PCBS-J-Vol 6-2-2012 W

PhytoChem & BioSub Journal

Peer-reviewed research journal on Phytochemistry & Bioactives Substances

ISSN 2170 - 1768

PCBS Journal

Volume 6 N° 2 2012

PhytoChem & BioSub Journal (PCBS Journal) is a peer-reviewed research journal published by Phytochemistry & Organic Synthesis Laboratory. The PCBS Journal publishes innovative research papers, reviews, mini-reviews, short communications and technical notes that contribute significantly to further the scientific knowledge related to the field of Phytochemistry & Bioactives Substances (Medicinal Plants, Ethnopharmacology, Pharmacognosy, Phytochemistry, Natural products, Analytical Chemistry, Organic Synthesis, Medicinal Chemistry, Pharmaceutical Chemistry, Biochemistry, Computational Chemistry, Molecular Drug Design, Pharmaceutical Analysis, Pharmacy Practice, Quality Assurance, Microbiology, Bioactivity and Biotechnology of Pharmaceutical Interest ) It is essential that manuscripts submitted to PCBS Journal are subject to rapid peer review and are not previously published or under consideration for publication in another journal. Contributions in all areas at the interface of Chemistry, Pharmacy, Medicine and Biology are welcomed.

Editor in Chief Pr Abdelkrim CHERITI

Phytochemistry & Organic Synthesis Laboratory

Co-Editor Dr Nasser BELBOUKHARI

Bioactive Molecules & Chiral Separation Laboratory Bechar University, 08000 Bechar, Algeria

Editorial Board

Afaxantidis J. (France), Akkal S. (Algeria), Al Hamel M. (Morocco), Al Hatab M. (Algeria), Aouf N. (Algeria), Asakawa Y. (Japan), Atmani A. (Morocco) , Awad Allah A.( Palestine) , Baalioumer A. (Algeria), Badjah A.Y. ( KSA), Balansard G. (France), Barkani M. (Algeria), Belkhiri A. (Algeria), Benachour D. (Algeria), Ben Ali Cherif N. (Algeria), Benayache F. (Algeria), Benayache S. (Algeria), Benharathe N. (Algeria), Benharref A. (Morocco), Bennaceur M. ( Algeria), Bensaid O. (Algeria), Bhalla A. ( India), Bnouham M. (Morocco), Bombarda E. (France), Bouchekara M. (Algeria), Boukir A. (Morocco), Berada M. ( Algeria), Bressy C. (France), Chehma A. (Algeria), Chemat F. (France), Chul Kang S. ( Korea), Cravoto G. ( Italia), Dadamoussa B. (Algeria), Daiche A. (France), Daoud K. ( Algeria), De la Guardia M. ( Brazilia), Dendoughi H. (Algeria), Derdour A. (Algeria), Djafri A. (Algeria), Djebar S. (Algeria), Dupuy N. ( France), El Abed D. (Algeria), EL Achouri M. (Morocco), Jouba M. (Turkey), Hacini S. (Algeria), Hadj Mahamed M. (Algeria), Halilat M. T. (Algeria), Hamed El Yahia A. ( KSA), Hamrouni A. ( Tunisia), Hania M. ( Palestine), Iqbal A. (Pakistan), Gaydou E. (France), Ghanmi M. (Morocco), Gharabli S. (Jordan), Gherraf N. ( Algeria), Ghezali S. (Algeria), Gouasmia A. (Algeria), Greche H. (Morocco), Kabouche Z. (Algeria), Kacimi S. (Algeria), Kajima J.M. (Algeria), Kaid-Harche M. (Algeria), Kessat A. (Morocco), Khelil-Oueld Hadj A. (Algeria), Lahreche M.B. (Algeria), Lanez T. (Algeria), Leghseir B. (Algeria), Mahiuo V. (France), Marongu B. ( Italia), Marouf A. (Algeria), Meklati F. (Algeria), Melhaoui A. ( Morocco), Merati N. (Algeria), Mesli A. ( Algeria), Mushfik M. ( India), Nefati M. (Tunisia), Ouahrani M. R. (Algeria), Oueld Hadj M.D. (Algeria), Pons J.M. ( France), Radi A. (Morocco), Rahmouni A. (Algeria), Raza Naqvi S. A. (Iran), Reza Moein M. (Iran), Rhouati S. (Algeria), Roussel C. (France), Roussis V. (Portugal), Saidi M. (Algeria), Salgueiro L.D (Portugal), Salvador J. A. (Spain), Seghni L. (Algeria), Sharma S. ( India), Sidiqi S. K. ( India), Souri E. ( Turkey), Tabti B. (Algeria), Taleb S. (Algeria), Tazerouti F. (Algeria), Vantyune N. (France), Villemin D. (France), Yayli N. (Turkey), Youcefi M. (Algeria), Zabut B. ( Palestine), Ziyyat A. (Morocco), Zouieche L. (Algeria)

PhytoChem & BioSub Journal ISSN 2170 – 1768ISSN 2170-1768

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Size: 14, Blod.) Author’s names and affiliations: Please indicate the given name and family name clearly (Times

New Roman; Size-12; Italic). Present the authors' affiliation addresses below the names (Times New Roman; Size-11; Italic). Provide the full postal address of each affiliation, including the country name, and, if available, the e-mail address, and telephone number of each author.

Abstract: A concise and factual abstract is required with 200 or less words highlighting the most important information, including the methodology, results, and conclusions that allows readers to evaluate their interest in the article and thus avoiding the reading of the full work (Times New Roman; Size-12; Italic).

Keywords: Immediately after the abstract, provide a maximum of 7 keywords, avoiding general and plural terms and multiple concepts (Times New Roman; Size-12; Italic).

Introduction: Should clearly establish the objectives of the work and its relationship with other works

in the same field Material and Methods: Description of the Material and the Methods used should be brief, and clear enough

to make possible the comprehension and the reproducibility of the work. Results and Discussion: Should be presented with a personal discussion or interpretation, and whenever

possible, be accompanied by adequate tables and figures and the discussion must be restricted to the significance of the data presented. Figures, Tables and Structural Formulas are included in the text.

Acknowledgements: (optional item) References: Should be standardized to conform to the requirements of the journal. Preferentially use

references that can be accessed by the readers worldwide.


Peer-reviewed research journal on Phytochemistry & Bioactives Substances ISSN 2170 - 1768

PCBS Journal

Volume 6 N° 2 2012

P O S L

Edition LPSO Phytochemistry & Organic Synthesis Laboratory

http://www.pcbs.webs.com , Email: [email protected]

PhytoChem & BioSub Journal Vol. 6(2) 2012 ISSN 2170-1768

Contents

PhytoChem & BioSub Journal Vol. 6 N° 2

B. FASLA, F. Z. ZEGHADA, A. MAROUF & M. BENNACEUR Cytotoxic and genotoxic effects of aqueous extracts of five Algerian medicinal plants on Allium cepa L. root tips

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A. KEMASSI, A. OULD EL HADJ-KHELIL, Z. BOUAL, A. HAMID OUDJANA & M. D. OULD EL HADJ Activités biologiques des huiles essentielles brutes foliaires de Peganum harmala L. (Zygophyllaceae) sur les larves du cinquième stade et sur les adultes de Schistocerca gregaria (Forskål, 1775) (Orthoptera- Cyrtacanthacridinae)

71

M. CHENNI, S. NEGGAZ, Z. FORTAS & D. El ABED Etude du pouvoir antibactérien de l’extrait méthanolique de la racine de Bryonia dioica Jacq., de la région d’Oran

78

S. RAHMANI, L.ZIANE, N. BELBOUKHARI & A. CHERITI

The Saharan medicinal plant Limoniastrum feei: Ethnomedical survey and preliminary phytochemical screening of antibacterial extracts

83

H. DJERADI , A. KRALLAFA , A. BOUYACOUB & M. LAHRECHE Etude théorique de la réaction de Diels-Alder : Effet de substitution par un métal de transition sur la cinétique et la régiosélectivité d’addition

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2012 Vol. 6 No.2 PhytoChem & BioSub Journal

ISSN 2170-1768

PhytoChem & BioSub Journal Vol. 6 (2) 2012 ISSN 2170-1768

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Cytotoxic and genotoxic effects of aqueous extracts of five Algerian medicinal plants on Allium cepa L. root tips B. FASLA*, F. Z. ZEGHADA, A. MAROUF & M. BENNACEUR Laboratoire de Biochimie Végétale et des Substances Naturelles Faculté des Sciences, Département de Biologie Université d’Oran, 31000 Oran, Algérie Received: January 04, 2012; Accepted: April 10, 2012 Corresponding author Email [email protected] Copyright © 2012-POSL

The antimitotic and genotoxic effects of aqueous extracts of five medicinal plants: Tetraclinis articulata (Vahl) Masters; Withania frutescens Pauquy; Peganum harmala L.; Ruta chalepensis L. and Haloxylon scoparium Pomel was evaluated using the Allium cepa assay. Onion bulbs were exposed to 0.25; 0.50; 0.75 and 1% concentrations (m/v) of each extracts for microscopic analyses. The extracts of P. harmala and H. scoparium shown mitodepressive effects on cell division at the 1% concentration. All the aqueous extracts induce an important aberrations due to different mechanisms: inhibitory, aneugenic and clastogenic effects of the aqueous extracts on Allium cepa meristematic cells. The antigenotoxic effect observed on cells treated by sodium azide and then by the aqueous extract of leaves of Withania frutescens at 1% concentration requires a chemical characterization of this plant and structural elucidation of the active principle. The qualitative analyses realized by thin layer chromatography (TLC) shows the presence of coumarins and flavonoides in some active extracts. The quantitative analyses realized by spectrophotometric assay indicate an important level of polyphenols and flavonoids in the aqueous extracts of T. articulata and H. scoparium.

Key words: Allium cepa L assay, Algerian medicinal plants, Antimitotic activity, Genotoxicity, Chromosomal aberration, Phytochemistry

INTRODUCTION

The plants and their extracts were used for a long time in traditional medicine. Being given their biological properties, they are the primary sources of drugs employed for the treatment of various diseases. Approximately 2 to 4% of plant species contain a great quantity of antineoplasic and/or cytotoxic components (Petit et al., 1994). The compounds isolated from these species lead to the development of new powerful products which inhibit tumors development, like vinblastin and vincristin (alkaloid) isolated from Catharanthus roseus G. DON (Cragg et al., 2003).


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The meristematic cells plant constitutes a material of an incomparable quality for the study of the mitosis. They approach what one could call“the typical isolated cell” or “the fundamental unit” (Olliviers, 1948). The use of the higher plants in bioessay appears to be an excellent indicator of the cytotoxic and genotoxic effects caused by various chemical or physical agents. These tests proved their great value since the plants express a great sensitivity to the mutagen agents and offer a good system of analysis of the genic and chromosomal aberrations in eukaryotic system (Grant, 1978). These bioassays are validated by the United Nations Environment Program (UNEP), the World Health Organization (WHO) and the United States Environmental Protection Agency (US EPA) (Grant, 1999). A. cepa is commonly used as a test for investigating environmental pollution factors (Fusconi et al., 2006), irradiation (Kovalchuk et al., 1998), waste water (Rank and Nielsen, 1994), osmotic stress (Radić et al., 2005), and evaluating anticancer potential by the first work realized by Levan (1938), studying the effect of the colchicine on the mitoses. Cytogenetically, A. cepa cells contain a reduced chromosomal number (2n=16); broad and long Chromosomes; high percentage of cellular division; easy detection of the chromosomal aberrations and easy coloring. On the handling plan, this test is relatively fast, vegetable material is available all the year and it’s easy to cultivate in the laboratory. In order to contribute to the valorization of the famous Algerian medicinal plants for their therapeutic virtues, this work is initially interested by the study of the antimitotic and genotoxic activity of five aqueous extracts of plants at different concentrations, followed by the study of the antigenotoxic activity of the aqueous extract of Withania frutescens Pauquy. on meristematic cells division of Allium cepa L. root tips MATERIAL AND METHODS Collection of medicinal plants The medicinal plants utilized in this study were selected on the basis of their ethnobotanical uses (Table 1) and their allelopatic activity (Zeghada et al 2009; unpublished). The botanical identification was made by Pr Abderrazak MAROUF, laboratory of plant Biochemistry and Natural Substances, Department of Biology, Faculty of Science, University of Oran, Algeria.

Table 1: Use of plants in traditional medicine.

Plant Family Part Ethnobotanical uses Reference

Anti-inflamatory Tekaya-Karoui et al. (2006)

respiratory and intestinal infection

Bellakhdar et al. (1991)

Tetraclinis articulata (Vahl) Masters

Cupressaceae

Leaves

hypotensive, hypoglycemic

Ziyyat et al. (1997), Bnouham et al. (2002)

Withania frutescens Pauquy

Solanaceae Leaves Treatment of the ulcers

Font Quer (1990)


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Fever, diarrhea, abortion, subcutaneous tumors

Bellakhdar (1997) Peganum harmala L.

Zygophyllaceae

Seeds

Rheumatic and intestinal pains, diabetes and eczema.

Hammiche and Maiza (2006)

Emmenagogue, abortive, antihelminthic, spasmolytic

Di Stasi et al. (1994) Ruta chalepensis L.

Rutaceae

Leaves

anti-inflammatory Atta and Alkofahi, (1998) Treat the sight trouble

Boukef, (1986) Haloxylon scoparium Pomel.

Chenopodiaceae Arial parts

anti-cancer activity

Sathiyamoorthy et al. (1999)

Preparation of plant extracts The plants are cleaned from all impurities (ground, parts died, parasitic plants, etc), dried in the drying oven at 50°C during 24 h then crushed. Ten g of dried powdered material was extracted with distillated water by refluxing for three times during 30 mn .The extract was lyophilized and stored at - 20°C. Five concentrations were prepared from the lyophilized extracts that were dissolved in synthetic medium (see A.cepa test) as follow: 0.25; 0.50; 0.75 and 1% Allium cepa test Onion bulbs Allium cepa L. (2n = 16) of the same size are obtained from local market. After removing brownish parts, the bulbs are properly washed by distilled water and placed in beakers containing 40 ml of a synthetic medium (CaSO4: 60; MgSO4 60; NaHCO4: 96; KCl: 4 Mg/L for a good culture) (Rank and Nielsen, 1997) during 72 h at ambient temperature of the laboratory (22°C). The roots of A. cepa from 2 to 3 cm length are exposed during 24 h with the four increasing concentrations of the aqueous extracts (0.25; 0.5; 0.75 and 1%), at a rate of two bulbs per treatment. The synthetic medium is used as control (T) for experiment. Antigenotoxic activity of the aqueous extract of Withania frutescens Pauquy. The study of the antigenotoxic activity of the aqueous extract of Withania frutescens Pauquy. (leaves) on meristematic cells of A. cepa exposed to sodium azide (NaN3) increasing solutions (0.25; 0.50; 0.75 and 1%). NaN3 is classified as a very toxic chemical causing the inhibition of mitochondriale chain respiration and cellular death by apoptosis (Inomata and Tanaka, 2003). The experiment was carried out under the same operating conditions as those of the antimitotic activity, except that after a setting in culture in the synthetic medium during 72h, the twenty (20) cultivated bulbs are distributed as follows: 02 bulbs are cultivated in the


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synthetic medium and are taken as control (T); 02 bulbs are treated by the aqueous extract of Withania frutescens Pauquy. at 1% during 24h; 08 bulbs are treated by sodium azide (NaN3) with increasing solutions (0.25; 0.50; 0.75 and 1%) during 24h; 08 bulbs are exposed to sodium azide (NaN3) to the same concentrations during 24h, then treated by the aqueous extract of Withania frutescens Pauquy at 1% during the same period. Coloration The coloring of Feulgen requires initially hydrolysis of the root meristems in 1N HCl at 60°C during 12 mn, in order to facilitate the fixing of the dye on the aldehydic groups released during this hydrolysis and to give thereafter a red coloring purplished to the chromosomes (Jahier , 1992). Slides preparation The hydrolyzed meristematic parts (approximately 2 mm) are isolated using a scalpel, deposited slide in a drop of 45% acetic carmin and crushed between slide and cover slide with gentle taping, in order to obtain a good spreading out of the cells. Microscopic evaluation All slides were coded and examined from right to left and top to bottom out using a microscope video - ZEISS type by using immersion oil at X 100 magnification. The cytogenetic analysis included: mitotic index (MI), cytotoxic limit value (CLV), phases index (PI) and index of aberrations (AI). The counting of the normal or aberrant cells is carried out on 6000 cells by concentration in extract at a rate of 600 cells per meristematic root tip, by taking into account all the phases of the cellular division: prophase (P), prometaphase (PM), metaphase (M), anaphase (A) and telophase (T). MI is defined by the ratio of cells stopped in mitoses on the total of the counted cells (6000) (Ikeda et al., 2000) according to the equation (1).

The cytotoxic limit value (CLV) was calculated from the MI of the treated sample/MI of the control) 100 according to Sharma (1983).

The PI is determined by the number of cells in prophase (or in prometaphase (PM), im metaphase (M), anaphase (A) and telophase (T)) on the number of cells examined (6000) multiplied by 100 (Glińska et al., 2007) according to the formula (3)

The frequency of aberrant cells (%) was calculated based on the number of aberrant cells per total cells scored at each concentration of each extract (Rǎcuciu and Creangǎ, 2007) from the equation (4):


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The chromosomal aberrations met are various types: micronucleus (MNC); chromosomal bridge (B); chromosomal break (Br); late chromosome (L); chromosome with sticking aspect (S); binucleated cell (bnl cell); fragmentation (Frgt); pycnose (PCN), etc. Phytochemical analysis TLC Preliminary analysis of the five aqueous extracts by thin layer chromatography on silicagel F254 (Merck) were performed. The chromatograms were developed in different mobile phases for testing the presence of secondary metabolites (polyphenol, flavonoids, tannins, alkaloids, coumarins, saponins, anthrones, anthranols, quinones, lignanes, sesquiterpenes lactones and triterpenes) as described by Wagner and Bladt (1996). The TLC plates were visualized under UV light at 254 and 365 nm. Determination of total polyphenol and flavonoid content The polyphenol content of the five aqueous extracts was quantified by the Folin–Ciocalteu reagent and was expressed as gallic acid equivalents (Singleton et al., 1999). 100 µL test samples were mixed with 500 µL Folin Ciocalteau’s phenol reagents. After 5 mn ofreaction on darkness, 1.5 mL Na2CO3 at 2% was added. These solutions were maintained at obscurity during 1 h and the absorbance was read at 720 nm. The estimation of flavonoid content was carrying out according to the colorimetric method described by kim et al. (2003). 1500 µL of distilled water was added to 500 µL of every aqueous extract solution followed by the addition of 150 µL of NaNO2 at 5 %. Aliquot of 150 µL of AlCl3 (1:10 w/v) was added 5 min later. After 6 min, 500 µL of NaOH 1 N was added and the absorbance was measured at 510 nm. Catechin was used as a standard for constructing a calibration curve. Spectrophotometric measurements were performed by using UV-Visible spectrophotometer 8500 (P Double BEAM). Statistical analysis The results are expressed in the form of average ± standard error (Means ± standard errors (S.E.M) calculated on the average from ten blades (for the cytogenetic study); the average of two or three experiments (for the proportioning of polyphenols and flavonoids). The experimental data are presented in the form of curves and histograms. Calculations were carried out using the software Microsoft EXCEL 2003. RESULTS Antimitotic and genotoxic activity Mitotic index and cytotoxic limit value


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Referring to the fig.3, the mitotic index of the meristematic cells of A. cepa increases considerably at the same level in cells treated by the aqueous extract of the leaves of T. articulata with all the concentrations tested. In the same case meristematic cells of A. cepa treated by the aqueous extract of the arial parts of H. scoparium Pomel. present a very important mitotic activity in particular with the concentrations 0.50% (71.71 ± 0.22%) ; this activity decrease considerably with the concentrations 0.75 and 1% (22.60 ± 0.24%; 6.75 ± 0.13% respectively) compared to the control. The analysis of the cells treated by the aqueous extract of seeds of P. harmala L. during24 h reveals a remarkable reduction in the mitotic index of wich rate reached 18,38 ± 0.09 % at the concentration 1% of the extract, i.e. reduction in half compared to the control (47.35 ± 0.16%). The meristematic cells of A. cepa treated by the aqueous extract of the leaves of R. chalepensis present a slight mitotic index reduction at all the concentrations tested compared to that observed for the control.

Figure.3. Mitotic index of the meristematic cells of Allium cepa treated with aqueous extracts. When the mitotic index decreases bellow 22% compared to the control it causes what we call “lethal effect” (Antonsie-wicz, 1990). A mitotic index reduction below 50% compared to the control is usually a subletal effect (Panda and Sahu, 1985) and is named “limiting value of cytotoxicity” (Sharma, 1983). According to these two definitions we will be able to deduce that the aqueous extract of seeds of P. harmala is regarded as sublethal for the cells of A. cepa at the concentration 1%, whereas with the same concentration the aqueous extract of the arial parts of H. scoparium is regarded as lethal. Phase indexes The phase indexes of the of A. cepa cells treated by the aqueous extract of T. articulata (leaves) is represented mainly by preprophases and prophases for all the concentrations tested (Fig. 4 a). The prophase represents the dominating stage, for both the control cells and the treated cells by W. frutescens extract (leaves). The other stages represent only few percent (Fig. 4 b). The proportion of the meristematic cells in division treated by the aqueous extract of P. harmala L. (seeds) and R. chalepensis (leaves) strongly decreases by increasing the concentrations (Fig. 4 c, fig.4 d). A strong phase


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indexes decrease was observed on cells treated by aqueous extract of H. scoparium (arial part) at 0.75 and 1% concentration.

a b

c d

e

Figure.4. Phase indexes of A. cepa meristematic cells treated by aqueous extracts

Aberration index The anomalies induced by the aqueous extract of T. articulata are chromosomal breaks (Cb) (Fig.5b) and sticky chromosomes (S) (Fig. 5 c), generally gathered in prophase (4.51%) and metaphase (0.31%) at the concentration 0.75%.


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The presence of micronucleus (MNC) and binucleated cells (bnl cell) was seldom observed. On the other hand we distinguishes the presence of what we called “nuclear vacuums” on cells at the prophase stage going from 1 to 5 vacuums per cell (Fig. 5 d), and whose rate increases with the concentrations tested. In addition, we noticed a thickening and a strong coloring of the prophasic chromatin that’s the intensity increases also with the concentrations of the extract used (Fig. 5 e).

Figure.5. Some anomalies met on meristematic cells of A.. cepa treated by the aqueous extract of

leaves of Tetraclinis articulata (Mast) Vahl. (Leaves) with increasing concentrations.

a: overall picture of control cell; b: breaks in prophase; c: breaks in metaphase with sticking aspect; d: nuclear vacuum; e: thickening and intense coloring of prophasic chromatin. The most anomalies caused by the aqueous extract of W.frutescens are nuclear budding (4.68% at the concentration 0.50%) (Fig.6 a), micronucleus (MNC) (2.85 at the concentration 0.75%) (Fig. 6 b), breaks (B) (Fig. 6 c), sticky chromosomes (Fig. 6 d), late chromosomes (Ct) (Fig. 6 e), multipolar anaphases (AMP) (Fig. 6 f).

Figure 6. Cell structure and forms of changed mitoses in Allium cepa root tip cells following treatment

by aqueous extract of. Withania frutescens Pauquy. (leaves) with increasing concentrations. a: cells with contracted nuclei; b: prophase with micronucleus; c: metaphase with micronucleus; d: breaks in anaphase; e: metaphase with sticking aspect; f: late chromosome in metaphase; g: multipolar anaphase; h: atypical cell.


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The cytogenetic analysis of cells treated by the aqueous extract of P. harmala indicates the presence of various types of anomalies which increase with the extract concentration. The majority of these are defined by the presence of pycnoses (PCN) (Fig. 7 a), binucleated cells (bnl cell) (Fig 7 b), sticky chromosomes (S) (Fig 7 c), breaks (B) (Fig 7 d); chromosomal bridges (Cb) (Fig 7 e); and late chromosomes (L) (Fig. 7 f). The multipolar anaphases (MPA) and micronucleus (MNC) are seldom noted.

Figure.7. Structure of meristematic cells of Allium cepa root tips after treatment of Peganum harmala seeds during 24h with increasing concentrations compared with the cells of the control (T) X 1000.

a: chromosomes with sticking aspect in prophase; b: metaphase with sticking aspect; c: breaks in Ana-telophase; e: chromosomal bridges in telophase; e: late chromosome in prophase; f and g: binucleated cell; h: pycnotic cells. During the microscopic evaluation of the meristematic cells of A. cepa L. treated by the aqueous extract of R. chalepensis we noticed that the majority of the anomalies were observed mainly at interphase and prophase stages and that for all the concentrations tested. Cells in interphase coloring was hardly visible (Fig. 8 a). The prophase stage is characterized by the presence of cells where coloring is also hardly visible, and this for the concentrations 0.25% and 0.50% (Fig. 8 b). At the cells exposed to the concentrations 0.75% and 1%, we noticed that the prophases present a thickening nucleus accompanied by an intense coloring of chromatin (Fig. 8 c). With the four concentrations tested, the prophase stage is characterized either by the presence of total thickening of chromatin in certain cells, or by the presence of partial thickening chromatin (intense coloring) within the same cell; the not thickened part tending to disappear (very clear coloring or almost goes away) (Fig. 8 d). The presence of various sizes of cells was also observed for all the concentrations tested. These are of four types: cells with important cytoplasmic volume and a nucleus of reduced size (Fig. 8 e); cells with important cytoplasmic volume and a nucleus of an important size (Fig. 8 f); cells with very reduced cytoplasmic volume and a big nucleus (Fig. 8 g); cell where the nucleus diffuses in the cytoplasm, appearing to be coloured in magenta (Fig. 8 h). We noticed the presence of cells where the nucleus is completely disappeared that we named “cells without nucleus” (CWN) (Fig. 8 i)


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Figure.8. Some anomalies met on meristematic cells of Allium cepa L. caused by the aqueous extract

of Ruta chalepensis L. (leaves) to increasing concentrations compared to the control (T) X 1000. a: cells in interphase with hardly visible coloring; b: prophases with a core thickened and an intense coloring of chromatin; c: prophases with hardly visible coloring; d: cells presenting a thickened part of chromatin and the other part tends to disappear; f: cells with important cytoplasmic volume and cells with reduced size of nucleus; g: cells with very reduced cytoplasmic volume with a bulky core; h: cells with nucleus diffusing in the cytoplasm; i: cells without nucleus; j: atypical cell. The aqueous extract of H. scoparium caused a cytoplasmic fragmentation (Fig. 9 a) followed by a nucleus fragmentation too (Fig. 9 b). A budding nucleus (BN) (Fig. 9 c) and thickening of chromatin were noticed. The presence of cells without nucleus (CWN) was also observed for some cells.

Figure 9. Anomalies met on meristematic cells of Allium cepa L. treated by an aqueous extract of

Haloxylon scoparium L. (arial parts) with increasing concentrations X 1000. a: cells with contracted nuclei; b and c: beginning of cytoplasmic fragmentation; d and e: beginning of nuclear fragmentation. Antigenotoxic activity of the aqueous extract of Withania frutescens Pauquy. Meristematic cells control of A. cepa, shows an important mitotic index corresponding to 88.48 ± 0.10% (fig 10). In the same way, the same cells of A. cepa treated by aqueous extract of W. frutescens at 1% exhibits an important mitotic activity corresponding to a value of 81.06 ± 0.13%. A clear reduction of the mitotic index of the cells of A. cepa exposed to the sodium azide (NaN3) solutions for all the concentrations tested was noticed. But the cells exposed to sodium azide at 0.25% increased half once treated by the aqueous extract of W.


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frutescens with 1%, whereas we noticed a light increase for those exposed to the concentrations 0.50% of sodium azide then consequently treated concentration in extract of withania. In addition, we observed a strong mitotic reduction in the index for those exposed to the solutions of sodium azide with 0.75% and 1% then treated by the aqueous extract of W. frutescens with 1%.

Figure10. Antigenotoxic effect of Withania frutescens at 1%

on A.cepa root tips exposed to sodium azide. Phytochemical analysis TLC The preliminary phytochimical tests of the TLC carried out on the various studied extracts, made it possible to two groups of secondary metabolites: flavonoid and coumarins (Table 2). With regard to the other metabolites, there are two possibilities: either they miss, or their low content does not make it possible to detect them with the techniques used.

Table 2: Composition of the extracts in flavonoid and coumarins.

Plant Part Phytoconstituant N° C Rf T. articulata Leaves 02 0.28

0.37 W. frutescens Leaves 01 0.6

Coumarins

02 0.32 0.32

P. harmala

Seeds

Flavonoid 01 0.14 Coumarins 04

0.1 0.21 0.29 0.48

R.chalepensis

Leaves

Flavonoid 02 0.40 0.46

H. scoparium

Arial parts

Coumarins 03

0.38 0.65 0.72


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Determination of total polyphenol and flavonoid content The content polyphenols of the various extracts is, by descending order, as follows: T. articulata > H. scoparium > P. harmala > R. chalepensis > W. frutescens (fig. 11).

Figure.11. Total phenol contents (mg/g) of aqueous plants extracts.

Data are given as means ±S.E.M. (n=3). In the same way, the content of flavonoïdes is, by descending order: T. articulata > H. scoparium > W. frutescens > R. chalepensis > P. harmala (fig. 12).

Figure.12. Total flavonoid contents (mg/g) of aqueous plants extracts.

Data are given as means ±S.E.M. (n=3). DISCUSSION

The mitotic index is regarded as a parameter making it possible to estimate the frequency of the cellular division (Marcano et al., 2004). The reduction in the mitotic activity of the meritematic cells of A cepa indicates a mitodepressif effect of the aqueous extract of P. harmala and of R. chalepensis for all the concentrations tested, as well as the aqueous extract of H. scoparium for the concentrations 0.75 and 1%. We could suggest that the tested extracts or their components must interfere with the normal development of the mitosis, by preventing a number of cells to enter in prophase and thus blocking the cycle mitotic lasting interphase (El-Ghamery et al, 2000).


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The reduction of the mitotic activity is probably due to the inhibition of the DNA and the nucleoproteins synthesis of the biological system (Chauhan et al., 1998), a prolongation of the duration of the S and G2 phases (Webster and Davidson, 1969), a modification or deterioration in the expression of certain genes Siddiqui et al. (2007). Increase in the number of preprophasic and prophasic cells of A. cepa treated by the aqueous extract of T. articulata let suggest according to D’Amato (1954), that is due, either at long duration of treatment, or to the use of high amounts, which leads to the deceleration of the entry at other stages of the mitosis, in particular, metaphase, anaphase and telophase. A great number of prophase was observed in the meristematic cells of Pisum sativum L treated by cadmium at concentration of 250µM after 18 hours of treatment leading to the mitotic index increase compared to the control cells (Fusconi et al., 2006). A lengthening of the cellular cycle with an extension of the G2 phase and stage prophase at the meristematic cells of A. cepa after treatment by cadmium at 30 µM (Borboa and De la torre, 1996). In the same way, the high NaCl concentrations (150 mM), cause a remarkable increase in the number of prophases in the root tips of Centauria ragusina L. compared to the control after 10 days of experimentation (Radić et al., 2005). The increase in the number of prophase must probably be connected to an intense deterioration of microtubules by preventing the assembly of the chromosomes at the metaphase stage (Fusconi et al., 2006). The strange aspect of the short and thickened chromosomes observed in prophase may indicate the effect of the aqueous extract of T. articulata on the organization of the chromatin, which can be in relation to disorders in the quantity of the histones, or other proteins responsible for the control of the nuclear chromatin structure (Stryer, 1997). Similar changes in the structure of chromatin were observed on meristematic cells of A. cepa treated by the aqueous extract of the barks of Uncaria tomentosa Willd (Rubiaceae) (Kuraś et al., 2006), and the aqueous extract of the needles of Taxus baccata L. (Taxaceae) (Majewska et al., 2003). The rate of chromosomal breaks (B) met at the meristematic cells of A. cepa is considerably important at those treated by the aqueous extract of T. articulata compared to the other extracts tested. These chromosomal breaks are due probably to the clastogenic effects of the extract, and its action on the chromosomes is generally regarded as being due to an action on the ADN (Grant, 1978). Fiskesjö (1993), suggests that the chromosomal breaks are associated to the formation of chromosomal fragments and the micronucleated cells. The presence of sticky chromosomes in prophase and metaphase is very important on the meristematic cells of A. cepa treated by the aqueous extract of P. harmala L. compared to other tested extracts. The sticking aspect of the chromosomes could be the result of the degradation or the depolymerization of the DNA (Darlington and Mc-leish, 1951) and a similar dissolution of the nucleoproteins (Kaufman, 1958), or of an intense contraction and condensation of the chromosomes (Ahmed and Grant, 1972). The change of consistency of the chromosomes which become sticking probably explains by the action of the phytochimic compounds of the aqueous extract of P. harmala L. on chromosomal proteins. The sticking aspect of the chromosomes reflects a high toxic effect, of an irreversible type usually and probably leads to cellular death (El- Ghamery et al., 2003). The late chromosomes present on the meristematic cells of A. cepa lets suggest that the aqueous extracts of W. frutescens, P. harmala and H. scoparium have clastogenic effects, resulting from a rearrangement of the chromosomal parts by a gain or a loss of one chromosome inside the genome (Panda and Panda., 2002). According to Gabara et al (2006), the late chromosomes or chromatides seems as consequence of malformation of the kinetochores, or a partial inactivation of the spindle division, driving with the prevention of their displacement to the other poles (Türkoğlu, 2008). These chromosomes are gradually


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gathered and can be surrounded by the nuclear membrane to form micronucleus (MNC) (El-Ghamery et al., 2003). The frequency of micronucleus (MNC) is rather important on the meristematic cells of A. cepa treated by the aqueous extract of W. frutescens . This value reached 2.85% at the concentration 0.75% and whose majority is present more in prophase than in interphase. The micronucleus can be originating by the acentric fragments formed following chromosomal or chromatidic breaks (clastogenic answer) (Müller and Streffer, 1994), to the chromosomes late during the mitotic anaphase, or starting from the spindle dysfunctionment (aneugenic answer) (Grover and Kaur, 1999; Sudhakar et al., 2001). The presence of an important rate of binucleated cells (bnl cell) on the root tips of A. cepa treated by the aqueous extract of P. harmala (0.86% with the concentration 1%) was noted compared to the other extracts. Their presence lets suggest that they are due probably to the eruption of the process of the cytokinesis while acting on the formation of the phragmoplaste, and preventing the formation of the girls cells, leading to the appearance of polyploid cells (Grant, 1976). The binucleated cells are regarded as the result of an inhibition of the cytokinesis at any point of control of the cellular cycle (Ateeq et al., 2002). The microtubules are implied in the formation of the cellular plate, the extract of P. harmala must probably affect the microtubules by thus inhibiting the cytokinesis (Türkoğlu, 2008). A pycnose (PCN) is a variety of irreversible nuclear lesion testifying to cellular death; it is characterized by the extreme retraction of the nucleus which becomes hyper colorable (Roger, 2007). The rate of pycnotic cells met on the meristematic cells of A. cepa treated by the aqueous extract of P. harmala increases with the concentration to reach a maximum value of 13.8% with the concentration 1%. This lets suggest that this extract contains substances causing these nuclear lesions. The phenomenon of the nucleus which diffuses in the cytoplasm of the meristematic cells of A. cepa treated by the aqueous extract of R. chalepensis corresponds probably to a caryorrhexy, defined by the bursting of the nuclear mass (Roger, 2007). In addition, the cells treated by the same extract presenting a thickened part of chromatin (intense coloring) and the other part tends to disappear (coloring very clear or almost goes away) lead probably to the appearance of what we called cells without nucleus (CWN), probable result of a karyolysis. This one is defined like dissolution of the nucleus with loss of its tinctorial affinities (Roger, 2007). The phenomena of pycnose, caryorrhexie and karyolysis are accompanied by modifications of nucleo-proteins, with depolymerization of the DNA and hydrolysis under the effect of cellular enzymes (Roger, 2007). The cytoplasmic and the nucleic fragmentation (Fgmt) of the meristematic cells of A. cepa treated by the aqueous extract of H. scoparium lets suggest that is about necrosis. Necroses are cellular death known as “accidental” which occurs at the time of tissue damage and it implies groups of cells (Moreau, 2006). The cells where this process takes place have increasingly raised ploïdies since the DNA is duplicated in loop. Moreover, the sizes of the nucleus being increased, the volume of the cells follows this tendency. This mechanism could play a part in the ways of adaptation of the plants to the abiotic stresses. On the other hand, cells treated by the aqueous extract of R. chalepensis presenting reduced nucleus sizes think is acts probably about a aneuploidy. The aneuploidy characterizes a cell which, following a change, does not have the normal number of chromosomes. With regard to the study the antigenotoxic activity of the aqueous extract of Withania frutescens Pauquy. at 1%, it is probable that this extract carries on a antigenotoxic activity on the meristematic cells of A. cepa treated by sodium azide at the concentrations 0.25% from where the mitotic index increase at a value of 61,71% (almost half).


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In addition, the antigenotoxic activity of the aqueous extract of W. frutescens on the meristematic cells of A. cepa. treated by sodium azide with the concentrations 0.75% and 1% is null. These results suggest that the sodium azide was not eliminated from the cells from where strong reduction in the mitotic activity to the quoted concentrations. CONCLUSION

The study of the antimitotic and genotoxic activity realized on the Allium cepa root tips shows that each extract tested acts according to a different mode of action. The presence of coumarins and the flavonoïdes in the extracts of these two plants could be responsable for the observed activity. The aberrations on the level of the mitotic phases would be the result of aneugenic effects of the substances contained in the extracts, causing a mitotic spindle dysfunctionment leading to chromosomal disorders lasting the cellular cycle and of clastogenic effects responsible for direct variable cytotoxic effects such as the breaks, or indirect, such as the inhibition of the synthesis of the enzymes or regulating proteins of the cellular division. The antigenotoxic effect observed on cells treated by sodium azide then by the aqueous extract of the leaves of W. frutescens arouses the interest to better characterize this plant chemically. REFERENCES Ahmed M. and Grant W.F., 1972. Cytological effects of the pesticides phosdrin and bladex in

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Activités biologiques des huiles essentielles brutes foliaires de Peganum harmala L. (Zygophyllaceae) sur les larves du cinquième stade et sur les adultes de Schistocerca gregaria (Forskål, 1775) (Orthoptera- Cyrtacanthacridinae) A. KEMASSI, A. OULD EL HADJ-KHELIL, Z. BOUAL, A. HAMID OUDJANA & M. D. OULD EL HADJ

Laboratoire de Protection des Écosystèmes en Zones Arides et Semi arides Université Kasdi Merbah-Ouargla, BP 511 Ouargla 30000 Algérie Received: December 30, 2011; Accepted: April 04, 2012 Corresponding author Email [email protected] Copyright © 2012-POSL

L’étude de la toxicité des huiles essentielles brutes foliaires de Peganum harmala L. récolté à Oued M’Zab dans la région de Ghardaïa (Sahara septentrional Est algérien), sur les larves L5 et les individus adultes du Criquet pèlerin, laisse remarquer un effet toxique chez ce locuste du désert. Après traitement, des larves du cinquième stade et des imagos S. gregaria, par les extraits bruts des huiles essentielles foliaires de P. harmala, des troubles de déséquilibres et des mouvements convulsifs sont observés. Ce sont les mêmes symptômes notés, chez des insectes traités par les insecticides. Les temps létaux 50 (TL50) évalués après traitement, sont de l’ordre de 06 mn 12’ pour les larves L5 et de 19 mn 21’ pour les individus adultes de cet insecte. Les larves du cinquième stade de ce locuste du désert, semblent plus sensibles à l’action des huiles essentielles brutes foliaires que les imagos. Mots clés: S. gregaria, Toxicité, P. harmala, Sahara, Huiles essentielles The biological activity of crude leaf essential oil of Peganum harmala L. harvested from Oued M'Zab in region of Ghardaïa (Algerian septentrional Sahara), on the larvae L5 and adult individuals of desert locust, showed a toxic effect in the desert locust. After treatment, the fifth stage larvae and imagos of S. gregaria, by crude extracts of P. harmala leaf essential oils, problems of imbalances and convulsive movements are observed. These are the same symptoms noted, in insects treated with insecticides. The lethal time 50 (LT50) measured immediately after treatment, are of the order of 06 mn 12 ' of L5 larvae and for 19 mn 21' for imagos of this insect. The fifth stage larvae of the desert locust seem more sensitive to the action of essential oils as imagos. Keywords: S. gregaria, Toxicity, P. harmala, Sahara, Essential oils 1. Introduction

En quête de nouvelles techniques pour protéger les cultures contre les insectes nuisibles afin d’augmenter la production agricole, pour une population mondiale sans cesse


ISSN 2170-1768


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croissante, tout en préservant l’environnement, les organismes et les institutions de recherches s’orientent vers la lutte biologique (APPERT et DEUS, 1982 ; ANTHELME et al., 2006). La possibilité d’utiliser des substances secondaires des plantes contre les insectes nuisibles en général et contre le Criquet pèlerin en particulier, a suscité beaucoup de travaux. Les plus récents sont ceux de ABBASSI et al. (2003a, 2003b, 2004, 2005), OULD EL HADJ et al. (2006), ZOUITEN et al. (2006), IDRISSI et HERMAS (2008), DOUMANDJI-MITICHE et DOUMANDJI (2008), AMMAR et N’CIR (2008) et KEMASSI et al. (2010). Le Sahara dispose d’une biodiversité floristique exceptionnelle, constitue d’environ 480 espèces (MAIRE, 1933) dont on dénombre 162 espèces endémiques dans le Sahara Septentrional seul et à la quelle s’ajoute une tradition séculaire de pharmacopée traditionnelle. Plusieurs espèces sont connues par leurs propriétés thérapeutiques remarquables (QUEZEL, 1963). Les plantes spontanées des zones arides sont considérées comme l’une des ressources phytogénétiques qui présentent un intérêt agronomique, économique, écologique mais aussi stratégique (UNESCO, 1960). Face à ce constat, et pour mieux caractériser les potentialités de la flore saharienne et valoriser, la présente étude recherche à partir de Peganum harmala (Zygophyllaceae); une plante spontanée du Sahara septentrional Est algérien, épargnée par le Criquet du désert, ses caractéristiques acridicides. 2. Méthodologie de travail 2.1. Matériel biologique Le matériel biologique est constitué de larves du cinquième stade (L5) et d'imagos du Criquet pèlerin et des feuilles de Peganum harmala L., récolté à Oued M’Zab (région de Ghardaïa Sahara septentrional Est algérien). 2.1. Elevage de Schistocerca gregaria Les larves du cinquième stade et les imagos du Criquet pèlerin expérimentés, sont issus d'un élevage de masse maintenu au laboratoire de Protection des Ecosystèmes en Zones Arides et Semi-arides du Département des Sciences Agronomiques de l’Université Kasdi Merbah-Ouargla. 2.1.2. Matériel végétal Peganum harmala L. est une plante herbacée vivace de la famille de Zygophyllaceae, à tiges ordinairement peu rameuses, de 30 à 90 cm de haut, à entrenœuds assez courts. Elle présente des feuilles allongées et irrégulièrement divisées en multiples lanières très fines, à fleurs blanches sales grandes avec des sépales inégaux persistants qui dépassent la corolle et des pétales crèmes lavés de rose-orangé à nervures jaunes, oblongs et subsymétriques. Cette plante pousse en Europe australe et austro-orientale, Asie mineure, Tibet, Iran, Turkestan, Syrie, Arabie, Egypte et en Afrique du Nord. En Algérie, P. harmala est commune aux hauts plateaux, au Sahara septentrional et méridional, et aux montagnes du Sahara central (MAIRE, 1933; OZENDA, 1991; U.I.C.N., 2001). Elle est utilisée par les populations locales en fumigation pour traiter les convulsions des enfants; en décoction et pommade pour le traitement des fièvres et en frictions pour soigner les rhumatismes. P. harmala présente des propriétés anthelminthique, antipaludique, antispasmodique,


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enivrante et sudorifique. C'est une plante non broutée par les animaux (OZENDA, 1991; UICN, 2001). 2.2. Extraction des huiles essentielles Les feuilles de P. harmala soumises à l’extraction sont prélevées à partir de plantules en stade végétation, récoltées de leur biotope d’existence naturelle loin des endroits anthropisés. A l’aide d’un montage d’hydrodistillation simple, les feuilles fraîches de P. harmala, sont portées à ébullition pendant 6 heures, la décantation est ensuite réalisée. Le produit obtenu est déshydraté à l’aide du sulfate de sodium anhydre, afin d'éliminer le peu d'eau susceptible d'avoir été retenue dans la phase organique. Le produit ainsi obtenu, est une huile essentielle pure, servira pour le traitement des insectes. 2.3. Etude de la toxicité A l’aide d’un micro-pulvérisateur (Ultra Bas Volume), les huiles essentielles pures, sont pulvérisées directement sur les juvéniles du cinquième stade et sur les adultes de S. gregaria afin d’étudiées leur action par contact. Il est noté après traitement l’activité motrice et le taux ainsi que le temps de mortalité. L’expérimentation est suivie jusqu’à la mortalité de la totalité des individus des lots traités. A cet effet, 4 lots d’insectes à raison de 60 individus dont 30 mâles et 30 femelles par lot sont constitués, ce qui fait un total de 240 individus. Deux lots sont des larves du cinquième stade dont un pour le témoin et l’autre pour le traitement et, les deux autres sont constitués par des imagos avec un pour le témoin et l’autre pour le traitement. 2.4. Calcul du temps létal 50 (TL50) Le temps létal 50 (TL50), correspond au temps nécessaire pour que 50% des individus d’une population, meurent suite à un traitement par une substance quelconque. Il est calculé à partir de la droite de régression des probits correspondants au pourcentage de la mortalité corrigée en fonction des logarithmes du temps de traitement. Il est utilisé la formule de Schneider et la table des probits. Formule de Schneider:

MC = [M2-M1/100-M1] x 100

MC: % de mortalité corrigée; M2: % de mortalité dans la population traitée; M1 : % de mortalité dans la population témoin.

3. Résultats 3.1. Effet des huiles essentielles de Peganum harmala sur la mortalité des adultes et des larves L5 de S. gregaria Au vu des résultats des figures 1 et 2, il ressort que les huiles essentielles des P. harmala présentent un effet létal aussi bien sur les larves L5 que sur les adultes du Criquet pèlerin. Les larves du cinquième stade semblent plus sensibles que les adultes. Elles meurent les premières. Chez les larves L5, la mortalité est notée à partir de la troisième minute, après le


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traitement et 100% de mortalité est atteinte au bout de 08 mn 30’, alors qu’elle est au bout de 30 mn 18’ chez les adultes. Mais les premiers cas de mortalité sont perceptibles à partir de la vingt-deuxième minute au début du traitement chez les adultes. En revanche, aucune mortalité n’est enregistrée chez les individus du lot témoin et que toutes les larves L5 ont achevées leur mue imaginale au bout de 7±1 jours. Par ailleurs, il est important de souligner que les mâles que ce soit leurs stades de développement, larves L5 ou bien adultes semblent plus sensibles, elles meurent aussi tôt que les femelles. En outre, des troubles d’équilibre, des mouvements convulsifs, défécation intense, perte de la capacité de se percher à un support suite l’incapacité de jointure tarsique, tremblements d’appendices et accroissement de rythme respiratoire sont observés. Ces manifestations témoignent l’action neurotoxique et organohalogéne des huiles essentielle de P. harmala sur le Criquet pèlerin qui est probablement la conséquence de l’effet de ses extraits végétaux sur le système nerveux des criquets. L’action neurotoxique des huiles essentielles de P. harmala sur les larves du cinquième stade et adulte du Criquet du désert émane probablement de l’effet des différents composés chimiques qu’elles constituent et en particulier les alcaloïdes sur le système nerveux du Criquet du désert (ABBASSI et al., 2005). Des manifestations analogues sont constatées chez les criquets traités par les insecticides organohalogènes sauvons utilisés en lutte contre les criquets essaimant (CHAUVIN, 1956; MORETEAU, 1991). L’examen des cadavres des criquets traités sous la loupe binoculaire, fait ressorti l’inexistence des lésions au niveau de la cuticule, pour cela, les huiles essentielles de cette plante n’exercent guère d’effets sur la cuticule et leur action par inhalation peut être envisagée en raison des caractères volatiles des ses essences végétales. ISMAN (2000) et CHIASSON et BELOIN (2007), en étudiant l’activité biologique des huiles essentielles de nombreuses plantes dont l’origan, basilic, marjolaine, thym, sauge, laurier, romarin, lavande et autres sur les Thrips, les Pucerons, les Aleurodes Coléoptères et les Hyménoptères, notent que les huiles essentielles agissent directement sur la cuticule des insectes et acariens à corps mou tel que les Thrips, les Pucerons, les Aleurodes et certains acariens. Par contre, elles sont avérées moins efficaces sur les insectes à cuticule dure tels que des Coléoptères et Hyménoptères adultes et certains Acariens prédateurs. En revanche, il est à noter également que les individus mâles que ce soit leur stade de développement larves ou bien adultes meurent avant les femelles, cela est probablement lié à la différence du poids existant entre les mâles et les femelles du Criquet pèlerin. Généralement chez les locustes le dimorphisme sexuel est bien apparent, les individus mâles pèsent moins comparativement aux femelles. Parallèlement, il est admis que la résistance aux toxiques diffère d’une espèce à une autre, et pour la même espèce, elle est relative à plusieurs facteurs dont le poids est un facteur essentiel. 3.2. Temps létal 50 (TL50) des huiles essentielles de Peganum harmala L. sur les adultes et les larves L5 de Schistocerca gregaria Le tableau 1 et la figure 2 A, B regroupent les équations et les droites de régression, les coefficients de régressions et les valeurs de TL50 et TL90 évalués pour les huiles essentielles de cette plante saharienne sur les larves L5 et les imagos du Criquet pèlerin. L’évaluation des temps létaux 50 (TL50) et 90 (TL90) pour les huiles essentielles de P. harmala sur les larves L5 et adultes de S. gregaria, a permet de confirmer la rapidité d’action de ces extraits sur les larves L5 comparativement aux adultes. Le TL50 rapporté pour les larves du cinquième stade étant plus court, il est de l’ordre de 06 mn 12’, quant pour celui évaluer pour les adultes, est de 19 mn 21’. Quant aux temps létaux 90 (TL90) évalués, ils sont de 07 mn. 56’ et 41mn. 43’ pour les larves du cinquième stade et les


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adultes respectivement. Cela affirme la sensibilité des larves par apport aux adultes. D’ailleurs, il est admis communément que la résistance des insectes aux toxiques accroît en fonction du stade de développement, et que les adultes sont généralement plus résistants que les larves (CHAUVIN, 1956).

Tableau 1- Équation de régression, coefficient de régression et les TL50 et TL90 calculés pour les huiles essentielles de Peganum harmala

Stade Équation de régression Coefficient de régression (R²)

Temps létal 50 (TL 50) (minute)

Temps létal 90 (TL 90) (minute)

Larve L5 y = 9,0624x – 1,8647 0,9042 06 mn 12’ 07 mn. 56’

Adulte y = 3,8067x – 2,8485 0,3542 19 mn 21’ 41mn. 43’

Figure 1 Cinétique de la mortalité cumulée des larves L5 de S. gregaria témoins et traitées par les huiles essentielles de Peganum harmala

Figure 2 Cinétique de la mortalité cumulée des adultes de S. gregaria témoins et traitées par les huiles essentielles de Peganum harmala


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Huiles essentielles de P. harmala dans le temps sur les adultes de S. gregaria.

Huiles essentielles de P. harmala dans le temps sur les larves L5 de S. gregaria

Figure 2 (A, B) Action des huiles essentielles de Peganum harmala sur les larves du cinquième stade et sur les adultes Schistocerca gregaria dans le temps.

4. Conclusion

L’étude de la toxicité des huiles essentielles de Peganum harmala sur les larves du cinquième stade et les adultes de Schistocerca gregaria mette en évidence leur pouvoir insecticide sur le Criquet pèlerin. Les larves du cinquième stade sont plus sensible à l’action biocide des huiles essentielles comparativement aux adultes, temps létaux 50 (TL50) évalué pour les larves L5 sont plus courts par apport à ceux rapportés pour les adultes de S. gregaria. Des symptômes de neurotoxicité sont rapportés soit, des troubles de mouvement, mouvements convulsives, l’incapacité de ce percher à un support est également notés chez les larves et les adultes exposés aux huiles essentielles de P. harmala, cela témoigne l’effet neurotoxique de ses extraits végétaux sur le Criquet du désert. Dans cette optique, l’utilisation des huiles essentielles de P. harmala contre le Criquet pèlerin pourrait être envisagée. Ces composés naturels pourraient constitués un élément de base pour la synthèse des nouvelles molécules à efficacité particulière sur les acridiens et sans risque d’intoxication environnementale. Néanmoins, au préalable, il est approprié d’affiner les connaissances sur la composition chimique de cette essence végétale, de ces propriétés fonctionnelles puis d’en déterminer les modalités et possibilités d’applications sans nuire l’écosystème et dans le respect de la santé humaine. 5. Références bibliographiques ABBASSI K., ATAY-KADIRI Z. and GHAOUT S., 2003a.- Biological effects of alkaloïds

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A B


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APPERT J. et DEUS J. 1982.- Les ravageurs des cultures vivrières et maraîchères sous les tropiques. Ed. Maison neuve et Larose, Paris, 419 p.

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Etude du pouvoir antibactérien de l’extrait méthanolique de la racine de Bryonia dioica Jacq., de la région d’Oran M. CHENNI 1, S. NEGGAZ 2, Z. FORTAS 2 & D. El ABED 1

1 Laboratoire de Chimie Fine 2 Laboratoire de Biologie des microorganismes et de Biotechnologie Faculté des Sciences, Université d 'Oran, Es-Sénia, Oran, Algérie Received: March 09, 2012; Accepted: June 17, 2012 Corresponding author Email [email protected] Copyright © 2012-POSL

Le présent travail porte sur l’évaluation du pouvoir antibactérien de l’extrait méthanolique de la racine de la Bryone (Bryonia dioica Jacq.) dénommée «Fashira ou Querioua» en arabe appartient à la famille des Cucurbitaceae. Les résultats des tests d’activité biologique réalisés sur l’extrait méthanolique avec six (06) espèces bactériennes (Bacillus subtilis, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus), par la méthode de diffusion en milieu solide, ont montré que la racine de la Bryone possède un large spectre d’action sur toutes les espèces bactériennes testées. Mots clés : Bryonia dioica Jacq., Cucurbitaceae, Extrait méthanolique, Activité antibactérienne.

1. Introduction

La médication par les plantes date depuis les temps les plus reculés. Actuellement, elle connait une recrudescence auprès des populations. Près de 80% de la population africaine ont recours aux plantes pour se soigner et n’ont pas accès aux médicaments dits modernes. Au cours de la dernière décennie, les extraits des plantes médicinales et aromatiques suscitent un grand intérêt, face à la méfiance accrue par l’usage des produits chimiques, aussi bien dans le domaine thérapeutique que dans le domaine alimentaire. L’utilisation des plantes ou de leurs extraits pourrait constituer une excellente alternative aux problèmes de résistance des antimicrobiens [1,2]. Aussi, un grand intérêt a été réservé à l’étude des microorganismes, tant de point de vue biologique, que de point thérapeutique, suite à l’apparition de la résistance des souches aux


ISSN 2170‐1768


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antibiotiques les plus communément utilisés et aux complications que ces germes produisent chez des patients à profil clinique particulier [3,4]. Dans le cadre de l’axe de recherche sur la valorisation de la biodiversité floristique algérienne et plus particulièrement des plantes aromatiques et médicinales, nous avons entrepris l’étude microbiologique de la racine de la Bryone dioïque dite Fashira ou Querioua, appartenant à la famille des Cucurbitaceae [6]. En Algérie, cette plante est commune partout dans les régions du Tell et plus rare ailleurs. Elle pousse parmi les broussailles et dans les forêts [7]. Il est à noter que dans l’ouest Algérien particulièrement à Oran et à Mascara, la racine sèche de la Bryone est populairement appelée ‘’Berestom‘’ par confusion avec celle du genre Aristolochia (A. baetica L. & A. paucinervis) qui appartient à la famille des Aristolochiaceae. Elle est recommandée pour le traitement de cancer sous forme de poudre avec de l’eau parfois mélangée avec du miel en raison de son goût amer. C’est un remède populaire utilisé comme purgatif et dans le traitement de la goutte [8]. Elle est recommandée essentiellement dans le cas des affections rhumatismales douloureuses et inflammatoires, tels que l'ulcère du duodénum, l'asthme, les bronchites et les pleurésies [9]. Elle est préconisée souvent dans le traitement de nombreux cancers (colon, abdomen, sein, peau, glande,… etc.) à tous les stades de la cancérogenèse [10]. Afin de justifier scientifiquement l’utilisation de la Bryone en médecine traditionnelle, nous nous sommes proposés de tester in vitro le pouvoir antibactérien de l’extrait méthanolique de la racine de cette plante sur la croissance de différentes souches bactériennes. 2. Matériel et méthodes 2.1. Préparation de l’extrait méthanolique L’extrait méthanolique testé a été obtenu par extraction au soxhlet à partir de la racine de la plante Bryone dioïque récoltée dans la localité de Bouamama (région ouest d’Oran) en Octobre 2008 (Figure 1 et 2).

Figure 1: Origine de la Bryone


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Après avoir récupéré la racine, nous l’avons lavée à l’eau courante, découpée en rondelles (ou rouelles), puis séchée au soleil et conservée à température ambiante, dans un endroit sec et à l’abri de la lumière (figure 3) [11]. Les rondelles sont ensuite broyées afin d’obtenir une poudre fine, qui sera utilisée dans nos expérimentations.

2.2. Microorganismes testés L’activité antimicrobienne de l’extrait méthanolique de la racine de la Bryone dioïque est testée sur six (06) souches bactériennes (tableau 1).

Tableau 1 : Souches bactériennes testées

Souches bactériennes Provenance Enterococcus faecalis Institut Pasteur d’Oran Forme de sphère :

Cocci à Gram + Staphylococcus aureus ATCC 6538 Institut Pasteur d’Oran Bacilles Gram+ Bacillus subtilis ATCC 6633 Institut Pasteur d’Oran

Escherichia coli ATCC25922 Institut Pasteur d’Oran

Proteus mirabilis ATCC 29906 LBMB*

Forme de bâtonnet : Bacilles

Gram - Pseudomonas aeruginosa ATCC 14028 Institut Pasteur d’Oran

* Laboratoire de Biologie des Microorganismes et de Biotechnologie de l’Université d’Oran Es-sénia.

Figure 2 : Racine de la Bryone fraîche Figure 3 : Racine de la Bryone sèche en rondelles


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2.3. Préparation des suspensions des microorganismes et incorporation au milieu de culture Les suspensions bactériennes sont préparées à partir des pré-cultures de 24 heures, sur gélose nutritive, dans 10 mL de bouillon nutritif et ajustées à l’étalon 0,5 Mac Farland (108UFC/mL). Après 24 heures d’incubation à 37°C, 1mL d’inoculum bactérien est mis dans chaque boîte de Pétri contenant 20 mL de milieu Mueller-Hinton gélosé en surfusion. Trois disques de papier filtre de 6 mm de diamètre sont déposés dans chaque boîte de Pétri, à la surface du milieu ensemencé pour éviter le chevauchement des zones d’inhibition. Les disques sont préalablement imprégnés de l’extrait méthanolique dissout dans le méthanol à 96% pour les cultures testées et uniquement de méthanol pour les cultures témoins. Pour chaque souche bactérienne, nous avons effectué trois répétitions. Pour une bonne diffusion du contenu des disques, les boîtes sont laissées à la température ambiante 15 mn avant de les incuber à 37°C. La sensibilité des souches bactériennes à l’extrait méthalonique est estimée par la mesure des diamètres des zones d’inhibition. Les cultures où il y a une croissance visible à l’œil nu et supérieure à 10 mm sont considérées comme positives [12]. 3. Résultats et discussion

Les résultats des tests, par la méthode de diffusion en milieu solide, sont résumés dans le tableau 1 et illustrés par l’histogramme de la figure 4 [13].

Tableau 2: Diamètres des zones d’inhibition des bactéries testées, après 24h d’incubation à 37°C

Souches bactériennes sensibles à l’extrait méthanolique Staphylococcus aureus ATCC 6538

Enterococcus faecalis

Bacillus subtilis ATCC 6633

Escherichia coli ATCC25922

Pseudomonas aeruginosa

Proteus mirabilis

Φ 14 mm 14 mm 12 mm 12 mm 10 mm 10 mm

D’après les résultats de l’évaluation de l’activité antibactérienne, on constate que l’ensemble des souches bactériennes testées son sensibles à l’action inhibitrice de l’extrait méthanolique de la racine de la Bryone. Les souches Staphylococcus aureus et Enterococcus faecalis sont les plus sensibles à l’effet de l’extrait méthanolique. Alors que Escherichia coli et Bacillus subtilis peuvent être considérées sensibles. Pseudomonas aeruginosa et Proteus mirabilis sont faiblement sensibles. L’action de l’extrait méthanolique sur les microorganismes possède un effet très important sur les bactéries à Gram+ et moindre sur les bactéries à Gram-. Cette différence d’activité est due à la structure de la paroi de la cellule cible.


82

0

2

4

6

8

10

12

14

16

Diamètre (mm)

Proteus mirablis

Pseudomonas aeruginosa

Bacillus subtilis

Escherichia coli

Enterococcus faecalis

Staphylococcus aureus

Souches Bactériennes

Figure 4 : Effet de l’extrait méthanolique de la Bryone sur la croissance des bactéries testées 4. Conclusion

Les résultats de cette étude montrent clairement que l’extrait méthanolique de la racine de la Bryone est doté d’un large spectre d’activité inhibitrice sur les souches bactériennes testées et particulièrement les bactéries à Gram+ comme Staphylococcus aureus et Enterococcus faecalis. Références [1] Organisation Mondiale de la Santé (OMS), Aide mémoire, N° 134, révisé Mai 2003. [2] Pousset, J.L., Medecine Tropicale, 2006, 66, p.606-609. [3] Farnsworth, N. R., Akerele, O., Bingel, A.S., Soejarto, D.D., Guo, Z., Bulletin de l’Organisation

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www.pcbsj.webs.com PhytoChem & BioSub Journal Vol. 6 (2) 2012 ISSN 2170-1768

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The Saharan medicinal plant Limoniastrum feei: Ethnomedical survey and preliminary phytochemical screening of antibacterial extracts

S. RAHMANI 1,2, L.ZIANE 1, N. BELBOUKHARI 1,2 & A. CHERITI 1

1) Phytochemistry & Organic Synthesis Laboratory 2) Bioactive Molecules and Chiral Separation Laboratory

University of Bechar, 08000 Bechar, Algeria Received: December 18, 2011; Accepted: March 30, 2012 Corresponding author Email [email protected] Copyright © 2012-POSL Limoniastrum feei (plumbagenaceae) a medicinal plant, used in Saharan ethnopharmacopeae to treat gastric tract, hepatit desorder and cought. The antibacterial extracts from leaves, stem and twig of this plant are screened for the principal classes of secondary metabolites, such as Alkaloids, Saponins, Terpenes, Tannins, Flavonoids, Steroids and Cardenolids. Key words: Limoniastrun feei, bioactive extract, phytochemical screening, ethnopharmacology, Sahara Introduction

Compounds such as quinine, morphine, aspirin (a natural product analog), digitoxin and many others, so natural products are so important to undertake research are that they can be a source of new compounds. [1]. A dozen potent drugs have been derived from plants including: derived diosgenin; reserpine and pilocarpine. Other natural products are metabolites from fungi, bacteria, algae, and marine organisms. So, the diversity of structures obtained and the different therapeutic activities shown for the natural products make that the isolation, identification, synthesis and biosynthesis of new natural compounds continue to be a field of enormous interest [2]. Natural products have made enormous contributions to human health and have served as an important source of drugs since ancient times and about half of the useful drugs today are derived from natural sources. One of the most efficient ways of finding new bioactive compounds is collecting data on the use of medicinal plants in traditional pharmacopeia. Nearly 50,000 species of higher plants have been used for traditional treatment of illness. In systems of traditional healing, major pharmaceutical drugs have been either derived from or patterned after compounds from biological diversity [3]. Algeria with its large area and diversified climate has a varied flora, which is a source of rich and abundant medical matter and, in particular, Sahara part constitutes an important reservoir


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of many plants which have not been investigated until today. Among this flora, Limoniastrum feei belonging to plumbagenaceae family is widely applied in traditional folk medicine. [4-8]. The aim of this study is to validate the ethnomedical use of the Saharan medicinal plant Limoniastrum feei and to evaluate the antibacterial extracts by phytochemical screening. In earlier works we have reported the antimicrobial activity of aerial part crude extracts from Limoniastrum feei [9] , and we have isolated flavonoids and saponins from the methanolic extract of leaves and stem part of this specie [10, 11] Plant materials and extraction

Aerial parts of Limoniastrum feei were collected in March – May 2005 from Boukais (Bechar district) south-western Algeria. A voucher specimen is deposited at the herbarium of Phytochemistry and Organic Synthesis Laboratory under CA99/14 All parts of limoniastrum feei (leaves stem and twig) were cut into small pieces and shade dried at room temperature for one week, individually ground to a fine powder and stored in airtight polythene bags protected from sunlight until use. The solvent extraction of plant powder is done by using soxhlet apparatus in reflux for 3 hours. The extract is evaporated in vacuo apparatus to obtain a residue for the phytochemical screening. Botanical description

Limoniastrum feei (syn. Ceratolimon feei , Bubania Feei ) - Plumbagenaceae- ( Figure 1), known under the name vernacular "Melefet Khadem", is a perennial shrub with densely ramified stems at the base, rather small, not exceeding 40 cm.The leaves form a basal rosette; they are lanceolated, approximately 5 cm. Flowering starts in early spring (end of February) and continues until late spring in May with a nice purplish red color of flower. Ecologically this Saharan specie thrives particularly on the stony grounds of the djebels, its occurrence on gravellysandy wadi beds. [5, 12, 13].

Figure 1: General morphology of Limoniastrum feei

Stem

Twig

Leaves

Leaves

Twig

Stem


85

Ethnomedical survey The ethnomedical survey was conducted in Bechar district (Figure 2). The majority of

the population consists of four important origins: Dewimenâ, Ouled djerir, Cheraga and Ksouri. The language of the inhabitants is Arabic and Berber. The people's main source of living in this region is farming [5, 6] The ethnomedical survey carried out during three months especially in Bechar town. The interviewing question include: Vernacular name, plant parts used (dried or fresh), medicinal use, preparation methods and daily dosage. The information is taken from aged people especially women and herbalist witch have interesting traditional knowledge about plants. The information collected from the survey on the traditional uses Limoniastrum feei are shown in the following figure.

Preparations are usually made by using the aerial parts of the plant boiled in hot water. The water preparation is applied in the treatment of gastric disorders, hepatitis and cough.

Figure 2: The location of Study region, Algeria.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

gastric disorrders hepatit cough


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Phytochemical screening of the antibacterial extracts In our previous studies conducted in the biological screening of Saharan medicinal

plants ,we have found that methanolic and heptane extracts of the three parts of Limoniastrum feei (leaves, stem and twig) have an interesting antibacterial effects ( Table 1). Thus we think that carrying out a phytochemical screening on the bioactive extracts for this plant is necessary to conducting a future works on the isolation and identification of natural compounds. [6, 9].

Table 1: Selected antibacterial Extracts

The crude of Metenolic and Heptane extracts of the three parts of Limoniastrum feei were screened for the presence of Alkaloids, Saponins, Terpenes, Tannins, Flavonoids, Steroids and Cardenolids, by using standard procedures to identify the constituents as described in literature [14, 15]. The results of phytochemical screening were given in the Table 2.

Table 2: Phytochemical screening of the Methanolic and heptane extracts from Limoniastrum feei

Leaves Twigs Stems

M M M H

Alkaloïds - - - -

Saponins + + + + Terpenes + + - +

Tanins + + + + Flavonoïds + + + +

Flavonoïds aglycon + + + +

Glycosids flavonoïds + + + +

Steroids + - - + Cardenolids - + + + (M: Methanol, H: Heptan , + : detected, - : not detected)

Phytochemical Screening based on tests of colouration and precipitation was undertaken by the bioactive extracts (Methanol and Heptan). The tests carried out on leaves, Twings and Stems show presence of Saponins, Terpens, Tannins, Flavonoids (free and glycosides) and

Bacteria

Parts of plant

Escherichia

coli

Pseudomonas

aeruginosa

Enterococcus

facalis

Klebsiella

pneumoniae

Staphylococu

aureus

Leaves MeOH MeOH MeOH MeOH MeOH

Twig MeOH MeOH MeOH MeOH MeOH

Stem MeOH MeOH _ Heptane MeOH


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Cardenolids. However we observed less presence of steroids and absence of Alkaloids. From the results it is evident that all parts of the Limoniastrum feei gave a positive test for a tested class of natural compounds whereas we noted the absence of Cardenolids in leaves and steroids in Twing and Stems. Conclusion

Limoniastrum feei (plombagenaceae) has great importance due to its ethnobotanical place in Saharan traditional medicine, for treatment of particularly gastric disorders. The phytochemical screening of the antibacterial extracts indicates the presence of Saponins, Tannins, Flavonoids and Cardenolids. The presences of this class of compounds are in agreement of the observed antibacterial activities. Finally, Limoniastrum feei can be a potential source of useful drugs and further studies are required to isolate the pure active metabolites. References [1] Newman, D. J., Cragg, G. M. 2007, Journal of Natural Products, 70, 461. [2] Hostettmann, K., Potterat, O., Wolfender, J.-L. 1998, Chimia. 52, 10. [3] Bisset N. 1994, ‘Herbal drugs and phytopharmaceuticals. A handbook for practice on a

scientific basis.’ Ed. Medpharm. Sc. Publishers, Sttutgarts-CRC Press, Boca Raton. [4] Cheriti, A.; Belboukhari, N.; Hacini, S., 2004 , Iran. J. Pharm. Res, , 3(2), 51. [5] Cheriti A., 2000, ‘, Plantes médicinales de la région de Bechar, Sud ouest Algérie

(Ethnopharmacologie) Rapport CRSTRA, Algeria. [6] a) Cheriti, A., Belboukhari, N.& Hacini, S., 2001. Annales Univ. de Bechar,1. 4. b)

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ancienne et savoirs populaires’. IBIS Press. [14] Trease, GE., Evans, W.C., ‘Pharmacognsy’, 1989, 11th Ed. Macmillian publishers, [15] Harborne, J.B., 1978, ‘Phytochemical methods’,3rd Ed., Chapman and Hall, London


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Etude théorique de la réaction de Diels-Alder : Effet de substitution par un métal de transition sur la cinétique et la régiosélectivité d’addition H. DJERADI1 , A. KRALLAFA1 , A. BOUYACOUB1 & M. LAHRECHE2

1) Laboratoire de Chimie Physique Macromoléculaire 2) Laboratoire de chimie organique appliqué Université Es Senia d’Oran, Algérie Received: March 24, 2012; Accepted: June 30, 2012 Corresponding author Email [email protected] Copyright © 2012-POSL Depuis sa découverte il y a 75 ans, la réaction de Diels-Alder est devenue un des outils le plus puissant dans la synthèse organique. Bien que la cycloaddition [4+2] substitué par une fonction carbonyle a été largement étudiée, les réactions impliquant les métaux de transition comme substituant ont été à peine décrite. Nous proposons dans ce travail une étude théorique basée sur des calculs quanto-chimique, de la réaction d’une mole du butadiène substitué en position 2 par un TiCl3 avec deux moles d’acroléine à l’aide de la méthode B3LYP/6-31G*. Deux chemins réactionnels sont envisagés. Une cycloaddition [4+2] s’effectue en premier, suivie par une addition [1,4]. Soit l’addition [1,4] précède la cycloaddition [4+2]. Mots clés : Cycloaddition [4+2], Addition(1,4), Régioselectivité, TiCl3, DFT Introduction

La réaction de Diels-Alder appelée la cycloaddition (4+2) fut mise au point en 1928 [1] par Otto Paul Hermann Diels et Kurt Alder D’Allemagne. Ils ont reçue conjointement le prix Nobel de chimie en 1950 pour avoir découvert et développé cette réaction , qui est devenue un des outils les plus important dans la synthèse organique[2] . Une quantité énorme de travaux expérimentaux et théoriques a été consacrée à la cycloaddition [4+2 ] entre un cisoid conjugué et un Alcène. Les résultats de ces travaux ont montré une remarquable régio et stéréospécificité menant à la formation des cycles à six chêneaux avec le haut contrôle de la stéréochimie [3]. L’importance de la réaction de Diels-Alder vient du fait qu’elle est généralisable aux alcène et aux diènes fonctionnalisés. On peu ainsi accéder aux cyclohexènes substitués qui constituent


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une partie du squelette de nombreuses molécules complexes tels les stéroïdes[4], les sucres[5] et autres[6] . Le mécanisme de la réaction de Diels-Alder est bien connu. Cependant les effets de substitution sur la cinétique et la régioselectivité d’addition le sont moins. Dans le but d’étudier l’effet de substituant TiCl3 en position 2 du butadiène sur la cinétique et l’orientation de la cycloaddition (4+2) ainsi que sa compétitivité l’addition (1,4), nous avons déterminé à l’aide de la méthode B3LYP/6-31G* les chemins réactionnels des différents modes d’addition de ces deux réactions . Méthode de calcul

La géométrie de tout les réactants, les états de transition, les intermédiaires réactionnels et les produits ont été optimisée avec la méthode DFT [7], utilisant la série Gaussien(98)[9]. En employant des fonctions hybrides d’échange de corrélation B3LYP[10], associées aux bases de fonction atomique de type Gaussien double-zeta contenant des orbitales de polarisation pour une approche incluant des métaux de transition . La 6-31 G* a été ainsi choisi, sachant que la B3LYP /6-31G* a été avec succès utilisé dans les réactions de cycloaddition [11]. Un calcul de fréquence a été exécutée pour tous les points stationnaires pour vérifier les états de transition. Résultats

L’addition d’une mole du butadiène substitué en position 2 par unTiCl3 avec deux moles d’acroléine peut se faire par deux chemins réactionnels (figure 1). Passant par une cycloaddition [4+2] suivi par une addition [1,4] ou bien l’addition [1,4] s’effectue en premier suivi par la cycloaddition[4+2].

4+2 (1,4)

4+2(1,4)

Figure 1 : schéma réactionnel des deux réactions étudiés


90

Mais lorsque le diène substitué par un TiCl3 est en présence d’un seul équivalant d’acroléine dans ce cas nous avons une compétition entre la cycloaddition [4+2] et l’addition (1,4). Nous tentons d’étudier les deux réactions utilisant la méthode B3LYP/6-31G* à fin de prédire le chemin réactionnel le plus probable. 1- Etude de la cycloaddition[4+2]

Figure 2 : schéma réactionnel de la cycloaddition[4+2] Nous avons optimisé les réactifs (1, 2, 3) utilisés pour cette étude. Les principaux paramètres géométriques sont représentés dans la figure 3 (les distances en Angströms, et les angles en degrés)

L’approche des deux réactifs 1 et 2 passe par un minimum représentant un cluster caractérisé par la formation d’une liaison entre le doublet de l’oxygène de l’acroléine et une orbitale (d) de l’atome Ti. L’énergie de stabilisation de ce cluster est estimé à – 9.2 kcal/mol

1 R = H 2 3 C5C6=1.338 C1C2=1.348 C1C2=1.345 C2C3=1.468 C2C3=1.475 C6C5CO -0.029 / cis C3C4= 1.340 C3C4=1.339 179.967 /trans C1C2C3C4= 53.90 C1C2C3C4=179.780

Figure 3 : structure des réactifs

Figure 4 : formation d’un cluster


91

quand au structures des états de transition optimisés ; peuvent mener au différents conforméres, de tout les modes d’addition dans le nombre est huit, selon la position du groupement TiCl3 par rapport la fonction carbonyle : une foie de même coté et une foie de part et d’autre ; et aussi par rapport la double liaison de la fonction carbonyle en a deux forme (Endo /Exo) qui sont présentés dans la figure 5

TS1(1,4 exo-cis) TS2(1,3 exo-cis) TS3(1,3 endo-trans)

TS4(1,3 exo-trans) TS5(1,4 exo-trans) TS6(1,4 endo-trans)

TS7(1,3 endo-cis) TS8(1,4 endo-cis)

Figure 5 structures des états de transition


92

Les résultats de l’optimisation sont donnés dans le tableau 1 suivant :

Tableau 1 : Résultats de l’optimisation des états de transitions

TS1 TS2 TS3 TS4 TS5 TS6 TS7 TS8

∆E# (kcal/mol) 17.7 17.5 15.7 15.2 12.2 11.9 1 .5 -1.8

C1C2 (Å) 1.389 1.390 1.404 1.403 1.386 1.404 1.350 1.381

C2C3 (Å) 1.423 1.422 1.430 1.430 1.423 1.433 1.437 1.452

C3C4 (Å) 1.383 1.381 1.364 1.350 1.383 1.363 1.383 1.350

C4C5 (Å) 2.210 2.257 2.683 2.096 2.176 2.799 2.147 3.291

C5C6 (Å) 1.383 1.392 1.392 1.390 1.392 1.390 1.398 1.390

C1C6 (Å) 2.377 2.324 2.066 2.248 2.461 2.039 3.527 2.248

C2Ti (Å) 2.019 2.008 1.999 2.096 2.008 2.000 2.136 2.096

Les résultats d’optimisation des produits sont regroupés dans la (figure 6) et le tableau 2, les valeurs inscrites sont les énergies de réactions, exprimés en kcal/mol et les longueurs de liaison données en Angstrœm Pour toute les orientations obtenus la réaction est exothermique.

Tableau 2 : Energie et parametres géometriques des produits obtenus

Pr1 Pr2 Pr3 Pr4 Pr5 Pr6 Pr7 Pr8

∆Er kcal/mole -39.6 -40.2 -41.1 -41.2 -41.7 -42.2 -43.9 -44.3

C1C2 (Å) 1.519 1.521 1.522 1.520 1.518 1.521 1.522 1.522

C3C4 (Å) 1.352 1.351 1.352 1.352 1.354 1.353 1.354 1.353

C4C5 (Å) 1.508 1.509 1.510 1.508 1.506 1.509 1.507 1.507

C5C6 (Å) 1.562 1.541 1.544 1.534 1.550 1.534 1.536 1.532

C1C2 (Å) 1.546 1.544 1.531 1.543 1.545 1.531 1.634 1.545

C6C1 (Å) 1.547 1.539 1.539 1.549 1.559 1.550 1.548 1.538

C2Ti (Å) 1.998 2.006 2.006 2.007 1.995 2.004 2.003 2.002

C1C2C3C4° deg 125.5 124.7 124.7 124.8 125.4 124.6 124.9 124.9


93

Pr7 Pr8

1 2

3 4

5

6 1

2

3 4 5

6

Pr5 Pr6

12

34

5

6 12

34

5

6

Pr1 Pr2

12

3 4

5

6 1 23

4 5

6

Pr3 Pr4

12

3 4 5

6 12

3 4

5 6

Figure 6 : géométrie des produits


94

2- La réaction d’addition (1,4)

Figure 7 : schéma réactionnel de l’addition(1,4) Lés résultats de l’optimisation pour l’addition [1,4] sont représenté dans la figure 8 les énergies inscrite se sont l’énergie d’activation et l’énergie de réaction donnée en kcal/mol

Figure 8 : optimisation pour l’addition [1,4] Discussion

Pour les deux réactions la cycloaddition[4+2] ainsi que l’addition(1,4) nous avons la formation d’un cluster caractérisé par la formation d’une liaison entre l’atome Ti et le doublet de l’oxygène.

• Huit états de transitions on été trouvés pour la cycloadditon [4+2], les deux états de

transition les plus bas sont caractérisées par la formation de liaison (O,Ti) qui est l’origine de leurs stabilité .

• Dans tous les états de transition la distance C(butadiène) – C(terminal de l’acroléine) est la plus courte.

• De point de vue cinétique la cycloaddition [4+2] l’emporte sur l’addition [1,4] puisque l’énergie de transition de cette dernière et plus haut en énergie.

• De point de vue thermodynamique le produit le plus stable est bien le produit de l’addition (1,4)

Nous regroupement les résultats de cette étude sous forme d'un profile énergétique représenté par la figure 9

∆H#= 29.8 kcal/mol ∆Hr= -53.0 kcal/mol


95

Conclusion :

La méthode B3LYP/6-31G* donne de bonne énergie d’activation comparé à l’expérience. Pour le butadiène portant le substituant TiCl3 nous avons envisagé plusieurs modes d’approches, les deux états de transition les plus bas sont caractérisé par la formation d’une liaison entre l’oxygène de l’acroléine et l’atome Ti qui est un acide de Lewis. La stabilisation de ces états de transition est du à la chélation, dans l’état de transition de l’oxygène de l’acroléine par l’élément de transition Ti. La réaction de cycloaddition[4+2]est cinétiquement favorisé par rapport l’addition (1,4) contrairement à l’étude thermodynamique qui favorise le produit de l’addition (1,4) Références [1] Breson, j. A. Tetrahedron 1992,48,3. [2] Breson, j. A. J. Braz. Chem. Soc., Vol. 15, No. 1, 22-27, 2004. [3] (a) Nicolaou, K. C.; Snyder, S. A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004, 101, 11929–11936;

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[4] Primean J.L., Anderson R.C.etFraser-Reid B., J.Am.Chem.Soc.;105,5874(1983) [5] Willard P.G.et De Laszlo S.E..; J.Am.Chem.Soc.,50,3738(1985) [6] Parr, R.G.;Pearson, R.G. ; J.Am.Chem.Soc.1983,105,7512.

-53.02 -44.3

-43.9

0 0

-9 2

-1.8

29.80

Coordonnées de la réaction

17.7

7.4

30.0

Réaction principale de Diels-Alder : Etat de transition le plus haut Etat de transition le plus bas Réaction secondaire de Diels-Alder

Figure 9 : profile énergétique de la cycloaddition[4+2] et l’addition(1,4)


96

[7]Parr,R.G.;Yang,W.Density Functional Theory of Atoms and Molecules; Oxford University:New York,1989.

[8]M.J.Frisch,G.W.Trucks,H.B.Schlegel,G.E.Scuseria,M.A.Robb,J.R.Cheeseman,V.G.Zakrzewski,J.A.Montgomery,Jr.,R.E.Stratmann,J.C.Burant,S.Dapprich,J.M.Millam,A.D.Daniels,K.N.Kudin,M.C.Strain, O.Farkas, J.Tomasi, V.Barone, M.Cossi, R.Cammi, B.Mennucci, C.Pomelli, C.Adamo,S.Clifford, J.Ochterski, G.A.Petersson, P.Y.Ayala, q.Cui, K.Morokuma, D K Malick, A.D.Rabuck,K.Raghavachari, J.B; Foresman, J; Cioslowski, J.V; Ortiz, A.G.Baboul, B.B.Stefanv, G.Liu, A. Liashenko, P. Piskorz, I.Komaromi, R. Gomperts, R.L. martin, D.J. Fox, T.Keith, M.A. Al-Laham, C.Y. Peng, A; Nanayakkara, C. Gonzalez, M.Challacombe, P.M.W. Gill, B. Johnsn, W. Chen, M.W.Wng, J.L. Andres, C. Gonzalez, M. Head-Gordon, E.S.Replogle, J.A. Pople, GAUSSIAN 98, Revision A.7,Gaussien,Inc.,Pittsburgh PA,1998

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Peer-reviewed research journal on Phytochemistry & Bioactives Substances ISSN 2170 - 1768

P O S L

Edition LPSO Phytochemistry & Organic Synthesis Laboratory

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