OOvervågningningOvervågning

for ringbakterioseteriose

i kartofler

for ringbakteriose

i kartofler

Informationfolder kartofler 14/10/04 8:58 Side 1

2

Denne folder er udarbejdet af Plantedirektoratet for at informere kartoffel-

avlere om, hvordan prøver til analyse for ringbakteriose udtages, analyseres

og hvordan avlerne får information om analyseresultatet.

Ringbakteriose er en karantæneskadegører i kartofler. Bakterien, der forår-

sager sygdommen, udgør stadig en trussel for kartoffelerhvervet og for den

enkelte avler. Det er derfor vigtigt, at der foregår et samarbejde om bekæmp-

else af ringbakteriose mellem de enkelte avlere, erhvervet og myndigheder-

ne. Overvågningen for ringbakteriose foretages efter samme retningslinier i

hele EU ved prøvetagning og laboratorieundersøgelser i henhold til det

gældende EU-Direktiv. I Danmark er det Plantedirektoratet, der overvåger

for ringbakteriose.

Der har igennem de seneste år været et fald i fund af ringbakteriose i kar-

tofler. Dette skyldes især, at der har været en struktureret indsats indenfor

følgende områder;

· Avlerne har taget mange forholdsregler, der forebygger mod ringbakte-

riose som f.eks. årlig rengøring og desinfektion af produktionsapparatet

· Det officielle certificeringssystem for danske læggekartofler reducerer

risikoen for spredning

· Som udgangsmateriale for læggekartofler bruger erhvervet meristem-

kultur

· Plantedirektoratet foretager intens overvågning for skadegøreren

herunder survey i læggekartofler og udskiftningskontrol i produktionen

af spise-, foder- og industrikartofler

· Indenfor EU anvender de officielle kontrolmyndigheder testmetoder

til diagnostik af bakterien i latent smittede knolde

2

Informationfolder kartofler 14/10/04 8:59 Side 2

Latent smittede kartoffelknolde, det vil sige tilsyneladende sunde knolde udgør

den egentlige fare for kartoffelavlen, idet sygdommen kan spredes uden man er klar

over problemet. Plantedirektoratet foretager derfor overvågning for ringbakteri-

ose i latent smittede kartoffelknolde med specielt fokus på læggekartoffelavlen.

Symptomer i latent smittede kartoffelknolde

Ved fremskredne angreb af ringbakteriose vil man sjældent være i tvivl om årsa-

gen. I de tilfælde vil ledningsvævet være blødråddent og brunfarvet og der kan

forekomme synlige revner på overfladen. Imidlertid er det som nævnt latent smit-

tede knolde, der udgør den største risiko for spredning af ringbakteriose. Ved at

lave et tværsnit af latent smittede knolde, vil man ved et begyndende angreb se

en svag pletvis gulfarvning af ledningsvævet ca.

0,5 cm under skrællen. Trykker man på en så-

dan gennemskåret knold, vil det gulfarvede væv

presses ud som tandpasta af en tube og have

konsistens som kartoffelmos. Er der tale om et

mere fremskredent angreb, vil ledningsvævet

blive mere blødråddent og brunfarvet.

Prøvetagning og prøveidentifikation

I forbindelse med overvågningen udtager Plantedirektoratets kontrollører knolde

hos avlerne der sendes til laboratorieundersøgelser. Da alle knolde i et parti natur-

ligt nok ikke kan udtages til testen, vil der være tale om en stikprøve, der bliver udta-

get så repræsentativt som muligt. Den naturlige opblanding, der sker under frilæg-

ning, optagning og indlægning i kule eller boks, er her en stor fordel. For yderligere

at gøre prøven så repræsentativ for partiet som muligt, udtager kontrolløren de 200

knolde, der skal bruges til en prøve, på mindst 10 forskellige steder i partiet.

Ringbakteriose bevæger sig normalt fra moderknolden til døtreknolde via navle-

strengen. Det er derfor i døtreknoldenes navleender den største koncentration

af eventuelle bakterier kan findes. Navleenderne udskæres fra kartoffelknoldene

og analyseres i Plantedirektoratets laboratorium. Til hver prøve følger et sæt streg-

kodemærkater til laboratorieundersøgelserne.

Overvågning for ringbakteriose i kartofler I 3

Overskåret kartoffelknold med symptomer

på ringbakteriose.

Informationfolder kartofler 14/10/04 9:00 Side 3

Laboratorieundersøgelser

Hver prøve behandles meget omhyggeligt for at undgå smitte fra den ene

prøve til den anden. Stregkodemærkater anvendes til alle dele af analysen

og sikrer identifikation af prøven gennem hele forløbet. Endvidere er prø-

ven anonym for medarbejderne i laboratoriet, indtil analysen er afsluttet og

analysebeviset er udskrevet. I Plantedirektoratets laboratorium er analysen

af kartoffelprøver for Ringbakteriose akkrediteret i henhold til ISO 17025,

som sikrer kvaliteten af analysearbejdet.

Udvinding af bakterier fra kartoffelprøven

Navleenderne overføres til engangsplastikbøtter, hvor en stregkode påkli-

stres. Der tilsættes ekstraktionsvæske til prøven og plastikbøtterne sættes

på et rysteapparat i 4 timer. Hvis der er ringbakteriose-bakterier i prøven,

vil bakterierne trænge ud i vandet. Rystevandet fra plastikbøtterne indehol-

dende eventuelle bakterier opkoncentreres ved centrifugering (kartoffelek-

strakt) og benyttes derefter til de forskellige testmetoder.

Testmetoder

Der anvendes testmetoder, der er baseret på biologisk forskellige princip-

per for at sikre optimal sikkerhed for resultaterne af laboratorieanalyserne.

Det drejer sig generelt om IF-test, PCR-test og ægplantetest. Men der kan

også iværksættes andre supplerende undersøgelser (f.eks. selektiv opfor-

mering af ringbakteriose-bakterier fra kartoffelprøven). Ved alle undersøg-

elser indgår brug af positive og negative kontroller for at dokumentere om

resultatet af en given test er brugbart.

4

Laboratorieundersøgelse Princip for analysen

IF-test (serologisk test - antistof) Genkendelse af bakteriens

overfladestrukturer

PCR-test (DNA-baseret test) Genkendelse af et specifikt stykke

genetisk materiale (DNA)

Ægplantetest (patogenitetstest) Test af om bakterien kan fremkalde

symptomer på en værtplante

Informationfolder kartofler 14/10/04 9:00 Side 4

Alle prøver undersøges ved en 1. screeningstest. Ifølge den gældende lovgivning

fra 1993 er den første screeningstest altid en IF-test. Ifølge EU-Direktivet, der træ-

der i kraft 2004/2005 kan denne test være enten IF eller PCR. Når prøven er

under mistanke efter 1. screeningstest gennemføres straks efter en 2. screening-

stest til at af- eller bekræfte svaret fra 1. screeningstest. Hvis mistanken ikke kan

bekræftes ved 2. screeningstest (eller ved en anden supplerende undersøgelse),

er prøven negativ. Hvis mistanken bekræftes, iværksættes ægplantetesten med

det samme. På det tidspunkt vil Plantedirektoratet orientere avleren om mistan-

ken. Det endelig svar på prøven kan først udmeldes til avleren, når resultatet af

ægplantetesten foreligger.

Overvågning for ringbakteriose i kartofler I 5

Plastikbægre med kartoffelpropper til rystning. Stregkoden følger prøven ved alle laboratorieundersøgelser.

Informationfolder kartofler 14/10/04 9:01 Side 5

6

Ægplantetesten

Til endelig bekræftelse eller afkræftelse af fund af ringbakteriose i kartoffel-

prøver anvendes ægplantetesten. Ved denne metode sprøjtes kartoffeleks-

traktet direkte ind i stænglen på ægplanten. I ægplanten vil der ske en opfor-

mering af eventuelle ringbakteriose-bakterier og spredning til de yngre blade.

I løbet af 2-4 uger reagerer planten

på bakterieangrebet, så enkelte blade

mister saftspændingen i afgrænsede

områder. Fra ægplantestængler og -

blade kan bakterierne efterfølgende

isoleres i renkultur. Det undersøges

afslutningsvis om de bakterier, der er

isoleret fra planten, er IF- eller PCR-

positive. Hvis det er tilfældet, er det

endeligt bekræftet, at prøven inde-

holdt ringbakteriose-bakterier.

IF-test

Undersøgelsesproceduren består i, at man tager en dråbe af kartoffelekstrak-

tet og overfører det til en lille glasplade. Dråben tørres ind på glasset. Der-

efter tilsættes en dråbe antistof, der udelukkende vil koble sig til ringbakte-

riose-bakterier. Derefter tilsættes et fluorescerende farvestof, der binder sig

til antistoffet og gør, at bakterierne kan ses i mikroskopet.

Ser man derefter på glaspladen i et

mikroskop og belyser med en be-

stemt bølgelængde, vil ringbakte-

riose-bakterier vise sig som små

fluorescerende lysende celler. En

prøve uden fluorescerende celler vil

kaldes negativ. En prøve, hvor der

findes fluorescerende celler, der

samtidig har en karakteristisk form

og størrelse, kaldes IF-positiv. IF-test. Renkultur af ringbakteriose-bakterier.

Ægplantetest.

Informationfolder kartofler 14/10/04 9:01 Side 6

Vurdering af resultaterne

Generelt gælder det;

· at et parti kartofler betragtes som fri for ringbakteriose, når den indledende

1. screeningstest giver negativt resultat i alle prøver.

· at et parti kartofler betragtes som angrebet af ringbakteriose,

hvis ægplantetesten giver positivt resultat i blot en enkelt prøve.

Når der ikke er fund af ringbakteriose i en kartoffelprøve, vil avleren kun modta-

ge et analysebevis for de enkelte prøver fra Plantedirektoratet. I de tilfælde hvor

der er mistanke om fund, vil Plantedirektoratet orientere avleren om mistanken og

båndlægge avlen inden fundet er bekræftet. Hvis fundet bekræftes, modtager av-

leren analysebeviset og et brev om restriktioner for avlen.

Overvågning for ringbakteriose i kartofler I 7

PCR-test

Ved PCR-testen udvindes først ringbakteriose-bakteriens genetiske materiale (DNA)

fra kartoffelekstraktet. Ved en speciel teknik (PCR=polymerase chain reaction) laves

der mange kopier af et lille stykke af bakteriens DNA. Det DNA, der kopieres er ene-

stående for netop ringbakteriose-bakterien. Dette stykke DNA synliggøres som et

bånd som vist på figuren. Som en kontrol for at metoden er gennemført rigtigt opfor-

meres tilsvarende et lille stykke DNA, der er enestående for kartoffelvævet i prøven.

Dette giver en sikkerhed for at et falsk negativt resultat opdages. Hvis der ikke er

noget bånd, der er karakteristisk for kartoffelvævet, kan resultatet ikke bruges og un-

dersøgelsen vil blive gentaget. Hvis der kun forekommer ét bånd som har en størrelse,

der er karakteristisk for kartoffelvævet, er prøven negativ.

M P N 1 2 3 4 5 6 7 8 9PCR-test. I bane M ses mange DNA-bånd. Disse

bruges som en lineal så man kan vurdere størrelsen

på de bånd, der fremkommer i kartoffelprøverne. I

bane P ses ét DNA-bånd, der er karakteristisk for

ringbakteriosebakterier. I bane N ses ét DNA-bånd,

der er karakteristisk for kartoffelvævet. I bane 1-9 er

vist resultatet af PCR-testen på forskellige kartoffel-

prøver. Der er i de fleste prøver bånd af begge stør-

relser, som tegn på at der er ringbakteriose i alle

disse prøver. For de prøver, hvor båndet for kartoffel-

vævet mangler, skal undersøgelsen gentages for at

kunne afgøre om prøven er positiv eller negativ.

Informationfolder kartofler 14/10/04 9:02 Side 7

8

Negativ

Negativ

Kontolløren udtager

kartoffelprøven hos avler

Plantedirektoratets laboratorium

modtager prøven

Udvinding og opkoncentrering

af kartoffelekstrakt fra navleender

fra kartoffelprøven

1. screeningstest

2. screeningstest

(og evt. andre supple-

rende undersøgelser)

Avler får brev fra

Plantedirektoratet

vedr. mistanke om

fund af

Ringbakteriose

Ægplantetest

Avler får tilsendt analysebevis og restrik-

tionsbrev fra Plantedirektoraret

Avler får tilsendt

analysebevis fra

Plantedirektoratet

Avler får tilsendt

analysebevis fra

Plantedirektoratet

Avler får tilsendt

analysebevis fra

Plantedirektoratet

Negativ

Positiv

Oversigt over kartoffelprøvens gang i Plantedirektoratet

Positiv

Positiv

Positiv

Informationfolder kartofler 14/10/04 9:02 Side 8