UNIVERSITE PAUL SABATIER – TOULOUSE III U.F.R Sciences de la Vie et de la Terre

THESE

En vue de l’obtention du

DOCTORAT DE L’UNIVERSITE DE TOULOUSE Délivrée par l’Université Toulouse III-Paul Sabatier

Spécialité : Physiopathologie Moléculaire, Cellulaire et Intégrée

Présentée par

Delphine MILHAS

RÔLE DES CASPASES ET DES SPHINGOLIPIDES

DANS LA SIGNALISATION CYTOTOXIQUE DU RECEPTEUR FAS

DANS LES LYMPHOCYTES T

Soutenue le 14 Décembre 2007 devant le jury :

M. Frédéric. RIEUX-LAUCAT Rapporteur Directeur de recherche, INSERM, Paris

M. Ali BETTAIEB Rapporteur Professeur, Université de Bourgogne-EPHE, Dijon

M. Patrick LEGEMBRE Examinateur Chargé de recherche, INSERM, Bordeaux

M. Justin TEISSIE Examinateur Directeur de recherche, CNRS, Toulouse

M. Bernard DUCOMMUN Président du Jury Professeur, Université Paul Sabatier, Toulouse Directeurs de thèse : M. Hervé BENOIST Professeur, Université Paul Sabatier, Toulouse III

M. Bruno SEGUI Maître de conférences, Université Paul Sabatier, Toulouse III

INSERM U858, I2MR, 1 Avenue Jean Poulhès, 31432 Toulouse Cedex 4

J’adresse mes sincères remerciements aux membres du jury pour avoir accepté

de juger ce travail :

Monsieur le Docteur Frédéric Rieux Laucat et Monsieur le Professeur Ali

Bettaieb, je suis très honorée de l’intérêt que vous avez porté à mon travail et je

vous remercie d’avoir accepté d’en être les rapporteurs.

Monsieur le Docteur Patrick Legembre, je suis très heureuse de vous compter

parmi les membres du jury.

Monsieur le Professeur Justin Teissié, je tiens à vous remercier pour notre

collaboration et pour votre présence dans ce jury de thèse.

Monsieur Bernard Ducommun, je vous remercie vivement d’avoir accepté de

présider ce jury, malgré une invitation tardive.

Je tiens également à remercier

Le Docteur Bruno Ségui : merci pour tout ce que tu m’as enseigné pendant ces 4

années, pour ta disponibilité, ta rigueur, ta franchise, ton humour et ta passion

que j’admire.

Le Professeur Hervé Benoist : merci pour votre esprit critique, vos conseils et

pour vos remarques pertinentes qui ont souvent permis de soulever des

discussions scientifiques enrichissantes.

Le Professeur Thierry Levade : merci pour votre accueil chaleureux dans le

monde des sphingolipides, pour votre connaissance et votre perspicacité

scientifique remarquables, votre disponibilité, votre générosité et votre bonne

humeur à toute épreuve.

Je remercie tous les membres de l’ex-U466 avec qui j’ai pu travailler, en

particulier : le professeur Robert Salvayre pour m’avoir accueilli dans son unité,

Jean-Claude Thiers pour m’avoir enseigner l’art d’observer comme il se doit nos

précieuses cellules, Marie Françoise pour sa disponibilité et tout le temps gagné

grâce à son organisation. Merci à Nathalie, Cécile et Stéphanie. Merci à tous les

étudiants qui sont passés dans le laboratoire : Sabine, Claudine, Babeth, Audrey,

Nicolas Carmen et Dimitri. Merci également à Jean-Claude Lepert pour son aide

précieuse en cytométrie.

Merci aussi à toute l’équipe du thème 3 pour son accueil chaleureux :

Nelly pour son écoute et ses conseils, Mogens pour les chocolats de Bruxelle et

le fameux gloug, Torsten pour m’avoir permis de m’entraîner à parler en anglais.

Nicole pour ta connaissance et ton aide technique mais aussi pour toutes nos

conversations et nos rigolades, Patricia pour ton aide précieuse et pour avoir

partagé avec moi les aléas des western, Houda, « la pompom girl », pour ta bonne

humeur et nos rigolades, Dani, pour tes astuces informatiques et ta gentillesse.

Merci à tout ceux qui ont partagé, pour un temps, l’aquarium avec moi: Yann,

Bertrand, Nargis, Bénédicte et Lucie.

Merci à Sylvain et Toto pour la bonne ambiance que vous avez pu instaurer et nos

fameuses conversations. On attend toujours le calendrier !

Dans la nouvelle équipe « sphingolipidique », merci à :

Nathalie pour ta gentillesse, tes conseils scientifiques et personnels.

Steph pour m’avoir appris à dompter les sphingolipides, pour ton aide et ta bonne

humeur.

Virginie merci pour ton accueil lors de mes brefs passages à l’école des ARN

Jean-Pierre pour ton American accent et ton sérieux lors des réunions.

Merci au trio de choc des 3 postdoc, Caro, Fred et Blandine pour nous faire

profiter de votre expérience, à nous petits thésards.

Maintenant le sifflement de Christian est remplacé par celui de Raphaël : merci

pour ta bonne humeur.

Et les petits derniers, Yayha, Guillaume, Elodie, Virginie et Julie, bon courage

pour la suite.

A mes pintades adorées, Sandra, Cindy, Anne et Cat, merci pour votre amitié,

tous ces moments inoubliables, vos bons petits plats et nos soirées facteur,

pyjama, movida et salsa et surtout pour votre soutien dans les moments

difficiles.

Merci à Marie et Jean-Phi pour votre gentillesse et vos conseils. On se

retrouvera aux States.

Merci à Jean-Phi pour m’avoir initié aux plaisirs du vertige et des toboggans.

Merci à tous ceux que j’ai rencontré brièvement lors des stages CIES et avec qui

j’ai partagé les joies et les peines de la thèse.

Merci à toute l’équipe pédagogique de biologie cellulaire pour son accueil et les

conseils de tous les enseignants avec qui j’ai travaillé, en particulier Arnaud

Labrousse, Raoul Mazar, et Marjorie Fanjul.

Merci à toi ma Jojo pour ta fidèle amitié.

Merci à Alice, Delphine et Flore pour tous ces moments passés sur les bancs de

la fac

A toute ma famille et un hommage particulier à mon papi et à ma mamie

A papa, maman et Romain pour votre soutien, tout votre amour et pour être là

toujours, pour moi.

A toi, Emilien, pour tes encouragements permanents, ton réconfort et pour avoir

supporté mon stress et mes indécisions.

RESUME

La mort des lymphocytes T est un processus essentiel pour le maintien de l’homéostasie

lymphocytaire et le contrôle de la réponse immunitaire. Le récepteur Fas (CD95) et son ligand

FasL (CD95-L) jouent un rôle clé dans la mort des lymphocytes T. Chez l’homme, des

mutations affectant Fas, FasL ou les caspases-8 et -10 sont responsables d’ALPS

(Autoimmune lymphoproliferative syndromes), soulignant l’importance de ces protéines en

physiopathologie. La caspase-8 a été montrée comme essentielle dans l’apoptose induite par

la stimulation de Fas. Toutefois, des travaux récents suggèrent l’existence de voies de

signalisation indépendantes de la caspase-8. Le céramide, un sphingolipide bioactif, joue un

rôle potentiel dans l’induction de la mort cellulaire. L’objectif de notre travail a été de

clarifier le rôle des caspases et du céramide dans la mort de lymphocytes T induite par FasL.

Nos résultats indiquent que la caspase-10 est capable de se substituer à la caspase-8 dans la

signalisation apoptotique de Fas, en clivant Bid (Bcl-2 interacting domain) et en activant la

cascade des caspases dans des cellules Jurkat. De plus, nous montrons que les caspases-8 et -

10 jouent un rôle dans la production de céramide et dans l’induction d’une mort nécrotique,

indépendamment de leur activité catalytique.

Une inhibition de l’activité de la sphingomyéline synthase (SMS), une enzyme qui convertit

le céramide en sphingomyéline, est détectée en réponse à la stimulation de Fas dans des

cellules sensibles mais pas dans des cellules résistantes. L’inhibition préalable de la SMS, par

approche pharmacologique ou épigénétique (siRNA), favorise l’augmentation du taux

intracellulaire de céramide et la mort en réponse à FasL. L’incubation de cellules Jurkat en

présence d’analogues exogènes de céramide s’accompagne d’une toxicité, suggérant un rôle

du céramide dans la signalisation cytotoxique de Fas.

L’ensemble de nos résultats mettent en évidence le rôle essentiel des caspases-8 et -10 dans la

mort apoptotique et nécrotique des lymphocytes T induite par FasL. De plus, l’inhibition de

l’activité de la SMS favorise l’accumulation intracellulaire de céramide et pourrait participer

activement à la mort des lymphocytes T induite par FasL. Interférer avec le métabolisme

sphingolipidique et notamment avec l’activité de la SMS, pourrait représenter une nouvelle

stratégie thérapeutique capable de sensibiliser des cellules résistantes à FasL ou aux

traitements anticancéreux.

ABSTRACT

Fas (CD95) engagement by FasL (CD95L) plays a crucial function in the regulation of T cell

homeostasis and in the control of immune response, essentially through cell death induction in

activated-T cells. In humans, gene mutations affecting either FasL, Fas or initiator caspases-8

and -10 are responsible for ALPS (Autoimmune Lymphoproliferative Syndrome). Fas cross-

linking triggers activation of both caspase-dependent and -independent pathways. In contrast

to caspase-8, controversy exists as to the ability of caspase-10 to mediate apoptosis in

response to FasL. FasL-induced caspase-independent signaling pathway remains largely

unknown. The ceramide, a bioactive sphingolipid, plays a potential role in cell death. The aim

of our study was to clarify the role of caspases and ceramide in FasL-induced T lymphocyte

death.

Ours results indicate that caspase-10 can substitute to caspase-8 as an initiator caspase in Fas

signaling leading to Bid (Bcl-2 interating protein) processing, caspase cascade activation, and

apoptosis of human leukemia Jurkat T cells. Moreover, initiator caspases-8 and -10 can

trigger cell death independently of their catalytic activities, and are absolutely required for

FasL-induced ceramide production and cell death, including necrosis.

The ceramide is converted to sphingomyelin (SM) by SM synthase (SMS). In Jurkat cells,

FasL treatment inhibits SMS activity in a dose- and time-dependent manner. The inhibition of

ceramide conversion to SM, by pharmacological approach or by siRNA, enhances FasL-

induced death of Jurkat and activated T cells. Novel ceramide analogs elevate endogenous

ceramide content and promote Jurkat cell death, suggesting a role of ceramide in cytotoxic

Fas signaling.

Altogether our results highlight the essential role of caspases-8 and -10 in FasL-induced

apoptotic and necrotic leukemia cell death. Moreover the inhibition of SM synthesis may

facilitate FasL-induced ceramide increase and lymphocytes death. Inhibiting SMS activity

may represent an interesting therapeutic strategy to sensitize cells to FasL or to anti-cancer

treatments.

LISTE DES ABBREVIATIONS

ACAD : Activated T Cell Autonomous Death

ADN (c) : Acide DésoxyriboNucléique (complémentaire)

AICD : Activation-Induced Cell Death

AIF : Apoptosis Inducing Factor

ALPS : Autoimmune LymphoProliferative Syndrome

Apaf-1 : Apoptotic protease-activating factor-1

APC : AlloPhycoCyanin

ASK-1 : Apoptosis Signal-Regulating Kinase-1

aSMase : Sphingomyélinase acide

ATP : Adénosine TriPhosphate

AV : Annexine-V

Bcl-2 : B-cell lymphoma 2

Bid : Bcl-2 interacting domain

BSA : Bovin Serum Albumin

CAPP : Ceramide-Activated Protein Phosphatase

CARD : Caspase Recruitment Domain

CCTα : CTP : phosphocholine cytidylyltransférase α

CD : Cluster of Differentiation

CERT : Ceramide Transfer protein

CrmA : Cytokine response modifier A

DAG : DiacylGlycerol

DD : Death Domain

DED : Death Effector Domain

Diablo : Direct IAP Binding protein with LOw pI

DISC : Death Inducing Signaling Complex

DNA-PK : DesoxyriboNucleic Acid-Protein Kinase

DNAse I : DésoxyriboNucléase I

DOC : Acide Desoxycholique

DR : Death Receptor

ELISA : Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay

EndoG : Endonucléase G

ESM : Ecart Standard de la Moyenne

FADD : Fas-Associated protein with Death Domain

FITC : Fluorescein Isothiocyanate

FLICE : FADD-like ICE

FLIP : FLICE Inhibitory Protein

GCS : Glucosyl Céramide Synthase

gld : generalized lymphoproliferation disease

HtrA2 : High temperature requirement protein A2

IAP : Inhibitor of Apoptosis Protein

ICAD : Inhibitor of Caspase-Activated DNase

ICE : Interleukin-1β-Converting Enzyme

Ig : Immunoglobuline

IL6 : Interleukine-6

IP : Iodure de Propidium

JNK : cJun N-terminal Kinase

KO : Knock Out

lpr : lymphoproliferation

MAPK : Mitogen-Activated Protein Kinase

MTT : Bromure de 3(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium

NFκB : Nuclear Factor-κB

NK : Natural Killer

PARP : Poly(ADP-Ribose) Polymérase

PBL : Peripheral Blood Lymphocytes

PBS : Phosphate Buffered Saline

PC : Phosphatidylcholine

PCD : Programmed Cell Death

PDMP : 1-Phenyl-2-Decanoylamino-3-Morpholino-1-Propanol

PDTC : Pyrrolidine DiThioCarbamate

PE : Phycoerythrine

PHA : Phytohémagglutinine

PI3K : PhosphatidylInositol-3-Kinase

PIDD : p53-induced protein with a Death Domain

PKC : Protéine Kinase C

PLAD : PreLigand binding Assembly Domain

PMSF : Phenyl Methyl Sulfonyl Fluorure

PP2A/1: Protéine Phosphatase 2A/1

PPMP : 1-Phenyl-2-Palmitoylamino-3-Morpholino-1-Propanol

PS : Phosphatidylsérine

RAIDD : Receptor-interacting protein (RIP)-Associated ICH-1/CED-3 homologous death

protein with a Death Domain

RE : Réticulum Endoplasmique

RIP : Receptor Interacting Protein

RNase : Ribonucléase

ROS : Reactive Oxygen Species

S1P : Sphingosine-1-Phosphate

SDS : Sodium Dodecyl Sulfate

SDS-PAGE : Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel Electrophoresis

siRNA : small interfering Ribonucleic Acid

SK : Sphingosine Kinase

SLE : Systemic Lupus Erythematosus

Smac : Second mitochondrial activator of caspases

SMase : Sphingomyélinase

SMS : Sphingomyéline Synthase

SPT : Sérine Palmitoyl Transférase

SVF : Sérum de Veau Fœtal

TCR : T-Cell Receptor

TNF : Tumor Necrosis Factor

TNFR-1 : Tumor Necrosis Factor-Receptor-I

TPCK : Tosyl Phenylalanine Chloromethyl Ketone

TRAIL : TNF-Related Apoptosis Inducing Ligand

z-VAD-fmk : Benzyloxycarbonyl Valyl-Alanyl-Aspartyl-(O-methyl)-fluoromethylketone

z-AEVD-fmk : Benzyloxylcarbonyl-AEVD-fluoromethylketone

SOMMAIRE

1

SOMMAIRE

REVUE GENERALE ............................................................................................................. 5

I- La mort cellulaire .............................................................................................................. 6

I-1 L’apoptose ................................................................................................................... 6

I-1-1 Caractéristiques morphologiques et biochimiques de l’apoptose ........................ 6

I-1-2 La machinerie apoptotique ................................................................................... 7

I-2 Les caspases................................................................................................................. 8

I-2-1 Structure et classification ..................................................................................... 8

I-2-2 Mode d’activation ................................................................................................ 8

I-2-3 Les caspases-8 et -10 et la voie extrinsèque....................................................... 10

I-2-4 Les caspases-2 et -9 et la voie intrinsèque ........................................................ 11

I-2-5 Les caspases effectrices et leurs substrats .......................................................... 13

I-3 Régulation des caspases : protéines régulatrices et inhibiteurs ................................. 14

I-3-1 Les inhibiteurs d’origine cellulaire .................................................................... 14

I-3-1-1 FLIP ............................................................................................................ 14

I-3-1-2 Les IAP ....................................................................................................... 15

I-3-2 Les inhibiteurs d’origine virale .......................................................................... 15

I-3-2-1 CrmA........................................................................................................... 15

I-3-2-2 p35 et p49.................................................................................................... 15

I-3-3 Les inhibiteurs chimiques................................................................................... 16

I-4 Les protéines de la famille Bcl-2............................................................................... 17

I-4-1 Structure et classification ................................................................................... 17

I-4-2 Mécanismes d’action sur la mitochondrie.......................................................... 18

I-5 Les facteurs solubles mitochondriaux ....................................................................... 19

I-6 Les autres protéases de l’apoptose............................................................................. 21

I-7 La mort caspase-indépendante................................................................................... 21

I-7-1 La signalisation caspase-indépendante émanant des récepteurs de mort ........... 22

I-7-2 Rôle de la mitochondrie dans la mort caspase-indépendante............................. 23

I-7-3 Les protéases impliquées dans la mort caspase-indépendante ........................... 23

I-7-4 Importance de la mort caspase-indépendante en cancérologie .......................... 24

II- La mort des lymphocytes T............................................................................................. 25

II-1 Sélection thymique................................................................................................... 25

II-2 Délétion périphérique et AICD (Activation-Induced Cell Death) ........................... 26

II-3 Pathologies associées à un défaut de la mort des lymphocytes T ............................ 28

II-4 Le récepteur Fas ....................................................................................................... 32

II-4-1 Structure de Fas................................................................................................. 32

II-4-2 Expression et régulation de Fas ........................................................................ 33

II-4-3 Le ligand de Fas ................................................................................................ 34

II-4-4 Signalisation apoptotique du récepteur Fas ...................................................... 34

II-4-4-1 Initiation du signal et formation du DISC ................................................. 34

II-4-4-2 Rôle de la voie mitochondriale : cellules de type I et de type II ............... 37

II-4-4-3 Rôle des caspases initiatrices dans la signalisation de Fas ........................ 38

II-4-5 Signalisations non apoptotiques activées par le récepteur Fas ......................... 39

II-4-5-1 Fas et la mort caspase-indépendante ......................................................... 39

II-4-5-2 Fas et JNK (Jun N-terminal Kinase).......................................................... 40

II-4-5-3 Fas et voie de survie : NF-κB.................................................................... 42

III- Sphingolipides et mort cellulaire .................................................................................. 44

2

III-1 Structure et métabolisme des sphingolipides .......................................................... 44

III-2 Rôle des sphingolipides dans l’apoptose ................................................................ 46

III-2-1 Les métabolites pro-apoptotiques .................................................................... 47

III-2-1-1 Le céramide .............................................................................................. 47

III-2-1-2 La sphingosine.......................................................................................... 49

III-2-1-3 Les gangliosides ....................................................................................... 50

III-2-2 Les métabolites anti-apoptotiques ................................................................... 50

III-2-2-1 Le céramide-1-phosphate ......................................................................... 50

III-2-2-2 La sphingosine-1-phosphate (S1P)........................................................... 51

III-2-2-3 Le glucosylcéramide ................................................................................ 51

III-2-3 Sphingolipides et morts non apoptotiques....................................................... 52

III-3 Rôle des sphingolipides dans la signalisation apoptotique du récepteur Fas.......... 53

III-3-1 La voie sphingomyéline-céramide dans la signalisation de Fas...................... 53

III-3-2 La sphingomyéline synthase (SMS) dans la signalisation de Fas ................... 55

III-3-3 La synthèse de novo de céramide dans la signalisation de Fas ....................... 56

III-3-4 La sphingosine et la sphingosine-1P dans la signalisation de Fas................... 56

III-3-5 Les glycosphingolipides dans la signalisation de Fas ..................................... 57

III-4 Analogues sphingolipidiques et inhibiteurs du métabolisme du céramide en

thérapie anticancéreuse ................................................................................................... 58

III-4-1 Ciblage du métabolisme du céramide.............................................................. 59

III-4-2 Ciblage de la voie Sphingosine-kinase/ S1P ................................................... 60

RESULTATS EXPERIMENTAUX .................................................................................... 63

I- Introduction et objectif général ....................................................................................... 64

I-1 La caspase-8 n’est pas essentielle pour l’induction de l’apoptose en réponse à FasL

......................................................................................................................................... 64

I-2 Existence potentielle d’une signalisation indépendante des caspases ....................... 65

I-3 Objectif général de la thèse ....................................................................................... 66

II- Rôle de la caspase-10 dans la signalisation apoptotique de Fas .................................. 67

II-1 Un rôle controversé de la caspase-10 dans la signalisation apoptotique.................. 67

II-2 Objectif et stratégie expérimentale de l’article 1 ..................................................... 67

II-3 Conclusions de l’article 1 :....................................................................................... 68

II-3-1 La caspase-10 est une caspase initiatrice dans la signalisation de Fas ............. 68

II-3-2 Inhibition partielle de la mort cellulaire par le z-VAD..................................... 70

II-4 Evènements mitochondriaux dans la signalisation caspase-indépendante de Fas ... 72

III- Cytotoxicité induite par les caspases-8 et -10 indépendamment de leur activité

catalytique ........................................................................................................................... 75

III-1 Les cellules Jurkat déficientes en caspase-8 et -10 résistent à l’apoptose et à la

nécrose induite par FasL ................................................................................................. 75

III-2 Objectif et stratégie expérimentale de l’article 2 .................................................... 76

III-3 Conclusions de l’article 2........................................................................................ 77

III-4 L’activité catalytique des caspases est nécessaire à leur effet toxique dans les

cellules HeLa................................................................................................................... 78

IV- Rôle du céramide dans la mort de cellules Jurkat ........................................................ 80

IV-1 Production de céramide dans la signalisation de Fas.............................................. 80

IV-2 Rôle de la sphingomyéline synthase dans la signalisation de Fas .......................... 80

IV-3 Objectif et stratégie expérimentale de l’article 3 .................................................... 82

IV-4 Conclusions de l’article 3 ....................................................................................... 83

3

IV-4-1 Inhibition de l’activité de la SMS dans la signalisation de Fas....................... 83

a- Inhibition dépendante de l’activité catalytique des caspases .......................... 83

b- Inhibition indépendante de l’activité catalytique des caspases ....................... 87

IV-4-2 L’inhibition de la SMS sensibilise les lymphocytes T à la mort induite par

FasL............................................................................................................................. 89

IV-5 De nouveaux analogues de céramide induisent une toxicité dépendante et

indépendante de l’activité catalytique des caspases........................................................ 91

IV-5-1 Objectif et stratégie expérimentale de l’article 4............................................. 91

IV-5-2 Conclusions de l’article 4 ................................................................................ 92

DISCUSSION ........................................................................................................................ 96

I- Les caspases-8 et -10 sont indispensables à la signalisation apoptotique et nécrotique

induite par FasL .................................................................................................................. 97

II- L’inhibition de l’activité de la SMS pourrait participer à la génération de céramide

dans la signalisation de Fas.............................................................................................. 100

MATERIELS ET METHODES ........................................................................................ 103

I- Cultures et lignées cellulaires ....................................................................................... 104

I-1 Cellules Jurkat ......................................................................................................... 104

I-2 Lymphocytes humains du sang périphérique (PBL, Peripheral Blood Lymphocytes)

....................................................................................................................................... 104

I-3 Cellules HeLa .......................................................................................................... 105

I-4 Transfections cellulaires .......................................................................................... 105

II- Source de FasL............................................................................................................. 106

III- Expression de CD95 à la surface cellulaire ............................................................... 106

IV- Tests de viabilité cellulaire ......................................................................................... 107

IV-1 Test d’exclusion au bleu Trypan........................................................................... 107

IV-2 Test MTT .............................................................................................................. 107

V- Tests d’apoptose ........................................................................................................... 107

V-1 Analyse morphologique ......................................................................................... 107

V-2 Externalisation des phosphatidylsérines et perméabilité membranaire ................. 108

V-3 Analyse de la fragmentation de l’ADN.................................................................. 108

V-4 Dosage de l’activité des caspases : essai enzymatique DEVDase ou IETDase..... 108

V-5 Essais in vitro : protéines recombinantes .............................................................. 109

VI- Western Blot ................................................................................................................ 109

VI-1 Extraits protéiques totaux ..................................................................................... 109

VI-2 Extraits protéiques cytosoliques ........................................................................... 110

VI-3 Migration électrophorétique des extraits protéiques............................................. 110

VII- Analyse de la localisation subcellulaire des protéines mitochondriales ................... 110

VIII- Analyse des sphingolipides....................................................................................... 111

VIII-1 Extraction lipidique............................................................................................ 111

VIII-2 Dosage du céramide (méthode de la DAG kinase) ............................................ 111

VIII-3 Analyse du profil sphingolipidique.................................................................... 112

VIII-4 Mesure de la synthèse de sphingomyéline......................................................... 112

VIII-5 Dosage des activités enzymatiques de la SMS et de la GCS ............................. 113

4

IX- Analyse de l’expression des ARNm ............................................................................. 113

X- Anticorps et autres réactifs........................................................................................... 114

REFERENCES.................................................................................................................... 115

5

REVUE GENERALE

6

I- La mort cellulaire

Trois grands types de mort cellulaire ont été définis, l’apoptose, la mort autophagique

et la nécrose. L’apoptose (PCD de type I) et la mort autophagique (PCD de type II) sont des

morts cellulaires programmées (PCD, Programmed Cell Death) induites par un signal codé

génétiquement. Différemment, la mort de type III, la nécrose, est provoquée

accidentellement. Récemment, des formes intermédiaires de PCD caspase-indépendante ont

été décrites ; il s’agit de l’apoptose-like et de la nécrose-like qui possèdent certaines

caractéristiques de l’apoptose, de la nécrose et de l’autophagie. Il existe aussi deux autres

types de mort cellulaire non classifiées : la catastrophe mitotique qui intervient lors d’une

mitose anormale (défaut au cours de la métaphase ou de la cytodiérèse) et entraîne

l’apparition respective de micro-noyaux et de cellules multinucléées et l’anoïkis qui

correspond à l’apoptose induite par le détachement des cellules de leur support (Kroemer et

al., 2005).

I-1 L’apoptose

L’apoptose (terme évoquant la chute des feuilles à l’automne), la plus connue des

morts cellulaires programmées, a été définie en 1972. Elle correspond aux phénomènes qui

conduisent à la mort physiologique des cellules. Elle a toujours été opposée à la nécrose, au

cours de laquelle la rupture physique de la membrane plasmique et la destruction « brutale »

de la cellule provoquées par des conditions anormales conduisent au déclenchement de

réponses inflammatoires. L’apoptose joue un rôle majeur au cours du développement

embryonnaire, de la croissance, ainsi que chez l'adulte, où elle est essentielle pour le maintien

de l’homéostasie cellulaire. Ainsi, une dérégulation des mécanismes contrôlant l’apoptose

peut participer au développement de pathologies telles que les cancers et les maladies auto-

immunes (dans le cas d’un défaut de mort) ou les maladies neurodégénératives et les déficits

immunitaires (dans le cas d’un excès de mort) (Fadeel et al., 1999; Thompson, 1995).

I-1-1 Caractéristiques morphologiques et biochimiques de l’apoptose

L’apoptose est définie par des modifications morphologiques caractéristiques

observables au niveau du noyau et de la membrane plasmique. Une condensation et une

fragmentation de la chromatine nucléaire ainsi qu’une réduction du volume cellulaire sont

7

d’abord observées. Puis, le noyau se fragmente et la membrane plasmique présente des

évaginations (blebbing) à partir desquelles se forment plus tardivement les corps

apoptotiques. Des modifications biochimiques typiques interviennent également au cours de

l’apoptose : la fragmentation internucléosomale de l’ADN, un disfonctionnement

mitochondrial et l’externalisation des phosphatidylsérines (PS) à la surface cellulaire. Ce

dernier phénomène semble participer à la reconnaissance et à la phagocytose des cellules

apoptotiques par les macrophages. Ainsi, puisque l’intégrité de la membrane plasmique est

maintenue jusqu’à l’élimination des corps apoptotiques, la réaction inflammation est limitée

(Kerr et al., 1972). Il est à noter qu’in vitro, des altérations de la perméabilité membranaire

sont détectables aux stades tardifs ; il s’agit de nécrose secondaire ou post-apoptotique. Enfin,

l’activation de protéases de la famille des Caspases (Cystéinyl aspartate specific proteinase)

constitue une véritable signature de l’apoptose. En effet, les caspases clivant des protéines

structurales de la cellule et inactivant des protéines essentielles à la survie, elles sont

responsables de la plupart des caractéristiques morphologiques et biochimiques de l’apoptose

(Cohen, 1997).

I-1-2 La machinerie apoptotique

Il existe deux voies majeures d’induction de l’apoptose :

- La voie extrinsèque est initiée au niveau de la membrane plasmique par l’activation

de récepteurs de mort, membres de la superfamille du TNF-R (Tumor Necrosis Factor

Receptor) tels que le TNF récepteur-1 (TNFR-1), Fas (CD95 ou APO-1) et TRAIL (TNF-

related apoptosis inducing ligand) récepteur, appelé aussi DR4 et DR5 pour « Death

Receptor » (Smith et al., 1994). Elle permet l’activation de la cascade des caspases

indépendemment de la mitochondrie.

- La voie intrinsèque implique la mitochondrie et est activée par divers agents de stress

tels que la privation en sérum, les radiations ionisantes, les dommages à l’ADN, les agents

chimiothérapeutiques, les infections virales ou bactériennes. Elle permet notamment

l’activation de protéines membres de la famille de Bcl-2 (B-cell lymphoma 2) qui participent

à la perméabilisation de la membrane externe mitochondriale (MOMP : Mitochondrial outer-

membrane permeabilization) et au relargage de facteurs mitochondriaux solubles impliqués

dans la signalisation apoptotique (Kroemer and Martin, 2005).

Ces deux voies de signalisation conduisent à deux phénomènes centraux dans

l’apoptose qui sont l’activation de la cascade des caspases et la perméabilisation de la

8

membrane mitochondriale (Figure 4) (Chipuk and Green, 2005). Au travers de la description

des caspases et des protéines de la famille de Bcl-2, nous verrons comment ces deux voies

sont interconnectées au cours de l’apoptose.

I-2 Les caspases

I-2-1 Structure et classification

Les caspases sont des cystéines protéases possédant un résidu cystéine dans leur

séquence nécessaire à l’activité catalytique. Elles clivent spécifiquement leurs substrats après

un résidu d’acide aspartique. Parmi les 13 caspases identifiées chez l’homme, certaines sont

impliquées dans les phénomènes d’inflammation ou de différenciation (caspases-1,-4,-5,-12

et 14) tandis que les caspases-2,-3,-6,-7,-8,-9,-10 participent à l’apoptose (Kroemer and

Martin, 2005). Elles possèdent un prodomaine en N-terminal de longueur variable et un

domaine catalytique en C terminal composé d’une petite sous-unité (10-12 kDa) et d’une

grande sous-unité (17-20 kDa) portant le site catalytique (cf figure 1) (Fuentes-Prior and

Salvesen, 2004). Les caspases de l’apoptose peuvent être divisées en deux catégories, les

caspases initiatrices (caspases-2, 8, 9 et 10) possédant un long pro-domaine N-terminal et qui

sont activées précocement dans la cascade apoptotique et les caspases effectrices (3, 6 et 7)

qui ont un domaine N-terminal court et qui sont activées dans la phase exécutrice de

l’apoptose (Thornberry and Lazebnik, 1998).

I-2-2 Mode d’activation

Elles sont synthétisées en tant que pro-enzymes inactives : sous forme de monomères

pour les caspases initiatrices et de dimères pour les caspases effectrices (Boatright et al.,

2003). La protéolyse au niveau de sites de clivage internes permet de libérer le site

catalytique des caspases. La forme active des caspases est constituée de l’association de la

petite et de la grande sous-unité formant un hétérodimère (Figure 1) (Boatright and Salvesen,

2003). Ainsi, pour les caspases effectrices le clivage protéolytique semble indispensable pour

l’activation. A l’inverse, pour les caspases initiatrices la dimérisation des proformes

monomériques inactives est suffisante à l’activation tandis que le clivage semble seulement

stabiliser les dimères actifs formés (Boatright et al., 2003; Chang et al., 2003; Donepudi et

al., 2003).

9

Le mode d’activation préférentiel des caspases initiatrices implique leur recrutement

au niveau de plateforme de signalisation. Ce recrutement est possible grâce à des domaines

particuliers présents au niveau du prodomaine des caspases initiatrices tels que le domaine

CARD (Caspase Recruitment Domain) pour les caspases-9 et -2 ou le domaine DED (Death

Effector Domain) pour les caspases-8 et -10 (Figure 2) (Bao and Shi, 2007). Le recrutement

des caspases initiatrices au sein de ces complexes favorise leur oligomérisation et leur

activation vraisemblablement par modifications conformationelles. Les caspases initiatrices

une fois activées peuvent cliver et activer les caspases effectrices. De plus, il existe une

boucle d’amplification positive de la cascade des caspases qui permet l’activation de caspases

en amont de la signalisation par des caspases activées en aval. Par exemple la caspase-8 peut

être clivée par les caspases effectrices -3 et 6 in vitro (Sohn et al., 2005).

Figure 1 : Structure générale des pro-caspases et des caspases activées. Les clivages

intrachaînes permettent la séparation du prodomaine puis de la grande sous unité p20 et de la

petite sous-unité p10 de la pro-caspase. La forme active des caspases est constituée de

l’association de la grande et de la petite sous-unité. QACxG : séquence du site catalytique

contenant le résidu cystéine.

10

Figure 2 : Les différents domaines structurant les caspases (Bao and Shi, 2007)

Les domaines CARD et DED sont présents au niveau du prodomaine des caspases

initiatrices. Les grandes flèches représentent les sites de clivage entre les grandes (p20) et

petites sous-unités (p10) tandis que les petites flèches indiquent les autres clivages. Le résidu

cystéine du site catalytique est représenté par un trait rouge. Les boucles L1 à L4 forment le

site actif des caspases.

I-2-3 Les caspases-8 et -10 et la voie extrinsèque

Les caspases-8 et 10 sont activées par la voie extrinsèque qui est initiée par les

récepteurs de la famille du TNFR. Ces récepteurs transmembranaires de type I sont

caractérisés par un domaine extracellulaire conservé riche en cystéines et un domaine

intracellulaire appelé domaine de mort (DD, Death Domain) de 80 acides aminés qui permet

l’interaction avec des protéines adaptatrices. Présents à la surface cellulaire sous forme de

trimères pré-associés, la fixation de leurs ligands respectifs, le TNFα, FasL (CD95-L) et

TRAIL (Apo2L), entraîne l’agrégation des récepteurs et leur activation permettant le

recrutement de protéines adaptatrices au niveau du DD. Ainsi, dans la signalisation de Fas, la

protéine FADD (Fas-Associated Death Domain protein) est recrutée au niveau du récepteur

par son domaine DD (Chinnaiyan et al., 1995) et permet à son tour le recrutement des

caspases-8 et -10 par le domaine DED présents à la fois sur FADD et sur les caspases

initiatrices (Muzio et al., 1996). Un complexe multimoléculaire appelé DISC (Death Inducing

Signaling Complex) est alors formé (Figure 3b) (Kischkel et al., 1995). Par proximité ces

11

caspases se dimérisent et cette dimérisation semble suffisante pour rendre les caspases actives

et permettre leur maturation par protéolyse. Les clivages intrachaînes au niveau des sites

consensus permettent la séparation des sous-unités catalytiques puis la libération du

prodomaine. Deux hypothèses de maturation de la caspase-8 ont été émises, le clivage inter-

dimères et l’autoprotéolyse (clivage intramoléculaire) (Chang et al., 2003; Chen et al., 2002).

Une fois activée, les caspases-8 et -10 peuvent cliver et activer les caspases-3 et -7, des

caspases effectrices de l’apoptose. Elles peuvent également induire la protéolyse d’autres

protéines de la signalisation apoptotique. Par exemple le clivage de Bid (Bcl-2 interacting

domain), une protéine membre de la famille de Bcl-2, par la caspase-8 permet la génération

d’une protéine Bid tronquée (tBid) qui transloque à la mitochondrie et participe à la

perméabilisation des membranes mitochondriales (Li et al., 1998). Ainsi, la voie extrinsèque

d’induction d’apoptose rejoint la voie intrinsèque et conduit à l’induction d’événements

mitochondriaux.

I-2-4 Les caspases-2 et -9 et la voie intrinsèque

Les membres de la famille de Bcl-2 participent à la voie intrinsèque en agissant sur la

perméabilisation de la membrane externe mitochondriale (MOMP : Mitochondrial outer-

membrane permeabilization) qui conduit au relargage du cytochrome c de la mitochondrie.

Le cytochrome c libéré dans le cytosol s’associe avec Apaf-1 (Apoptotic Protease- activating

factor), la protéine qui permet le recrutement ATP-dépendant de la pro-caspase-9 par

l’intermédiaire des domaines CARD présents à la fois sur la caspase-9 et sur Apaf-1. Le

complexe ainsi formé est appelé apoptosome et permet l’activation de la caspase-9 (Figure

3c) (Zou et al., 1999). Par ailleurs, comme son prodomaine n’est pas clivé suite à son

activation, la caspase-9 reste liée à l’apoptosome au niveau duquel elle active directement la

caspase-3.

La caspase-2 est également activée par la voie intrinsèque mais plus spécifiquement

en réponse à des dommages à l’ADN déclenchés soit directement par les radiations ionisantes

ou indirectement par l’étoposide qui, en inhibant la topoisomèrase II, favorise les cassures de

l’ADN (Zhivotovsky and Orrenius, 2005). Dans ces conditions, le suppresseur de tumeur

p53 est activé et induit l’expression de PIDD (p53-induced protein with a DD). Par

interaction avec le DD, PIDD recrute RAIDD (RIP (Receptor interacting protein)-associated

ICH-1/CED-3 homologous death protein with death domain) qui à son tour recrute la pro-

caspase-2 par l’intermédiaire du domaine CARD présent à la fois sur RAIDD et sur la pro-

12

caspase-2. Le complexe multimoléculaire formé, nommé PIDDosome, sert de plateforme

d’activation pour la caspase-2 (Figure 3a) (Tinel and Tschopp, 2004). Des études in vitro

indiquent qu’une fois activée la caspase-2 peut activer la caspase-8 et participer à la

perméabilisation des membranes mitochondriales par l’intermédiaire du clivage de Bid

(Lassus et al., 2002; Lin et al., 2004a).

Figure 3 : Les complexes d’activation des caspases initiatrices (Bao and Shi, 2007)

a, La caspase-2 est activée par le PIDDosome constitué de PIDD, RAIDD et de la pro-

caspase-2 ; b, Le DISC formé au niveau du récepteur Fas permet l’activation des caspases-8

et -10 par l’intermédiaire de FADD ; c, La caspase-9 est activée par l’apoptosome composé

de sept molécules d’Apaf-1 qui se lient au cytochrome c en présence d’ATP.

Figure 4 : Les voies de signalisation intrinsèque et extrinsèque de l’apoptose conduisant à l’activation des caspases effectrices (Chipuk and Green, 2005)

13

I-2-5 Les caspases effectrices et leurs substrats

Activée par les caspases initiatrices, les caspases exécutrices -3, -6 et -7 achèvent la

cascade apoptotique et participent à la phase terminale de l’apoptose. Ainsi elles sont

responsables du phénotype apoptotique puisqu’elles clivent et dégradent de nombreux

substrats essentiels à la survie cellulaire (Tableau 1). Par exemple, le clivage des lamines

structurant le noyau contribue à la condensation de la chromatine. En clivant des composants

ou des protéines régulatrices du cytosquelette telles que l’actine ou la gelsoline, les caspases

effectrices participent à la désorganisation des structures cellulaires (Kothakota et al., 1997).

En particulier, le clivage des fodrines pourrait jouer un rôle dans les phénomènes de

« blebbing » membranaire. De plus, les caspases effectrices inactivent des protéines

nécessaires au maintien de l’intégrité du génome, provoquant les phénomènes de

fragmentation de l’ADN. Par exemple le clivage de ICAD (Inhibitor of CAD/DFF45) permet

la libération de CAD (Caspase-Activated deoxyribonuclease), une nucléase responsable de la

fragmentation de l’ADN. De même, le clivage de PARP (Poly-(ADP-Ribose) Polymérase) ou

de la DNA-PKcs inhibe leur activité de réparation de l’ADN, favorisant les cassures de

l’ADN (Cohen, 1997; Thornberry and Lazebnik, 1998).

Finalement, malgré un rôle prépondérant des caspases effectrices dans la phase d’exécution

de l’apoptose, il semblerait que les caspases-3 et -7 exercent une boucle de rétrocontrôle

positif permettant l’amplification des évènements mitochondriaux. En effet, des cellules

déficientes à la fois en caspase-3 et en caspases-7 présentent un défaut dans l’induction des

évènements mitochondriaux en réponse aux radiations UV (Lakhani et al., 2006).

14

Tableau 1 : Les substrats des caspases et leur séquence consensus de clivage (Cohen,

1997)

I-3 Régulation des caspases : protéines régulatrices et inhibiteurs

I-3-1 Les inhibiteurs d’origine cellulaire

I-3-1-1 FLIP

La protéine c-FLIP (cellular-FLICE inhibitory protein), l’homologue de la protéine

virale v-FLIP est connue pour inhiber la signalisation apoptotique médiée par les récepteurs

de mort. Elle existe sous forme de deux variants d’épissage alternatif, FLIPs (forme courte) et

FLIPL (forme longue). FLIPs est constituée de deux domaines DED tandis que FLIPL est un

homologue de la caspase-8 protéolytiquement inactif. Par compétition les deux formes de c-

FLIP préviennent le recrutement des caspases initiatrices-8 et -10 par la protéine FADD et

inhibent la formation du DISC (Irmler et al., 1997). Cependant, alors que FLIPs semble

toujours agir en tant qu’inhibiteur, de faibles concentrations de FLIPL permettent l’activation

protéolytique de la caspase-8 au niveau du DISC grâce à la formation de l’hétérodimère

caspase-8/FLIP (Boatright et al., 2004; Chang et al., 2002). Cette observation renforce

l’hypothèse selon laquelle la dimérisation des caspases initiatrices est suffisante pour

favoriser leur activation.

15

I-3-1-2 Les IAP

Les IAPs (Inhibitor of apoptosis protein) appartiennent à une famille de 8 protéines

inhibitrices de l’apoptose (Salvesen and Duckett, 2002). XIAP, la mieux caractérisée, se lie

aux caspases -3, -7 et -9 grâce à un domaine conservé, BIR (Baculovirus IAP Repeat), et les

inactivent (Takahashi et al., 1998). Les IAPs possèdent également un domaine RING

impliqué dans la dégradation par le protéasome des IAPs elles mêmes (Yang et al., 2000) et

des caspases avec lesquelles elles interagissent (Suzuki et al., 2001).

I-3-2 Les inhibiteurs d’origine virale

I-3-2-1 CrmA

CrmA (Cytokine response modifier A), une serpine (inhibiteur de sérine protéase)

produite par le virus cowpox prévient les réponses inflammatoires et apoptotiques en inhibant

préférentiellement l’activité des caspases-1 et -8 (Zhou et al., 1997). La fixation de CrmA sur

le site catalytique des caspases entraîne l’inhibition irréversible de leur activité par

dissociation du tétramère composant la caspase active et perte de la petite sous-unité

catalytique (Dobo et al., 2006). Ainsi, CrmA inhibe l’apoptose induite par Fas dans des

lymphocytes, suggérant un rôle important de la caspase-8 dans cette signalisation (Smith et

al., 1996). Malgré son effet inhibiteur sur la caspase-9 in vitro, CrmA n’a aucun effet sur la

mort médiée par la voie intrinsèque qui implique la caspase-9 (Ryan et al., 2002).

I-3-2-2 p35 et p49

La protéine p35 produite par le Baculovirus et son homologue p49 inhibent l’activité

d’un spectre large de caspases incluant la caspase-1, -3, -6, -7, -8, -9 et -10 (Callus and Vaux,

2007). Le clivage de p35 par les caspases entraîne la formation d’un complexe caspase/p35

qui bloque le site catalytique des caspases (Zhou et al., 1998).

16

Tableau 2 : Spécificités des inhibiteurs cellulaires et viraux des caspases (Callus and

Vaux, 2007)

I-3-3 Les inhibiteurs chimiques

De nombreux inhibiteurs chimiques des caspases ont été synthétisés dans le but

d’étudier le rôle des caspases dans les processus de mort cellulaire ou d’inflammation. Ce

sont des peptides qualifiés de pseudo substrats puisqu’ils contiennent la séquence de clivage

de la caspase cible. Ils sont couplés à des groupements chimiques, le plus souvent aldéhydes

(CHO) ou chloro/fluoro-méthylcétones (fmk) qui permettent non seulement d’inhiber le site

actif des caspases mais aussi d’augmenter leur stabilité et leur efficacité (Callus and Vaux,

2007). Ainsi, ils agissent en tant qu’inhibiteurs compétitifs en se fixant de façon réversible

(couplage CHO) ou irréversible (couplage fmk) sur le site catalytique des caspases. Certains

peptides possèdent des spécificités pour des caspases particulières (Tableaux 3 et 4) (Garcia-

Calvo et al., 1998) ; tandis que d’autres sont des inhibiteurs à large spectre tel que le z-VAD-

fmk qui inhibe irréversiblement toutes les caspases, avec une efficacité moindre vis-à-vis de

la caspase-2 (Tableau 3) (Callus and Vaux, 2007). Cependant, certains de ces inhibiteurs ne

sont pas spécifiques des caspases, comme le z-VAD.fmk, le z-DEVD.fmk et le YVAD.cmk

qui inhibent également l’activité, in vitro et en culture, d’ autres types de cystéine protéases

comme la Cathepsine B (Schotte et al., 1999). Ainsi, l’utilisation de ces inhibiteurs pour

étudier spécifiquement le rôle des caspases doit être complété par d’autres approches.

Finalement, des molécules utilisables en clinique dans le traitement des maladies

neurodégénératives ont été développées par différents groupes pharmaceutiques et

correspondent à des inhibiteurs de caspases non peptidiques (cf tableau 4) (Callus and Vaux,

2007).

17

Tableau 3 : Spécificités des inhibiteurs chimiques des caspases (Callus and Vaux, 2007)

Tableau 4 : Les constantes d’inhibition (Ki) des différents inhibiteurs peptidiques des caspases (Garcia-Calvo et al., 1998).

I-4 Les protéines de la famille Bcl-2

I-4-1 Structure et classification

Les protéines de la famille de Bcl-2 représentent une vingtaine de membres, pouvant

être divisés en trois sous-catégories en fonction de leur rôle dans l’apoptose et la présence de

domaines conservés BH (Bcl2 homology) caractéristiques (BH1-BH4) dans leur structure

(Figure 5). Les protéines anti-apoptotiques les plus étudiées, Bcl-2 et Bcl-xL, possèdent les

quatres domaines BH. Les membres pro-apoptotiques sont subdivisés en deux groupes, la

18

famille Bax incluant Bax, Bak, et Bok qui possèdent trois domaines BH et les protéines à

domaine unique BH3 (BH3 only) dont les plus connues sont Bid et Bad. Le domaine BH3 est

nécessaire pour l’effet pro-apoptotique tandis que le domaine C-terminal hydrophobe (TM)

permet un ancrage dans les membranes des organelles intracellulaires et en particulier dans la

membrane externe mitochondriale. Bcl-2, Bcl-xL et Bak sont des protéines membranaires

majoritairement localisées dans la membrane externe mitochondriale tandis que la plupart des

autres membres de la famille Bcl-2 résident dans le cytosol et transloquent à la mitochondrie

sous l’effet d’un stimulus apoptotique (Cory and Adams, 2002). Une littérature récente

indique un rôle potentiel des membres de la famille de Bcl-2 dans le contrôle de la

perméabilité membranaire d’autres organites comme le lysosome, le RE et le noyau.

Figure 5 : Structure des membres de la famille de Bcl-2 (Cory and Adams, 2002). Les

domaines BH1 à BH4 sont des régions conservées. Les hélices α connues sont représentées.

TM, Transmembrane Domain.

I-4-2 Mécanismes d’action sur la mitochondrie

Les protéines « BH3-only » sont les sentinelles qui déclenchent la signalisation

intrinsèque de l’apoptose en réponse aux stimuli de stress et qui participent aussi à la

signalisation extrinsèque médiée par les récepteurs de mort. Dans des conditions normales,

leur activité pro-apoptotique est réprimée. Par exemple, Bad est phosphorylée par akt/PKB et

est séquestré par la protéine 14-3-3 (Zha et al., 1996). L’inhibition d’akt/PKB favorise la

déphosphorylation de Bad et sa relocalisation mitochondriale. Bid est cytosolique et

19

transloque à la mitochondrie qu’après clivage en tBid par la caspase-8 (Li et al., 1998). Ainsi,

tBid induit l’activation de Bax et de Bak qui s’oligomérisent et forment des pores à travers la

membrane mitochondriale (Korsmeyer et al., 2000). Les mécanismes de formation de ces

canaux diffèrent selon le type de protéines pro-apoptotiques. Ainsi, Bax et Bak peuvent être

activés directement par Bid ou Bim tandis que Bad et Bik participent à la perméabilisation

des membranes mitochondriales de façon indirecte en inhibant les protéines anti-apoptotiques

Bcl-xL et Bcl-2 (Kuwana et al., 2005). Bcl-xL et Bcl-2 préviennent l’ouverture de ces canaux

par des mécanismes qui restent encore incertains : soit par séquestration des protéines BH3-

only (Cheng et al., 2001), soit par inhibition de l’activation de Bak et de Bax (Adams, 2003).

I-5 Les facteurs solubles mitochondriaux

La perméabilisation de la membrane externe mitochondriale est un évènement majeur

dans la signalisation apoptotique puisqu’elle permet la libération de nombreux facteurs

mitochondriaux nécessaires au processus apoptotique (Saelens et al., 2004; van Gurp et al.,

2003). Tout d’abord le cytochrome c résidant dans l’espace intermembranaire mitochondrial,

une fois libéré dans le cytosol participe à la formation de l’apoptosome et à l’activation de la

caspase-9 (cf I-2-4) (Liu et al., 1996). De même, Smac/Diablo (Second mitochondria-derived

activator of caspases / Direct IAP binding protein with low pI) et Omi/HtrA2 (High

temperature requirement A2) sont également libérés de la mitochondrie et participent à

l’apoptose en antagonisant les IAPs (cf I-3-1). La libération d’AIF (Apoptosis Inducing

Factor) et d’EndoG (Endonucléases G) dans le cytosol et leur translocation dans le noyau

conduit à la dégradation de l’ADN. En effet, AIF induit la macrofragmentation de l’ADN

(génération de fragments de hauts poids moléculaires) et participe à la condensation

chromatinienne, tandis qu’EndoG, en collaboration avec des exonucléases et la DNAse I,

permet la dégradation internucléosomale de l’ADN. Il a également été suggéré que certaines

caspases résidaient dans l’espace intermitochondrial (Zhivotovsky et al., 1999) mais cette

localisation mitochondriale reste controversée (van Loo et al., 2002a).

Deux modèles pouvant coexister ont été proposés pour expliquer le mécanisme de

libération des facteurs mitochondriaux : (i) la formation de canaux par les membres de la

famille de Bcl-2 (cf I-4-2) ; (ii) la rupture de la membrane externe mitochondriale par

l’ouverture des pores de transition PTP (permeability transition pore). Le PTP est constitué

d’un canal ionique voltage-dépendant (VDAC) localisé dans la membrane mitochondriale

externe et de la translocase de nucléotides adényliques (ANT) située dans la membrane

20

mitochondriale interne. Les stimuli apoptotiques déclenchent l’ouverture de ces pores,

induisant la dissipation du potentiel transmembranaire mitochondrial et la rupture de

l’homéostasie ionique et osmotique de la mitochondrie. Ceci a pour conséquence la rupture

de la membrane mitochondriale externe. De plus, plusieurs études indiquent des interactions

possible entre les membres de la famille de Bcl-2 et les composants du PTP (Armstrong,

2006).

Figure 6 : Les protéines de la famille de Bcl-2 et les évènements mitochondriaux dans la signalisation intrinsèque de l’apoptose (Saelens et al., 2004).

21

I-6 Les autres protéases de l’apoptose

De nombreux travaux indiquent que d’autres protéases participent à la signalisation

apoptotique, parmi lesquelles citons, les granzymes, les calpaïnes et les cathepsines.

Les granzymes sont des sérines protéases libérées par exocytose par les lymphocytes

T et les cellules NK (Natural Killers) pour tuer les cellules cibles (cellules infectées, cellules

tumorales). La granzyme B clive ses substrats après un résidu d’acide aspartique ; elle est

donc capable d’induire l’apoptose notamment en clivant et en activant de nombreuses

caspases telles que les caspases -3, -6, -7, -8, -9 et -10 (Johnson, 2000). Les calpaïnes

(calcium activated neutral protease) sont des cystéines protéases activées par autolyse par

divers stimuli apoptotiques tels que les irradiations, les agents antitumoraux, les ionophores

et en particulier ceux induisant un stress du Réticulum Endoplasmique (RE), qui provoquent

une augmentation du taux de calcium dans le cytosol. Elles partagent des substrats communs

avec les caspases (Wang, 2000). Par exemple, les calpaïnes clivent Bax lors de l’apoptose de

cellules leucémiques HL-60 induite par des drogues antitumorales (Wood et al., 1998). Les

cathepsines sont des protéases lysosomales synthétisées sous forme de zymogènes et activées

par protéolyse. Elles sont libérées dans le cytoplasme après perméabilisation des membranes

lysosomales induite par les stimuli apoptotiques. Elles semblent activer la voie apoptotique

mitochondriale ; la cathepsine D participe à l’apoptose de lymphocytes T induite par la

staurosporine en activant Bax (Bidere et al., 2003).

I-7 La mort caspase-indépendante

La mort caspase-dépendante est la plus étudiée, mais des voies alternes caspase-

indépendante conduisent au déclenchement de mort cellulaire en réponse à divers stimuli pro-

apoptotiques. Des travaux in vitro et in vivo, en partie basés sur le fait que le z-VAD, un

inhibiteur à spectre large des caspases, ne bloque pas la mort cellulaire, attestent de

l’existence d’une mort indépendante des caspases : (i) lors du développement embryonnaire,

la perte des cellules interdigitales peut être provoquée par un mécanisme indépendant des

caspases (Chautan et al., 1999) ; (ii) l’inhibition de l’activité des caspases par le z-VAD-fmk

dans des cellules leucémiques Jurkat ne bloque pas la toxicité induite par Bax mais provoque

des changements morphologiques et biochimiques de la mort cellulaire (Xiang et al., 1996) ;

(iii) l’injection systémique de z-VAD à des souris potentialise les effets cytotoxiques du

TNFα (Cauwels et al., 2003).

22

Une classification des différents types de morts cellulaires programmées a été

proposée ; basée sur des critères morphologiques et biochimiques permettant de distinguer

l’apoptose des deux types de mort caspase-indépendante, nommées « apoptose-like » et «

nécrose-like ». Ainsi, la mort de type « apoptose-like » possède certaines caractéristiques de

l’apoptose telles que la condensation chromatinienne et l’externalisation des PS, mais les

phénomènes de blebbing, de fragmentation nucléaire, de microfragmentation de l’ADN et la

formation de corps apoptotiques ne sont pas observés. La mort de type « nécrose-like » se

caractérise plutôt par une augmentation de la perméabilité membranaire, un gonflement des

organites intracellulaires et par l’absence de condensation chromatinienne (Jaattela and

Tschopp, 2003; Kroemer and Martin, 2005; Leist and Jaattela, 2001).

I-7-1 La signalisation caspase-indépendante émanant des récepteurs de mort

Les mécanismes moléculaires impliqués dans la signalisation cytotoxique caspase-

indépendante ne sont pas clairement élucidés. Des travaux du groupe de Vandenabeele

indiquent que l’activation des récepteurs de mort Fas et TNFR-1 conduit à une mort caspase-

indépendante impliquant la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) (Vercammen

et al., 1998a; Vercammen et al., 1998b). La sérine thréonine kinase RIP1 (Receptor

Interacting Protein) semble nécessaire à la mort caspase-indépendante médiée par le TNFR-1,

Fas et TRAIL, puisque la déficience en RIP, ou une diminution de son expression, inhibe la

mort induite par l’activation de ces trois récepteurs en présence de z-VAD (Holler et al.,

2000; Thon et al., 2006). Les cibles de RIP dans la signalisation cytotoxique caspase-

indépendante des récepteurs de mort ne sont pas encore clairement élucidées. RIP a été

imliquée dans la production de ROS dans la signalisation nécrotique du TNFR-1 (Lin et al.,

2004b). De plus, la voie de stress impliquant l’activation de JNK (Jun N-terminal Kinase)

constitue une des hypothèses. Ainsi, lorsque la caspase-8 est inhibée (par le z-VAD ou par

des siRNA spécifiques), RIP1 participe à une mort de type autophagique, via l’activation de

JNK (Yu et al., 2004). De plus, en réponse aux dommages à l’ADN, l’activation successive

de RIP et de JNK pourrait participer à la perméabilisation des membranes mitochondriales,

au relargage d’AIF de la mitochondrie et à l’induction d’une mort de type nécrose-like (Xu et

al., 2006). En outre, RIP1 semble impliquée dans l’accumulation de céramide au cours de la

mort caspase-indépendante médiée par le TNFα dans plusieurs lignées cellulaires (Thon et

al., 2005).

23

I-7-2 Rôle de la mitochondrie dans la mort caspase-indépendante

La mitochondrie semble jouer un rôle important dans la signalisation caspase-

indépendante. En effet, la surexpression de Bcl-2 protège les cellules de la mort de type

nécrose-like induite par le TNFα (Thon et al., 2005). De plus, des fibroblastes déficients pour

la protéine Apaf1, qui participe à la formation de l’apoptosome, meurent en réponse à la

surexpression de tBid, tandis que des fibroblastes doubles déficients pour les protéines Bax et

Bak sont résistants. Ces résultats suggérent que les événements mitochondriaux induits par

tBid impliquent les membres pro-apoptotiques Bax et Bak et participent à une mort caspase-

indépendante (Cheng et al., 2001; Wei et al., 2001). En outre, certaines protéines

mitochondriales peuvent être relarguées en l’absence d’activation de caspases. Par exemple,

HtrA2/Omi pourrait agir en tant que protéine effectrice dans une mort de type nécrose-like

grâce à son activité sérine protéase (Hegde et al., 2002). EndoG est capable d’induire une

fragmentation de l’ADN de manière caspase-indépendante sur des noyaux isolés (Li et al.,

2001). Enfin, le z-VAD ne prévient pas les effets d’AIF sur la condensation chromatinienne

et la fragmentation de l’ADN (Susin et al., 1999).

I-7-3 Les protéases impliquées dans la mort caspase-indépendante

Les autres protéases de l’apoptose, distinctes des caspases, telles que les cathepsines,

les calpaïnes et les granzymes (cf I-6) participent aussi aux voies de signalisation caspase-

indépendante, notamment en réponse aux agents antitumoraux. La cathepsine B induit la

mort non apoptotique de cellules pulmonaires cancéreuses en réponse à des agents

stabilisants les microtubules, tel que le paclitaxel (Broker et al., 2004). Les calpaïnes

participent à une mort de type apoptose-like induite par la vitamine D dans des cellules MCF-

7 du cancer du sein (Mathiasen et al., 2002). Le relargage sélectif d’AIF de la mitochondrie

médié par ces deux types de protéases pourrait participer aux voies de signalisation

cytotoxique caspase-indépendante (Bidere et al., 2003; Polster et al., 2005). Le granzyme B

participe également à l’induction d’une mort caspase-indépendante. En effet, les altérations

mitochondriales (relarguage du cytochrome c et chute du potentiel mitochondrial) induites

par le granzyme B dans des cellules Jurkat sont indépendantes de l’activation des caspases

(Heibein et al., 1999). Finalement, le TPCK (N-Tosyl-L-Phenylalanine Chloro-

methylkétone), un inhibiteur de sérine protéases, inhibe la mort nécrotique en réponse au

TNFα et à un agoniste de Fas en présence de z-VAD, suggérant l’implication de ce type de

24

protéase dans la signalisation caspase-indépendante des récepteurs de mort (Denecker et al.,

2001).

I-7-4 Importance de la mort caspase-indépendante en cancérologie

Le succès des traitements anticancéreux repose notamment sur leur capacité à induire

la mort des cellules cancéreuses et en particulier par l’induction de l’apoptose dépendante de

l’activation des caspases. Cependant, l’activation de voie de signalisation caspase-

indépendante semble prometteuse en thérapie anticancéreuse. Ainsi, de nombreux agents

chimiothérapeutiques induisent des morts de type apoptose-like ou nécrose-like. Notamment,

un panel d’agents antitumoraux incluant l’Ara-C, la Doxorubicine, la Vincristine et le Taxol

induisent la mort caspase-indépendante de cellules leucémiques myéloïdes (Carter et al.,

2003). La mort de cellules cancéreuses pulmonaires induite par le taxol, un inhibiteur du

fuseau mitotique, n’est pas inhibée en présence de z-VAD (Huisman et al., 2002). En réponse

à ce même agent, des cellules cancéreuses ovariennes meurent en l’absence d’activation de

caspases vraisemblablement par un mécanisme dépendant d’AIF (Ahn et al., 2004).

En outre, l’activation de ces voies alternes de mort cellulaire pourrait permettre de

surmonter les résistances des cellules aux traitements. En effet, AIF est impliqué dans la mort

caspase-indépendante induite par la staurosporine dans des cellules cancéreuses pulmonaires

chimiorésistantes (Gallego et al., 2004). Ainsi, de nouvelles molécules aux propriétés

antitumorales induisent la mort de cellules leucémiques U937, de neuroblastomes et de

myélomes multiples chimiorésistants, par des mécanismes indépendants des caspases

(Ishitsuka et al., 2005; Lee et al., 2006b; Michaelis et al., 2007).

25

II- La mort des lymphocytes T

La mort cellulaire est un processus essentiel pour la sélection du répertoire

lymphocytaire en favorisant notamment l’élimination des clones autoréactifs et des clones qui

ne reconnaissent pas les molécules du soi. En périphérie, la mort des lymphocytes activés

constitue un mécanisme de rétrocontrôle négatif de la réponse immunitaire. Un défaut de la

mort des lymphocytes T participe au développement de maladies auto-immunes comme

l’ALPS (Autoimmune lymphoproliferative syndrome).

II-1 Sélection thymique

Les lymphocytes T dérivent de progéniteurs immatures synthétisés dans la moelle

osseuse qui migrent ensuite dans le thymus, un organe lymphoïde primaire impliqué dans

leur maturation. Après le réarrangement des gènes codant pour les chaînes α et β de leur

récepteur d’antigène, le TCR (T-cell receptor), les lymphocytes T immatures en

développement dans le thymus subissent une sélection basée sur la spécificité du TCR

(Figure 7).

Les thymocytes « double-positifs », c’est-à-dire exprimant à la fois les molécules

CD4 et CD8, dont les TCR ne reconnaissent pas les molécules du soi (Complexe Majeur

d’Histocompatibilité (CMH)) associées à des peptides antigéniques du soi présentées par les

cellules épithéliales du thymus, meurent d’apoptose. A l’inverse, les thymocytes dont le TCR

se lie aux molécules du soi surexpriment Bcl-2 et survivent : c’est la sélection positive.

Ensuite, la sélection négative contribue au maintien de la tolérance du soi en

permettant l’élimination des lymphocytes potentiellement auto-réactifs. Ainsi, la liaison de

trop haute affinité d’un lymphocyte T immature avec des molécules du CMH du soi liées à

des peptides du soi exposées à la surface de cellules présentatrices d’antigène, entraîne sa

mort. Seuls les thymocytes qui se lient avec une affinité modérée au CMH-peptide du soi

survivent et migrent vers les organes lymphoïdes périphériques. Ceux qui reconnaissent le

CMH de classe 1 portent alors uniquement le marqueur CD8 (simple positif CD4-CD8

+) alors

que ceux qui se lient au CMH de classe 2 expriment le marqueur CD4 (simple positif

CD4+CD8

-) (Marsden and Strasser, 2003).

Le rôle des récepteurs de mort dans la sélection négative des thymocytes reste

controversé tandis que l’implication des membres pro-apoptotiques de la famille de Bcl-2

dans la mort des thymocytes semble plus probable. Ainsi, des expériences à partir de souris

26

lpr déficientes pour le récepteur Fas indiquent que la sélection négative dépend de Fas

seulement en présence de fortes doses d’antigène tandis qu’elle est indépendante de ce

récepteur dans le cas de faibles doses d’antigène (Kishimoto et al., 1998). Cependant, des

travaux plus récents in vitro et in vivo à partir de souris lpr et de souris transgéniques

exprimant un dominant négatif de la protéine FADD excluent un rôle de Fas dans l’apoptose

des thymocytes lors de la sélection thymique (Villunger et al., 2004). Par ailleurs, la

surexpression de Bcl-2, ainsi que la déficience en Bim prévient la mort des thymocytes in

vitro et in vivo, suggérant une implication des protéines pro-apoptotiques de la famille de

Bcl-2 et en particulier de la protéine Bim dans la sélection négative des thymocytes

(Villunger et al., 2004). En outre, il semblerait que des mécanismes de signalisation

indépendants des caspases participent à la mort des thymocytes au cours de leur

développement puisque l’expression de p35, un inhibiteur des caspases d’origine virale ou le

z-VAD (cf chapitre I-3-2 et I-3-3), n’ont pas d’effet sur la sélection négative dans un modèle

de souris transgénique (Doerfler et al., 2000).

II-2 Délétion périphérique et AICD (Activation-Induced Cell Death)

La délétion périphérique participe au phénomène de tolérance du soi (par élimination

des clones autoréactifs) et constitue un mécanisme de rétrocontrôle négatif de l’activité des

lymphocytes (par élimination des lymphocytes T activés) afin d’éviter l’emballement de la

réponse immunitaire. Dans les organes lymphoïdes secondaires, les lymphocytes T matures

survivent et prolifèrent grâce aux cytokines comme l’IL-2, -4, -6 et -7 qui semblent favoriser

l’expression de Bcl-2 et Bcl-xL (Marsden and Strasser, 2003). Les rencontres répétées des

lymphocytes T avec les antigènes provoquent l’activation de leur TCR et leur expansion. Les

lymphocytes T CD4+ se différencient en cellules T helper de type I (Th1) ou de type 2 (Th2)

en fonction de l’environnement cytokinique. Puis, pour maintenir l’homéostasie

lymphocytaire, les lymphocytes T activés sont éliminés par AICD en fin de réponse

immunitaire. L’IL-2 sensibilise les cellules à la mort en permettant notamment

l’augmentation de l’expression de Fas et de FasL à la surface des lymphocytes T ainsi que la

diminution de l’expression de FLIP (Budd, 2001). Deux mécanismes ont été proposés

concernant l’implication du système Fas/FasL dans l’AICD : (i) une mort par « suicide » dans

le cas où le lymphocyte activé exprime à la fois Fas et FasL à sa surface (Brunner et al.,

1995; Dhein et al., 1995) ; (ii) une mort « fratricide » entre deux lymphocytes exprimant

respectivement le récepteur et le ligand. De plus, il est possible que des cellules non

27

lymphoïdes exprimant FasL dans les tissus périphériques infiltrés par les lymphocytes T

participent à l’AICD (Green et al., 2003). Cependant, l’inhibition de la signalisation de Fas

par des anticorps antagonistes de CD95 ou de CD95-L ne prévient pas totalement l’apoptose

des lymphocytes T activés induite par un anti-CD3, suggérant l’implication de mécanismes

alternatifs indépendants de Fas dans l’AICD (Dhein et al., 1995).

Le rôle du TNF dans l’AICD reste très controversé. En effet, un antagoniste du TNF

récepteur I n’a aucun effet sur l’apoptose des lymphocytes T activés induite par l’activation

du TCR (Brunner et al., 1995). A l’inverse, une étude récente indique que des anticorps anti-

TNF neutralisants inhibent l’AICD (Lawrence and Chow, 2005). Différemment,

l’implication de TRAIL dans l’AICD est démontrée dans plusieurs études. Notamment, chez

des patients atteints du SIDA (Syndrome d’immunodéficience acquise), la mort des

lymphocytes T activés dépend de TRAIL (Katsikis et al., 1997). De même, l’expression de

TRAIL augmente au cours de l’activation des lymphocytes T en périphérie et l’inhibition de

la signalisation du récepteur par des anticorps antagonistes prévient partiellement l’AICD

(Martinez-Lorenzo et al., 1998).

Par ailleurs, certains travaux suggèrent l’implication de mécanismes caspase-

indépendants dans l’AICD (Jaattela and Tschopp, 2003). En effet, le z-VAD n’a aucun effet

sur la mort de PBL (Peripheral Blood Lymphocytes) activés en réponse à la PHA

(Phytohémagglutinine) (Holler et al., 2000). De plus, des lymphocytes T issus de souris

portant les mutations lpr et gld sont partiellement résistants à l’AICD et meurent par un

mécanisme indépendant du TNFα et des caspases (Davidson et al., 2002). De même, une

mort de type nécrotique, indépendante des caspases, est observée dans des lymphocytes T

CD4+ et CD8+ après stimulation du TCR. Deux mécanismes distincts ont été proposés : (i)

l’un dépendant de Fas et de p38/MAPK (Mitogen Activated Protein Kinase) dans les cellules

CD4+ ; (ii) l’autre indépendant de Fas et de p38/MAPK dans les cellules CD4+ et CD8+

(Davidson et al., 2002). En outre, des phénomènes caspases-indépendants tels que le

relargage d’AIF et l’activation de JNK ont été décrits au cours de l’AICD de lymphocytes T

cytotoxiques, renforçant l’hypothèse de l’existence de voies de signalisation caspase-

indépendante dans l’AICD (Chhabra et al., 2006). Finalement, une étude récente suggère un

rôle de Granzyme B dans l’AICD de lymphocytes T de type Th2. En effet, à l’inverse des

cellules Th1, la mort des cellules Th2 induite par l’activation du TCR ne dépend pas du

système Fas/FasL. Par contre, les lymphocytes Th2 issus de souris invalidées pour granzyme

B sont résistantes à l’AICD (Devadas et al., 2006).

28

Enfin, l’ACAD (Activated T Cell Autonomous Death) ou la mort « par négligence »

correspond à un second mécanisme de mort des lymphocytes T activés qui dépend de la

privation en cytokines. Cette voie de signalisation cytotoxique est inhibée par Bcl-2 et semble

impliquer la protéine Bim (Jaattela and Tschopp, 2003).

Figure 7 : Rôle de l’apoptose dans le développement des lymphocytes T (Marsden and

Strasser, 2003)

II-3 Pathologies associées à un défaut de la mort des lymphocytes T

Un défaut de mort des lymphocytes T entraîne des maladies du système immunitaire

se manifestant par des phénomènes de lymphoprolifération et d’autoimmunité. Des mutations

chez la souris et chez l’homme portant sur le récepteur Fas, FasL ou les caspases sont

responsables de maladies nommées ALPS (Autoimmune lymphoproliferative syndromes) et

rendent comptent de l’importance de ces protéines dans l’apoptose des lymphocytes T

(Rieux-Laucat et al., 2003).

Chez l’homme, les ALPS sont causés par une défaillance des mécanismes

apoptotiques qui participent au maintien de l’homéostasie lymphocytaire, entraînant

l’accumulation de cellules lymphoïdes T double négatives (CD4-CD8

-) dans les organes

lymphoïdes secondaires et la persistance de cellules autoréactives. L’origine des cellules T

double négatives est incertaine ; elles semblent dériver de cellules CD8+ qui ont perdu leur

capacité à exprimer CD8, probablement en réponse à une stimulation par un antigène du soi.

Ce sont des maladies lymphoprolifératives se manifestant par une lymphadénopathie sévère

29

accompagnée d'une splénomégalie. De plus, les ALPS sont caractérisées par un syndrome

autoimmun se traduisant par une hypergammaglobulinémie et la présence d’auto-anticorps

circulants dirigés contre les hématies, les neutrophiles et les plaquettes. Une anémie

hémolytique, une neutropénie auto-immune et un purpura thrombopénique auto-immun sont

fréquemment retrouvés (Straus et al., 1999).

Les différents types d’ALPS avec leurs caractéristiques sont illustrés sur la figure 8.

- Dans l’ALPS de type 0, une mutation homozygote de Fas entraîne une déficience

complète de la protéine Fas et une forme sévère de la maladie (Rieux-Laucat et al., 1995).

- L’ALPS de type Ia est associé à une mutation hétérozygote sur le gène codant pour

Fas, qui induit l’expression d’un récepteur Fas non fonctionnel muté au niveau du domaine

de mort. Plus de soixante-dix cas ont été décrits à ce jour. Ces mutations entraînent des

défauts d’apoptose par Fas. Il semble que les formes mutées des récepteurs Fas agissent en

tant que dominant négatif sur les formes sauvages en perturbant le recrutement de la protéine

FADD et la formation du DISC (Martin et al., 1999; Straus et al., 2001).

- Une mutation hétérozygote dominante sur le gène codant pour FasL est responsable

de l’ALPS de type Ib chez un patient atteint de lupus érythémateux disséminé. Le phénotype

clinique de cette maladie est très différent des ALPS classiques avec une lymphadénopathie

mais sans splénomégalie ni accumulation de cellules T doubles négatives. In vitro, les PBLs

de ce patient présentent une diminution de l’activité cytotoxique de FasL et sont résistants à

l’AICD, tandis que la prolifération des cellules T induite par l’activation du TCR est

augmentée (Wu et al., 1996). Par ailleurs, une étude récente décrit un nouveau cas d’ALPS de

type Ib dans lequel une forme mutée de FasL exerce un effet dominant négatif sur l’apoptose

médiée par Fas. En se liant aux formes sauvages de FasL, il prévient la formation d’un

homotrimère biologiquement actif. A l’inverse du cas précédent, le patient présente un

phénotype d’ALPS classique (Bi et al., 2007).

- De même, récemment une nouvelle ALPS de type Ic due à une mutation

autosomale récessive dans le domaine extracellulaire de FasL a été identifiée chez une

patiente présentant les manifestations cliniques et immunologiques d’ALPS sévères (Del-Rey

et al., 2006).

- L’ALPS de type IIa est caractérisée par un défaut d’apoptose des lymphocytes et

des cellules dendritiques. Ces patients ne présentent pas d’anomalies du récepteur Fas mais

deux types de mutations (homozygote (V410I) et hétérozygote (L285F)) au niveau de la

grande sous-unité de la caspase-10 affectant son activité. Les lymphocytes T de ces patients

sont résistants à l’apoptose induite par l’engagement de Fas tandis que la signalisation de

30

TRAIL est défectueuse dans les cellules dendritiques et les lymphocytes (Wang et al.,

1999a). Des expériences de co-transfection indiquent que la caspase-10 mutée qui est

recrutée au niveau du DISC pourrait agir en tant que dominant négatif sur l’activation de la

caspase-8. De façon surprenante, la mutation V410I de la caspase-10 a été décrite dans la

population Danoise comme étant un polymorphisme génétique n’ayant pas de conséquence

fonctionnelle (Gronbaek et al., 2000). Toutefois, des patients atteints d’ALPS de type Ia

(ayant une mutation sur le récepteur Fas) qui possèdent l’allèle V410I de la caspase-10,

développent une forme moins sévère de la maladie, suggérant un rôle protecteur de ce variant

de la caspase-10 (Zhu et al., 2006). Des travaux récents décrivent une nouvelle mutation

hétérozygote de la caspase-10 (I406L) responsable d’ALPS de type II (Zhu et al., 2006)

- Un syndrome lymphoprolifératif associé à une immunodéficience en l’absence

d’autoimmunité caractérise l’ALPS de type IIb. Cette maladie concerne deux patients

possédant une mutation homozygote dans le gène codant pour la caspase-8 entraînant

l’expression d’une protéine dépourvue d’activité enzymatique. La caspase-8 mutée est

recrutée au niveau d’un DISC non fonctionnel qui ne provoque pas l’activation de la caspase-

3. Ainsi, l’apoptose induite par Fas est fortement inhibée dans les PBLs de ces patients. De

plus, des défauts dans la production d’IL2 en réponse à la stimulation du TCR, dans

l’activation des lymphocytes T, des cellules NK et dans la production d’anticorps par les

lymphocytes B expliquent les manifestations d’immunodéficience. Ces résultats démontrent

l’importance de la caspase-8 dans l’activation des cellules T, B et NK en plus de son rôle

dans la signalisation apoptotique (Chun et al., 2002).

- Les ALPS de type III concernent les patients présentant des symptômes

caractérisant l’ALPS de type Ia mais dont le défaut génétique n’a pas encore été identifié.

Paradoxalement, in vitro, l’apoptose induite par l’activation de Fas est normale dans les

lymphocytes T activés de ces patients. Une étude récente a mis en évidence des mutations

somatiques hétérozygotes de Fas dans certaines cellules hématopoëtiques de ces patients

tandis que les autres cellules expriment un Fas sauvage. Cet ALPS a donc été classé en tant

que sous-groupe de l’ALPS de type I et renommé ALPS de type Im (mosaïque) (Holzelova

et al., 2004).

Des modèles animaux des ALPS existent chez la souris. La mutation lpr

(lymphoproliferation) consiste en l’insertion d’un rétrotransposon dans le gène fas et entraîne

un défaut total de l’expression de Fas. Dans la souche lprcg

une mutation au niveau du

domaine DD de Fas induit l’expression d’une protéine non fonctionnelle. Enfin, la mutation

gld (generalized lymphoproliferative disease) correspond à une mutation dans le domaine

31

extracellulaire de FasL qui prévient sa capacité à interagir avec le récepteur Fas. Ces

anomalies génétiques se traduisent cliniquement par une accumulation, en périphérie, de

cellules lymphoïdes T double négatives (CD4-CD8

-) associée à des manifestations d'auto-

immunité analogues à celles observées au cours des APLS de type Ia et Ib (Nagata, 1998).

Figure 8: Conséquences des ALPS : DR, Death Receptor ; DC, Dendritic Cell ; CID,

Combine Immunodeficiency ; SLE, Systemic Lupus Erythematosus (Rieux-Laucat et al.,

2003).

Enfin, les patients atteints d’ALPS sont susceptibles de développer certains cancers

tels que les lymphomes Hodgkiniens et non-Hodgkiniens (Straus et al., 2001). De plus, les

mutations au niveau du récepteur Fas sont associées au développement de leucémies

lymphoblastiques aiguës de la lignée T (Beltinger et al., 1998).

32

II-4 Le récepteur Fas

Les ALPS soulignent l’importance du système Fas/FasL dans l’apoptose des

lymphocytes T in vivo. Aussi, la signalisation émanant de ce récepteur a été intensément

étudiée dans les lymphocytes.

II-4-1 Structure de Fas

Comme évoqué précédemment, Fas (CD95 ou Apo1) appartient à la superfamille des

récepteurs au TNF qui sont caractérisés par la présence de 3 à 6 domaines conservés riches en

cystéine (CRD pour « cystein-rich domain ») situés dans la partie extracellulaire. Ces

récepteurs ne possèdent pas d’activité enzymatique intrinsèque. Certains, comme Fas,

possèdent un domaine de mort (DD) intracellulaire, nécessaire et suffisant pour la

transduction du signal apoptotique (Nagata and Golstein, 1995).

Fas est une protéine transmembranaire de type I de 335 acides aminés, avec un poids

moléculaire de 45 KDa, possédant une séquence signal en NH2-terminal extracellulaire. La

partie extracellulaire comprend 3 domaines riches en cystéine d’une quarantaine d’acides

aminés : CRD1, CRD2 et CRD3. Les deux domaines les plus proches de la partie trans-

membranaire (CRD2 et CRD3) correspondent à la zone de fixation du ligand de Fas ou LBD

(pour « ligand binding domain ») (Starling et al., 1997). Le CRD1, associé au

domaine PLAD (pre-ligand binding assembly domain), constitue la zone d'oligomérisation du

récepteur permettant sa trimérisation (Figure 9) (Papoff et al., 1999). En effet, la formation

d’un complexe constitué de récepteurs Fas préassociés en trimère, en dehors de toute

stimulation, semble indispensable pour la transduction du signal apoptotique (Siegel et al.,

2000).

La partie intra-cellulaire de Fas contient le domaine de mort constitué d’une centaine

d’acides aminés, nécessaire au recrutement de protéines de la signalisation telles que FADD,

DAXX et RIP (Chinnaiyan et al., 1995; Stanger et al., 1995; Yang et al., 1997). La partie C-

terminale de Fas sert de zone d'interaction avec la protéine tyrosine phosphatase FAP-1 (pour

« Fas-associated phosphatase ») dont la délétion entraîne une augmentation de l'apoptose

transmise par Fas, suggérant un rôle inhibiteur de cette protéine dans la transduction du signal

par Fas (Sato et al., 1995).

Une étude récente montre que l’inhibition de la phosphorylation de Fas au niveau

extracellulaire sensibilise des cellules leucémiques de type Jurkat à l’apoptose en favorisant

33

l’agrégation du récepteur, suggérant un rôle de ces sites de phosphorylation dans la régulation

des évènements précoces de la signalisation de Fas (Lautrette et al., 2006).

Figure 9 : Structures du récepteur Fas et de son ligand FasL (Wajant et al., 2003)

L : peptide signal, CRD : cystein-rich domain, TM : transmembrane domain, PLAD : pre-

ligand associated domain, PRD : Proline rich domain. La flèche grise indique le site de

clivage de FasL par les métalloprotéinases

II-4-2 Expression et régulation de Fas

Fas est exprimé de façon ubiquitaire, mais son expression est faible dans les

thymocytes, alors qu’elle est augmentée dans les lymphocytes T activés ou dans les

lymphocytes transformés par le virus de la leucémie T humaine (HTLV-I), le virus de

l’immunodéficience humaine (HIV) ou le virus de la mononucléose infectieuse (EBV,

Epstein Barr Virus). Une étude récente montre que l’engagement de CD44 est impliqué dans

l’induction de l’expression de Fas au cours de l’AICD (Nakano et al., 2007). De plus, des

cytokines telles que le TNFα et l’IFNγ sont impliquées dans l’augmentation de l’expression

de Fas (Nagata and Golstein, 1995). En outre, très récemment, il a été suggéré que l’oxyde

nitrique (NO) pourrait participer à la surexpression de Fas dans les cellules tumorales

(Peshes-Yaloz et al., 2007). Finalement, un épissage alternatif de Fas permet la génération de

formes solubles du récepteur tronqué au niveau du domaine transmembranaire. On les

34

retrouvent chez des patients atteints de lupus érythémateux disséminé ou de leucémies

lymphoblastiques aigues (Cheng et al., 1994; Wood et al., 2003). Ces formes solubles de Fas

pourraient bloquer l’apoptose en agissant en tant qu’inhibiteur du ligand.

II-4-3 Le ligand de Fas

Le ligand de Fas, FasL (CD95-L ou Apo1L) est une protéine membranaire de type II

de 281 acides aminés avec un poids moléculaire de 40 kDa. Les séquences d’acides aminés

des FasL humains et murins partageant 77% d’homologie, les interactions Fas/FasL

franchisent les barrières d’espèces (Nagata and Golstein, 1995). Des métalloprotéinases telles

que la MMP-3 (matrix metalloproteinase-3) ou la MMP-7 (Matsuno et al., 2001; Vargo-

Gogola et al., 2002) clivent FasL pour générer une forme homotrimérique soluble qui semble

être moins active que la forme membranaire (Schneider et al., 1998).

Contrairement à Fas, FasL est principalement exprimé par les lymphocytes T activés

et les cellules Natural Killer (Suda et al., 1993). Par ailleurs, son expression dans les tissus

non lymphoïdes pourrait contribuer au « privilège immun » qui consiste à éliminer les

lymphocytes T infiltrant des organes protégés du système immunitaire comme l’œil. De

même, l’expression de FasL à la surface des cellules tumorales pourrait leur permettre

d’échapper à la réponse immunitaire en tuant les lymphocytes T infiltrant les tumeurs.

Cependant, ces notions restent encore controversées. En effet, il semble que FasL ne soit pas

le seul acteur dans la maintenance du « privilège immun » puisque les patients atteints

d’ALPS ne présentent pas de défauts oculaires qui pourraient être provoqués par une

signalisation de Fas défectueuse dans les cellules immunitaires (Maher et al., 2002).

II-4-4 Signalisation apoptotique du récepteur Fas

II-4-4-1 Initiation du signal et formation du DISC

En l’absence de ligand, les monomères du récepteur Fas sont pré-associés en

homotrimères grâce à leur domaine PLAD (Figure 10, I). La liaison de FasL induit la

formation de micro-agrégats de Fas ainsi qu’un changement de conformation au niveau de la

partie cytoplasmique du récepteur permettant l’interaction de protéines adaptatrices avec le

domaine de mort de Fas. Ainsi, la protéine FADD et les caspases-8 et -10 sont recrutées au

niveau du récepteur et participent à la formation d’un complexe multiprotéique appelé DISC

(cf chapitre I-2-3) (Figure 10, II). Quelques minutes suffisent pour l’assemblage du DISC qui

35

dépend des filaments d’actine et qui induit une faible activation de la caspase-8 insuffisante

pour la transduction d'un signal apoptotique (Algeciras-Schimnich et al., 2002). Cependant,

la faible activité de la caspase-8 permet d’activer une sphingomyélinase acide (aSMase) qui

entraîne une génération de céramide dans les rafts de la membrane plasmique par hydrolyse

de sphingomyéline (cf chapitre III-3-a) (Grassme et al., 2003). Ceci favorise la relocalisation

des récepteurs Fas dans les rafts lipidiques qui forment des oligomères de hauts poids

moléculaires nommés SPOTS (Signaling Protein Oligomerization Transduction Structures)

détectables en microscopie confocale (Figure 10, III) (Siegel et al., 2004). Ensuite, le

regroupement des récepteurs (« cluster » de Fas) au niveau de larges plateformes lipidiques

(Figure 10, IV) (cf chapitre III-3-a) permet d'augmenter le signal transmis et une activation

de la caspase-8 efficace pour induire le signal apoptotique (Grassme et al., 2003). Puis, le

complexe Fas/FasL est internalisé par un mécanisme dépendant des filaments d’actine

(Algeciras-Schimnich et al., 2002) et des molécules de clathrine (Figure 10 V). L’association

des récepteurs internalisés avec les lysosomes précoces permet alors un assemblage efficace

du DISC et une amplification du signal apoptotique (Figure 10 VI). Il est à noter qu’en

l’absence d’internalisation du récepteur, l’activation du récepteur Fas conduit à l’induction de

voies de signalisation non apoptotiques, que nous décrirons par la suite (Lee et al., 2006a).

En outre, deux études récentes montrent que la palmitoylation de Fas sur le résidu

cystéine (C199) situé dans une région intracellulaire du récepteur proche de la membrane est

nécessaire à la signalisation précoce de Fas. En effet, l’inhibition de la palmitoylation réduit

la formation des agrégats de hauts poids moléculaire de Fas, l’internalisation du récepteur et

l’activation de la caspase-8 (Feig et al., 2007). Plus précisément, ces modifications

postraductionnelles du récepteur semblent essentielles pour la redistribution de Fas dans les

rafts et son association avec le cytosquelette d’actine médié par l’ezrine, des processus qui

jouent un rôle majeur dans l’internalisation de Fas (Chakrabandhu et al., 2007) (Figure 11).

36

Figure 10 : Les évènements précoces de la signalisation du récepteur Fas dans les cellules de type I (Lee et al., 2006a)

Figure 11 : Rôle de la palmitoylation dans la signalisation précoce du récepteur Fas (Chakrabandhu et al., 2007)

A : La palmitoylation de Fas favorise la localisation de Fas au niveau des microdomaines de

la membrane plasmique.

B : La stimulation du récepteur permet la connexion de Fas avec le cytosquelette d’actine via

l’association avec l’ezrine.

C : L’association avec la cytosquelette d’actine par l’intermédiaire de l’ezrine initie

l’internalisation du récepteur (D), qui permet l’assemblage optimal du DISC (E), conduisant

à l’activation efficace des caspases et à la mort cellulaire.

ceramide

37

Par ailleurs, il est important de préciser que ces modèles sont basés sur des

expériences réalisées à partir de cellules dites de type I (cellules B lymphoblastoïdes SKW6

ou cellules T H9) dans lesquelles le processus d’internalisation semble crucial pour

l’assemblage des composants du DISC, l’activation des caspases et l’induction de l’apoptose,

(Lee et al., 2006a). Or, dans les cellules de type II (cellules lymphoïdes T de type Jurkat ou

CEM) l’internalisation du récepteur n’est détectable que tardivement après la stimulation de

Fas et ne semble pas directement impliquée dans l’induction de l’apoptose. Ceci pourrait

expliquer les différences de signalisation que nous allons détailler maintenant entre les deux

types de cellules (Eramo et al., 2004).

II-4-4-2 Rôle de la voie mitochondriale : cellules de type I et de type II

En se basant sur l'implication de la mitochondrie dans la voie apoptotique induite par

les récepteurs de mort, l'équipe de Krammer a proposé l'existence de deux types de cellules

(Scaffidi et al., 1998) (figure 12).

Consécutivement à l’engagement de Fas, les cellules de type I présentent un taux

important de caspase 8 active au niveau du DISC suffisant pour cliver et activer directement

la caspase-3, une caspase effectrice de l’apoptose, entraînant l’exécution des phases finales

de l’apoptose. Ainsi, le blocage des fonctions mitochondriales par la surexpression de Bcl-2

ou de Bcl-xL dans ce type de cellule, n’a aucun effet sur l'activation des caspases-3 et -8 ou

sur la sensibilité de ces cellules à l’apoptose induite par FasL ou un agoniste de Fas. En

revanche, les cellules de type II présentent un faible taux de caspase-8 au niveau du DISC et

l’activation de la cascade des caspases nécessite l’implication de la voie mitochondriale.

Dans les cellules de type II, à la fois l'activation des caspases ainsi que l'apoptose sont

bloquées par une surexpression de Bcl-2 ou de Bcl-xL. Ainsi, dans ces cellules, pour

lesquelles une amplification du signal apoptotique via la voie mitochondriale est nécessaire,

la mort induite par Fas est modulée par des protéines de la famille Bcl-2. La faible quantité

de caspase-8 activée est suffisante pour le clivage de Bid, un membre pro-apoptique de la

famille de Bcl-2 qui transloque à la mitochondrie et qui participe au relargage de facteurs

mitochondriaux, dont le cytochrome c, permettant l’amplification du signal apoptotique (cf

chapitre I-4).

38

Figure 12 : Voie de signalisation apoptotique du récepteur Fas dans les cellules de type I et de type II (Scaffidi et al., 1998)

Les différences de signalisation observées entre les deux types de cellules n’ont pas

encore été clairement expliquées. Dans les cellules de type I, contrairement aux cellules de

types II, CD95 est principalement localisé dans les rafts en dehors de toute stimulation. Dans

les cellules de type II, la stimulation du récepteur est nécessaire pour la localisation de Fas au

niveau des microdomaines. Ainsi, il semblerait que la localisation de Fas dans les rafts

prédispose à l’internalisation, à la formation du DISC et à l’activation directe de la cascade

des caspases (Eramo et al., 2004).

II-4-4-3 Rôle des caspases initiatrices dans la signalisation de Fas

Les caspases-8 et -10 sont toutes deux recrutées au niveau du DISC en réponse à FasL

(Kischkel et al., 2001; Muzio et al., 1996) mais tandis que les travaux du groupe de Blenis

montrent un rôle essentiel de la caspase-8 dans l’initiation de l’apoptose induite par Fas (Juo

39

et al., 1998), le rôle de la caspase-10 dans la signalisation de Fas est plutôt controversé. En

effet, le groupe de Lenardo montre que la surexpression de la caspase-10 dans les cellules

Jurkat I9-2 (dépourvue de caspase-8) peut complémenter la déficience en caspase-8 et

restaurer la sensibilité des cellules à FasL (Wang et al., 2001). A l’inverse, une autre étude

utilisant une stratégie expérimentale comparable, indique que la caspase-10 ne peut pas se

substituer à la caspase-8 dans la signalisation cytotoxique émanant de Fas (Sprick et al.,

2002) (Figure 13).

Une autre caspase initiatrice, la caspase-2 est recrutée et activée au niveau de DISC en

réponse à la stimulation de Fas. Cependant, ne complémentant pas la déficience en caspase-8,

elle n’est pas considérée comme une caspase initiatrice dans la signalisation apoptotique de

Fas (Lavrik et al., 2006).

II-4-5 Signalisations non apoptotiques activées par le récepteur Fas

Bien que les caspases aient un rôle essentiel dans la mort induite par la stimulation de

Fas, plusieurs études montrent l’existence d’une signalisation cytotoxique indépendante des

caspases émanant du récepteur Fas. Ceci repose principalement sur le fait que le z-VAD

n’inhibe pas totalement la mort cellulaire en réponse à de fortes concentrations de FasL.

Cependant, alors que les voies de signalisation apoptotique activées par CD95 ont été

intensément explorées, les mécanismes de mort caspase-indépendante ne sont pas totalement

élucidés (Figure 13).

II-4-5-1 Fas et la mort caspase-indépendante

Les travaux du groupe de Tschopp ont montré l’implication de la protéine FADD et

de la kinase RIP dans l’induction d’une mort cellulaire programmée caspase-indépendante de

type nécrotique en réponse à FasL dans des lymphocytes. En effet, des cellules Jurkat

déficientes pour ces deux protéines sont résistantes à la mort caspase-indépendante induite

par la stimulation de Fas. Le domaine DED de FADD ainsi que l’activité sérine-thréonine

kinase de RIP semblent requis à l’induction de ce type de mort cellulaire (Holler et al., 2000)

RIP possède trois domaines distincts : un domaine kinase au niveau de l’extrémité NH2-

terminale, un domaine intermédiaire et un domaine de mort situé au niveau de l’extrémité

carboxy-terminale lui permettant de se lier directement au récepteur Fas (Stanger et al.,

40

1995). Par ailleurs, le domaine intermédiaire et le domaine de mort sont nécessaires pour

l’activation de la voie NF-κB dans la signalisation du TNF récepteur (Ting et al., 1996).

Concernant la signalisation en aval du récepteur, les travaux du groupe de Nagata ont

montré que la pyrolidine dithiocarbamate (PDTC), à activité anti-oxydante, inhibe la mort

caspase-indépendante émanant de Fas dans des cellules Jurkat (Matsumura et al., 2000). De

même, il a été montré que le BHA, un autre anti-oxydant, bloque la mort nécrotique induite

par l’engagement de Fas dans des fibroblastes (Denecker et al., 2001; Vercammen et al.,

1998b). Ces travaux suggèrent une implication des espèces réactives de l’oxygène (ROS :

Reactive Oxygene Species) dans la signalisation caspase-indépendante du récepteur Fas. De

plus, comme une diminution du potentiel mitochondrial (∆Ψ) a été détectée dans cette voie

de signalisation, la perméabilité des membranes mitochondriales pourrait être impliquée dans

ce type de mort (Holler et al., 2000; Matsumura et al., 2000). Des protéines pro-apoptotiques

membres de la famille de Bcl-2 pourraient être impliquées dans la signalisation caspase-

indépendante du récepteur Fas. Ainsi, un agoniste de Fas entraîne l’activation de Bak

indépendamment des caspases (Zhang et al., 2004). En outre, une étude très récente indique

un rôle de Fas dans l’induction de l’expression de Bim par un mécanisme indépendant des

caspases et du domaine de mort du récepteur. Cette induction implique la génération de

peroxyde d’hydrogène (Bosque et al., 2007).

Le TPCK, un inhibiteur de sérine protéase, protège des fibroblastes de la mort

nécrotique induite par un agoniste de Fas sans affecter l’apoptose suggérant un rôle des sérine

protéases dans la signalisation caspase-indépendante du récepteur Fas (Denecker et al.,

2001).

II-4-5-2 Fas et JNK (Jun N-terminal Kinase)

La signalisation des MAPK (Mitogen-Actived Protein Kinase) regroupe 3 types de

kinases, les ERK (Extracellular Regulated Kinase), p38 et JNK. La voie de JNK peut être

induite par divers signaux tels que les facteurs de croissance, les cytokines, les médicaments

antitumoraux ou les ultra-violets. JNK active par phosphorylation des facteurs de

transcription tels que cJun et ATF2. Elle est impliquée à la fois dans la prolifération, la

différenciation, la survie cellulaire et l’apoptose (Wajant et al., 2003).

Fas active la voie JNK grâce à la protéine Daxx (Death associated protein) qui

intéragit avec le domaine de mort du récepteur indépendemment de la protéine FADD.

L’intéraction entre DAXX et la kinase ASK-1 (Apoptosis Signal-Regulating Kinase-1)

41

permet l’activation de la cascade des kinases JNK qui conduit à la mort cellulaire (Chang et

al., 1998; Yang et al., 1997). Cependant cette voie de signalisation semble mineure comparée

à la signalisation apoptotique initiée par FADD. En effet, la surexpression d’un variant de Fas

se liant sélectivement à DAXX et incapable de se lier à FADD induit l’activation de JNK

mais pas l’apoptose (Chang et al., 1999). Ainsi, cette voie ne semble pas suffisante pour

induire la mort cellulaire mais elle pourrait constituer un mécanisme d’amplification de la

signalisation cytotoxique.

Rip

FADDFADD

Caspase-8/(10?)

Caspase-3/7

Mort caspase-indépendanteApoptose

?

ROS

Bid

tBid

DA

XX

JNK

?

?

?

Fas

Figure 13 : Les voies de signalisation cytotoxique activées par le récepteur Fas

42

II-4-5-3 Fas et voie de survie : NF-κB

Malgré un rôle prépondérant du récepteur Fas dans la mort cellulaire, certains travaux

suggèrent une implication de Fas dans l’induction de voies prolifératives (Wajant et al.,

2003).

Ainsi, il a été montré que l'activation du récepteur Fas potentialise la prolifération de

cellules T stimulées par l’activation du TCR (Alderson et al., 1993). De plus, Fas et les

caspases, en particulier la caspase-8, semblent impliqués dans la prolifération des cellules T

humaines activées par la stimulation du TCR. En effet, la prolifération des cellules T induite

par un anti-CD3 est bloquée en présence d’un inhibiteur à spectre large des caspases ou un

anticorps antagoniste de Fas. Il a été suggéré que l’induction de l’expression de FasL médiée

par l’activation du TCR pouvait participer au déclenchement d’une voie de signalisation non

apoptotique dépendante de l’activation des caspases (Kennedy et al., 1999). Une étude

récente montre une implication de la caspase-8 dans l’activation de la voie NF-κB (nuclear

factor-kappa B) induite par la stimulation de Fas, qui pourrait expliquer le rôle de cette

caspase dans la prolifération des cellules T induite par la stimulation du TCR (Imamura et al.,

2004).

La voie de signalisation de NF-κB est activée par divers stimuli tels que les cytokines

ou les ultra-violets et régule l’expression de gènes impliqués dans la survie cellulaire. NF-κB

existe sous forme latente dans la cellule, séquestré dans le cytoplasme par un inhibiteur IκB.

La phosphorylation de IκB par le complexe IκB kinase (IKK) entraîne la dégradation d’IκB

et permet la translocation de NF-κB dans le noyau où il peut exercer ses fonctions de facteur

de transcription.

Il a été montré que l'activation de NF-κB et l'induction de l'apoptose, en particulier

par les récepteurs de mort, sont liées par des boucles de rétro-contrôle inhibitrices. Ainsi, la

voie NF-κB régule négativement l'apoptose induite par les récepteurs de mort en augmentant

l'expression de protéines anti-apoptotiques. De plus, l'apoptose interfère avec l'activation de

NF-κB par l'intermédiaire des caspases qui clivent plusieurs composants de la voie de

signalisation de NF-κB. Ainsi, l'inhibition de l'apoptose augmente fortement l'activation de

NF-κB par Fas (Wajant et al., 2003). Notamment, dans des cellules cancéreuses résistantes à

l’apoptose induite par la stimulation de Fas, il a été montré que la stimulation de CD95

favorise la migration et l’invasion tumorale par l’activation de la voie NF-κB (Barnhart et al.,

2004). De même, dans des lymphocytes issus de patients atteints d’ALPS de type Ia qui

43

possèdent un allèle sauvage et un allèle muté du récepteur Fas et qui sont résistants à

l’apoptose, l’activation de NF-κB est normale et pourrait contribuer aux risques de cancers

observés chez ces patients (Legembre et al., 2004).

Les mécanismes moléculaires de cette signalisation non apoptotique de Fas ne sont

pas complètement élucidés. FADD, la caspase-8, la caspase-10 et RIP semblent impliqués

dans l’activation de NF-κB par le récepteur Fas, tandis que FLIP inhibe cette signalisation

(Kreuz et al., 2004; Shikama et al., 2003).

44

III- Sphingolipides et mort cellulaire

III-1 Structure et métabolisme des sphingolipides

Les sphingolipides appartiennent à une classe de lipides structurant les membranes

des cellules eucaryotes. Du fait de leur fonction énigmatique, ils furent nommés ainsi par

J.L.W. Thudichum en référence au sphinx de la mythologie grecque. Ce sont des lipides

complexes dont l'acide gras est lié à une base azotée à longue chaîne (18-20 carbones) par

une liaison amide. La base longue chaîne peut être insaturée (sphingosine) ou saturée

(dihydrosphingosine ou sphinganine). Le céramide qui est l'amide d'une sphingosine et d'un

acide gras, sert de précurseur pour la synthèse de sphingolipides plus complexes résultant de

l’addition de groupements hydrophiles en position hydroxyl-1. Ainsi, l’attachement de

phosphocholine, de glucose, de galactose ou de phosphate sur le céramide permet la

formation respective de sphingomyéline, de glucosylcéramide, de galactosylcéramide et de

céramide-1-phosphate (Figure 14) (Morales et al., 2007).

Figure 14 : Structure des principaux sphingolipides (Futerman and Hannun, 2004)

Le céramide, chef de file des sphingolipides bioactifs est généré dans les cellules par

différentes voies. La synthèse de novo de céramide s’initie sur la face cytosolique du

réticulum endoplasmique (RE) par la condensation d’une sérine et d’un palmitoyl-CoA pour

produire la 3-céto-sphinganine. Cette réaction est catalysée par l’enzyme limitante de la voie

de biosynthèse du céramide, la sérine palmitoyl transférase (SPT). La 3-céto-sphinganine est

45

ensuite réduite en sphinganine qui est ensuite acylée par la (dihydro)céramide synthase

(codée par une famille de 6 gènes LASS, longevity assurance) en dihydrocéramide. Une

désaturation du (dihydro)céramide permet la formation du céramide. Alternativement,

l’hydrolyse de sphingomyéline, le sphingolipide le plus abondant, par des sphingomyélinases

neutres, acides ou alkaline participe à la formation de céramide au niveau de la membrane

plasmique, des lysosomes ou des endosomes. De même, l’hydrolyse des glycosphingolipides

principalement dans les compartiments endolysosomaux permet aussi de générer du céramide

(Goni and Alonso, 2002).

Une fois généré, le céramide peut être convertit en une variété de métabolites. Cette

conversion en dérivés sphingolipidiques est régulée par son transport d’un compartiment

subcellulaire à l’autre. Ainsi, le céramide néosynthétisé transloque du RE à l’appareil de

Golgi par transport vésiculaire ou monomérique (Futerman and Riezman, 2005). CERT

(Ceramide transfer protein), une protéine cytoplasmique récemment découverte semble

assurer le transport monomérique et ATP dépendant du céramide. CERT reconnaît le

céramide grâce à un domaine de transfert de lipides nommé START, tandis qu’un domaine

PH (Pleckstrin Homology) de liaison aux phosphoinositides (PI4P) lui permet de cibler

l’appareil de Golgi (Hanada et al., 2003). La sphingomyéline synthase 1 (SMS1), dont

l’activité catalytique est située sur la face luminale de l’appareil de Golgi convertit le

céramide en sphingomyéline par transfert d’un groupement phosphorylcholine à partir de la

phosphatidylcholine. Il est à noter que la sphingomyéline synthase 2 (SMS2), localisée au

niveau de la membrane plasmique, permet aussi la conversion de céramide en

sphingomyéline selon la même réaction biochimique (Huitema et al., 2004; Yamaoka et al.,

2004). Alternativement, la glucosylcéramide synthase (GCS) transfère une résidu glucose sur

le céramide pour former le glucosylcéramide (GlcCer) ou le galactosylcéramide (GalCer) au

niveau du feuillet cytosolique du Golgi. Enfin, l’ajout de divers groupements sucrés tels que

la N-acetylglucosamine, la N-acétylgalactosamine, le fucose et le galactose sur le GlcCer et

le GalCer permet la formation de nombreux glycosphingolipides. Par exemple, le

lactosylcéramide est formé par galactosylation du glucosylcéramide. Enfin, l’ajout d’acide

sialique sur le lactosylcéramide est à l’origine des gangliosides.

Les céramidases neutres, alkalines, ou acides sont responsables de la dégradation du

céramide en sphingosine dont la phosphorylation, par les sphingosine kinases 1 et 2 permet la

formation de sphingosine-1-phosphate (Kohama et al., 1998; Liu et al., 2000). Finalement, la

sphingosine-1-phosphate est soit déphosphorylée par les S1P-phosphatase 1 et 2, soit

dégradée de façon irréversible par la sphingosine-1-phosphate lyase en hexadécénal et en

46

phosphoéthanolamine (Kihara et al., 2007; Zhou and Saba, 1998). Enfin, le céramide peut

être phosphorylé par la céramide-kinase en céramide-1-phosphate pouvant être

déphosphorylé par la céramide-1-phosphate-phosphatase (Kihara et al., 2007; Sugiura et al.,

2002).

Lactosylcéramide

Glycosphingolipides

Glucosylcéramide

Céramide

Sérine + Palmitoyl-CoA

3-cétosphinganine

Sphinganine

Sphingosine

Dihydrocéramide

Sphingomyéline

GOLGI RE

SPT

FAsCS

SMS1

Sphingomyéline

Glycosphingolipides

Membrane plasmique

Endosome/Lysosome

SMS2

SMase

Céramide

CERT

CKCDase

Sphingosine

Sphingosine-1-phosphate

Phosphoéthanolamine + Hexadécénal

SKS1PP

SPL

Céramide-1-phosphate

C1PP CS

GCS

Figure 15 : Métabolisme sphingolipidique (Morales et al., 2007). RE, Réticulum

Endoplasmique ; GCS, Glucosylcéramide synthase ; SMS, Sphingomyéline synthase ; SPT

Sérine Palmitoyltransférase ; CS, Céramide Synthase ; FAs, Fatty Acids ; ASMase,

Sphingomyélinase acide ; NSMase, Sphingomyélinase neutre ; CK, Céramide Kinase ; C1PP,

Céramide-1-phosphate phosphatase ; CDase, Céramidase ; S1PP, Sphingosine-1-phosphate-

phosphatase ; SK, Sphingosine Kinase ; SPL, Sphingosine-1-phosphate-lyase.

III-2 Rôle des sphingolipides dans l’apoptose

Les sphingolipides ont été considérés pendant de nombreuses années comme des

constituants majeurs des membranes biologiques ayant essentiellement des fonctions

47

structurales, mais peu d’intérêt dans la signalisation cellulaire. Cependant, cette vision a

évolué avec le constat évident que des sphingolipides tels que le céramide, la sphingosine-1-

phosphate et les gangliosides pouvaient intervenir activement dans les voies de signalisation,

régulant différentes fonctions cellulaires comme la prolifération, la différenciation, l’adhésion

et la mort cellulaire. Ainsi, de nombreuses études ont montré que certains sphingolipides sont

impliqués dans la régulation de l’apoptose et participent à des voies alternes de mort

cellulaire.

III-2-1 Les métabolites pro-apoptotiques

III-2-1-1 Le céramide

Diverses observations indiquent un rôle du céramide dans la signalisation

intracellulaire à l’origine du déclenchement de la mort cellulaire :

(i) De nombreux stimuli apoptotiques ou antiprolifératifs (agents

chimiothérapeutiques, récepteurs de mort, radiations UV, infections virales/bactériennes,

privation en sérum) induisent une accumulation intracellulaire de céramide par divers

mécanismes : activation de la synthèse de novo de céramide, hydrolyse de sphingomyéline ou

inhibition de la conversion du céramide en sphingolipides complexes (Hannun and Luberto,

2000). L’augmentation du taux de céramide n’est pas une simple conséquence de la mort. En

effet, la surexpression de proteines anti-apoptotiques comme Bcl-2 inhibe la toxicité sans

affecter la génération de céramide (Zhang et al., 1996) .

(ii) Des analogues perméants de céramide induisent l’activation des caspases et

l’apoptose de diverses lignées cellulaires incluant des cellules tumorales. Il est à noter que le

dihydrocéramide, un précurseur naturel du céramide, n’a aucun effet toxique (Hannun and

Luberto, 2000).

(iii) La modulation du métabolisme du céramide par des inhibiteurs pharmacologiques

ou des stratégies épigénétiques permet de réguler la mort cellulaire. La surexpression

d’enzymes impliquées dans la génération de céramide favorise la mort cellulaire tandis que

leur inhibition protège de la toxicité. Par exemple, la surexpression de la sphingomyelinase

au niveau de la mitochondrie provoque une élévation du taux de céramide suffisante pour

induire l’apoptose (Birbes et al., 2001), alors qu’à l’inverse, des cellules déficientes en SMase

acide sont résistantes aux agents de stress (Zhang et al., 2001). De même, la surexpression de

la C18-céramide synthase induit l’apoptose de cellules de carcinomes humains (Koybasi et

48

al., 2004), tandis que la réduction de la synthèse de novo de céramide par l’inhibition de la

SPT (par la L-cyclosérine) ou de la céramide synthase (par la fumonisine B1) confère une

résistance à la mort induite par divers stimuli (Kroesen et al., 2001; Scarlatti et al., 2004).

(iv) L’inhibition des enzymes de conversion du céramide permet d’accumuler le

céramide et de favoriser la mort cellulaire. Ainsi, l’inhibition de sa conversion en

glucosylcéramide, par des antisens dirigés contre la GCS, ou en sphingomyéline par le D609,

un inhibiteur pharmacologique de la SMS, provoque l’augmentation du taux de céramide

endogène et potentialise la mort induite par des agents chimiothérapeutiques ou par un

agoniste de Fas (Liu et al., 2004; Watanabe et al., 2004). Enfin, l’inhibition de la céramidase

ou de la sphingosine kinase par approche pharmacologique ou par siRNA induit les mêmes

effets (Holman et al., 2007; Pchejetski et al., 2005). A l’inverse, la surexpression de ces

enzymes du métabolisme du céramide protège de la mort cellulaire (Bonhoure et al., 2006;

Liu et al., 1999b; Separovic et al., 2007; Thon et al., 2006). Ces études indiquent un rôle

important du métabolisme sphingolipidique dans la réponse cytotoxique à divers agents de

stress.

Le céramide pourrait agir en tant que second messager en activant directement ou

indirectement des cibles intracellulaires à l’origine de l’activation de voies de signalisation.

PP2A et PP1, des sérine/thréonine phosphatases de la famille des CAPP (Ceramide-Activated

Protein Phosphatase) sont activées par le céramide in vitro et sont impliquées dans la

déphosphorylation de divers substrats incluant la protéine kinase PKCα, Bcl-2, Akt, c-jun, la

protéine rb, Bax et les protéines SR (Morales et al., 2007; Xin and Deng, 2006). Ainsi, les

CAPP apparaissent comme des cibles directes médiant les effets antiprolifératifs et pro-

apoptotiques du céramide. De plus, le céramide active la kinase suppresseur de Ras (KSR)

qui elle-même active les voies des MAPK (Mitogen-activated protein kinase), Raf1, PKCζ et

des MEKK (MAPK/ERK kinase kinase) (Ogretmen and Hannun, 2004; Ruvolo, 2003). Des

expériences in vitro ont également montré que la cathepsine D pouvait être une cible du

céramide (Heinrich et al., 1999). Les caspases semblent aussi être impliquées dans l’apoptose

induite par le céramide. En effet, des céramides perméants activent les caspases effectrices 3

et 7 dans des cellules Jurkat (Cuvillier et al., 1998). Cependant la place du céramide dans la

cascade des caspases reste controversé.

La mitochondrie, un des compartiments de génération du céramide, semble être une

des cibles du céramide (Bionda et al., 2004). En effet la surexpression de Bcl-2 inhibe les

effets cytotoxiques du céramide (Sawada et al., 2000). De plus, l’addition de céramide

49

exogène sur des mitochondries purifiées entraîne l’inhibition de l’activité de la chaîne

respiratoire, la génération d’espèces réactives de l’oxygène et la libération de cytochrome c

(Hannun and Obeid, 2002). Ces perturbations du fonctionnement mitochondrial induites par

le céramide pourraient s’expliquer par sa capacité à former des canaux à travers la membrane

externe mitochondriale (Siskind et al., 2005).

En outre, un autre mode d’action du céramide dans les voies de signalisation de mort

implique son rôle dans la réorganisation des structures membranaires. En effet,

l’accumulation de céramide, par hydrolyse de sphingomyéline au niveau de microdomaines

de la membrane plasmique types rafts ou cavéoles, participe à la formation de larges

plateformes de signalisation (Bollinger et al., 2005). Ces plateformes servent de sites

d’oligomérisation des récepteurs et de formation de complexes moléculaires à l’origine de la

transduction de signaux apoptotiques en réponse à divers stress cellulaires tels que les UV,

les radiations γ, les traitements chimiothérapeutiques et les récepteurs de mort (Morales et al.,

2007).

III-2-1-2 La sphingosine

La sphingosine est générée à partir du céramide par l’action des céramidases. De

nombreux travaux du groupe de Spiegel ainsi que des travaux plus récents montrent un rôle

pro-apoptotique de la sphingosine dans divers types cellulaires. En effet, son taux est

augmenté en réponse à de nombreux stimuli de stress incluant l’anti-Fas, le TNFα, la

doxorubicine, la privation en sérum (Cuvillier et al., 2000; Cuvillier and Levade, 2001;

Cuvillier et al., 2001; Nava et al., 2000; Suzuki et al., 2004). Ajoutées de façon exogène aux

cellules, elle entraîne la mort par apoptose avec activation des caspases et relargage de

protéines mitochondriales (cytochrome c et Smac/diablo) (Cuvillier et al., 2001; Phillips et

al., 2007). De plus, la surexpression de Bcl-xL prévient ces phénomènes, suggérant un rôle de

la mitochondrie dans la médiation des effets pro-apoptotiques de la sphingosine (Cuvillier,

2002). Récemment, la sphingosine a été montrée comme capable de former des canaux au

niveau de membranes de mitochondries isolées. Cependant la contribution de ce phénomène

dans l’induction de l’apoptose reste incertaine du fait de la petite taille des pores formés

(Siskind et al., 2005).

50

III-2-1-3 Les gangliosides

Les gangliosides, des glycosphingolipides contenant des résidus d’acide sialique sont des

constituants ubiquitaires des membranes plasmiques. Ils peuvent aussi être associés à

certaines organelles intracellulaires telles que la mitochondrie ou le réticulum endoplasmique.

Leur rôle dans l’induction de la mort semble dépendre du type cellulaire étudié. En effet,

certains travaux indiquent clairement un rôle tumorigène des gangliosides. Le pouvoir

métastatique de lignées humaines ou murines de mélanome est corrélé avec les taux de GD3

et de GM3. De plus, la diminution de l’expression de la GD3 synthase par stratégie

d’interférence à l’ARN diminue la croissance cellulaire et l’activité invasive de lignées

cellulaires de cancer du poumon (Segui et al., 2006). A l’inverse, d’autres études montrent un

rôle de ces mêmes gangliosides en tant qu’inducteur d’apoptose dans des cellules

leucémiques, gliales ou neuronales (De Maria et al., 1997; Omran et al., 2006; Sohn et al.,

2006). Ainsi, le GD3 augmenterait la perméabilité des membranes mitochondriales favorisant

le relargage de protéines pro-apoptotiques (Malorni et al., 2007). Mais il semble également

agir sur la voie extrinsèque de l’apoptose en induisant la relocalisation des récepteurs de mort

Fas, TNFR-1 et DR5 dans les microdomaines de la membrane plasmique et en favorisant

l’activation de la caspase-8 (Omran et al., 2006). De plus, l’accumulation de GM1 dans les

membranes du réticulum endoplasmique (RE) provoque le stress du RE, la libération de

calcium dans le cytosol et l’activation de la cascade apoptotique initiée par la caspase-12

(d'Azzo et al., 2006).

III-2-2 Les métabolites anti-apoptotiques

III-2-2-1 Le céramide-1-phosphate

Le céramide-1-phosphate apparaît comme une nouvelle classe de métabolite

sphingolipidique bioactif. Jusqu’à présent les travaux du groupe de Gomez-Munoz avaient

montré son rôle mitogène dans des fibroblastes (Gomez-Munoz et al., 1995). De plus, il

participe à l’inhibition de l’apoptose dans des macrophages par différents mécanismes : (i)

inhibition de la sphingomyélinase acide et prévention de l’accumulation de céramide en

réponse à la privation en facteur de croissance M-CSF (Gomez-Munoz et al., 2004); (ii)

activation de la voie PI3K/NFκΒ et augmentation de l’expression de Bcl-xL (Gomez-Munoz

et al., 2005). Cependant des travaux plus récents indiquent un effet cytotoxique du Ceramide-

51

1-phosphate à de fortes concentrations dans des cellules de carcinome pulmonaire A549 et

des fibroblastes NIH 3T3 qui pourrait dépendre de sa conversion en céramide (Mitra et al.,

2007).

III-2-2-2 La sphingosine-1-phosphate (S1P)

La S1P est générée par phosphorylation de la sphingosine par deux enzymes, la SK1

et la SK2. D’après des données récentes, il semblerait que ces deux enzymes qui catalysent la

même réaction enzymatique aient des fonctions cellulaires opposées. Alors que la SK1

participerait à la prolifération et la migration, la SK2 favoriserait des réponses pro-

apoptotiques (Huwiler and Zangemeister-Wittke, 2007). En effet, l’inhibition de la SK1

potentialise l’apoptose induite par la doxorubicine dans des cellules MCF-7 (Sarkar et al.,

2005) tandis que la surexpression de la SK2 inhibe la croissance et stimule l’apoptose (Liu et

al., 2003). Par ailleurs, de récents travaux du groupe de Spiegel suggèrent que c’est le lieu de

production de la S1P qui déterminerait la façon dont ces deux enzymes exercent leurs effets

opposés (Hait et al., 2006). L’addition de S1P exogène sur la plupart des cellules inhibe

l’apoptose médiée par le céramide et par l’activation de récepteurs de mort tels que Fas ou le

TNFR-I. Ainsi, la S1P antagonise les effets du céramide et interfère avec la cascade

apoptotique en inhibant le relargage du cytochrome c et de Smac/Diablo de la mitochondrie

(Cuvillier et al., 2001; Cuvillier et al., 1996; Ogretmen and Hannun, 2004). Elle participe

aussi à des processus importants pour la progression tumorale tels que les phénomènes de

migration, de survie, d’adhésion cellulaire et d’angiogénèse, ce qui lui confère des propriétés

tumorigènes (Ogretmen and Hannun, 2004) (Segui et al., 2006).

III-2-2-3 Le glucosylcéramide

Les travaux du groupe de Cabot ont d’abord montré l’implication du

glucosylcéramide dans les phénomènes de résistance multidrogues ; l’expression de la

protéine P-gp impliquée dans les phénomènes d’efflux des drogues étant corrélée à

l’augmentation du taux de glucosylcéramide. Ceci attribue plutôt un rôle anti-apoptotique au

glucosylcéramide. Ainsi, des cellules du cancer du sein MCF-7 résistantes aux traitements

chimiothérapeutiques accumulent de façon excessive le glucosylcéramide en comparaison à

des cellules sensibles. De plus, l’inhibition de la synthèse du glucosylcéramide sensibilise des

cellules résistantes aux drogues anti-tumorales, tandis qu’à l’inverse, sa surexpression

52

entraîne une résistance accrue des cellules à la doxorubicine (Segui et al., 2006). Des études

récentes montrent que l’inhibition de l’activité de la GCS favorise l’augmentation du taux

intracellulaire de céramide et participe à l’apoptose de cellules leucémiques induite par les

radiations UV ou l’Arsenic trioxide (Dolgachev et al., 2004) (Dbaibo et al., 2007).

Cependant, des travaux de notre laboratoire modèrent l’importance de la glucosylation

du céramide dans les mécanismes de résistance. En effet, des cellules de mélanome B16 de

souris déficientes en GCS (lignée GM95) ont une sensibilité aux drogues anti-tumorales

comparable aux cellules qui surexpriment la GCS (Veldman et al., 2003). De plus, des

lignées lymphoblastoïdes issues de patients atteints de la maladie de Gaucher, due à un défaut

de la glucosylcéramidase acide, accumulent le glucosylcéramide et sont plus sensibles à

l’apoptose induite par la daunorubicine que des lymphoblastes issus d’individus sains. A

l’inverse, l’inhibition de la GCS par le PDMP protège les cellules leucémiques vis-à-vis de la

daunorubicine, suggèrant plutôt un rôle pro-apoptotique du glucosylcéramide (Grazide et al.,

2004). Ceci est en accord avec une étude très récente indiquant un effet cytotoxique du

glucosylcéramide spécifique aux cellules tumorales (Oku et al., 2007). En outre, les effets

pro-apoptotiques du glucosylcéramide pourraient dépendre de sa conversion en GD3, décrit

comme inducteur d’apoptose (cf chapitre III-2-1-3).

III-2-3 Sphingolipides et morts non apoptotiques

Des travaux récents indiquent un rôle des sphingolipides dans l’induction de voies

alternes de mort cellulaire non apoptotiques (Figure 16). Ainsi, le céramide est impliqué dans

la mort autophagique induite par le tamoxifène dans des cellules du cancer du sein MCF-7 en

favorisant l’accumulation de Beclin1 (Scarlatti et al., 2004). De plus, le céramide a été

montré comme pouvant activer BNIP3, un membre de la famille BH3-only qui participe au

processus d’autophagie (Daido et al., 2004). L’implication du céramide dans la mort caspase-

indépendante a également été montré dans plusieurs études. Des analogues de céramide

induisent une toxicité qui n’est que partiellement inhibable par le z-VAD-fmk (Ramos et al.,

2003) (Zhao et al., 2004). Une production de céramide médiée par la kinase RIP a été décrite

dans la mort caspase-indépendante en réponse au TNF (Thon et al., 2005). De même, des

fibroblastes murins surexprimant la céramidase acide résistent à la mort caspase-

indépendante induite par le récepteur TRAIL, suggérant un rôle du céramide dans cette

signalisation cytotoxique (Thon et al., 2006). En ce qui concerne la mort mitotique, une étude

sur des cellules leucémiques montre que la psychosine (β-galactosylsphingosine) inhibe la

53

cytodiérèse entraînant ainsi la formation de cellules multinucléées caractéristiques de ce type

de mort (Kanazawa et al., 2000).

Figure 16 : Les sphingolipides dans la modulation de la mort cellulaire (Segui et al.,

2006). CD, cell death ; Cer, céramide ; Cer1P, céramide 1-phosphate ; GalCer,

galactosylcéramide ; GalSph, galactosylsphingosine (psychosine) ; GD3, ganglioside GD3 ;

GlcCer, glucosylcéramide ; GM3, ganglioside GM3 ; LacCer, lactosylcéramide ; MDR,

multidrug résistance ; Sph, sphingosine ; Sph-1P, sphingosine 1-phosphate.

III-3 Rôle des sphingolipides dans la signalisation apoptotique du récepteur Fas

III-3-1 La voie sphingomyéline-céramide dans la signalisation de Fas

La voie sphingomyéline-céramide consiste en l’hydrolyse de sphingomyéline en

céramide par une sphingomyélinase neutre ou acide. Plusieurs études montrent une

génération de céramide consécutive à l’activation du récepteur Fas par un anti-Fas agoniste

dans des cellules leucémiques T de type Jurkat. Cette production de céramide semble

biphasique, (Cuvillier et al., 2000) avec une accumulation précoce (dès trente minutes) et

transitoire, consécutive à l’activation des deux types de sphingomyelinases neutre et acide

(Cifone et al., 1995) ; une augmentation plus tardive et soutenue dépendant plutôt de

l’activation d’une SMase neutre cytosolique (Tepper et al., 1997; Tepper et al., 1999). La

production précoce de céramide pourrait être impliquée dans la phase d’initiation de

l’apoptose tandis que la production tardive interviendrait de façon concomitante à l’induction

de l’apoptose et à l’activation des caspases effectrices (van Blitterswijk et al., 2003).

54

Les travaux des groupes de Kolesnick et de Gulbins indiquent que le céramide généré de

façon précoce au niveau du feuillet externe de la membrane plasmique favorise l’agrégation

du récepteur Fas localisé dans les rafts et par conséquent l’activation de la signalisation

cytotoxique en réponse à FasL ou à un agoniste de Fas (Grassme et al., 2001) (Cremesti et al.,

2001). Il semblerait que la translocation, par des mécanismes inconnus, de la SMase acide du

lysosome vers la membrane plasmique soit dépendante des caspases (plus probablement de la

caspase-8) et soit impliquée dans ce phénomène d’oligomérisation (Grassme et al., 2003)

(Figure 17). Cependant, même si des travaux réalisés sur des cellules déficientes en SMase

acide, issues de patients atteints de la maladie de Niemann-Pick, ainsi que chez la souris KO

pour la SMase acide suggèrent une fonction de cette hydrolase dans la signalisation

cytotoxique de CD95 (Cremesti et al., 2001; Kirschnek et al., 2000; Lin et al., 2000), le rôle

de la SMase acide dans la signalisation apoptotique reste controversé. En effet, la restauration

de l’activité de la SMase acide dans des lignées lymphoblastoïdes déficientes en SMase acide

n’affecte pas l’apoptose induite par l’engagement de Fas (Bezombes et al., 2001; Cock et al.,

1998).

En outre, alors que la déficience en SMase acide peut prévenir la production rapide de

céramide dans certains types cellulaires (Cremesti et al., 2001), elle n’affecte pas la formation

tardive de céramide dans des cellules Jurkat (Cock et al., 1998). Les travaux du groupe de

Borst sont en faveur du rôle d’une SMase neutre dans la génération du céramide tardif dans la

signalisation de Fas (Tepper et al., 1999; Tepper et al., 1995). Toutefois, comme la

surexpression de la SMase neutre 1 n’affecte pas la production de céramide, ni l’apoptose de

cellules Jurkat induite par un agoniste de CD95, la nature de la SMase neutre potentiellement

responsable de cette génération de céramide reste à identifier (Tepper et al., 2001).

Finalement, en plus de son rôle dans la signalisation apoptotique, l’hydrolyse de SM

en céramide au niveau du feuillet externe de la membrane plasmique en réponse à Fas,

pourrait participer aux changements morphologiques et biochimiques caractéristiques de

l’apoptose, tels que le blebbing, l’externalisation des PS et la formation des corps

apoptotiques (Tepper et al., 2000b)

55

Figure 17 : Implication de la voie sphingomyéline/céramide dans la signalisation précoce de Fas (Grassme et al., 2003).

Ce modèle indique que l’engagement de Fas induit l’activation de la caspase-8 qui participe à

la translocation de la sphingomyélinase acide (ASM) des vésicules lysosomales à la

membrane plasmique. Le céramide généré favorise l’agrégation du récepteur permettant

l’amplification du signal apoptotique par l’activation efficace de la caspase-8.

III-3-2 La sphingomyéline synthase (SMS) dans la signalisation de Fas

La voie sphingomyéline/céramide est régulée par l’activité de la sphingomyéline

synthase qui convertit le céramide en sphingomyéline. En effet, la SMS permet de produire la

SM, substrat des SMases et favorise la resynthèse de SM à partir du céramide. Il existe des

controverses quant au rôle de la SMS dans la signalisation de Fas. Les travaux du groupe

d’Okazaki suggèrent un rôle de l’inhibition de la SMS dans l’apoptose induite par l’activation

de Fas. En effet, suite à l’engagement de Fas, une inhibition caspase-dépendante de l’activité

nucléaire de la SMS corrélée à une augmentation du taux de céramide dans le noyau a été

montrée dans des cellules T de type Jurkat. De plus, le D609, un inhibiteur pharmacologique

56

de la SMS potentialise la mort induite par un agoniste de Fas. Ainsi, l’inhibition de la SMS

nucléaire pourrait participer à la production de céramide et à la signalisation cytotoxique de

Fas (Watanabe et al., 2004). Cependant, des travaux récents sont en contradiction avec ses

résultats et indiquent un effet protecteur du D609 vis-à-vis d’un agoniste de Fas dans des

cellules Jurkat et des cellules HeLa (Zhang et al., 2005). En outre, des cellules leucémiques

murines totalement déficientes en SMS (WR19L) présentent un défaut dans la redistribution

de Fas dans les rafts ainsi qu’une résistance à l’apoptose induite par un agoniste de Fas. Il a

été suggéré que la SM membranaire était nécessaire pour l’aggrégation du récepteur Fas au

niveau des rafts (Miyaji et al., 2005).

III-3-3 La synthèse de novo de céramide dans la signalisation de Fas

Peu de données, et apparemment controversées, existent quant au rôle de la synthèse

de novo de céramide dans l’apoptose induite par Fas. Les travaux du groupe de Borst exclue

l’implication de la céramide synthase dans la génération de céramide conséquente à

l’activation de Fas puisque l’accumulation de céramide n’est pas affectée par la fumonisine

B1, un inhibiteur de cette enzyme (Tepper et al., 2000b). A l’opposé, deux études indiquent

que la majeure partie du céramide accumulé tardivement en réponse à un anti-Fas provient de

l’activation de la synthèse de novo puisque la fumonisine B1 prévient de 80% l’élévation du

taux de céramide dans des cellules Jurkat. Cependant la fumonisine n’affecte pas la mort

cellulaire, suggérant un rôle mineur de la synthèse de novo de céramide dans la signalisation

cytotoxique de Fas (Chalfant et al., 2001) (Cuvillier et al., 2000).

En outre, une étude suggère un rôle de la synthèse de novo des sphingolipides et plus

particulièrement de la synthèse de sphinganine dans l’AICD qui dépend du système Fas/FasL

(cf chapitre II-2). En effet la myriocine, un inhibiteur de la sérine palmitoyl transférase (SPT)

inhibe la mort de lymphocytes T induite par un anti-CD3. A l’inverse, la fumonisine B1

n’affecte pas l’AICD, suggérant un rôle de la synthèse de novo de la sphinganine plutôt que

du céramide dans l’AICD (Solomon et al., 2003).

III-3-4 La sphingosine et la sphingosine-1P dans la signalisation de Fas

Il a également été montré un rôle de la sphingosine dans l’induction d’évènements

mitochondriaux au cours de l’apoptose induite par l’engagement de Fas. En effet, le

traitement de cellules Jurkat par un agoniste de Fas induit une augmentation rapide de

57

sphingosine consécutive à l’accumulation précoce de céramide et à l’activation transitoire

d’une céramidase acide. Une partie du céramide précoce généré en réponse à l’engagement

de Fas, pourrait donc être dégradée en sphingosine et les deux métabolites pourraient agir au

niveau de la mitochondrie pour activer la cascade apoptotique (Cuvillier et al., 2001).

A l’inverse, d’autres études indiquent un effet inhibiteur de la S1P dans la

signalisation apoptotique du récepteur Fas. En effet, la S1P a été montrée comme pouvant

inhiber l’activation des caspases effectrices, le clivage de PARP et la mort de cellules Jurkat

en réponse à un anti-Fas agoniste (Cuvillier and Levade, 2001; Cuvillier et al., 1998). De

même, des lymphoblastes de patients atteints de polyarthrite rhumatoïde et résistants à la

mort induite par l’activation de Fas, présentent une activité basale accrue de la sphingosine

kinase et, par conséquent, des taux élevés de S1P. Cette résistance peut être reversée par

l’inhibition de la SK1 par des siRNA ou un inhibiteur de la SK1, la N, N-

diméthylsphingosine (DMS), confirmant un rôle anti-apoptotique de la S1P dans la

signalisation de Fas (Pi et al., 2006).

Par ailleurs, la surexpression de la céramidase acide, qui induit une diminution du taux de

céramide et une augmentation concomitante des taux de sphingosine et de sphingosine-1-

phosphate, confère une résistance des cellules SCC-1 du cancer de la tête et du cou vis-à-vis

de FasL. L’inhibition de la céramidase acide par l’inhibiteur LCL 204 (AD2646) ou par

stratégie siRNA, sensibilise les cellules SCC-1 à l’apoptose induite par un agoniste de Fas

(Norris et al., 2006). De plus, in vivo, sur un modèle de xénogreffe tumorale, l’inhibiteur

LCL204 potentialise les effets de la thérapie génique par FasL, en inhibant la croissance

tumorale de ces cellules et en augmentant considérablement la survie des souris (Elojeimy et

al., 2007).

III-3-5 Les glycosphingolipides dans la signalisation de Fas

Les études du groupe de Testi montrent qu’au cours de l’apoptose induite par CD95,

la génération de céramide est suivie d’une accumulation intracellulaire de GD3 qui

semblerait dépendre des activités successives de la SMase acide et de la GD3 synthase. Ainsi,

en réponse à l’activation de Fas, l’accumulation de GD3 est bloquée dans des lymphoblastes

déficients en SMase acide (issus de patients atteints de la maladie de Niemann-Pick) ainsi

qu’en présence d’anti-sens spécifiques de la GD3 synthase. De plus, l’inhibition

pharmacologique de l’activité de la GD3 synthase prévient partiellement la mort cellulaire

confirmant une implication du GD3 dans l’induction de l’apoptose par Fas (De Maria et al.,

58

1997; Malisan and Testi, 1999). Par ailleurs, une intéraction entre le GD3 et l’ezrine, une

protéine se liant au cytosquelette d’actine, pourrait favoriser la relocalisation du GD3 dans la

mitochondrie en réponse à la stimulation de Fas (Giammarioli et al., 2001; Malorni et al.,

2007). Ainsi, suite à l’engagement du récepteur Fas, le GD3 pourrait jouer un rôle en tant que

composant structural de la mitochondrie au sein d’un complexe multimoléculaire incluant

VDAC-1, les protéines de la famille de Bcl-2 (tBid et Bax) et des protéines de fission telle

que hFis1. Ce complexe favoriserait l’ouverture des pores de transition de perméabilité

mitochondriale et le déclenchement de l’apoptose (Garofalo et al., 2005).

En outre, dans les cellules lymphocytaires humaines, le GD3 et le GM3 sont

principalement concentrés dans les rafts. La formation du DISC dans les rafts a été décrite

suite à l’engagement du récepteur Fas (cf chapitre II-4-4-1). Elle semble contribuer à

l’induction de l’apoptose puisque l’altération des rafts par la β-methylcyclodextrine inhibe

fortement la toxicité en réponse à un agoniste de Fas dans des cellules lymphoblastoïdes

humaines (Garofalo et al., 2003). Ainsi, les gangliosides pourraient aussi être impliqués dans

l’initiation de la signalisation du récepteur Fas, en tant que composants structuraux du

complexe multimoléculaire de signalisation au niveau de la membrane plasmique.

Le rôle du glucosylcéramide a été peu étudié dans la signalisation de Fas. Une seule

étude du groupe de Borst indique que le céramide généré en réponse à Fas n’est pas converti

en glucosylcéramide lorsque la GCS est surexprimée dans des cellules Jurkat. Ceci peut

s’expliquer par le fait que l’activité de la GCS est inhibée pendant l’apoptose et/ou que la

production de céramide s’effectue dans un compartiment subcellulaire distinct de celui de la

GCS (Tepper et al., 2000a).

III-4 Analogues sphingolipidiques et inhibiteurs du métabolisme du céramide en

thérapie anticancéreuse

Le céramide apparaît comme médiateur de réponses antiprolifératives à l’inverse de la

S1P qui favorise la croissance et la progression tumorale. Des stratégies qui miment,

antagonisent ces sphingolipides ou qui modulent leur taux représentent une nouvelle

perspective en thérapie anticancéreuse. Ainsi, de nombreux composés ayant des homologies

structurales avec les sphingolipides, ou pouvant inhiber le métabolisme sphingolipidique, ont

été synthétisés chimiquement ou isolés à partir de composés naturels.

59

III-4-1 Ciblage du métabolisme du céramide

Le céramide étant impliqué dans la mort cellulaire induite par de nombreux agents

anticancéreux, de nouvelles approches thérapeutiques pourraient consister à augmenter le

taux de céramide endogène ou à mimer ses effets à l’aide d’analogues structuraux.

De nombreux analogues structuraux de céramide ont été synthétisés ces dernières

années, capables de reproduire les effets pro-apoptotiques du céramide dans divers types de

cellules cancéreuses, en induisant l’activation des caspases ou des cibles directes du

céramide, telles que les CAPP (Ogretmen and Hannun, 2004). Le LCL-30, un analogue de

céramide cationique à longue chaîne nouvellement synthétisé induit une forte toxicité sur des

cellules de cancer du colon, en s’accumulant dans la mitochondrie et en favorisant le

relargage du cytochrome c et l’activation des caspases-3 et -9 (Dindo et al., 2006). De plus, il

apparaît que ces analogues peuvent à la fois induire une toxicité caspase-dépendante mais

également indépendante des caspases. Ainsi le 4,6-diene-céramide induit l’apoptose caspase-

dépendante de cellules du cancer du sein, tandis que les effets toxiques du C2-céramide sur

des cellules cancéreuses de la prostate ou des cellules de neuroblastome, peuvent être

indépendants de l’activation des caspases (Engedal and Saatcioglu, 2001; Struckhoff et al.,

2004). Certains, comme l’adamantyl-céramide et le B13, présentent des propriétés de

cytotoxicité sélective, respectivement vis-à-vis des cellules du cancer du sein et du colon, et

semblent moins toxiques pour les cellules normales (Crawford et al., 2003; Selzner et al.,

2001). De plus, certains analogues présentent des effets toxiques in vivo sur des modèles de

tumeurs du colon chez la souris. Ainsi, le thiouracil-céramide induit une réduction de la

masse tumorale tandis que le B13 prévient la formation de métastases hépatiques (Macchia et

al., 2001; Selzner et al., 2001).

Le ciblage des enzymes de métabolisation du céramide constitue une autre approche

permettant d’augmenter le taux intracellulaire de céramide, et donc de favoriser la mort

cellulaire. Les effets potentialisateurs sur la toxicité induite par les radiations γ, d’une

stratégie de multiciblage du métabolisme du céramide, montrent l’avantage de cibler les

enzymes de conversion du céramide. Ainsi, l’inhibition combinée de la GCS, de la SMase

acide et de la céramidase par des inhibiteurs pharmacologiques tels que le PDMP,

l’imipramine et le D-MAPP, favorise l’augmentation du taux intracellulaire de céramide,

permettant de lever la résistance de cellules squameuses de carcinomes à l’apoptose induite

par les rayons γ (Alphonse et al., 2004). De même, le B13, inhibe la céramidase acide et

favorise l’apoptose dans un modèle de xénogreffe du cancer de la prostate chez la souris

60

(Samsel et al., 2004). De plus, les activités de la GCS et de la SMS ayant été corrélées à la

résistance des cellules cancéreuses aux agents chimiothérapeutiques, ces enzymes

apparaissent comme des cibles prometteuses pour le développement d’agents anticancéreux

(Itoh et al., 2003; Liu et al., 1999a). Ainsi, le D609, un inhibiteur de la sphingomyeline

synthase, induit l’apoptose de cellules leucémiques humaines (Meng et al., 2004). De plus, le

PDMP et le PPMP en inhibant la glucosylcéramide synthase, potentialisent l’efficacité des

drogues antitumorales dans des cellules cancéreuses résistantes (Ogretmen and Hannun,

2004; Segui et al., 2006). De même, l’OGT2378, un autre inhibiteur de la glucosylcéramide

synthase, similaire à l’OGT918 (NB-DNJ), efficace dans le traitement de la maladie de

Gaucher, bloque la croissance tumorale dans un modèle murin de mélanome (Weiss et al.,

2003).

Les analogues sphingolipidiques et les inhibiteurs du métabolisme du céramide

apparaissent donc comme de bons outils en thérapie anticancéreuse puisqu’ils permettent de

surmonter la résistance de cellules cancéreuses aux traitements, qu’ils participent à la

régression tumorale et préviennent la formation de métastases in vivo. Aussi, il semble

important de s’intéresser à leur méthode d’administration. L’injection systémique de

céramides couplés à des liposomes semble prometteuse puisque qu’elle permet, d’une part

une meilleure induction de l’apoptose in vitro dans des cellules du cancer du sein, et d’autre

part, elle induit un effet inhibiteur sur la croissance tumorale dans un modèle de xénogreffe

du cancer du sein chez la souris (Stover and Kester, 2003; Stover et al., 2005).

III-4-2 Ciblage de la voie Sphingosine-kinase/ S1P

De nombreux travaux sont en faveur d’une implication de la voie sphingosine-

kinase/S1P dans la croissance, la formation de métastases et la chimiorésistance de plusieurs

types de cancer (Cuvillier, 2007; Hait et al., 2006). De plus, la SK1 est fréquemment

surexprimée dans plusieurs tumeurs solides en comparaison aux tissus seins, suggérant un

rôle important de cette enzyme dans le processus de tumorigénèse (French et al., 2003). Des

stratégies visant à bloquer la conversion de la sphingosine en sphingosine-1-phosphate ont

donc été développées dans la perspective de thérapies anticancéreuses. Ainsi, une série

d’inhibiteurs de la SK1 (SKI I-V) synthétisés chimiquement induisent un effet anti-

prolifératif et pro-apoptotique in vitro sur plusieurs lignées cellulaires cancéreuses et un effet

antitumoral in vivo sur un modèle d’adénocarcinome mammaire murin, sans toxicité

apparente pour les souris (French et al., 2003). Ces mêmes effets sont reproduits par des

61

analogues de la sphingosine, tels que la N,N-diméthylsphingosine (DMS) et le safingol (DL-

threo-dihydrosphingosine) pour plusieurs types de cellules cancéreuses (Huwiler and

Zangemeister-Wittke, 2007). De plus, la DMS (en combinaison avec le C2-céramide) et la

phytosphingosine permettent de sensibiliser respectivement des cellules du cancer du

poumon et des cellules lymphomateuses T humaines résistantes aux radiations (Park et al.,

2004; Park et al., 2005). Le safingol potentialise la cytotoxicité induite par le Fenretinide (4-

HPR) dans plusieurs lignées cancéreuses, tandis que la toxicité est réduite pour des

fibroblastes humains normaux (Maurer et al., 2000). Récemment, les travaux du groupe de

Sabbadini ont montré le potentiel antitumoral d’un anticorps anti-S1P capable d’inhiber

l’angiogénèse, l’invasion de cellules tumorales et la prolifération ainsi que la capacité de la

S1P à protéger de la mort cellulaire (Visentin et al., 2006). Il reste cependant à élucider si les

effets de la S1P résultent de son action en tant que ligand des récepteurs couplés aux

protéines G, nommés S1P1 à S1P5, ou comme second messager intracellulaire.

Un autre analogue de la sphingosine, le FTY720, a d’abord été montré comme

immunosuppresseur. Il est actuellement en essais cliniques de phase III pour le traitement de

la sclérose en plaque. Sa phosphorylation par la SK2 in vivo permet la génération de

FTY720-phosphate qui constitue un agoniste pour le récepteur S1P1. Le FTY720 a un effet

désensibilisateur sur le récepteur S1P1 et provoque la diminution de son expression à la

surface des lymphocytes T. L’absence de signalisation médiée par la S1P endogène entraîne

alors la séquestration des lymphocytes dans le thymus ou les organes lymphoïdes

secondaires, en empêchant leur migration vers la circulation sanguine (Chiba, 2005).

En plus de ces effets immunosuppresseurs, l’implication du FTY720 dans l’induction

de la mort cellulaire est révélée par son pouvoir protecteur contre les maladies auto-immunes

et lymphoprolifératives causées par la déficience en Fas dans des souris MRL-lpr/lpr

(Okazaki et al., 2002; Suzuki et al., 1997) et par son effet cytotoxique sur plusieurs types de

cellules cancéreuses. Il induit notamment l’apoptose de cellules pancréatiques cancéreuses

(Shen et al., 2007), de cellules leucémiques (Nagahara et al., 2000), de cellules de myélome

multiple résistantes aux drogues antitumorales (Yasui et al., 2005), de cellules du cancer du

sein (Azuma et al., 2002), de la prostate (Wang et al., 1999b), d’hépatocarcinome (Ho et al.,

2005) et de cellules du cancer du rein (Ubai et al., 2007). De plus, in vivo, le FTY720 inhibe

la croissance tumorale, l’angiogénèse ainsi que la formation de métastases dans plusieurs de

ces modèles de cancer (Azuma et al., 2002; Chua et al., 2005; Ho et al., 2005; Ubai et al.,

2007). Quant aux mécanismes impliqués dans la mort cellulaire induite par le FTY720, il

semble dépendre de l’activation des caspases, ainsi que d’évènements mitochondriaux tels

62

que le relargage de cytochrome c et de Smac/Diablo (Nagahara et al., 2000; Yasui et al.,

2005). De plus, l’inhibition de la voie PI3Kinase/Akt et de l’expression de molécules

d’adhésion par le FTY720 pourrait participer à son action antiproliférative (Azuma et al.,

2002; Lee et al., 2004). En outre, il reste à déterminer si les effets cytotoxiques du FTY720

dépendent ou non des récepteurs S1P. Finalement, les effets antitumoraux du FTY720 étant

clairement démontrés, le FTY720 constitue un bon candidat pour les thérapies

anticancéreuses.

63

RESULTATS EXPERIMENTAUX

64

I- Introduction et objectif général

Les travaux du groupe de Blenis indiquent que des cellules Jurkat déficientes en

caspase-8 (I9-2) sont totalement résistantes à l’apoptose induite par la stimulation de Fas.

Aucun clivage des caspases n’est détecté dans ces cellules en réponse à la stimulation de Fas.

La complémentation de la déficience en caspase-8 par un vecteur codant pour cette caspase

permet de restaurer la sensibilité des cellules à un agoniste de Fas (Juo et al., 1998). Ceci

place la caspase-8 en tant que caspase initiatrice exclusive dans la cascade apoptotique de la

signalisation de Fas. En réponse à l’engagement de Fas, une voie alterne de mort cellulaire

caspase-indépendante a été observée dans des cellules Jurkat et des PBL activés (Davidson et

al., 2002; Holler et al., 2000; Matsumura et al., 2000; Vonarbourg et al., 2002). Les

mécanismes de cette signalisation restent à élucider. Les cellules I9-2, déficientes en caspase-

8 et résistantes à l’apoptose, nous sont apparues comme un bon modèle pour l’étude de la

signalisation caspase-indépendante du récepteur Fas.

I-1 La caspase-8 n’est pas essentielle pour l’induction de l’apoptose en réponse à FasL

Dans un premier temps, nous avons évalué la toxicité d’un surnageant de culture de

cellules Neuro2A, transfectées de façon stable par un plasmide codant pour FasL murin

(Cellules Neuro2A-FasL), sur les lignées Jurkat parentales A3, ∆caspase-8 (I9-2) et ∆FADD

(I2-1). Différentes dilutions du surnageant de culture de Neuro2A-FasL induisent une perte

de viabilité des cellules A3 en fonction de la dose de FasL (de 7,5 ng/ml à 500 ng/ml)

pouvant atteindre plus de 90% en 24 heures (Figure 18A). Il est à noter que le surnageant de

culture de Neuro2A n’exprimant pas FasL n’induit pas de toxicité cellulaire (Figure 18A).

Les cellules ∆FADD, déficitaires pour la protéine adaptatrice FADD, résistent complètement

à FasL (Figure 18A). Ces résultats sont en accord avec les travaux du groupe de Blénis

montrant que la protéine FADD est indispensable à la signalisation cytotoxique de Fas (Juo et

al., 1999).

Cependant, si les cellules ∆caspase-8 résistent complètement aux faibles

concentrations de FasL, la plus forte dose s’accompagne de 50% de toxicité (Figure 18A).

Une analyse morphologique des cellules déficientes en caspase-8 indique une mort de type

apoptotique, caractérisée par une condensation cellulaire et une fragmentation nucléaire, en

présence de 500 ng/ml de FasL (Figure 18B). Ces résultats montrent que l’absence de

65

caspase-8 n’inhibe pas de façon totale la signalisation apoptotique de Fas et suggèrent qu’une

autre caspase initiatrice pourrait intervenir et se substituer à la caspase-8.

0,01 0,1 1 0,01 0,1 1 0,01 0,1 10

50

125

100

25

75

Via

bilit

é(%

)

Dilution DilutionDilution

∆∆∆∆FADD∆∆∆∆caspase-8A3

A

B FasL (ng/ml)

zVAD (µµµµM)

00

5000

50040

Figure 18 : Mort apoptotique dans les cellules Jurkat déficientes en caspase-8 en réponse à FasL. A, Les cellules ont été incubées pendant 24h en présence de différentes dilutions de

surnageant de culture de Neuro2A surexprimant (�), ou non (O), FasL. Les cellules traitées

par FasL ont été incubées en présence ( ) de z-VAD (40µM). La viabilité cellulaire a été

évaluée par test MTT. Les résultats correspondent à la moyenne ± ESM de trois expériences

indépendantes. B, Les cellules déficientes en caspase-8 ont été incubées pendant 16h en

présence de FasL murin en présence ou en absence de z-VAD (40µM). Les cellules ont été

marquées au syto13 et à l’iodure de propidium avant observation au microscope à

fluorescence. Les résultats sont représentatifs de trois expériences indépendantes.

I-2 Existence potentielle d’une signalisation indépendante des caspases

En accord avec la littérature, nos travaux indiquent que le z-VAD ne bloque pas

complètement la toxicité dans les cellules Jurkat parentales A3 et les cellules I9-2 à de fortes

concentrations de FasL (Figure 18A). L’analyse morphologique montre que le z-VAD inhibe

la fragmentation nucléaire induite par FasL. Les cellules présentent plutôt une morphologie

nécrotique caractérisée par une perméabilité à l’iodure de propidium (Figure 18B). Dans ces

66

conditions, le z-VAD inhibe bien l’activation des caspases. Ainsi, le clivage des caspases-3,

et -7 (Figures 19A et B) et de PARP (Figure 19B), évalué par western blot, est totalement

bloqué par le z-VAD, quelque soit le temps d’incubation, confirmant une inhibition de la

cascade apoptotique par le z-VAD.

A B

kDah

FasL

0 4 8 16 24 4 8 16 24

FasL + zVAD FasL + zVAD

8 16 240 16

FasL

pro-casp 7

PARP

27

13

casp7 clivée

kDa

41

20

h

82122

Figure 19 : Le z-VAD inhibe le clivage des caspases induit par FasL La caspase-3 (A), la caspase-7 et PARP (B) ont été analysées par Western Blot à partir

d’extraits protéiques totaux de cellules A3 incubées avec FasL (500 ng/ml) en présence de z-

VAD (40µM) pendant les temps indiqués. Pour contrôle, les cellules A3 ont été incubées

avec FasL (500 ng/ml, A ; 15 ng/ml, B). Les résultats sont représentatifs de trois expériences

indépendantes.

I-3 Objectif général de la thèse

Ces observations préliminaires nous ont conduits à émettre l’hypothèse selon laquelle

au moins deux voies de signalisation pourraient conduire à la mort en réponse à FasL

indépendamment de la caspase-8 : une voie impliquant l’activation des caspases et

conduisant à une mort apoptotique ; une voie indépendante des caspases conduisant à une

mort nécrotique. L’objectif général de la thèse est de clarifier la nature des voies de

signalisation pro-apoptotique et pro-nécrotique en évaluant notamment le rôle des caspases

initiatrices-8 et-10 et du céramide dans cette signalisation.

67

II- Rôle de la caspase-10 dans la signalisation apoptotique de Fas

II-1 Un rôle controversé de la caspase-10 dans la signalisation apoptotique

La caspase-10 (FLICE-2, Mch4) est une autre caspase initiatrice de l’apoptose

structurellement proche de la caspase-8 qui partage le même locus génique sur le

chromosome 2 chez l’homme (Fernandes-Alnemri et al., 1996; Vincenz and Dixit, 1997).

Elle pourrait être impliquée dans l’initiation de l’apoptose dans la signalisation de Fas. Les

travaux des groupes de Lénardo et d’Ashkenazi indiquent un recrutement de la caspase-10 au

niveau du DISC dans les cellules Jurkat (Kischkel et al., 2001) et dans les PBL activés (Wang

et al., 2001) en réponse à la stimulation de Fas. De plus, les recrutements des caspases-8 et-

10 au niveau du DISC et leur activation en réponse à TRAIL, peuvent s’effectuer

indépendamment l’une de l’autre (Kischkel et al., 2001). Toutefois, le rôle de la caspase-10

dans la signalisation de Fas reste controversé. Les deux groupes montrent que la

complémentation de la déficience en caspase-8, par la surexpression de différentes isoformes

de la caspase-10 dans des cellules Jurkat ∆caspase-8, permet de restaurer la sensibilité des

cellules à FasL ou à TRAIL (Kischkel et al., 2001; Wang et al., 2001). A l’inverse, une autre

étude utilisant une stratégie expérimentale comparable, indique que la caspase-10 ne peut pas

se substituer à la caspase-8 dans la signalisation cytotoxique de Fas (Sprick et al., 2002).

II-2 Objectif et stratégie expérimentale de l’article 1

Les objectifs de cette étude ont consisté à étudier la signalisation apoptotique caspase-

8-indépendante du récepteur Fas et en particulier à élucider le rôle de la caspase-10.

Cette étude a été réalisée dans les cellules Jurkat déficientes en caspase-8 (I9-2) traitées par

du FasL humain recombinant ou par le FasL murin issu du surnageant de culture de cellules

Neuro2A surexprimant FasL. L’apoptose a été appréciée par différents critères tels que

l’externalisation des phosphatidylsérine (PS), la perméabilité à l’Iodure de Propidium, la

morphologie du noyau, l’activation des caspases et l’hypodiploïdie. L’implication de la

caspase-10 dans l’apoptose des cellules I9-2 a été évaluée par l’utilisation du z-AEVD-fmk

(benzyloxylcarbonyl-AEVD-fluoromethylketone), un inhibiteur de la caspase-10. De plus,

nous avons isolé, par dilution limite, des sous populations de cellules I9-2 exprimant

différents taux de caspase-10. Nous avons évalué la sensibilité à FasL de ces variants

n’exprimant pas la caspase-8 et exprimant la caspase-10 à différents niveaux.

ARTICLE 1

Milhas, D., Cuvillier, O., Therville, N., Clave, P., Thomsen, M., Levade, T., Benoist, H., and

Segui, B. (2005). Caspase-10 triggers Bid cleavage and caspase cascade activation in FasL-

induced apoptosis. J Biol Chem 280(20), 19836-42.

Caspase-10 Triggers Bid Cleavage and Caspase Cascade Activationin FasL-induced Apoptosis*

Received for publication, December 21, 2004, and in revised form, March 4, 2005Published, JBC Papers in Press, March 16, 2005, DOI 10.1074/jbc.M414358200

Delphine Milhas, Olivier Cuvillier, Nicole Therville, Patricia Clave, Mogens Thomsen,Thierry Levade, Herve Benoist, and Bruno Segui‡

From INSERM U466, Institut Louis Bugnard, BP 84225, 31432 Toulouse Cedex 4, France

In contrast to caspase-8, controversy exists as to theability of caspase-10 to mediate apoptosis in response toFasL. Herein, we have shown activation of caspase-10,-3, and -7 as well as B cell lymphoma-2-interacting do-main (Bid) cleavage and cytochrome c release incaspase-8-deficient Jurkat (I9–2) cells treated withFasL. Apoptosis was clearly induced as illustrated bynuclear and DNA fragmentation. These events were in-hibited by benzyloxycarbonyl-VAD-fluoromethyl ke-tone, a broad spectrum caspase inhibitor, indicatingthat caspases were functionally and actively involved.Benzyloxycarbonyl-AEVD-fluoromethyl ketone, acaspase-10 inhibitor, had a comparable effect. FasL-induced cell death was not completely abolished bycaspase inhibitors in agreement with the existence of acytotoxic caspase-independent pathway. In subpopula-tions of I9–2 cells displaying distinct caspase-10 expres-sion levels, cell sensitivity to FasL correlated withcaspase-10 expression. A robust caspase activation, Bidcleavage, and DNA fragmentation were observed in cellswith high caspase-10 levels but not in those with lowlevels. In vitro, caspase-10, as well as caspase-8, couldcleave Bid to generate active truncated Bid (p15). Alto-gether, our data strongly suggest that caspase-10 canserve as an initiator caspase in Fas signaling leadingto Bid processing, caspase cascade activation, andapoptosis.

Cell death is an essential process in the regulation of cellularhomeostasis. Dysfunction of the mechanisms involved can leadto human diseases such as cancers, autoimmune diseases (inthe case of death defect), and neurodegenerative and immunedeficiency diseases (in the case of death excess) (reviewed inRefs. 1 and 2). Two types of cell death have been clearly dis-tinguished, apoptosis (programmed cell death) and necrosis (3).Apoptosis can be characterized by typical sets of changes in-cluding plasma membrane blebbing, cellular and chromatincondensation, nuclear fragmentation, and formation of apop-totic bodies. Phosphatidylserine externalization and DNA frag-mentation are biochemical features of apoptosis. Most of theseprocesses are mediated by caspases that cleave and inactivateproteins essential for cell survival (for review, see Ref. 4). Incontrast to apoptosis, necrosis is an “accidental” cell deathcharacterized by profound plasma membrane alterations and

oncosis. Intermediate forms of programmed cell death, namelyapoptosis- and necrosis-like cell death, have been recently de-scribed (for review, see Ref. 5).

Programmed cell death is essential for elimination of self-reactive lymphocytes and down-regulation of the immune re-sponse. Stimulation of Fas receptor (CD95) by FasL (CD95L orCD178) plays a crucial role in inducing lymphocyte pro-grammed cell death. Fas cross-linking triggers activation ofboth caspase-dependent and -independent pathways (6, 7).Caspase-independent cell death requires receptor-interactingprotein (RIP) as an effector molecule, but cytotoxic signalingpathwaysactivatedbyRIPremainlargelyunknown(6).Caspase-dependent pathways have been extensively explored (for a re-cent review, see Ref. 8). Oligomerization of Fas by FasL leads tosuccessive recruitment of FADD (9) and initiator caspase-8 (10)and -10 (11). Formation of this complex, termed DISC1 (death-inducing signaling complex) (12), allows caspase-8 and -10 ac-tivation (10, 11). Both caspases can directly activate effectorcaspases (13–15). Once activated, effector caspases specificallycleave and inactivate proteins leading to apoptosis. In addition,caspase-8 cleaves Bid, a pro-apoptotic member of the B celllymphoma-2 superfamily (16, 17). The terminal part of Bidcontaining a B cell lymphoma-2 homology (BH) 3 domain,namely truncated Bid, translocates to mitochondria and pro-motes cytochrome c release into the cytosol (16, 17). In associ-ation with APAF-1 and pro-caspase-9, another initiatorcaspase, cytochrome c forms the apoptosome complex leading tothe activation of caspase-9 that cleaves and activates effectorcaspases (18).

In analogy with caspase-8, caspase-10 has two DEDs (deatheffector domains) and the QACQG sequence containing thecatalytic cysteine residue (4). To date, four different caspase-10splice variants have been identified, caspase-10a (Mch4) (13),-10b (FADD-like ICE or FLICE-2) (11), -10c and -10d (19). Incontrast to caspase-10c, caspase-10a, -10b, and -10d have largeand small catalytic subunits. Strong homology betweencaspase-8 and -10 might suggest that both enzymes sharesimilar substrate specificity and biological function. However,in contrast to caspase-10, caspase-8 can cleave receptor-inter-acting protein in FasL-treated Jurkat cells (20).

Jurkat T lymphoma cells contain caspase-8 and -10, andcaspase-8 has been shown to be essential for apoptosis induc-tion in response to Fas stimulation (21). The mitochondrialpathway involving cytochrome c release was reported to becritical for caspase cascade activation in Jurkat cells, classified

* This work was supported by INSERM, Paul Sabatier University,and Grant 3417 from the Association pour la Recherche sur le Cancer.The costs of publication of this article were defrayed in part by thepayment of page charges. This article must therefore be hereby marked“advertisement” in accordance with 18 U.S.C. Section 1734 solely toindicate this fact.

‡ To whom correspondence should be addressed. Tel.: 33-5-61-32-20-61; Fax: 33-5-61-32-20-84; E-mail: bruno.segui@toulouse.inserm.fr.

1 The abbreviations used are: DISC, death-inducing signaling com-plex; Bid, B cell lymphoma-2-interacting domain; DED, death effectordomain; FADD, Fas-associated protein with death domain; PARP, poly-(ADP-ribose) polymerase; PBL, peripheral blood lymphocyte; Z-AEVD-fmk, benzyloxylcarbonyl-AEVD-fluoromethylketone; Z-VAD-fmk, ben-zyloxycarbonyl-VAD-fluoromethylketone; PE, phycoerythrin.

THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol. 280, No. 20, Issue of May 20, pp. 19836–19842, 2005© 2005 by The American Society for Biochemistry and Molecular Biology, Inc. Printed in U.S.A.

This paper is available on line at http://www.jbc.org19836

as type II cells (22). More recently, Ashkenazi and co-workers(15) reported that endogenous caspase-10 could be recruited toand activated at the DISC level in FasL-treated Jurkat cells.Similar findings were described in activated PBL upon Fasligation (20). However, the role of caspase-10 in Fas signalingremains controversial. Overexpression of caspase-10 comple-mented caspase-8 deficiency in FasL-treated Jurkat cells intwo independent studies (15, 20), but not in another (23). Inaddition, there is no direct evidence in the literature thatcaspase-10 is able to cleave Bid and trigger cytochrome crelease.

Herein, we have shown that FasL can induce apoptosis ofcaspase-8-deficient Jurkat cells, which was associated to en-dogenous caspase-10, -3, and -7 activation, as well as Bid cleav-age and cytochrome c release. Cell sensitivity to FasL corre-lated with caspase-10 expression in caspase-8-deficient cells. Acaspase-10 inhibitor prevented Bid processing, caspase cascadeactivation, and apoptosis. In addition, evidence is provided forthe first time that Bid is a direct substrate of caspase-10,strongly indicating that, like caspase-8, caspase-10 can lead toactivation of the mitochondrial pathway.

EXPERIMENTAL PROCEDURES

Reagents—Final concentrations or dilutions used of the followingreagents are indicated: Z-VAD(OMe)-fmk (40 �M) and Z-AE(OMe)-VD(OMe)-fmk (10 �M) were purchased from Bachem (Voisins-Le-Bretonneux, France) and RD systems (Lille, France), respectively;monoclonal anti-FADD (clone A66–2; 0.5 �g/ml), anti-cytochrome c(clone 7H8.2C12; 1 �g/ml), and anti-caspase-8 (clone B9–2; 0.5 �g/ml)antibodies were obtained from BD Biosciences; polyclonal anti-caspase-8 (1/5 dilution) was a kind gift from Dr. G. Cohen (Leicester,UK); monoclonal anti-caspase-10 (clone 4C1; 1 �g/ml) was purchasedfrom MBL (Meudon, France); polyclonal anti-caspase-3 (10 �g/ml) wasobtained from Dako; polyclonal anti-caspase-7, anti-PARP, and anti-Bid antibodies were purchased from Cell Signaling Technology andused at 1/1000 dilution; monoclonal anti-�-actin (clone AC-15; 5 �g/ml)was obtained from Sigma. Monoclonal anti-CD95 (clone 7C11; 1/5 dilu-tion) and IgM irrelevant antibody (10 �g/ml) coupled to phycoerythrin(PE) were purchased from Immunotech (Marseille, France) and SantaCruz, respectively. Human recombinant FasL was obtained from Abcys(Paris, France). Alternatively, mouse FasL produced in the supernatantof Neuro-2A cells stably transfected with a plasmid encoding FasL wasused (24). Similar data were obtained with mouse and human FasL.Human recombinant caspase-8 (6000 units/mg) and -10 (8000 units/mg)were purchased from Abcys.

Cell Lines—Parental Jurkat T lymphoma cells (clone A3) and derivedcell lines deficient for FADD (clone I2–1) or caspase-8 (clone I9–2) werekindly provided by Dr. J. Blenis (Boston, MA). Cells were cultured inRPMI containing Glutamax and 10% heat-inactivated fetal calf serum.In limiting dilution experiments, I9–2 cells were cultured in RPMImedium containing 10% fetal calf serum in 96-well plates. From serialdilutions, five cell cultures were isolated and named I9–2a, I9–2b,I9–2c, I9–2d, and I9–2e.

Flow Cytometry Analyses—CD95 cell surface expression was deter-mined after incubation of cells for 30 min at 4 °C with or withoutanti-CD95-PE or an irrelevant antibody coupled to PE. To allow studyof phosphatidylserine externalization, cells were labeled with AnnexinV-fluorescein isothiocyanate (250 ng/ml) and propidium iodide (12.5�g/ml) (Immunotech) for 10 min at 4 °C. To allow study of hypodiploidy,cells were washed in phosphate-buffered saline and permeabilized inethanol (70%) for 10 min at �20 °C. Cells were next incubated for 30min at 37 °C with RNase (1 mg/ml) and propidium iodide (0.1 mg/ml).Percentage of hypodiploid cells carrying DNA content below cells inG0/G1 was quantified by flow cytometry. Analyses were performed on aFACScan (BD Biosciences) cytometer.

Morphological Analyses—Cells were co-incubated with propidiumiodide (2 �g/ml) (Sigma) and Syto 13 (2.5 �M) (Molecular Probes) for 15min at 37 °C and analyzed under a Leica fluorescence-equipped micro-scope (25). At least 300 cells were examined.

MTT Assay—Viability was evaluated by the tetrazolium-based MTTassay. Cells were seeded in flat-bottom 96-well plates (106 cells/ml, 100�l/well) for 16 h at 37 °C. 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltet-razolium bromide (MTT) (0.5 mg/ml) (Sigma) was added during 4 h.Formazan crystals were solubilized overnight at 37 °C by adding 100 �l

of solubilization buffer (HCl 0.01 N, 10% SDS) and spectrophotometri-cally quantified using an enzyme-linked immunosorbent assay reader(� � 590 nm).

Cell-free System Assay—Mitochondria-free cytosolic protein extracts(250 �g) from A3 or I9–2 cells were incubated in the presence of oneunit (as defined by the manufacturer) of recombinant caspase-8 or -10for different times up to 90 min at 37 °C in a final volume of 200 �l ofbuffer containing 50 mM HEPES, pH 7.5, 150 mM NaCl. At the indicatedtimes, reaction was stopped by freezing on dry ice. 20 �g of protein weresubjected to SDS-PAGE and Western blotting analysis.

Alternatively, 1 �g of His-tagged mouse recombinant Bid (26) wasincubated in the presence of one unit of recombinant caspase at 37 °C ina final volume of 60 �l of buffer containing 50 mM HEPES, pH 7.5, 150mM NaCl. At the indicated times, 100 ng of protein were immediatelyfrozen on dry ice and analyzed by Western blotting with anti-Hisantibody (clone sc8036, Santa Cruz). Alternatively, extracts were sep-arated on 15% SDS-PAGE and stained with Coomassie blue. Of note,mouse and human Bid proteins share 63.5% identity and the LQTD2Gcaspase cleavage motif (16).

Protein Extraction and Western Blotting Analyses—For total proteinextraction, 5–20 � 106 of cells were lysed for 30 min on ice in a buffercontaining 50 mM HEPES, pH 7.5, 150 mM NaCl, 10% glycerol, 1%Triton X-100, 0.5% deoxycholate, 1 mM NaVO4, 10 mM �-glycerophos-phate, 50 mM NaF, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 10 �g/mlleupeptin, 2 �g/ml pepstatin A, and 10 �g/ml aprotinin. Samples werecentrifuged at 10,000 � g at 4 °C for 10 min. Supernatants were col-lected and protein content determined by the Bradford method (Bio-Rad). Cytosolic protein extracts were prepared from 20 � 106 of cells asdescribed previously (27). For Western blot analyses, equal amount ofproteins were separated on 15% SDS-PAGE.

RESULTS

FasL Can Trigger Apoptosis in Caspase-8-deficient JurkatCells—Caspase-8 has previously been reported to be essentialin anti-Fas-induced Jurkat apoptosis (21). However, two differ-ent groups have recently shown that caspase-8-independentcell death occurs in response to high FasL concentration (6, 7).Both studies reached the conclusion that this caspase-8-inde-pendent cell death is a form of necrosis rather than apoptosis.Herein, we have re-examined caspase-8-independent cell deathin Jurkat cells. First, we compared the sensitivity to FasL ofparental (clone A3), caspase-8-deficient (clone I9–2), andFADD-deficient (clone I2–1) Jurkat cell lines (21, 28).Caspase-8 and FADD expression was analyzed by Westernblotting to confirm respective protein deficiency in I9–2 andI2–1 clones (Fig. 1A). Flow cytometry analysis indicated thatthe various cell lines exhibited similar Fas expression on thecell surface (Fig. 1B). When incubated at a low FasL concen-tration (15 ng/ml), apoptotic features were seen only in A3 cellsin agreement with previous reports (21, 28). When a higherFasL concentration (500 ng/ml) was used, caspase-8-deficientcells displayed an apoptotic phenotype with pronounced cellu-lar condensation and nuclear fragmentation (Fig. 1C). Flowcytometry analysis indicated that 54.4 � 4.4% and 11.5 � 3.6%(mean � S.D. of three independent experiments) of caspase-8-deficient cells were scored Annexin-V-positive when incubatedin the presence or absence of 500 ng/ml FasL, respectively.FADD-deficient cells completely resisted FasL-induced apopto-sis at all doses tested (up to 500 ng/ml) (Fig. 1C).

FasL Induces Caspase-dependent and Caspase-independentCell Death in Caspase-8-deficient Jurkat Cells—DNA fragmen-tation in caspase-8-deficient cells was next assessed by meas-uring hypodiploidy. Although 15 ng/ml FasL did not inducehypodiploidy in these cells, 14.4 � 1.6% (mean � S.D. of threeindependent experiments) of them displayed DNA fragmenta-tion in response to 500 ng/ml FasL (Fig. 2A). This process wascompletely abolished by the broad-spectrum caspase inhibitorZ-VAD-fmk, indicating involvement of caspases in DNA frag-mentation. In accordance with a previous study (6), cell deathwas not fully impaired by Z-VAD-fmk in caspase-8-deficientcells even though caspase activation was completely inhibited

Caspase-10 in Fas Signaling 19837

(Fig. 3B and data not shown). As a matter of fact, 45.9 � 3.4%(mean � S.D. of three independent experiments) of cells werestill Annexin-V-positive in the presence of Z-VAD-fmk andFasL (Fig. 2B). The cell size was reduced as evaluated by flowcytometry (Fig. 2C) and microscopic examination (Fig. 2D). It isof interest that Z-VAD-fmk abrogated nuclear fragmentation,but not nuclear condensation and membrane alterations, asillustrated by propidium iodide uptake (Fig. 2D). Thus, Z-VAD-fmk weakly affected FasL-induced cytotoxicity, but the latterwas shifted into cell death without nuclear fragmentation.

FasL Promotes Bid Cleavage, Cytochrome c Release, andCaspase Activation in Caspase-8-deficient Jurkat Cells—Caspase activation in I9–2 cells was next analyzed by Westernblotting (Fig. 3). Cleavage of caspase-3, -7, and PARP wasobserved in I9–2 cells incubated for 16 h with FasL at concen-trations higher than 60 ng/ml (Fig. 3A). Because caspase-10can be recruited to and activated at the DISC in Jurkat cells(15, 23), we examined caspase-10 expression using a specificanti-caspase-10 antibody (15, 23). The level of pro-caspase-10clearly decreased in I9–2 cells incubated with FasL, in a dose-dependent manner. Interestingly, Bid content also decreased inI9–2 cells treated with 500 ng/ml FasL. The disappearance ofcaspase-10 and Bid in I9–2 cells treated with FasL was com-pletely abolished in the presence of Z-VAD-fmk, strongly sug-gesting a caspase-dependent proteolytic processing of both pro-teins (Fig. 3B). Next, we examined the effect of Z-AEVD-fmk, acaspase-10 inhibitor (29). Z-AEVD-fmk (10 �M) inhibited theprocessing of caspase-10, Bid, and PARP (Fig. 4A) as well ascaspase-3 activation (data not shown) and hypodiploidy at 16 h(Fig. 4B). A time course experiment of I9–2 cells incubatedwith 500 ng/ml indicated that caspase-10 and -7 and PARPwere cleaved at as early as 4 h of treatment with FasL (Fig. 5).As a consequence, apoptosis as evaluated by the quantificationof hypodiploid cells increased to reach a maximum at 8 h.Cytochrome c efflux was also observed but only at late time

points (8 and 16 h). This phenomenon might indicate that earlycaspase activation did not require cytochrome c release. Alter-natively, our assay might not be sensitive enough to detect lowamounts of cytochrome c released at early time points. To-gether, our data strongly support the notion that FasL canpromote caspase activation, Bid processing, and cytochrome crelease even in the absence of caspase-8 and that caspase-10 islikely involved in these events.

Sensitivity to FasL Correlates with Caspase-10 Concentra-tion in I9–2 Cells—All the above-mentioned experiments indi-cated that only about half of I9–2 cells were sensitive to FasL.We hypothesized that I9–2 cells were heterogeneous and con-tained a mixture of both sensitive and non-sensitive cells. Inlimiting dilution experiments, different subpopulations of I9–2cells (I9–2a, I9–2b, I9–2c, I9–2d, I9–2e) were isolated. Thevarious cell lines displayed distinct sensitivity to FasL (Fig. 6A)and exhibited low (I9–2a and I9–2e), intermediate (I9–2b andI9–2c), and high (I9–2d) caspase-10 levels but comparablecaspase-3 and -7, FADD (Fig. 6B), and CD95 expression (Fig.6C). Of note, caspase-10 expression in I9–2 parental cells wassimilar to that of I9–2b and I9–2c cells (data not shown).Interestingly, although all the subpopulations died similarly inresponse to staurosporine (data not shown), their sensitivity toFasL correlated with caspase-10 content. Indeed, although

FIG. 1. FasL induces apoptosis in caspase-8-deficient Jurkatcells. A, 50 �g of total protein extract from parental (A3), caspase-8-deficient (�casp-8), and FADD-deficient (�FADD) Jurkat cell lines weresubjected to SDS-PAGE and Western blotted with anti-caspase-8, anti-FADD, or anti-�-actin antibodies. B, CD95 expression was analyzed byflow cytometry. Cells were incubated with irrelevant (dotted lines) oranti-CD95 PE-conjugated antibodies (plain lines). Percentages of CD95-expressing cells are indicated. C, cells were incubated for 16 h in thepresence or absence of the indicated FasL concentration. Cells werestained with Syto 13 and propidium iodide and analyzed by fluores-cence microscopy. Data are representative of at least three independentexperiments.

FIG. 2. Caspase-dependent hypodiploidy and caspase-independ-ent cell death in FasL-treated caspase-8-deficient Jurkat cells.Caspase-8-deficient Jurkat cells were incubated for 16 h in the presence orabsence of the indicated FasL concentration and Z-VAD-fmk (40 �M). A,cells were harvested, stained with propidium iodide (P.I.), and DNAcontent was analyzed by flow cytometry. Percentages of hypodiploid cellsare indicated. B, alternatively, cells were labeled with Annexin-V-fluores-cein isothiocyanate (Ann.V) and propidium iodide (P.I.) and analyzed byflow cytometry. Percentages of Annexin-V- and propidium iodide-positivecells are indicated. C, size and granularity were analyzed by flow cytom-etry. Percentages of cells displaying a decreased size are indicated. D, cellswere labeled with Syto 13 probe and propidium iodide and examined byfluorescence microscopy. Percentages of cells having fragmented or con-densed nuclei were quantified (mean � S.D.). All data are representativeof three independent experiments.

Caspase-10 in Fas Signaling19838

I9–2a and I9–2e cells strongly resisted FasL-induced toxicity,I9–2d cells were highly sensitive and I9–2b and I9–2c cellsdisplayed an intermediate response. By comparison, A3 cellsthat expressed not only caspase-10 but also caspase-8 similarlyto I9–2d cells were more sensitive to FasL than I9–2d cells(Fig. 6A). Z-VAD-fmk efficiently impaired FasL-induced toxic-ity in I9–2d cells, but not in I9–2e cells, suggesting a strongercaspase activation in the high caspase-10-expressing cells (datanot shown). Accordingly, caspase-3 (data not shown) and PARPcleavage occurred in I9–2d and, to a lesser extent, in I9–2b andI9–2c cells treated with FasL (Fig. 7A). In contrast, caspases

were not or were weakly activated in I9–2a and I9–2e cells.Caspase-10 was processed in the various cell lines, whereas Bidwas cleaved proportionally to caspase-10 content (Fig. 7A).Similarly, FasL-induced hypodiploidy correlated with theamount of caspase-10 and was strongly impaired by Z-VAD-fmk and Z-AEVD-fmk (Fig. 7, B and C). Altogether, our dataindicate that caspase-10 can cleave Bid and activate thecaspase cascade in Fas signaling.

Recombinant Caspase-10 Can Cleave Bid—Active caspase-8can promote effector caspase activation (14) as well as Bid

FIG. 3. FasL induces caspase activation and Bid processing incaspase-8-deficient Jurkat cells. A, caspase-8-deficient Jurkat cellswere incubated for 16 h in the presence or absence of the indicated FasLconcentration. B, caspase-8-deficient Jurkat cells were incubated for16 h in the presence or absence of 500 ng/ml FasL and 40 �M Z-VAD-fmk as indicated. A and B, cells were then harvested, and 50 �g of totalprotein extract were subjected to SDS-PAGE and Western blotted withanti-caspase-10, -7, -3, anti-Bid, anti-PARP, or anti-�-actin antibodies.Data are representative of three independent experiments.

FIG. 4. Caspase-10 is involved in Bid processing, caspase cas-cade activation, and apoptosis in caspase-8-deficient Jurkatcells treated by FasL. Caspase-8-deficient Jurkat cells were incu-bated for 16 h in the presence or absence of 500 ng/ml FasL and 10 �M

Z-AEVD-fmk as indicated. A, 50 �g of total protein extract were sub-jected to SDS-PAGE and Western blotted with anti-caspase-10, anti-Bid, anti-PARP, or anti-�-actin antibodies. B, hypodiploidy was evalu-ated by flow cytometry. Percentages of hypodiploid cells are indicated.Data are representative of three independent experiments.

FIG. 5. FasL induces cytochrome c release in caspase-8-defi-cient Jurkat cells. Caspase-8-deficient Jurkat cells were incubated inthe presence or absence of 500 ng/ml FasL for the indicated times. Cellswere harvested, and 20 �g of cytosolic protein extract were subjected toSDS-PAGE and Western blotted with anti-caspase-10, -7, anti-cyto-chrome c, anti-PARP, or anti-�-actin antibodies. Percentages of hypo-diploid cells were determined by flow cytometry. Data are representa-tive of two independent experiments.

FIG. 6. Sensitivity to FasL correlates with caspase-10 expres-sion in caspase-8-deficient Jurkat cells. A, parental (A3) and var-ious caspase-8-deficient (I9–2a, -b, -c, -d, -e) Jurkat cells were incubatedfor 16 h with or without the indicated FasL concentrations. Cell viabil-ity was determined by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazo-lium bromide assay as the percentage of untreated cells (mean � S.D.,n � 3). B, 50 �g of parental (A3) and various caspase-8-deficient (I9–2a,-b, -c, -d, -e) Jurkat cells were subjected to SDS-PAGE and Westernblotted with anti-caspase-10, -8, -3, -7, anti-FADD, or anti-�-actin an-tibodies. C, CD95 expression was analyzed by flow cytometry. Cellswere incubated with irrelevant (dotted lines) or anti-CD95 PE-conju-gated antibodies (plain lines). Percentages of CD95-expressing cells areindicated.

Caspase-10 in Fas Signaling 19839

processing leading to cytochrome c release from the mitochon-dria into the cytosol (16, 17). Little is known about caspase-10substrate specificity. Notably, to our knowledge, it has neverbeen demonstrated that Bid could be a substrate of caspase-10.Thus, we compared the activity of human recombinantcaspase-8 and -10 produced in Escherichia coli. A mitochon-dria-free cytosolic protein extract from parental A3 cells wasused as a source of substrate and incubated for different timesin the presence or absence of recombinant caspases. Substratecleavage was next evaluated by Western blotting (Fig. 8). Re-combinant caspase-8 and -10 had no or little effect on endoge-nous caspase-8 in agreement with a previous study (15). Incontrast to recombinant caspase-8, recombinant caspase-10triggered an obvious endogenous caspase-10 processing. Bothcaspase-8 and -10 activated caspase-3 and -7. Interestingly, Bidconcentration clearly decreased after 60 min of incubation inboth cases indicating that caspase-10, like caspase-8, was ca-pable of cleaving Bid. Caspase-3 and -7 cleavage, as well as Bidproteolysis, were also effective when a cytosolic protein extractfrom I9–2 cells was incubated in the presence of either recom-binant caspase, indicating that endogenous caspase-8 did notinterfere in our system (data not shown). In addition, bothrecombinant caspases were equally active toward recombinantBid protein, therefore suggesting that Bid could serve as asubstrate of caspase-10 (Fig. 9). Bid proteolysis was character-ized by the generation of an active form of Bid (p15) (Fig. 9B),which is known to trigger cytochrome c release (16, 17). Thus,our in vitro study demonstrates that caspase-10 can serve as aninitiator caspase in Fas signaling, leading to Bid processingand cytochrome c release.

DISCUSSION

The present study demonstrates the existence of a caspase-dependent signaling pathway in response to FasL in caspase-8-deficient Jurkat cells. Thus, in contrast to a previous reportshowing that caspase-8 deficiency leads to a complete block ofcaspase activation in Fas signaling (21), we have establishedthat FasL can activate the caspase cascade in a caspase-8-independent manner. Caspase-8-independent pathway leads to(i) Bid processing (Figs. 3, 4, and 7), (ii) effector caspase acti-vation (Figs. 3 and 5), (iii) DNA fragmentation (Figs. 2, 4, and7), and (iv) nuclear fragmentation (Figs. 1 and 2). All theseevents could be inhibited by the broad-spectrum caspase inhib-itor Z-VAD-fmk, arguing that caspases are functionally andactively involved in this form of cell death (Figs. 2, 3, 6, and 7).Z-AEVD-fmk, a caspase-10 inhibitor, had a comparable effect,strongly supporting the notion that caspase-10 acts upstreamof FasL-induced caspase-8-independent apoptosis. However,this signaling pathway seems to play a minor function in Jur-kat cells and can be activated only in the presence of high FasLconcentrations (from 60 ng/ml), possibly because of a low ex-pression level of caspase-10 in I9–2 cells (15, 23). Hence, ourstudy confirms the important role of caspase-8 and highlightsthe existence of an alternative pathway involving caspase-10 inFasL-induced caspase activation.

A similar observation was made in caspase-8-deficient Jur-kat cells treated by tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) (15). Endogenous caspase-10 was re-cruited to and activated at the TRAIL receptor DISC level inJurkat cells upon stimulation with TRAIL even in the absence

FIG. 7. FasL-induced caspase activation, Bid processing, andhypodiploidy are proportional to caspase-10 expression incaspase-8-deficient Jurkat cells. The various caspase-8-deficient(I9–2a, -b, -c, -d, -e) Jurkat cells were incubated for 16 h in the presenceor absence of 500 ng/ml FasL, 10 �M Z-AEVD-fmk, and 40 �M Z-VAD-fmk as indicated. A, 50 �g of I9–2a, -b, -c, -d, -e Jurkat cells weresubjected to SDS-PAGE and Western blotted with anti-caspase-10,anti-Bid, or anti-PARP antibodies. B, hypodiploidy was evaluated byflow cytometry (mean � S.D., n � 3). C, data obtained with I9–2d cellsare representative of three independent experiments. Percentages ofhypodiploid cells are indicated.

FIG. 8. Analysis of recombinant caspase-8 and -10 activity in acell-free system. 50 �g of cytosolic protein extract prepared from A3cells were incubated in the presence or absence of recombinant (rec.)caspase-8 or -10 (1 unit) for the indicated times. 20 �g of extract werethen subjected to SDS-PAGE and Western blotted with anti-caspase-8,-3, -7, -10, anti-Bid, or anti-�-actin antibodies. Data are representativeof three independent experiments.

FIG. 9. Recombinant caspase-10 cleaves Bid in vitro. A, His-tagged recombinant Bid (100 ng) was incubated in the presence orabsence of recombinant caspase-8 or -10 (1 unit) for the indicated times.Extracts were analyzed by Western blotting using anti-His antibody. B,His-tagged recombinant Bid (1 �g) was incubated in the presence orabsence of recombinant caspase-8 or -10 (1 unit) for 60 min. Extractswere separated on 15% SDS-PAGE and stained with Coomassie blue.Data are representative of two independent experiments.

Caspase-10 in Fas Signaling19840

of caspase-8. TRAIL-induced apoptosis was delayed but stilloccurred in caspase-8-deficient cells. Enforced expression ofcaspase-10a, -10b, or -10d sensitized TRAIL-induced apoptosis,indicating that caspase-10 could function as an initiatorcaspase. Endogenous caspase-10, similarly to caspase-8, can berecruited to the Fas DISC level in Jurkat cells (15) and in PBL(20). Accordingly, a clear caspase-10 processing was detected incaspase-8-deficient cells in response to FasL (Figs. 3–5 and 7).Opposite findings were reported by Rieux-Laucat and co-work-ers (30) showing no caspase-10 activation despite PARP cleav-age in FasL-treated I9–2 cells. These authors have discussedthe possibility that a caspase-10-independent pathway mightbe responsible for PARP processing. Herein, use of a highlyspecific anti-caspase-10 antibody, as demonstrated by two dif-ferent groups (15, 23), allowed us to show an obviouscaspase-10 processing in FasL-treated I9–2 cells (Figs. 3–5and 7).

The function of caspase-10 in Fas signaling is still controver-sial. Overexpression of caspase-10 has been shown to bypasscaspase-8 deficiency and restore sensitivity to FasL (15, 20). Incontrast, using a similar strategy Walczak and co-workers (23)did not succeed in sensitizing caspase-8-deficient cells to FasL.Different expression levels of caspase-10 might explain theseconflicting observations indicating that high caspase-10 con-centration might be required to overcome caspase-8 deficiency.In addition, caspase-10-enforced expression in I9–2 cells mightperturb cell response to FasL non-specifically due to ectopicexpression. Thus, previous studies based on caspase-10 over-expression in I9–2 cells do not allow drawing any conclusion onthe physiological function of caspase-10 in Fas signaling.Herein, we isolated various I9–2 subcultures that display dif-ferent caspase-10 expression levels. The sensitivity of theseI9–2 subpopulations correlated with their content of caspase-10. As a matter of fact, PARP and Bid cleavage as well as DNAfragmentation occurred proportionally to caspase-10 expres-sion. Consequently, our data indicate that caspase-10 can ini-tiate caspase cascade activation in Fas signaling. In humans,gene mutations affecting the catalytic enzyme activity of eithercaspase-8 (31) or caspase-10 (32) are responsible for autoim-mune lymphoproliferative syndrome. In vitro, PBL carryingeither mutation resisted Fas ligation, implying that bothcaspase-8 and -10 are involved in FasL-induced apoptosis(31, 32).

To date, it is still unclear whether or not caspase-8 and -10share similar substrates. For instance, both caspases are capa-ble of activating effector caspases in vitro (13–15). However,whereas caspase-3 was equally activated in FasL-treated I9–2cells overexpressing caspase-8 or caspase-10, receptor-interact-ing protein processing occurred only in caspase-8 expressingcells (20). We therefore carried out in vitro experiments tocompare the substrate specificity of human recombinantcaspase-8 and -10. In a cell-free system, caspase-8 and -10cleaved effector caspases as well as Bid (Fig. 8). In addition,caspase-10, like caspase-8, directly processed recombinant Bidleading to active truncated Bid (p15) generation (Fig. 9). Thus,both caspases might be capable of cleaving Bid in vivo andtrigger the activation of the mitochondrial pathway in a similarfashion. Accordingly, Bid processing (Figs. 3, 4, and 7) andcytochrome c release (Fig. 5) occurred in FasL-treated caspase-8-deficient cells.

Recent studies have suggested the involvement of a caspase-independent pathway in T lymphocyte cell death induction. Invivo, transgenic mice overexpressing cytokine response modi-fier A, a Poxvirus-encoding caspase inhibitor, did not developlymphoproliferative syndrome (33). In vitro studies demon-strated that FasL can trigger cytotoxic caspase-independent

pathways in Jurkat cells and in activated PBL (6, 7, 30, 34).Accordingly, Z-VAD-fmk did not completely abolish I9–2 celldeath in response to 500 ng/ml FasL (Fig. 2). Caspase-inde-pendent cell death was characterized by phosphatidylserineexternalization and absence of nuclei and DNA fragmentation.Membrane alterations were present, in agreement with previ-ous reports showing that caspase-independent pathways couldtrigger a necrosis-like cell death (6, 7). However, most of thedead cells displayed strong nuclear condensation and de-creased cell size. Importantly, we noticed similar alterations inactivated PBL that were co-incubated with FasL and Z-VAD-fmk (data not shown). These observations might indicate that,according to recent definitions (5), FasL-induced caspase-inde-pendent pathway triggers apoptosis-like rather than necrosis-like cell death.

Collectively, the present study indicates that at least twocaspase-8-independent pathways operate in T lymphocyte tomediate Fas-induced cell death: (i) a caspase-dependent path-way involving caspase-10 activation, Bid processing, cyto-chrome c release, and classical apoptosis, and (ii) a caspase-independent pathway leading to apoptosis-like cell death.

Acknowledgments—We thank Dr. J. Blenis (Boston, MA) for provid-ing I9–2 and I2–1 Jurkat cells, Dr. G. Cohen (Leicester, UK) for the giftof anti-caspase-8 antibody, Dr. J. C. Martinou (Geneva, Switzerland)for providing recombinant Bid protein, and Dr. J. Teissie (Toulouse,France) for helpful discussion.

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68

II-3 Conclusions de l’article 1 :

Alors qu’il a été montré que la déficience en caspase-8 induit une résistance totale des

cellules Jurkat à FasL, nos résultats indiquent qu’en l’absence de caspase-8, au moins deux

voies de signalisation peuvent être activées en réponse à de fortes concentrations de FasL :

une signalisation apoptotique dépendante de la caspase-10 et une signalisation caspase-

indépendante non inhibable par le z-VAD.

II-3-1 La caspase-10 est une caspase initiatrice dans la signalisation de Fas

De faibles concentrations de FasL n’induisent pas la mort de cellules Jurkat ∆caspase-

8, confirmant un rôle majeur de la caspase-8 dans la signalisation cytotoxique du récepteur

Fas. Cependant, en présence de fortes concentrations de FasL, une voie de signalisation

apoptotique est activée dans les cellules Jurkat ∆caspase-8, caractérisée par un clivage de la

caspase-10, de Bid, des caspases effectrices 3 et 7, de PARP et un relargage du cytochrome c.

La caspase-10 semble impliquée dans l’induction de ces évènements puisque le z-AEVD, un

inhibiteur de la caspase-10, inhibe l’apoptose induite par FasL dans ces cellules. De plus,

l’expression de la caspase-10 dans les différents variants de la lignée I9-2 est corrélée à leur

sensibilité à l’apoptose induite par FasL. Nos résultats confirment les travaux de Lenardo et

d’Ashkenazy montrant la capacité de la caspase-10 à se substituer à la caspase-8 dans

l’initiation de la signalisation apoptotique du récepteur Fas (Kischkel et al., 2001; Wang et

al., 2001).

La discordance des études visant à complémenter la déficience en caspase-8 par la

surexpression de caspase-10 exogène, pourrait s’expliquer par des différences d’expression

de la caspase-10. Ceci souligne l’importance du niveau d’expression de la caspase-10 dans la

sensibilité des cellules à l’apoptose en réponse à FasL. D’autre part, l’étude du groupe

Allemand repose sur l’analyse de la sensibilité à FasL de cellules Jurkat transfectées de façon

stable avec un plasmide codant pour la caspase-10 (Sprick et al., 2002). Ainsi, l’absence

d’effet de la surexpression de la caspase-10 pourrait s’expliquer par le fait que les clones

sélectionnés, résistants au G418, soient aussi résistants à la signalisation apoptotique de Fas,

par un défaut d’expression de protéines pro-apoptotiques, ou au contraire, une surexpression

de protéines anti-apoptotiques. De plus, les techniques de clonage d’ADNc dans des

plasmides pourraient favoriser la génération de mutations éventuelles de la caspase-10

altérant son activité catalytique. Notre approche basée sur la sélection de variants cellulaires

69

exprimant différents taux de caspase-10 permet d’étudier le rôle de la caspase-10 endogène, à

des concentrations plus physiologiques.

Même si, in cellulo, la caspase-10 semble capable de se substituer à la caspase-8 dans

l’initiation de la cascade apoptotique en réponse à la stimulation de Fas, il semblerait qu’ in

vivo, les deux caspases soient requises pour l’apoptose des lymphocytes T. Les mutations

affectant la caspase-8 ou la caspase-10 sont responsables des ALPS de type II chez l’homme

et entraînent une résistance des lymphocytes T à la mort par FasL (Chun et al., 2002; Wang et

al., 1999a) ; ce qui souligne l’importance, in vivo, de ces deux caspases dans la signalisation

apoptotique du récepteur Fas.

Les caspases-8 et -10 jouent-elles un rôle redondant dans l’apoptose ? Activent-elles

la même voie de signalisation ou possèdent-elles des substrats distincts ? Nos études

indiquent que la caspase-10, comme la caspase-8, est capable de cliver Bid in vitro. Des

travaux récents confirment que Bid est un substrat commun pour les caspases-8 et -10 mais

révèlent un site de clivage supplémentaire pour la caspase-10. Comme la caspase-8, la

caspase-10 permet la génération d’un fragment p15 de tBid. De plus, la caspase-10 clive

également Bid au niveau du même site consensus que Granzyme B pour générer le fragment

p13 (Fischer et al., 2006) (Figure 20). Le fait que les caspases-8 et -10 clivent les mêmes

protéines mais à des sites différents, pourrait permettre de surmonter d’éventuelles mutations

sur des substrats des caspases potentiellement responsables de phénomènes de résistance à

l’apoptose.

Figure 20 : Sites consensus de clivage par des protéases sur la séquence de Bid (Fischer

et al., 2006).

RIP, une protéine impliquée dans la signalisation cytotoxique de Fas, pourrait aussi

être une cible des caspases. Les données sur le clivage de RIP par les caspases-8 et -10 sont

70

controversées. Alors que le groupe de Lenardo montre que seule la caspase-8 peut cliver RIP

(Wang et al., 2001), d’autres travaux indiquent que RIP est un substrat commun aux deux

caspases initiatrices (Fischer et al., 2006).

Malgré une certaine redondance des fonctions des caspases-8 et -10 dans l’apoptose, il

semble qu’elles possèdent un rôle distinct dans la signalisation. En effet, les mutations de la

caspase-8 chez l’homme provoquent un déficit immunitaire caractérisé par un défaut

d’activation des cellules T, B et NK (Chun et al., 2002). De plus, le KO de la caspase-8, qui

est létal chez la souris, est caractérisé par un défaut du développement cardiaque et de la

prolifération des lymphocytes T (Varfolomeev et al., 1998). Ceci suggère un rôle non

apoptotique de la caspase-8 in vivo.

La diminution de l’expression de la caspase-10, souvent retrouvée dans les cellules

transformées et dans les tumeurs humaines (Filomenko et al., 2006; Kischkel et al., 2001;

Wang et al., 2001), suggère un rôle de cette caspase dans la prévention du développement

tumoral. En accord avec cette hypothèse, des mutations de la caspase-10 ont été retrouvées

chez des patients atteints de lymphomes non-Hodkinien ou de cancers gastriques (Kumar,

2007). De plus, l’activation de la caspase-10 dans des cellules leucémiques U937 et des

cellules carcinomateuses HeLa semble jouer un rôle majeur dans l’induction de l’apoptose

par divers agents antitumoraux comme l’étoposide, la daunorubicine, la cytarabine et la

camptothécine (Filomenko et al., 2006). Ces observations soulignent l’importance potentielle

de la caspase-10 en cancérologie.

II-3-2 Inhibition partielle de la mort cellulaire par le z-VAD

En accord avec les travaux de la littérature, la toxicité induite par de fortes doses de

FasL dans les cellules Jurkat n’est pas complètement inhibée par le z-VAD. Comme décrit

dans la classification des types de mort caspase-indépendante (Jaattela and Tschopp, 2003),

la mort possède à la fois des caractéristiques : (i) de l’apoptose telles que l’externalisation des

phosphatidylsérines et la condensation nucléaire et cellulaire ; (ii) et de la nécrose telles que

le trouble de la perméabilité membranaire. Cette mort caspase-indépendante apparaît mineure

dans les cellules Jurkat comparée à la mort apoptotique induite par FasL, puisque de fortes

concentrations sont nécessaires pour son induction.

Afin d’évaluer le rôle des caspases dans la signalisation de Fas de lymphocytes T

activés en culture primaire, nous avons incubé des PBL activés par la PHA en présence de

FasL.

71

A B

C D

Cellule

s h

ypodip

loïd

es

(%)

Cellule

s A

V p

ositiv

es (%

)C

ellule

s A

V p

ositiv

es (%

)

Cellule

s h

ypodip

loïd

es

(%)

0

10

20

30

40

0

10

20

30

40

Contr. zVAD FasL FasL

zVAD

Contr. zVAD FasL FasL

zVAD

Contr. zVAD PHA PHA

zVAD

Contr. zVAD PHA PHA

zVAD

0

20

40

60

80

100

0

20

40

60

80

100

P < 0.05 P < 0.05P < 0.05

P < 0.001 P < 0.001P < 0.001

n.s.

n.s.

Figure 21 : Rôle des caspases dans la mort de PBL en réponse à FasL ou à la PHA.

Les PBL ont été activés par la PHA (1µg/ml) et l’IL2 (20 unités/ml) pendant 10 jours avant

d’être incubés, ou non (contr.), pendant 24h avec du FasL (500 ng/ml) (A, B) ou de la PHA

(1µg/ml) (C, D) en présence ou en absence de z-VAD (40µM). Le pourcentage de cellules

marquées à l’Annexine V (AV) (A, C) et la proportion de cellules hypodiploïdes (B, D) ont

été évalués par cytométrie en flux. Les résultats correspondent à la moyenne ± ESM de trois à

cinq expériences indépendantes.

De façon surprenante, les PBL activés sont peu sensibles à FasL. En effet, seule la plus forte

concentration de FasL (500 ng/ml) induit le doublement de la toxicité basale évaluée par

mesure de l’externalisation des phosphatidylsérines (PS) (Figure 21A) et du taux de cellules

hypodiploïdes (Figure 21B). Il est à noter que l’externalisation des PS n’est pas

significativement inhibée par le z-VAD tandis que la fragmentation de l’ADN est

complètement abolie en présence de cet inhibiteur. Par la suite, nous avons évalué l’effet du

z-VAD vis-à-vis de la mort cellulaire induite par l’activation (AICD), après restimulation des

PBL activés par la PHA. Dans ces conditions où la mort cellulaire dépend, en partie, de la

stimulation de Fas par FasL endogène (Brunner et al., 1995; Dhein et al., 1995), 80% des

lymphocytes sont annexine-V positifs (Figure 21C) et environ 60% présentent une

hypodiploïdie (Figure 21D). Comme précédemment, le z-VAD n’affecte pas l’externalisation

72

des PS mais inhibe significativement la fragmentation de l’ADN. Ces résultats renforcent

donc l’hypothèse selon laquelle la fragmentation de l’ADN en réponse à FasL est un

processus majoritairement caspase-dépendant. Toutefois, l’inhibition des caspases n’altère

pas significativement la toxicité induite par FasL confirmant les travaux de la littérature

attestant de l’existence de voies de signalisation cytotoxique caspase-indépendante dans des

cultures primaires de lymphocytes T activés (Davidson et al., 2002; Holler et al., 2000;

Vonarbourg et al., 2002)

II-4 Evènements mitochondriaux dans la signalisation caspase-indépendante de Fas

Différentes études suggèrent un rôle de la mitochondrie dans la mort caspase-

indépendante des lymphocytes T en réponse à divers stimuli pro-apoptotiques (Jaattela and

Tschopp, 2003). Nous avons comparé la sensibilité de cellules Jurkat E6 surexprimant, ou

non, Bcl-xL, une protéine anti-apoptotique membre de la famille de Bcl-2 (Figure 22B). Les

Jurkat sont des cellules de type II dont la signalisation apoptotique en réponse à FasL dépend

principalement de la mitochondrie (Scaffidi et al., 1998). De façon surprenante, les cellules

qui surexpriment Bcl-xL ne résistent que très partiellement à FasL, en comparaison aux

cellules E6 transfectées par un vecteur vide (Figure 22A). Ceci pourrait s’expliquer par le fait

que la surexpression de Bcl-xL ne bloque pas complètement les évènements mitochondriaux,

tels que le relargage du cytochrome c, mais les retarde. Toutefois, l’inhibition de la toxicité

par la surexpression de Bcl-xL à de faibles doses de FasL, confirme qu’une partie de la

signalisation émanant de Fas implique la mitochondrie. En présence de z-VAD, les cellules

E6 résistent complètement aux faibles doses mais que partiellement aux fortes doses de FasL,

en accord avec l’existence d’une signalisation cytotoxique caspase-indépendante émanant du

récepteur Fas dans les cellules Jurkat (Figure 22A). La surexpression de Bcl-xL inhibe

significativement la mort caspase-indépendante évaluée par test MTT (Figure 22A) et

cytométrie en flux (Figure 22C), ce qui suggère l’implication de la mitochondrie dans ce type

de mort cellulaire.

Différents événements mitochondriaux tels que la production d’espèces réactives de

l’oxygène (ROS, Reactive Oxygene Species), le relargage de la sérine protéase HtrA2, d’AIF

(Apoptosis Inducing Factor) et d’EndoG (Endonucléase G) ont été décrits comme

potentiellement impliqués dans l’induction de la mort caspase-indépendante des lymphocytes

T (Jaattela and Tschopp, 2003).

73

La localisation subcellulaire d’AIF et du cytochrome c a été étudiée par microscopie

confocale (Figure 22D). Dans les cellules contrôles, AIF et le cytochrome c sont localisés en

périphérie nucléaire au niveau des mitochondries. Après traitement par 15 ng/ml de FasL, le

marquage est diffus, indiquant une redistribution extra-mitochondriale de ces deux protéines.

Il est à noter que dans ces conditions, le z-VAD inhibe complètement ce phénomène

(Résultats non montrés). En présence de 500 ng/ml de FasL et de z-VAD, nous observons un

marquage périnucléaire punctiforme, identique aux cellules contrôles pour le cytochrome c et

diffus pour l’AIF. A l’opposé, EndoG ne semble pas être relocalisée en réponse à FasL en

présence ou en absence de z-VAD (Figure 22D). Ces résultats indiquent une relocalisation

possible d’AIF dans la mort caspase-indépendante des cellules Jurkat induite par FasL qui

pourrait être responsable des altérations nucléaires observées au cours de cette mort.

La localisation submitochondriale différentielle du cytochrome c, d’EndoG et d’AIF

pourrait expliquer le relargage sélectif d’AIF au cours de la mort caspase-indépendante. Alors

qu’AIF est lié au feuillet externe de la membrane mitochondriale, EndoG est fortement

associé à la membrane interne mitochondriale ou localisé dans la matrice mitochondriale.

Différemment, 85 % du cytochrome c est localisé et séquestré dans les crêtes mitochondriales

tandis que 15% est retrouvé dans l’espace intermembranaire (Arnoult et al., 2003; Scorrano et

al., 2002; van Loo et al., 2002b). Ainsi, une perméabilisation modérée de la mitochondrie,

affectant uniquement la membrane externe, permettrait le relargage sélectif des protéines

mitochondriales de l’espace intermembranaire telles qu’AIF. Selon cette thérorie, 15 % du

cytochrome c devrait être relargué. L’absence de redistribution du cytochrome c évaluée par

microscopie confocale pourrait s’expliquer par la limite de sensibilité de cette technique ou

par la demi-vie courte du cytochrome c relocalisé.

La relocalisation d’AIF nécessite d’être confirmée par western blot à partir d’extraits

mitochondriaux et nucléaires. L’effet de siRNA dirigés contre AIF sur cette mort pourrait

permettre d’évaluer l’importance de ce facteur dans la signalisation caspase-indépendante

induite par FasL.

74

E6 none

E6

BclxL none BclxL FasL 1-100 BclxL FasL 1-2 zVad-

Bcl-xL

FasL (ng/ml)

zVAD (µµµµM)

00

150

50040

Iod

ure

de p

rop

idiu

m

Annexine-V

B

5

3 27

31

32

9

6

2

44

7

8

5

C

A

D

0

50

125

100

25

75

Via

bilit

é (

%)

1 100010010

FasL (ng/ml)

AIF

Cytochrome c

FasL (ng/ml)

zVAD (µµµµM)

00

150

50040

E6 Bcl-xL

ββββ-actine

Bcl-xL

kDa

41

27

* * *

**

**

EndoG

Figure 22 : Rôle de la mitochondrie dans la mort caspase-indépendante induite par FasL. A, Les cellules contrôles (E6) (�,�) et qui surexpriment Bcl-xL (Bcl-xL) (�,O) ont

été incubées pendant 24h avec les concentrations indiquées de FasL en présence (�,�) ou en

absence (�,O) de z-VAD (40µM). La viabilité cellulaire a été évaluée par test MTT. B,

L’expression de Bcl-xL et de la β-Actine a été analysée par Western Blot à partir d’extraits

protéiques totaux de cellules E6 et Bcl-xL. C, Analyse par cytométrie en flux des cellules E6

et Bcl-xL traitées comme en A ; les valeurs correspondent aux pourcentages de cellules dans

les différents quadrants. D, La localisation subcellulaire d’AIF, du cytochrome c et d’EndoG

a été étudiée par microscopie confocale, dans les cellules E6 incubées en présence, ou non, de

FasL et de z-VAD. C, D Les résultats sont représentatifs de trois expériences indépendantes.

75

III- Cytotoxicité induite par les caspases-8 et -10 indépendamment de leur activité catalytique

III-1 Les cellules Jurkat déficientes en caspase-8 et -10 résistent à l’apoptose et à la

nécrose induite par FasL

L’étude des voies de signalisation caspase-indépendante repose principalement sur

l’utilisation du z-VAD, un inhibiteur à spectre large des caspases. Nos travaux sont en faveur

de l’existence d’une mort caspase-indépendante, c'est-à-dire une mort non inhibable par le z-

VAD, en réponse à FasL. Cependant, comme le z-VAD n’inhibe pas toutes les caspases avec

la même efficacité, nous ne pouvons exclure la possibilité d’une activité résiduelle des

caspases non détectable en western blot ou par le test DEVDase ou IETDase.

Les cellules Jurkat I9-2e deficientes pour les caspases-8 et -10, isolées au laboratoire au cours

des travaux de l’article1, pourraient représenter un bon modèle d’étude de la mort caspase-

indépendante. Cependant, alors que les cellules I9-2e sont aussi sensibles à la staurosporine

que les cellules Jurkat parentales A3 (Figure 23A), elles résistent complètement à 500 ng/ml

de FasL (une concentration capable d’induire une mort en présence de z-VAD dans les

cellules parentales) (Figure 23B).

0 1 2 3

0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3

0 1 2 3 0 1 2 3

A3

I9-2e

FasL (ng/ml)

zVAD (µµµµM)

00

5000

50040

Iod

ure

de

pro

pid

ium

Annexine-V

3

5 37

61

24

12

9

7

4

5

4

5

Staurosporine (µg/ml)

Via

bilit

é(%

)

100

80

60

40

20

0

0,1 0,2 0,3 0,4 0,50

A3 I9-2e

BA

Figure 23 : Les cellules I9-2e sont sensibles à la staurosporine mais résistent à FasL A, Les cellules Jurkat parentales (A3) et déficientes en caspase-8 et -10 (I9-2e) ont été

incubées pendant 16 heures en présence ou non de staurosporine aux concentrations

indiquées. La viabilité cellulaire a été évaluée par test MTT. Les résultats correspondent à la

moyenne ± ESM de deux expériences indépendantes. B, Les cellules Jurkat parentales (A3)

et déficientes en caspase-8 et -10 (I9-2e) ont été incubées pendant 16 heures en présence ou

non de 500 ng/ml de FasL et de z-VAD (40 µM). Les cellules ont été analysées par

cytométrie en flux après marquage à l’Annexine-V et à l’Iodure de propidium. Les

pourcentages de cellules marquées sont indiqués. Les résultats sont représentatifs de trois

expériences indépendantes.

76

Ces observations préliminaires suggèrent un rôle essentiel des caspases-8 et -10, non

seulement dans la signalisation apoptotique, mais aussi dans la signalisation nécrotique de

Fas. Ces résultats remettent en cause l’existence d’une mort caspase-indépendante.

III-2 Objectif et stratégie expérimentale de l’article 2

Puisque la mort dite « caspase-indépendante (en présence de z-VAD) pourrait

nécessiter la présence des caspases-8 et-10, sans faire intervenir leur activité catalytique, nous

avons émis l’hypothèse selon laquelle les caspases-8 et-10 pouvaient participer à la

signalisation cytotoxique indépendamment de leur activité catalytique. Nous avons comparé

la sensibilité des cellules parentales A3, des cellules I9-2d (déficientes pour la caspase-8 et

exprimant la caspase-10) et des cellules I9-2e (double déficiente en caspase-8 et -10), à

l’apoptose et à la nécrose induite par FasL. Pour évaluer le rôle de l’activité catalytique des

caspases-8 et -10 dans l’induction de la mort, nous avons testé l’effet de la surexpression de

caspases-8 et -10 sauvages ou mutées sur le site catalytique dans des cellules I9-2e, en

présence ou en absence de z-VAD. Enfin, nous avons évalué la capacité des caspases-8 et -10

sauvages ou catalytiquement inactives à restaurer la sensibilité des cellules I9-2e à la mort

induite par FasL.

ARTICLE 2

Milhas, D., Tessie, J., Benoist, H. and Segui, B. Initiator caspases-8 and -10 can trigger cell

death independently of their catalytic active sites in Fas signaling. (en préparation).

1

INITIATOR CASPASE-8 AND -10 CAN TRIGGER FASL-INDUCED CELL DEATH

INDEPENDENTLY OF THEIR CATALYTIC ACTIVITIES.

Delphine Milhas1,2

, Justin Teissié3, Hervé Benoist

1,2,4 and Bruno Ségui

1,2,4

1 U858 INSERM, Equipe 14, BP84225, 31432 Toulouse cedex 4 France.

2 IFR31, I2MR, Bâtiment L3, Avenue Jean Poulhes, BP84225, 31432 Toulouse cedex 4, France.

3 IPBS UMR 5089 UPS CNRS, 205 route de narbonne, 31077, Toulouse Cedex, France.

4 Université Paul Sabatier (Toulouse III), Faculté des sciences pharmaceutiques, service

d’immunologie, 35 chemin des maraîchers, 31062, Toulouse, France.

Running title: caspase-8 and -10 in necrosis.

Corresponding author: Bruno Ségui; (33)5.61.32.20.60; Fax (33)5.61.32.20.84; E-mail:

bruno.segui@toulouse.inserm.fr

In T-cells, both initiator caspase-8 and -10

are known to activate effector caspases either

directly or through a mitochondrial pathway

in Fas signaling. Fas engagement can also

induce an alternative caspase-independent cell

death, leading to necrosis rather than

apoptosis. We report in the present study that

FasL-induced apoptosis and necrosis were

completely impaired in caspase-8- and -10-

doubly deficient (I9-2e) Jurkat leukemia T-

cell lines. Over-expressing either wild-type

caspase-8 or -10 triggered apoptosis and

necrosis in I9-2e cells. zVAD-fmk, a broad-

spectrum caspase inhibitor, partly, but not

totally, inhibited cell death in response to

caspase-8 or -10 over-expression. Moreover,

over-expressing a catalytically inactive mutant

of caspase-8 or -10 triggered substantial cell

death. Finally, enforced expression of not only

wild-type but also mutant caspases, restored

FasL-induced cell death in I9-2e cells, albeit to

a lesser extent. Altogether, our data strongly

suggest that initiator caspase-8 and -10 (i) can

trigger cell death independently of their

protease activities, and (ii) are absolutely

required for FasL-induced cell death,

including necrosis, which was previously

described as a form of caspase-independent

cell death.

Keywords: CD95, apoptosis, necrosis, ceramide,

leukemia

Abbreviations: ALPS, Autoimmune

lymphoproliferative syndrome; Bcl-2, B Cell

Lymphoma-2; BH, Bcl-2 homology; Bid, Bcl-2

interacting domain; DD, Death Domain; DISC,

Death Inducing Signaling Complex; FADD, Fas-

Associated protein with Death Domain; PARP,

Poly (ADP-Ribose) Polymerase; RIP, Receptor

Interacting Protein; ROS: Reactive Oxygen

Species; TNF!, Tumor necrosis factor !; zVAD-

fmk, Benzyloxycarbonyl Valyl- Alanyl-

Aspartyl-(O-methyl)-fluoromethylketone.

Introduction

Fas (CD95 or Apo-1) is a member of the TNF

(Tumor Necrosis Factor) receptor superfamily.

Fas plays a crucial function in the regulation of

T-cell homeostasis as illustrated by the

development of an autoimmune

lymphoproliferative syndrome (ALPS) in

patients carrying gene mutations affecting Fas

signaling (1-3).

Upon FasL (CD95L or CD178) challenge, the

adaptor protein FADD (Fas-Associated protein

with Death Domain) is recruited to the Fas death

domain (4). FADD next interacts with caspase-8

(5) and -10 (6) to form the death-inducing

signaling complex (DISC). Oligomerization of

caspase-8 and -10 at the DISC level is

responsible for the activation of the caspase

cascade leading to apoptosis (5,6). Caspase-8 and

-10 cleave and activate effector caspase-3 and -7

(7-9), which in turn specifically cleave and

inactivate different substrates essential for

survival leading to apoptosis (10).

Initiator caspases can trigger an alternative

route of cell death involving mitochondria. This

pathway requires the cleavage of Bid (Bcl-2

interacting domain), a pro-apoptotic member of

the Bcl-2 superfamily (11,12). Both caspase-8

and -10 cleave Bid to generate a 15 kDa and a 13

kDa truncated Bid (tBid), respectively (11-14).

tBid translocates to the outer mitochondria

membrane through interaction with Bax/Bak

channel leading to membrane permeability

increase and cytochrome c release into the

cytosol. The apoptosome complex is next formed

by interaction of cytochrome c with APAF1 and

the initiator caspase-9 enabling caspase-9

activation. In turn, caspase-9 activates effector

caspases by proteolytic cleavage (11,12,15).

2

FasL-induced cell death may activate a

caspase-independent cell death pathway, leading

to necrosis rather than apoptosis (16). This

pathway involves FADD and the kinase activity

of RIP (Receptor interacting protein), which is

recruited to the Fas receptor. Whereas signaling

pathways mediated by RIP are not fully

delineated, mitochondrial events, such as "#

loss, together with reactive oxygen species

(ROS) production have been reported to lead to a

necrotic form of cell death (16,17). FasL-induced

caspase activation was reduced in RIP-deficent

cells, indicating the possibility that RIP function

in cell death is not restricted to the caspase-

independent pathway (18). RIP is also involved

in TNF!- and TRAIL (TNF-related apoptosis-

inducing ligand)-induced cell death (16). More

recently, ceramide, a putative biologically active

sphingolipid in cell death (17), has been shown

to be a key component of the RIP-dependent cell

death pathway in response to TNF! (19).

The existence of the caspase-independent cell

death pathway in Fas signaling remains a matter

of debate (20). Indeed, most of the key

experiments demonstrating that FasL-induced

RIP-dependent necrotic pathway rely on the use

of caspase inhibitors, such as the broad-spectrum

caspase inhibitor zVAD-fmk (10). The efficacy

of zVAD-fmk may depend on the type of

caspases (10,20,21). High zVAD-fmk

concentrations are required to impair caspase-

dependent cascade and thus, other proteases,

such as cathepsins and calpains, could be

inhibited (20). In addition, Quest and colleagues

reported that zVAD-fmk inhibited both FasL-

induced apoptosis and necrosis (22). Finally,

processed caspase-2 has been shown to mediate

cytochrome c release from isolated mitochondria

and permeabilized cells, independently of its

enzymatic activity, most likely through a direct

interaction with the outer mitochondrial

membrane (23,24). Whether caspase-2 or other

caspases can mediate a catalytic activity-

independent cell death pathway in cellulo

remains to be demonstrated.

Death effector domains (DED) of caspase-8

and -10 can activate NF-$B in a RIP-dependent

manner (25). Moreover, a novel caspase-10

isoform lacking the large and small sub-units,

has been recently reported to interact with RIP,

activate NF-$B and induce cell death in the

absence of PARP (Poly-(ADP-Ribose)

Polymerase) cleavage (26). Thus, initiator

caspase-8 and -10 could physically and

functionally interact with RIP, facilitating RIP-

dependent pathway activation.

The present study was undertaken to evaluate

the function of initiator caspase-8 and -10 in the

so-called “caspase-independent cell death”

triggered by FasL. Our data demonstrate that (i)

FasL-induced necrosis is impaired in caspase-8-

deficient cells exhibiting a very low level of

caspase-10 (I9-2e variant); (ii) caspase-8 and -10

can trigger necrosis independently of their

catalytic activities; (iii) catalytically inactive

mutants of caspase-8 and -10 restored, to some

extent, FasL-induced cell death in I9-2e cells.

Experimental procedures

Reagents - Final concentrations or dilutions

used of the following reagents are indicated:

zVAD(OMe)-fmk (40 µM) was purchased from

Bachem (Voisins-Le-Bretonneux, France);

monoclonal anti-FADD (clone A66-2; 0.5

µg/ml), and anti-caspase-8 (clone B9-2; 0.5

µg/ml) antibodies were obtained from BD

Biosciences (Le Pont-de-Claix, France);

monoclonal anti-caspase-10 (clone 4C1; 1

µg/ml) was purchased from MBL (Meudon,

France); polyclonal anti-caspase-3 (10 µg/ml)

was obtained from Dako (Trappes, France);

polyclonal anti-caspase-7 antibody was

purchased from Cell Signaling Technology

(Saint Quentin en Yvelines, France) and used at

1/1000 dilution; monoclonal anti-%-actin (clone

AC-15; 5 µg/ml) was obtained from Sigma

(Saint Quentin Fallavier, France). pEGFP.N1

plasmids encoding EGFP, EGFP-tagged wild-

type or catalytically inactive mutant caspase-8

(C360S) or EGFP-tagged wild-type caspase-10

and pCiNeo plasmid encoding catalytically

inactive mutant caspase-10 (C401S) were kindly

given by Dr. M. Lenardo (Bethesda, MD) (27).

Mouse FasL produced in the supernatant of

Neuro-2A cells stably transfected with a plasmid

encoding FasL was used at a final concentration

of 500 ng/mL to study both FasL-induced

apoptosis and necrosis (13,28).

Cell lines - Parental Jurkat T leukemia cells

(clone A3) and the derived cell line deficient for

caspase-8 (clone I9-2) were kindly provided by

Dr. J. Blenis (Boston, MA) (29). I9-2d and I9-2e

cells have been isolated by limiting dilution

experiments from I9-2 cells as previously

described (13). Cells were cultured in RPMI

containing Glutamax and 10% heat-inactivated

foetal calf serum (FCS).

3

Flow cytometry analyses - For studying

phosphatidylserine externalization, cells were

labelled with Annexin V-FITC (250 ng/ml) and

propidium iodide (12.5 µg/ml) (Immunotech,

Marseille, France) for 10 min at 4°C.

Alternatively, cell death was monitored in EGFP

fluorescent cells after labelling with either

Annexin V-APC (250 ng/mL) (Immunotech,

Marseille, France) or propidium iodide (12.5

µg/ml) (Immunotech, Marseille, France) for 10

min at 4°C. Analyses were performed on a

FACScan (Becton Dickinson, Le Pont de Claix,

France) cytometer.

Protein extraction and Western blotting

analyses - For total protein extraction, 5 to 20 x

106 cells were lysed for 30 min on ice in a buffer

containing 50 mM HEPES, pH 7.5, 150 mM

NaCl, 10 % glycerol, 1% Triton X-100, 0.5%

deoxycholate, 1 mM NaVO4, 10 mM %-

glycerophosphate, 50 mM NaF, 1 mM

phenylmethylsulfonyl fluoride, 10 µg/mL

leupeptin, 2 µg/ml pepstatin A and 10 µg/mL

aprotinin. Samples were centrifuged at 10,000 g

at 4°C for 10 min. Supernatants were collected

and protein content determined by the Bradford

method (Biorad). For Western blot analyses,

equal amount of proteins were separated on 15%

SDS-PAGE.

Ceramide mass measurement - Lipids were

extracted and ceramide mass was determined as

previously reported (30,31) using E. coli

membranes as a source of DAG kinase (a kind

gift of Drs. D. Perry and Y.A. Hannun

(Charleston, NC)). Radioactive ceramide-1-

phosphate was isolated by TLC using

chloroform/acetone/methanol/acetic acid/water

(50:20:15:10:5, by vol.) and then scraped before

counting radioactivity by liquid scintillation.

Fluorogenic DEVD and IETD cleavage

enzyme assays - Cells were pre-incubated for one

hour with or without 40 µM zVAD-fmk and

further incubated in the presence or absence of

500 ng/mL FasL. Caspase activities were

assessed using Ac-DEVD-AMC or Ac-IETD-

AMC as described elsewhere (32).

Transfection experiments - Jurkat cells were

transiently transfected as previously described

(33). Briefly, 2 millions Jurkat cells were

incubated in 0.2 mL 10 mM phosphate buffer

(pH 7.4) containing 250 mM sucrose and 1 mM

MgCl2. Eight µg plasmids encoding EGFP,

EGFP-tagged wild-type caspase-8, EGFP-tagged

C360S caspase-8 or EGFP-tagged wild-type

caspase-10 were added before transfection.

Alternatively, cells were co-transfected by 2 µg

of the plasmid encoding EGFP and 8 µg of the

plasmid encoding C401S caspase-10. Electro-

pulsation was carried out by 3 consecutive 10 ms

pulses (240 V, electrode width 4 mm).

Immediately after transfection, 20% FCS was

added and cells were then incubated at 37°C in 2

mL RPMI medium containing 10% FCS.

Statistical analysis - Results are expressed as

means ± s.e.m. of at least three values per

experiment. Mean values were compared using

the Student’s t-test. Differences were considered

statistically significant when p<0.05 (as indicated

by an asterisk on the figures; n.s. : not

significant).

Results

FasL-induced apoptosis and necrosis is

impaired in Jurkat cells doubly deficient for

caspase-8 and -10 - Protein expression was first

analyzed by western blot in parental A3 cells and

in the two variants (I9-2d and I9-2e) derived

from I9-2 cells. As expected from previous

observations (13,29), I9-2d and I9-2e cells did

not express caspase-8 in contrast to A3 cells.

However, expression of FADD, RIP, caspase-2, -

9, -3 and -7 (Figure 1A), Fas (13) and FLIP (data

not shown) was comparable in A3 and in the two

I9-2 variants. Although Bcl-2 and Bcl-xL were

not detectable in all cell lines by western blot,

Bid was similarly expressed (data not shown). As

previously reported (13), whereas caspase-10

was expressed to a similar extent in A3 and I9-2d

cells, very little expression of caspase-10 was

found in I9-2e cells (Figure 1A).

When cells were incubated in the presence of

FasL, caspase activity towards Ac-DEVD-AMC

(Figure 1B) and Ac-IETD-AMC (Figure 1C)

increased in A3 and, albeit to a lesser extent, in

I9-2d cells. In sharp contrast, FasL-induced

caspase activity increase was totally impaired in

I9-2e cells (Figures 1B and 1C). These data are

in accordance with the involvement of both

caspase-8 and -10 in FasL-induced apoptosis, as

others and we previously reported (7-9,13). Also,

zVAD-fmk totally abrogated caspase activation

in response to FasL (Figures 1B and 1C).

Phosphatidylserine (PS) externalization

(Figure 2A) and propidium iodide uptake (Figure

2B) were next evaluated by flow cytometry in

the different variants to monitor apoptosis and

necrosis, respectively. Upon FasL treatment,

apoptosis (Figure 2A) and necrosis (Figure 2B)

occurred in A3 and, albeit to a lesser extent, in

I9-2d cells. FasL-induced PS externalization

4

(Figure 2A) and the increase of propidium iodide

uptake (Figure 2B) was substantially, but not

totally, inhibited by zVAD-fmk. This is in

agreement with a previous study indicating that

FasL may trigger some flip of PS to the cell

surface and necrosis, independently on the

caspase activities (16). Also, the intracellular

level of ceramide, a putative bioactive

sphingolipid in death receptor-induced toxicity

(17,19,34), increased proportionally to apoptosis

and necrosis in A3 and I9-2d cells (Figure 2C).

Surprisingly, not only apoptosis (Figure 2A) but

also necrosis (Figure 2B) and intracellular

ceramide content (Figure 2C) did not increase in

FasL-treated I9-2e cells. Altogether, our results

(i) highlight the putative role of initiator caspase-

8 and -10 in ceramide production and necrosis

induction in response to FasL, (ii) may indicate

that catalytic activities are not absolutely

required in caspase-8 and -10-mediated cell

death.

Enforced expression of caspase-8 or -10 can

trigger cytotoxicity independently of their

catalytic activities - We next evaluated the effect

of the over-expression of initiator caspase-8 and

-10 in Jurkat cells. Experiments were restricted

to I9-2e cells to avoid interaction between the

over-expressed enzymes and their endogenous

counterparts. Over-expression of EGFP, an

irrelevant protein in cell death signaling, was

used as a negative control to evaluate the basal

cytotoxicity induced in our experimental settings.

Cells were transfected with plasmids encoding

EGFP-tagged caspases. Alternatively, cells were

co-transfected with EGFP and untagged-

catalytically inactive mutant caspase-10

(C401S). Transfection efficiency was evaluated

by flow cytometry 24 hours post-transfection

(table 1). When cells were transfected with the

control vector encoding EGFP alone, 4% of cells

robustly expressed EGFP. Following transfection

with plasmids encoding either wild-type or

mutant caspase-8 and -10, only 1 to 1.7% of cells

were EGFP positive. In addition, EGFP

expression level, as evaluated by the mean

fluorescence intensity, was lower in cells over-

expressing either caspases than in cells

transfected with the control vector. The addition

of zVAD-fmk did not modify the transfection

efficiency with any plasmids but increased the

mean fluorescence intensity when cells were

transfected with wild-type caspases (table 1).

These results indicate that zVAD-fmk may

stabilize wild-type caspases most likely by

preventing their auto-catalytic degradation.

We hypothesized that the low transfection

efficiency with plasmids encoding either wild-

type or mutant caspase-8 and -10 may be a

consequence of cell death. Cell death was

therefore analyzed by flow cytometry on the

EGFP expressing cells after annexin-V (Figure

3) or propidium iodide (Figure 4) labelling.

Because of the low percentage of transfected

cells, at least 1,000 EGFP positive cells were

analyzed. Twenty four-hour post-transfection of

plasmids encoding either wild-type caspase-8 or

-10, 60 to 70% of EGFP expressing cells were

labelled with Annexin-V indicating cell death

induction upon expression of initiator caspases

(Figure 3). Addition of zVAD-fmk only partially

protected from cell death (Figure 3). In addition,

over-expressing either catalytically inactive

caspase-8 or -10 increased annexin-V staining in

the presence or absence of zVAD-fmk (Figure

3). Necrosis, as evaluated by propidium iodide

staining, was also monitored upon caspase over-

expression (Figure 4). Not only wild-type but

also catalytically inactive caspase-8 and -10

mutants expression increased necrosis (Figure 4).

Accordingly, caspase-8 and -10-induced necrosis

was only partially altered by zVAD-fmk (Figure

4).

Altogether, our data strongly suggests that

initiator caspase-8 and -10 can trigger cell death,

including necrosis, and that this phenomenon

was not totally dependent on their catalytic

activities.

Caspase-8 and -10 can trigger FasL-induced

cytotoxicity independently of their catalytic

activities - Finally, we evaluated the capacity of

wild-type and catalytically inactive mutants to

restore FasL-induced cell death in I9-2e cells.

Cell death was evaluated by annexin-V labelling

to stain both apoptotic and necrotic cells.

Whereas EGFP over-expression had no effect,

enforced expression of either wild-type caspase-

8 or -10 restored cell death upon FasL (Figure 5).

Cell death still occurred, albeit to a lesser degree,

in the presence of zVAD-fmk. Also, catalytically

inactive caspase mutants were able to restore, to

some extent, FasL-induced cell death (Figure 5).

Similar findings were obtained by analysing cell

death according to the modification of size and

granularity (data not shown).

Altogether, our data indicates that initiator

caspases-8 and -10 can trigger some cytotoxicity

independently of their catalytic active sites in Fas

signaling.

5

Discussion

Our results indicate that initiator caspase-8

and -10 are absolutely required for FasL-induced

cell death including not only apoptosis but also

necrosis. Thus, our study questions the existence

of a caspase-independent cell death in Fas

signaling.

Previous studies showing an alternative caspase-

independent cell death pathway in response to

FasL, rely mostly on the use of zVAD-fmk,

which is considered as a broad-spectrum caspase

inhibitor (20). Indeed, 40 µM zVAD-fmk

completely abrogated caspase activities towards

either Ac-DEVD-AMC or Ac-IETD-AMC (see

Figures 1C and 1D), which are known substrates

for effector and initiator caspases, respectively.

However, the efficacy of zVAD-fmk may

depend on the type of caspase. For instance,

caspase-2 is poorly inhibited by zVAD-fmk as

compared to other caspases (20). Thus, it is

likely that, even in the presence of high zVAD-

fmk concentration, some caspases display

residual activities, which cannot be detected by

classical methods for caspase activity

measurement. One can speculate that residual

caspase activities insensitive to zVAD-fmk, may

trigger an incomplete caspase cascade activation

leading to necrosis rather than apoptosis. This

scenario is in agreement with a previous study

showing that, when A20 B-lymphoma cells and

Jurkat cells were incubated with Ac-DEVD-cho

to inhibit effector caspases, Fas engagement

triggered ceramide increase and necrosis in an

initiator caspase-dependent manner (22).

Evidence is provided in the present study that

initiator caspases can kill cells independently of

their catalytic activity. Thus, even if classical

caspase activity was completely impaired by

zVAD-fmk, caspases may still be involved in

cell death signaling. A previous study showed

that over-expression of a catalytically inactive

caspase-10 mutant restores, to some extent,

FasL-induced cell death in caspase-8-deficient

Jurkat cells expressing endogenous caspase-10

(35). Because dimerization of initiator caspases

may be sufficient to trigger apoptosis (36,37),

over-expressing a catalytically inactive caspase-

10 mutant in Jurkat cells may enhance the

activation of its endogenous counterpart and

sensitize cells to FasL. However, this scenario is

unlikely to take place in the present study since

(i) experiments were carried out in I9-2e cells

having no endogenous caspase-8 at all and very

little endogenous caspase-10, which was hardly

detectable by western blot, even with an

enhanced chemo-luminescent signal; (ii) over-

expression of a catalytically inactive caspase-8

mutant also sensitized I9-2e cells to FasL; (iii)

homodimers but not heterodimers are active in

cell death signaling (36).

The previously so-called “caspase-

independent cell death” triggered by Fas involves

FADD and RIP (16). Indeed, we found that

FADD- and RIP-deficient cells were completely

resistant to FasL-induced cell death in the

presence of zVAD-fmk (data not shown). In this

context, ceramide, a recently reported bioactive

sphingolipid in TNF! and TRAIL-induced

necrosis (19,34), increased in wild-type but not

in RIP-deficient cells treated by FasL (data not

shown). Our present study illustrates that

initiator caspase-8 and -10 are also involved in

FasL-induced necrosis and ceramide generation

(see Figures 2A and 2B). Thus, Fas, FADD, RIP

and initiator caspase-8 and -10 may form a

molecular protein complex enabling RIP kinase

activity to promote pro-necrotic cell death.

Initiator caspase-8 and -10 mediated FasL-

induced cell death mostly via their catalytic sites

in Jurkat cells. Indeed, zVAD-fmk potently

impaired FasL-induced cell death in wild-type

cells (13,16). Moreover, over-expression of

catalytically inactive mutants weakly restored

FasL-induced cell death as compared to wild-

type caspases in I9-2e cells (see Figure 5).

However, the relative contribution of catalytic-

dependent versus catalytic-independent cell

death pathways mediated by initiator caspases in

other cells such as normal T-cells is currently

unknown. As previously reported by others (16),

we observed that zVAD-fmk inhibited less

efficiently FasL-induced cell death in PHA-

activated T cells than in Jurkat cells (data not

shown).

Mutations affecting Fas, FasL, caspase-8 or -

10 may be responsible for ALPS (2,35,38). So

far, no specific mutations on the caspase catalytic

sites have been reported. Thus, it is tempting to

speculate that some mutations may affect not

only the catalytic-dependent pathway but also the

catalytic-independent pathway, which may

contribute to FasL resistance in ALPS or in

malignant diseases such as leukemia.

6

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Acknowledgments

We thank Dr. M. Lenardo (Bethesda, MD) for providing plasmids encoding caspases. We thank Dr. J.

Blenis (Boston, MA) for providing A3 and I9-2 Jurkat cells. We thank Patricia Clavé, Nicole Therville

and Stéphane Carpentier for excellent technical assistance. We thank Drs. Nathalie Andrieu-Abadie,

Sonia Caroline Sorli, Blandine Kedjouar, Jean-Pierre Jaffrézou and Thierry Levade for critical reading

of the manuscript. This study was supported by INSERM, Paul Sabatier University, grant 3417 from

the Association pour la Recherche sur le Cancer (ARC) (to BS) and grant from Ligue Nationale contre

le cancer and les comités départementaux du Gers, de l’Aveyron, de la Haute-Garonne et du Lot-et-

Garonne (to Jean-Pierre Jaffrézou’s group). Authors declare no conflict of interest and no competing

financial interests.

Figure Legends

Figure 1: Impairment of FasL-induced caspase activation in I9-2e cells. A, 20 µg total protein

extract from parental (A3), caspase-8 deficient (I9-2d) and caspase-8 and -10 doubly deficient (I9-2e)

Jurkat cell lines were subjected to SDS-PAGE and Western blotted with anti-caspase-8, -10, -2, -9, -3,

-7, anti-FADD, anti-RIP or anti-%-actin antibodies. B-C, A3 (white bars), I9-2d (grey bars) and I9-2e

(black bars) Jurkat cells were incubated for 8 hours in the presence or absence of 500 ng/mL FasL and

zVAD-fmk (40 µM) as indicated. Cells were harvested and caspase activities were assessed using Ac-

DEVD-AMC (B) or Ac-IETD-AMC (C). B-C, All data are means ± SEM of three to four independent

experiments. *p<0.05; **p<0.01.

Figure 2: Impairment of FasL-induced cell death and ceramide production in I9-2e cells. A3

(white bars), I9-2d (grey bars) and I9-2e (black bars) Jurkat cells were incubated for 8 hours in the

presence or absence of 500 ng/mL FasL and zVAD-fmk (40 µM) as indicated. A-B, Cells were

harvested and stained with Annexin-V-FITC and propidium iodide and analyzed by flow cytometry.

Percentages of Annexin-V-positive (AnV+) and propidium iodide-negative (PI-) cells are indicated

(A). Percentages of propidium iodide-positive (PI+) cells are indicated (B). C, ceramide content was

determined by DAG kinase assay. A-C, Data are means ± sem of three to four independent

experiments. *p<0.05; **p<0.01; *** p<0.001.

Figure 3: Caspase-8 and -10 can trigger cell death independently of their catalytic active sites.

I9-2e cells were transiently transfected with plasmids encoding EGFP, EGFP-tagged wild-type (Casp-

8) or catalytically inactive mutant (Casp-8 C360S) caspase-8, EGFP-tagged wild-type caspase-10

(Casp-10). Alternatively, cells were co-transfected with EGFP and catalytically inactive mutant (Casp-

10 C401S) caspase-10. Immediately after transfection, cells were incubated in the presence or absence

of 40 µM zVAD-fmk. Twenty-four hours post-transfection, cells were labelled with Annexin-V-APC

and analyzed by flow cytometry. Analyses were restricted to EGFP fluorescent cells and at least 1,000

EGFP expressing cells were analysed. A, data obtained from a representative experiment. Percentages

of AnnexinV+ cells are indicated B, Data are means ± sem of four independent experiments.

8

Figure 4: Caspase-8 and -10 can trigger necrosis independently of their catalytic active sites.

Cells were transfected and incubated as described in the legend to Figure 3. Twenty-four hours post-

transfection, cells were labelled with propidium iodide and analyzed by flow cytometry. Analyses

were restricted to EGFP fluorescent cells and at least 1,000 EGFP expressing cells were analysed.

Percentages of propidium iodide positive cells are indicated. Data are representative of two

independent experiments.

Figure 5: Caspase-8 and -10 can restore FasL-induced I9-2e cell death independently of their

classical caspase activities. Cells were transfected as described in the legend to Figure 3. Four hours

(experiment 1) or 12 hours (experiment 2) post-transfection, cells were incubated for 4 hours in the

presence or absence of 500 ng/mL FasL. Cells were labelled with AnnexinV-APC and analyzed by

flow cytometry. Analyses were restricted to the EGFP positive cells and at least 1,000 EGFP-

expressing cells were analysed. FasL-induced cell death was evaluated by subtracting the basal cell

death induced by transfection in the different conditions in the absence of FasL. Results are expressed

as percentages of cell death measured in untreated cells.

Table 1

% of EGFP expressing cells Mean Fluorescence Intensity

construct None zVAD-fmk None zVAD-fmk

EGFP 4 ± 1.5 4.8 ± 1.7 141 ± 19 133 ± 23

WT Casp-8 1.2 ± 0.3 a 1.3 ± 0.3

a 37 ± 6

a 79 ± 12

a,b

WT Casp-10 1.2 ± 0.3 a 1.3 ± 0.4

a 41 ± 6

a 66 ± 12

a,d

C360S Casp-8 1.0 ± 0.3 a 1.1 ± 0.3

a 79 ± 6

a 89 ± 15

C401S Casp-10 1.7 ± 0.7 c 1.6 ± 0.6

a 86 ± 1

c 96 ± 17

Table 1: Analysis of EGFP expression 24 hours post-transfection with the different constructs in

the presence (zVAD-fmk) or absence (None) of 40 µM zVAD-fmk. a p<0.05 and

c p=0.07 as compared to EGFP alone.

b p<0.05 and

d p=0.07 as compared to values obtained in the absence of zVAD-fmk.

RIP

Caspase-10

A3 I9.2e

Caspase-8

Caspase-2

FADD

Caspase-3

Caspase-7

Caspase-9

!-actin

I9.2d

IET

Da

se

(n

mo

l/h

/mg

)

None FasL FasL

zVAD

0

0.4

0.8

1.2

1.6

2D

EV

Da

se

(n

mo

l/h

/mg

)

None FasL FasL

zVAD

0

4

8

12A B

C

Milhas et al.

Figure 1

****

*

**

*

None FasL FasL

zVAD

0

10

20

30

40

[PI+

] c

ell

s (

%)

Ce

ram

ide

(%

)

None FasL FasL

zVAD

0

100

200

300

400500

600

Milhas et al.

Figure 2

B

C

[An

V+

PI-

] c

ell

s (

%)

0

20

40

60

80

None FasL FasL

zVAD

A ****

* ***

**

***

*****

*

******

*****

ns***

GFP

100

101

102

103

104

Annexine-APC

GFP ZVad

100

101

102

103

104

Annexine-APC

W8

100

101

102

103

104

Annexine-APC

W8 ZVad

100

101

102

103

104

Annexine-APC

W10

100

101

102

103

104

Annexine-APC

W10 ZVad

100

101

102

103

104

Annexine-APC

M8

100

101

102

103

104

Annexine-APC

M10

100

101

102

103

104

Annexine-APC

EGFP EGFP + zVAD

Casp-8

Casp-10

Casp-8 + zVAD Casp-8 C360S

Casp-10 C401SCasp-10 + zVAD

Counts

Annexin-V-APC

EG

FP

Ca

sp

-8

Ca

sp

-10

Ca

sp

-8 C

36

0S

Ca

sp

-10

C4

01

S

EG

FP

Ca

sp

-8

Ca

sp

-10

Ca

sp

-8 C

36

0S

Ca

sp

-10

C4

01

S

100

80

60

40

20

0

[An

V+

] c

ell

s (

%)

None zVAD

Milhas et al.

Figure 3

A

B

24

80

66

17

42

45

59

46

**** ** p=0.06

** ****

*

GFP-IP

100 101 102 103 104

Propidium Iodide

W8 IP 50000

100 101 102 103 104

Propidium Iodide

W8 zvad IP 50000

100 101 102 103 104

Propidium Iodide

W10 IP 50000

100 101 102 103 104

Propidium Iodide

W10 zvad IP 50000

100 101 102 103 104

Propidium Iodide

m8 IP 50000

100 101 102 103 104

Propidium Iodide

m10 IP 50000

100 101 102 103 104

Propidium Iodide

GFP zvad IP 50000

100 101 102 103 104

Propidium Iodide

EGFP EGFP + zVAD

Casp-8

Casp-10

Casp-8 + zVAD Casp-8 C360S

Casp-10 C401SCasp-10 + zVAD

Counts

Propidium iodide7

33

33 12

27

Milhas et al.

Figure 4

6

20

25

Milhas et al.

Figure 5

0

20

40

60

80

100

[An

V+

] c

ell

s (

%)

0

20

40

60

80

100

Experiment 1

Experiment 2

EG

FP

Ca

sp

-8

Ca

sp

-10

Ca

sp

-8 C

36

0S

Ca

sp

-10

C4

01

S

Ca

sp

-10

+ z

VA

D

Ca

sp

-8 +

zV

AD

77

III-3 Conclusions de l’article 2

L’ensemble de nos résultats indique un rôle des caspases-8 et -10 dans l’induction de

l’apoptose, mais aussi de la nécrose, et dans la production de céramide induite par la

stimulation de Fas. En effet, ces divers évènements sont corrélés avec la présence des

caspases-8 et -10 dans les cellules Jurkat. Comparé aux cellules parentales A3, les cellules I9-

2d, qui sont déficientes en caspase-8 et qui expriment la caspase-10, ont une sensibilité

intermédiaire à l’apoptose et à la nécrose et une production de céramide modérée en réponse

à FasL. A l’inverse, aucun de ces phénomènes n’est observé dans les cellules I9-2e double

déficientes en caspases-8 et -10. La surexpression des caspases -8 et -10 sauvages ou mutées

sur le site catalytique suffit à induire une mort cellulaire (sans FasL), en présence ou en

absence de z-VAD. De plus, alors que cela avait été décrit dans les cellules I9-2, déficientes

en caspase-8 et exprimant la caspase-10 (Chang et al., 2003; Wang et al., 2001), nos résultats

indiquent que la surexpression des caspases-8 ou -10 sauvages restaure la sensibilité des

cellules I9-2e à la mort induite par FasL. En outre, la surexpression des caspases-8 et -10

catalytiquement inactives ou des formes sauvages en présence de z-VAD permet une

restauration partielle de la mort des cellules I9-2e induite par FasL. Ceci suggère un rôle des

caspases-8 et -10 dans l’induction d’une mort nécrotique indépendamment de leur activité

catalytique.

Nos travaux, et ceux de la littérature, montrent un rôle essentiel de RIP et de FADD

dans l’induction de la mort caspase-indépendante en réponse à FasL (Holler et al., 2000).

Plusieurs études impliquent les caspases-8 et -10 dans l’activation de NF-κB,

indépendamment de leur activité catalytique. Cette signalisation semble dépendre de FADD

et de l’interaction entre le prodomaine DED des caspases avec RIP (Kreuz et al., 2004;

Shikama et al., 2003; Wang et al., 2007). Ainsi, il est possible que la formation d’un

complexe entre Fas, FADD, les caspases-8 et -10 et RIP participe à l’induction de la mort

nécrotique. Pour vérifier cette hypothèse, il serait envisageable de surexprimer les caspases-8

et -10 catalytiquement inactives ou les caspases -8 et -10 sauvages en présence de z-VAD

dans des cellules Jurkat déficientes pour la protéine RIP ou la protéine FADD. Si ces

protéines sont indispensables à la formation du complexe, aucune mort nécrotique ne sera

observée.

78

III-4 L’activité catalytique des caspases est nécessaire à leur effet toxique dans les

cellules HeLa

Nous avons testé l’effet de la surexpression des caspases-8 et -10 sauvages et mutées

dans un autre type cellulaire, les cellules carcinomateuses HeLa.

0

5

10

15

20

25

0

10

20

30

40

50

0

5

10

15

20

% c

ellu

les A

nn

-Vp

osit

ive

% c

ell

ule

s A

nn

-Vp

osit

ive z-VAD

% c

ellu

les

IP

po

sit

ive

% c

ellu

les

IP

po

sit

ive

EG

FP

Ca

sp

-8

Cas

p-1

0

Casp

-8 C

360

S

Ca

sp

-10

C4

01

S

EG

FP

Casp

-8

Ca

sp

-10

Cas

p-8

C36

0S

Casp

-10 C

40

1S

z-VAD

EG

FP

Ca

sp

-8

Cas

p-1

0

Casp

-8 C

360

S

Ca

sp

-10

C4

01

S

EG

FP

Cas

p-8

Casp

-10

Ca

sp

-8 C

360S

Cas

p-1

0 C

401S

A B

C D

0

10

20

30

40

50

60

70 *

*

* *

*

*

**

*

*

P= 0,07

Figure 24 : Effet de la surexpression des caspases-8 et -10 sauvages et mutées dans les cellules HeLa Les cellules HeLa ont été transfectées par des plasmides codant pour EGFP, pour la caspase-

8 sauvage taggée EGFP (Casp-8) ou la caspase-8 mutée sur le site catalytique taggée EGFP

(Casp-8 C360S), la caspase-10 sauvage taggée EGFP (Casp-10). Alternativement, les cellules

ont été co-transfectées avec EGFP et un mutant catalytiquement inactif de la caspase-10

(Casp-10 C401S). Immédiatement après la transfection, les cellules sont incubées en présence

de 40 µM de z-VAD (B et D). 24 heures après la transfection, les cellules sont marquées par

l’Annexine-V-APC (A et B) ou par l’Iodure de Propidium (C et D) et analysées par

cytométrie en flux. Les analyses sont restreintes aux cellules EGFP positives. Les résultats

correspondent à la moyenne ± ESM de cinq expériences indépendantes. * p< 0,05.

79

De la même façon que dans les cellules Jurkat, la surexpression des caspases-8 et -10

sauvages induit une mort évaluée par le pourcentage de cellules positives pour l’Annexine-V

(Figure 24A) et pour l’Iodure de Propidium (Figure 24C). Ces résultats confirment les

travaux de la littérature qui montrent que la surexpression de caspases initiatrices sauvages

provoque l’apoptose des cellules HeLa (Chang et al., 2003; Chen et al., 2002). Par ailleurs,

nos travaux indiquent que les caspases-8 et -10 catalytiquement inactives induisent également

une mort qui est totalement bloquée en présence de z-VAD, suggérant une activation des

caspases par les caspases mutées (Figure 24 A et B). Comme cela a déjà été montré, il est

possible que la dimérisation des caspases mutées avec les caspases endogènes favorise

l’activation des caspases endogènes et induise l’apoptose (Chang et al., 2003; Chen et al.,

2002). Par ailleurs, le z-VAD ne prévient pas totalement la mort en réponse à la

surexpression des caspases-8 et -10 sauvages (Figure 24B et D). Ainsi, dans ces conditions

expérimentales, le z-VAD ne semble pas capable de bloquer complètement l’activité

catalytique des caspases-8 et -10. Cette observation est en accord avec le fait que le z-VAD

n’est pas un inhibiteur parfait permettant d’antagoniser totalement les différents membres de

la famille des caspases.

Ces résultats suggèrent que contrairement aux cellules Jurkat, les caspases-8 et -10

induisent préférentiellement une mort dépendante de leur activité catalytique dans les cellules

HeLa. Il semblerait donc que l’induction de la mort nécrotique par les caspases-8 et -10

indépendamment de leur activité catalytique, dépende du type cellulaire. Une faible

expression des protéines potentiellement impliquées dans la mort nécrotique, comme la

protéine RIP, pourrait favoriser une résistance des cellules HeLa à la mort indépendante de

l’activité catalytique des caspases. En accord avec cette hypothèse, le z-VAD inhibe

complètement la mort des cellules HeLa en réponse à la stimulation de Fas (Holler et al.,

2000).

En accord avec les résultats et les conclusions de l’article2, dans la suite de ce manuscrit,

le terme de mort « caspase-indépendante » sera remplacé par « mort indépendante de

l’activité catalytique des caspases ».

80

IV- Rôle du céramide dans la mort de cellules Jurkat

IV-1 Production de céramide dans la signalisation de Fas

Comme évoqué dans la revue générale, il a été suggéré un rôle du céramide dans

l’apoptose mais aussi dans des voies alternes de mort cellulaire, qualifiées classiquement de

mort caspase-indépendante. Dans la signalisation de Fas, la contribution de l’activité

catalytique des caspases dans la génération de céramide semble majeure, puisque le z-VAD

bloque l’accumulation précoce et tardive de céramide (Cuvillier et al., 2000). En particulier,

la caspase-8 semble jouer un rôle majeur dans la production de céramide dans la signalisation

de Fas. Ainsi, le traitement de cellules déficientes en caspase-8 par un anticorps agoniste de

Fas n’induit pas d’augmentation du taux intracellulaire de céramide (Juo et al., 1999).

Plusieurs études suggèrent que la formation tardive de céramide dépend de la caspase-

8 et intervient en amont de l’activation de la caspase-3 et des évènements mitochondriaux. En

effet, alors que la surexpression de FLIP-L, une protéine inhibitrice de la caspase-8, prévient

totalement l’accumulation de céramide dans des cellules Jurkat en réponse à un agoniste de

Fas, l’addition de DEVD qui inhibe préférentiellement l’activité de la caspase-3, n’inhibe pas

la production de céramide (Rodriguez-Lafrasse et al., 2001; Tepper et al., 1997; Tepper et al.,

1999). De plus, la surexpression de Bcl-2 ou de Bcl-xL dans des cellules Jurkat n’inhibe que

partiellement l’élévation du taux de céramide induite par l’activation de Fas, tandis que la

libération du cytochrome c dans le cytosol ou l’activation de la caspase-9 sont totalement

bloqués (Cuvillier et al., 2000; Tepper et al., 1999).

IV-2 Rôle de la sphingomyéline synthase dans la signalisation de Fas

Les mécanismes d’accumulation du céramide en réponse à FasL ne sont pas

clairement définis et plusieurs enzymes du métabolisme du céramide pourraient être

impliquées dans l’augmentation du taux intracellulaire de céramide. Comme évoqué dans la

revue générale, il existe des contradictions quant au rôle de la synthèse de novo de céramide

ou de l’hydrolyse de sphingomyéline en céramide par les sphingomyélinases dans la

signalisation apoptotique de Fas. L’inhibition des enzymes de conversion du céramide

pouvant aussi participer à son accumulation dans la cellule, le rôle de la GCS et de la SMS a

été étudié dans la signalisation cytotoxique de Fas. Les travaux du groupe de Borst exclus

une implication de la GCS dans l’apoptose induite par l’engagement de Fas, puisque sa

81

surexpression dans des cellules Jurkat n’affecte pas la génération de céramide (Tepper et al.,

2000a). En réponse à la stimulation de Fas, une inhibition de l’activité nucléaire de la SMS

est corrélée avec l’augmentation du taux de céramide dans le noyau et l’induction de

l’apoptose (Watanabe et al., 2004). Cependant, ces travaux reposent uniquement sur

l’évaluation de l’activité enzymatique de la SMS par mesure de la conversion de C6-NBD-

Céramide en C6-NBD-SM. Depuis, le clonage de la SMS chez l’homme a permis d’étudier

spécifiquement le rôle de la SMS dans la signalisation. Ainsi, deux isoformes de la SMS ont

été décrites : la SMS1 localisée sur la face luminale de l’appareil de Golgi et la SMS2 qui

réside sur le feuillet externe de la membrane plasmique (Huitema et al., 2004; Yamaoka et

al., 2004). Elle catalyse le transfert d’un groupement phosphorylcholine sur le céramide à

partir de la phosphatidylcholine (PC), permettant de générer la sphingomyéline et le

diacylglycérol (DAG) (Figure 25)

Figure 25 : Réaction enzymatique catalysée par la sphingomyéline synthase (Luberto

and Hannun, 1998).

En régulant le taux de céramide, considéré comme pro-apoptotique, et celui du DAG,

un second messager anti-apoptotique, la SMS pourrait jouer un rôle clé dans le contrôle de la

prolifération et de la mort cellulaire (Tafesse et al., 2006). Ainsi, l’activité de la SMS est

augmentée dans des fibroblastes transformés par SV40 (en comparaison avec des fibroblastes

non transformés) ainsi que dans des cellules leucémiques chimiorésistantes (Luberto and

Hannun, 1998) (Itoh et al., 2003). De plus, la surexpression de la SMS1 inhibe l’apoptose de

cellules Jurkat induite par thérapie photodynamique (Separovic et al., 2007).

82

IV-3 Objectif et stratégie expérimentale de l’article 3

Dans cette étude nous avons tenté de préciser l’implication de la sphingomyéline

synthase dans la signalisation cytotoxique de Fas dans les lymphocytes T, dépendante et

indépendante de l’activité catalytique des caspases. La synthèse de novo de sphingomyéline

et l’activité de la SMS ont été mesurées dans des cellules Jurkat et des PBL, incubés ou non,

en présence de FasL. Pour préciser les mécanismes moléculaires, l’effet de la déficience en

caspase-8, du z-VAD ou de la surexpression de Bcl-xL a été testé sur l’activité de la SMS.

Pour évaluer le rôle de la SMS dans la signalisation cytotoxique de Fas nous avons testé : (i)

l’effet du D609, un inhibiteur de la SMS (Huitema et al., 2004; Luberto and Hannun, 1998),

sur la synthèse de SM et la mort de cellules Jurkat et de PBL en réponse à FasL ; (ii) la

sensibilité à FasL de cellules Jurkat exprimant de façon stable un siRNA dirigé contre la

SMS1.

ARTICLE 3

Milhas, D., Benoist, H., Garcia, V., Zhe-Xiong, J., Umehara, H., Okazaki, T., Levade, T. and

Segui, B. FasL-triggered inhibition of sphingomyelin synthesis is involved in ceramide

increase and caspase-dependent and -independent cell death in human activated and leukemia

T cells. (en préparation).

1

FasL-triggered inhibition of sphingomyelin synthesis is involved in ceramide

increase and caspase-dependent and -independent cell death in human

activated and leukemia T cells.

Delphine Milhas1, Hervé Benoist1, Virginie Garcia1, Zhe-Xiong Jin2, Hisanori

Umehara2, Toshiro Okazaki3, Thierry Levade1, and Bruno Ségui1

1Inserm U858, Institut de Médecine Moléculaire de Rangueil, BP 84225, 31432

Toulouse Cédex 4, France.

2Division of Hematology and Immunology, Department of Internal Medicine,

Kanazawa Medical University, Ishikawa 920-0293, Japan.

3Department of Clinical Laboratory, Medicine/Hematology, Faculty of Medicine,

Tottori University, Yonago, Tottori 683-8504, Japan.

Corresponding author: Bruno Ségui, Inserm U858, Institut de Médecine Moléculaire

de Rangueil, BP 84225 31432 Toulouse Cédex 4, France.

bruno.segui@toulouse.inserm.fr, (33)5 61 32 20 60, Fax (33)5 61 32 20 84

Running title: Sphingomyelin synthesis in Fas signaling

Keywords: lymphocyte, CD95, sphingomyelin synthase, sphingolipids, apoptosis,

necrosis.

Abstract word count: 197; Total text word count: (excluding title page, abstract,

figure legends and references): 4355; Number of references: 47.

Scientific category: Immunobiology

2

Abstract

Ceramide is converted to sphingomyelin (SM) by SM synthase (SMS). Herein, we

show that in human leukemia Jurkat cells, FasL treatment inhibited SMS activity in a

dose- and time-dependent manner. SMS inhibition elicited by low FasL

concentrations (10–50 ng/mL) was abrogated by zVAD-fmk, a broad-spectrum

caspase inhibitor, and did not occur in caspase-8-deficient cells. When a higher FasL

concentration (500 ng/mL) was used, SMS inhibition was only partially blocked by

zVAD-fmk and caspase-8 deficiency. Thus, FasL-mediated SMS inhibition depends

mainly on caspase activation but can also occur in a caspase-independent manner.

A non-toxic concentration (50 µg/mL) of the tricyclodecan-9-yl xanthogenate D609

inhibited SMS activity and transiently increased ceramide level. D609 significantly

enhanced FasL-induced caspase activation and apoptosis and partially overcame

zVAD-fmk- and caspase-8-deficiency-conferred resistance to FasL. In activated

human T lymphocytes, FasL triggered SMS inhibition, and D609 enhanced FasL-

induced cell death in the presence or absence of zVAD-fmk. FasL-induced caspase-

dependent and -independent ceramide production and cell death were enhanced in

Jurkat cells stably over-expressing siRNA against SMS1. Altogether, our data

indicate that the inhibition of ceramide conversion to SM is accompanied by an

enhancement of FasL-induced caspase-dependent and -independent cell death in T

lymphocytes.

3

Introduction

Fas (CD95) engagement by FasL (CD95L or CD178) plays a crucial function in the

regulation of T cell homeostasis, essentially through cell death induction in activated-

T cells 1. FasL-induced T cell death is viewed as an essential negative regulatory

mechanism of T cell activation, limiting T cell response in immune responses and

autoimmune diseases. In humans, gene mutations affecting either FasL, Fas or Fas

signaling proteins such as initiator caspases are responsible for ALPS (Autoimmune

lymphoproliferative syndrome) 2.

Scaffidi and co-workers reported the existence of two different cell types as defined

by distinct Fas signaling routes 3. Type 1 cells were originally defined by their

capacity to form large amounts of death-inducing signaling complex (DISC)

consisting in the recruitment of the adaptor protein FADD and initiator caspases to

the Fas receptor upon activation. This enables strong and direct activation of the

caspase cascade independently of mitochondrial events. In type 2 cells, such as

Jurkat T leukemia cells, DISC formation occurs less efficiently than in type 1 cells.

Both initiator caspases, i.e., caspase-8 and -10, are activated at the DISC level 4-6

and cleave Bid 7-10, allowing cytochrome c release from the mitochondria 7,8, which is

a critical event for FasL-induced caspase activation and apoptosis 3. It has been

recently reported that internalization of the Fas receptor is required for efficient DISC

formation and apoptosis induction in type 1 cells but not in type 2 cells 11. Fas

stimulation has also been reported to activate a caspase-independent pathway

involving the serine/threonine kinase RIP1 (Receptor Interacting Protein) as an

effector molecule 12. The signaling pathway activated by RIP is largely unknown and

likely involves ROS production, and leads to a necrotic form of cell death rather than

apoptosis 12.

4

A growing body of evidence supports the involvement of ceramide, a sphingolipid

bioactive molecule, or its metabolites in stress-induced caspase-dependent and -

independent cell death (for a recent review, see 13). This ceramide-induced cell death

is inhibited by over-expression of Bcl-2 or Bcl-xL, suggesting the involvement of

mitochondrial events 13. Ceramide has been recently proposed as a mediator in TNF-

induced caspase-independent cell death in various cell lines 14. In this context,

ceramide production involved RIP1 14. Ceramide can be generated by sphingomyelin

(SM) breakdown as a consequence of sphingomyelinase (SMase) activation and/or

increase of de novo synthesis. Ceramide is synthesized within the endoplasmic

reticulum and converted in the Golgi to SM and glucosylceramide (GlcCer) by SMS

and GlcCer synthase (GCS), respectively. Both enzymes are capable of negatively

regulating intracellular ceramide concentrations and are inhibited upon various stress

conditions, which trigger ceramide increase and cell death 13. Tepper and co-workers

previously reported that GCS does not regulate ceramide generated upon Fas cross-

linking 15. A more recent study indicates that Fas engagement is accompanied by

the inhibition of a SMS activity and ceramide increase within the nucleus 16.

Two different genes encoding SMS have been cloned so far 17,18. The corresponding

proteins, SMS1 and SMS2, are mainly localized at the Golgi and at the plasma

membrane, respectively 17. Members of the SMS family include four different splice

variants of the mouse SMS1 gene 19. Recently, SMS1 has been identified by

screening a mouse T-cell cDNA library in Saccharomyces cerevisiae as a suppressor

of the growth inhibitory effect of Bax and other cytotoxic stimuli including hydrogen

peroxide, heat shock, osmotic stress and exogenous ceramide 20. Expression of

SMS1 in yeast could limit ceramide accumulation and cell death signaling 20.

However, anti-Fas induced apoptosis was partly impaired in a murine leukemia cell

5

line deficient in SMS, and over-expression of SMS1 restored full caspase activation

and cell death 21. Thus, a robust and sustained inhibition of SMS might alter

membrane composition and properties through SM depletion and confer cell death

resistance 13.

D609, a xanthate compound with anti-viral, anti-tumor and anti-inflammatory

properties 22-25, has been reported to inhibit phosphatidylcholine (PC) phospholipase

C (that awaits molecular identification) and SMS 16,17,26,27. Both SMS1 and SMS2 can

be inhibited by D609, the extent of inhibition for SMS1 being greater than for SMS2

17. Controversy exists as to the effect of D609 in Fas signaling. D609 enhances Fas

cross-linking-induced ceramide production and cell death in human leukemia cells

16,28. More recently, it has been published that D609 impaired HeLa cell death in

response to an agonistic anti-Fas antibody whereas it had no effect in SKW6.4 cells

29. Thus, one could speculate that the ability of D609 to modulate death receptor-

induced cell death is cell type-dependent. However, it should be noted that conflicting

findings were reported using the same cell type, i.e., Jurkat cells, in response to Fas

engagement 16,29.

The present study aimed at investigating the function of SM biosynthesis in

modulating FasL-induced cell death in T lymphocytes and leukemia cells. Our data

underscore the importance of SMS inhibition in FasL-triggered ceramide increase

and cell death.

6

Materials and Methods

Reagents

Final concentrations or dilutions and the source of reagents were as follows:

D609 (50 µg/mL) was obtained from Sigma (Saint Quentin Fallavier, France);

zVAD(OMe)-fmk (40 µM) was purchased from Bachem (Voisins-Le-Bretonneux,

France); polyclonal anti-caspase-3 (10 µg/ml) was obtained from Dako (Trappes,

France); monoclonal anti-caspase-8 (clone 1C12) and polyclonal anti-PARP were

purchased from Cell Signaling Technology (Saint-Quentin-en-Yvelines, France) and

used at 1/1000 dilution; monoclonal anti-β-actin (clone AC-15; 5 µg/ml) was from

Sigma; monoclonal anti-Bcl-xL (clone 2H12, 1 µg/mL) was from BD Biosciences (Le

Pont-De-Claix, France).

Human recombinant FasL was obtained from Abcys (Paris, France).

Alternatively, mouse FasL produced in the supernatant of Neuro-2A cells stably

transfected with a plasmid encoding FasL 30 was used. Similar data were obtained

with mouse and human FasL.

Cell lines

Parental Jurkat T leukemia cells (clone A3) and derived cell lines deficient for

caspase-8 (clone I9-2) 31 were kindly provided by Dr. J. Blenis (Boston, MA). Mock

transfected Jurkat cells (clone E6) and Bcl-xL over-expressing E6 cells were a kind

gift from Dr. C. Thompson (Chicago, IL) 32. Jurkat cells were transduced by a

retroviral vector encoding either a scrambled (ATTGAAAAAGACACGCGCC) or

human SMS1 siRNA (GCCCAACTGCGAAGAATAA) to obtain stable transfectants

(Jin Z.X., Okazaki T., Umehara H., submitted). Production of the retrovirus carrying

the SMS1 siRNA and scrambled siRNA sequences and infection of Jurkat cells by

the recombinant viruses were performed as previously described 33.

7

Human peripheral blood lymphocytes (PBL) were obtained from healthy

donors after separation from heparinized venous blood by centrifugation (700 x g, 20

min) over Ficoll (Gibco, Cergy-Pontoise, France). Allowing cell adhesion to the flask

for 4 hours eliminated adherent cells. The remaining cells (i.e., PBL) were cultured

for 6 days with 1 µg/mL phytohemagglutinin (PHA) (Sigma) in the presence of 20

U/mL IL-2 (a kind gift from Sanofi Aventis, Toulouse, France). Cells were cultured in

RPMI 1640 medium containing Glutamax and 10% heat-inactivated fetal calf serum

(FCS) (Gibco, France).

Analysis of mRNA expression

Total RNA was isolated from Jurkat cells using QIAGEN RNeasy kit (Qiagen,

France) and reverse transcribed using oligo(dT)15 (Promega, France) and

Superscript II (Invitrogen, France), as recommended by the manufacturers. cDNA

were analyzed by quantitative real time polymerase chain reaction (PCR) using

specific primers for SMS1, SMS2 and GAPDH (Qiagen) and Power SYBR Green

PCR Master mix (Applied biosystems, France). Mixtures were loaded in a Taqman

7900 (Applied biosystems) and amplification was performed according to the

manufacturer’s instructions. Alternatively, cDNA were amplified by 30 PCR cycles

using GoTaq Flexi DNA Polymerase (Promega) and specific primers for SMS1

(forward primer: CATTTCAACTGTTCTCCGAAGC; reverse primer:

CCATAGTGTGATACCACCAG), SMS2 (forward primer:

TTAATCTGCTGGCTGCTGAG; reverse primer: ACCAATCTTCTGAACCCGTG) and

GAPDH (forward primer: AACATCATCCCTGCCTCTACTG; reverse primer:

TTGACAAAGTGGTCGTTGAGG). cDNA prepared from human skin fibroblasts and

vectors carrying human cDNA for SMS1 and SMS2 were used as positive controls.

Amplifications were performed in a thermal cycler (Biorad) and amplification products

8

were analyzed after migration into a 0.8% agarose gel and ethidium bromide

staining.

Flow cytometry analyses

Phosphatidylserine (PS) externalization was evaluated by labeling cells with

Annexin V-FITC (250 ng/ml) and propidium iodide (12.5 µg/ml) (Immunotech,

Marseille, France) for 10 min at 4°C. Hypodiploidy was detected by washing cells in

PBS and permeabilization in 70% ethanol for 10 min at –20°C. Cells were next

incubated for 30 min at 37°C with RNase (1 µg/ml) and propidium iodide (0.1 mg/ml).

Percentage of hypodiploid cells carrying a DNA content below that of cells in G0/G1

was quantified by flow cytometry. Analyses were performed on a FACScan cytometer

(Becton Dickinson, Le-Pont-de-Claix, France) 9.

Protein extraction and Western blotting analyses

For total protein extraction, 5 x 106 cells were lysed for 30 min on ice in a

buffer containing 50 mM HEPES, pH 7.5, 150 mM NaCl, 10 % glycerol, 1% Triton X-

100, 0.5% deoxycholate, 1 mM NaVO4, 10 µM β-glycerophosphate, 50 mM NaF, 1

mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 10 µg/ml leupeptin, 2 µg/ml pepstatin A and 10

µg/ml aprotinin. Samples were centrifuged at 3,500 x g at 4°C for 10 min.

Supernatants were collected and protein content was determined by the Bradford

method (Biorad). For Western blot analyses, equal amounts of proteins were

separated on 12.5% SDS-PAGE.

Determination of SMS and GCS activities

1x106 Jurkat cells were incubated in 1 mL RPMI 1640 medium containing 10%

FCS and 2.5 µM C6-NBD-ceramide (solubilized in ethanol) (Sigma). After incubation

at 37°C for two hours, reaction was stopped and lipids were extracted by adding 5

mL of chloroform/methanol (2:1, v/v). After centrifugation (1000 x g, 10 min), the

9

lower phases were dried under nitrogen and resolved by analytical thin layer

chromatography (TLC) developed in chloroform/methanol/30% ammonia (70:30:5, by

vol.). C6-NBD-ceramide, C6-NBD-GlcCer and C6-NBD-SM were eluted from the silica

and quantified spectrofluorometrically (λex=470 nm and λem=530 nm) 34.

Ceramide and Diacylglycerol (DAG) mass measurement

Lipids were extracted as described above. Ceramide mass was determined as

previously reported 35 using E. coli membranes as a source of DAG kinase (a kind

gift of Drs. D. Perry and Y.A. Hannun (Charleston, NC)). Radioactive ceramide-1-

phosphate and phosphatidic acid were isolated by TLC using

chloroform/acetone/methanol/acetic acid/water (50:20:15:10:5, by vol.) and then

scraped before counting radioactivity by liquid scintillation.

Quantification of sphingolipids

3x106 cells were incubated for 48-72 hours in the presence of 0.33 µCi/mL

[3H]sphingosine (PerkinElmer, France) to label sphingolipids to the equilibrium. Lipids

were extracted and separated by TLC using chloroform/methanol/water (100:42:6, by

vol.). Radiolabeled sphingolipids were detected using a Berthold

radiochromatoscanner, identified using lipid standards and then scraped before

counting radioactivity by liquid scintillation. Alternatively, 3x106 cells were incubated

for 48-72 hours in the presence of 1 µCi/mL [3H]choline (PerkinElmer, France) to

label SM and PC to the equilibrium. The extracted SM and PC were separated by

alkaline hydrolysis as previously described 36.

De novo SM synthesis

3x106 cells were incubated in the presence of [3H]choline (1 µCi/mL) for 4

hours to allow PC labeling and further incubated for the indicated times in the

presence or absence of FasL. Then, cells were sedimented at 4°C by low-speed

10

centrifugation, and cell pellets were immediately frozen at -20°C. [3H]choline-labeled

SM was next quantified after alkaline methanolysis as previously described 36.

Morphological analysis

Cells were half-diluted in a trypan blue dye solution (0.4% in PBS) for 5 min

and analyzed under a Leica light microscope. At least 300 cells were examined and

the percentage of cells exhibiting apoptotic nuclei (i.e., condensed and/or

fragmented nuclei) was determined. The percentage of trypan blue positive cells did

not increase during the first 4 hours of incubation with FasL.

Statistical analysis

Results are expressed as means ± s.e.m. of at least three values per

experiment. Mean values were compared using the Student’s t-test. Differences were

considered statistically significant when p<0.05 (as indicated by an asterisk on the

figures; n.s. : not significant).

11

RESULTS

FasL triggered inhibition of de novo SM synthesis.

In Jurkat cells, SM represents the most abundant sphingolipid (approximately 70% of

total sphingolipids) whereas ceramide content averages 8% (Fig. 1A). Upon FasL,

sphingolipid pattern was profoundly perturbed (Fig. 1A). Notably, ceramide content

strongly increased in a time-dependent manner up to 20%, concomitantly to SM

decrease and cell death induction (Figs. 1B and 1C). In sharp contrast, no or little

variation was observed for the cellular content of GlcCer and lactosylceramide

(LacCer) (Fig. 1B). SM decrease and ceramide increase were likely a consequence

of SMase activation since FasL has been reported to activate both neutral and acidic

SMases 37. We hypothesized that an inhibition of SM synthesis may also account for

the observed changes in sphingolipid levels. Accordingly, FasL induced a sustained

and substantial inhibition of SM synthesis as early as one hour, and SM synthesis

was almost completely impaired after 4-hour FasL treatment (Fig. 1D). We next

measured in situ SMS and GCS activities by monitoring in intact cells the conversion

of a fluorescent analog of ceramide into SM and GlcCer. In Jurkat cells, SMS activity

was inhibited upon FasL in a time and dose-dependent manner whereas GCS

remained essentially unaffected, except at late time points and at the highest FasL

concentration (Figs. 2A and 2B). 500 ng/mL FasL also triggered the inhibition of SMS

and GCS activities in activated human PBL (Fig. 2A). FasL-induced GCS inhibition

was prevented by zVAD-fmk, a broad-spectrum caspase inhibitor, and did not occur

in caspase-8-deficient cells indicating caspase involvement (Fig. 2B right). SMS

inhibition mediated by low FasL concentrations (10 – 50 ng/mL) was also abrogated

by zVAD-fmk and caspase-8 deficiency (Fig. 2B left). When a higher FasL

concentration (500 ng/mL) was used, SMS inhibition was only partially blocked by

12

zVAD-fmk (Fig. 2B left) whereas FasL-induced caspase activation, as evaluated by

measuring specific activities towards DEVD-AMC and IETD-AMC peptides, was

completely inhibited (data not shown). Also, SMS inhibition elicited by 500 ng/mL

FasL occurred, to some extent, in caspase-8-deficient cells (Fig. 2B). Thus, FasL-

mediated SMS inhibition depends mainly on caspase activation but can also occur in

a caspase-independent manner. To further delineate molecular events involved in

SMS inhibition, we evaluated the impact of Bcl-xL over-expression. Whereas Bcl-xL

over-expression significantly impaired cell death (data not shown), it did not prevent

SMS inhibition to all doses of FasL (Fig. 2C). Thus, FasL-mediated SMS inhibition

occurred chiefly downstream of caspase-8 activation and upstream of mitochondrial

events.

D609 inhibits SMS and stimulates FasL-induced caspase-dependent and -

independent cell death in Jurkat and in activated T cells.

D609 has been previously shown to inhibit SMS activity in SV40-transformed

fibroblasts and leukemia cells 16,17,26,27. A non-toxic concentration of D609 (50 µg/mL)

significantly inhibited SMS but not GCS in Jurkat cells (Fig. 3A). Also, endogenous

ceramide content transiently increased with a peak at 2 to 3 hours post-treatment

and returned to control values at 8 hours (Fig. 3A and data not shown). In response

to a low FasL concentration (10 ng/mL), caspase activation was increased by D609

as evaluated by Western blot using anti-caspase-3 and anti-PARP antibodies (Fig.

3B). Accordingly, D609 significantly enhanced FasL-induced PS externalization (Fig.

3C). In Jurkat cells, caspase-8 plays a pivotal role in initiating caspase cascade

activation in response to Fas engagement 31. As a matter of fact, toxicity was strongly

impaired in caspase-8-null (I9-2) Jurkat cells in response to 50 ng/mL FasL, even

after 16 hours incubation (Fig. 3C). D609 sensitized caspase-8-deficient Jurkat cells

13

to FasL indicating that D609 overcomes, to some extent, caspase-8 deficiency (Fig.

3C). We next evaluated the effect of D609 in FasL-induced cell death in the presence

of zVAD-fmk. The addition of D609 not only significantly sensitized Jurkat cell death

induced by a high FasL concentration (500 ng/mL) but also by-passed zVAD-fmk-

mediated resistance towards FasL concentration as low as 50 ng/mL (Fig. 3D). This

phenomenon was associated to an enhancement of ceramide increase by D609 (Fig.

3D). Whereas FasL alone triggered apoptosis as evidenced by nuclear

fragmentation, FasL-induced cell death was associated with some necrotic features

(i.e., marginal chromatin condensation and membrane permeability increase) when

cells were incubated with zVAD-fmk in the presence or absence of D609 (data not

shown).

Similarly to Jurkat cells, 50 µg/mL D609 significantly inhibited SMS but not GCS in

activated T lymphocytes (Fig. 4A). FasL-induced cell death, as evaluated by the

increase of hypodiploid cells (Fig. 4B) and PS externalization (Fig. 4C), was

stimulated by D609. Whereas zVAD-fmk completely abrogated cell death in response

to FasL, D609 restored FasL-induced toxicity and, thus, overcame caspase

inhibition-induced resistance of T lymphocytes.

SMS1 knockdown enhances FasL-induced caspase-dependent and -

independent cell death in Jurkat cells.

The expression of SMS1 and SMS2 was evaluated by quantitative real time PCR in

Jurkat cells. Cycle threshold (Ct) values for SMS1 and SMS2 were 24.6 ± 0.3 and

29.7 ± 0.7 (mean ± s.e.m., n=3), respectively, suggesting that SMS1 was likely the

most expressed SMS isoform in Jurkat cells. Similar findings were recently reported

in S49, a murine lymphoma cell line 38. Also, analytical RT-PCR showed SMS1 but

no SMS2 mRNA in Jurkat cells whereas human skin fibroblasts expressed both

14

isoforms (Fig. 5A). Jurkat cell lines stably over-expressing siRNA against SMS1 were

then established. Expression of SMS1 mRNA in SMS1 knockdown (KD) Jurkat

variant (SMS1 KD Jurkat cells) was reduced by approximately 40% as evaluated by

quantitative real time PCR (Jin Z.X., Okazaki T., Umehara H., submitted) and

analytical RT-PCR (Fig. 5A) as compared to Jurkat cells stably transfected with

scrambled siRNA (control Jurkat cells). SMS1 KD Jurkat cells displayed about 40%

reduction in SMS activity but normal GCS activity as compared to control Jurkat cells

(Fig. 5B). Noteworthy, the two variants displayed similar expression of Fas, FADD,

caspase-8, -3 and -7, PARP and RIP, as evaluated by flow cytometry and Western

blotting (data not shown). Because SMS activity is known to putatively participate in

the homeostasis of SM, PC, ceramide and DAG, we evaluated the intracellular levels

of these different lipids in control and SMS1 KD Jurkat cells. Whereas SMS1 KD

Jurkat cells displayed less SM and more PC (Fig. 5C), no significant differences were

observed for ceramide and DAG contents (Fig. 5D). Also, basal levels of GlcCer and

LacCer were increased by 171±29% and 145±21% (mean ± s.e.m., n=3),

respectively, in SMS1 KD Jurkat cells as compared to control cells. Upon FasL,

whereas no or little variation was observed for DAG (Fig. 5D), GlcCer and LacCer

(data not shown), ceramide increase (Figs. 5D and 5E) and SM decrease (Fig. 5E)

were enhanced in SMS1 KD Jurkat cells as compared to control counterparts.

SMS1 KD Jurkat cells and control cells were analyzed to further evaluate the

importance of SMS inhibition in FasL-induced cell death. Whereas the two variants

displayed a comparable sensitivity to staurosporine (data not shown), SMS1 KD

Jurkat cells were more sensitive to any doses of FasL (Figs. 6A and 6B). FasL-

triggered caspase activation as evaluated by Western blotting was enhanced in

SMS1 KD Jurkat cells (Fig. 6C). In addition, their sensitivity to FasL in the presence

15

of zVAD-fmk was greater than that of control cells, indicating that the SMS1 KD effect

was not only restricted to caspase-dependent pathway (Fig. 6D). This phenomenon

was associated with an enhancement of ceramide increase in SMS1 KD Jurkat cells

in response to the combination of FasL and zVAD-fmk whereas no DAG variation

was observed (Fig. 6E).

16

Discussion

The present study supports the notion that FasL-induced inhibition of sphingomyelin

synthesis likely contributes to the modification of sphingolipid pattern, including SM

decrease and ceramide increase, and to cell death induction.

FasL-induced SMS inhibition occurred essentially, but not entirely, through a

caspase-dependent process and was strongly impaired in caspase-8 deficient cells.

Also, SMS inhibition appears as a proximal event in Fas signaling that occurs

upstream of mitochondrial events, since Bcl-xL over-expression did not prevent this

phenomenon (see Fig. 2C). One possible explanation to account for the decrease in

SMS activity upon FasL could be a caspase-dependent cleavage of either SMS1,

SMS2 (which is not expressed or at very low level in Jurkat cells) or a regulatory

protein of SMS activity such as, for instance, the recently identified ceramide transfer

protein CERT 39. The analysis of the cleavage sites on SMS1, SMS2 and CERT

sequences by bioinformatics indeed revealed the presence of putative sites for both

initiator and effector caspases 40. Whether SMS enzymes or CERT are direct targets

of caspases remains to be established. In addition, we also found a significant

decrease in SMS activity in the presence of zVAD-fmk indicating a non-caspase-

dependent pathway leading to SMS inhibition. Caspase-independent cell death

initiated by FasL is likely dependent on RIP and reactive oxygen species (ROS)

increase 12,14. Because ROS have already been reported to interfere with

sphingolipid metabolism, one can speculate that ROS may also somehow down-

regulate SMS activity 13.

In our experimental setting, a non-toxic concentration of D609 inhibited SMS activity

and triggered a transient increase of intracellular ceramide (see Fig. 3A) most likely

as a consequence of the inhibition of ceramide conversion into SM. In a previous

17

study, Fas cross-linking led to the inhibition of a nuclear SMS leading to ceramide

increase into the nucleus 16. Furthermore, D609 was also able to inhibit SMS into the

nucleus and to enhance Fas-induced nuclear ceramide accumulation and cell death

16. The inhibition of nuclear SMS has been proposed as a consequence of caspase

activation in response to Fas stimulation 16. The present study demonstrates that

D609 enhances FasL-induced caspase activation and apoptosis. Thus, it is likely that

caspase-dependent ceramide increase, possibly within the nucleus, acts as a

positive amplification loop in caspase cascade activation and apoptosis induction.

Moreover, D609 also promoted FasL-induced ceramide accumulation and cell death

in the presence of zVAD-fmk, a widely used broad-spectrum caspase inhibitor (see

Figs. 3 and 4). D609 also enhanced FasL-induced cell death in caspase-8-deficient

Jurkat cells (see Fig. 3C). Thus, our results indicate that D609 effects in Fas

signaling are not restricted to the caspase-dependent pathway. As a matter of fact,

D609 sensitized Jurkat cells to zVAD-fmk resistant (i.e., caspase-independent) cell

death in response to low FasL concentration (i.e., 50 ng/mL) and overcame zVAD-

fmk-mediated resistance of activated T lymphocytes to FasL. In humans, some

defects in caspase-dependent pathway, resulting from gene mutations affecting the

catalytically active sites of either caspase-8 or -10, are responsible for ALPS 2. A

major finding presented here is the ability of D609 to enhance FasL-induced cell

death or to restore it in cells where the death cascade is impaired. Thus, the use of

D609 or derivatives 41 may represent a promising strategy, at least in some cases, for

the treatment of patients affected with ALPS.

The possibility that inhibition of SM synthesis may represent an important event in

FasL-induced cell death signaling is also highlighted by the highest sensitivity of

SMS1 KD Jurkat cells to FasL. These data may seem at odds with a previous report

18

showing FasL resistance of a mouse leukemia cell line (WR19L), which was severely

deficient for SMS activity 21. In this particular mouse cell line, the reduction of SM

synthesis was accompanied by large SM depletion in membranes, notably within lipid

rafts. Thus, the initiation of Fas signaling was greatly compromised, most likely as the

consequence of the alteration of biochemical and biophysical properties of the

plasma membrane. Also, SM breakdown through acidic SMase has been reported as

an essential event for ceramide generation at the cell surface, facilitating Fas capping

42-44. The reduced SM content in WR19L may be limiting for ceramide generation by

SMase. As a matter of fact, Fas cross-linking-mediated early events such as Fas

aggregation and capping were impaired in SMS-deficient WR19L cells 21. Herein, we

used SMS1 KD Jurkat cells, which exhibited about 40% inhibition of SMS activity and

a 15% reduction of the total intracellular pool of SM. Thus, one can speculate that the

85% remaining SM are enough for efficient relocation of Fas on the plasma

membrane upon FasL.

The high sensitivity of SMS1 KD Jurkat cells to FasL-induced caspase-dependent

and-independent cell death was associated with an enhancement of SM decrease

and ceramide increase upon Fas cross-linking. The inhibition of SM synthesis may

favor ceramide accumulation by preventing the conversion of newly formed ceramide

(derived from SM breakdown and/or de novo ceramide synthesis) into SM. Ceramide

is considered as a bioactive molecule in both caspase-dependent and -independent

cell death signaling 13. Indeed, we have recently published that exogenous ceramide

analogs can induce both caspase-dependent and -independent cell death in Jurkat

cells 45. The cytotoxic mechanisms initiated by ceramide are not yet fully elucidated.

Ceramide derived from cell surface SM breakdown, as a consequence of acidic

SMase secretion, has been proposed to be involved in Fas capping and DISC

19

formation 42-44. However, the involvement of acidic SMase in Fas signaling remains a

matter of debate 46. Ceramide or metabolites can also act intracellularly in signal

transduction by activating mitochondrial events including cytochrome c and AIF

release as well as ROS production. Also, ceramide can promote the increase of

lysosomal membrane permeability, autophagic cell death and endoplasmic reticulum

stress 13.

In summary, our results suggest that inhibition of SM synthesis might facilitate FasL-

induced ceramide increase and cell death in leukemia cells and in activated T

lymphocytes. In humans, SMS activity, together with GCS activity, are increased in

chemo-resistant leukemia cells 47. Interfering with SMS activity may represent an

interesting therapeutic strategy to sensitize cells not only to FasL but also to anti-

cancer treatments.

Acknowledgments

We thank Dr. J. Blenis (Boston, MA) for providing A3 and I9-2 Jurkat cells and Dr. C.

Thompson (Chicago, IL) for giving mock-transfected and Bcl-xL over-expressing E6

cells. We thank Patricia Clavé, Nicole Therville and Stéphane Carpentier for excellent

technical assistance. We thank Drs. Nathalie Andrieu-Abadie, Sonia Caroline Sorli

and Jean-Pierre Jaffrézou for critical reading of the manuscript. This study was

supported by INSERM, Paul Sabatier University, grant 3417 from the Association

pour la Recherche sur le Cancer (ARC) (to BS) and grant from Ligue Nationale

contre le cancer and les comités départementaux du Gers, de l’Aveyron et de la

Haute-Garonne (to Jean-Pierre Jaffrézou’s group). Authors declare no conflict of

interest and no competing financial interests.

20

Authorship contribution

BS designed research, DM, BS and HB performed research, ZXJ, HU and TO

contributed vital reagents, DM, BS and VG collected data, DM, BS, HB, TL, TO and

VG analyzed and interpreted data, DM and BS performed statistical analysis, BS,

DM, HB and TL drafted the manuscript.

21

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27

Figure Legends

Figure 1, Treatment of Jurkat cells with FasL triggered the inhibition of SM

synthesis and altered sphingolipid content. A and B, Jurkat cells (clone A3) were

incubated for 48 hours in the presence of [3H]sphingosine (0.33 µCi/mL). 3x106 Cells

were further incubated for 4 hours (A) or the indicated times (B) in the presence

(FasL) or absence (Untreated) of 500 ng/mL FasL. Lipids were extracted and

separated by TLC. Sphingolipid pattern was analyzed by a radiochromatoscanner

and representative images of four independent experiments are shown. B,

Radioactivity associated to non-identified (N.I) sphingolipids (possibly GM3 and

sphingosylphosphorylcholine), sphingomyelin (SM), lactosylceramide (LacCer),

glucosylceramide (GlcCer) and ceramide (Cer) was quantified. Each lipid is

expressed as the % of total sphingolipids present in the organic phase including the

non-identified (N.I) sphingolipids. Of note, no variation of these non-identified

sphingolipids was observed upon FasL (data not shown) (means ± s.e.m., n=4). C

and D, 3x106 cells were incubated in the presence of [3H]choline (1 µCi/mL) for 4

hours to allow PC labeling and further incubated for the indicated times in the

presence or absence of 500 ng/mL FasL. The proportion of cells exhibiting apoptotic

nuclei (i.e., condensed and/or fragmented nuclei) was evaluated by microscopic

analysis (C). [3H]choline-labeled SM was quantified after alkaline methanolysis and

results are expressed as the % of [3H]choline-labeled SM measured in cells

incubated in the absence of FasL at the corresponding time. Data are means ±

s.e.m. of three independent experiments carried out in duplicate.

Figure 2, FasL triggered caspase-dependent and -independent inhibition of

SMS activity. A, Jurkat cells (clone A3) and human activated-T cells derived from

28

three healthy volunteers were incubated for the indicated times in the presence or

absence of 500 ng/mL FasL. B and C, Jurkat cells (clone A3), caspase-8-deficient

Jurkat cells (clone I9-2), mock-transfected Jurkat cells (clone E6) and Bcl-xL over-

expressing cells (Bcl-xL) were pre-incubated for one hour in the presence or absence

of 40 µM zVAD-fmk and further incubated for 8 hours with or without the indicated

concentrations of FasL. Two hours before stopping the reaction, 2.5 µM C6-NBD-

ceramide was added to the cell culture medium. SMS and GCS activities were

determined by quantifying fluorescent SM and GlcCer. Results are expressed as the

% of the activities measured in the absence of FasL. Data are means ± s.e.m. of

three independent experiments. C insert, Western blotting of protein extracts from E6

and Bcl-xL over-expressing cells with anti-Bcl-xL and anti-β-actin antibodies.

Figure 3, D609 inhibits SMS and enhances FasL-induced Jurkat cell death. A,

Jurkat cells (clone A3) were incubated in the presence or absence of 50 µg/mL D609

for one hour and further incubated for 2 hours in the presence of 2.5 µM C6-NBD-

ceramide. SMS and GCS activities were determined by quantifying fluorescent SM

and GlcCer. Endogenous ceramide content was evaluated by DAG kinase assay

after a 3-hour incubation in the presence of 50 µg/mL D609. Results are expressed

as the % of the values measured in the absence of D609. Data are means ± s.e.m. of

three independent experiments. B and C, Jurkat cells were pre-incubated in the

presence or absence of 50 µg/mL D609 for one hour and further incubated with or

without FasL. A3 cells and I9-2 cells (i.e., caspase-8-deficient cells) were treated with

10 ng/mL FasL for 8 hours and 50 ng/mL FasL for 16 hours, respectively. B,

Caspase activation was evaluated by Western blot using anti-caspase-3 or anti-

PARP antibodies. Anti-β-actin antibody was used as a control. C, Phosphatidylserine

29

exposure at the cell surface and membrane permeability were monitored by flow

cytometry after annexin-V-FITC and propidium iodide labeling. The percentage of

annexin-V-FITC-positive and propidium iodide-negative cells is indicated in the lower

right quadrants. The percentage of propidium iodide-positive cells is indicated in the

upper right quadrants. B and C, Data are representative of 3 independent

experiments. D, Jurkat cells (clone A3) were pre-incubated for one hour with or

without 40 µM zVAD-fmk or a combination of 40 µM zVAD-fmk and 50 µg/mL D609.

Cells were further incubated for 16 hours with or without FasL (50 or 500 ng/mL, as

indicated). Cell death was evaluated by flow cytometry after annexin-V-FITC and

propidium iodide labeling. Under these experimental conditions, most of the dead

cells were labeled by both annexin-V-FITC and propidium iodide. Ceramide content

was monitored by DAG kinase assay. Data are means ± s.e.m. of three independent

experiments.

Figure 4, D609 inhibits SMS activity and enhances FasL-induced cell death in

activated human T lymphocytes. A-C, Human PBL derived from three healthy

volunteers were cultured for 6 days in the presence of 1 µg/mL PHA and IL-2 (20

I.U./mL). A, Cells were pre-incubated in the presence or absence of 50 µg/mL D609

for one hour and further incubated for 2 hours in the presence of 2.5 µM C6-NBD-

ceramide. SMS and GCS activities were determined by quantifying fluorescent SM

and GlcCer. Results are expressed as the % of the activities measured in the

absence of D609. Data are means ± s.e.m. of three independent experiments. B-C,

activated PBL were pre-incubated for one hour with or without 40 µM zVAD-fmk and

50 µg/mL D609 as indicated. Cells were further incubated for 16 hours in the

presence or absence of 500 ng/mL FasL. B, The percentage of hypodiploid cells was

30

determined by flow cytometry. Basal hypodiploidy in untreated cells did not exceed

15% in all conditions and was subtracted from the values. Values are means ± s.e.m.

of three independent experiments. C, PS externalization was measured by flow

cytometry after annexin-V-FITC and propidium iodide staining. Analysis was

restricted to propidium iodide-negative cells to exclude cellular debris derived from

non-activated lymphocytes. Data are representative of three independent

experiments.

Figure 5, SMS1 silencing alters sphingolipid metabolism and enhances FasL-

induced ceramide production. A, SMS1, SMS2 and GAPDH mRNA expression in

A3, SMS1 knockdown (KD) and control (Ct) Jurkat cells as well as in human skin

fibroblasts (F), was analyzed by RT-PCR. Vectors (V) containing either SMS1 or

SMS2 cDNA were used as positive controls for PCR. B, SMS1 KD and control Jurkat

cells were incubated in the presence of 2.5 µM C6-NBD-ceramide for 2 hours. SMS

and GCS activities were determined by quantifying fluorescent SM and GlcCer. SMS

and GCS activities in SMS1-KD Jurkat cells are expressed as the % of those

measured in control cells. Data are means ± s.e.m. of three independent

experiments. C, Cells were incubated in the presence of 1 µCi/mL of [3H]choline for

48-72 hours. After a 2-hour chase, cells were collected and [3H]choline-labeled SM

and PC were quantified after alkaline hydrolysis. SM and PC contents in SMS1 KD

Jurkat cells are expressed as the % of those measured in control cells (means ±

s.e.m., n=5). D, Cells were incubated for 8 hours in the presence or absence of 100

ng/mL FasL. Ceramide and DAG contents were determined by DAG kinase assay

(means ± s.e.m., n=4). E, Cells were labeled with 0.33 µCi/mL [3H]sphingosine for 72

hours. After 2-hour chase, cells were incubated in the presence or absence of 100

31

ng/mL FasL for 4 hours. Lipids were extracted, separated by TLC and radioactivity

associated to sphingomyelin (SM) and ceramide (Cer) was quantified. Each lipid is

expressed as the % of total sphingolipids present in the organic phase. Values are

means ± s.e.m. of duplicate determinations. Similar data were obtained in two other

experiments.

Figure 6, SMS1 silencing enhances FasL-induced caspase-dependent and -

independent cell death. A and B, SMS1 KD and control Jurkat cells were incubated

for 8 hours in the presence of FasL [100 ng/mL (A) or the indicated concentrations

(B)] and analyzed by flow cytometry after annexin-V-FITC and propidium iodide

labeling. Values are means ± s.e.m. of three independent experiments. C, Cells were

incubated for the indicated times in the presence of 100 ng/mL FasL. Proteins were

extracted and analyzed by Western blotting using anti-caspase-8, anti-caspase-3,

anti-PARP and anti-β-actin antibodies. Results are representative of two independent

experiments. D and E, Cells were incubated in the presence of 40 µM zVAD-fmk for

one hour and further incubated for 8 hours with 500 ng/mL FasL. D, Cell death was

evaluated by flow cytometry after annexin-V-FITC and propidium iodide labeling.

Under these experimental conditions, most of the dead cells were positive for both

annexin-V-FITC and propidium iodide. E, Ceramide and DAG contents were

determined by DAG kinase assay (D and E, means ± s.e.m., n=4).

1000

500

0

CPM

Distance (cm)Distance (cm)

Figure 1

A Untreated FasL

B

0 3 6 9 12 15 18 0 3 6 9 12 15 18

SM CerGlcCer

LacCer SM Cer

GlcCer

LacCer

C

Apo

ptot

ic n

ucle

i (%

)

0 1 2 43Time (hours)

10080604020

0 De

novo

SM

syn

thes

is(%

of c

ontr

ol)

**

100806040200

0 1 2 43Time (hours)

D

0 1 2 3 45560

70

Time (hours)

Sph

ingo

lipid

(% o

f tot

al)

SM

Milhas et al.

65

75

0

6

4

2

LacCer

0 1 2 3 4Time (hours)Time (hours)

GlcCer

0

6

4

2

0 1 2 3 4Time (hours)

20

10

Cer25

15

50 1 2 3 4

N.I. N.I.1000

500

0

**

*

**

*

*

Figure 2

In s

itu G

CS

activ

ity

(% o

f con

trol

)

In s

itu S

MS

activ

ity

(% o

f con

trol

)

020406080

100120

10 50 500FasL (ng/ml)

10 50 500FasL (ng/ml)

A3 A3 + zVAD

5010FasL (ng/ml)

500

In s

itu S

MS

activ

ity(%

of c

ontr

ol)

0

40

100

80

20

60Bcl-xLE6

140

020406080

100120140

Δcaspase-8

E6 Bcl-xL

β-actinBcl-xL

B

C

In s

itu a

ctiv

ity(%

of c

ontr

ol)

020406080

100120

2 4 8Time (hours)

T cells

SMS GCS

020406080

100120

8Time (hours)

Jurkat

A

Milhas et al.

*

**

*

**

*

* *

* **

*

n.s.

n.s.

n.s.

A

A3 none 7H

100

101

102

103

104

Annexin V FITC

A3 D609 7H

100

101

102

103

104

Annexin V FITC

A3 Fas L 1/100 7H

100

101

102

103

104

Annexin V FITC

A3 D609 FasL 1/100 7H

100

101

102

103

104

Annexin V FITC

FasL - - + +D609 - + - +

Annexin-V-FITC

2 5 38 61

6 6 8 7

Figure 3

Pro-caspase-3

β-actin

D609FasL

-+

--

Cleaved caspase-3

PARP

I9-2d none 16h

100

101

102

103

104

AnnexineV-FITC

3

5

Prop

idiu

m io

dide

I9-2d FasL 50 16h

100

101

102

103

104

AnnexineV-FITC

I9-2d FasL 50 D609 16h

100

101

102

103

104

AnnexineV-FITC

10

6

18

17

I9-2d D609 16h

100

101

102

103

104

AnnexineV-FITC

5

7

806040200

100

Dea

d ce

lls (%

)

0 50 500FasL (ng/mL)

zVAD

zVAD + D609

None

9080706050

% o

f con

trol

*

100

SMS GCS

++

+-

B

C

D

Milhas et al.

n.s.

A3

I9-2

*

2518

13

4879

kDa

600500400300200100

Cer

amid

e (%

of c

ontr

ol)

500FasL (ng/mL)

*

200

175

100

125

150

*

Ceramide

*

Figure 4

zVADD609FasL

+--

-+-

++-

--+

-++

+-+

+++

B

Hyp

odip

loid

cel

ls (%

) 50

40

30

20

0

10

*

*

1 IL2

100

101

102

103

104

Annexin V FITC

1 D609

100

101

102

103

104

Annexin V FITC

1 Fas 500

100

101

102

103

104

Annexin V FITC

1 FasL 500 D609

100

101

102

103

104

Annexin V FITC

1 zVAD

100

101

102

103

104

Annexin V FITC

1 D609 zVAD

100

101

102

103

104

Annexin V FITC

1 Fas 500 zVAD

100

101

102

103

104

Annexin V FITC

1 FasL 500 D609 zVAD

100

101

102

103

104

Annexin V FITCAnnexin-V-FITC

Cel

l num

ber

None

D609

FasLzVAD

--

-+

+-

++

11.5 2912 14

15 5213.5 29

C

90

80

70

60

50

In s

itu a

ctiv

ity(%

of c

ontr

ol)

100

SMS GCS

A

Milhas et al.

*

n.s.

In s

itu a

ctiv

ity(%

of c

ontr

ol)

SMS GCS

Figure 5

Cer

amid

e (n

mol

/mg)

0

0.5

1

1.5

2 *

100

75

50

125

*

n.s.B C

Milhas et al.

80

70

60

50

SM

FasL - +

Cer

- +

20

15

10

0

5Sphi

ngol

ipid

(% o

f tot

al)

E

DD

AG

(nm

ol/m

g)

00.5

11.5

22.5

SM PC

80

100

120

140

[3 H]c

holin

e lip

id(%

of c

ontr

ol)

*

*

FasL - + - +

Control Jurkat cells SMS1 KD Jurkat cells

SMS1SMS2

GAPDH

A3 KDCt

AF V

Figure 6

30

20

0

10

Dea

d ce

lls (

%)

Milhas et al.

nmol

/mg

0

0.5

1

1.5

2ED

FasLzVAD

None

Cont SMS hFasL 100 6h30

100

101

102

103

104

AnnexineV-FITC

si RNA SMS hFasL 100 6h30

100

101

102

103

104

AnnexineV-FITC

Cont SMS none 6h30

100

101

102

103

104

AnnexineV-FITC

si RNA SMS none 6h30

100

101

102

103

104

AnnexineV-FITC

FasL

Annexin-V-FITC

Prop

idiu

m io

dide

2

4

23

5

4

5

60

12

Untreated

Control

SMS1 KD

20 50 1000 200FasL (ng/ml)

100

80

60

40

0

20

Ann

exin

-V p

ositi

ve c

ells

(%)

A

DAGCer

B

β-actinPARP

Time (h) 0 2 4 8 0 2 4 8

Control SMS1 KD

Pro-casp-3

Cleavedcasp-3

Pro-casp-8

Cleavedcasp-8

C

*

**

p=0.07

*

Control Jurkat cells

SMS1 KD Jurkat cells

*

FasL + zVAD

5543

17

34

17

7943

kDa

Control Jurkat cells SMS1 KD Jurkat cells

83

IV-4 Conclusions de l’article 3

IV-4-1 Inhibition de l’activité de la SMS dans la signalisation de Fas

Cette étude montre que dans des cellules leucémiques T de type Jurkat, FasL induit

une inhibition de la synthèse de sphingomyéline concomitante à une accumulation

intracellulaire de céramide et à l’induction d’une mort cellulaire. Le z-VAD ou la déficience

en caspase-8 préviennent l’inhibition de l’activité de la SMS en réponse à de faibles

concentrations de FasL, mais pas à de fortes doses. Ceci confirme un rôle majeur des

caspases dans l’inhibition de la synthèse de SM (Watanabe et al., 2004) et suggère que des

phénomènes indépendants de l’activité catalytique des caspases peuvent participer à cette

inhibition. A l’inverse, la surexpression de Bcl-xL n’affecte pas la diminution de l’activité de

la SMS en réponse à la stimulation de Fas, suggérant que l’inhibition de la SMS est un

évènement précoce dans la signalisation de Fas, qui intervient en amont de la mitochondrie.

a- Inhibition dépendante de l’activité catalytique des caspases

L’activité catalytique des caspases apparaît prépondérante dans l’inhibition de la

synthèse de SM. Aussi, plusieurs mécanismes d’inhibition de la SMS impliquant l’activité

catalytique des caspases peuvent être envisagés : (i) la SMS pourrait être un substrat direct

des caspases (hypothèse1) ; (ii) l’altération de la structure du Golgi par les caspases pourrait

inhiber indirectement l’activité de la SMS1 (hypothèse 2) (iii) la diminution du taux

intragolgien des substrats (céramide et PC) de la SMS pourrait participer à la diminution de la

synthèse de SM (hypothèse 3).

Hypothèse 1 : Des analyses bioinformatiques mettent en évidence des sites potentiels

de clivage pour les caspases sur la séquence protéique de la SMS1, principalement après

l’acide aspartique en position 327 contenu dans le motif peptidique LAHD↓H (tableau 5)

(Backes et al., 2005). Le résidu histidine situé après l’acide aspartique 327 fait partie du site

catalytique de la SMS1 (Huitema et al., 2004). Ainsi, un clivage par les caspases au niveau de

ce résidu pourrait altérer l’activité de la SMS. Les caspases initiatrices, en particulier la

caspase-2, semblent susceptibles de cliver la SMS1 au niveau de ce site (Tableau 5). Le motif

peptidique LAHD↓H est situé sur une boucle extra membranaire du côté luminal du Golgi.

La caspase-2 étant localisée dans le noyau mais aussi dans le Golgi, un clivage de la SMS1

par cette caspase est donc envisageable. En outre, aucun site de clivage par la caspase-2 n’est

84

prédit pour la GCS, ce qui pourrait expliquer l’inhibition sélective de la SMS dans la

signalisation de Fas. La SMS2 pourrait aussi être un substrat des caspases. Les scores les plus

élevés sont obtenus pour les caspases effectrices -3 et -7 au niveau de la séquence DYID↓R

(122).

Finalement, d’après ces prédictions bioinformatiques, la SMS1 pourrait être clivée par

les caspases initiatrices, tandis que la SMS2 serait une cible des caspases effectrices.

Cependant, pour la SMS2, le motif peptidique étant localisé sur une boucle extracellulaire de

l’enzyme, l’accès au site de clivage par les caspases cytosoliques pourrait être limité. Nos

résultats montrent que l’inhibition de la SMS est un évènement précoce dans la signalisation

de Fas. Ainsi, il est possible d’envisager un clivage de la SMS1 par les caspases initiatrices

qui permettrait une inhibition précoce de l’activité de la SMS. De plus, l’inhibition de la

SMS2 par les caspases effectrices pourrait constituer un évènement tardif dans la

signalisation apoptotique.

Nos travaux en cours consistent à déterminer si la SMS est un substrat des caspases, en

particulier de la caspase initiatrice -2.

SMS1

LAHD↓H (327)

SMS2

DYID↓R (122)

CERT

VDHD↓S (510)

Caspase-2 27.2 2.7 0

Caspase-8 1.4 2.3 4

Caspase-9 8.5 0 18.6

Caspase-3 0 18.2 0

Caspase-6 2.4 0 17.6

Caspase-7 0 14.4 0

Tableau 5 : Sites potentiels de clivage par les caspases sur les séquences protéiques de la SMS1, la SMS2 et de CERT. Le motif peptidique susceptible d’être clivé ainsi que le score

obtenu pour chaque caspase sont indiqués. Les chiffres entre parenthèses indiquent la

position du site de clivage dans la séquence en acides aminés.

Hypothèse 2 : La caspase-2 participe à la fragmentation du Golgi en clivant

notamment la protéine golgienne golgin-160 au cours de l’apoptose induite par la

staurosporine (Mancini et al., 2000). De même, le clivage de golgin-160 et de p115, une autre

protéine golgienne, par les caspases, sont des événements précoces dans la signalisation

apoptotique de Fas qui favorisent la fragmentation du Golgi (Mukherjee et al., 2007). Ainsi,

85

la fragmentation du Golgi observée au cours de l’apoptose induite par FasL pourrait altérer

indirectement l’activité de la SMS. Toutefois, nos résultats indiquent que l’activité de la GCS

n’est pas affectée en réponse à FasL dans les cellules Jurkat. Comme cette enzyme est

également localisée au niveau du Golgi, cette hypothèse est peu probable. Cependant, la

localisation différentielle des sites catalytiques de la SMS et de la GCS, respectivement sur la

face luminale et cytosolique du Golgi, pourrait expliquer une altération sélective de l’activité

de la SMS.

Hypothèse 3 : Le céramide nécessite un transport, médié par CERT, du RE à

l’appareil de Golgi, pour sa conversion en SM. Les caspases-6 et -9 possèdent un site

potentiel de clivage sur la séquence de CERT avec des scores élevés (Tableau 5). Ce motif

peptidique est situé au niveau du domaine START, un domaine de transfert de lipide qui

permet à CERT d’intéragir avec le céramide (Hanada et al., 2003). Un clivage de CERT par

les caspases pourrait prévenir l’adressage du céramide à l’appareil de Golgi. Ceci pourrait

provoquer un défaut de substrat pour la SMS entraînant l’inhibition de son activité.

Nos résultats préliminaires montrent une inhibition de la synthèse des PC en réponse à

FasL qui pourrait participer à l’inhibition de la synthèse de novo de SM (Figure 27A). Une

enzyme limitante de la voie de biosynthèse des PC, la CCTα (CTP : phosphocholine

cytidylyltransferase) (Figure 26), est une cible des caspases au cours de l’apoptose. Le

clivage de la CCTα par les caspases-6 et -8, au niveau du domaine de localisation nucléaire

(NLS, Nuclear Localization Signal) en N terminal, entraîne son exclusion du noyau, ce qui

conduit à la diminution de la synthèse des PC (Lagace et al., 2002).

Figure 26 : Voie de biosynthèse de novo des phosphatidylcholine (PtdCho) (Lagace et al.,

2002).

En accord avec cette hypothèse, un clivage de la CCTα est observé par western blot dans des

cellules Jurkat traitées par FasL (Figure 27 B). Le fragment généré possède une taille

légèrement inférieure à 37 KDa, suggérant un clivage en N-terminal de la CCTα, au niveau

de la NLS.

86

Temps (heures)

[3-H

-Ch

oli

ne]

PC

(d

pm

)

CCTαααα

0 100 500FasL (ng/ml)B

37KDa

0

0

1

50000

100000

150000

3 42

A

Figure 27 : Inhibition de la synthèse des PC et clivage de la CCTαααα en réponse à FasL.

A, Les cellules Jurkat A3 ont été incubées en présence de [3H]-Choline pendant 4 heures puis

en présence (�), ou en absence (�) de 500 ng/ml de FasL pendant les temps indiqués. La

radioactivité associée au PC a été mesurée après méthanolyse alcaline. Les résultats

correspondent à la moyenne ± ESM de quatre expériences indépendantes. B, L’expression de

CCTα a été analysée par Western Blot à partir d’extraits protéiques totaux de cellules Jurkat

A3 incubées en présence des concentrations indiquées de FasL pendant 8 heures. La flèche

indique la forme clivée de CCTα. Les résultats sont représentatifs de trois expériences

indépendantes.

Cependant, l’inhibition de la SMS en réponse à FasL est également détectée par

dosage de l’activité de l’enzyme in vitro, dans des conditions où les PC et le céramide

exogène sont en excès. (Figure 28). Il est à noter que la GCS est inhibée uniquement à la plus

forte concentration de FasL, en accord avec nos observations in situ. De plus, l’inhibition de

la SMS est moindre comparée à celle observée par dosage des activités enzymatiques in situ.

En effet, 500 ng/ml de FasL n’induisent que 50% d’inhibition de l’activité de la SMS in vitro,

alors que dans les mêmes conditions, le dosage in situ indique une inhibition complète de la

SMS. Ceci suggère que plusieurs mécanismes (dont ceux cités ci-dessus) pourraient être

impliqués dans l’inhibition de la SMS. Afin d’évaluer si la diminution de la synthèse de novo

de PC participe à l’inhibition de la synthèse de SM, nous envisageons d’incuber les cellules

Jurkat en présence de PC exogènes et d’évaluer les conséquences sur l’activité de la SMS et

sur la toxicité induite par FasL.

87

0

20

40

60

80

100

120

10 50 500

FasL (ng/ml)

Ac

tiv

ité

(%

of

co

ntr

ol)

Figure 28 : Inhibition de l’activité de la SMS in vitro en réponse à FasL. Les activités enzymatiques de la SMS (�) et de la GCS (�) ont été dosées in vitro à partir

d’extraits protéiques de cellules A3 traitées par FasL aux concentrations indiquées pendant 8

heures. Les résultats sont représentatifs de deux expériences indépendantes et correspondent

à la moyenne ± ESM des doubles d’une expérience.

b- Inhibition indépendante de l’activité catalytique des caspases

RIP pourrait participer à l’inhibition de la SMS dans la signalisation de Fas. En effet,

un rôle essentiel de RIP dans l’induction de la mort indépendante de l’activité caspase a été

montré par l’équipe de Tschopp (Holler et al., 2000). Nos travaux confirment ces résultats et

montrent que des cellules déficientes en RIP (Figure 29A) résistent totalement à la mort en

réponse à FasL, en présence de z-VAD (Figure 29B). L’augmentation du taux intracellulaire

de céramide, ainsi que l’inhibition de l’activité de la SMS, observés dans la mort

indépendante de l’activité caspase induite par FasL, sont totalement bloqués par la déficience

en RIP (Figure 29C et D). Ceci suggère un rôle de la protéine RIP dans l’inhibition de

l’activité de la SMS et la production de céramide, au cours de la signalisation indépendante

de l’activité des caspases et émanant du récepteur Fas. RIP a été impliqué dans la production

de céramide et de ROS dans la signalisation indépendante de l’activité caspase du TNFR-1

(Lin et al., 2004b; Thon et al., 2005). Comme les ROS peuvent interférer avec le

métabolisme sphingolipidique (Andrieu-Abadie et al., 2001), il est possible d’envisager une

inhibition de la SMS par les ROS. Une meilleure compréhension de la signalisation en aval

de RIP et en particulier la découverte de ses substrats dans la signalisation cytotoxique

permettront de définir les mécanismes reliant RIP et l’inhibition de la SMS. En outre, comme

l’activité de la caspase-2 est faiblement inhibée par le z-VAD (Tableau 3), il est possible

d’envisager une inhibition de la SMS par l’activité résiduelle de la caspase-2.

88

Rip+ Rip-

Rip

ββββ-actin

In s

itu

SM

S a

civ

ity

(%o

fco

ntr

ol)

Cera

mid

e(n

mo

l/m

g)

FasLzVAD

FasLzVAD

100

90

80

70

60

50

1000

800

600

400

200

0

Mo

rtality

(%)

FasLzVAD

50

40

30

20

10

60

none

BA

C D

Figure 29 : Rôle de la protéine RIP dans la signalisation caspase-indépendante de Fas A, L’expression de RIP et de la β-Actine a été analysée par Western Blot à partir d’extraits

protéiques totaux de cellules parentales (RIP+) et de cellules déficientes en RIP (RIP

-). B, C,

D, Les cellules RIP+ (�) et RIP

- (�) ont été pré-incubées en présence de z-VAD (40 µM)

pendant 1 heure puis incubées pendant 8 heures en présence, ou non, de FasL (500 ng/ml). B,

Les cellules ont été analysées en cytométrie en flux après marquage à l’annexine-V et à

l’iodure de propidium. Le pourcentage de cellules mortes correspond au pourcentage de

cellules positives pour les deux marqueurs. C, Le céramide a été dosé selon la méthode de la

DAG kinase. D, L’activité de la SMS a été évaluée par mesure de la conversion de C6-NBD-

céramide en C6-NBD-SM. Les résultats sont les moyennes de trois expériences

indépendantes.

89

IV-4-2 L’inhibition de la SMS sensibilise les lymphocytes T à la mort induite par

FasL

Le D609, un inhibiteur de la SMS, qui induit une augmentation transitoire du taux

intracellulaire de céramide, sensibilise les cellules Jurkat et les PBL à l’apoptose et à la mort

indépendante de l’activité catalytique des caspases en réponse à FasL. De plus, des cellules

qui surexpriment de façon stable un siRNA dirigé contre la SMS1 sont significativement plus

sensibles à la mort dépendante et indépendante de l’activité catalytique des caspases induite

par FasL. L’accumulation de céramide en réponse à FasL est potentialisée dans ces cellules.

L’ensemble de ces résultats est en faveur d’un rôle de l’inhibition de l’activité de la SMS1

dans la production de céramide et la mort (dépendante et indépendante de l’activité

catalytique des caspases) des lymphocytes T en réponse à FasL. Dans une étude récente, la

surexpression de la SMS1 dans les cellules Jurkat prévient l’accumulation de céramide et

l’apoptose en réponse à la thérapie photodynamique (Separovic et al., 2007). Ceci renforçe

l’hypothèse selon laquelle l’inhibition de la SMS participe à la production de céramide,

potentiellement impliqué dans la mort des cellules.

Plusieurs hypothèses pourraient expliquer la sensibilisation des cellules à la mort

induite par FasL par l’inhibition de la SMS. L’inhibition de la SMS1 qui est localisée dans le

Golgi pourrait prévenir la conversion du céramide en SM au niveau du feuillet luminal de la

membrane Golgienne et favoriser l’accumulation de céramide dans ce compartiment

subcellulaire. Le céramide pourrait alors induire la fragmentation du Golgi, un phénomène

observé au cours de l’apoptose induite par l’activation de Fas (Mukherjee et al., 2007). Ainsi

le traitement de cellules HeLa par du C6-céramide exogène qui s’accumule dans le golgi,

induit une fragmentation des structures golgiennes. Ceci entraîne une désorganisation des

microtubules et du cytosquelette d’actine ainsi qu’une inhibition de l’adhésion cellulaire,

conduisant à la mort cellulaire (Hu et al., 2005). En outre, le céramide accumulé en

intracellulaire pourrait agir sur la perméabilisation d’autres organelles comme la

mitochondrie ou le lysosome pour favoriser le relargage de protéines impliquées dans la

signalisation cytotoxique comme le cytochrome c, AIF ou les cathepsines.

La SM produite au niveau du Golgi est ensuite transportée à la membrane plasmique

où elle participe à la formation des microdomaines lipidiques. L’inhibition de la SMS

pourrait entraîner une perturbation de la structure des rafts membranaires en favorisant

notamment la diminution des taux de SM et l’augmentation des taux de céramide. Ainsi,

l’inhibition de l’activité de la SMS1 dans des cellules surexprimant un siRNA dirigé contre la

90

SMS1 entraîne une baisse du taux de SM dans les microdomaines de la membrane plasmique

(Li et al., 2007). L’accumulation de céramide dans les rafts lipidiques de la membrane

plasmique pourrait favoriser l’agrégation du récepteur Fas, permettant une activation efficace

du récepteur et une amplification de la cascade apoptotique (Cremesti et al., 2001). Le

traitement des cellules Jurkat avec de la SMase bactérienne exogène, qui hydrolyse la SM au

niveau du feuillet externe de la membrane plasmique, diminue drastiquement le taux de SM

et augmente le taux de céramide (Figure 30A). Cependant, ce traitement n’affecte pas la

sensibilité des cellules à la mort induite par FasL en présence ou en absence de z-VAD

(Figure 30B). Ceci suggère que, dans notre modèle, la SM et le céramide de la membrane

plasmique ne semblent pas jouer un rôle majeur dans la modulation de la signalisation

apoptotique.

Jurkat + SMase

A

0

10

20

30

40

50

60

Mo

rta

lité

(%)

Cont FasL FasLzVAD

BJurkat CerSM

Figure 30 : La SMase bactérienne n’a aucun effet sur la mort de cellules Jurkat induite par FasL. A, Les cellules Jurkat A3 ont été incubées en présence de [

3H]-sphingosine

(0,33µCi/ml) pendant 16 heures. Les cellules ont été traitées (�), ou non (�), pendant 30

minutes avec 0,1 unité/mL de SMase bactérienne puis les lipides ont été extraits et le profil

sphingolipidique a été analysé à l’aide d’un radiochromatoscanner. Les images sont

représentatives de trois expériences indépendantes. B, Les cellules ont été incubées, ou non

(Cont), pendant 6 heures en présence de FasL (10 ng/ml) ou en présence de FasL (500 ng/ml)

et de z-VAD (40 µM). Les résultats sont les moyennes ± ESM de trois à quatre expériences

indépendantes.

91

IV-5 De nouveaux analogues de céramide induisent une toxicité dépendante et

indépendante de l’activité catalytique des caspases

Pour évaluer le rôle potentiel du céramide dans la mort dépendante et indépendante de

l’activité caspase dans les cellules Jurkat, nous avons incubé ces cellules en présence de

nouveaux analogues de synthèse de céramide. Ces analogues (AD2646 et AD2687),

synthétisés par le groupe de Shimon Gatt, interfèrent avec le métabolisme sphingolipidique,

provoquent une augmentation du taux intracellulaire de céramide et induisent l’apoptose de

cellules leucémiques myéloïdes HL-60 (Dagan et al., 2003).

IV-5-1 Objectif et stratégie expérimentale de l’article 4

L’objectif de cette étude est de mieux caractériser le potentiel cytotoxique

d’analogues du céramide en évaluant notamment le rôle des caspases et de la mitochondrie

dans la signalisation de mort. Pour évaluer l’implication des caspases dans les effets

cytotoxiques des analogues de céramide : (i) nous avons testé l’effet du z-VAD sur la mort de

cellules Jurkat induite par l’AD2646 et l’AD2687 ; (ii) la sensibilité de cellules Jurkat

déficientes en caspase-8 et -10 (cellules Jurkat I9-2e) vis-à-vis de ces analogues ; (ii) l’effet

de l’AD2646 et l’AD2687 sur l’activation des caspases. La mitochondrie ayant un rôle

potentiel dans les effets du céramide, nous avons évalué l’effet de la surexpression de Bcl-xL

sur la mort et sur l’augmentation du taux de céramide endogène induites par ces analogues

dans des cellules Jurkat.

ARTICLE 4

Granot, T.*, Milhas, D.*, Carpentier, S., Dagan, A., Segui, B., Gatt, S., and Levade, T.

(2006). Caspase-dependent and -independent cell death of Jurkat human leukemia cells

induced by novel synthetic ceramide analogs. Leukemia 20(3), 392-9. (* co-auteurs).

ORIGINAL ARTICLE

Caspase-dependent and -independent cell death of Jurkat human leukemia cells inducedby novel synthetic ceramide analogs

T Granot1,3, D Milhas2,3, S Carpentier2, A Dagan1, B Segui2, S Gatt1,3 and T Levade2,3

1Department of Biochemistry, Hebrew University-Hadassah School of Medicine, Jerusalem, Israel and 2INSERM, U466,and Laboratoire de Biochimie, CHU Rangueil, Toulouse, France

Ceramide metabolism has emerged as a potential target foranticancer therapy. Here, the potential usefulness of two novelsynthetic ceramide analogs as anti-leukemic drugs wasinvestigated. Compounds AD2646 and AD2687 were able todose-and time-dependently decrease the viability of Jurkatleukemic cells. This was accompanied by an accumulationof endogenous ceramide owing to perturbed ceramide meta-bolism. Cytotoxicity involved caspase activation but alsonecrotic-like features, as evidenced by phosphatidylserineexternalization, membrane permeability, hypodiploidy, caspaseprocessing and only partial protection from cell death by apan-caspase inhibitor. Ceramide analogs also induced celldeath in Jurkat mutants that are deficient in cell death signalingproteins, including FADD, caspase-8 and 10, and RIP. Whileoverexpression of Bcl-xL did not suppress ceramide accumula-tion, it conferred robust protection from caspase activation andcell death. Altogether, these novel ceramide analogs are able tokill leukemic cells through distinct pathways implicatingcaspase activation and mitochondrial events, and represent anew group of bioactive molecules with potential applications inanticancer therapy.Leukemia (2006) 20, 392–399. doi:10.1038/sj.leu.2404084;published online 5 January 2006Keywords: ceramide; apoptosis; sphingolipid; Bcl-xL; leukemia;anticancer drug

Introduction

Sphingolipids are now recognized as a novel class ofbiomodulators that can regulate a wide spectrum of cellularresponses, including cell death. In particular, sphingomyelin(SM) metabolites, such as ceramide and sphingosine1-phosphate, behave as tumor-suppressor or tumor-promotinglipid mediators, respectively. Recent interest has thus emergedon the potential use of ceramide in the treatment of severalpathological conditions, and notably in cancer (for a recentreview, see Ogretmen and Hannun1).

Since the pioneering work by Obeid and Hannun on theinduction of apoptosis of leukemic cells by exogenousceramide,2 numerous studies have established the cytotoxiceffect of this lipid. Not only can stress agents, includingcytokines, chemotherapeutic drugs, ionizing radiation andphotodynamic therapy, promote the production and intracel-lular accumulation of ceramide before the onset of apoptosis,

but also addition of exogenous, either short-chain or long-chain(natural) ceramides to a variety of tumor or leukemia cell typeslead to cell death.1 In addition, genetic or pharmacologicalmanipulation of ceramide-metabolizing enzymes results inelevation of intracellular concentration of ceramide andsubsequent cell death.

As sphingolipids can affect many aspects of cancer pathogen-esis, and because defects of ceramide production have beenobserved in tumor cells and multidrug resistant cells,1 anti-cancer therapeutic strategies aiming at restoring a normalmetabolism or the accumulation of ceramide have been recentlydeveloped.3,4 Owing to the complexity of ceramide metabo-lism, interfering with the enzymatic biosynthesis or degradationof ceramide, or its conversion to other, non-antiproliferativesphingolipids, is likely to require a multi-target approach. Thisconcept, also justified by the fact that cancer cells could adaptthemselves to a single alteration, is illustrated by the recent useof a poly-drug chemotherapy aiming at blocking simultaneouslydifferent pathways of ceramide metabolism.5 Whereas thisapproach needs to target several pathways concomitantly,another (complementary) strategy is the administration of anexogenous ceramide analog or mimetic to directly inducecancer cell death. Addition of synthetic short-chain ceramides,ceramines, C16- or C18-serinols, cationic ceramides as well assome other analogs was reported to mimic ceramide in inducingapoptosis in various cancer or leukemia cell lines, and, in someinstances, to reduce the mass of xenografted tumors.6–15 Theseobservations have emphasized the potential usefulness ofdeveloping novel, ceramide-based chemotherapeutic agentsfor anticancer treatment.

In this study, we further investigated the cytotoxic propertiesof novel ceramide analogs, AD2646 and AD2687, that werecently synthesized.16 Their ability to kill leukemic T cells, andthe cell death signaling pathways they trigger were investigated.We show that these ceramide analogs affect intracellularsphingolipid metabolism, elevate ceramide content, and pro-mote a Bcl-xL-inhibitable cell death.

Materials and methods

Materials and ceramide analogsThe procedures for synthesis of ceramide analogs AD2646 andAD2687, and Bodipy-C3-ceramide, as well as the structures ofthese compounds (see also Figure 1), have been reported.16

zVAD-fmk was purchased from Bachem (Voisins-Le-Breton-neux, France). Polyclonal anti-caspase-8 was a kind gift fromDr G Cohen (Leicester, UK). Polyclonal anti-caspase-3 wasobtained from Dako (Trappes, France). Polyclonal anti-PARPand anti-caspase-9 were from Cell Signaling Technology (Saint-Quentin-en-Yvelines, France). Monoclonal anti-b-actin was

Received 13 July 2005; revised 2 November 2005; accepted 18November 2005; published online 5 January 2006

Correspondence: Professor T Levade, INSERM U466, Laboratoire deBiochimie, Institut Louis Bugnard, Centre Hospitalier Universitaire deRangueil, BP 84225, 31432 Toulouse Cedex 4, France.E-mail: levade@toulouse.inserm.fr or levade.t@chu-toulouse.fr3These authors contributed equally to this work.

Leukemia (2006) 20, 392–399& 2006 Nature Publishing Group All rights reserved 0887-6924/06 $30.00

www.nature.com/leu

from Sigma (Saint-Quentin Fallavier, France). Human recombi-nant FasL was obtained from Abcys (Paris, France).

Cell cultureHuman T-cell leukemic Jurkat cells were from ATCC. Jurkatclones, transfected with an empty vector (Jurkat/neo) or with aBcl-xL expressing vector (Jurkat-Bcl-xL),17 were kindly providedby Dr O Cuvillier (INSERM U.466, Toulouse, France). Jurkatclone I9-2e, deficient for caspase-8 and having a low caspase-10 level, has previously been described.18 Jurkat cells weregrown in RPMI 1640 medium containing Glutamax and 10%

heat-inactivated FCS (Invitrogen, Cergy-Pontoise, France, orKibbutz Beth Ha’Emek, Israel). When testing the effects ofceramide analogs on cells, ceramide analogs were added to thecells as ethanolic or DMSO solutions; the concentration of thesolvent did not exceed 0.5% for ethanol and 0.1% for DMSO.

Cell viability, flow cytometry and morphologicalanalysesCell viability was assessed using the MTT test. Cell morphologywas analyzed using Syto 13 and propidium iodide (PI),

0 2 4 6 8 10

0

25

50

75

100

125

Concentration (µM)

Via

bili

ty (

%)

Via

bili

ty (

%)

Via

bili

ty (

%)

0

20

40

60

80

100

0 2 4 6 8 10

AD2646 (µM)

0

20

40

60

80

100

0 1 2 3 4

AD2687 (µM)

Cell concentration (× 10-6/ml)

EC

50 (

µM)

0 0.5 1

2

0

4

6

8

10

N+O

O-

OH

OH

NH CH3

NH

OH

HO

N+

CH3

H3C

H3C

O

CH3

AD2646

AD2687

a b

dc

Figure 1 Effect of AD2646 and AD2687 analogs on Jurkat cell viability. (a–c) Effect of cell density on the cytotoxic effect of ceramide analogs.1� 105 (diamonds), 5� 105 (squares), and 1�106 (triangles) Jurkat cells per ml were incubated for 24 h in the presence of the indicatedconcentrations of AD2646 (a) and AD2687 (b), and cell viability was assessed by MTT. EC50 was determined for AD2646 (empty squares) andAD2687 (black squares) at the different cell concentrations (c). (d) Comparative cytotoxic effect of AD2646 and AD2557. 5�105 Jurkat cells perml were incubated for 24 h in the presence of the indicated concentrations of AD2646 (empty squares) and AD2557 (black circles). Cell viabilitywas assessed by MTT. Data are from a representative experiment out of at least three (a–c) or are means7s.d. of three independent experiments (d).

Ceramide analogs trigger Jurkat cell deathT Granot et al

393

Leukemia

and phosphatidylserine externalization was monitored asdescribed.18

Determination of caspase activityEffector caspase activity was measured on cell lysates using thefluorogenic substrate Ac-Asp-Glu-Val-Asp-aminomethylcou-marin (DEVD-AMC; Bachem) as described.19 Alternatively,caspase cleavage was examined by Western blot.

Glucosylceramide synthase and sphingomyelinsynthase assaysJurkat cells were incubated in the absence of FCS with theanalogs for varying times. For glucosylceramide (GlcCer) andSM synthase assays, one hour after the beginning of theexperiment, Bodipy-C3-ceramide (2.5 mM) was added to thecells. At the end of the experiment, the lipids were extracted andseparated as described.16

Ceramide quantificationLipids were extracted with chloroform/methanol from the celllysates prepared for DEVDase assay. Ceramide content wasdetermined using E. coli diacylglycerol kinase (kindly providedby Drs D Perry and YA Hannun, Charleston, SC) and [32P]g-ATP(6000 Ci/mmol; Perkin-Elmer) as previously reported.20 Of note,the ceramide analogs AD2646 and AD2687 did not producephosphorylated forms that could interfere with the ceramideassay.

Other determinationsProtein content was determined using bicinchoninic acid or theBradford method (Biorad).

Statistical studiesResults are expressed as means7s.d. or s.e.m., and are averagesof at least three values per experiment. Mean values werecompared using the Student’s t-test. Differences were consi-dered statistically significant when Po0.05 (as indicated by anasterisk on the figures).

Results

Ceramide analogs induce Jurkat cell deathBased on initial observations on leukemic HL-60 cells,16 weinvestigated the potential cytotoxic effect of novel syntheticceramide analogs on the human leukemia Jurkat T-cell line. Asillustrated in Figure 1a and b, AD2646 and AD2687 compoundsexhibited a dose-dependent cytotoxic action that was enhancedby decreasing the cell density. The AD2687 analog displayed ahigher cytotoxicity than the AD2646 compound (Figure 1c).Reduction in cell viability was observed even after short-term(4 h) incubation (data not shown), with EC50 values approxi-mating 15 and 40 mM for AD2687 and AD2646, respectively.We then compared the cytotoxicity of these novel analogs tothat of a previously described compound, AD2557 (also calledB13).9 As shown in Figure 1d, AD2646 that has an amine (-R-CH2-NH-) bond, was much more toxic than AD2557, which hasan amide (-R-CO-NH-) bond. Addition of FCS (10%) to theincubation medium resulted in an increased EC50 for allcompounds (data not shown).

Ceramide analogs impair ceramide metabolism andtrigger ceramide accumulationBecause of their previously reported effects on GlcCer and SMbiosynthesis in HL-60 cells,16 AD2646 and AD2687 were testedfor their potential inhibitory action on sphingolipid metabolismin Jurkat cells. As observed after incubating cells with afluorescent ceramide substrate, both compounds inhibitedGlcCer (Figure 2a) and SM (Figure 2b) syntheses, the latterbeing more susceptible to AD2687 than AD2646. Inhibition of

GC

S a

ctiv

ity

(% o

f in

hib

itio

n)

0

10

20

30

40

50a

0 15 30 45 907560

0 15 30 45 907560

Time before adding Bodipy-C3-ceramide (min)

SM

S a

ctiv

ity

(% o

f in

hib

itio

n)

b

0

10

20

30

40

50

Time before adding Bodipy-C3-ceramide (min)

100

250

200

150

0 3 6 9 12 15 18

Cer

amid

e (%

)

c

Time (hours)

Figure 2 Effect of AD2646 and AD2687 analogs on the activities ofglucosylceramide synthase (GCS) and sphingomyelin synthase (SMS),and on intracellular ceramide levels. (a and b) Jurkat cells(0.75� 106 cells/ml) were incubated for the indicating times in thepresence of 6 mM of AD2646 (empty squares) or AD2687 (blacksquares) and further incubated up to 4 h in the presence of Bodipy-C3-ceramide (2.5mM). Each sample had its own control. Cells werecollected and the fluorescence of Bodipy-C3-GlcCer (a) and Bodipy-C3-SM (b) were quantified. Of note, there was a threefold greaterutilization of Bodipy-C3-ceramide for synthesis of SM than GlcCer.(c) Jurkat cells were incubated for the indicated times in the presenceor absence (hatched bars) of 7 mM AD2646 (empty bars and squares)or 5 mM AD2687 (black bars and squares). Cells were harvested andceramide concentrations determined as described in Materialsand Methods. Data are from a representative experiment out ofthree independent experiments (c). The basal ceramide contentaveraged 370790 pmol/mg of protein; the ceramide level in untreatedcells after 18 h incubation averaged 105710% of that in cellsat time 0.

Ceramide analogs trigger Jurkat cell deathT Granot et al

394

Leukemia

these biosynthetic pathways was accompanied by a time-dependent accumulation of ceramide, which was detectableas early as after 2 h incubation with the analogs (Figure 2c). Thisaccumulation might also result from inhibition of acid and/orneutral ceramidase activity (see Supplementary Information andHe et al21).

Ceramide analogs kill Jurkat cells throughcaspase-dependent and -independent pathwaysTo further characterize the cytotoxic effect of ceramide analogs,we first examined their impact on Jurkat cell permeability andphosphatidylserine externalization (Figure 3). Both AD2646 andAD2687 led to an increased proportion of annexin-V-positive

z-VAD

z-VAD

13.1 ±1.8

32.0 ±10.4

2.5 ±0.5

5.1 ±0.5

8.6 ±2.6

none

3.8 ±0.8

10.7±1.1

25.0 ±2.7

28.5±4.3

10.4 ±1.0

20.7

±2.6

28.6±6.5

AD2646 (µM)

0

20

40

60

80

100

Cel

l via

bili

ty (

%)

0 5 10 15

AD2687 (µM)

0

20

40

60

80

100

Cel

l via

bili

ty (

%)

0 7.5 102.5 5

Ann.V

P.I.

none AD2687 (5µM)AD2646 (7µM)

*

*

**

AD2687 (5µM)AD2646 (7µM)

a

b

c

Figure 3 Effect of z-VAD-fmk on the cytotoxic effect of AD2646 and AD2687 analogs on Jurkat cells. Parental (A3) Jurkat cells were incubated for16 h in the presence or absence of the indicated concentrations of AD2646 or AD2687 with (solid symbols) or without (empty symbols) z-VAD-fmk(40mM). (a and b) Cells were labeled with Annexin-V-FITC (Ann.V) and propidium iodide (P.I.) and analyzed by flow cytometry. (a) Cell viabilitywas determined as the percentage of Annexin-V- and PI-doubly negative cells (mean7s.e.m.). (b) Representative dot plots. Percentages(mean7s.e.m.) of PI-negative/Annexin-V-positive cells (lower, right hand corner) and PI-positive cells (upper half) are indicated. (c) Cells werelabeled with Syto 13 probe and PI and examined by fluorescence microscopy. All data are representative of at least three independent experiments.

Ceramide analogs trigger Jurkat cell deathT Granot et al

395

Leukemia

and PI-negative cells (i.e. cells with externalized phosphatidyl-serine), and also of PI-positive cells (Figure 3b). Appearance ofthese populations was dose-dependent, as indicated by thedose-dependent decrease in the proportion of annexin-V-andPI-negative cells (Figure 3a). These changes were accompaniedby morphological alterations characteristic for apoptotic celldeath, for example, nuclear condensation and fragmentation(Figure 3c).

We then tested the contribution of caspases and classicalapoptosis to the ceramide analog-induced Jurkat cell death. Pre-incubation of the cells with the broad-spectrum caspaseinhibitor, z-VAD-fmk, resulted in a significant reduction of theannexin-V-positive and PI-negative cell population, but little orno change in the proportion of PI-positive cells (Figure 3b). Thiswas reflected by small (for AD2646) or partial (for AD2687)changes in the overall cell viability as estimated by theproportion of doubly negative cells (Figure 3a) or by MTT assay(data not shown). Whereas z-VAD-fmk efficiently preventednuclear fragmentation, it did not reduce membrane permeabilityand necrotic-like alterations (Figure 3c). Ceramide analogs alsoled to an increased proportion of hypodiploid cells, an effectthat was considerably, but not completely in the case ofAD2687, attenuated by co-treatment with z-VAD-fmk (seeSupplementary Information). Altogether, these observationsindicate that ceramide analogs impair Jurkat cell viabilitythrough distinct mechanisms.

Ceramide analogs efficiently kill Jurkat cells harboringdefects in the apoptotic cascade but not Bcl-xL-overexpressing cellsBecause ceramide analog-induced cytotoxicity was partiallymediated by an apoptotic mechanism, we examined thesensitivity of various Jurkat cell mutants to these analogs.Ceramide analog-induced cell death was not impaired inFADD-, RIP- or caspase-8 and -10-deficient cells, whichare resistant to FasL-induced cell death (see SupplementaryInformation). This strongly suggests that the cytotoxic pathwayactivated by the ceramide analogs is not regulated by thedeath receptor adaptor FADD nor the initiator caspases-8and -10. To test whether caspases were activated upontreatment with these ceramide analogs, we analyzed caspaseactivation by Western blotting. As illustrated in Figure 4a,AD2646 and AD2687 triggered the cleavage of caspase-8,-9 and -3, as well as the caspase substrate PARP. The caspase-3-like activity towards a synthetic tetrapeptide substrate peakedat 4 h incubation with both analogs (Figure 4b). Theseevents were also observed in I9-2e Jurkat cells (Figure 4a),a variant of caspase-8-deficient cell line exhibiting a lowcaspase-10 expression, which is resistant to FasL-induced celldeath,18 indicating that the analogs activate caspase-3 indepen-dently or downstream of initiator caspases. In contrast, FasL-induced caspase activation was abrogated in I9-2e cells(Figure 4a).

Finally, to test the potential implication of mitochondria inceramide analog-induced cell death, we studied the effect ofAD2646 and AD2687 on Jurkat cells stably overexpressing theanti-apoptotic, mitochondrial protein, Bcl-xL.17 Bcl-xL over-expression suppressed ceramide analog-induced caspase acti-vation (Figure 5a) and strongly attenuated cell death (Figure 5b).However, overexpression of Bcl-xL did not completely abrogateceramide accumulation (Figure 5c) indicating that generation ofceramide occurred upstream of mitochondria and is not thetrivial consequence of cell demise.

Discussion

Ceramide metabolism is currently viewed as an attractive targetfor anticancer therapy.1,4,5,22 This view is supported by thefollowing arguments. First, various commonly used anticancerdrugs and ionizing radiation elicit ceramide accumulation intumor cells. Second, chemo- or radio-resistant cancer/leukemiacells exhibit defects in ceramide production, and restoration ofthe ability to generate ceramide or administration of exogenousceramide leads to resensitization to cell death. Third, inhibitionof intracellular ceramide accumulation results in resistance ofcancer/leukemia cells to stress agents. This has been accom-plished either by blocking SM breakdown or de novo ceramidebiosynthesis using pharmacological inhibitors or genetic ap-proaches including antisense oligodesoxynucleotides or RNAinterference. Alternatively, reducing ceramide levels by enhan-cing its conversion to other sphingolipids such as GlcCer (viaoverexpression of glucosylceramide synthase) can promotechemoresistance.5 Reciprocally, blocking ceramide degradationthrough inhibition of ceramidase or ceramide conversion byinhibition of SM or GlcCer synthases can sensitize cells toanticancer drug-induced cell death (see Ogretmen andHannun1).

ββ-actin

Cleaved caspase-3

Procaspase-3

Caspase-8

PARP

27

13

kDa

FasLz-VAD

A3

+-

++

82

41

4838

A3 I9-2e

FasLAD2646 AD2687

+--

-+ -

---

--+

+--

-+ -

---

--+

a

b

0

2

4

6

8

10

12

0 3 6 9 12 15 18

DE

VD

ase

(nm

ol/h

/mg

)

Time (hours)

Caspase-938

Figure 4 Effects of AD2646 and AD2687 analogs on caspaseactivation in Jurkat cells. Parental (A3) and caspase-8-deficient (I9-2e) Jurkat cells were incubated for 16 h in the presence or absence ofAD2646 (7mM), AD2687 (5mM) or FasL (10 ng/ml) and, whenindicated, z-VAD-fmk (40 mM). (a) Total protein extracts (20mg) weresubjected to SDS–PAGE and Western blotted with anti-caspase-8, anti-caspase-9, anti-caspase-3, anti-PARP, or anti-b-actin antibodies. (b)Jurkat cells (A3) were incubated in the presence of 7 mM AD2646(empty squares) or 5mM AD2687 (black squares) for the indicatedtimes, and DEVDase activity was assessed as described in theMaterials and methods. Data are means7s.e.m. of three independentexperiments.

Ceramide analogs trigger Jurkat cell deathT Granot et al

396

Leukemia

Whereas manipulation of intracellular ceramide concentra-tions by interfering with its metabolizing enzymes is likely torequire multiple intervention (as proposed by the so-called poly-drug therapy approach),5 addition of ceramide analogs that canmimic the antiproliferative effects of endogenous ceramiderepresents an alternative strategy for killing tumor cells. With thelatter aim, various cell-permeant, structurally related ceramideanalogs have been synthesized which indeed displayedcytotoxicity. Besides short-chain (C2, C6 or C8) ceramides,which penetrate cells more easily than natural long-chainceramides and kill leukemic or lymphoma cells,2,7,23,24

ceramide analogs having an amine instead of an amide bondproved to be pro-apoptotic for U937 leukemic cells.6 Anothertype of structural analog, FS-5, having a short sphingoid moiety,induced apoptosis of Molt-4 leukemic cells.25 N-acylatedderivatives of serinol also caused apoptosis of neuroblastomaor breast cancer cells.8,26 Further analogs exhibited cytotoxicity

against cancer cells, including compounds containing athiouracil ring,27 benzene,28 or 4,6-diene-ceramides.14

In addition to the numerous effects reported on different cellculture models, several ceramide analogs proved to be effectivein vivo, some of them having been administered as liposomes.29

Treatment (by intraperitoneal injection) of mice with B13 led toreduction or even suppression of liver metastases of coloncancer.9 The same analog could sensitize xenografted prostatetumors to radiation and reduce tumor volume.13 More recently,N-oleoyl-serinol has been shown to prevent teratoma formationafter transplantation into mouse brain.12 These observationsemphasize the usefulness of developing ceramide mimics aspotential antitumor agents.

We have synthesized new metabolically stable compoundsthat share structural homology with ceramide. Despite compar-able uptake by cells, these non-natural analogs display highertoxicity than short-chain ceramides or previously synthesizedrelated compounds (such as B13/AD2557). There is not yetclear-cut structure–activity relationship. However, in analogywith previously developed cytotoxic analogs, these compoundscontain an allylic hydroxyl group in C3, which has beenproposed to be important in mediating their effects, possibly atthe mitochondrial levels by generation of reactive oxygenspecies.5 The presence of an aromatic ring in our analogs, aswell as in B13, may also contribute to the biological action.However, the amide linkage (present in B13 but absent inAD2646) seems dispensable.6 Replacing this ring by a 4,6-dienealso resulted in a potent cytotoxic effect.14 Moreover, thetoxicity of AD2687 might be related to its analogy withtrimethylsphingosine, a sphingolipid derivative previously re-ported to be cytotoxic.30

The present study demonstrates that these new ceramidederivatives induce leukemic cell death by typical apoptosis aswell as by other types of cell death. Not only was caspaseactivity stimulated, leading to DNA fragmentation, but alsoinhibition of caspase activity by synthetic peptide inhibitors oroverexpression of anti-apoptotic proteins could protect from celldeath. In agreement with previous studies also showingprotection by Bcl-2 overexpression,24,25 our observationssuggest that the ceramide analogs activate the apoptoticmachinery upstream of the mitochondria. In addition, asreported for short-chain ceramides,11,31–34 the ceramide analogstrigger a non-apoptotic form of cell death because caspaseinhibitors did not completely block membrane permeabilityalterations, phosphatidylserine externalization, morphologicalchanges and cell death.

The molecular mechanism(s) of action of ceramide mimicsstill remain(s) poorly elucidated. Several hypotheses have beenproposed, including activation of serine-threonine kinases, forexample, PKCz,8,12 mitochondrial events, that is, disruption ofmitochondrial membrane potential, production of reactiveoxygen species, and cytochrome c release,14 drop in glutathionelevels13 or Rb dephosphorylation.7 Positively charged ceramidesalso appear to trigger mitochondrial permeabilization.15 One ofthe putative mechanisms that underlie these alterations is theincreased endogenous ceramide level. Sustained elevation ofceramide was observed after treatment with our analogs: afinding also described with other ceramide mimics, including N-acylated-serinol, B13 and diene-ceramides.8,9,14 Interestingly,the present study shows that ceramide accumulation occursupstream of the mitochondrial events since, in contrast toexecution of the cell death program, it was not suppressed byBcl-xL overexpression. Several mechanisms could account forceramide elevation : inhibition of SM and GlcCer synthases(present study), inhibition of ceramide degradation by cerami-

DE

VD

ase

(nm

ol/

h/m

g)

0

2

4

6

8

10

12

None AD2646 AD2687

0

50

100

150

200

250

None AD2646 AD2687

Cer

amid

e (%

)

0

20

40

60

80

100

120

AD2646 AD2687

Via

bili

ty (

%)

Bcl-xLMock

n.s.

n.s.

**

**

**

a

b

c

Figure 5 Effect of Bcl-xL overexpression on ceramide analog-inducedceramide production and toxicity. Mock-transfected and Bcl-xL-overexpressing Jurkat cells were incubated for 4 h (a) or 18 h (b andc) in the presence or absence (None) of AD2646 (7mM) or AD2687(5mM). Cells were harvested and DEVDase activity (a), cell viability asevaluated by MTT assay (b), and ceramide content (c) weredetermined. Data are means7s.e.m. of 3 independent experiments.In (c), there was no significant differences in ceramide content ofmock-transfected and Bcl-xL-overexpressing Jurkat cells. The basalceramide content in Bcl-xL cells averaged 410770 pmol/mg ofprotein.

Ceramide analogs trigger Jurkat cell deathT Granot et al

397

Leukemia

dase,9 or ceramide-induced ‘self-accumulation’.35,36 In accor-dance with these hypotheses, other compounds such as PPMP orD609, which inhibit ceramide conversion to GlcCer or SM, alsotrigger cell death.37,38 Inhibition of acid ceramidase activity byAD2646 has recently been reported;21 it is, however, unlikelythat this mechanism solely accounts for the cytotoxic effect ofAD2646 and AD2687 because control and Farber (acidceramidase-deficient) lymphoblasts were equally sensitive tothese analogs (data not shown).

Altogether, these observations support the feasibility of anovel therapeutic approach based on manipulation of ceramidemetabolism to kill tumor cells, that could synergize withclassical antitumor agents (e.g. as shown with Safingol37,39).They also emphasize the need for a better understanding of themode of action of these sphingolipid analogs, and for develop-ing even more active and/or selective derivatives.

Abbreviations

DEVD-AMC; Ac-Asp-Glu-Val-Asp-aminomethylcoumarin, FCS;fetal calf serum, GlcCer; glucosylceramide, MTT; 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, SM;sphingomyelin, TLC; thin layer chromatography, z-VAD-fmk;benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp-fluoromethylketone.

Acknowledgements

We thank Dr O Cuvillier (INSERM U.466, Toulouse) for providingJurkat/neo and Jurkat/Bcl-xL clones. The technical assistance of NTherville is acknowledged. This study was supported by grant 607/02 from the Israel Science Foundation (to AD and SG), INSERM (toDM, SC, BS and TL) and ARC 3417 (to BS).

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Supplementary Information accompanies the paper on the Leukemia website (http://www.nature.com/leu)

Ceramide analogs trigger Jurkat cell deathT Granot et al

399

Leukemia

92

IV-5-2 Conclusions de l’article 4

Cette étude montre la capacité de nouveaux analogues de céramide à induire la mort

de cellules leucémiques Jurkat, dépendante et indépendante de l’activité catalytique des

caspases. Ces analogues induisent l’activation des caspases qui conduit à l’apoptose des

cellules Jurkat, caractérisée par une fragmentation de l’ADN, évaluée par le pourcentage de

cellules hypodiploïdes (Figure 31). Il est à noter que l’hypodiploïdie induite par FasL ou

l’AD2646 est inhibée en présence de z-VAD, suggérant un rôle des caspases dans la

fragmentation de l’ADN. A l’inverse, le z-VAD ne prévient pas totalement l’hypodiploïdie

en présence de l’AD2687 (Figure 31). L’apoptose induite par les analogues semble

indépendante des caspases initiatrices-8 et-10 et de la protéine FADD. En effet, des cellules

Jurkat déficientes en caspases-8 et -10 ou déficientes pour FADD, qui sont totalement

résistantes à la mort induite par FasL, sont aussi sensibles aux analogues que les cellules

parentales A3 (Figure 32). Ceci suggère un effet cytotoxique des analogues indépendant de la

signalisation des récepteurs de mort.

Figure 31: Les analogues de céramide AD2646 et AD2687 induisent une fragmentation de l’ADN dans les cellules Jurkat. Les cellules Jurkat parentales A3 ont été incubées dans

du milieu RPMI sans SVF en présence d’AD2646 (7µM), d’AD2687 (5µM) ou de FasL (10

ng/ml) en présence ou non de z-VAD (40 µM) pendant 16 heures. Le contenu en ADN a été

évalué par marquage des cellules à l’Iodure de Propidium (P.I.). Les pourcentages (moyenne

± ESM, n=3) de cellules hypodiploïdes sont indiqués. Le pourcentage d’hypodiploïdie dans

les cellules non traitées est de 24±6 et 12±2 respectivement en absence ou en présence de z-

VAD. Les résultats sont représentatifs de trois expériences indépendantes.

93

A B

Figure 32 : Les cellules Jurkat déficientes en caspase-8 et -10 ou pour la protéine FADD sont sensibles aux analogues de céramide. Les cellules Jurkat parentales A3, déficientes

pour la protéine FADD (I2-1) ou déficientes pour les caspase-8 et -10 (I9-2e) ont été incubées

dans du milieu RPMI sans SVF en présence d’AD2646 (7µM), d’AD2687 (5µM) ou de FasL

(10 ng/ml) pendant 16 heures. Les cellules ont été marquées à l’Annexine-V-FITC et à

l’Iodure de propidium et analysées par cytométrie en flux. La viabilité cellulaire a été

déterminée par le pourcentage de cellules doubles négatives pour l’Annexine-V et l’Iodure de

propidium. Les résultats sont les moyennes ± ESM de trois expériences indépendantes.

Un inhibiteur des caspases, le z-VAD, ne bloque pas totalement la toxicité en réponse

à l’AD2646 et l’AD2687 mais induit un changement dans la morphologie des cellules qui

présentent des caractéristiques des morts « caspase-indépendante » de type apoptose-like ou

nécrose-like. Les analyses biochimiques et morphologiques montrent l’induction d’une mort

indépendante de l’activité caspase comparable à celle observée en réponse à la stimulation de

Fas. En accord avec ces résultats, des analogues de céramide à courtes chaînes ont déjà été

décrits comme pouvant induire une mort cellulaire non apoptotique (Engedal and Saatcioglu,

2001; Kim et al., 2005).

Par analogie de structure avec le céramide, ces analogues agissent en tant

qu’inhibiteurs compétitifs des enzymes de conversion du céramide, telles que la

sphingomyéline synthase, la glucosylcéramide synthase et induisent une accumulation

intracellulaire de céramide. Les effets de ces analogues pourraient être indirects et être

médiés par le céramide endogène qui s’accumule dans les cellules, dès trois heures

d’incubation. Cependant, nous ne pouvons pas exclure un effet direct des analogues de

céramide. En effet, la présence du groupement hydroxyl allylique en C3 pourrait médier

l’effet des analogues sur la production de ROS au niveau de la mitochondrie, comme cela a

94

déjà été décrit (Radin, 2001). L’activation de la caspase-9 en réponse à l’AD2646 et

l’AD2687 suggère une implication de la voie mitochondriale dans leurs effets cytotoxiques.

De plus, le céramide généré, ou les analogues eux même, semblent agir en amont de la

mitochondrie dans la signalisation cytotoxique des analogues. En effet, la surexpression de

Bcl-xL inhibe la toxicité induite par les analogues mais ne prévient pas l’accumulation

intracellulaire de céramide. En accord avec ces observations, un analogue cationique de

céramide à longue chaîne, le LCL-30, induit l’apoptose de cellules du cancer du colon, en

ciblant la mitochondrie, en provoquant une diminution du potentiel mitochondrial et un

relargage du cytochrome c (Dindo et al., 2006). En outre, même si Bcl-xL, qui est

principalement localisé dans la membrane externe mitochondriale, inhibe la perméabilisation

des membranes mitochondriales en inactivant les membres pro-apoptotiques de la famille de

Bcl-2, il semble que ces effets ne soient pas restreints à la mitochondrie. Comme décrit pour

son homologue Bcl-2, Bcl-xL pourrait agir sur le réticulum endoplasmique (Ferri and

Kroemer, 2001). En effet, sa surexpression dans des cellules myoblastiques murines inhibe

l’activation de la caspase-12 et l’apoptose en réponse au stress du RE (Morishima et al.,

2004). De plus, l’expression d’un mutant de Bcl-xL ciblant le RE, inhibe la toxicité induite

par la thapsigargine, un inducteur de stress du RE (Fiebig et al., 2006). Aussi, nous ne

pouvant pas exclure un effet des analogues de céramide sur d’autres organelles différentes de

la mitochondrie comme le RE, le Golgi ou le lysosome.

L’utilisation de ces analogues de céramide en thérapie anticancéreuse pourrait être

envisagée. Une surexpression de la céramidase acide est observée dans 70 % des cellules

tumorales de la tête et du cou, en comparaison avec des tissus sains. L’AD2646 ou LCL 204

qui inhibe aussi l’activité de la céramidase acide, sensibilise les cellules SCC-1, du cancer de

la tête et du cou, à l’apoptose induite par un agoniste de Fas, in vitro et in vivo sur un modèle

de xénogreffe tumorale chez la souris (Elojeimy et al., 2007; Norris et al., 2006). Une

approche thérapeutique combinant FasL et l’AD2646 semble être prometteuse pour le

traitement des tumeurs de la tête et du cou. Toutefois, les analogues AD2646 et AD2687

n’ont aucun effet sur l’apoptose des cellules Jurkat induite par FasL, suggérant que les effets

de ces molécules dépendent du type cellulaire (résultats non montrés). Il serait donc

intéressant de tester cette combinaison de molécules sur d’autres types de cellules

cancéreuses. De plus, il a été montré que des cellules leucémiques myéloïdes HL-60

chimiorésistantes présentent des taux de céramide plus faibles, et des activités de la SMS et

de la GCS plus élevées, en comparaison avec des cellules sensibles (Itoh et al., 2003). Aussi,

comme les analogues AD2646 et AD2687 inhibent les activités de ces deux enzymes et

95

augmentent le taux intracellulaire de céramide, ils pourraient sensibiliser ces cellules aux

traitements chimiothérapeutiques classiques. Ainsi, un effet cytotoxique synergique de

l’analogue de céramide LCL-30 avec la doxorubicine a été montré dans des cellules du

cancer du colon (Dindo et al., 2006).

96

DISCUSSION

97

La mort cellulaire induite par l’activation du récepteur Fas (CD95), consécutive à la

liaison de Fas Ligand (CD95-L), joue un rôle majeur dans la régulation de l’homéostasie

lymphocytaire. L’objectif de notre travail a été de clarifier le rôle des caspases et du céramide

dans la signalisation cytotoxique du récepteur Fas.

I- Les caspases-8 et -10 sont indispensables à la signalisation apoptotique et nécrotique

induite par FasL

Alors qu’un rôle essentiel de la caspase-8 avait été montré dans l’apoptose induite par

l’engagement de Fas (Juo et al., 1998), nos travaux démontrent que dans des cellules

déficientes en caspase-8, la caspase-10 active la voie mitochondriale via le clivage de Bid et

active la cascade des caspases conduisant à l’apoptose (Milhas et al., 2005) (Figure 33, 1). Il

est à noter que notre étude a été réalisée avec du FasL, contrairement aux travaux du groupe

de Blenis reposant sur l’utilisation d’un anticorps anti-Fas agoniste. Ces résultats

contradictoires pourraient s’expliquer par le fait que les voies pro-apoptotiques activées par

un anti-Fas agoniste et par FasL ne soient pas strictement identiques (Legembre et al., 2003).

Plusieurs études suggèrent l’existence de voies de signalisation cytotoxique

indépendantes des caspases, c'est-à-dire non inhibable par le z-VAD, dans les lymphocytes T

en réponse à la stimulation de Fas (Davidson et al., 2002; Holler et al., 2000; Matsumura et

al., 2000; Vonarbourg et al., 2002). Nos résultats confirment l’induction d’une mort en

réponse à de fortes concentrations de FasL, dans les cellules Jurkat et dans les PBL incubés

en présence de z-VAD. Cette signalisation semble impliquer la kinase RIP et des évènements

mitochondriaux comme le relargage d’AIF, qui restent à confirmer. Cependant, malgré la

classification des types de morts non apoptotiques, il semble que la définition du type de mort

caspase-indépendante et dépendante de RIP ne soit pas encore clairement établie (Jaattela and

Tschopp, 2003; Kroemer and Martin, 2005; Leist and Jaattela, 2001). En effet, nos résultats

mettent en évidence une mort de type apoptose-like caractérisée par une forte condensation

nucléaire et cellulaire et une externalisation des PS (Milhas et al., 2005). D’autres travaux

décrivent une mort de type nécrose-like caractérisée par une altération de la perméabilité

membranaire détectée par un marquage à l’iodure de propidium et un gonflement des

organites intracellulaires et du cytoplasme des cellules, observé par microscopie électronique

(Holler et al., 2000; Matsumura et al., 2000). Une autre étude indique une mort de type

autophagique caractérisée par la présence de vacuoles autophagiques dans le cytoplasme des

98

cellules (Yu et al., 2004). Enfin, cette mort a aussi été qualifiée de nécroptose ayant à la fois

des caractéristiques de nécrose et de mort autophagique (Degterev et al., 2005).

Les cellules Jurkat déficitaires en caspase-8 et -10 sont complètement résistantes à

FasL, suggérant que ces caspases initiatrices sont indispensables pour l’induction de la mort

apoptotique et nécrotique (Figure 33, 1 et 2). De plus, notre étude suggère qu’une partie de la

signalisation activée par les caspases-8 et -10 est indépendante de leur activité catalytique. En

accord avec cette hypothèse, la surexpression de la caspase-8 ou -10 sauvage en présence de

z-VAD ou de la caspase-8 ou -10 catalytiquement inactive est toxique et restaure la

sensibilité des cellules I9-2e à la mort par FasL. Ces résultats remettent en cause l’existence

d’une mort « caspase-indépendante » dans la signalisation de Fas et indiquent un rôle des

caspases-8 et -10 dans l’induction d’une mort « nécrotique » indépendamment de leur activité

catalytique. Il est à noter que les cathepsines peuvent également sensibiliser des cellules

cancéreuses à la mort induite par des agents antitumoraux, indépendamment de leur activité

catalytique (Beaujouin et al., 2006).

Comme montré pour l’activation de NF-κB en réponse à la stimulation de Fas, les

caspases-8 et -10, par l’intermédiaire de leur domaine DED, pourraient s’associer à RIP et à

FADD pour former un complexe qui permettrait l’activation de RIP (Figure 33, 2). Il

semblerait donc que les mêmes protéines participent à l’induction de trois types de

signalisation distinctes : voie de survie NF-κB-dépendante, voie apoptotique caspase

dépendante et voie nécrotique indépendante de l’activité catalytique des caspases. Des inter-

relations entre ces voies semblent exister pour permettre leur activation respective. La

synthèse protéique étant indispensable dans les voies de prolifération et de survie, son

inhibition pourrait favoriser l’activation des voies apoptotiques ou nécrotiques. Ainsi,

l’induction d’une mort dans des cellules Jurkat par le TNFα, TRAIL ou FasL est

potentialisée en présence de cycloheximide, un inhibiteur de la synthèse protéique (Holler et

al., 2000). De plus, il semble que la voie apoptotique inhibe les deux autres voies grâce à

l’activité des caspases. En réponse au TNFα ou à un agoniste de Fas, la caspase-8 clive RIP

permettant de séparer le domaine kinase (en N-terminal) du reste de la protéine comprenant

le domaine intermédiaire et le domaine de mort (en C-terminal). Le fragment C-terminal de

RIP participe à l’induction de l’apoptose tandis qu’il inhibe l’activation de la voie NF-κB en

réponse au TNFα (Kim et al., 2000). De plus, comme l’activité kinase de RIP est

indispensable à la signalisation nécrotique, son clivage par les caspases pourrait inhiber son

activité pro-nécrotique (Holler et al., 2000). Aussi, il a été montré que l’inhibition des

99

caspases sensibilise des fibroblastes L929 à la mort nécrotique induite par le

TNFα (Vercammen et al., 1998a). De plus, une étude récente montre l’induction d’une mort

autophagique RIP dépendante des cellules L929 incubées en présence de z-VAD ou de

siRNA dirigés contre la caspase-8 (Yu et al., 2004). En outre, comme l’activité kinase de RIP

n’est pas indispensable à l’activation de NF-κB (Ting et al., 1996), l’augmentation de son

activité pourrait induire préférentiellement la voie nécrotique plutôt que la voie de survie. De

plus, il semblerait que la compartimentation subcellulaire du récepteur Fas conditionne

l’activation des voies de mort ou de survie. Des travaux récents indiquent que

l’internalisation du récepteur est nécessaire à la formation du DISC et à la signalisation

apoptotique du récepteur Fas, tandis qu’une absence d’internalisation de Fas dans les

lysosomes conduirait à l’induction de voie de survie (Lee et al., 2006a). Enfin, dans un

contexte infectieux, la voie nécrotique pourrait être favorisée. Par exemple, lors de l’infection

de cellules endothéliales par Chlamydia pneumoniae, la mort apoptotique induite par les LDL

oxydées est inhibée tandis que la nécrose est potentialisée, notamment par la production de

ROS. L’agent infectieux pourrait exercer le même effet que le z-VAD en inhibant les

caspases (Nazzal et al., 2006). Il est à noter qu’une partie de la signalisation cytotoxique des

LDL oxydées implique le système Fas/FasL (Alcouffe et al., 2004).

Finalement, les mutations de la caspase-8 ou de la caspase-10 responsables d’ALPS affectent

l’activité catalytique des caspases mais ne sont pas localisées au niveau du site catalytique.

Ainsi, comme les caspases mutées sont recrutées au niveau du récepteur Fas, il a été suggéré

un effet dominant négatif des caspases mutées qui empêcheraient le recrutement des caspases

sauvages (Wang et al., 1999a). En outre, il est possible que ces mutations perturbent la

formation du complexe hypothétique entre RIP, FADD et les caspases-8 et -10, responsable

de l’activation de la voie de signalisation indépendante de l’activité catalytique des caspases,

et participent ainsi au développement des ALPS. De même, chez des patients atteints d’ALPS

de type I, qui possèdent des mutations au niveau du récepteur Fas responsables de la

résistance des lymphocytes à la mort induite par l’engagement de Fas, l’activation de NF-κB

pourrait favoriser la survie et la prolifération (Legembre et al., 2004). Il est envisageable que

ces mutations, en affectant à la fois l’induction de la voie apoptotique et nécrotique,

favorisent l’activation des voies de survie.

100

II- L’inhibition de l’activité de la SMS pourrait participer à la génération de céramide dans la

signalisation de Fas

Nos résultats mettent en évidence une inhibition de l’activité de la SMS qui pourrait

être impliquée dans la génération de céramide et dans l’induction de la mort cellulaire en

réponse à FasL (Figure 33, 3). L’inhibition de la SMS dépend principalement de l’activité des

caspases. Ceci est en accord avec les travaux du groupe d’Okazaki qui montrent une

inhibition de l’activité de la SMS nucléaire dépendante de la caspase-3 en réponse à un

agoniste de Fas (Watanabe et al., 2004). Toutefois, nos résultats suggèrent que l’inhibition de

la synthèse de SM est un évènement précoce dans la signalisation de Fas, intervenant en

amont des évènements mitochondriaux. Les mécanismes d’inhibition de l’activité de la SMS

reste à préciser. Il serait intéressant de déterminer si la SMS est un substrat direct des

caspases initiatrices. Pour cela, nous envisageons d’évaluer la capacité des caspases

recombinantes-2, -8, -9 et -10 à cliver la SMS1 in vitro. L’utilisation de siRNA dirigés contre

ces différentes caspases pourrait permettre de définir leur éventuelle implication dans

l’inhibition de la SMS in situ. De plus, la surexpression de la SMS1 mutée (D327E) sur le

site potentiel de clivage par les caspases (LAHD↓H) pourrait permettre de valider ce site in

situ et d’évaluer si l’inhibition de la SMS dépend d’un clivage direct de cette enzyme. Dans

cette éventualité, l’effet de la surexpression de la SMS1 mutée permettrait de déterminer si

l’inhibition de la SMS est un évènement causal dans la production de céramide et la toxicité

en réponse à FasL. En outre, d’autres mécanismes pourraient participer à l’inhibition de la

SMS, comme : (i) une altération de la structure du Golgi par les caspases ; (ii) une inhibition

indirecte due à un défaut de substrat pour l’enzyme, soit le céramide, soit les PC.

Dans la signalisation indépendante de l’activité catalytique des caspases, il semble

que RIP soit impliquée dans l’inhibition de l’activité de la SMS et la génération de céramide.

Cependant, les mécanismes moléculaires responsables de l’inhibition de la SMS restent à

préciser. Une production de ROS a été décrite dans la signalisation du TNFR-1 indépendante

de l’activité catalytique des caspases et dépendante de RIP (Lin et al., 2004b; Thon et al.,

2005). L’étude de l’effet d’antioxydants sur l’inhibition de l’activité de la SMS et sur la

génération de céramide en réponse à FasL, en présence de z-VAD, pourrait permettre de

déterminer si les ROS sont impliqués dans ces phénomènes.

Nos résultats, suggèrent que l’inhibition de la SMS participe à la génération de

céramide dans la signalisation apoptotique et nécrotique en réponse à FasL (Figure 33, 3). Il

semble que les caspases-8 et -10 sont nécessaires à la production de céramide, puisque

101

qu’aucune élévation du taux intracellulaire de céramide n’est détecté dans des cellules

déficientes en caspase-8 et -10 en réponse à FasL. Ainsi, dans la signalisation apoptotique,

l’activité des caspases-8 et -10 pourrait participer à l’inhibition de l’activité de la SMS qui

favoriserait l’augmentation du taux intracellulaire de céramide. Dans la signalisation

indépendante de l’activité catalytique des caspases, l’activation de RIP au sein du complexe

formé par RIP, FADD, la caspase-8 et la caspase-10 pourrait participer à l’inhibition de la

SMS, potentiellement responsable de l’augmentation intracellulaire du taux de céramide. De

plus, nos résultats indiquent que le céramide généré pourrait être un élément de la

signalisation apoptotique et nécrotique. En effet, des analogues de céramide induisent une

mort apoptotique et une mort indépendante de l’activité catalytique des caspases (Figure 33,

4). Ces analogues interfèrent avec le métabolisme sphingolipidique endogène et inhibent

l’activité de la SMS, de la GCS et de la céramidase acide. Ainsi, en prévenant la conversion

de céramide en SM, en glucosylcéramide et en sphingosine, les analogues induisent une

augmentation du taux intracellulaire de céramide qui pourrait participer à la mort cellulaire.

Finalement, interférer avec le métabolisme sphingolipidique et notamment avec

l’activité de la SMS, dans le but d’augmenter le taux intracellulaire de céramide, pourrait

permettre de sensibiliser les cellules résistantes à la mort. En effet, nos résultats indiquent que

le D609, qui inhibe l’activité de la SMS, permet de sensibiliser les cellules déficientes en

caspase-8 à FasL. De plus, le D609 permet de restaurer la sensibilité de PBL à la mort

indépendante de l’activité catalytique des caspases induite par FasL. Ainsi, l’utilisation de

dérivés du D609, ou des analogues de céramide, pourrait être envisagée pour sensibiliser les

lymphocytes de patients atteints d’ALPS et les cellules malignes à FasL ou aux traitements

anticancéreux.

102

FADD

RIP

Casp-3/7

Mort non apoptotique

Apoptose

Casp-8/10

Fas/CD95

Voie dépendante de l’activité

catalytique des caspases

Voie indépendante de l’activité

catalytique des caspases

SMS1Bid

↑Céramide

ROS

Casp8-/10

FADD

Z-VAD

AD2646 AD2687

1

4

3

2

FasL/CD95L

Figure 33 : Voie dépendante et indépendante de l’activité catalytique des caspases dans la signalisation de Fas. 1, L’activation du récepteur Fas par la liaison de FasL permet la

formation du DISC constitué de la protéine FADD et des caspases-8 et -10. L’activation de

ces caspases initiatrices au niveau du DISC permet soit l’activation directe des caspases

effectrices -3 et -7, soit l’activation de la voie mitochondriale par le clivage de la protéine

Bid. Les deux voies conduisent à l’apoptose. 2, La formation du complexe constitué de la

protéine FADD, des caspases-8 et -10 et de RIP pourrait activer une signalisation de mort

indépendante de l’activité catalytique des caspases et impliquant la production de ROS. 3,

L’activation des deux types de signalisation conduit à l’inhibition de l’activité de la SMS1,

localisée au niveau du trans Golgi. Cette inhibition de la synthèse de SM favorise

l’augmentation du taux intracellulaire de céramide. 4, Le céramide accumulé en réponse à la

stimulation de Fas ou à des analogues de céramide tels que l’AD2646 et l’AD2687, pourrait

participer activement à l’induction de l’apoptose et de la mort non apoptotique.

103

MATERIELS ET METHODES

104

I- Cultures et lignées cellulaires

I-1 Cellules Jurkat

Différentes lignées leucémiques T humaines de type Jurkat sont utilisées : la lignée

parentale A3 et ses lignées dérivées obtenues après traitement mutagène telles que le clone

I2-1 (∆FADD, déficitaire pour la protéine FADD) (Juo et al, 1999) et le clone I9-2

(∆caspase-8, déficitaire pour la caspase-8) (Juo et al, 1998), fournies par le Dr. J. Blenis

(Boston, USA) ; les sous-populations I9-2a, I9-2b, I9-2c, I9-2d et I9-2e obtenues par

dilutions limites de la lignée I9-2 (Milhas et al., 2005) ; la lignée E6-1 transfectée par un

vecteur contrôle neo ou par un vecteur permettant la surexpression de Bcl-xL (lignée Bcl-xL)

(Boise and Thompson, 1997), fournies par le Dr. O. Cuvillier (Toulouse, France) ; la lignée

RIP- déficitaire pour la protéine RIP dérivée de la lignée parentale RIP

+ fournies par le Dr. B.

Seed (Boston, USA) (Ting et al., 1996) ; la lignée SMS1-KD surexprimant de façon stable un

siRNA dirigé contre la SMS1 et la lignée contrôle surexprimant un siRNA « scramble »,

fournies par le Dr. T. Okazaki (Tottori, Japon). Ces lignées Jurkat sont cultivées à 37°C, en

atmosphère humide et en présence de 5% de CO2 dans du milieu RPMI 1640 (+Glutamax)

(Invitrogen) contenant 10% de sérum de veau fœtal (SVF) décomplémenté (Eurobio). Les

lignées transfectées sont cultivées en présence de 0,6 à 0,8 mg/ml de G418.

I-2 Lymphocytes humains du sang périphérique (PBL, Peripheral Blood

Lymphocytes)

Les PBL sont isolés sur gradient de Ficoll (Gibco) à partir de 20 ml de sang de

donneurs sains. Les monocytes sont éliminés par adhésion cellulaire pendant 4 heures. Puis

les PBL sont activés par 1 µg/ml de phytohémagglutinine (PHA) (Sigma) et cultivés pendant

6 jours dans du milieu RPMI 10% SVF contenant 20 unités/ml d’IL-2 (Sanofi-Synthélabo).

Les PBL activés sont ensuite restimulés pendant 24 heures avec de la PHA (1µg/ml) en

présence d’IL-2 (20 unités/ml) pour induire l’AICD. Alternativement, les cellules sont

incubées pendant 24 heures en présence de 500 ng/ml de FasL (Abcys) et de 20 unités/ml

d’IL-2.

105

I-3 Cellules HeLa

Les cellules carcinomateuses humaines HeLa sont cultivées dans du milieu DMEM

(+Glutamax) (Gibco) contenant 10% de SVF décomplémenté.

I-4 Transfections cellulaires

Transfections transitoires : Les transfections des cellules Jurkat ont été réalisées en

collaboration avec le Dr. Justin Tessié (CNRS, Toulouse) par électroperméabilisation de 2

millions de cellules dans 200 µl d’un tampon de perméabilisation contenant 10 mM de

tampon phosphate, 250 mM de sucrose et 1 mM de MgCl2 (pH 7,4), 8 µg de plasmide codant

pour EGFP, la caspase-8 sauvage taggée EGFP, la caspase-8 mutée (C360S) taggée EGFP ou

la caspase-10 sauvage taggée EGFP. Alternativement les cellules ont été transfectées par 8µg

de plasmide codant pour la caspase-10 mutée (C401S) et 2 µg de plasmide codant pour

EGFP. Les plasmides ont été fournis par le Dr. M. Lénardo (Bethesda, MD). Le champ

électrique est appliqué par 3 pulsations de 10 ms (240 V, électrode de 4mm). Immédiatement

après l’électroperméabilisation, 20 % de SVF est ajouté à la suspension cellulaire suivi de 2

ml de RPMI 10% SVF (Gabriel et al., 2003). 4, 12 ou 24 heures après la transfection, les

cellules sont incubées ou non en présence de FasL murin (500 ng/ml) pendant 4 heures, puis

analysées par cytométrie en flux après marquage à l’Annexine-V-APC (AlloPhycoCyanin)

ou à l’iodure de propidium (cf I-4-1).

Les cellules HeLa ont été transfectées à l’aide du réactif de transfection JetPEI

(PolyPlus- transfection). 24 heures avant la transfection, 0,2 millions de cellules sont

ensemencées dans 2 ml de DMEM 10% SVF. Le jour de la transfection, le mélange

contenant : 6µl de réactif JetPEI dans 100 µl Nacl (150 mM), 0,3µg de plasmide codant pour

EGFP ou 3µg de plasmide codant pour la caspase-8 sauvage taggée EGFP, la caspase-8

mutée (C360S) taggée EGFP ou pour la caspase-10 sauvage taggée EGFP et contenu dans

100 µl de Nacl, est incubé 15 minutes à température ambiante puis ajouté goutte à goutte

dans les cellules. Alternativement, les cellules ont été transfectées par 3µg de plasmide

codant pour la caspase-10 mutée (C401S) et 0,6 µg de plasmide codant pour EGFP. 16

heures après la transfection, les cellules sont analysées par cytométrie en flux après marquage

à l’Annexine-V-APC ou à l’iodure de propidium (cf I-4-1).

Transfections stables : les cellules Jurkat ont été transformées de façon stable par un

vecteur rétroviral codant pour un siRNA « scramble » (ATTGAAAAAGACACGCGCC) ou

106

un siRNA dirigé contre la SMS1 humaine (GCCCAACTGCGAAGAATAA) (Jin Z.X.,

Okazaki T., Umehara H., soumis). La méthode de production de rétrovirus codant pour des

siRNA et l’infection de cellules Jurkat par des virus recombinants a été décrite (Jin et al.,

2002).

II- Source de FasL

Du FasL humain recombinant (Abcys) a été utilisé pour induire l’activation du

récepteur Fas. Alternativement, des surnageants de culture de cellules neuronales murines de

type Neuro-2A surexprimant et sécrétant du FasL murin (Neuro2A-FasL) ont été utilisés

comme source de FasL (Shimizu et al., 1999). Les cellules Neuro2A transfectées, ou non, par

un plasmide codant pour FasL sont cultivées dans du milieu RPMI 10% SVF. A confluence,

les surnageants de culture sont prélevés, filtrés (0,2µm) et stockés à -20°C. Par technique

ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay), la concentration de FasL dans les

surnageants de culture de Neuro2A-FasL est évaluée à 1µg/ml (résultats non montrés). Des

dilutions géométriques de raison 2 de ces surnageants sont effectuées dans du RPMI 10%

SVF, pour évaluer la cytotoxicité en réponse à différentes doses de FasL. Ainsi, la plus faible

dilution du surnageant (dilution au demi) contient 500 ng/ml de FasL et la plus forte dilution

(dilution au 1/128) contient 7,5 ng/ml de FasL. La toxicité mesurée résulte bien de

l’activation de Fas par son ligand car (i) l’incubation de cellules Jurkat en présence de

surnageant de Neuro2A-FasL induit une toxicité comparable à celle induite par un FasL

humain recombinant purifié ; (ii) l’incubation de cellules Jurkat en présence de surnageant de

Neuro2A non transfectées n’engendre pas de perte de viabilité (Figure 18A), ni d’activation

de caspases (Résultats non montrés) ; (iii) les Jurkat ∆FADD, déficitaires pour FADD (Juo et

al., 1999), une protéine adaptatrice indispensable pour la signalisation cytotoxique de Fas

(Holler et al., 2000) résistent complètement à la toxicité induite par le surnageant de

Neuro2A-FasL (Figure 18A).

III- Expression de CD95 à la surface cellulaire

500000 cellules sont centrifugées et incubées pendant 30 minutes à 4°C, à l’abri de la

lumière, en présence de 10µl d’anticorps anti-CD95-PE (clone 7C11, Immunotech Beckman

Coulter) dans un volume final de 50µl. De la même façon, pour les contrôles isotypiques,

500000 cellules sont incubées avec 0,5µg d’un anticorps IgM irrelevant couplé au PE

107

(Phycoerythrine) (Santa Cruz Tebu). L’analyse des cellules par cytométrie en flux

(FACSCalibur, Becton Dickinson) s’effectue après lavage des cellules avec du PBS

(Phosphate Buffered Saline)

IV- Tests de viabilité cellulaire

IV-1 Test d’exclusion au bleu Trypan

La proportion de cellules mortes est évaluée par observation sur une lame de

Malassez d’un aliquot de culture cellulaire dilué volume à volume dans une solution de Bleu

Trypan (0,4 % dans du PBS). Les pourcentages de cellules présentant un noyau apoptotique

(condensé et/ou fragmenté) et de cellules nécrotiques (colorées en bleu) sont évalués.

IV-2 Test MTT

Les cellules Jurkat (2 millions/ml) sont incubées en présence, ou non, de 40µM de z-

VAD(OMe)-fmk (Bachem) pendant une heure. 100000 cellules sont ensuite ensemencées par

puits de plaques de 96 puits dans 50µl de RPMI 10% SVF. 50µl de milieu contenant de 15

ng/ml à 1 µg/ml de FasL murin ou humain sont rajoutés par puits. Après 24h d’incubation, le

MTT (ou Bromure de 3(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium) (Sigma) est

incubé dans le milieu de culture à une concentration finale de 500 µg/ml pendant 3h à 37°C.

Après dissolution des cristaux de formazan formés, dans 100µl d’une solution de

solubilisation (HCl (0.01N) et SDS 10%), une lecture spectrophotométrique à 590 nm est

réalisée. Les densités optiques obtenues sont directement proportionnelles au nombre de

cellules vivantes. L'effet cytotoxique du FasL est calculé par le pourcentage de viabilité après

traitement par FasL, par rapport au 100% correspondant aux cellules incubées en absence de

FasL.

V- Tests d’apoptose

V-1 Analyse morphologique

Les cellules sont incubées pendant 15 minutes à 37°C à l’abri de la lumière en

présence de 2 µg/ml d’iodure de propidium (Sigma), un marqueur des cellules nécrosées

108

présentant un trouble de la perméabilité membranaire et avec 2,5 µM de Syto13 (Molecular

Probes), une sonde perméante colorant le noyau et le cytoplasme des cellules en se fixant sur

les acides nucléiques. 100000 cellules sont ensuite déposées entre lame et lamelle avant

observation au microscope à fluorescence. Les cellules présentant une condensation ou une

fragmentation nucléaire sont considérées comme apoptosées. Les cellules marquées à

l’iodure de propidium sont nécrosées. Parmi les cellules nécrosées, on distingue des cellules

en nécrose primaire (n’ayant pas ou peu de condensation chromatinienne), des cellules en

nécrose secondaire présentant une fragmentation nucléaire.

V-2 Externalisation des phosphatidylsérines et perméabilité membranaire

Une quantification de l’apoptose est réalisée après marquage des cellules par

l’Annexine V-FITC (AV) et l’iodure de propidium (IP) (Immunotech Beckman Coulter). Les

cellules sont centrifugées et incubées 10 minutes à 4°C en présence d’AV (250 ng/ml) et d’IP

(50 ng/ml) avant d’être analysées par cytométrie en flux. Le pourcentage de cellules

apoptotiques qui présentent une externalisation des phosphatidylsérines, marquées par l’AV,

ainsi que la proportion de cellules nécrosées, marquées par l’IP, sont évalués. Il est à noter

que les cellules nécrosées sont aussi marquées par l’AV. Ainsi, les cellules apoptosées et

nécrosées sont respectivement AV + / IP- et AV+ / IP+.

V-3 Analyse de la fragmentation de l’ADN

Deux millions de cellules sont lavées en PBS et centrifugées à 4°C puis

perméabilisées en présence d’éthanol à 70% pendant 10 minutes à -20°C. Après plusieurs

lavages en PBS, les cellules sont incubées 30 minutes à 37°C en présence de 1 mg/ml de

RNAse et de 0,1 mg/ml d’iodure de propidium (Sigma) avant d’être analysées par cytométrie

en flux. Le pourcentage de cellules hypodiploïdes présentant un contenu d’ADN inférieur à

celui de cellules en G0/G1, dû à une fragmentation de l’ADN, est évalué.

V-4 Dosage de l’activité des caspases : essai enzymatique DEVDase ou IETDase

Les cellules sont lavées dans du PBS puis centrifugées à 1500 rpm pendant 5 minutes

à 4°C. Les culots cellulaires sont lysés dans 250 µl de tampon de lyse contenant 10 mM

d’Hepes (pH 7,4), 42 mM de KCl, 5mM de MgCl2, 1mM de DTT, 0,5% de CHAPS, 1mM de

109

PMSF et 2µg/ml de leupeptine, puis soniqués. Le lysat est centrifugé à 10000 rpm pendant 5

minutes à 4°C. 100 µl du surnageant obtenu (extrait protéique) sont incubés avec 100 µl

d’une solution contenant 40 µM Ac-DEVD-AMC ou Ac-IETD-AMC (Bachem) pendant 30

minutes à l’obscurité et à température ambiante. La réaction est stoppée par ajout de 800 µl

de tampon de lyse. La quantité d’AMC (7-Amino-4-methylcoumarin) libéré consécutivement

à l’action des caspases est déterminée par spectrofluorimétrie (λexcitation = 351 nm ;

λémission = 430 nm). Les activités spécifiques DEVDase et IETDase sont calculées en se

référant à une gamme standard d’AMC.

V-5 Essais in vitro : protéines recombinantes

- Caspases recombinantes : 200 µg d’extraits protéiques (cf I-5-4) de cellules Jurkat

A3 ou I9-2 sont incubés en présence d’une unité de caspase-8 ou -10 recombinante pendant

différents temps à 37°C dans un volume final de 200 µl d’un tampon contenant 50 mM

d’Hépès et 150 mM de NaCl à pH 7,5. Aux temps indiqués, la réaction enzymatique est

stoppée par congélation dans l’azote liquide. 20 µg de protéines sont déposés sur un gel SDS-

PAGE et analysés par Western Blot.

- Bid recombinant : 1µg d’une protéine Bid recombinante murine taggée Histine est

incubé en présence d’une unité de caspase recombinante à 37°C dans un volume final de 60

µl d’un tampon contenant 50 mM d’HEPES et 150 mM de NaCl à pH 7,5. Aux temps

indiqués, 100 ng de protéine sont immédiatement congelés dans l’azote liquide et analysés

par Western Blot avec un anticorps anti-His (clone sc8036, Santa Cruz). Alternativement, les

extraits sont séparés sur un gel SDS-PAGE et colorés au Bleu de Coomassie.

VI- Western Blot

VI-1 Extraits protéiques totaux

De 5 à 20 millions de cellules sont soniquées dans un tampon de lyse [Hepès (10mM ;

pH 7,4 ), Glycérol (10%), Triton X-100 (10mM), DOC (Acide Desoxycholique, 0.5%),

NaVO4 (1mM), β−glycero-phosphate (10mM), NaF (50mM), leupeptine (2µg/ml), pepstatine

(2µg/ml), aprotinine (10µg/ml), PMSF (1mM)]. Après une centrifugation de 10 minutes à

10000 rpm à 4°C, les surnageants sont récupérés et les protéines sont dosées selon la méthode

110

de Bradford (Biorad). Les extraits protéiques sont finalement dénaturés par chauffage à 95°C

en présence de Bleu de Bromophénol et de β-mercaptoéthanol.

VI-2 Extraits protéiques cytosoliques

20 millions de cellules sont homogénéisées grâce à un potter dans un tampon de lyse

[Hepès/KOH (20mM ; pH 7,4), EDTA (1mM), albumine bovine délipidée (0,1 %), sucrose

(250 mM), leupeptine (20µg/ml), aprotinine (10µg/ml), pepstatineA (10µg/ml), PMSF

(0,1mM)]. Une première centrifugation de 5 minutes à 1500 rpm à 4°C permet de sédimenter

les noyaux et les cellules intactes. La fraction enrichie en mitochondries est sédimentée par

10 minutes de centrifugation à 10000 rpm et à 4°C du surnageant (surnageant 1) obtenu lors

de la première centrifugation. Enfin, une centrifugation de 10 minutes à 15000 rpm et à 4°C

du surnageant obtenu précédemment (surnageant 2) permet d’isoler la fraction cytosolique

dans le surnageant 3.

VI-3 Migration électrophorétique des extraits protéiques

De 20 à 50µg d’extraits protéiques sont déposés sur un gel SDS-PAGE (12 ou 15%)

puis transférés sur une membrane de nitrocellulose. Les membranes sont hybridées en

présence des anticorps primaires puis des anticorps secondaires couplés à la Peroxidase

(Jackson ImmunoResearch). La révélation est effectuée par chimiluminescence à l’aide d’un

kit ECL (Perbio).

VII- Analyse de la localisation subcellulaire des protéines mitochondriales

100000 cellules sont cytocentrifugées sur lames avant d’être fixées pendant 15

minutes. Pour le cytochrome c et EndoG, les cellules sont fixées par la paraformaldéhyde

(4%), lavées en PBS et perméabilisées pendant 15 minutes en présence de Triton X-100

(0.1%). Pour AIF, les cellules sont fixées en présence de méthanol (100%) à -20°C puis

lavées en PBS et incubées pendant 15 minutes avec de la BSA (3%). Après lavage, les lames

sont incubées pendant une heure en présence des anticorps primaires anti-cytochrome c

(clone 6H2.B4, 5µg/ml, BD Biosciences), anti-EndoG (1µg/ml, ψProSci) ou anti-AIF (clone

E-1, 4µg/ml, Santa Cruz Tebu) avant une incubation d’une heure en présence de l’anticorps

111

secondaire anti-IgG de souris couplé au FITC (4µg/ml, Molecular Probes). Les lames sont

ensuite analysées par microscopie confocale.

VIII- Analyse des sphingolipides

VIII-1 Extraction lipidique

Les culots cellulaires sont repris par 200 µl d’eau distillée et homogénéisés par

sonication. 30 µl sont conservés pour le dosage protéique par la méthode de Bradford. 850 µl

de chloroforme/méthanol (2 :1, v/v) sont ajoutés au 170 µl d’extraits restant. Après mélange

et centrifugation à 2500 rpm pendant 15 minutes, la phase inférieure est récupérée et lavée

avec une phase supérieure synthétique constituée de chloroforme/méthanol/eau (3 :48 :47,

v/v/v), puis évaporée sous azote.

VIII-2 Dosage du céramide (méthode de la DAG kinase)

Le principe de la méthode repose sur la capacité de la DAG kinase à phosphoryler le

DAG et le céramide. Les extraits lipidiques sont solubilisés par 40 µl de solution détergente

(di-oléoyl-phosphatidyl-glycérol/octyl-β-glucoside), vortexés, soniqués et incubés en

présence de DAG Kinase d’E.coli (isolée à partir de bactéries fournies par les Drs. D. Perry et

Y.A. Hannun (Charleston, SC)) et d’ATPγP32 à température ambiante pendant 30 minutes.

La réaction est stoppée par l’addition de 250 µl d’eau contenant 1% d’acide perchlorique,

400 µl de chloroforme et 400 µl de méthanol. Une centrifugation à 2500 rpm pendant 10

minutes permet d’isoler la phase inférieure contenant le céramide-1-phosphate et l’acide

phosphatidique. La phase inférieure est ensuite évaporée sous azote puis solubilisée par 60 µl

de chloroforme/méthanol (2:1, v/v). 20 µl de cet extrait sont séparés sur une plaque de silice

dans un système de migration contenant chloroforme/acétone/méthanol/acide acétique/eau

(50:20:15:10:5, v/v/v/v/v). Les bandes correspondant au céramide-1-phosphate et à l’acide

phosphatidique sont révélées par autoradiographie, grattées et comptées par scintillation.

112

VIII-3 Analyse du profil sphingolipidique

3 millions de cellules Jurkat sont incubées en présence de [3H]-sphingosine (0,33

µCi/ml) (PerkinElmer), un précurseur de la synthèse des sphingolipides, pendant 48 heures

ou 72 heures pour marquer les sphingolipides à l’équilibre. Après 2 heures de « chasse »

(incubation des cellules en présence d’un milieu non radioactif), les cellules sont incubées en

présence de FasL aux concentrations et pendant les temps indiqués avant d’être récoltées et

centrifugées à 1500 rpm. Les lipides sont extraits à partir des culots cellulaires (cf chapitre

VIII-1). Les résidus lipidiques sont repris par 20 µl de chloroforme/méthanol (2 :1, v/v) puis

séparés par chromatographie sur couche mince dans un système de migration contenant

chloroforme/méthanol/eau (100:42:6, v/v/v). La distribution des sphingolipides radiomarqués

sur la plaque de chromatographie est analysée grâce à un radiochromatoscanner (Bertold).

Des lipides standards permettent d’identifier les différents sphingolipides qui sont ensuite

grattés puis quantifiés par scintillation.

Dosage de la sphingomyéline (SM) et des PC(phosphatidylcholine) :

Alternativement, 3 millions de cellules sont incubées en présence de [3H]-choline

(1µCi/ml) (PerkinElmer) pendant 48 à 72 heures pour permettre le marquage de la SM et des

PC à l’équilibre. La SM et les PC radiomarqués sont ensuite séparés par méthanolyse

alcaline. Ainsi, après extraction lipidique (cf chapitre VIII-1), les résidus lipidiques sont

solubilisés dans 84µl de chloroforme et 84µl de soude méthanolique 0,5 M. Le mélange est

incubé à 37°C pendant 2 heures sous agitation et la réaction de méthanolyse est arrêtée par

l’ajout de 84µl d’acide chlorhydrique méthanolique (HCl 0,5 M), 144 µl d’eau, 284 µl de

chloroforme et 167 µl de chloroforme/méthanol (2 :1, v/v). Après mélange et centrifugation

à 2500 rpm pendant 10 minutes, la phase supérieure contenant la glycérophosphocholine

marquée est comptée par scintillation. La phase inférieure contenant la SM radioactive est

lavée deux fois par une phase supérieure synthétique constituée de chloroforme/méthanol/eau

(3 :48 :47, v/v/v) avant d’être évaporée sous azote et comptée par scintillation liquide.

VIII-4 Mesure de la synthèse de sphingomyéline

3 millions de cellules Jurkat sont incubées en présence de [3H]-choline (1µCi/ml)

pendant 4 heures pour permettre le marquage des PC, un précurseur de la synthèse de

sphingomyéline. Puis les cellules sont lavées et incubées dans un milieu froid en présence ou

113

non de FasL pendant les temps indiqués avant d’être récoltées et centrifugées à 1200 rpm à

4°C. Les culots cellulaires sont immédiatement congelés à -20°C. Les PC et la SM

radiomarqués sont quantifiés après la réaction de méthanolyse alcaline comme décrit

précédemment (cf chapitre VIII-3).

VIII-5 Dosage des activités enzymatiques de la SMS et de la GCS

In situ : Les activités de la SMS et GCS sont évaluées en culture par la quantification

de la conversion de C6-NBD-Céramide en C6-NBD-SM et C6-NBD-GlcCer. 1 million de

cellules Jurkat sont incubées dans 1ml de RPMI 10 % SVF et 2,5 µM de C6-NBD-Céramide

(Sigma) pendant 2 heures à 37°C. L’ajout de 5 ml de chloroforme/méthanol (2 :1, v/v)

permet d’arrêter la réaction. Les lipides sont extraits par une centrifugation à 2500 rpm

pendant 10 minutes permettant la séparation de la phase inférieure lipidique qui est ensuite

évaporée sous azote. Les lipides sont solubilisés par 20 µl de chloroforme/méthanol (2 :1,

v/v) et séparés par chromatographie sur couche mince dans un système de migration

contenant chloroforme/méthanol/30%Ammoniac (70 :30 :5, v/v/v). Les bandes correspondant

au C6-NBD-Ceramide, au C6-NBD-SM et au C6-NBD-GlcCer sont révélées sous UV,

solubilisées dans 1 ml de chloroforme/méthanol (1 :1, v/v) puis quantifiées par

spectrofluorimétrie (λexcitation = 470 nm ; λémission = 530 nm).

In vitro : 100 µg d’extraits protéiques de cellules traitées par FasL sont repris dans

250 µl de tampon de réaction contenant MgCl2 (5 mM), MnCl2 (5 mM), EDTA (1 mM),

Hépès (50 mM). Le mélange est incubé en présence de 250 µl de substrat contenant 400 µM

de PC (Sigma), 5µM de C6-NBD-Ceramide et 400 µM de UDP-Glucose pendant 30 minutes

à 37°C. La réaction est arrêtée avec 2,5 ml de chloroforme/méthanol (2 :1, v/v). Puis le

mélange réactionnel est centrifugé 10 minutes à 2500 rpm. La phase inférieure est évaporée

sous azote. Les lipides sont séparés par chromatographie sur couche mince comme décrit

pour le dosage in vitro.

IX- Analyse de l’expression des ARNm

L’ARN total est isolé à partir de cellules Jurkat grâce au kit QIAGEN RNeasy kit

(Qiagen) et soumis à une réverse transcription en utilisant des oligo(dT)15 (Promega) et

Superscript II (Invitrogen). Les ADNc obtenus sont analysés par PCR (Polymerase Chain

Reaction) en temps réel en utilisant des primers spécifiques de la SMS1, SMS2 et GAPDH

114

(Qiagen) et un Master mix Power SYBR Green PCR (Applied biosystem). L’amplification

est effectuée grâce à un Taqman 7900 (Applied biosystem).

Alternativement, les ADNc sont amplifiés par 30 cycles de PCR en utilisant GoTaq Flexi

DNA Polymerase (Promega) et des primers specifiques pour la SMS1 (primer sens :

CATTTCAACTGTTCTCCGAAGC; primer antisens : CCATAGTGTGATACCACCAG), la

SMS2 (primer sens :TTAATCTGCTGGCTGCTGAG; primer antisens :

ACCAATCTTCTGAACCCGTG) et GAPDH (primer sens :

AACATCATCCCTGCCTCTACTG ; primer antisens :

TTGACAAAGTGGTCGTTGAGG). Des ADNc isolés à partir de fibroblastes de peau

humaine et des vecteurs codant pour les ADNc de la SMS1 et SMS2 sont utilisés comme

contrôles positifs. Les amplifications sont réalisées dans un thermal Cycler (Biorad) et les

produits d’amplifications sont analysés par migration sur un gel d’agarose 0,8 % et une

coloration au bromure d’éthidium.

X- Anticorps et autres réactifs

La concentration ou la dilution utilisée est indiquée. z-VAD(OMe)-fmk (40µM) et z-

AE(OMe)-VD(OMe)-fmk (10 µM) (Bachem), D609 (50 µg/ml) (Sigma).

Anticorps : Anti-FADD (clone A66-2, 0,5 µg/ml, BD Biosciences), anti-Caspase-8 (clone

B9-2, 0,5 µg/ml, BD Biosciences), anti-Bcl-xL (clone 2H12, 1µg/ml, BD Biosciences), anti-

Caspase-10 (clone 4C1, 1µg/ml, MBL), anti-Caspase-3 polyclonal (10µg/ml, DAKO), anti-

Caspase-7 polyclonal (1/1000, Cell Signaling Technology), anti-PARP polyclonal (1/1000,

Cell Signaling Technology), anti-PARP clivé (clone 19F4, 1/1000, Cell Signaling

Technology), anti-Bid polyclonal (1/1000, Cell Signaling Technology), anti-cytochrome c

pour Western-blot (clone 7H8.2C12, 1µg/ml, BD Biosciences), anti-Rip monoclonal (1/1000,

BD Biosciences), anti-CCTα (clone 7H8, 1/1000, Abnova), anti-β-Actine (clone AC-15,

5µg/ml, Sigma).

115

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RESUME

La mort des lymphocytes T est un processus essentiel pour le maintien de l’homéostasie

lymphocytaire et le contrôle de la réponse immunitaire. Le récepteur Fas (CD95) et son ligand

FasL (CD95-L) jouent un rôle clé dans la mort des lymphocytes T. Chez l’homme, des

mutations affectant Fas, FasL ou les caspases-8 et -10 sont responsables d’ALPS

(Autoimmune lymphoproliferative syndromes), soulignant l’importance de ces protéines en

physiopathologie. La caspase-8 a été montrée comme essentielle dans l’apoptose induite par

la stimulation de Fas. Toutefois, des travaux récents suggèrent l’existence de voies de

signalisation indépendantes de la caspase-8. Le céramide, un sphingolipide bioactif, joue un

rôle potentiel dans l’induction de la mort cellulaire. L’objectif de notre travail a été de

clarifier le rôle des caspases et du céramide dans la mort de lymphocytes T induite par FasL.

Nos résultats indiquent que la caspase-10 est capable de se substituer à la caspase-8 dans la

signalisation apoptotique de Fas, en clivant Bid (Bcl-2 interacting domain) et en activant la

cascade des caspases dans des cellules Jurkat. De plus, nous montrons que les caspases-8 et -

10 jouent un rôle dans la production de céramide et dans l’induction d’une mort nécrotique,

indépendamment de leur activité catalytique.

Une inhibition de l’activité de la sphingomyéline synthase (SMS), une enzyme qui convertit

le céramide en sphingomyéline, est détectée en réponse à la stimulation de Fas dans des

cellules sensibles mais pas dans des cellules résistantes. L’inhibition préalable de la SMS, par

approche pharmacologique ou épigénétique (siRNA), favorise l’augmentation du taux

intracellulaire de céramide et la mort en réponse à FasL. L’incubation de cellules Jurkat en

présence d’analogues exogènes de céramide s’accompagne d’une toxicité, suggérant un rôle

du céramide dans la signalisation cytotoxique de Fas.

L’ensemble de nos résultats mettent en évidence le rôle essentiel des caspases-8 et -10 dans la

mort apoptotique et nécrotique des lymphocytes T induite par FasL. De plus, l’inhibition de

l’activité de la SMS favorise l’accumulation intracellulaire de céramide et pourrait participer

activement à la mort des lymphocytes T induite par FasL. Interférer avec le métabolisme

sphingolipidique et notamment avec l’activité de la SMS, pourrait représenter une nouvelle

stratégie thérapeutique capable de sensibiliser des cellules résistantes à FasL ou aux

traitements anticancéreux.