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CD. OBR
CUA
CRO
INSTITUTO TECNOLOGICO DE SONORAMAYO DE 2005 EGÓN, SONORA
OLIVIERT MARTÍNEZ CRUZ
PRESENTA
TESIS
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE
INGENIERA BIOTECNÓLOGA
NTIFICACIÓN DE ÁCIDO LÁCTICO DURANTE EL
ENSILAJE DE RESIDUOS DE CAMARÓN POR
MATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN
Este trabajo fue aceptado para presentarse en:
28th International Symposium on Capillary Chromatography and Electrophoresis. Las Vegas, Nevada, May 22-25, 2005.
Quantification of Organic Acids during Ensilation of Shrimp Waste by High
Performance Liquid Chromatography
Jaime López-Cervantes, Dalia I. Sánchez-Machado*, Oliviert Martínez Cruz. Departamento de Biotecnología y Ciencias Alimentarias, Instituto Tecnológico de Sonora, P. O. Box 541,
Cd. Obregón, Sonora, México.
i
DEDICATORIAS
A Dios por otorgarme la fuerza y paciencia para no rendirme ante las adversidades.
A mis padres y mi hermano para quienes mi gratitud no tiene límites. A quienes no
podré pagar nunca los principios que sobre todo con el ejemplo de sus vidas
influyeron en mí desde la niñez, hasta llegar a ser lo que soy.
Hoy es el día más feliz, porque he logrado una de las más importantes metas de mi
vida, que sin ustedes no hubiera alcanzado.
Lo valioso padres, no se encuentra en un papel, sino en la defensa que haré por el.
Por el amor que compartimos y por ser la luz que guiará mi camino.
ii
AGRADECIMIENTOS
A Dios por darme la oportunidad de vivir y alcanzar esta meta.
A mis padres, Oliviert y Jesús Manuel, por su apoyo y amor en los momentos
difíciles.
A mi hermano, Jesús Manuel, por todo el tiempo invertido en el combate al stress,
gracias por compartir tu alegría.
A la familia Rivera Pérez, por adoptarme como su hija y el apoyo brindado.
A mis asesores, Dr. Jaime López y Dra. Dalia Sánchez, por confiar en mí para
desarrollar el trabajo de investigación, por sus consejos y la disponibilidad para
resolver cualquier duda.
A mis ángeles, Jesús Alfredo, Rosario, Crisalejandra, Jhonatan y Darío, por estar
conmigo en los momentos en que mas los necesitaba.
A mis amigos y compañeros de tesis, Karina, Lilian, Raúl y Sayda por alentarme
cuando las cosas se tornaban difíciles, así como también a Patricia, Berenice y
Teresa.
A todos mis amigos y compañeros de clases, por compartir momentos inolvidables
conmigo.
iii
Índice
Pag. LISTA DE TABLAS…………………………………………………………………. v
LISTA DE FIGURAS………………………………………………………………... vi
RESUMEN……………………………………………………………………………. vii
INTRODUCCIÓN
JUSTIFICACIÓN…...…………………………………………………………….….. 3
OBJETIVO…….………………………………………………………………........... 5
HIPÓTESIS..… ……………………………………………………………………… 6
I. ANTECEDENTES BIBLIOGRÁFICOS
1.1 Fermentación láctica de residuos de camarón……………………………... 7
1.1.1 Características morfológicas y nutricionales del camarón……… 7
1.1.2 Fermentación láctica…………………………………………………. 10
1.1.3 Probióticos…………………………………………………………….. 11
1.2 Ácidos orgánicos……………………………………………………………….. 12
1.3 Cromatografía…………………………………………………………………... 16
1.3.1 Teoría cromatográfica……………………………………………….. 16
1.3.2 HPLC…………………………………………………………………... 19
1.3.3 Validación de métodos analíticos…………………………………... 22
1.4 Métodos propuestos para el análisis de ácido
láctico…...……………………………………………………………………………..
24
1.4.1 Pretratamiento de la muestra……………………………………….. 25
1.4.2 Condiciones cromatográficas……………………………………….. 27
II. METODOLOGÍA
2.1 Patrones y reactivos químicos………………………………………………… 28
2.2 Preparación del residuo de camarón…...……………………………………. 28
2.3 Condiciones de fermentación…………………………………………………. 29
2.4 Pretratamiento de la muestra…………………………………………………. 32
2.5 Equipo y condiciones HPLC…………………………………………………... 32
iv
III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.1 Optimización de la fermentación láctica del residuo de camarón…………. 34
3.2 Preparación de la muestra…………………………………………………….. 37
3.3 Establecimiento de las condiciones cromatográficas………………………. 38
3.4 Identificación del ácido láctico………………………………………………… 42
3.5 Validación del método…………………………………………………………. 43
3.5.1 Linealidad……………………………………………………………… 43
3.5.2 Precisión……………..………………………………………………… 44
3.5.3 Recuperación……………..…………………………………………… 45
3.6 Aplicabilidad del método: muestreo…………………………………………… 46
CONCLUSIÓN……………………………………………………………………….. 49
BIBLIOGRAFIA................................................................................................. 50
v
LISTA DE TABLAS
Tabla Título Pág.
1
Composición en 100 g de parte comestible del camarón……………
9
2 Composición del cefalotórax (% base seca).…………………………. 9
3 Clasificación de los métodos cromatográficos en columna.………… 18
4 Características de los detectores de cromatografía líquida………… 21
5 Pretratamiento de la muestra para la determinación de ácidos
orgánicos…………………………………………………………………..
26
6 Condiciones cromatográficas para el análisis de ácidos orgánicos
por HPLC………………………………………………………………….
27
7 Condiciones de la fermentación láctica de los residuos de
camarón…………………………………………………………………...
29
8 Condiciones cromatográficas para el análisis……………………….. 41
9 Tiempo de retención del ácido láctico……………..………………….. 42
10 Parámetros y coeficiente de correlación (r2) de la recta patrón del
ácido láctico….…………………………………………………………...
43
11 Valores de precisión del método……………………………………….. 45
12 Valores de recuperación del método..………………………………… 46
13 Contenido de ácido láctico presente en las muestras agitadas…….. 47
14 Contenido de ácido láctico presente en las muestras sin
agitación.............................................................................................
47
vi
LISTA DE FIGURAS
Figura Título Pág.
1
Caracteres anatómicos y morfológicos externos de un camarón
penéido……………………………………………………………………..
8
2 Tratamiento de los residuos de camarón, las condiciones de
fermentación y el monitoreo de pH y acidez total titulable…………..
31
3 Procedimiento para el tratamiento de la muestra y las condiciones
para el análisis cromatográfico………………………………………….
33
4 Comportamiento del pH en la fermentación bajo condiciones de
agitación…………………………………………………………………….
35
5 Comportamiento de la ATT en la fermentación bajo condiciones de
agitación…………………………………………………………………….
36
6 Comportamiento del pH en la fermentación sin agitación……………. 37
7 Influencia de la temperatura en el tiempo de retención………………. 39
8 Influencia de la velocidad de flujo en el tiempo de
retención……………………………………………………………………
40
9 Cromatograma del patrón con las condiciones establecidas………… 41
10 Espectro de absorción del ácido láctico………………………………... 42
11 Recta patrón del ácido láctico..………………………………………….. 44
12 Comparación del tiempo de retención entre el patrón y la
muestra……………………………........................................................
48
vii
El presente trabajo describe el desa
de ácido láctico en la fermentación d
estudió el efecto de los diversos p
ácido orgánico. Con las condicio
método a través de parámetros co
RSD de 3.76 y recuperación con un
El ácido láctico fue cuantificado iso
metafosfórico en una columna 250
temperatura de la columna de 30 ºC
del ácido láctico en la fase líquida o
el cual se encontró en un rango en
mantener la calidad y valor nutricion
RESÚMEN
rrollo de un método HPLC para la determinación
e residuos de camarón. Para lograr lo anterior se
arámetros cromatográficos en la separación del
nes cromatográficas establecidas se validó el
mo: precisión y linealidad, expresados como %
valor de 101.67%.
craticamente con un eluyente conteniendo ácido
x 4.6 mm Extrasil ODS 5 µm (flujo 0.6 mL/min,
). El método fue empleado para la cuantificación
btenida del fermentado del residuo de camarón,
tre 26.05 y 75.76 mg/mL. El ácido láctico puede
al del ensilado.
En México la producción de cama
a partir de esto aproximadamente
y tórax). Actualmente solo el 5
manera, mayormente como alim
un problema ambiental (SAGARP
En el ensilaje el ácido láctico e
proporcionando el pH bajo del
microorganismos indeseables (
produce un cambio en el desper
días, debido a que el pH es
representa del 60 al 70% (peso h
y líquidos los cuales pueden ser
2001).
INTRODUCCIÓN
rón en 2003 fue considerada en 160 000 toneladas,
se generó 35-45% de residuo de camarón (cabeza
% del desecho del camarón es usado de alguna
ento animal, el remante es descartado y representa
A, 2003; Cira, 2002).
s producido por la transformación de la glucosa,
ensilaje lo que permite suprimir el crecimiento de
Rao et al., 2000). La fermentación ácido láctica
dicio de camarón de semi-sólida a líquida en 2 o 3
reducido y las proteasas son activadas. El líquido
úmedo) del ensilaje y esta compuesto de proteínas
utilizados para la alimentación animal (Shirai et al.,
Introducción 2
Los ácidos orgánicos producidos en el ensilaje ocurren extensamente en los suelos
agrícolas y son intermediarios en el metabolismo de compuestos de alto peso
molecular tales como carbohidratos, lípidos y proteínas. En alimentos, varios ácidos
orgánicos están presentes y el contenido de cualquier ácido ejerce un efecto
significativo en el sabor y aroma (Casella y Gatta, 2002). También, en la industria
farmacéutica, los ácidos orgánicos son utilizados como antioxidantes, preservativos,
acidulantes y como modificadores en la absorción de algún ingrediente activo (Daood
et al., 1994). Sin embargo, estos ácidos en la fermentación láctica mantienen la
calidad y el valor nutritivo del ensilado.
Numerosos métodos han sido utilizados para determinar los ácidos orgánicos en
materiales biológicos, incluyendo ensayos volumétricos, enzimáticos, colorimétricos,
espectrofotométicos, microfluorométricos, polarográficos y cromatográficos. De
estos, los métodos cromatográficos son los más extensamente utilizados debido a su
sensibilidad, simplicidad, rapidez y reproducibilidad (Vázquez et al., 1994).
La Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC) ha simplificado el análisis de
varios constituyentes alimenticios, incluyendo ácidos orgánicos. De hecho, estos
métodos presentan una rápida, sensible y específica determinación de ácidos
orgánicos en una variedad de muestras de interés científico y tecnológico, y algunos
métodos cromatográficos de intercambio iónico, ion-exclusion, ion-pair, y fase
reversa han sido desarrollados hasta la fecha para la separación y determinación de
estos compuestos (Blanco y Mangas, 1996).
3
Debido a la contaminación prove
del camarón de cultivo, y al poco
propone la fermentación láctic
aprovechamiento de estos dese
infraestructura, proporciona una
agregado como quitina, pigment
se espera lograr mejorar en
representar una alternativa a
desechos orgánicos y generar un
origen pecuario.
Por otro lado, para que el ensilaj
la cantidad de ácido producido du
evitará la contaminación por m
JUSTIFICACIÓN
niente de los desperdicios de la pesca, en especial
o nulo tratamiento que sufren al ser desechados se
a como una alternativa de aplicación para el
chos, ya que además de requerir poca inversión e
fácil separación de compuestos de alto valor
os y proteínas. A partir del desarrollo de tecnología
gran medida la situación ecológica del país, al
la problemática de contaminación ambiental por
a novedosa opción de utilización de los residuos de
e sea considerado de calidad es necesario conocer
rante la fermentación, ya que en función de éste se
icroorganismos indeseables. Además, al ser una
Justificación 4
fuente de ácido láctico, puede ser considerado como materia prima para obtener éste
ácido y destinarlo a diversos usos, entre ellos como conservador alimentario.
Además, es posible la polimerización para productos plásticos biodegradables, para
mejorar el batido del polvo de clara de huevo y el sabor de los encurtidos de
hortalizas y bebidas. Además, para impedir la decoloración de frutas y hortalizas.
Por todo lo anterior, en esta investigación se propone el desarrollo de un método
analítico para la cuantificación del ácido láctico producido durante la fermentación
láctica de los residuos de camarón.
5
General:
Valorar el contenido de ácido láctic
láctica del residuo de camarón, me
Alta Resolución con detector UV (HP
Específicos:
Estudiar el efecto de los pa
ácidos orgánicos.
Desarrollar un método HPLC
analítica.
Cuantificar el contenido de á
del residuo de camarón.
OBJETIVO
o producido durante el proceso de fermentación
diante la utilización de Cromatografía Líquida de
LC - UV).
rámetros cromatográficos en la separación de
para establecer los parámetros de validación
cido láctico al término de la fermentación láctica
6
HIPÓTESIS
La concentración de ácidos orgánicos se incrementa durante la fermentación láctica
de residuos de camarón.
1.1 Fermentación lác
1.1.1 Caracter
El camarón es un cr
cuerpo es algo enco
comercialmente cono
es una combinación
caparazón que contie
patas prensoras y dos
y termina en un rastr
seis segmentos. El ú
debajo está la cola qu
I. ANTECEDENTES BIBLIOGRÁFICOS
tica de residuos de camarón
ísticas morfológicas y nutricionales del camarón
ustáceo decápodo, macruro, de tamaño y color variables. Su
rvado y está dividido en dos partes, cefalotórax y abdomen,
cidos como cabeza y cola, respectivamente. El cefalotórax, que
de cabeza y tronco en una sola unidad, está cubierto por un
ne a la cabeza, los órganos vitales del animal, tres pares de
caminadoras. La cresta en la parte superior es rígida, dentada
o alargado por delante de la cabeza. El abdomen se divide en
ltimo de ellos termina en una punta fina llamada telson y por
e le sirve para nadar (Dore y Frimodt, 1987).
Antecedentes bibliográficos 8
En la figura 1 se muestran los principales caracteres anatómicos y morfológicos
externos de un camarón penéido (Peneaus vannamei).
Cefalotórax o cabeza Abdomen o cola
Dientes o espinas Rostro Antenas
Escapocerito
Antena o bigote
Periopodos o patas ambulacrales
Pleopodos o patas nadadoras
Uropodos
Telson Cadena dorsal
Surco dorso lateral
Pleuras
Fuente: Soluap, 1998.
Figura 1. Caracteres anatómicos y morfológicos externos de un
camarón penéido
El camarón es un alimento con alto contenido de proteínas y bajo en grasas. Debe
mencionarse que sólo el 50% del animal es comestible y que el restante 50% está
constituido por el cefalotórax, que no es comestible (Cañipa y Durán, 1997).
Por otro lado éste crustáceo, es excepcionalmente nutritivo, en la tabla 1 se presenta
la composición comestible y en la tabla 2 la composición del cefalotórax del animal
en base seca.
Antecedentes bibliográficos 9
Tabla 1. Composición en 100 g de parte comestible del camarón
Composición Parte comestible
Agua (g) 78.2
Proteína (g) 18.1
Grasa (g) 0.8
Carbohidratos (g) 1.5
Niacina (mg) 3.20
Calcio (mg) 63.00
Fósforo (mg) 166.00
Hierro (mg) 1.60
Tiamina (mg) 0.02
Calorías (cal) 91.00
Fuente: Charley, 2001.
Tabla 2. Composición del cefalotórax (% base seca) Componente % en base seca
Proteína cruda 41.93
Lípidos 10.2
Carbohidratos 2.47
Fibra cruda 15.17
Fuente: Oyedapo, 1996.
Antecedentes bibliográficos 10
1.1.2 Fermentación láctica
El término bacterias del ácido láctico, es un término general que se refiere a
bacterias que utilizan varios azúcares como la glucosa y lactosa para producir ácido
láctico mediante la fermentación. Entre las muchas bacterias lácticas los géneros
representativos se denominan Lactobacillus, Bifidobacterium, Streptococcus y
Leuconostoc. Estas bacterias se clasifican según su morfología y el tipo de
fermentación de ácido láctico (Torres, 2002; García et al., 2002).
Torres (2002), menciona que la fermentación con bacterias ácido lácticas es uno de
los métodos de preservación más antiguo. Sin embargo, fue hasta los años 70’s que
sus mecanismos de acción han sido investigados. Así mismo afirma que la inhibición
de muchas bacterias patógenas en alimentos fermentados es considerada como el
resultado de sustancias antimicrobianas producidas por las Bacterias Ácido Lácticas
(BAL) dando como resultado una preservación natural a través del antagonismo
bacteriano.
Según Madigan et al. (2001), los compuestos inhibitorios producidos por las BAL
incluyen:
a) Ácido láctico y otros ácidos volátiles con la consecuente disminución del pH.
b) Metabolitos primarios tales como peróxido de hidrógeno, dióxido de carbono y
diacetilo.
c) Bacteriocinas (especiales compuestos antimicrobianos)
Dependiendo del sustrato y microorganismos, el ácido láctico es el metabolito que
produce en mayor cantidad las BAL, además este ácido se ha reconocido por tener
un efecto antimicrobiano bueno, medio o pobre (Torres, 2002).
El bajo pH en que actúa la molécula no disociada, afecta en varios aspectos el
metabolismo celular, retarda el crecimiento de la flora asociada en los medios de
Antecedentes bibliográficos 11
cultivo. El ácido láctico y acético no disociado daña la membrana celular dando como
resultado la inhibición del transporte de sustrato y la actividad ATPasa (Torres, 2002;
Badui, 1999).
La literatura sobre la inhibición de bacterias patógenas por BAL es muy amplia. El
efecto antimicrobiano se puede demostrar tanto en medios de cultivo de laboratorio
como en los propios alimentos. Virtualmente cualquier bacteria patógena presente en
los alimentos es susceptible al efecto antagónico, si se utilizan cepas seleccionadas
y se coloca el sistema en condiciones apropiadas (Torres, 2002).
Rao et al. (2000), menciona que la eficiencia de la fermentación empleando bacterias
ácido lácticas depende de factores como la calidad del inóculo, glucosa, pH inicial y
durante la fermentación, cantidad y tipo de ácido usado para el ajuste de pH y el
tiempo de fermentación.
La bacteria comúnmente usada en la producción industrial de ácido láctico es
Lactobacillus delbrueckii. Tiene la ventaja de consumir eficientemente glucosa y ser
termofílico (temperatura óptima 45-62 ºC), presenta un pH óptimo entre 5.5 y 6.5,
como fuentes de carbohidratos son comúnmente utilizadas soluciones de sacarosa,
glucosa o hidrolizados de almidón. La fermentación dura entre 2-4 días y se termina
cuando todo el azúcar es consumido (García et al., 2002).
1.1.3 Probióticos
La palabra probiótico proviene del griego y significa << por la vida >>. Existen varias
definiciones de probióticos, pero la más completa de ellas expresa que son <<
cultivos puros, mezcla de cultivos de microorganismos vivos, que aplicados al
hombre o animales aportan efectos benéficos al huésped mejorando las propiedades
de la microflora nativa >>. Los probióticos se utilizan para mejorar la salud intestinal y
para estimular el sistema inmunológico (Mazza, 1998; Forsythe, 2000).
Antecedentes bibliográficos 12
Forsythe (2000), señala que la mayoría de estos microorganismos pertenecen al
grupo de las bacterias ácido lácticas y son utilizadas por la industria alimentaria para
la elaboración de productos fermentados. Las bacterias lácticas comúnmente
utilizadas en la preparación de probióticos incluyen algunas especies de los géneros
Streptococcus y Bifidobacterium.
Estos microorganismos podrían inhibir el crecimiento de microorganismos patógenos
mediante la producción de ácidos orgánicos y bacteriocinas y mediante la
desconjugación de las sales biliares (Mazza, 1998).
En algunos casos son los microorganismos probióticos en sí los que funcionan a
favor del huésped como es en el caso de los mecanismos antimicrobianos, mientras
que en otros casos, el probiótico puede modificar a microbios dañinos o la fisiología
del huésped para inducir una determinada acción benéfica. Cualquiera de las
preparaciones puede ser o no, necesariamente multifuncional (Torres, 2002).
1.2 Ácidos orgánicos De los compuestos orgánicos que muestran acidez apreciable, los ácidos
carboxílicos son los más importantes. Estas sustancias contienen el grupo carboxilo
unido a un hidrógeno, a un grupo alquilo o a un arilo. Trátese de un grupo alifático o
aromático, saturado o no, sustituido o no, las propiedades del grupo carboxilo son
esencialmente las mismas (Morrison, 1990).
Nomenclatura
Los nombres IUPAC siguen el esquema usual. La cadena más larga que contiene el
grupo carboxilo se considera como estructura matriz, y se nombra reemplazando la o
final del alcano correspondiente por la terminación oico, y se antepone la palabra
ácido. La posición de un sustituyente se indica de manera usual, mediante un
número (Wingrove y Caret, 1984).
Antecedentes bibliográficos 13
Propiedades físicas
Los ácidos monocarboxílicos con menos de cinco átomos de carbono son solubles
en agua. Presentan puntos de ebullición elevados; el ácido fórmico, que es el de
menor punto de ebullición, hierve a 100.5 ºC. El ácido fórmico y el ácido acético
tienen olores penetrantes y fuertes, en tanto que otros ácidos monocarboxílicos de
bajo peso molecular tienen olores desagradables. Los ácidos superiores tienen un
olor débil, debido probablemente a su escasa volatilidad (Rakoff y Rose, 1993).
Los ácidos orgánicos se encuentran comúnmente presentes en bebidas, alimentos,
medicina y en una variedad de muestras biológicas e industriales reales. Además,
estos compuestos se encuentran extensamente en suelos y son intermediarios en el
metabolismo de compuestos de gran peso molecular, tales como carbohidratos,
lípidos y proteínas. Así, muchas disciplinas científicas necesitan métodos analíticos
para la determinación exacta, sensitiva y rápida de los ácidos y sus derivados en
varios tipos de muestras. En alimentos, varios ácidos orgánicos están presentes y el
contenido de cualquier ácido tiene un efecto significativo en el sabor y aroma. En
este aspecto el análisis de los ácidos en alimentos y bebidas es importante en control
de calidad durante su producción, transformación, almacenaje y distribución (Casella
y Gatta, 2002).
Por otro lado Eiteman y Chastain (1997), señalan que los ácidos orgánicos
comúnmente presentes en los productos fermentados son trece: ácido acético,
butírico, cítrico, fórmico, fumárico, isobutírico, α-cetoglutárico, láctico, málico,
propiónico, pirúvico, succínico y úrico.
a) Ácido acético
La masa molecular del ácido acético es de 60.05 y es miscible con el agua en todas
las proporciones. Se utiliza a concentraciones elevadas en el caso de escabeches de
pescados, hortalizas (o frutas), en vinagre (inmersión en soluciones que contienen de
Antecedentes bibliográficos 14
0.5 a 5% de ácido) así como en mayonesas y en diversas emulsiones y salsas para
ensaladas, etc. (Multon, 2000).
En el presente, la mayoría de la demanda de ácido acético es conocida
artificialmente, la cual parecería ser la manera más económica en los últimos 100
años. La fermentación por especies de Acetobacter, los cuales convierten etanol a
ácido acético con una concentración final de un pequeño porcentaje (4-6%), ha sido
usada en su mayoría exclusivamente para la producción de vinagre (Crueger y
Crueger, 1993).
Por la pérdida de un carbono en forma de CO2 en la fermentación glucosa-etanol, la
máxima producción teórica de toda la reacción son 2 moles de ácido acético por una
mol de glucosa ó 0.67 g de ácido acético por gramo de glucosa (Ward, 1991). En la
práctica comercial, la producción actual es de 0.50-0.55 g de ácido acético por gramo
de glucosa ó 75-80% de la producción teórica (Danner y Braun, 1999).
Por otro lado, la acción microbiana del ácido acético se basa en la reducción del
valor de pH de los productos a conservar. Sin embargo, las concentraciones de ácido
acético requeridas con tal fin son muy grandes. Solo por encima de una
concentración de un 0.5%, este ácido ejerce una acción antimicrobiana al penetrar
en la pared celular y desnaturalizar las proteínas del plasma celular (Lück y Jager,
2000).
b) Ácido láctico
El ácido láctico es un líquido viscoso y no volátil, su masa molecular es de 90.08; la
del lactato sódico es 112.07. El lactato sódico es un buen depresor de la aw, casi tan
eficaz como el NaCl. Tiene además efectos favorables sobre la textura (aumento de
la flexibilidad) (Multon, 2000).
Antecedentes bibliográficos 15
El ácido láctico representa a un químico con un pequeño mercado mundial de 54500-
59000 toneladas por año. Mientras que el mercado de las aplicaciones tradicionales
de ácido láctico está estimado su crecimiento en 3-5% anual, los nuevos productos
basados en ácido láctico podrían incrementar parte del mercado mundial
significativamente. Nuevas aplicaciones para el ácido láctico incluyen el uso de
derivados como etil estéres para reemplazar solventes peligrosos como el
chlorinated hydrocarbon en aplicaciones seguras industriales. Además, el ácido
láctico puede ser polimerizado para plásticos biodegradables como fue demostrado
por Danone Inc. en forma de recipientes para yogurt (Danner y Braun, 1999).
Por otro lado Belitz y Grosh (1997), señalan que el ácido láctico se usa para mejorar
el batido del polvo de clara de huevo (ajustado a pH 4.8 – 5.1), para mejorar el sabor
de los encurtidos de hortalizas y de las bebidas, para impedir la decoloración de
frutas y hortalizas, así como en forma de lactato cálcico en la leche en polvo.
Según Crueger y Crueger (1993), teóricamente se producen dos moles de lactato a
partir de 1 mol de glucosa. En la práctica se obtiene más el 90% de este rendimiento
teórico. También menciona que los microorganismos utilizados son Lactobacillus
delbrueckii y L. leichmannii cuando se utiliza glucosa como sustrato, L. bulgaricus
con suero y L. petosus con líquidos sulfíticos. La producción se lleva a cabo a 45 –
50 ºC con un pH de 5.5 y 6.5, el tiempo de fermentación es de aproximadamente 72
horas.
Lück y Jager (2000), afirman que la acción microbiana del ácido láctico es
relativamente suave, manifestándose el efecto conservante solamente a
concentraciones superiores al 0.5%. Su acción está dirigida fundamentalmente frente
a las bacterias anaeróbicas. Un aspecto importante de su efecto es la reducción que
causa de pH. Puesto que muchas levaduras y mohos son capaces de utilizar
metabólicamente el ácido láctico, frecuentemente se combina con otros
conservadores, tales como el ácido benzoico y/o ácido sórbico, así también como
Antecedentes bibliográficos 16
con la pimaricina, al objeto de impedir la alteración de los alimentos por estos
microorganismos en particular.
1.3 Cromatografía
1.3.1 Teoría cromatográfica
En general, los métodos para el análisis químico son, en el mejor de los casos,
selectivos; pocos son verdaderamente específicos. En consecuencia, la separación
del analito de las posibles interferencias es a menudo una etapa de vital importancia
en los procedimientos analíticos. Hasta mediados del siglo XX, las separaciones
analíticas se llevaban a cabo en su mayor parte por métodos clásicos como
precipitación, destilación y extracción. Ahora, sin embargo, las separaciones
analíticas se realizan, en la mayoría de los casos, por cromatografía y electroforesis,
especialmente en el caso de las mezclas complejas y multicomponentes (Skoog et
al., 2001).
Las aplicaciones de la cromatografía han aumentado en gran manera en los últimos
cincuenta años, debido, no sólo al desarrollo de nuevos y diversos tipos de técnicas
cromatográficas, sino también a las necesidades crecientes, por parte de los
científicos, de mejores métodos para la caracterización de mezclas complejas.
Day y Underwood (1989), afirman que en todas las separaciones cromatográficas, la
muestra se desplaza con una fase móvil, que puede ser un gas o un líquido. Esta
fase móvil se hace pasar a través de una fase estacionaria con la que es inmiscible,
y que se fija a una columna o a una superficie sólida. Las dos fases se eligen de tal
forma, que los componentes de la muestra se distribuyen de modo distinto entre la
fase móvil y la fase estacionaria. Aquellos componentes que son fuertemente
retenidos por la fase estacionaria se mueven lentamente con el flujo de la fase móvil;
por el contrario, los componentes que se unen débilmente a la fase estacionaria, se
mueven con rapidez. Como consecuencia de la distinta movilidad, los componentes
Antecedentes bibliográficos 17
de la muestra se separan en bandas o zonas discretas que pueden analizarse
cualitativa y/o cuantitativamente.
Tejeda (1995), menciona que se pueden distinguir tres tipos básicos de
cromatografía por elución:
a) Cromatografía líquido–líquido: se utiliza un adsorbente sólido impregnado con
un líquido que funciona como fase estacionaria. La separación de los solutos
es resultado de las diferencias en los coeficientes de partición de cada uno de
los solutos de la mezcla entre las fases líquidas (estacionaria y móvil).
b) Cromatografía por filtración en gel: utiliza partículas fabricadas de geles
porosas que actúan como mallas moleculares que permiten separar moléculas
en función de su tamaño.
c) Cromatografía por adsorción: emplea adsorbentes en los que los solutos a
separar presentan diferentes grados de retención.
Una clasificación más fundamental de los métodos cromatográficos se basa en el
tipo de fase móvil y estacionaria, y en la clase de equilibrios implicados en la
transferencia de los solutos entre las fases. En la tabla 3 se observa la relación de
las tres clases generales de cromatografía: líquida, gaseosa y de fluidos supercríticos
(Skoog et al., 2001).
Con lo que respecta a cromatografía, la de papel y capa delgada son escasamente
sensitivos y proveen información de un rango cualitativo más que cuantitativo.
La cromatografía de gas es ocasionalmente utilizada para la determinación de ácidos
orgánicos. Sin embargo, debido a que muchos de ellos no son suficientemente
volátiles, requieren derivatización, lo cual complica los pretratamientos de la muestra
(Skoog et al., 2001).
Antecedentes bibliográficos 18
Tabla 3. Clasificación de los métodos cromatográficos en columna Clasificación general Método específico Fase estacionaria Tipo de equilibrio Cromatografía de líquidos (LC) fase móvil: líquida
Líquido-líquido, o reparto Líquido-Fase unida químicamente Líquido-sólido, o adsorción Intercambio iónico Exclusión por tamaño
Líquido adsorbido sobre un sólido Especies orgánicas enlazadas a una superficie sólida Sólido Resina de intercambio iónico Líquido en los intersticios de un sólido polimérico
Distribución entre líquidos inmiscibles Distribución entre el líquido y la superficie enlazada Adsorción Intercambio iónico Distribución/exclusión
Cromatografía de gases (GC) fase móvil: gas
Gas-líquido Gas-fase unida químicamente Gas-sólido
Líquido adsorbido sobre un sólido Especies orgánicas enlazadas a una superficie sólida Sólido
Distribución entre un gas y un líquido Distribución entre el líquido y la superficie enlazada Adsorción
Cromatografía de fluidos supercríticos (SFC) fase móvil: fluido supercrítico
Especies orgánicas enlazadas a una superficie sólida
Distribución entre el fluido supercrítico y la superficie enlazada
Fuente: Skoog et al. (2001).
Por otro lado, la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC por sus siglas en
inglés) ha simplificado el análisis de varios constituyentes de los alimentos,
incluyendo ácidos orgánicos. De hecho, arroja rápida, sensitiva y casi una específica
determinación de ácidos orgánicos en alimentos y bebidas, e incluye un tratamiento
de muestra sencillo. Una gran variedad de métodos cromatográficos han sido
desarrollados para la determinación de ácidos orgánicos en una variedad de
muestras de interés científico y tecnológico. El método de elección en cada caso esta
dictado por el tipo de ácido a ser determinado y sus proporciones, así como de la
naturaleza de la matriz que los contiene (Skoog et al., 2001).
Antecedentes bibliográficos 19
1.3.2 HPLC
Literatura reciente revela que los ácidos orgánicos en frutas, jugos, bebidas
fermentadas, vegetales y en alimentos de todos tipos, en general han sido
determinados con mayor frecuencia por HPLC sobre otros métodos de análisis. La
elección de la técnica de HPLC, para la separación de ácidos orgánicos en
alimentos, esta establecida esencialmente por su naturaleza y la de su matriz. El
método más utilizado para la determinación de ácidos orgánicos en alimentos y
bebidas es la cromatografía de exclusión iónica, seguida por cromatografía de fase
reversa. La mejor nitidez de los picos es obtenida utilizando columnas de exclusión y
por otro lado para análisis rápidos se emplean columnas de fase reversa (Blanco y
Mangas, 1996).
Columnas
Las columnas para cromatografía de líquidos se constituyen comúnmente con tubo
de acero inoxidable de diámetro interno uniforme, aunque en algunas ocasiones se
encuentran tubos de vidrio de paredes resistentes. Estas últimas sólo se utilizan a
presiones menores de 600 psi (Harris, 2001).
La mayoría de las columnas para cromatografía de líquidos tienen una longitud entre
10 y 30 cm. Por lo común, las columnas son rectas y se pueden alargar, si es
necesario, acoplando dos o más columnas. El diámetro interno de las columnas es a
menudo de 4 a 10 mm y los tamaños de las partículas de los rellenos más comunes
son 5 y 10 µm, las partículas son de sílice, alúmina, de una resina sintética de
poliestireno-divinilbenceno o resinas de intercambio iónico, aunque, sílice es el
material de relleno más común en cromatografía de líquidos. Tal vez la columna más
frecuentemente utilizada es la de 25 cm de longitud y 4.6 mm de diámetro interno, y
rellena con partículas de 5 µm. Este tipo de columnas tienen hasta 100 000 platos /
metro (Oliver, 1998).
Antecedentes bibliográficos 20
Detectores
Los detectores más frecuentemente utilizados en HPLC son los de índice refractivo
(RI por sus siglas en inglés), conductividad y UV-Vis. No hay duda que los detectores
de ultravioleta–visible son los más empleados en la actualidad para la determinación
de ácidos orgánicos en alimentos (Krull et al., 2001).
En la tabla 4 se indican los detectores más empleados en HPLC y algunas de sus
propiedades más importantes. Una revisión de 1982 sobre 365 artículos publicados
en los que la cromatografía de líquidos tenía un papel importante, reveló que el 71%
utilizaban la detección de la absorción UV, el 15% la fluorescencia, el 5.4% el índice
de refracción, el 4.3% empleaba medidas electroquímicas y el 4.3 restante otras
medidas (Skoog et al., 2001).
a) Detector ultravioleta.
El detector más común en HPLC es el detector de ultravioleta. Los sistemas más
simples utilizan la intensa raya de emisión a 254 nm de una lámpara de mercurio.
Los instrumentos más versátiles tienen lámparas de deuterio, xenón o volframio, y un
monocromador, con el que se puede elegir la longitud de onda óptima, de ultravioleta
o visible, para detectar los analitos estudiados. Los detectores de gran calidad tienen
intervalos de escala completa desde 0.0005 a 3 unidades de absorbancia. Los
detectores de ultravioleta están indicados para elusión gradiente, y para disolventes
que no absorben a la longitud de onda de trabajo (Harris, 2001).
Antecedentes bibliográficos 21
Tabla 4. Características de los detectores de cromatografía líquida
Detector CL Disponible
comercialmente LOD de masa (detectores
comerciales)a
LOD de masa (estado
actual)b
Absorbancia sic 100 pg-1 ng 1 pg
Fluorescencia Sic 1-10 pg 10 fg
Electroquímica Sic 10 pg-1 ng 100 fg
Índice de refracción Si 100 ng-1µg 10 ng
Conductividad Si 500 pg-1 ng 500 pg
Espectrometría de
masas
Sid 100 pg-1 ng 1 pg
FT-IR Si 1 µg 100 ng
Dispersión de la luze Si 10 µg 500 ng
Actividad óptica No ------ 1 ng
Selectivo de elementos No ------ 10 ng
Fotoionización No ------ 1 pg-1 ng
Fuente: Skoog et al. (2001).
a El LOD de masa de calcula para la masa inyectada que proporciona una señal igual a cinco veces la σ del ruido, empleando un compuesto de masa
molecular 200 g/mol e inyectando 10 µL en CL convencional y 1 µL CL microcapilar.
b La misma definición que en a, pero el volumen inyectado es por lo general menor.
c Disponible comercialmente también para CL microcapilar.
d Disponible comercialmente, todavía muy caro.
e Incluyendo la dispersión de la luz de ángulo bajo y la nefelometría.
Antecedentes bibliográficos 22
b) Detector infrarrojo
Los compuestos orgánicos absorben energía a diversas longitudes de onda del
espectro infrarrojo. Los detectores infrarrojos resultan especialmente útiles cuando el
componente pertinente no es detectado por las unidades ultravioleta/visible o por los
detectores de índice de refracción, o bien, cuando el analista desea determinar la
distribución de los grupos funcionales. Es necesario tomar precauciones al
seleccionar el sistema de disolvente y de longitud de onda analítica, pero una vez
que se ha ajustado, el detector infrarrojo no tiene comparación en cuanto al grado de
información específica que proporciona (Willard et al., 1986).
Sin lugar a dudas la cromatografía líquida de alta resolución es la elección más
conveniente para la determinación de ácidos orgánicos de acuerdo a su rapidez,
sensibilidad, selectividad y reproductividad. Además, el costo del análisis
cromatográfico es sumamente bajo (Blanco y Mangas, 1996).
.
1.3.3 Validación de métodos analíticos La Asociación Española de Farmacéuticos de la Industria (2001), afirma que para
lograr un buen análisis es necesario validar el método, que significa tener una
evidencia documental de que un procedimiento analítico conducirá, con un alto grado
de seguridad, a la obtención de resultados precisos y exactos, dentro de las
especificaciones y los atributos de calidad establecidos. Validar es verificar
documentalmente que un método o proceso hace lo que tiene que hacer.
Una de las etapas para la validación es poner a punto el método, que incluye desde
los primeros estudios de tanteo con patrones, hasta la utilización de muestras reales
que garanticen el buen funcionamiento del sistema en el momento del análisis.
Antecedentes bibliográficos 23
Las características de fiabilidad son las que demuestran la capacidad de un método
analítico para mantener a lo largo del tiempo los criterios fundamentales de
validación.
Selectividad: Capacidad de un método analítico para medir y/o identificar
simultáneamente o separadamente los analitos de interés, de forma inequívoca, en
presencia de otras sustancias químicas que puedan estar presentes en la muestra.
Linealidad: Se define como la capacidad del método para proporcionar resultados
que son directamente (o por medio de transformaciones matemáticas) proporcionales
a la concentración del analito en la muestra dentro de un rango establecido.
Rango: Es el intervalo entre la concentración superior e inferior para las cuales se ha
demostrado la correcta precisión, exactitud y linealidad del método.
Precisión: Es la capacidad de un método para proporcionar resultados próximos
entre sí. Se puede realizar en tres niveles: repetibilidad: evalúa la precisión del
método (precisión intraensayo); precisión intermedio: evalúa la precisión frente a
variaciones de analista, equipo y día; reproducibilidad: evalúa la precisión entre
laboratorio (precisión interlaboratorios).
Repetibilidad del sistema instrumental: Este parámetro estudia la variabilidad
debida únicamente al instrumento, y se determina analizando repetidamente una
misma muestra de forma consecutiva de 6 a 10 veces.
Repetibilidad del método: Se efectúa con una serie de alícuotas de una muestra
homogénea que se analiza independientemente desde el principio (preparación de la
muestra) hasta el final (lectura de resultados) por el mismo instrumento y el mismo
analista. Puede realizarse con un mínimo de 6 muestras a la concentración nominal o
un mínimo de 3 muestras a tres niveles de concentración cubriendo el intervalo
especificado (un total de 9 muestras).
Antecedentes bibliográficos 24
Exactitud: Expresa la proximidad entre el valor que es aceptado convencionalmente
como valor verdadero o valor de referencia y el valor experimental encontrado.
Límite de cuantificación: Se define como la cantidad mínima de analito que puede
determinarse cuantitativamente con una adecuada exactitud y precisión.
Limite de detección: Se define como la mínima cantidad de un analito en una
muestra que puede ser detectado aunque no necesariamente cuantificado con
precisión y exactitud.
1.4 Métodos propuestos para el análisis de ácido láctico La gran relevancia de los ácidos orgánicos en la tecnología de alimentos a hecho
posible el desarrollo de métodos distintos para su determinación; muchos de estos
métodos son volumétricos, colorimétricos, microfluorimétricos, polarográficos o
cromatográficos (papel, capa fina, gas, cromatografía líquida de alta resolución)
(Daood et al., 1994).
El método usado comúnmente para la determinación del contenido de ácido es la
titulación alcalina utilizando un indicador. Sin embargo, los métodos volumétricos
generalmente no son selectivos ni lo suficientemente sensitivos y precisos para
detectar cantidades pequeñas de ácido (Casella y Gatta, 2002).
Por otro lado, como la mayoría de los compuestos biológicos, los ácidos orgánicos
pueden ser determinados enzimáticamente, suministrando enzimas específicas para
aquellos en los que su degradación catalítica se encuentra disponible. Sin embargo,
las determinaciones enzimáticas se realizan con kits para cada ácido, lo cual
disminuye el rendimiento del proceso y eleva los costos por ensayo en
multideterminaciones. Se ha incrementado el uso de los métodos electroquímicos en
conexión con biosensores, particularmente estos utilizan oxidadas y
deshidrogenasas inmovilizadas, los cuales son extensamente utilizados para
Antecedentes bibliográficos 25
determinar algunos ácidos orgánicos, especialmente ácido láctico y málico, en
alimentos (Blanco y Mangas, 1996).
1.4.1 Pretratamiento de la muestra
Para la determinación de los ácidos orgánicos ya sea en muestra sólida o semisólida
es importante primeramente extraerlos, lo cual generalmente se realiza utilizando
solventes como etanol o acetonitrilo y agua, para después filtrar y analizar en el
cromatógrafo. En la tabla 5 se presenta la metodología sugerida para el manejo de
muestra sugeridas por diversos autores en investigaciones previas.
Antecedentes bibliográficos 26
Tabla 5. Pretratamiento de la muestra para la determinación de ácidos orgánicos
Autor Procedimiento
Ferreira et al. (2002)
A 5 mL de muestra se le agrega 100 µL de ácido becilmalónico y 0.5 g de dowex SOW – X8, se agita por 15 min, se derivatiza con 500 µL de O-(4-nitrobencil)N-N’-diisopropilisourea en dioxano (100 mg/mL), después se diluye con 2 mL de acetonitrilo y por ultimo se filtra (0.22 µm) para ser analizado.
Daood et al.(1994)
Se mezcla la muestra con 48 mL de ácido metafosfórico al 2%, se agita por 10 min y el extracto incoloro es analizado por HPLC.
Simal-Gándara et al. (1999)
20 g muestra es tratada con 60 mL de ácido metafosfórico al 4.5%, filtrada y llevada a un volumen de 100 mL para después volver a ser filtrada por 0.45 µm para después ser analizada por HPLC.
López – Hernández et al. (1996)
20 g muestra es tratada con 60 mL de ácido metafosfórico al 4.5%, filtrada (whatman No. 541) y llevada a un volumen de 100 mL para después volver a ser filtrada por 0.22 µm para después ser analizada por HPLC.
Díaz Romero et al. (2002)
A 1.25 g de muestra se le agrega 4 mL de etanol al 80%, se agita por 1 min y se liofiliza el sobrenadante, mismo que es redisuelto en 4 mL de agua grado HPLC. Se filtra (0.45 µm) la solución y es analizada por HPLC.
Hasib, et al. (2002)
Los ácidos orgánicos son extraídos con agua destilada (1:10 p/v), después son centrifugados a 3150 g por 10 min y filtrados (0.45 µm) y analizados.
Shirai et al. (2001)
10 g de muestra es diluida en agua (1:10), centrifugada a 10000 g por 15 min y filtrado el sobrenadante en membrana de 0.45 µm para ser analizada en HPLC.
Picha (1985) 10 g de muestra es homogenizada en etanol al 80% por un minuto, inmediatamente es llevada al punto de ebullición por 15 min, se enfría y se filtra, el residuo es lavado con etanol al 80% y aforado a 100 mL. Una alícuota de 5 mL es filtrada por una membrana de 0.45 µm para ser analizada por HPLC.
Casella y Gatta (2002)
10 g de muestra molida es adicionada a 100 mL de solución 50 mM de amonio o agua destilada para después sonicarla 20 min a 70 ºC. La suspensión es filtrada (0.45 µm) y diluida 1:200 con agua destilada. La solución obtenida es inyectada en el cromatógrafo.
Zeppa et al. (2001)
A 5 g de muestra se le adicionan 25 mL de ácido sulfúrico 0.013 M después es colocado en un digestor por 10 min, la mezcla es centrifugada a 7000 g por 5 min y el sobrenadante es filtrado en una membrana de 0.20 µm y es analizado por HPLC.
Palmer y List, (1973)
La muestra solo es filtrada si es necesario para remover material insoluble y después analizada.
Holloway et al. (1989)
A 1 g de muestra (peso seco) se le agrega 25 mL de agua destilada o ácido sulfúrico 0.25 M, la mezcla es hervida en un baño de agua por 10 min, después enfriada y llevada a un volumen de 100 mL. La muestra diluida es filtrada por papel filtro No. 542 y filtrada nuevamente por un poro de 0.45 µm para ser analizada por HPLC.
Antecedentes bibliográficos 27
1.4.2 Condiciones cromatográficas
En la tabla 6 se muestran las condiciones cromatográficas utilizadas en análisis de ácidos orgánicos. Tabla 6. Condiciones cromatográficas para el análisis de ácidos orgánicos por HPLC
Autor Columnas Fase móvil Detección Ferreira et. al. (2002) RP-18 (3 µm) Agua y acetonitrilo UV, 265 nm
Daood et. al.(1994) ODS-2 10 µm (25 cm x 4.6-mm i.d)
Fosfato dihidrogeno de potasio, hidróxido de tetrabutil amonio, metanol
UV-vis, 190-340 nm
Simal -Gándara et. al. (1999)
ODS2 (4.6 mm i.d x 25 cm)
Agua y ácido metafosfórico
UV, 245 nm (ácido oxálico) y 215nm (ácido málico y fumárico)
López – Hernández et. al. (1996)
OD2 C18 (250 X 4 mm) Agua y ácido metafosfórico
UV, 245 nm (ácido oxálico) y 215 (ácido málico, cítrico, fumárico y quínico)
Díaz Romero et. al. (2002)
KC-811 (250 x 4 mm) H2SO4 al 0.1% Comparación tiempos de retención
Hasib et. al. (2002) RP18 (25 x 0.46 cm) Agua y ácido fosfórico UV, 210 nm
Shirai, et. al. (2001) Sugar Shodex 30 mM H2SO4
2.1 Patrones y reactivos quím El ácido acético, cítrico y lácticoácido metafosfórico de Productse utilizó agua grado HPLC, obBarnstead). 2.2 Preparación del residuo de
El residuo de camarón se trans
Instituto Tecnológico de Sono
almacenarlo en un congelador m
triturado en un molino para carn
4 mm y almacenado.
II. METODOLOGÍA
icos
fueron adquiridos a Supelco (Bellefonte, PA, USA), os Químicos Monterrey (Monterrey, N. L., México) y tenida con un sistema Milli-Q (Nano pure Diamond,
camarón
portó al laboratorio LV -712 de la Unidad Nainari del
ra, donde se eliminaron las impurezas antes de
arca AMERICAN modelo 110 a -20ºC, después fue
e marca TORREY modelo 12 con tamaño de dado de
Metodología 29
En la fermentación láctica se utilizaron 500 g de residuo de camarón (Penaeus
vannamel) previamente molidas.
Como inóculo fue utilizado un producto probiótico comercial que contiene
Lactobacíllus sp. a 5% (v/v) en agua destilada y enriquecido con 3.75% (p/v) de
sacarosa, previamente activado durante 5 días a 37 °C.
2.3 Condiciones de fermentación
A 6 muestras de 500 g de cabeza de camarón molida y descongelada se le
adicionaron 6.6% de azúcar de caña (p/p) como fuente de carbohidratos. También,
se agregó ácido cítrico 2 M a dos de las muestras para disminuir el pH inicial de la
cabeza de camarón a 6.0 aproximadamente, lo mismo se realizó con ácido láctico
5 M y acético 5 M. Una vez ajustado el pH de las fermentaciones se les adicionó el
inóculo activado de Lactobacillus sp. (50% v/p). En la tabla 7 se detallan las
condiciones de fermentación antes citadas.
Tabla 7. Condiciones de la fermentación láctica de los residuos de camarón
500g cabeza
camarón
6.6 (p/v) sacarosa
50% Lactobacillus
spp.
Ácido acético
Ácido láctico
Ácido cítrico
agitación
Sin agitación
A1 X X X X ----- ----- X -----
A2 X X X ------ X ----- X -----
A3 X X X ------ ----- X X -----
B1 X X X X ----- ----- ----- X
B2 X X X ------ X ----- ----- X
B3 X X X ------ ----- X ----- X A1 pH inicial ajustado con ácido acético y con agitación. A2 pH inicial ajustado con ácido láctico y con agitación. A3 pH inicial ajustado con ácido cítrico y con agitación.
B1 pH inicial ajustado con ácido acético y sin agitación.
B2 pH inicial ajustado con ácido láctico y sin agitación B3 pH inicial ajustado con ácido cítrico y sin agitación. X presencia.
----- ausencia.
Metodología 30
Cabe resaltar que la fermentación de este sustrato semisólido se llevó a cabo en
recipientes de plástico con capacidad de 1L con tapa.
Por otro lado, una vez realizado el ajuste de pH, utilizando un potenciómetro marca
CORNING modelo 340 previamente calibrado con una soluciones buffer de pH 4.5 y
pH 7, con los 3 ácidos orgánicos distintos por duplicado, se tomaron uno de cada uno
para colocarse en condiciones de agitación a 100 rpm en un baño maría marca LAB-
LINE INSTRUMENTS modelo 3535 a 30 ºC y el resto se mantuvo sin agitación en
una incubadora a la misma temperatura.
Se monitoreo el pH y la acidez total titulable cada 3 horas durante las primeras 12
horas con el fin de confirmar la estabilidad del fermentado durante todo el proceso.
Además, las mediciones se realizaron por duplicado.
Acidez total titulable (ATT)
Se tomó 1g de muestra homogénea a la cual se le adicionó 10 mL de agua destilada
y se agitó por 15 s en vortex. Después se tituló con una solución estándar de NaOH
a 0.1 N hasta llegar a un pH entre 8.40 y 8.49. Se determinó el gasto de NaOH y se
calculó la acidez total en % de ácido láctico según la siguiente fórmula:
% de acidez = (mL de NaOH)(0.009)(100) g de muestra
En la figura 2 se presenta el tratamiento del residuo de camarón, las condiciones de
fermentación y el monitoreo de pH y acidez total titulable.
Metodología 31
Residuo de camarón
Condiciones de fermentación
Mediciones pH y ATT cada 3 horas
Ac. Cítrico 2M Ac. Láctico 5M Ac. Acético 5M
Con agitación y sin agitación
Calcular % de ácido láctico
Titular NaOH 0.1 N hasta pH = 8.4
1g muestra diluir H2O destilada 1:10
Acidez Total Titulable (ATT)
Activar Lactobacillus sp. 37°C x 3 días
Eliminar materia extraña y empaquetar bolsas plástico 0.5 Kg
Congelar por 2 días
Moler muestra con dado 4 mm
Colectar en bolsas plástico 0.5Kg
Almacenar -20 °C congelador
Inocular cabezas de camarón 50% (v/p)
Adicionar 6.6% (p/p) de sacarosa
Ajustar pH 6 con los diferentes ácidos
Incubar 24 h a 35 ºC
Figura 2. Tratamiento del residuo de camarón, las condiciones de
fermentación y el monitoreo de pH y acidez total titulable
Metodología 32
Recuperación de la fase líquida del fermentado
Las muestras provenientes del fermentado se centrifugaron a 8 °C y 6000 rpm por 15
minutos en una centrífuga marca Harrier 18/80, donde se separaran tres fases: fase
grasa, fase líquida y residuo, rescatándose el licor para determinaciones posteriores.
2.4 Pretratamiento de la muestra Una vez obtenido el licor proveniente de fermentaciones distintas, utilizando los 3
diferentes ácidos se prosiguió a realizar la sonificación por 20 minutos en un
ultrasonido marca BRANSON modelo 1515R-MT para después filtrar en papel
Whatman No. 1 al vacío. Estas muestras ya filtradas fueron congeladas hasta su
posterior uso.
Antes de ser inyectadas en el cromatógrafo las muestras son diluidas en agua grado
HPLC (2:25) para después ser pasadas por un filtro de 0.45 µm.
2.5 Equipo y condiciones HPLC
Se utilizó un cromatógrafo de líquidos equipado con una bomba cuaternaria y un
sistema de inyección de 20 µL. También cuenta con un detector UV-vis con
Photodiode Array controlados con un software WinChrom. La temperatura se
controla a 30 ºC con termostizador de columna todo el equipo es de GBC
Instruments (Australia). La separación se llevó a cabo con una columna de fase
reversa Extrasil ODS (250mm x 4.6mm i.d.) con 5 µm de tamaño de partícula (SGE,
Melbourne, Australia). Para el análisis cromatográfico se inyectaron 20 µL de la
muestra.
La fase móvil consiste en agua grado HPCL acidulada con ácido metafosfórico a pH
de 2.10. En la figura 3, se detalla el procedimiento para el tratamiento de la muestra y
las condiciones para el análisis cromatográfico.
Metodología 33
Condiciones de operación de HPLC: • Columna: SGE Extrasil ODS (250 x 4.6 mm SS), 5 µm • Fase móvil: agua grado HPLC pH = 2.10 con ácido
metafosfórico. • Flujo: 0.6 mL/min • Temperatura: 30 ºC • λ = 210 nm
Inyectar en HPCL
Diluir (2:25) y filtrar por papel de 0.45 µm
Filtrar al vacío con papel Whatman # 1
Sonicar por 20 min
Recuperar fase líquida
Centrifugar a 6000 rpm x 15 min a T = 8 ºC
40 g de muestra cada 3 horas
Toma de muestras para HPLC
Figura 3. Procedimiento para el tratamiento de la muestra y las condiciones
para el análisis cromatográfico.
III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Se presentará a continuación en resultados la optimización de la fermentación láctica
del residuo de camarón, incluyendo parámetros como temperatura, agitación, así
como el empleo de diferentes ácidos orgánicos para el ajuste inicial del pH. También,
la preparación de la muestra, las condiciones óptimas para la puesta a punto del
método el análisis cromatográfico de muestras.
3.1 Optimización de la fermentación láctica del residuo de camarón
Con el propósito de lograr un ensilado en el menor tiempo posible, se realizaron
ensayos de la fermentación láctica en los cuales se adicionó a la cabeza de camarón
previamente molida, 15% (p/p) de sacarosa, 30% (v/p) de inóculo y se ajustaba el pH
con una solución de ácido cítrico, esta mezcla se mantenía a temperatura de 35 ºC y
con agitaciones cada hora con una varilla de vidrio. Sin embargo, el descenso de pH
a niveles de 4.3 se requerían 7 días, pero este tiempo es muy prolongado según Cira
Resultados y discusión 35
et al. (2002), debido que ellos mencionan que se logra ese pH en 96 horas
aproximadamente.
Por lo anterior se modificaron la fuente de carbohidratos a 6.6 % (p/p) y se
incrementó la cantidad de inóculo, diluido 5% (v/v), al 50% (v/p), la temperatura
permaneció a 35 ºC así como la agitación cada hora, logrando la disminución de pH
a 4.3 en solo 29 horas.
Una vez estandarizadas estas condiciones se prosiguió a estudiar el efecto de la
utilización de diversos ácidos para ajustar el pH inicial y la agitación. De ello se
obtuvieron las figuras 4 y 5, mismas que describen el comportamiento de la
fermentación con respecto al pH y ATT.
5
5.5
6
6.5
7
7.5
0 5 10 15 Tiempo (hr)
pH ácido acético
ácido láctico
ácido cítrico
Figura 4. Comportamiento del pH en la fermentación bajo
condiciones de agitación
Resultados y discusión 36
0
0.5
1
1.5
2
0 5 10 15 Tiempo (hr)
ATT ácido acético
ácido láctico
ácido cítrico
Figura 5. Comportamiento de la ATT en la fermentación bajo
condiciones de agitación
En la figura 4 se observa un descenso del pH en la primera hora, esto debido a que
la cabeza de camarón cuenta con un pH alrededor de 7.2 y se ajusta este pH a 6.5
para proporcionar un medio apropiado para las bacterias lácticas presentes en el
probiótico. También se aprecia un incremento de pH alrededor de las 2 horas de
inicio de la fermentación, esto debido a la proteólisis y a la liberación de amonio de
las enzimas producidas por los Lactobacillus provenientes del probiótico según lo
reportado por Rao et al. (2000). Debido a este incremento en el pH es necesario
reajustarlo una vez más para evitar la putrefacción. Estos cambios en el pH se ven
reflejados obviamente en la producción de ácido láctico el cual es mostrado en la
figura 5, en donde se observa el aumento y disminución de este analito con respecto
al tiempo.
Resultados y discusión 37
Se logra destacar, también con estas figuras, que prácticamente no existe diferencia
significativa entre el empleo de un ácido u otro para el ajuste del pH, ya que se
comportan de manera muy similar.
En el caso de la fermentación sin agitación los resultados obtenidos son muy
similares que para la situación en el cual el proceso fermentativo es llevado a cabo
bajo agitación, observándose en la figura 6.
Figura 6. Comportamiento del pH en la fermentación sin agitación
ácido cítrico
ácido láctico
ácido acético
pH
Tiempo (hr)
15 10 5 0
7.5
7
6.5
6
5.5
5
3.2 Preparación de la muestra
Se buscaron las condiciones más favorables para el manejo de la muestra, fase
líquida proveniente del ensilado. Diferentes autores como Hasib et al., (2002) y Shirai
et al., (2001) señalan que la muestra que emplearon era previamente diluida 1:10
(p/v) en agua para que de ese punto se inicie la preparación de la muestra y con ello
el análisis cromatográfico.
Resultados y discusión 38
Para este estudio se realizaron diferentes diluciones de la muestra, misma que
estaba constituida por el licor obtenido de la fermentación, las cuales consistieron en
1:50 (v/v), 1:10 (v/v) y 2:25 (v/v) en agua grado HPLC. Observándose que para la
dilución 2 mL en 25 mL se obtenía mejor resolución de los picos arrojados por el
cromatógrafo, confirmándose con ello que esta dilución es la más adecuada para el
análisis de ácido láctico, ya que en las muestras con mayor concentración la
resolución es menor.
3.3 Establecimiento de las condiciones cromatográficas
Antes de iniciar el análisis de las muestras en el cromatógrafo es necesario realizar
ensayos o pruebas con los patrones de la sustancias que se desean evaluar y con
ello proporcionar las condiciones necesarias para efectuar un análisis correcto.
Para ello primero se inició con el establecimiento de la temperatura ideal de la
columna, aumentando este parámetro paulatinamente desde 25 ºC hasta 38 ºC,
encontrándose una mejor resolución de los picos a una temperatura de 30 ºC como
se muestra en la figura 7.
También se estableció el flujo de la fase móvil a 0.6 mL/min, ya que a flujos mayores
el pico tendía a disminuir el tiempo de retención y a aumentar la presión dentro de la
columna. De manera contraria al disminuir el flujo el tiempo de retención permanecía
prácticamente sin variaciones, sin embargo el pico tiende a ensancharse y con ello
perdía resolución. En la figura 8 se observa la influencia de la velocidad de flujo (0.5
y 0.8 mL/min) en el tiempo de retención del patrón.
Por otro lado, el pH de la fase móvil es muy importante ya que de él depende la
ionización de los ácidos como lo señala Daood et al., (1994), de tal manera que
también se buscó el valor óptimo para este parámetro. Así, que se diminuyó el pH de
Resultados y discusión 39
la fase de 2.70 hasta llegar a 2.10 y eligiéndose este ultimo valor para la realización
del análisis de las muestras, ya que se obtenía mayor respuesta cromatográfica.
Ácido
F
láctico ----- T = 29 ºC ____T = 25 ºC
igura 7. Influencia de la temperatura en el tiempo de retención
Resultados y discusión 40
Ácido láctico
Ácido láctico
-----Flujo = 0.8 mL/min
____Flujo = 0.5 mL/min
Figura 8. Influencia de la velocidad de flujo en el tiempo
de retención
Una vez establecidos los parámetros cromatográfico se determinaron las condiciones
óptimas con las cuales la muestra fue analizada, mismas que se muestran en la tabla
8 y en la figura 9 se observa un cromatograma del patrón identificado bajo esas
condiciones.
Resultados y discusión 41
Tabla 8. Condiciones cromatográficas para el análisis Parámetro Condiciones
Columna SGE Extrasil ODS 250 x 4.6 mm SS, 5 µm
Fase móvil Agua grado HPLC acidificada con ácido metafosfórico a pH = 2.10
Velocidad de flujo 0.6 mL/min
Detector UV: 210 nm
Temperatura 30 ºC
Ácido láctico
Figura 9. Cromatograma del patrón con las condiciones establecidas
3.4 Identificación del ácido láctico
Resultados y discusión 42
El método propuesto permitió la identificación y cuantificación de ácido láctico en la
fase líquida proveniente de la fermentación de cabezas de camarón. Este ácido fue
identificado en la muestra por la comparación con el patrón, del tiempo de retención y
su espectro. La tabla 9 muestra el tiempo de retención de este ácido y la figura 10 el
espectro.
Tabla 9. Tiempo de retención del ácido láctico Ácido orgánico Tiempo de retención
(min) Desviación estándar
Láctico
8.096
0.0226
Figura 10. Espectro de absorción
del ácido láctico
Resultados y discusión 43
Así, la radiación emitida por una fuente excitada se caracteriza adecuadamente por
medio de un espectro de emisión, que generalmente toma la forma de una
representación emitida en función de la longitud de onda o de la frecuencia (Skoog et
al., 2001). Este espectro es único para cada sustancia, de tal manera que es
empleado para su identificación.
3.5 Validación del método
3.5.1 Linealidad
En cualquier análisis cromatográfico es importante demostrar la linealidad en el
rango de interés analítico. Así, la curva de calibración fue determinada con 4
diferentes concentraciones de la solución patrón de ácido láctico en el rango de 5400
µg/mL hasta 4.32 µg/mL, las cuales fueron inyectadas por duplicado. La recta patrón
fue obtenida graficando concentración contra la altura del pico obteniendo un
coeficiente de correlación (r2) de 0.9992. En la tabla 10 se enlistan los parámetros y
el coeficiente de correlación de la recta patrón.
Tabla 10. Parámetros y coeficiente de correlación (r2) de la recta patrón del
ácido láctico
Ácido orgánico
a
b
r2
Láctico
1356.9
1977.4
0.9992
Resultados y discusión 44
La recta patrón es expresada como regresión lineal (y = ax + b), donde y es la altura
del pico y x es la concentración de ácido en µg/mL de licor de cabeza de camarón
fermentada, a se refiere a la pendiente y b a la intercepción de la recta en y. Si la
recta no pasa cerca del origen de coordenadas significa que el método a evaluar esta
afectado por un error sistemático por defecto o por exceso en el intervalo estudiado.
Si existen diferencias apreciables entre los valores experimentales y los puntos de la
recta significa que la linealidad no es buena (existe falta de ajuste) o bien que el error
experimental es importante (figura 11).
y = 1356.9x + 1977.4R2 = 0.9992
0
1000000
2000000
3000000
4000000
5000000
6000000
7000000
8000000
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000
Concentración (µg/mL)
Área
Figura 11. Recta patrón del ácido láctico
3.5.2 Precisión
La precisión es la capacidad de un método para proporcionar resultados próximos
entre sí. Este se realizó analizando una muestra cuatro veces, bajo las condiciones
ya establecidas para HPLC, los valores se enlistan en la tabla 11.
Resultados y discusión 45
Tabla 11. Valores de precisión del método Muestra mg ácido láctico/mL de fase
líquida del fermentado
1
2
3
4
33.88
33.08
33.99
31.30
Promedio
Desviación estándar
% RSD
33.06
1.24
3.76
La desviación estándar relativa o coeficiente de variación (% RSD) es de 3.76 el cual
indica que el método es preciso, según los resultados obtenidos por Hasib et al.,
(2002); Suárez-Luque et al., (2002) y lo que se especifica en la norma de Asociación
Española de Farmacéuticos de la Industria (2001). 3.5.3 Recuperación
Cuando se realiza la recuperación del método, es usual que se agregue una cantidad
conocida de la sustancia de interés a una muestra. Lo anterior se realizó adicionando
1 mL de ácido láctico, a una concentración de 118 mg/mL, a una muestra. Los datos
se indican en la tabla 12, en la cual se observa que la recuperación es de 101.67%.
Este resultado se debe a que las muestras no estuvieron completamente
homogéneas al momento de ser analizadas, obteniéndose con ello mayor cantidad
de ácido láctico que el que fue adicionado.
Resultados y discusión 46
Tabla 12. Valores de recuperación del método Muestra % de recuperación
1
2
3
4
100.90
100.06
100.46
105.27
Promedio
Desviación estándar
% RSD
101.67
2.42
2.38
3.6 Aplicabilidad del método: muestreo El muestreo se realizó utilizando la fase líquida proveniente del final de la
fermentación láctica, la cual se llevo a cabo con agitación y sin agitación. Las
muestras fueron analizadas por duplicado bajo las condiciones ya establecidas para
HPLC. Para identificar al ácido láctico dentro de la muestra se comparó el tiempo de
retención con un patrón (figura 12). En la tabla 13 se muestran los valores obtenidos
de ácido láctico cuando la muestra proviene de una fermentación agitada y en la
tabla 14 se señalan los valores de ácido para una fermentación sin agitación.
Resultados y discusión 47
Tabla 13. Contenido de ácido láctico presente en
las muestras agitadas Muestra mg de ácido láctico / mL de fase
líquida del fermentado
1
2
3
4
51.49
35.30
26.05
74.47
Tabla 14. Contenido de ácido láctico presente en
las muestras sin agitación Muestra mg de ácido láctico / mL de fase
líquida del fermentado
1
2
3
4
47.58
53.15
31.59
75.76
Shirai et al., (2001) y Cira et al., (2002), señalan que la fase líquida representa entre
el 60 – 70% y 52% de la fermentación, de tal manera que se debe considerar que
existe en el residuo ácido láctico retenido el cual no fue analizado. Así, se estimó que
la cantidad de ácido láctico en el total del fermentado se encuentra alrededor de
60.10 mg de ácido láctico/g de fermentado, el cual es similar al reportado por Shirai
et al., (2001).
Resultados y discusión 48
------ Patrón ____ Muestra
Ácido láctico
Ácido láctico
Figura 12. Comparación del tiempo de retención entre el patrón y la muestra
49
En el presente trabajo de investiga
fase líquida proveniente de la ferme
La validación del método se consid
recuperación mayores al 101. 67%
%RSD 3.76, demostrándose con
análisis de ácido láctico en esta mu
De tal manera que al llevar a cab
ensilado, se asegura que éste s
desmineralización y la desprotein
manera adecuada, y con ello se o
quitina, pigmentos y proteínas. Ade
al bajo pH a causa de la cantidad
microorganismos indeseables.
CONCLUSIÓN
ción se evaluó el contenido de ácido láctico en la
ntación de residuo de camarón.
era satisfactoria ya que se obtuvieron niveles de
y una buena precisión del método con valores de
lo anterior que el método empleado es para el
estra.
o el análisis de contenido de ácido láctico en el
e encuentre en cantidad suficiente para que la
ización del residuo de camarón se realice de
btienen productos de alto valor económico como
más, se confirma la estabilidad del ensilaje debido
de ácido presente, evitándose el crecimiento de
50
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