G A C A C C C C G T T C C A C T T
* M a r k s t h e
mutation
( A t o
T )
i n t h e
s i c k l e
c e ] 1 g e n e w h i c h d i s r u p t s
the D d e I site
-
8/12/2019 PCR - Patent - 1986
10/36
US.
Patent J u l .
2 8 ,
1 9 8 7 S h e e t 9 0 f 1 2
4,683,195
GACTCCTGAC
TGAGGACTC BA
denature
a n n e a ]
t o p r o b e
* - - G A C T C C T G A G p r o b e
CTGAGGACTC
d i g e s t w i t h D d e I
( s - m e r ) * - - G A C T C C
T G A G
CTGAGGACT
C
d i g e s t w i t h H i n f I
*GACTCC
T G A G
CTGAGGACT C
*
1 ' s
label
-
8/12/2019 PCR - Patent - 1986
11/36
U.S.
Patent J u l . 2 8 ,
1 9 8 7
S h e e t
1 0 o f 1 2
4,683,195
GACTCCTGTC
* i s 1abe1
C T G A G G A C A C
a 5
denature
a n n e a l t o
p r o b e
A
*--GACTCCTG
G---probe
CTGAGGAC C
A
d 1 g e s t w i t h D d e I
A
*GAC
C C
T G
G
CTGAGGAC C
A
d i g e s t
w i t h H i n f I
A
( 3 - m e r )
*-G A C T C C T G G----
CTGA GGAC C
A
-
8/12/2019 PCR - Patent - 1986
12/36
U.S. Pat ent J u l . 2 8 ,
1 9 8 7
S h e e t
1 1
0 f 1 2
4,683,195
ABCD
8-MER
3-MER
-
8/12/2019 PCR - Patent - 1986
13/36
U . Patent 31mm 1%?
S h e m 1 1 2 @ f
1 1 2
4 9 8 3 J 9 5
P O
1
-
8/12/2019 PCR - Patent - 1986
14/36
4 , 6 8 3 , 1 9 5
1
PROCESS FOR
AMPLIFYING, DETECTING,
AND/OR-CLONING NUCLEIC ACID
SEQUENCES
BACKGROUND OF
THE
INVENTION
T h i s
a p p l i c a t i o n i s
a
c o n t i n u a t io n - i n - p a r t a p p l ic a t i o n
o f
c o p e n d i n g U . S .
S e r . N o .
8 2 4 , 0 4 4 ? l e d
J a n .
3 0 , 1 9 8 6 ,
n o w
abandoned,
which i s a d i v i s i o n a l
a p p l i c a t i o n
o f
c o p e n d i n g U . S . S e r .
N o .
7 9 1 , 3 0 8
? l e d O c t .
2 5 , 1 9 8 5 ,
w h i c h
s
a
c o n t i n u a t i o n - i n - p a r t
a p p l i c a t i o n
o f
c o p e n d i n g
U . S . a p p l i c a t i o n S e r . N o . 7 1 6 , 9 7 5 ? l ed
M a r . 2 8 , 1 9 8 5 ,
now abandoned.
FIELD OF THE INVENTION
The
p r e s en t i n v e n t i o n
r e l a t e s
t o a
p r o c e s s
f o r a m p l i
f y i n g e x i s t i n g n u c l e i c a c i d s e q u e n c e
s
i f
t h e y
a r e
p r e s e n t
i n
a
t e s t
s a m p l e a n d d e t e c t i n g
them i f
p r e s e n t
by
u s i n g
a
p r o b e . More s p e c i ? c a l l y , i t r e l a t e s t o a
p r o c e s s f o r
p r o
ducing
any
p a r t i c u l a r
n u c l e i c
a c i d
sequence from
a
given
sequence
of
DNA
r
RNA n
amounts which
a r e
l a r g e
compared
t o t h e
amount
i n i t i a l l y p r e s e n t s o
a s
t o
f a c i l i t a t e
d e t e c t i o n o f t h e s e qu e n c e s .
The DNA r
RNA
m a y be s i n g l e - o r d o u b l e - s t r a n d e d ,
and
m a y be a r e l a
t i v e l y
pure
s p e c i e s
or a component of a mixture
o f nu
c l e i c a c i d s . The p r o c e s s o f t h e
i n v e n t i o n
u t i l i z e s a
r e p e t
i t i v e r e a c t i o n t o a c c o m p l i s h t h e a m p l
i ? c a t i o n o f
t h e
d e s i r ed n u c l e i c a c i d
s e q u e n c e .
DESCRIPTION OF RELATED
DISCLOSURES
F o r d i a g n o s t i c a p p l i c a t i o n s i n
p a r t i c u l a r ,
t h e t a r g e t
n u c l e i c a c i d s e q u e n c e may
b e
o n l y a s ma l l p o r t i o n o f t h e
DNA
r RNA n q u e s t i o n ,
s o t h a t
i t may
be
d i f ? c u l t
t o
d e t e c t i t s p r e s e n c e u s i n g n o n i s o t o p i
c a l l y
l a b e l e d
o r
e n d - l a b e l e d o l i g o n u c l e o t i d e
p r o b e s .
Much
e f f o r t
i s
b e i n g
e x p e n d e d i n i n c r e a s i n g
t h e
s e n s i t i v i t y o f
h e
p r o b e
d e t e c t i o n s y s t e m s , b u t l i t t l e
r e s e a r c h
h a s been con
d u c t e d
on a m p l i f y i n g t h e t a r g e t
s e q u e n c e
s o t h a t
i t i s
p r e s e n t i n q u a n t i t i e s
s u f ? c i e n t t o
b e r e a d i l y d e t e c t a b l e
u s i n g c u r r e n t l y a v a i l a b l e m e t h o d s
.
S e v e r a l methods have
been
d e s c r i b e d i n t h e
l i t e r a t u r e
f o r
t h e
s y n t h e s i s
of n u c l e i c a c i d s
de nov o o r from an
e x i s t i n g
s e q u e n c e .
These
methods
a r e
c a p a b l e o f
p r o
d u c i n g
l a r g e
amounts
o f
a
g i v e n n u c l e i c
a c i d
o f c o m
p l e t e l y s p e c i ? e d
s e q u e n c e .
One known method
f o r s y n t h e s i z i n g n u c l e i c a c i d s d e
novo i n v o l v e s t h e o r g a n i c s y n t h e s i s o f a
n u c l e i c a c i d
from
n u c l e o s i d e
d e r i v a t i v e s .
T h i s s y n t h e s i s may b e p e r
formed
i n
s o l u t i o n
o r
on
a s o l i d s u p p o r t .
One
t y p e
of
o r g a n i c s y n t h e s i s
i s t h e p h o s p h o t r i e s te r
m e t h o d ,
w h i c h
h a s
been u t i l i z e d
t o p r e p a r e gene f r a g m e n t s o r s h o r t
g e n e s . I n t h e p h o s p h o t r i e s t er m e t h o d ,
o l i g o n u c l e o t i d e s
a r e p r e p a r e d which c a n t h e n b e j o i n e d t o g
e t h e r t o
form
l o n g e r n u c l e i c
a c i d s .
For a d e s c r i p t i o n o f t h i s
m e t h o d ,
s e e N a r a n g ,
S .
A . ,
e t
a l . , M e t h . E n z y m o l ,
6 8 ,
9 0 ( 1 9 7 9 )
a n d U . S .
P a t .
N o .
4 , 3 5 6 , 2 7 0 . The p a t e n t d e s c r i b e s t h e
s y n t h e s i s a n d c l o n i n g o f
t h e
s o m a t o s t a t i n
g e n e .
A
e c o n d t y p e o f o r g a n i c
s y n t h e s i s
i s t h e
p h o s p h o d i
e s t e r
method, which h a s
been u t i l i z e d t o p r e p a r e a
tRNA
e n e .
S e e Brown,
E .
L . , e t a l . , M e t h . E n z y m o L ,
6 8 ,
1 0 9 ( 1 9 7 9 )
f o r
a
d e s c r i p t i o n o f h i s m e t h o d .
As
n t h e
p h o s p h o t r i e s t e r m e t h o d ,
t h e
p h o s p h o d i e s t e r
m e t h o d
i n v o l v e s s y n t h e s i s
o f
o l i g o n u c l e o t i d e s
which
a r e s u b s e
q u e n t l y j o i n e d t o g e t h e r t o f o r m t h e d e
s i r e d n u c l e i c
a c i d .
A l t h o u g h
t h e
a b o v e
p r o c e s s e s
f o r d e novo
s y n t h e s i s
may
b e u t i l i z e d t o
s y n t h e s i z e l o n g s t r a n d s o f n u c l e i c
a c i d , t h e y a r e n o t
v e r y
p r a c t i c a l
t o u s e f o r
t h e s y n t h e s i s
o f l a r g e amounts of a n u c l e i c a c i d . Both p r o c
e s s e s ar e
40
4 5
6 5
2
l a b o r i o u s
a n d t i m e - c o n s u m i n g ,
r e q u i r e
e x p e n s i v e e q u i p
ment
and
r e a g e n t s ,
and
have a
low
o v e r a l l e f ? c i e n c y .
The
low
o v e r a l l e f ? c i e n c y may
b e c a u s e d
b y t h e i n e f ?
c i e n c i e s o f t h e s y n t h e s i s o f t h e o l i g o
n u c l e o t i d e s
a n d
o f
t h e
j o i n i n g
r e a c t i o n s .
I n
t h e
s y n t h e s i s o f a l o n g n u c l e i c
a c i d ,
or
even
i n
t h e
s y n t h e s i s
of
a l a r g e
amount
of
a
s h o r t e r n u c l e i c a c i d ,
many o l i g o n u c l e o t i d e s w o u l d n e e d
t o
b e s y n t h e s i z e d
a n d
many j o i n i n g r e a c t i o n s
would
b e
r e q u i r e d . C o n s e q u e n t l y , t h e s e m e t h o
d s would
n o t
b e
p r a c t i c a l
f o r
s y n t h e s i z i n g l a r g e a m o u n t s o f a n y
d e s i r e d
n u c l e i c
a c i d .
Methods
a l s o e x i s t f o r p r o d u c i n g n u c l e i c a c i d
s i n
l a r g e amounts f r o m
s m a l l
amounts
o f
t h e i n i t i a l e x i s t i n g
n u c l e i c a c i d .
These methods
i n v o l v e t h e c l o n i n g o f a
n u c l e i c a c i d
i n
t h e
a p p r o p r i a t e
h o s t s y s t e m , where t h e
d e s ir e d n u c l e i c a c i d
i s i n s e r t e d i n t o a n
a p p r o p r i a t e
vec
t o r
which i s u s e d
t o
t r a n s f o r m t h e
h o s t . When
t h e h o s t
i s c u l t u r e d t h e v e c t o r i s
r e p l i c a t e d , and hence
more
c o p i e s
of
t h e d e s i r e d n u c l e i c a c i d a r e produced. For
a
b r i e f
d e s c r i p t i o n
o f s u b c l o n i n g
n u c l e i c a c i d f r a g m e n t s ,
s e e
M a n i a t i s ,
T . ,
e t
a l . , M o l e c u l a r C l o n i n g : A L a b o r a t o r
y
M a n u a l , C o l d S p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r
y , p p . 3 9 0 - 4 0 1
( 1 9 8 2 ) .
S e e a l s o
t h e
t e c h n i q u es d e s c r i b e d i n U . S . P a t .
N o s . 4 , 4 1 6 , 9 8 8 a n d 4 , 4 0 3 , 0 3 6 .
A t h i r d method f o r s y n t h e s iz i n g n u c l e i c a
c i d s , d e
s c r i b e d
i n U . S .
P a t . No. 4 , 2 9 3 , 6 5 2 , i s a
h y b r i d o f
t h e
a b o v e - d e sc r i b e d o r g a n i c
s y n t h e s i s a n d m o l e c u l a r c l o n
i n g
m e t h o d s . I n t h i s p r o c e s s ,
t h e
a p p r o p r i a t e number o f
o l i g o n u c l e o t i d e s
t o make
u p t h e d e s i r e d n u c l e i c a c i d
s e q u e n c e
s o r g a n i c a l l y sy n t h e s i z e d a n d i n s e r t e
d s e q u e n
t i a l l y i n t o a v e c t o r w h i c h i s
a m p l i ? e d
b y g r o w t h
p r i o r
t o e a c h s u c c e e d i n g
i n s e r t i o n .
The p r e s e n t i n v e n t i o n b e a r s some s i m i l a r
i t y
t o
t h e
m o l e c u l a r
c l o n i n g
m e t h o d ;
h o w e v e r , i t d o e s n o t i n v o l v e
t h e p r o p a g a t i o n o f a n y o r g a n i s m a n d t h
e r e b y
a v o i d s
t h e
p o s s i b l e h a z a r d s o r i n c o n v e n i e n c e
which t h i s e n t a i l s .
The
p r e s e n t
i n v e n t i o n
a l s o
d o e s n o t
r e q u i r e
s y n t h e s i s o f
n u c l e i c a c i d
s e q u e n c e s u n r e l a t e d t o
t h e d e s i r e d
s e
q u e n c e , a n d t h e r e b y
t h e
p r e s e n t
i n v e n t i o n
o b v i a t e s
t h e
n e e d f o r e x t e n s i v e
p u r i ? c a t i o n
o f t h e
p r o d u c t
f r o m a
c o m p l i c a t e d b i o l o g i c a l
m i x t u r e .
SUMMARY OF
THE INVENTION
The
p r e s e n t
i n v e n t i o n r e s i d e s i n
a p r o c e s s
f o r a m p l i
f y i n g one o r more s p e c i ? c n u c l e i c a c i d
s e q u e n c e s
p r e s
e n t
i n a n u c l e i c a c i d o r
m i x t u r e
t h e r e o f u s i n g p r i m e r s
a n d
a g e n t s
f o r
p o l y m e r i z a t i o n
a n d
t h e n
d e t ec t i n g t h e
a m p l i ? e d
s e q u e n c e .
The e x t e n s i o n
p r o d u c t
o f o n e
p r i m e r
when
h y b r i d i z e d
t o t h e
o t h e r becomes a
tem
p l a t e f o r t h e
p r o d u c t i o n
o f t h e
d e s i r e d
s p e c i ? c n u c l e i c
a c i d s e q u e n c e ,
and
v i c e v e r s a ,
and
t h e
p r o c e s s i s r e
p e a t e d
a s o f t e n a s i s n e c e s s a r y
t o
produce t h e d e s i r e d
amount o f
t h e s e q ue n c e . T h i s method
i s
e x p e c t e d t o
b e
more
e f ? c i e n t
t h a n t h e
methods
d e s c r i b e d above
f o r
p r o d u c i n g l a r g e
amounts
o f
n u c l e i c a c i d from a t a r g e t
sequence and
t o
produce s u c h
n u c l e i c
a c i d i n a com p ar
a t i v e l y s h o r t p e r i o d o f t i m e . The
p r e s e n t
m e t h o d i s
e s p e c i a l l y
u s e f u l f o r a m p l i f y i n g
r a r e s p e c i e s
o f n u c l e i c
a c i d p r e s e n t i n a m i x t u r e o f n u c l e i c a c
i d s
f o r
e f f e c t i v e
d e t e c t i o n
o f s u c h
s p e c i e s .
More
s p e c i ? c a l l y , t h e p r e s e n t i n v e n t i o
n
p r o v i d e s
a
p r o c e s s f o r
d e t e c t i n g
t h e
p r e s e n c e
o r a b s e n c e o f
a t l e a s t
one s p e c i ? c n u c l e i c a c i d s e q u e n c e i n a s
a m p l e c o n t a i n
i n g
a n u c l e i c a c i d
o r m i x t u r e
o f
n u c l e i c a c i d s , o r
d i s t i n
g u i s h i n g b e t w e e n
two
d i f f e r e n t
f o r m s o f s e q u e n c e s i n
s a i d s a m p l e , w h e r e i n
t h e
s a m p l e i s
s u s p e c t e d
o f c o n t a i n
-
8/12/2019 PCR - Patent - 1986
15/36
4 , 6 8 3 , 1 9 5
3
i n g s a i d sequence
o r s e q u e n c e s ,
which
p r o c e s s com
p r i s e s :
( a )
t r e a t i n g t h e s a m p l e
w i t h
o n e
o l i g o n u c l e o t i d e
p r i m e r f o r e a c h s t r a n d
o f
e a c h d i f f e r e n t s p e c i ? c s e
q u e n c e s u sp e c t e d o f b e i n g
p r e s e n t i n t h e s a m p l e , u n d e r
h y b r i d iz i n g c o n d i t i o n s s u c h
t h a t
f o r e a c h s t r a n d
o f
e a c h
d i f f e r e n t sequence
t o
b e d e t e c t e d a n e x t e n s i o n product
o f e a c h p r i m e r
i s s y n t h e s i z e d
w h i c h
i s
c o m p l e m e n t a r y
t o each
n u c l e i c a c i d
s t r a n d ,
wherein s a i d
primer
o r
p r i m e r s a r e s e l e c t e d
s o
a s t o
be
s u b s t a n t i a l l y comple
mentary t o
e a c h s t r a n d o f e a c h s p e c i ? c s e q u e n c
e
s u c h
t h a t
t h e
e x t e n s i o n
p r o d u c t
s y n t h e s i z e d
f r o m
o n e
p r i m e r ,
when
t
i s
separated f r o m i t s com plement, can serve a s
a t e m p l a t e
f o r
s y n t h e s i s
o f t h e
e x t e n s i o n
p r o d u c t
o f t h e
o t h e r
p r i m e r ;
( b )
t r e a t i n g t h e s a m p l e
u n d e r d e n a t u r i n g
c o n d i t i o n s t o
s e p a r a t e t h e p r i m e r
e x t e n s i o n
p r o d u c t s
f r o m
t h e i r t e m
p l a t e s
i f
t h e sequence
o r sequences
t o
be d e t e c t e d
a r e
p r e s e n t ;
( c )
t r e a t i n g
t h e s a m p l e w i t h o l i g o n u c l e o t i d e s p r i
m e r s
s u c h
t h a t a
p r i m e r e x t e n s i o n p r o d u c t i s s y n t h e s i
z e d
u s i n g
e a c h o f
t h e
s i n g l e
s t r a n d s
p r o d u c e d i n
s t e p
( b ) a s
a t e m p l a t e , r e s u l t i n g i n
a m p l i? c a t i o n o f
t h e s p e c i ? c
n u c l e i c
a c i d sequence o r s e q u e n c e s i f p r e s e n t ;
( d ) a d d i n g
t o t h e
p r o d u c t o f s t e p ( c )
a l a b e l e d
p r o b e
c a p a b l e o f h y b r i d i z i n g t o
s a i d
s e q u e n c e b e i n g d e t e c t e d
or a
mutation
t h e r e o f ;
a nd
( e )
d e t e r m i n i n g w h e t h e r
s a i d
h y b r i d i z a t i o n
h a s o c
c u r r e d .
The
s t e p s
( a ) ( c ) may b e c o n d u c t e d s e q u e n t i a l l y o
r
s i m u l t a n e o u s l y .
I n
a d d i t i o n , s t e p s
( b ) a n d
( c )
may
b e
r e p e a t e d u n t i l t h e d e s i r e d
l e v e l
o f s e q ue n c e a m p l i ? c a
t i o n i s o b t a i n e d .
I n
o t h e r e m b o d i m e n t s t h e
i n v e n t i o n
r e l a t e s
t o d i a g
n o s t i c
k i t s
f o r t h e d e t e c t i o n o f a t l e a s t one s p e c i ?
c nu
c l e i c
a c i d
sequence i n
a
sample containing one or m o r e
n u c l e i c a c i d s
a t
l e a s t one
of
which n u c l e i c a c i d i s s u s
p e c t e d o f c o n t a i n i n g s a i d s e q u e n c e
,
which
k i t c o m
p r i s e s , i n p a c k a g e d
f o r m ,
a m u l t i c o n t a i n e r
u n i t
h a v i n g
( a ) o n e
c o n t a i n e r f o r
e a c h
o l i g o n u c l e o t i d e
p r i m e r f o r
e a c h
s t r a n d
o f e a c h
d i f f e r e n t
s e q u e n c e
t o
b e
d e t e c t e d ,
which p r i m e r o r p r i m e r s
a r e
s u b s t a n t i a l l y complemen
t a r y t o
e a c h s t r a n d o f e a c h s p e c i ? c n u c l e i c a c
i d s e
quence s u c h t h a t a n e x t e n s i o n p r o d u c t s y n
t h e s i z e d from
o n e p r i m e r , when t i s
s e p a r a t e d
f r o m
i t s c o m p l e m e n t ,
can s e r v e
a s a
template f o r t h e
s y n t h e s i s
of
t h e
e x t e n s i o n
p r o d u c t o f t h e
o t h e r
p r i m e r ;
( b ) a c o n t a i n e r c o n t a i n i n g
a n
a g e n t f o r
p o l y m e r i z a
t i o n ;
( 0 ) a
c o n t a i n e r
f o r e a c h
o f f o u r
d i f f e r e n t
n u c l e o s i d e
t r i p h o s p h a t e s ;
( d ) a
c o n t a i n e r c o n t a i n i n g
a p r o b e c a p a b l e o f d e t e c t
i n g
t h e
p r e s e n c e o f s a i d s e q u e n c e i n s a i d s a m p
l e ; a n d
( e )
a c o n t a i n e r c o n t a in i n g means f o r
d e t e c t i n g
hy
b r i d s o f s a i d p r o b e a n d s a i d
s e q u e n c e .
I n y e t
a n o t h e r
embodiment, t h e i n v e n t i o n
r e l a t e s
t o a
p r o c e s s f o r c l o n i n g i n t o a
v e c t o r
a s p e c i ? c n u c l e i c a c i d
sequence contained i n
a n u c l e i c a c i d
or
a
mixture of
n u c l e i c a c i d s ,
w h i c h
p r o c e s s
c o m p r i s e s :
( a ) t r e a t i n g t h e n u c l e i c
a c i d ( s )
w i t h
o n e
o l i g o n u c l e o
t i d e p r i m e r
f o r
e a c h s t r a n d o f e a c h
d i f f e r e n t
s p e c i ? c
s e q u e n c e b e i n g a m p l i? e d , u n d e r c o n d i t
i o n s
s u c h t h a t
f o r
e a c h
s t r a n d
o f e a c h
d i f f e r e n t
s e q u e n c e b e i n g a m p l i
? e d
a n
e x t e n s i o n p r o d u c t o f e a c h p r i m e r i s s y
n t h e s i z e d
which i s
c o m p l e m e n t a r y
t o e a c h
n u c l e i c a c i d
s t r a n d ,
wherein s a i d primer
or primers
a r e s e l e c t e d s o a s t o
be
s u b s t a n t i a l l y
c o m p l e m e n t a r y t o
e a c h
s t r a n d
o f e a c h
s p e c i ? c s e q u e n c e
s u c h
t h a t t h e e x t e n s i o n p r o d u c t s y n
4
t h e s i z e d f r o m
o n e p r i m e r ,
when
t i s s e p a r a t e d
f r o m
i t s
complement,
can s e r v e a s
a template f o r s y n t h e s i s
of
t h e
e x t e n s i o n p r o d u c t o f t h e
o t h e r
p r i m e r , a n d w h e r e i n s a i d
primer o r p r i m e r s
each c o n t a i n
a
r e s t r i c t i o n s i t e on
i t s 5
end
which i s
t h e
same
a s
or d i f f e r e n t from t h e r e s t r i c
_
t i o n
s i t e ( s )
on
t h e
other
p r i m e r ( s ) ;
0
20
2 5
4 0
50
5 5
60
( b ) s e p a r a t i n g t h e
p r i m e r
e x t e n s i o n
p r o d u c t s f r o m
t h e
t e m p l a t e s o n which t h e y were
s y n t h e s i z e d t o p r o d u c e
s i n g l e - s t r a n d e d
m o l e c u l e s ;
( 0 ) t r e a t i n g t h e s i n g l e - s t r a n d e d
m o l e c u l e s
g e n e r a t e d
f r o m s t e p
( b ) w i t h
o l i g o n u c l e o t i d e p r i m e r s
s u c h
t h a t a
p r i m e r e x t e n s i o n p r o d u c t
i s
s y n t h e s i z e d u s i n g e a c h o f
t h e
s i n g l e s t r a n d s produced
i n
s t e p
( b ) a s
a t e m p l a t e ,
w h e r e i n
d e p e n d i n g
o n
t h e p a r t i c u l a r s e q u e n c e
b e i n g
a m p l i ? e d , s t e p s
( a )
a n d ( c ) a r e c a r r i e d
o u t i n
t h e p r e s
ence of
from
0
up
t o an
e f f e c t i v e a mount
of dimethyl
s u l f o x i d e
or a t
a
temperature of
up
t o about
4 5 C . ;
( d )
a d d i n g
t o t h e
p r o d u c t
o f s t e p ( c ) a r e s t r i c t i o n
enzyme
f o r e a c h
o f
s a i d r e s t r i c t i o n
s i t e s t o o b t a i n
c l e a v e d p r o d u c t s
i n
a
r e s t r i c t i o n d i g e s t ;
a n d
( e ) l i g a t i n g
t h e
c l e a v e d p r o d u c t ( s ) i n t o one o r more
c l o n i n g v e c t o r s .
I n y e t
a n o t h e r
e m b o d i m e n t , t h e i n v e n t i o n h e r e i n
r e l a t e s t o a p r o c e s s f o r s y n t h e s i z i n g
a n u c l e i c a c i d
f r a g
ment f r o m a n
e x i s t i n g
n u c l e i c
a c i d
f r a g m e n t h a v i n g
f e w e r n u c l e o t i d e s
t h a n
t h e
f r a g m e n t
b e i n g s y n t h e s i z e d
a n d
two
o l i g o n u c l e o t i d e p r i m e r s ,
w h e r e i n
t h e
n u c l e i c
a c i d b e i n g s y n t h e s i z e d i s
c o m p r i s e d
o f
a l e f t
s e g m e n t ,
a
c o r e segment and
a
r i g h t s e g m e n t , and wherein
t h e
c o r e
s e g m e n t r e p r e s e n t s a t l e a s t s u b s t a n t
i a l l y t h e n u c l e o t i d e
s e q u e n c e o f s a i d e x i s t in g
n u c l e i c
a c i d f r a g m e n t , a n d t h e
r i g h t a n d l e f t s e g m e n t s r e p r e s e n t t h e
s e q u e n c e
n u c l e o
t i d e p r e s e n t i n t h e 5 e n d s o f t h e two p r i m
e r s, t h e 3 ' e n d s
o f
which
a r e complementary o r s u b s t a n t i a l l y comple
m e n t a r y t o t h e 3 ' e n d s o f t h e s i n g l e s t r
a n d s p r o d u c e d b y
s e p a r a t i n g
t h e
s t r a n d s
o f
s a i d e x i s t i n g n u c l e i c a c i d f r a g
m e n t , w h i c h p r o c e s s c o m p r i s e s :
( a ) t r e a t i n g t h e s t r a n d s o f
s a i d
e x i s t i n g f r a g m e n t w i t h
two o l i g o n u c l e o t i d e
p r i m e r s
u n d e r c o n d i t i o n
s u c h t h a t
a n e x t e n s i o n p r o d u c t o f e a c h p r i m e r i s
s y n t h e s i z e d
which i s complementary
t o e a c h
n u c l e i c a c i d
s t r a n d ,
wherein
s a i d
primers
a r e s e l e c t e d
s o a s
t o
be s u b s t a n
t i a l l y
complementary
t o
t h e
3 e n d o f e a c h
s t r a n d o f
s a i d
e x i s t i n g
f r a g m e n t s uc h
t h a t
t h e
e x t e n s i o n
p r o d u c t s y n
t h e s i z e d from
one
p r i m e r , when t i s s e p a r a t e d from i t s
complement, can
s e r v e
a s a t e m p l a t e
f o r s y n t h e s i s o f
t h e
e x t e n s i o n
p r o d u c t
o f
t h e o t h e r p r i m e r ,
a n d w h e r e i n
e a c h p r i m e r c o n t a i n s , a t i t s 5
e n d , a
s e q u e n c e o f n u c l e o
t i d e s which a r e
n o t
complementary t o s a i d e x i s t i n g
f r a g m e n t
a n d which
c o r r e s p o n d
t o t h e
two e n d s o f
t h e
n u c l e i c a c i d f r a g m e n t
b e i n g
s y n t h e s i z e d ;
( b )
s e p a r a t i n g t h e
p r i m e r
e x t e n s i o n
p r o d u c t s
f r o m t h e
t e m p l a t e s
on
which
t h e y were s y n t h e s i z e d t o
p r o d u c e
s i n g l e - s t r a n d e d m o l e c u l e s ;
( c )
t r e a t i n g
t h e
s i n g l e - s t r a n d e d m o l e c u l e s
g e n e r a t e d
f r o m s t e p ( b ) w i t h
t h e p r i m e r s
o f s t e p ( a ) u n d e r c o n d i
t i o n s
s u c h t h a t
a p r i m e r e x t e n s i o n
p r o d u c t
i s s y n t h e s i z e d
u s i n g e a c h o f t h e
s i n g l e s t r a n d s p r o d u c e d
i n s t e p
( b ) a s
a template s o a s t o produce
t wo
i n t e r m e d i a t e double
s t r a n d e d n u c l e i c
a c i d m o l e c u l e s , i n t o e a c h o f
which h a s
b e e n
i n c o r p o r a t e d t h e n u c l e o t i d e
s e q u e n c e
p r e s e n t
i n
t h e
5 '
e n d o f
one
o f t h e o l i g o n u c l e o t i d e p r i m e r s ,
and
two u l l - l e n g t h d o u b l e - s t r a n d e d
n u c l e i c a c i d
m o l e c u l e s ,
i n t o
e a c h
o f which h a s
b e e n
i n c o r p o r a t e d
t h e
n u c l e o t i d e
s e q u e n c e p r e s e n t
i n
t h e 5
e n d s o f b o t h
o f t h e o l i g o n u
c l e o t i d e
p r i m e r s ;
-
8/12/2019 PCR - Patent - 1986
16/36
4 , 6 8 3 , 1 9 5
5
( d )
r e p e a t i n g
s t e p s ( b ) a n d ( c ) f o r
a
s u f ? c i e n t number
o f
t i m e s
t o p r o d u c e t h e
f u l l - l e n g t h
d o u b l e - s t r a n d e d
molecule i n
an
e f f e c t i v e amount;
( e )
t r e a t i n g
t h e
s t r a n d s
o f t h e
p r o d u c t
o f
s t e p
( d ) w i t h
two
p r i m e r s s o
a s t o
l e n g t h e n t h e p r o d u c t
o f
s t e p
( d ) on
b o t h
e n d s ;
a n d
( D r e p e a t i n g
s t e p s
( a ) - ( d ) u s i n g t h e p r o d u c t o f
t e p ( d )
a s
t h e
c o r e
f r a g m e n t a n d two
o l i g o n u c l e o t i d e
p r i m e r s
which a r e complementary o r s u b s t a n t i a l l y
complemen
t a r y t o t h e
3
e n d s o f t h e s i n g l e s t r a n d s p r o d u c e d b
y
s e p a r a t i n g t h e s t r a n d s o f t h e
p r o d u c t
o f s t e p ( d ) .
The
c o r e f r a g m e n t
may
b e o b t a i n e d
b y
t h e
s t e p s
c o m p r i s i n g :
( a ) r e a c t i n g two o l i g o n u c l e o t i d e s , e a
c h o f which c o n
t a i n a t t h e i r 3 ' ends a n u c l e o t i d e sequence
which
i s
complementary t o
t h e o t h e r o l i g o n u c l e o t i d e a t i t s 3
e n d , and which a r e non-complementary t o each
o t h e r
a t
t h e i r
5 '
e n d s ,
w i t h
a n
a g e n t f o r p o l y m e r i z a t i o n a n d f o u r
n u c l e o s i d e t r i p h o s p h a t e s u n d e r c o n d
i t i o n s s u c h
t h a t
a n
e x t e n s i o n p r o d u c t o f
e a c h
o l i g o n u c l e o t i d e i s
s y n t h e
s i z e d which i s complementary t o
e a c h
n u c l e i c a c i d
s t r a n d ;
( b ) s e p a r a t i n g t h e e x t e n s i o n p r o d u c t
s f r o m t h e t e m
p l a t e s on which t h e y were
s y n t h e s i z e d
t o
produce s i n
g l e - s t r a n d e d m o l e c u l e s ; a n d
( c ) t r e a t i n g t h e s i n g l e - s t r a n d e d
m o l e c u l e s g e n e r a t e d
f r o m
s t e p
( b ) w i t h t h e o l i g o n u c l e o t i d e s o f
s t e p
( a )
u n d e r
c o n d i t i o n s s u c h t h a t a p r i m e r e x t e n s i
o n p r o d u c t i s s y n
t h e s i z e d
u s i n g e a c h o f t h e s i n g l e s t r a n d s p r o d u
c e d
i n
s t e p ( b )
a s a t e m p l a t e , r e s u l t i n g i n
a m p l i ? c a t i o n
o f t h e
c o r e
f r a g m e n t .
BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS
FIG.
1
i l l u s t r a t e s
a
9 4
b a s e
p a i r
l e n g t h
s e q u e n c e o f
human B - g l o b i n d e s i r e d t o b e a m p l i ? e d .
The i n g l e
b a s e
p a i r
c h a n g e which s a s s o c i a t e d w i t h s i c k l e c e
l l a n e m i a
i s d e p i c t e d
b e n e a t h
t h e
9 4 - m e r .
FIG. 2 i l l u s t r a t e s
a photograph
o f a n ethidium bro
m i d e - s t a i n e d p o l y a c r y l a m i d e
g e l d e m o n s t r a t i n g
a m p l i ?
c a t i o n o f t h e 9 4 - m e r c o n t a i n e d
i n human
w i l d - t y p e
DNA n d i n
a
p l a s m i d c o n t a i n i n g
a 1 . 9 kb
B a m I - I I f r a g
m e n t o f t h e n o r m a l
B - g l o b i n
g e n e ( p B R 3 2 8 : I - I b A ) .
FIG. 3 i l l u s t r a t e s a
photograph
o f a n e t h i d i u m bro
m i d e - s t a i n e d
p o l y a c r y l a m i d e
g e l
d e m o n s t r a t i n g
a m p l i ?
c a t i o n o f
a n y
o f t h e s p e c i ? c t a r g e t 9 4 - m e r s e q u e n c
e
p r e s e n t i n
pBR328:HbA,
a p l a s m i d c o n t a i n i n g a 1 . 9 k b
BamHI
f r a g m e n t
o f t h e s i c k l e c e l l
a l l e l e
o f B - g l o b i n
( p B R 3 2 8 z H b S ) ,
pBR328zHbA
w h e r e t h e s e q u e n c e
t o
b e
a m p l i ? e d i s c l e a v e d w i t h
M s t I I ,
a n d pBR328zHbS
where t h e s e q u e n c e
t o
b e a m p l i ? e d h a s
b e e n t r e a t e d
b u t
n o t c l e a v e d with M s t I I .
FIG.
4
i l l u s t r a t e s
i n d e t a i l t h e
s t e p s
a n d p r o d u c t s o f
t h e
p o l y m e r a s e
c h a i n r e a c t i o n
f o r
a m p l i? c a t i o n o f t h e
d e s i r e d
9 4 - m e r
s e q u e n c e
o f
human , B - g l o b i n f o r t h r e e
c y c l e s
u s i n g
t w o o l i g o n u c l e o t i d e s
p r i m e r s .
FIG. 5 r e p r e s e n t s a photograph
o f
a n
e t h i d i u m b r o
m i d e - s t a i n e d p o l y a c r y l a m i d e
g e l d e m o n s t r a t i n g
a m p l i ?
c a t i o n
a f t e r
f o u r
c y c l e s
o f
a 2 4 0 - m e r
s e q u e n c e i n
pBR328zHbA, w h e r e t h e
a l i q u o t s
a r e d i g e s t e d w i t h
NcoI
( L a n e 3 ) ,
M s t I I
( L a n e 4 ) o r H i n f l ( L a n e 5 ) . L a n e
1 i s t h e m o l e c u l a r w e i g h t
s t a n d a r d
a n d Lane 2 c o n t a i n s
t h e
i n t a c t
2 4 0 - b p
p r o d u c t .
F I G . 6
i l l u s t r a t e s
t h e s e q u e n c e
o f
t h e n o r m a l ( 1 3 ) a n d
s i c k l e
c e l l ( B 5 ) B - g l o b i n
g e n e s i n
t h e r e g i o n
o f
t h e
Ddel
a n d H i n f l
r e s t r i c t i o n s i t e s , w h e r e t h e
s i n g l e
l i n e s
f o r
BA
mark
t h e p o s i ti o n
o f t h e DdeI
s i t e (CTGAG)
a n d
t h e
d o u b l e
b a r s f o r
BA
a n d
BS mark t h e p o s i t i o n o f t h e
H i n f l
s i t e
(GACTC).
2 5
3 0
3 5
45
5 0
5 5
6 0
6 5
6
F I G . 7 i l l u s t r a t e s t h e
r e s u l t s
o f s e q u e n t i a l d i g e s t io n o f
n o r m a l B - g l o b i n u s i n g a
4 0 - m e r p r o b e a n d
Ddel
f o l
lowed b y I - I i n f I
r e s t r i c t i o n
e n z y m e s .
F I G . 8 i l l u s t r a t e s t h e r e s u l t s o f s e q u
e n t i a l d i g e s t i o n o f
s i c k l e
, B - g l o b i n
u s i n g
t h e
same
40-mer
p r o b e a s i n FIG.
7 a n d
Ddel f o l l o w e d
by
H i n f l
r e s t r i c t i o n e n z y m e s .
FIG. 9 i l l u s t r a t e s
a photograph
o f a n e t h i d i u m
bro
m i d e - s t a i n e d
p o l y a c r y l a m i d e
g e l d e m o n s t r a t i n g t h e
u s e
o f t h e same
40-mer probe
a s i n FIG. 7 t o s p e c i ? c a l l y
c h a r a c t e r i z e t h e
b e t a - g l o b i n
a l l e l e s
p r e s e n t i n s a m p l e s o f
whole human
DNA
hich
have been
s u b j e c t e d t o a m
p l i ? c a t i o n ,
h y b r i d i z a t i o n
w i t h t h e
p r o b e ,
a n d
s e q u e n t i a l
d i g e s t i o n w i t h
Ddel
a n d H i n f l .
FIG. 1 0 i l l u s t r a t e s a photograph o f
a
6 NuSieve
a g a r o s e g e l v i s u a l i z e d u s i n g e t h i d i u
m b r o m i d e a n d
UV
l i g h t . T h i s p h o t o g r a p h
d e m o n s t r a t es a m p l i ? c a t io n o f
a
s u b - f r a g m e n t o f
a l l O - b p
a m p l i ? c a t i o n
p r o d u c t w h i c h
s u b - f r a g m e n t i s a n i n n e r n e s t e d
s e t
w i t h i n t h e
1 1 0 - b p
f r a g m e n t .
DETAILED
DESCRIPTION
OF THE
PREFERRED EMBODIMENTS
The t e r m
o l i g o n u c l e o t i d e
a s
u s e d
h e r e i n
i n
r e f e r
r i n g t o p r i m e r s , p r o b e s , o l i g o m e r f r a
g m e n t s t o b e d e
t e c t e d ,
o l i g o m e r
c o n t r o l s a n d
u n l a b e l e d
b l o c k i n g
o l i g o
mers s d e ? n e d a s a molecule comprised of two
or
more
d e o x y r i b o n u c l e o t i d e s
o r
r i b o n u c l e o t i d e s ,
p r e f e r a b l y
m o r e t h a n
t h r e e .
I t s e x a c t s i z e
w i l l
depend on m a n y
f a c t o r s ,
which
i n
t u r n
depend
on t h e u l t im a t e f u n c t i o n
o r
u s e
o f t h e o l i g o n u c l e o t i d e .
The term primer a s u s e d h e r e i n
r e f e r s
t o a n
o l i g o
n u c l e o t i d e w h e t h e r
o c c u r r i n g n a t u r a l l y
a s i n - a
p u r i ? e d
r e s t r i c t i o n
d i g e s t o r p r o d u c e d s y n t h e t i c a l l y ,
w h i c h
i s
c a p a b l e o f a c t i n g a s a p o i n t
o f
i n i t i a t i o n o f
s y n t h e s i s
when
p l a c e d u n d e r
c o n d i t i o n s
i n
which
s y n t h e s i s o f a
p r i m e r e x t e n s i o n p r o d u c t which
s
c o m p l e m e n t a r y
t o
a
n u c l e i c
a c i d
s t r a n d i s
i n d u c e d , i . e . , i n
t h e
p r e s e n c e o f
n u c l e o t i d e s and a n
a g e n t
f o r
p o l y m e r i z a t i o n s u c h
a s
DNA o l y m e r a s e a n d
a t a
s u i t a b l e
t e m p e r a t u r e
a n d
pH.
The
p r i m e r
i s
p r e f e r a b l y
s i n g l e
s t r a n d e d
f o r maximum
e f ? c i e n c y
i n a m p l i ? c a t i o n , b u t
may a l t e r n a t i v e l y
b e
d o u b l e s t r a n d e d .
I f
d o u b l e s t r a n d e d , t h e p r i m e r
i s
? r s t
t r e a t e d t o s e p a r a t e i t s s t r a n d s
b e f o r e
b e i n g u s e d t o
p r e
p a r e
e x t e n s io n p r o d u c t s .
P r e f er a b l y , t h e
p r i m e r i s a n
o l i g o d e o x y r i b o n u c l e o t i d e . The p r i m e
r m u s t b e s u f ?
c i e n t l y
l o n g
t o
p r i m e t h e s y n t h e s i s
o f e x t e n s i o n
p r o d u c t s
i n
t h e p r e s e n c e
o f
t h e a g e n t
f o r p o l y m e r i z a t i o n . The
e x a c t l e n g t h s
o f t h e p r i m e r s w i l l d e p e n d on many
f a c
t o r s ,
i n c l u d i n g
t e m p e r a t u r e
a n d
s o u r c e o f
p r i m e r .
For
e x a m p l e , d e p e n d i n g o n t h e
c o m p l e x i t y
of t h e t a r g e t
s e q u e n c e , t h e
o l i g o n u c l e o t i d e p r i m e r
t y p i c a l l y c o n t a i n s
1 5 - 2 5 o r more n u c l e o t i d e s , a l t h o u g h i t
may c o n t a i n
f e w e r
n u c l e o t i d e s . S h o r t
p r i m e r
m o l e c u l e s g e n e r a l l y
r e q u i r e c o o l e r t e m p e r a t ur e s t o f o r m s u
f ? c i e n t l y s t a b l e
h y b r i d c o m p l e x e s w i t h t e m p l a t e .
The
p r i m e r s h e r e i n
a r e s e l e c t e d t o b e
s u b s t a n t i a l l y
c o m p l e m e n t a r y t o t h e d i f f e r e n t s t r a n
d s
o f e a c h s p e c i ? c
s e q u e n c e
t o
b e
a m p l i ? e d . T h i s
means t h a t
t h e p r i m e r s
m u s t b e s u f ? c i e n t l y c o m p l e m e n t a r y t
o
h y b r i d i z e
w i t h
t h e i r
r e s p e c t i v e
s t r a n d s .
T h e r e f o r e , t h e p r i m e r s e q u e n c e
n e e d
n o t r e f l e c t t h e e x a c t s e q u e n c e o f t h e t
e m p l a t e . For
e x a m p l e , a n o n - c o m p l e m e n t a r y n u c l e o
t i d e
f r a g m e n t
may
b e
a t t a c h e d
t o t h e
5
e n d o f t h e p r i m e r , w i t h t h e
r e m a i n d e r o f t h e p r i m e r s e q u e n c e b e i n
g c o m p l e m e n t a r y
t o
t h e
s t r a n d .
A l t e r n a t i v e l y , n o n - c o m p l e m e n t a r y b
a s e s
o r
l o n g e r
s e q ue n c e s c a n b e i n t e r s p e r s e d i n t o
t h e p r i m e r ,
p r o v i d e d
t h a t t h e
p r i m e r s e q u e n c e
h a s s u f f i c i e n t c o m
p l e m e n t a r i t y
with
t h e
sequence o f
t h e
s t r a n d
t o
be a m
-
8/12/2019 PCR - Patent - 1986
17/36
4 , 6 8 3 , 1 9 5
7
p l i ? e d
t o
h y b r i d i z e
t h e r e w i t h and t h e r e b y form
a
tem
p l a t e
f o r s y n t h e s i s
o f t h e e x t e n s i o n
p r o d u c t
o f t h e o t h e r
p r i m e r .
As u s e d h e r e i n , t h e t e r m s r e s t r i c t i o
n
e n d o n u c l e a s e s
a n d r e s t r i c t i o n
enzymes
r e f e r t o b a c t e r i a l
enzymes
each of w h i c h
cut
double-stranded
DNA t or near
a
s p e c i ? c n u c l e o t i d e s e q u e n c e .
As u s e d h e r e i n ,
t h e
term DNA
polymorphism
r e
f e r s t o t h e
condition
i n w h i c h
t w o
or
m o r e
d i f f e r e n t
n u c l e o t i d e s e q u e n c e s c o e x i s t i n
t h e
same i n t e r b r e e d i n g
p o p u l a t i o n
i n
a
DNA e q u e n c e .
The t e r m r e s t r i c t i o n
f r a g m e n t
l e n g t h p o l y m o r
p h i s m
(RFLP)
r e f e r s t o t h e d i f f e r en c e s i n DNA
n u c l e o t i d e
s e q u e n c e s
t h a t
a r e
randomly d i s t r i b u t e d
t h r o u g h o u t
t h e
e n t i r e human genome a n d t h a t p r o d u c e
d i f f e r e n t r e s tr i c t i o n
e n d o n u c l e a s e
p a t t e r n s .
The
p r e s e n t i n v e n t i o n
i s
d i r e c t e d
t o a p r o c e s s f o r
a m p l i f y i n g
any
one o r m o r e d e s i r e d s p e c i ? c n u c l e i c
a c i d
s e q u e n c e s
s u s p e c t e d
o f b e i n g
i n
a
n u c l e i c
a c i d .
Because
l a r g e amounts o f a
s p e c i ? c s e q u e n c e
may
b e
p r o d u c e d b y
t h i s
p r o c e s s , t h e p r e s e n t
i n v e n t i o n
may
b e
u s e d
f o r i m p r o v i n g t h e
e f f i c i e n c y o f c l o n i n g
DNA
r
messenger
RNA
nd
f o r a m p l i f y i n g a t a r g e t sequence
t o
f a c i l i t a t e
d e t e c t i o n t h e r e o f .
I n g e n e r a l , t h e p r e s e n t p r o c e s s i n v o l
v e s a c h a i n r e a c
t i o n f o r p r o d u c i n g , i n e x p o n e n t i a l q u
a n t i t i e s
r e l a t i v e
t o
t h e number o f r e a c t i o n s t e p s i n v o l v e d , a
t
least one s p e
c i ? c n u c l e i c a c i d
sequence g i v e n ( a ) t h a t
t h e e n d s
o f
t h e
r e q u i r e d
s e q u e n c e
a r e known
i n
s u f ? c i e n t
d e t a i l
t h a t
o l i g o n u c l e o t i d e s c a n b e s y n t h e s i z e d
w h i c h
w i l l
h y b r i d
i z e t o
t h e m ,
and ( b ) t h a t
a
s m a l l
amount o f t h e
s e q u e n c e
i s a v a i l a b l e t o i n i t i a t e t h e c h a i n r e a
c t i o n . The p r o d u c t
o f
t h e c h a i n
r e a c t i o n
w i l l be a
d i s c r e t e
n u c l e i c a c i d
d u p l e x
w i t h
t e r m i n i c o r r e s p o n d i n g t o t h e e n d s o f t
h e s p e c i ? c
p r i m e r s
e m p l o y e d .
Any
s o u r c e o f
n u c l e i c
a c i d ,
i n
p u r i ? e d o r n o n p u r i ? e d
f o r m , can be
u t i l i z e d
a s t h e s t a r t i n g n u c l e i c a c i d
or
a c i d s , p r o v i d e d i t i s s u s p e c t e d
o f c o n t a i n i n g
t h e s p e c i ? c
n u c l e i c a c i d
s e q u e n c e
d e s i r e d .
T h u s ,
t h e
p r o c e s s
may
e m p l o y , f o r e x a m p l e ,
DNA
r RNA, i n c l u d i n g m e s s e n
. ger RNA,
which DNA r
RNA
ay
be
s i n g l e stranded
o r d o u b l e s t r a n d e d .
I n
a d d i t i o n , a
DNA-RNA
y b r i d
which c o n t a i n s
one
s t r a n d
o f each may
be
u t i l i z e d . A
m i x t u r e o f any o f
t h e s e n u c l e i c
a c i d s
m ay
a l s o be em
p l o y e d , o r t h e n u c l e i c a c i d s produced
f r o m
a p r e v i o u s
a m p l i ? c a t i o n r e a c t i o n
h e r e i n
u s i n g t h e same o r d i f f e r e n t
p r i m e r s may
b e
s o
u t i l i z e d . The
s p e c i ? c n u c l e i c
a c i d
sequence t o
be ampli?ed
may
be o n l y
a f r a c t i o n o f a
l a r g e r
molecule
o r
can be
p r e s e n t
i n i t i a l l y
a s a d i s c r e t e
m o l e c u l e , s o
t h a t
t h e s p e c i ? c
s e q u e n c e
c o n s t i t u t e s t h e
e n t i r e
n u c l e i c
a c i d . I t i s
n o t
n e c e s s a r y
t h a t t h e sequence
t o
b e
a m p l i ? e d
b e
p r e s e n t
i n i t i a l l y
i n a p u r e f o r m ; i t may
be a
minor f r a c t i o n
o f a complex m i x t u r e , such
a s
a
p o r t i o n
o f
t h e
B - g l o b i n
g e n e
c o n t a i n e d i n whole human
DNA r a
p o r t i o n of
n u c l e i c a c i d sequence due
t o
a
p a r t i c u l a r m i c r o o r g a n i s m w h i c h
o r g a n i s m
m i g h t
c o n s t i
t u t e
o n l y
a
v e r y
minor f r a c t i o n
o f
a p a r t i c u l a r b i o l o g i c a l
s a m p l e .
The
s t a r t i n g n u c l e i c a c i d may c o n t a i n more
t h a n one d e s i r e d s p e c i ? c n u c l e i c a c i d s
e q u e n c e which
m ay be t h e same o r
d i f f e r e n t .
T h e r e f o r e , t h e p r e s e n t
p r o c e s s
i s
u s e f u l
n o t
o n l y f o r p r o d u c i n g l a r g e a m o u n t s
o f
o n e
s p e c i ? c n u c l e i c a c i d
s e q u e n c e , b u t
a l s o f o r a m p l i
f y i n g
s i m u l t a n e o u s l y
more
t h a n
o n e
d i f f e r e n t
s p e c i ? c
n u c l e i c a c i d
sequence l o c a t e d on
t h e same
or
d i f f e r e n t
nucleic acid
molecules. _
The
n u c l e i c a c i d o r a c i d s m ay be
o b t a i n e d
from
any
s o u r c e ,
f o r
e x a m p l e ,
f r o m p l a s m i d s s u c h
a s
pBR322,
from
cloned DNA r RNA, or
from
n a t u r a l
DNA
r
0
5
2 5
3 0
3 5
45
5 5
60
6 5
8
RNA from any s o u r c e , i n c l u d i n g b a c t e r i a , y
e a s t , v i
r u s e s , and h i g h e r
o r g a n i s m s s u c h a s
p l a n t s
o r
a n i m a l s .
DNA
r
RNA m a y
be
e x t r a c t e d from
b l o o d ,
t i s s u e
m a t e r i a l
such
a s
chorionic
v i l l i o r
amniotic c e l l s by a
v a r i e t y
o f t e c h n i q u e s
s u c h
a s t h a t d e s c r i b e d b y
M a n i a t i s
e t
a l . ,
M o l e c u l a r
C l o n i n g : A
L a b o r a t o r y M a n u a l ,
(New
Y o r k :
C o l d
S p r i n g
H a r b o r
L a b o r a t o r y ,
1 9 8 2 ) ,
p p
2 8 0 - 2 8 1 .
Any
s p e c i ? c
n u c l e i c a c i d s e q u e n c e
c a n
b e p r o d u c e d
by t h e p r e s e n t p r o c e s s . I t
i s o n l y
n e c e s s a r y t h a t
a s u f ?
c i e n t
number o f
b a s e s
a t both e n d s o f t h e sequence be
k n o w n i n s u f ? c i e n t
d e t a i l
s o
t h a t
tw o o l i g o n u c l e o t i d e
p r i m e r s
c a n
b e p r e p a r e d
which
w i l l h y b r i d i z e
t o
d i f f e r
e n t
s t r a n d s o f
t h e
d e s i r e d sequence and
a t
r e l a t i v e p o s i
t i o n s a l o n g t h e
s e q u e n c e s u c h
t h a t a n e x t e n s i o n
p r o d u c t
s y n t h e s i z e d
f r o m o n e
p r i m e r ,
when
t i s
s e p a r a t e d f r o m
i t s t e m p l a t e (complement), can
s e r v e
a s a t e m p l a t e
f o r
e x t e n s i o n o f t h e o t h e r p r i m e r i n t o a n u
c l e i c
a c i d
o f
d e ? n e d l e n g t h . The g r e a t e r t h e k n o w l e d
g e
a b o u t
t h e
b a s e s
a t
both
ends
of t h e
s e q u e n c e , t h e
g r e a t e r
can
be
t h e s p e c i ? c i t y
o f
t h e p r i m e r s
f o r
t h e
t a r g e t
n u c l e i c a c i d
s e q u e n c e ,
a n d t h u s t h e g r e a t e r t h e
e f ? c i e n c y o f
t h e
p r o c e s s .
I t w i l l
b e u n d e r s t o o d t h a t t h e w ord p r i m e r a s
used
h e r e i n a f t e r m a y r e f e r
t o
more
t h a n
one
p r i m e r ,
p a r t i c u l a r l y i n t h e c a s e
where t h e r e i s
some
a m b i g u i t y
i n
t h e
i n f o r m a t i o n
r e g a r d i n g t h e
t e r m in a l s e q u e n c e ( s ) o f
t h e f r a g m e n t t o b e
a m p l i ? e d .
For i n s t a n c e , i n t h e c a s e
where
a n u c l e i c
a c i d
s e q u e n c e
i s i n f e r r e d
from p r o t e i n
s e q u e n c e
i n f o r m a t i o n a
c o l l e c t i o n
o f p r i m e r s c o n t a i n in g
s e q u e n c e s r e p r e s e n t i n g a l l p o s s i b l e
c o d o n v a r i a t i o n s
b a s e d
on d e g e n e r a c y
o f
t h e g e n e t i c code
w i l l
b e
u s e d
f o r e a c h s t r a n d . One p r i m e r f r o m t h i s c o
l l e c t i o n w i l l b e
homologous w i t h
t h e e n d o f t h e
d e s i r e d
s e q u e n c e
t o
b e
a m p l i ? e d .
The
o l i g o n u c l e o t i d e
p r i m e r s
may
b e p r e p a r e d
u s i n g
a n y s u i t a b l e
m e t h o d ,
s u c h a s , f o r
e x a m p l e ,
t h e p h o s p h o
t r i e s t e r a n d
p h o s p h o d i e s t e r m e t h o d s
d e s c r i b ed a b o v e ,
or automated embodiments t h e r e o f . I n
one
such auto
mated
embodiment diethylphosphoramidites a r e
used a s
s t a r t i n g m a t e r i a l s a n d may b e s y n t h e s i
z e d
a s
d e s c r i b e d
b y B e a u c a g e e t a l . , T e t r a h e d r o n L e t t e
r s ( 1 9 8 1 ) ,
2 2 : 1 8 5 9 - 1 8 6 2 . One
m e t h o d f o r s y n t h e s i z i n g
o l i g o n u c l e
o t i d e s
on a
modi?ed s o l i d s u p p o r t
i s d e s c r i b e d
i n
US.
P a t .
No. 4 , 4 5 8 , 0 6 6 . I t i s a l s o p o s s i b l e t o u s
e a primer
which h a s been i s o l a t e d from a b i o l o g i c a l s o
u r c e ( s u c h
a s a
r e s t r i c t i o n endonuclease d i g e s t ) .
The s p e c i ? c n u c l e i c a c i d s e q u e n c e
i s
p r o d u c e d b y
u s i n g t h e n u c l e i c a c i d c o n t a i n i n g t h a
t s e q u e n c e a s a
t e m p l a t e .
I f
t h e
n u c l e i c a c i d
c o n t a i n s
two
s t r a n d s ,
i t i s
n e c e s s a r y
t o s e p a r a t e t h e s t r a n d s
o f
t h e n u c l e i c a c i d
b e f o r e i t
can
be
used a s
t h e t e m p l a t e ,
e i t h e r
a s a s e p a r a t e
s t e p o r
s i m u l t a n e o u s l y
w i t h t h e s y n t h e s i s o f t h e p r i m e r
e x t e n s i o n p r o d u c t s . T h i s
s t r a n d
s e p a r a t i o n can be a c
c o m p l i s h e d
b y
a n y s u i t a b l e d e n a t u r i n g m e t h o d
i n c l u d
i n g
p h y s i c a l , c h e m i c a l o r e n z y m a t i c m e a n
s . One p h y s i
c a l
method
o f s e p a r a t i n g
t h e s t r a n d s o f t h e
n u c l e i c a c i d
i n v o l v e s h e a t i n g
t h e n u c l e i c a c i d
u n t i l i t
i s c o m p l e t e l y
(>99%)
d e n a t u r e d . T y p i c a l h e a t d e n a t u r a t i o
n
may
i n v o l v e t e m p e r a t u r e r a n g i n g from
a b o u t
8 0 t o 1 0 5
C .
f o r t i m e s
r a n g i n g
from
a b o u t
1 t o 1 0 m i n u t e s .
S t r a n d
s e p a r a t i o n may a l s o
b e
i n d u c e d
by
a n
enzyme
from
t h e
c l a s s
of enzymes
k n o w n a s h e l i c a s e s or t h e enzyme
RecA, which
h a s
h e l i c a s e
a c t i v i t y
a n d
i n
t h e p r e s e n c e
o f
riboATP
i s
k n o w n t o
d e n a t u r e DNA. The r e a c t i o n
c o n d i t i o n s s u i t a b le f o r s e p a r a ti n g t h
e s t r a n d s o f n u c l e i c
a c i d s w i t h h e l i c a s e s a r e
d e s c r i b e d
by C o l d S p r i n g
Har
b o r S y m p o s i a o n
Q u a n t i t a t i v e
B i o l o g y , V o l .
XLIII
DNA:
R e p l i c a t i o n
a n d R e c o m b i n a ti o n (New Y o r k :
-
8/12/2019 PCR - Patent - 1986
18/36
4 , 6 8 3 , 1 9 5
9
C o l d
S p r i n g Harbor L a b o r a t o r y ,
1 9 7 8 ) , B .
Kuhn e t 2 1 1 . ,
DNA
- l e l i c a s e s , p p .
6 3 - 6 7 .
a n d
t e c h n i q u e s f o r
u s i n g
Rec A a r e
reviewed i n
C .
R a d d i n g ,
A n n . R e v . G e n e t i c s .
1 6 : 4 0 5 - 3 7 ( 1 9 8 2 ) .
I f t h e
o r i g i n a l n u c l e i c a c i d
c o n t a i n i n g t h e s e q u e n c e
t o
b e
a m p l i ? e d i s s i n g l e s t r a n d e d , i t s c o m p
l e m e n t i s
s y n
t h e s i z e d b y
a d d i n g o n e o r
two
o l i g o n u c l e o t i de p r i m e r s
t h e r e t o . I f a n a p p r o p r i a t e s i n g l e p r i
m e r i s a d d e d .
a
p r i m e r
e x t e n s i o n
p r o d u c t
i s s y n t h e s i z e d i n
t h e
p r e s e n c e
o f t h e p r i m e r ,
a n
a g e n t f o r
p o l y m e r i z a t i o n
a n d
t h e f o u r
n u c l e o t i d e s d e s c r i b e d b e l o w .
The
p r o d u c t w i l l b e p a r
t i a l l y c o m p l e m e n t a r y t o
t h e si n g l e - s t r a n d e d
n u c l e i c
a c i d
a n d
w i l l
h y b r i d i z e w i t h
t h e
n u c l e i c a c i d s tr a n d t o
f o r m
a
d u p l e x o f u n e q u a l
l e n g t h
s t r a n d s t h a t
may
t h e n b e
s e p a r a t e d i n t o
s i n g l e s t r a n d s a s d e s c r i b e d
above
t o p r o
d u c e
two s i n g l e
s e p a r a t e d c o m p l e m e n t a r y s t r a n d s . A
l
t e r n a t i v e l y , two a p p r o p r i a t e
p r i m e r s
may
b e a d d e d t o
t h e
s i n g l e - s t r a n d e d
n u c l e i c
a c i d
a n d
t h e r e a c t i o n c a r r i e d
o u t .
I f t h e
o r i g i n a l
n u c l e i c
a c i d
c o n s t i t u t e s
t h e
s e q u e n c e t o
b e
a m p l i ? e d ,
t h e
p r i m e r
e x t en s i o n p r o d u c t ( s )
p r o d u c e d
w i l l b e
c o m p l e t e l y c o m p l e m e n t a r y t o t h e s t r a
n d s o f t h e
o r i g i n a l n u c l e i c a c i d a n d w i l l h y b r i d
i z e t h e r e w i t h t o
f o r m a
d u p l e x
o f
e q u a l
l e n g t h s t r a n d s t o b e
s e p a r a t e d
i n t o s i n g l e - s t r a n d e d m o l e c u l e s .
W hen t h e c o m p l e m e n t a r y s t r a n d s o f t h e n
u c l e i c a c i d
o r
a c i d s a r e s e p a r a t e d ,
whether t h e n u c l e i c a c i d was
o r i g i n a l l y d o u b l e
o r
s i n g l e s t r a n d e d , t h e
s t r a n d s
a r e
r e a d y t o
b e
u s e d a s
a t e m p l a t e
f o r
t h e
s y n t h e s i s o f a d d i
t i o n a l n u c l e i c a c i d
s t r a n d s .
T h i s
s y n t h e s i s c a n b e p e r
f o r m e d
u s i n g a n y
s u i t a b l e m e t h o d .
G e n e r a l l y
i t
o c c u r s
i n a b u f f e r e d a q u e o u s s o l u t i o n , p r e f e
r a b l y a t a
pH
o f
7 - 9 , most p r e f e r a b l y
a b o u t 8 . P r e f e r a b l y , a molar e x c e s s
( f o r c l o n e d n u c l e i c a c i d ,
u s u a l l y
a b o u t 1 0 0 0 : 1
p r i m e r :
t e m p l a t e ,
a n d
f o r
g e n o m i c n u c l e i c a c i d , u s u a l l y a b o u
t
1 0 6 : l p r i m e r z t e m p l a t e ) o f t h e t w o o l i
g o n u c l e o t i d e p r i m
e r s
i s added
t o
t h e b u f f e r c o n t a i n i n g t h e s e p a r a t e
d
tem
p l a t e s t r a n d s . I t
i s u n d e r s t o o d ,
h o w e v e r , t h a t t h e
amount o f complementary s t r a n d
may
n o t b e
k n o w n
i f
t h e p r o c e s s
h e r e i n i s
u s e d
f o r
d i a g n o s t i c
a p p l i c a t i o n s ,
s o
t h a t t h e amount o f
p r i m e r
r e l a t i v e t o t h e amount
o f
complementary s t r a n d
c a n n o t b e
d e t e r m i n e d
w i t h
c e r
t a i n t y .
As a p r a c t i c a l m a t t e r , h o w e v e r , t h e
amount o f
p r i m e r added
w i l l
g e n e r a l l y
be
i n molar e x c e s s
over
t h e
amount o f
c o m p l e m e n t a r y s t r a n d ( t e m p l a te ) when t
h e
s e q u e n c e t o
b e a m p l i ? e d
i s c o n t a i n e d
i n a m i x t u r e o f
c o m p l i c a t e d l o n g - c h a i n
n u c l e i c a c i d s t r a n d s . A l a r g e
m o l a r
e x c e s s
i s
p r e f e r r e d
t o i m p r o v e t h e e f ? c i e n c y o f
t h e p r o c e s s .
T h e
d e o x y r i b o n u c l e o s i d e
t r i p h o s p h a t e s d A T P ,
dCTP,
dGTP
and TTP r e a l s o added t o t h e s y n t h e s i s
m i x t u r e i n a d e q u a t e a m o u n t s
a n d
t h e r e s u l t i n g
s o l u t i o n
i s
h e a t e d t o
a b o u t 9 0 - 1 0 0 C .
f o r from
a b o u t 1
t o 1 0
m i n u t e s , p r e f e r a b l y from
t o 4
m i n u t e s . A f t e r
t h i s
h e a t
i n g
p e r i o d
t h e s o l u t i o n i s
a l l o w e d
t o
c o o l
t o from
2 0 - 4 0
C . ,
w h i c h
s
p r e f e r a b l e f o r
t h e p r i m e r
h y b r i d i z a
t i o n . To t h e c o o l e d m i x t u r e i s
a d d e d a n
a g e n t f o r p o l y
m e r i z a t i o n ,
and
t h e r e a c t i o n i s
allowed t o occur
under
c o n d i t i o n s
known
i n t h e
a r t .
T h i s s y n t h e s i s r e a c t i o n
may occur
a t f r o m
r o o m temperature up
t o
a tempera
t u r e
above which t h e
a g e n t f o r
p o l y m e r i z a t i o n
no
l o n g e r f u n c t i o n s e f ? c i e n t l y .
T h u s ,
f o r e x a m p l e , i f DNA
p o l y m e r a s e
i s
u s e d
a s
t h e
a g e n t
f o r p o l y m e r i z a t i o n ,
t h e
t e m p e r a t u r e
i s g e n e r a l l y no g r e a t e r t h a n
a b o u t
4 5 C .
P r e f e r a b l y a n
amount
o f d i m e t h y l s u l f o x i d e
(DMSO) s
p r e s e n t which i s e f f e c t i v e i n d e t e c t i o n
o f t h e s i g n a l
o r
t h e
t e m p e r a t u r e i s 3 5 4 0 C . Most
p r e f e r a b l y , 5-10%
b y
volume
DMSO
s p r e s e n t
a n d
t h e t e m p e r a t u r e i s
5
2 5
40
45
5 0
6 5
1 0
3 5 - 4 0
C .
For
c e r t a i n a p p l i c a ti o n s , where t h e
s e q u e n
c e s t o b e ampli?ed a r e over
1 1 0
b a s e
p a i r
f r a g m e n t s ,
such a s
t h e HLA
DQ-a r - B
g e n e s ,
an
e f f e c t i v e amount
( e . g . , 10% b y v o l u m e ) o f DMSO s a d d e d t o t h e
a m p l i ?
c a t i o n
m i x t u r e , and t h e r e a c t i o n i s
c a r r i e d a t 3 5 ~ 4 0
C . ,
t o
o b t a i n d e t e c t a b l e r e s u l t s
o r
t o
e n a b l e c l o n i n g .
The
a g e n t
f o r
p o l y m e r i z a t i o n
may
b e
a n y
compound
o r
s y s t e m which w i l l
f u n c t i o n t o a c c o m p l i s h t h e s y n t h e
s i s o f
p r i m e r e x t e n s i o n p r o d u c t s , i n c l u d i n
g e n z y m e s .
S u i t a b l e enzymes f o r t h i s p u r p o s e i n c l u d
e , f o r
e x a m p l e ,
E . c o l i
DNA
o l y m e r a s e I ,
Klenow
f r a g m e n t o f E . 0 0 1 1
DNA
o l y m e r a s e
I ,
T4
DNA
o l y m e r a s e , o t h e r a v a i l
a b l e DNA
o l y m e r a s e s ,
r e v e r s e t r a n s c r i p t a s e , a n d
o t h e r
e n z y m e s ,
i n c l u d i n g h e a t s t a b l e
e n z y m e s , which
w i l l
f a
c i l i t a t e c o m b i n a t i o n
o f t h e
n u c l e o t i d e s i n t h e
p r o p e r
manner
t o
f o r m t h e
p r i m e r
e x t e n s i o n p r o d u c t s which
a r e
complementary t o
e a c h
n u c l e i c a c i d s t r a n d . Gener
a l l y , t h e s y n t h e s i s w i l l b e i n i t i a t e d
a t t h e 3 '
e n d
o f e a c h
p r i m e r a n d
p r o c e e d i n t h e
5 '
d i r e c t i o n
a l o n g t h e
t e m
p l a t e s t r a n d , u n t i l s y n t h e s i s t e r m i n
a t e s ,
p r o d u c i n g
m o l e
c u l e s
o f
d i f f e r e n t l e n g t h s .
There
may
b e
a g e n t s ,
h o w
e v e r ,
which
i n i t i a t e s y n t h e s i s a t t h e
5
end a n d p r o c e e d
i n t h e o t h e r d i r e c t i o n , u s i n g t h e same p r
o c e s s
a s de
s c r i b e d a b o v e .
The
n e w l y s y n t h e s i z e d s t r an d
a n d
i t s c o m p l e m e n t a r y
n u c l e i c
a c i d
s t r a n d
form
a d o u b l e - s t r a n d e d molecule
which i s
u s e d
i n t h e s u c c e e d i n g s t e p s o f
t h e
p r o c e s s . I n
t h e
n e x t s t e p ,
t h e
s t r a n d s
o f t h e d o u b l e - s t r a n d e d
mole
c u l e a r e
s e p a r a t e d u s i n g a n y
o f t h e
p r o c e d u r e s d e
s c r i b e d
a b o v e t o p r o v i d e
s i n g l e - s t r a n d e d m o l e c u l e s .
New n u c l e i c a c i d i s s y n t h e s i z e d
on
t h e s i n g l e
s t r a n d e d
m o l e c u l e s .
A d d i t i o n a l i n d u c i n g
a g e n t , n u c l e o
t i d e s a n d
p r i m e r s may
b e
added
i f
n e c e s s a r y f o r
t h e
r e a c t i o n
t o
p r o c e e d u n d e r
t h e
c o n d i t i o n s p r e s c r i b e d
a b o v e .
A g a i n ,
t h e
s y n t h e s i s
w i l l
b e
i n i t i a t e d a t
one
end
o f t h e o l i g o n u c l e o t i d e p r i m e r s a n d w i
l l p r o c e e d a l o n g
t h e s i n g l e s t r a n d s
o f t h e
t e m p l a t e t o p r o d u c e a d d i t i o n a l
n u c l e i c a c i d . A f t e r t h i s s t e p ,
h a l f o f
t h e
e x t e n s i o n p r o d
u c t w i l l c o n s i s t o f t h e s p e c i ? c n u c l e i
c a c i d
s e q u e n c e
b o u n d e d b y t h e two p r i m e r s .
The
t e p s
o f
s t r a n d s e p a r a t io n
a n d
e x t e n s i o n p r o d u c t
s y n t h e s i s can
b e r e p e a t e d a s o f t e n a s needed
t o
produce
t h e
d e s i r e d
q u a n t i t y o f t h e
s p e c i ? c
n u c l e i c a c i d
s e
q u e n c e .
As w i l l b e
d e s c r i b e d i n
f u r t h e r
d e t a i l b e l o w , t h e
amount
o f t h e s p e c i ? c n u c l e i c
a c i d
s e q u e n c e
p r o d u c e d
w i l l a c c u m u l a t e
i n a n e x p o n e n t i a l
f a s h i o n .
W h e n t
i s d e s i r e d
t o produce
more
t h a n
one
s p e c i ? c
n u c l e i c a c i d s e q u e n c e from t h e ? r s t n u c l
e i c a c i d
o r
m i x t u r e o f
n u c l e i c
a c i d s ,
t h e a p p r o p r i a t e
number
o f
d i f f e r e n t
o l i g o n u c l e o t i d e p r i m e r s a r e u t i l i z e
d . For e x
a m p l e ,
i f two d i f f e r e n t s p e c i ? c n u c l e i c
a c i d
s e q u e n c e s
a r e
t o
b e p r o d u c e d , f o u r p r i m e r s a r e u t i l i z e
d .
Two
f
t h e p r i m e r s
a r e
s p e c i ? c f o r o n e o f
t h e
s p e c i ? c n u c l e i c
a c i d
s e q u e n c e s
and t h e o t h e r two
p r i m e r s
a r e s p e c i ? c
f o r t h e
s e c o n d s p e c i ? c
n u c l e i c a c i d s e q u e n c e . I n
t h i s
manner, each
o f t h e
two
d i f f e r e n t s p e c i ? c
s e q u e n c e s can
b e p r o d u c e d e x p o n e n t i a l l y
b y t h e
p r e s e n t
p r o c e s s .
The p r e s e n t
i n v e n t i o n c a n
b e peformed
n a s t e p - w i s e
f a s h i o n where
a f t e r each
s t e p n e w r e a g e n t s ar e
a d d e d ,
o r s i m u l t a n e o u s l y , where
a l l
r e a g e n t s a r e added a t t h e
i n i t i a l s t e p ,
o r
p a r t i a l l y
s t e p - w i s e
a n d p a r t i a l l y
s i m u l t a
n e o u s , where f r e s h
r e a g e n t i s
added
a f t e r
a
g i v e n
num
b e r o f
s t e p s .
I f
a
method
o f
s t r a n d
s e p a r a t i o n ,
s u c h
a s
h e a t , i s e m p l o y e d w h i c h w i l l i n a c t i v a
t e
t h e
a g e n t
f o r
p o l y m e r i z a t i o n ,
a s i n
t h e c a s e
of
a
h e a t - l a b i l e enzyme,
t h e n
i t
i s n e c e s s a r y
t o r e p l e n i s h
t h e
a g e n t
f o r p o l y m e r i
z a t i o n a f t e r e v e r y
s t r a n d s e p a r a t i o n
s t e p . The
s i m u l t a
neous
method m a y b e
u t i l i z e d
w h e n a number o f p u r i
-
8/12/2019 PCR - Patent - 1986
19/36
4 , 6 8 3 , 1 9 5
1 1
?ed components, i n c l u d i n g an enzymatic means such a
s
h e l i c a s e ,
i s
u s e d
f o r
t h e s t r a n d s e p a r a t i o n s t e p .
I n
t h e
s i m u lt a n e o u s p r o c e d u r e ,
t h e r e a c t i o n
m i x t u r e may con
t a i n , i n a d d i t i o n
t o
t h e n u c l e i c a c i d s t r a n d ( s ) c o n t a i n i n
g
t h e d e s i r e d s e q u e n c e , t h e s t r a n d - s e p
a r a t i n g enzyme
( e . g . , h e l i c a s e ) , a n a p p r o p r i a t e energy
s o u r c e f o r
t h e
s t r a n d - s e p a r a t i n g enzyme, such a s
r AT P,
t h e f o u r
nu
c l e o t i d e s .
t h e
o l i g o n u c l e o t i d e p r i m e r s
i n m o l a r e x c e s s ,
and t h e i n d u c i n g a g e n t , e . g . , Kl eno w
fragment ofE.
c o l i
DNA
olymerase
.
I f h e a t
i s u s e d f o r
d e n a t u r a t i o n i n
a
s i m u l t a n e o u s
p r o c e s s ,
a h e a t - s t a b l e
i n d u c i n g a g e n t
s u c h
a s a t h e r m o s t a b l e
polymerase
may b e
employed which
w i l l
o p e r a t e a t
a n
e l e v a t e d t e m p e r a t u r e , p r e f e r a b l y
6 5 9 0 C .
d e p e n d i n g on t h e i n d u c i n g a g e n t ,
a t which
t e m p e r a t u r e
t h e n u c l e i c
a c i d
w i l l c o n s i s t
o f
s i n g l e a n d
d o u b l e s t r a n d s i n e q u i l i b r i u m .
F o r s m a l l e r
l e n g t h s o f
n u c l e i c a c i d ,
lower
t e m p e r a t ur e s o f
a b o u t
5 0 C . may b e
e m p l o y e d . The u p p e r
t e m p e r a t u r e
w i l l depend on t h e
t e m p e r a t u r e a t which t h e enzyme w i l l d e g r a d
e o r t h e
t e m p e r a t u r e
above which
a n i n s u f ? c i e n t
l e v e l
o f p r i m e r
h y b r i d i z a t i o n
w i l l
o c c u r .
Such
a h e a t - s t a b l e
enzyme
i s
d e s c r i b e d ,
e . g . ,
b y
A .
S .
K a l e d i n
e t a l . ,
B i o k h i m l ' y a ,
4 5 ,
6 4 4 - 6 5 1 ( 1 9 8 0 ) . Each s t e p
o f t h e
p r o c e s s
w i l l
occur
s e q u e n t i a l l y n o t w i t h s t a n d i n g t h e i n
i t i a l p r e s en c e o f
a l l
t h e
r e a g e n t s .
A d d i t i o n a l m a t e r i a l s
m a y be added a s
n e c e s s a r y .
A f t e r
t h e
a p p r o p r i a t e
l e n g t h o f
t i m e h a s
p a s s e d t o
p r o d u c e
t h e d e s i r e d amount o f t h e s p e c i ? c
n u c l e i c a c i d s e q u e n c e , t h e r e a c t i o n
may b e h a l t e d by
i n a c t i v a t i n g
t h e
enzymes
i n any k n o w n m a nner or sepa
r a t i n g
t h e
c o m p o n e n t s o f
t h e
r e a c t i o n .
The p r o c e s s
o f t h e p r e s e n t i n v e n t i o n may
b e
con
ducted c o n t i n u o u s l y .
I n one
embodiment of an auto
mated p r o c e s s, t h e
r e a c t i o n
may b e c y c l e d
t h r o u g h a
d e n a t u r i n g
r e g i o n , a
r e a g e n t
a d d i t i o n r e g i o n , a n d a
30
r e a c t i o n r e g i o n . I n
a n o t h e r
e m b o d i m e n t ,
t h e
enzyme
3 5
u s e d f o r t h e
s y n t h e s i s
o f
p r i m e r
e x t e n s i o n
p r o d u c t s c a n
1 2
t h e d e s i r e d s e q u e n c e [ 5 ] c o m p r i s e d o f
c o m p l e m e n t a r y
s t r a n d s [ 5 + ] a n d
[ 5 - ]
i s u t i l i z e d a s t h e n u c l e i c a c i d .
D u r i n g
t h e ? r s t a n d e a c h
s u b s e q u e n t
r e a c t i o n c y c l e
e x t e n s i o n o f e a c h
o l i g o n u c l e o t i d e
p r i m e r
o n
t h e
o r i g i n a l
t e m p l a t e w i l l
produce one
new ssDNA m o l e c u l e p r o d
u c t
o f
i n d e ? n i t e
l e n g t h which
t e r m i n a t e s
w i t h o n l y
one
o f
t h e p r i m e r s .
These
p r o d u c t s , h e r e a f t e r r e f e r r e d
t o a s
l o n g p r o d u c t s ,
w i l l a c c u m u l a t e
i n
a l i n e a r f a s h i o n ;
t h a t
i s , t h e amount p r e s e n t a f t e r any
number
of c y c l e s
w i l l
b e
p r o p o r t i o n a l
t o
t h e number o f c y c l e s .
The
l o n g p r o d u c t s
t h u s produced w i l l a c t
a s
tem
p l a t e s f o r one o r t h e
o t h e r o f
t h e
o l i g o n u c l e o t i d e
p r i m
e r s
d u r i n g
s u b s e q u e n t
c y c l e s
a n d w i l l p r o d u c e m o l e
c u l e s o f t h e d e s i r e d s e q u e n c e [ 5 + ] o r [
S ] . These mole
c u l e s
w i l l a l s o
f u n c t i o n
a s templates f o r one or
t h e
other
o f t h e o l i g o n u c l e o t i d e p r i m e r s ,
p r o d u c i n g
f u r t h e r [ 5 + ]
and
[ S r ] , and
t h u s
a c h a i n r e a c t i o n can
b e
s u s t a i n e d
which
w i l l r e s u l t
i n t h e a c c u m u l a t i o n o f [ S ] a t a n expo
n e n t i a l r a t e r e l a t i v e t o t h e number o f c y c
l e s .
B y - p r o d u c t s f o r m e d b y o l i g o n u c l e o t i
d e
h y b r i d i z a
t i o n s
o t h e r t h a n
t h o s e
i n t e n d e d
a r e
n o t
s e l f - c a t a l y t i c
( e x c e p t
i n r a r e i n s t a n c e s )
and
t h u s
accumulate a t
a
l i n e a r
r a t e .
The s p e c i ? c
s e q u e n c e t o
b e a m p l i ? e d , [ S ] , c a n b e
d e p i c t e d d i a g r a m m a t i c a l l y
a s :
[ 5 + ]
5AAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCC
3 '
[ 5 - ] 5'TTTTTTTTTTYYYYYYYYYYGGGGGGGGGG 5
The
a p p r o p r i a t e
o l i g o n u c l e o t i d e p r i m e r s would b e :
P r i m e r t : GGGGGGGGGG
Primer
2 :
AAAAAAAAAA
s o
t h a t
i f
DNA o n t a i n i n g
[ S ]
.
. .
zzzzzzzzzzzzzzzz XXXXXXXXXXCCCCCCCCCCzzzzzzzzzzzzzzzz
. .
. .
.zzzzzzzzzzzzzzzzTTTTTTTTTTYYYYYYYYYYGGGGGGGGGGzzzzzzzzzzzzzzzz.
.
be immobilized i n a column. The o t h e r
![NBER WORKING PAPER SERIES R&D AND THE PATENT … · empirical studies of Scherer et al [1959], Taylor and Silberston [1973], and Mansfield [1986] suggest that patent protection may](https://img.pdfslide.us/doc/110x75/5c62b3be09d3f27c208b5e66/nber-working-paper-series-rd-and-the-patent-empirical-studies-of-scherer-et.jpg)
![1.4. A PCR PRIMER - UAB Barcelona...Next to its conception in 1983 and its formal presentation in 1986 [Mullis1986], the single most remarkable technological development in PCR [Guyer1989]](https://img.pdfslide.us/doc/110x75/610b3289644e08018d300dd2/14-a-pcr-primer-uab-barcelona-next-to-its-conception-in-1983-and-its-formal.jpg)
