Olive oil’s polyphenolic metabolites: from their influence on

human health to their chemical synthesis

Filipe Monteiro-Silva

aDepartamento de Química e Bioquímica, Faculdade de Ciências, Universidade do Porto,

Rua do Campo Alegre, 4169-007 Porto, Portugal

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English version of abstract

Abstract

A growing number of scientific researches have been demonstrating that olive oil operates

a crucial role on the prevention of cardiovascular and tumoral diseases, being related with low

mortality and morbidity in populations that tend to follow a Mediterranean diet. Amongst its

minor components, polyphenols have been subject to several clinical trials that have

established health benefits associated to their antioxidant, antitumoral and anti-

atherosclerotic activity.

However the biological activity of polyphenols is dependent not only of their absorption but

also of their metabolization. Bioavailability studies have demonstrated that after olive oil

intake, not only hydroxytyrosol but also its metabolites can be found in plasma, such as 3,4-

dihydroxyphenylacetaldehyde, 3,4-dihydroxyphenylacetic acid, homovanillyl alcohol and its

glucoronides.

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Portuguese version of abstract

Resumo

Um número crescente de pesquisas científicas demonstram que o azeite opera um papel

crucial na prevenção de doenças cardiovasculares e doenças tumorais, estando relacionado

com a baixa mortalidade e morbilidade em populações que tradicionalmente seguem uma

dieta Mediterrânica. De entre os seus componentes minoritários, os polifenóis têm vindo a ser

alvo de estudos clínicos que demonstraram o seu benefício para a saúde pela atividade

antioxidante, anti-tumoral e anti-aterosclerótica que possuem.

No entanto a atividade biológica destes polifenóis é dependente não só da sua absorção

como poderá também depender da sua metabolização. Estudos de biodisponibilidade

demonstraram que após o consumo de azeite encontram-se no plasma não só hidroxitirosol,

mas igualmente os seus metabolitos, tais como o ácido 3,4-dihidroxifenilacético, o 3,4-

dihidroxifenilacetaldeído, o álcool homovanílico e os respectivos glucoronídeos.

Keywords:

Polyphenol; antitumoral; antioxidant; anti-atherosclerotic; metabolite; glucoronide

Índice

1. Introdução e enquadramento geral 1.1.Oliveiras, azeitonas e azeite 1.2.O azeite e a economia 1.3.Normas de comercialização

2. Constituição química do azeite 2.1. Ácidos Gordos 2.2. Antioxidantes 2.2.1. Carotenóides 2.2.2. Compostos Fenólicos

3. O Azeite e a Saúde Humana: Qual a relação? 3.1. Propriedades Benéficas dos Componentes Minoritários do Azeite 3.2. Efeitos sobre a Saúde 3.2.1. Obesidade 3.2.2. Stress Oxidativo 3.2.2.1. Aterosclerose e Doenças Cardiovasculares 3.2.2.2. ADN 3.2.2.3. Cancro 3.2.2.4. Doenças Neuro-Degenerativas 3.2.2.5. Inflamação e Dor 3.2.2.6. Ação Anti-Microbiana 3.3. Biodisponibilidade dos compostos fenólicos do azeite 3.3.1 Metabolismo

4. Síntese de O-Glicósidos 4.1. Método Enzimático 4.2. Método de Síntese Química 4.2.1. Método dos Fosfitos 4.2.2. Método Intramolecular 4.2.3. Método de Fischer-Helferich 4.2.4. Método de Koenigs-Knorr 4.2.5. Método do Tricloroacetimideto

5. Conclusão e observações finais 6. Bibliografia

1. Introdução e enquadramento geral

A utilização do azeite para diversos fins é milenar e remonta à Idade de Bronze (3000-600

a.C.) e entre as suas principais aplicações distingue-se obviamente, a utilização na alimentação,

mas a sua polivalência permitiu ser usado quer como combustível, quer como unguento para

diversas maleitas. O valor deste óleo era tão grande que chegou mesmo a ser usado como

prémio nas conquistas efetuadas nos Jogos Olímpicos antigos (Gigon et al., 2010; Boskou,

2006).

Apesar de atualmente ser utilizado na produção de cosméticos e desempenhar um papel

importante em diversas religiões, o uso como alimento prevaleceu sobre os restantes

nomeadamente como tempero em saladas ou em pratos principais, ou como parte integrante

na preparação de sopas, características da dieta mediterrânica.

1.1. Oliveiras, azeitonas e azeite

A oliveira, de designação científica Olea europaea L., é uma planta de climas e

temperaturas amenas, é resistente à seca e a condições adversas, apesar de as suas raízes

crescerem tendencialmente na horizontal e não na vertical. As suas folhas são estreitas,

ovalizadas e persistentes – em períodos de cerca de 3 anos – com pequenos pêlos que

protegem as mesmas contra a desidratação.

Após o aparecimento das flores, pequenas, de cor amarela/branca, em pequenos

aglomerados, ocorre a formação dos primeiros frutos, os quais amadurecem em períodos

longos e lentos. As fases de amadurecimento são diversas, dependendo também da variedade,

que num primeiro estado de maturação adquirem a cor verde e o seu tamanho final.

Posteriormente, a coloração verde dá lugar às fases designadas por “manchada”, “púrpura” e

“preta”. É durante estas transições que a clorofila é gradualmente substituída por antocianinas

(Boskou, 2006).

O azeite, por seu lado, é extraído das azeitonas, e as suas qualidades dependem do estado

de maturação do fruto, da forma de extração, mas também do tipo de clima, tratamento e

cuidados com as oliveiras. Mesmo sem qualquer tipo de cuidado específico, esta planta é

capaz de produzir azeitonas, resistindo a climas agrestes, chegando a haver casos reportados

de árvores com centenas e milhares de anos.

A sua resiliência permitiu-lhe adaptar-se à bacia Mediterrânica – e apresentar resistência ao

sal - e tornar-se numa das plantas de fruto mais produtivas desta área.

1.2. O azeite e a economia

No quadriénio 2005–2008, a nível mundial, a produção de azeitonas foi cerca de 69176,3

milhares de toneladas. Deste valor correspondem à produção da União Europeia 46460,6

milhares de toneladas, dos quais mais de 96 % foram produzidos pelos três maiores

produtores europeus de azeitona: Espanha, Itália e Grécia. Neste plano económico cabe a

Portugal uma quota de mercado europeu de cerca de 2,46 %, sendo que os últimos dados

disponíveis apontam para uma produção de 1143,3 mil toneladas em cerca de 1 516 261

hectares (FAOSTAT, 2010).

Em termos de países consumidores de azeite, o principal mercado está focado, para além

de na maioria dos países produtores, no plano europeu. O consumo no continente europeu

ronda os 67,8 % da percentagem mundial sendo que o restante consumo está distribuído pelo

resto do Mundo, com novos nichos económicos nos Estados Unidos da América e Canadá

(FAOSTAT, 2010).

Em termos de competitividade o azeite rivaliza diminutamente com os restantes óleos,

representando apenas 3,5 % de mercado dos óleos alimentares, devido aos seus elevados

custos de produção. Quando comparado com outros óleos, sejam de obtenção primária ou de

obtenção secundária, estes são de cultivo anual, com altos rendimentos e com elevado grau de

mecanização, por oposição ao azeite, de cultivo e produção laboriosa e longa, resultando num

azeite, independentemente da sua qualidade, com valor acrescentado (Boskou, 2006).

1.3. Normas de comercialização

A qualidade do azeite obtido depende de vários fatores como a variedade de oliveira, o

estado de maturação, a colheita e transporte, bem como o armazenamento e o modo de

extração do azeite das azeitonas.

O primeiro passo no processo de obtenção de azeite será a determinação do momento

ideal de maturidade das azeitonas, quando o teor de óleo é máximo, normalmente quando a

coloração do fruto é verde/amarela ou preta/púrpura, sendo assim colhidas as azeitonas

inteiras e sãs. Após a colheita (manual ou mecanizada), segue-se o transporte que deve ser

feito em caixas plásticas abertas e com orifícios de modo a permitir que o ar circule, inibindo a

atividade enzimática e eventuais aparecimentos de bolores ou fungos.

O processamento deverá ser feito o quanto antes após a colheita. Caso seja necessário

esperar algumas horas as azeitonas devem ser armazenadas em locais bem ventilados, com

temperatura inferior a 25°C e com humidade relativa inferior a 75 %. Na fase de limpeza as

folhas e galhos são removidos por ação de ar forçado e a lavagem é feita com um fluxo de

água.

O passo seguinte é a moenda ou trituração, por ação de moinhos de pedra ou de metal,

com produção de uma pasta.

Na fase subsequente a pasta é malaxada para permitir a libertação do óleo dos vacúolos

das células, onde a oxidação poderá ser minimizada com recurso a um sistema de injeção de

gases inertes. A pasta é posteriormente prensada de modo a separar a fase sólida (bagaço) da

fase líquida (azeite e água “vegetal”). O azeite é finalmente separado da água por

centrifugação ou percolação (filtração seletiva).

O último passo de processamento é o armazenamento, que deverá ser feito em

contentores inox de fundo cónico, totalmente cheios e/ou com gás inerte no espaço de

cabeça, mantidos ao abrigo da luz e a temperaturas inferiores a 25°C a fim de evitar a oxidação

do azeite obtido.

A forma como o azeite é obtido e eventuais tratamentos ao mesmo, permitem a sua

classificação e denominação pela Legislação em vigor Regulamento (CE) n.o 1513/2001 do

Conselho, de 23 de Julho de 2001, que altera o Regulamento 136/66/CEE, bem como o

Regulamento (CE) n.o 1638/98, da seguinte forma:

Azeites Virgens

Azeites obtidos a partir do fruto de oliveira unicamente por processos mecânicos ou outros

processos físicos – em condições que não alterem o azeite – e que não tenham sofrido outros

tratamentos para além da lavagem, da decantação, da centrifugação e filtração, com exclusão

dos azeites obtidos por solventes, com adjuvantes de ação química ou bioquímica ou por

processos de reesterificação e de qualquer mistura com óleos de outra natureza.

Estes azeites são classificados e descritos do seguinte modo:

- Azeite Virgem Extra

Azeite virgem com uma acidez livre, expressa em ácido oleico, não superior a 0,8 g por 100

g e com as outras características conformes com as previstas para esta categoria.

- Azeite Virgem

Azeite virgem com uma acidez livre, expressa em ácido oleico, não superior a 2 g por 100 g

e com as outras características conformes com as previstas para esta categoria.

- Azeite lampante

Azeite virgem com uma acidez livre, expressa em ácido oleico, superior a 2 g por 100 g e/ou

com as outras características conformes com as previstas para esta categoria.

- Azeite Refinado

Azeite obtido por refinação de azeite virgem, com uma acidez livre expressa em ácido

oleico não superior a 0,3 g por 100 g e com as outras características conformes com as

previstas para esta categoria.

- Azeite – Contém Exclusivamente Azeite Refinado e Azeite Virgem

Azeite constituído por loteamento de azeite refinado e azeite virgem, com exclusão do

azeite lampante, com uma acidez livre expressa em ácido oleico não superior a 1 g por 100 g e

com as outras características conformes com as previstas para esta categoria.

É também de referir que, o Regulamento (CE) n.° 1019/2002 da Comissão de 13 de Junho

de 2002 vem definir regras de normalização de rotulagem, sendo de destacar o seu Art.° 5°,

alínea d), onde determina que a menção à acidez ou acidez máxima deve fazer-se sem

destaque e acompanhar as restantes informações de qualidade do azeite em questão, a fim de

evitar a indução do comprador em erro relativamente às características do azeite, como sendo

características especiais que, no entanto, serão comuns à maior parte dos azeites.

2. Constituição química do azeite

Os componentes do azeite distribuem-se essencialmente por duas frações: a fração

saponificável, constituída por ácidos gordos esterificados sob a forma de triacilgliceróis (TAGs)

que perfazem cerca de 99 % do azeite, e uma fração insaponificável, que contém, compostos

fenólicos, esteróis, vitaminas, fosfolípidos e pigmentos (Boskou, 2006; Gigon et al., 2010;

Cicerale et al., 2010).

Tabela I – Principais constituintes do azeite (adaptado de Gigon et al., 2010 e *Boskou, 2006)

Família de Constituintes Constituintes Teor (%)

Ácidos Gordos (99 %) Ácido Palmítico (C16:0) 7,5 – 20,0

Ácidos Gordos Saturados (14,8 %) Ácido Palmitóleico (C16:1) 0,3 – 3,5

Ácido Esteárico (C18:0) 0,5 – 5,0

Ácidos Gordos Monoinsaturados (76,6 %) Ácido Óleico (C18:1) 55,0 – 83,0

Ácido Araquídico (C20:0) ≤ 0,6; ≤ 0,7*

Ácido Eicosenóico (C20:1) 0,5; ≤ 0,4*

Ácido Tetracosanóico (C24:0) ≤ 0,5; ≤ 0,2*

Ácidos Gordos Polinsaturados (8,6 %) Ácido Linolénico (C18:3) 0,9; ≤ 1,0*

Ácido Linoléico (C18:2) 3,5 – 21,0

Outras Substâncias (1 %) Insaponificável, Esqualenos -

Fitoesteróis -sistosterol, Campesterol, Stigmasterol -

Vitaminas Vitamina E (Tocoferóis), Vitaminas A e K -

Polifenóis Secoiridóides: Oleuropeína, Dimetileuropeína, Ligstrósido

-

Hidroxitirosol, Tirosol -

Lignanos Acetoxipinoresinol, Pinoresinol -

Triterpenos Ácido Oleanólico, Eritrodiol -

2.1. Ácidos Gordos

Os principais constituintes do azeite são os ácidos gordos esterificados sob a forma de TAGs

e em menor quantidade os ácidos gordos sob a forma livre. Existem diversos tipos de ácidos

gordos, classificados pelo grau de saturação: as gorduras monoinsaturadas (MUFA), as

gorduras polinsaturadas (PUFA) e as gorduras saturadas (SFA).

Destes ácidos gordos do azeite distinguem-se o palmítico, palmitóleico, esteárico, oleico,

linoléico e linolénico, que variam na proporção dependendo da amostra, local de produção,

clima, variedade de azeitona e grau de maturação do fruto. Na Tabela II, sinopse da tabela

anterior é possível aferir a proporção dos ácidos gordos mais relevantes presentes no azeite.

Tabela II – Principais ácidos gordos do azeite (adaptado de Gigon et al., 2010 e *Boskou, 2006)

Ácido Gordo Fórmula Química Teor (%)

Palmítico (C16:0) CH3(CH2)14COOH 7,5 – 20,0

Palmitóleico (C16:1) CH3(CH2)5CH=CH(CH2)7COOH 0,3 – 3,5

Esteárico (C18:0) CH3(CH2)16COOH 0,5 – 5,0

Óleico (C18:1) CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7COOH 55,0 – 83,0

Linoléico (C18:2) CH3(CH2)4(CH=CHCH2)2(CH2)6COOH 3,5 – 21,0

Linolénico (C18:3) CH3CH2(CH=CHCH2)3(CH2)6COOH 0,9; ≤ 1,0*

Como é percetível na interpretação da Tabela II, o ácido óleico é o que se encontra em

maior proporção de todos os ácidos gordos, sendo este portanto, o ácido gordo de referência

– sob a forma livre - para a determinação do grau de acidez, expresso em percentagem,

conforme referido na Secção 1.3. – Normas de Comercialização.

2.2. Antioxidantes

O envelhecimento e morte celular ocorrem no corpo humano pelos mais variados motivos,

desde os efeitos da poluição até a motivos de origem endógena, tais como a respiração celular

ou mesmo devido ao próprio metabolismo.

No entanto, existem moléculas que devido às suas propriedades e características químicas,

permitem abrandar e mesmo inibir tais comportamentos oxidativos, sendo designadas por

antioxidantes. Estas moléculas, quando inseridas num meio lipídico, como uma célula ou

mesmo numa garrafa de azeite, mesmo em baixas concentrações, possuem um efeito

antioxidante, impedindo ou retardando a sua oxidação por inibição dos radicais livres, o que

permite classificá-las em dois tipos, respetivamente:

- Antioxidantes Preventivos

Reduzem a velocidade do processo de iniciação da oxidação, impedindo ou retardando a

formação de radicais livres, desativando os iões dos metais que catalisam a sua decomposição.

- Antioxidantes “Chain-Breaking”

São normalmente compostos fenólicos substituídos que bloqueiam a propagação da cadeia,

dado que atuam como antioxidantes primários, pela doação de um radical hidrogénio ao

radical peróxilo gerado pela oxidação lipídica, formando derivados estáveis (Servili et al.,

2009).

No azeite estão presentes diversas substâncias que podem atuar como antioxidantes, entre

as quais os carotenóides, compostos fenólicos lipofílicos (tocoferóis) – comuns a outros óleos

vegetais – e compostos fenólicos hidrofílicos (álcoois e ácidos fenólicos, flavonóides, lignanos e

secoiridóides) - encontrados exclusivamente no azeite (Sánchez-Moreno et al., 1998; Servili et

al., 2004).

2.2.1. Carotenóides

Os carotenóides são uma família de pigmentos lipossolúveis naturais, de cor amarela,

laranja ou vermelha e sensíveis à luz, oxigénio e calor. São normalmente tetraterpenos (Figura

1) (MacDougall, 2002) e estão divididos em duas categorias: os carotenos – constituídos

apenas por átomos de carbono e hidrogénio – e as xantofilas – que contêm pelo menos um

átomo de oxigénio.

Figura 1 – Exemplo de um caroteno.

A alta temperatura e na ausência de oxigénio, ocorre a isomerização de algumas ligações

duplas trans a cis e ocorre uma consequente diminuição na intensidade da cor. A descoloração

também pode ocorrer por ação dos hidroperóxidos, via radicais peróxilo e por ação da

lipoxigenase tipo II (Freitas, 2006/2007).

Estas moléculas têm um papel importante nos alimentos e na alimentação pois funcionam

como antioxidantes e contribuem para a prevenção de diversas doenças.

Os carotenóides maioritários presentes no azeite são a luteína e o β-caroteno (pró-vitamina

A), mas poderão existir também diversas (Figura 2) xantofilas: violaxantina, neoxantina,

luteoxantina, anteraxantina, mutatoxantina e β-criptoxantina (Boskou, 2006).

Figura 2 – Exemplos de diferentes xantofilas presentes no azeite.

2.2.2. Compostos Fenólicos

Na composição do azeite encontram-se os compostos fenólicos, responsáveis não só pela

elevada estabilidade do azeite, como também pelas propriedades biológicas que lhe assistem

(Servili et al., 2009).

Estes são diversificados em termos estruturais, mas possuem normalmente um grupo

fenólico. Os compostos fenólicos são, ocasional e erradamente, designados por polifenóis, pois

nem todos os compostos fenólicos do azeite são polihidroxilados, como por exemplo o tirosol

– Figura 3.

Figura 3 – Estrutura química de um polifenol per se e de um composto fenólico.

A atividade antioxidante também está diretamente relacionada com a sua estrutura e com

a sua habilidade em transferir o protão do grupo hidroxilo do anel aromático aos radicais

livres. Estudos indicam que existe uma maior atividade antioxidante em compostos

polihidroxisubstituídos, e preferencialmente nos orto e para substituídos (Tripoli et al., 2005).

Assim, estes compostos são classificados em duas categorias:

- Lipofílicos, como os tocoferóis e tocotrienóis (comuns a todos os óleos vegetais);

- Hidrofílicos, como os álcoois e ácidos fenólicos, flavonóides, lignanos e secoiridóides

(exclusivos do azeite).

Compostos Fenólicos Lipofílicos

A fração lipofílica dos compostos fenólicos é constituída maioritariamente por tocoferóis

(Vitamina E) e também por tocotrienóis (Figura 4). O α-tocoferol representa cerca de 90 % dos

tocoferóis do azeite, sendo a restante percentagem constituída pelos diferentes homólogos.

Todos os tocoferóis possuem uma estrutura cíclica de cromano, com o substituinte

hidroxilo do anel em posição para relativamente à cadeia alifática formada por 4 anéis

isoprénicos.

Figura 4 – Comparação entre a estrutura química dos tocoferóis e do tocotrienol, com n= α, β , γ ou σ; onde α:

R1= R2= CH3; β: R1= CH3, R2= H; γ: R1=H, R2= CH3; σ: R1= R2= H

Contribuem para a estabilidade oxidativa dos óleos vegetais onde se encontram pois

inibem a foto-oxidação por desativação do oxigénio singleto (Boskou, 2006).

Vários estudos demonstram que a atividade dos tocoferóis depende do meio em que estão

inseridos e da presença de metais, uma vez que atuam como pró-oxidantes na presença de

cobre e ferro (Paiva-Martins et al., 2005; Paiva-Martins et al., 2006).

Compostos Fenólicos Hidrofílicos

A fração fenólica hidrofílica do azeite é constituída pelos antioxidantes mais abundantes no

azeite, dividindo-se, como anteriormente mencionado, em 5 categorias: álcoois e ácidos

fenólicos, flavonóides, lignanos e secoiridóides (Tabela III e Figuras 5 a 9).

Tabela III – Composição fenólica do azeite virgem (adaptado de Servili et al., 2009)

Categoria Composto Fenólico Categoria Composto Fenólico

Ácidos Fenólicos vanílico Álcoois Fenólicos (3,4-dihidroxifenil)etanol

siríngico (p-hidroxifenil)etanol

p-cumárico glicósido do (3,4-dihidroxifenil)etanol

o-cumárico Flavonóides apigenina

gálico luteolina

cafeico Lignanos (+)-acetoxipinoresinol

protocatequoico (+)-pinoresinol

p-hidroxibenzoico

ferúlico

Cinâmico

4-(acetoxietil)-1, 2-dihidroibenzeno

benzóico

Secoiridóides 3,4-DHPEA-EDA

p-HPEA-EDA

3,4-DHPEA-EA

aglicona do ligstrósido

oleuropeína

derivado da p-HPEA

forma dialdeídica da aglicona da oleuropeina

forma dialdeídica da aglicona do ligstrósido

Figura 5 – Estrutura química de alguns ácidos fenólicos.

Em óleos frescos, a concentração de álcoois fenólicos e respetivos derivados é reduzida,

mas após o armazenamento estes valores aumentam devido à hidrólise dos secoiridóides

presentes no azeite virgem (Servili e Montedoro, 2002).

Figura 6 – Estrutura química de alguns exemplos de álcoois fenólicos e seus derivados.

Os flavonóides são antioxidantes presentes naturalmente em várias espécies vegetais,

conferindo poder antioxidante às mesmas, devido às suas estruturas fenólicas. São

classificados em diversos grupos, com base em critérios estruturais, tais como flavonóis,

flavanóis, flavonas, flavanonas, antocianidinas, catequinas e proantocianidinas, sendo que os

flavonóides em maior concentração no azeite são a apigenina e a luteolina – Figura 7 – com

concentrações que podem variar entre os 0,4 – 2,2 mg.kg-1 e os 0,7 – 7,6 mg.kg-1 (Servili et

al., 2009; Freitas, 2006/2007; Carrasco-Pancorbo et al., 2006).

Figura 7 – Estrutura química de alguns flavonoides.

Também estão presentes no azeite os lignanos (+)-1-acetoxipinoresinol e (+)-1-pinoresinol

(Figura 8), recentemente isolados e caracterizados, e cujas concentrações podem rondar entre

os 25 e 15 mg.kg-1 respetivamente (Servili e Montedoro, 2002).

Figura 8 – Estrutura química dos lignanos mais comuns presentes no azeite.

Os secoiridóides são os antioxidantes presentes em maior quantidade no azeite virgem e,

ao contrário dos outros compostos fenólicos já referidos, são exclusivos da família Olearaceae,

onde se incluem as oliveiras.

Estes compostos fenólicos têm tido especial atenção por parte da investigação

internacional, pois dos compostos polifenólicos com atividade antioxidante, os que se têm

mostrado com maior atividade protetora do azeite e maior atividade biológica são o 3,4-

DHPEA-EDA e o 3,4-DHPEA-EA (Servili et al., 2009).

Figura 9 – Estrutura química de alguns dos secoiridóides mais comuns presentes no azeite.

Em termos químicos os secoiridóides são derivados dos iridóides, em que ocorre a clivagem

do anel do ciclopentano (Figura 10).

Figura 10 – Estrutura química geral de iridóides e de secoiridóides.

No azeite virgem, os secoiridóides predominantes são os derivados da oleuropeína e do

ligstrósido, o 3,4-DHPEA-EDA e o p-HPEA-EDA, e o secoiridóide isómero da oleuropeína

aglicona, o 3,4-DHPEA-EA (Servili e Montedoro, 2002; Paiva-Martins et al., 2001). Estes

secoiridóides são obtidos por hidrólise enzimática efectuada pelas β-glucosidases endógenas

do azeite (Servili et al., 2009).

3. O Azeite e a Saúde Humana: Qual a relação?

Não é recente nem uma novidade a eventual relação entre a saúde vigorosa dos povos que

habitavam a bacia do Mediterrâneo e a sua singular alimentação. A relativa baixa incidência de

doenças cardiovasculares, tumorais e neurodegenerativas comparativamente com outros

povos despertou e desperta muito interesse na comunidade científica. A dieta típica destes

povos mediterrânicos inclui entre outros alimentos, uma fonte de gordura, classificada

atualmente como saudável, no azeite.

3.1. Propriedades Benéficas dos Componentes Minoritários do Azeite

Um vasto leque de estudos epidemiológicos demonstra o benefício da ingestão do azeite,

especialmente quando inserido numa Dieta Mediterrânica (Stark e Madar, 2002; Visioli e Galli,

1995a, 2002; Pérez-Lopéz et al., 2009; Psaltopoulou et al., 2004).

No entanto, os benefícios advêm não só do tipo de gordura que o azeite é - uma gordura

essencialmente monoinsaturada – mas também dos componentes minoritários presentes,

como os diversos compostos antioxidantes que possui. Desempenha por isso, um papel

importante na saúde humana, cujos benefícios são tão vastos e abrangentes como a

prevenção de doenças cardiovasculares e de doenças tumorais. É também atribuído um papel

quimiopreventivo, com propriedades anti-cancerígenas e anti-inflamatórias a diversos

constituintes minoritários do azeite (Servili et al., 2009; Cicerale et al., 2010).

Sendo o azeite uma gordura essencialmente monoinsaturada, quando integrada numa

dieta equilibrada, substitui o consumo de gordura saturada e de gordura trans, que estão

associadas a problemas coronários, elevados valores de LDL, triglicéridos (TG) e colesterol total

(TC), entre outros (Cicerale et al., 2010). O azeite é menos suscetível a alterações quando

exposto a temperaturas elevadas ou à degradação oxidativa, conservando assim grande parte

das propriedades que lhe são atribuídas, sendo essa característica distintiva dos restantes

óleos. Alguns autores indicam que esta resiliência é devida não só ao baixo teor em PUFAs mas

também aos antioxidantes (Tripoli et al., 2005; Hardwood et al., 2002). Ensaios in vivo indicam

que a substituição de SFAs por MUFAs permite baixar os valores de TC, LDL e aumentar os de

HDL (Covas et al., 2007).

Aos antioxidantes é atribuída a responsabilidade da diminuição do stress oxidativo e todas

as repercussões nefastas inerentes à presença de radicais livres ao nível celular. Cicerale et al.

referem a existência de estudos em animais que demonstram que a ingestão de azeite virgem

rico em polifenóis melhora o perfil lipídico, bem como o perfil glicídico do sangue, com

redução dos valores de TC, TG e LDL, assim como o aumento substancial dos valores de HDL

(Gigon et al., 2010; Covas, 2007).

3.2. Efeitos sobre a Saúde

Pelo referenciado até aqui, é possível depreender que existem diversos estudos que

apontam para um conjunto alargado de benefícios da ingestão de azeite - especialmente

quando inserido numa dieta adequada, reforçado por exercício físico regular – e dos seus

constituintes, sejam eles os ácidos gordos ou qualquer um dos tipos de antioxidantes. Por

estes motivos, os efeitos sobre a saúde por parte do azeite e seus constituintes merecem

especial atenção nos pontos seguintes.

3.2.1. Obesidade

Os tecidos adiposos do corpo humano servem como camada de protecção em termos

climatéricos, funcionando também como reserva energética em períodos em que a ingestão

de energia é reduzida ou impossível.

No entanto, com o grau de evolução das sociedades modernas, existe uma tendência de

consumismo excessivo a todos os níveis, e em especial a nível alimentar. A sobrealimentação é

um problema “urbano” e induzido pelo marketing dos mass media, mas também tem

explicações fisiológicas como a necessidade de saciedade, levando a comer em maiores

quantidades. Não obstante, é um problema de saúde pública que os Governos tentam agora

subjugar, quer pelos prejuízos diretos para a saúde individual, quer para os prejuízos a longo

prazo para o Estado.

A forma de cálculo do índice de massa corporal (IMC) é a fórmula mais comum de cálculo

para determinar o grau de obesidade ou de ausência desta, e é feito da seguinte forma:

Tabela IV - Classificações de Índice de Massa Corporal (Fonte: OMS, Global Database on BMI)

A sobrealimentação causa o acumular de energia não necessária/consumida nos tecidos

adiposos sob a forma de TAGs, levando assim à obesidade e aos problemas inerentes a essa

nova condição: dificuldades de locomoção, dificuldades respiratórias, problemas ósseos e

cardiovasculares.

O efeito do consumo de gorduras essencialmente monoinsaturadas, sob a forma de azeite,

enquadrada numa dieta Mediterrânica, foi estudado por Bes-Rastrollo et al., e revelou que um

elevado consumo de azeite não está associado a um maior ganho de massa corporal, ou a um

aumento do risco de desenvolver obesidade no contexto de uma dieta Mediterrânica,

resultados em linha com outros estudos efetuados (Serra-Majem et al., 2003). O consumo de

azeite está também ligado a um melhoramento do perfil glicídico e insulínico (Gigon et al.,

2010), bem como a um potencial de saciedade maior induzido pela transformação do ácido

oleico no intestino, numa hormona responsável pelo aumento de saciedade – a

oleoiletanolamida (OEA) - reduzindo assim a necessidade de comer em excesso para obter o

mesmo efeito. Schwartz e seus colaboradores reportam a transformação do ácido oleico

Classificação

IMC (kg/m2)

Intervalos de classificação

Ab

aixo

do

Pes

o

Idea

l

<18

.50

Magreza Grave < 16,00

Magreza Moderada 16,00 – 16,99

Magreza Leve 17,00 – 18,49

Pes

o Id

eal

18

.50

- 2

4.9

9

Peso Ideal

18,50 – 24,99

Aci

ma

do

Pes

o

Idea

l

≥25.00

Pré-Obesidade

25,00 – 29,99

Ob

esid

ade

≥30.00

Obesidade Classe I 30,00 – 34,99

Obesidade Classe II 35,00 – 39,99

Obesidade Classe III ≥ 40,00

ingerido – no qual o circulante não demonstrou o mesmo comportamento – em OEA, um

mensageiro lipídico que se liga a recetores-α ativados por proliferador de peroxíssomas (PPAR-

α) e que não se verifica em cobaias geneticamente modificadas para a ausência do

transportador de ácido gordos CD36. Este facto sugere que a ativação da mobilização do OEA

do intestino delgado, possibilitada pelo transportador CD36, serve de sensor, relacionando a

ingestão lipídica com a saciedade (Schwartz et al., 2008). O interesse acerca desta hormona é

crescente na comunidade científica e na investigação relacionada com a obesidade pois

diferentes estudos referem também que, a OEA exógena regula o tempo entre refeições

(Oveisi et al., 2004), diferenciando-a de outros péptidos de origem intestinal, como a

colecistoquinina (CCK) que regula, não a frequência mas o tamanho das refeições (Moran,

2006).

3.2.2. Stress Oxidativo

Os efeitos do stress oxidativo (desequilíbrio no balanço produção/remoção de espécies

reativas de oxigénio – ROS – consideradas subprodutos resultantes da respiração aeróbia) são

vários e levam a repercussões em diversos componentes do organismo, tais como danos no

ADN, nos eritrócitos, com influência direta em doenças como aterosclerose e o surgimento de

problemas cardiovasculares (Servili et al., 2009; Cicerale et al., 2010).

3.2.2.1. Aterosclerose e Doenças Cardiovasculares

Tem-se verificado, nos últimos anos, um aumento de interesse na influência do azeite e

seus constituintes na modificação oxidativa das LDL (Torre-Carbot et al., 2007; Cicerale et al.,

2003; Servili et al., 2009; Tripoli et al., 2005). Crê-se que um passo-chave no desenvolvimento

de doenças cardiovasculares é a aterosclerose, caracterizada pelo endurecimento e

espessamento das paredes arteriais, devido à acumulação de lípidos, tecidos fibrosos e cálcio

nas mesmas (Sies, 1997).

Circulam na corrente sanguínea lípidos (TAGs, fosfolípidos, colesterol esterificado e

colesterol livre) que se associam a proteínas – génese da designação lipoproteínas – cuja

função é transportar esses mesmos lípidos desde os locais de absorção até aos locais onde se

processa a sua degradação e posterior utilização, e respetiva excreção. Existem diferentes

tipos de lipoproteínas classificados de acordo com a respetiva densidade e função: quilomicra,

lipoproteínas de muito baixa densidade (VLDL), lipoproteínas de baixa densidade (LDL) e

lipoproteínas de elevada densidade (HDL).

O “mau colesterol” são cientificamente as lipoproteínas (LDL), que transportam colesterol

na corrente sanguínea, do fígado para os tecidos. Os fatores que influenciam os seus níveis no

sangue tendem também a afetar a concentração total de colesterol. A oxidação das LDL causa

danos nas paredes vasculares, estimulando a sua endocitose pelos macrófagos e a formação

de células esponjosas que levarão à formação de ateromas. Fatores necróticos libertados por

estas células permitem uma penetração mais fácil de monócitos na íntima que, por endocitose

de LDLox levam à formação de placas dentro das paredes arteriais.

Por este motivo, teores elevados de TC e de LDL foram estabelecidos como fatores de risco

para o desenvolvimento de aterogénese, a causa principal de problemas cardiovasculares

(Cicerale et al., 2010; Covas et al., 2007; Tripoli et al., 2005; Sies, 1997).

O vulgarmente chamado de “bom colesterol” é cientificamente designado por HDL e

transporta o excesso de colesterol do local onde se encontra (células dos tecidos ou órgãos

periféricos) para o fígado, onde é reutilizado ou excretado pela via biliar através de duas

formas possíveis: sob a forma livre, ou sob a forma de ácidos biliares. Por este motivo, crê-se

que as HDL são benéficas na saúde humana, atuando como fator de proteção na prevenção de

doenças coronárias (Fennema, 1996; Harwood e Yaqoob, 2002) Alguns estudos indicam que a

ingestão de azeites virgens com elevado teor de fenóis leva ao aumento de HDL no sangue, em

alguns casos com valores de cerca de 5 - 7%, bem como à diminuição dos valores de LDL

(Cicerale et al., 2010).

O stress oxidativo pode ser indiciado pela presença de determinados marcadores, como

isoprostanos-F2, peróxidos lipídicos (LPO), glutationa oxidada (GSSG), e peroxidase glutationa

(GSH-Px). O estudo in vivo realizado por Biswas et al. em 2005 demonstrou que os

isoprostanos-F2 são resultado da peroxidação induzida do ácido araquidónico pelos radicais

livres, enquanto os LPO serão um subproduto da oxidação dos ácidos gordos e do

esgotamento da GSH que antecede a oxidação lipídica e a aterogénese (Cicerale et al., 2010).

Igualmente em 2005, Ruano et al. demonstraram os efeitos benéficos da ingestão de azeite

com elevado teor em compostos fenólicos em pacientes hipercolestorémicos (com elevado

teor de colesterol sanguíneo), através da redução dos níveis de isoprostano-F2, resultados

coadunantes com o estudo executado por Visioli et al., 2000a.

Vários polifenóis do azeite têm vindo a mostrar efeitos benefícios em sistemas biológicos –

o hidroxitirosol (Figura 3, Secção 2.2.2.) – mostrou em estudos in vitro, inibir totalmente a

agregação das plaquetas em sangue humano, tendo sido notados comportamentos inibitórios

semelhantes em outros antioxidantes do azeite, como a luteolina e a aglicona da oleuropeína

(Figura 7 e 9 respetivamente, Secção 2.2.2.) (Servili et al., 2009). No seu estudo ex vivo de

1995, Visioli e seus colaboradores sugerem que a oxidação das LDL é inibida por ação dos

constituintes do azeite extra-virgem. Ainda noutro estudo, dois fatores pró-coagulantes, o

plasminogéneo ativador inibidor-1 (PAI-1) e o fator VII (FVII) viram as suas concentrações

reduzidas por ação de azeite virgem de elevado teor polifenólico (Ruano et al., 2007).

Assim o azeite e os seus constituintes poderão apresentar um papel importante na

prevenção da oxidação das LDL e dos lípidos, inibindo a aterogénese (Tripoli et al., 2005).

Sob outro ponto de vista na linha de investigação do stress oxidativo, existem estudos que

indicam outros efeitos nefastos na saúde humana: desde danos aos eritrócitos e ao ADN, até à

relação com doenças neurodegenerativas.

Os eritrócitos são células sanguíneas, anucleadas, responsáveis pelo transporte de oxigénio.

Possuem uma capacidade reduzida de auto-reparação e sendo células de transporte específico

de oxigénio, estão expostas a danos oxidativos sempre que se desenvolve uma situação de

stress oxidativo. No entanto, possuem antioxidantes endógenos de modo a proteger

minimamente a sua integridade e funcionalidade, tais como enzimas antioxidantes, glutationa,

tocoferóis e ascorbato. Não obstante, ocorrem constantemente no eritrócito danos parciais ou

irreversíveis, marcando a célula para a sua remoção após uma vida de cerca de 120 dias (Paiva-

Martins et al., 2009). No entanto, o eritrócito torna-se importante para o estado oxidativo do

sangue não só porque é uma fonte de ROS mas também porque é o principal local de

regeneração do ácido ascórbico sanguíneo, dependendo esta regeneração da integridade das

suas defesas antioxidantes.

Um estudo recente de Paiva-Martins et al. (2010) demonstra a interação do 3,4-DHPEA-EDA

com os eritrócitos, protegendo-os da hemólise oxidativa iniciada por radicais peróxilo.

Também fica subjacente dos resultados obtidos que, a proteção não advém apenas de um

mecanismo de “radical scavenging” mas possivelmente também de uma interação direta com

as membranas celulares, induzindo modificações ao perfil proteico da mesma.

3.2.2.2. ADN

Para além da hemólise induzida nos eritrócitos também danos a nível do ADN poderão

acontecer e já foram reportados em alguns estudos (Salvini et al., 2006; Silva et al., 2008;

Yermilov et al., 1995) que visaram demonstrar o potencial antioxidante dos compostos

polifenólicos do azeite na prevenção do dano ou na reparação do mesmo. Muita atenção tem

sido dada a esta linha de investigação pois os danos oxidativos no ADN estão na génese de

muitos carcinomas (Covas, et al., 2007; Cicerale et al., 2010; deRojas-Walker et al., 1995;

Baskin e Salem, 1997). Muito embora os polifenóis tenham propriedades antioxidantes que

permite prevenir a oxidação lipídica e proteica, alguns podem agir também como pró-

oxidantes, induzindo danos oxidativos em células, sendo por isso citotóxicos. Esta

citotoxicidade tem-se mostrado em alguns casos seletiva, tendo-se verificado ser superior em

células cancerígenas. Assim, certos antioxidantes poderão desempenhar um duplo papel na

mutagénese e carcinogénese, dependendo a sua atuação como anti ou pró-oxidantes do

estado redox do ambiente biológico em que está inserido (Baskin e Salem, 1997).

O radical hidroxilo é o mais comum dos radicais capazes de induzir danos no ADN, pois

possui elevada eletrofilicidade e alta reatividade termocinética. Devido às suas propriedades,

pode atacar o ADN por duas vias possíveis: abstração de protões da desoxirribose ou pela

adição às ligações π do ADN. No primeiro caso, a abstração de átomos de hidrogénio da

desoxirribose pode levar à cisão da estrutura açúcar-fosfato numa das cadeias de ADN

helicoidal e cabe a certas enzimas reparadoras retificarem os danos. No entanto, quando o

ataque de radicais hidroxilo é excessivo, os danos podem acontecer nas duas cadeias de ADN,

o que poderá levar à cisão da estrutura de ADN resultando na morte celular. No segundo caso,

a adição às ligações π das bases leva, entre outras, à formação de 8-hidroxi-2’-desoxiguanosina

(8OH2dG), uma das lesões mais mutagénicas conhecidas. Esta lesão pode levar a alterações na

velocidade de replicação do ADN, resultando em mutações, hidrólise ou cisão das cadeias

(Baskin e Salem, 1997).

Estudos demonstraram que o consumo de azeite com elevado teor em polifenóis consegue

reduzir em 30% (Salvini et al., 2006) os danos oxidativos no ADN, bem como diminuir a

concentração de marcadores específicos da ocorrência de danos oxidativos no ADN na urina

(Machowetz et al., 2007; Weinbrenner et al., 2004). Outros estudos revelam que três

polifenóis específicos, entre os quais um flavonóide característico do azeite, a luteolina (Figura

7), têm efeitos protetores contra os danos oxidativos ao ADN (Silva et al., 2008).

3.2.2.3. Cancro

São diversos os estudos epidemiológicos que demonstraram uma associação entre o

consumo de azeite e o risco reduzido de contrair diferentes tipos de cancro – da mama, da

próstata, dos pulmões, da laringe, dos ovários e do cólon (Servili et al., 2009; Filik e Ozyilkan,

2003; Covas et al., 2007).

Colomer e Menéndez, no seu estudo de 2006, referem a capacidade do ácido óleico regular

diretamente a expressão de certos oncogénios, com papel crucial na transformação maligna,

tumorogénese, metástase e insucesso nos tratamentos anti-cancerígenos, e responsáveis por

cerca de 20 % dos cancros da mama e agressividade dos mesmos. Mais recentemente, outros

estudos revelaram que o ácido oleico atua sinergeticamente com uma certa terapia anti-

cancerígena, inibindo o crescimento celular de células cancerosas mamárias MCF-7 e SKBR3

(Menéndez et al., 2007; Menéndez et al., 2008; Menéndez et al., 2009).

Para além do ácido oleico, alguns fenóis, nomeadamente a oleuropeína e o hidroxitirosol,

demonstraram a capacidade de reduzir a taxa de proliferação celular (Fabiani et al., 2002;

Fabiani et al., 2006) e induzir a apoptose nas células MCF-7 (Han et al., 2009). Mais

recentemente, o hidroxitirosol demonstrou também inibir a proliferação do adenocarcinoma

humano, através da forte inibição da fosforilação das quinases reguladas por sinais

extracelulares (ERK1/2) (Corona et al., 2009).

3.2.2.4. Doenças Neuro-Degenerativas

Ainda relacionada com os efeitos do stress oxidativo existem as doenças neuro-

degenerativas como a doença de Alzheimer.

A doença de Alzheimer é uma doença de presença crescente na sociedade atual, incurável,

degenerativa e terminal. É caracterizada por irritabilidade, confusão, variações bruscas de

humor e perda de memória, culminando em perda funcional e morte do paciente. O

desenvolvimento da doença não é ainda bem compreendido, tal como não existe uma cura ou

um método preventivo e os tratamentos atuais apenas atenuam os sintomas. Duas novas

abordagens poderão permitir obter informações cruciais. Numa linha de estudo, está a ser

analisada uma proteína – designada por Tau – que está ligada à construção e estabilização de

microtubulos e que, em certos casos se agrega sob a forma de emaranhados neurofibrilares.

Outra linha de estudo incide sobre os oligómeros beta-amiloides (A) – também chamados por

ADDL (ligandos amilóides difusíveis beta-derivados) – poderem estar relacionados com

desenvolvimento da doença de Alzheimer por se ligarem aos neurónios, causando alterações

eléctricas ao nível neuronal e ao nível sináptico, causando problemas de memória. Dois

estudos diferentes, ambos de 2009, incidiram sobre estas duas vias: Li et al. revelaram que o

Ty-EDA inibe a agregação da proteína Tau, enquanto Pitt e seus colaboradores demonstraram

que o Ty-EDA tem a capacidade de alterar o estado da oligomerização dos ADDL protegendo os

neurónios dos respetivos efeitos nefastos.

Outra doença do foro degenerativo cuja relação com o stress oxidativo parece ser uma

realidade é a doença de Parkinson (Castellani et al., 1996; Jenner, 2003). É uma doença

perturbadora do sistema nervoso central (SNC), do tipo crónico e progressivo, que prejudica as

capacidades motoras do indivíduo, em como a capacidade comunicativa.

3.2.2.5. Inflamação e Dor

Após a demonstração das propriedades benéficas do azeite incluído numa dieta do tipo

Mediterrânico, as atenções dos investigadores centraram-se primeiramente nos seus

principais constituintes e depois nos minoritários. Estes últimos revelaram propriedades

antioxidantes, capazes de reduzir e mesmo inibir o stress oxidativo de eritrócitos, das cadeias

de ADN e deste modo ter uma influência direta sobre doenças cardiovasculares.

Recentemente foram publicados alguns estudos que revelam efeitos sobre modulação da

inflamação e da atividade endotelial (Covas et al., 2007), como a diminuição da concentração

de marcadores biológicos da inflamação, como a interleuquina (Il-6) e proteína C reativa (PCR)

(Alemany et al., 2010), a diminuição das concentrações plasmáticas de tromboxano B2 (TXB2)

e leucotrieno B4 (LTB4) (Bogani et al., 2007; Visioli et al., 2005; Léger et al., 2005). Também

foram reportados efeitos sobre a capacidade de modular a expressão de certas

metaloproteases (MMP-9), pela ação da via do fator nuclear kappa B (NF-kB) (Verma et al.,

1995) – e a diminuição da concentração de alguns mediadores de inflamação como o fator de

necrose tumoral alfa (TNF-α), a interleuquina-1-β (IL-1-b) e a prostaglandina E2 (PGE2) (Miles

et al., 2005).

Para além da diminuição dos processos inflamatórios, diversos estudos indicam que a

atividade dos polifenóis inibem a formação de ciclooxigenases (COX) – enzima responsáveis

pela formação de mediadores, como as prostaglandinas e os tromboxanos (Beauchamp et al.,

2005). A COX existe sob três formas, correspondentes a três isoenzimas, designadas por COX-1

(considerada uma enzima constitutiva e presente na maioria da células dos mamíferos, com

funções fisiológicas), COX-2 (uma enzima induzida, encontrada em macrófagos ativados e em

outras células em locais de inflamação) e COX-3 (enzima cuja função exata é desconhecida mas

se crê estar relacionada com o SNC). A inibição da COX leva à diminuição sintomática da dor e

inflamação, sendo este o modo de atuação de medicamentos não-esteróides como o

ibuprofeno ou a aspirina.

Observou-se uma actividade anti-inflamatória semelhante à do ibuprofeno ou à da aspirina

por parte do Ty-EDA (Figura 11) (Beauchamp et al., 2005), obtida pela inibição da COX-1 e COX-

2. (Romero et al., 2007; Cicerale et al., 2010; Covas et al., 2007; Servili et al., 2009; Tripoli et

al., 2005; Obied et al., 2008).

Figura 11 – Estrutura química do Ty-EDA.

3.2.2.6. Ação Anti-Microbiana

Outros trabalhos afirmam também que, certos compostos fenólicos apresentam atividade

antibacteriana e/ou bactericida contra numerosos patogénios, como a Listeria monocytogenes,

a Staphylococcus aureus, a Shigella sonnei e a Salmonella enterica (Romero et al., 2007).

Romero et al. reportaram também atividade anti-Helicobacter pylori (bactéria do revestimento

mucoso do estômago, responsável por úlceras pépticas, gastrites e cancros estomacais) por

parte do Ty-EDA, em quantidades tão reduzidas quanto 1,5 µg.mL-1. A atividade anti-microbial

de outros compostos fenólicos foi também demonstrada, nomeadamente para a oleuropeína,

o hidroxitirosol e tirosol (Medina et al., 2006; Besignano et al., 1999; Tripoli et al., 2005).

3.3. Biodisponibilidade dos compostos fenólicos do azeite

As propriedades biológicas dos compostos fenólicos do azeite dependem da extensão da

absorção e consequente metabolismo, pelo qual são diversos os estudos in vivo efetuados a

fim de investigar a biodisponibilidade dos fenóis do azeite (Visioli et al., 2000b; Vissers et al.,

2002; Miró-Casas et al., 2001; Miró-Casas et al., 2003a, Miró-Casas et al., 2003b).

Nestes estudos determinaram-se os níveis de tirosol na urina e sangue, cujos valores

aumentam após a ingestão de azeite, verificando-se que estes são excretados essencialmente

sob a forma de O-glucoronídeos, tanto dos compostos parentais como do ácido e álcool

homovanílico (Visioli et al., 2000b; Visioli et al., 2003; D’Angelo et al., 2001; Caruso et al.,

2001), demonstrando que nos humanos estes compostos sofrem a ação da catecol-O-

metiltransferase (COMT) (Tripoli et al., 2005; Caruso et al., 2001). Destes estudos resulta

também que a excreção destes compostos estará correlacionada com a dose administrada

(Caruso et al., 2001; Vissers et al., 2002; Visioli et al., 2000b). Em 2006, Corona e seus

colaboradores, efetuaram um estudo no qual reportaram uma concentração dos

glucoronídeos do HyTy e do HVA maior que a administrada, sendo portanto provável que o

hidroxitirosol tenha origem também nos secoiridóides.

Mais recentemente, confirmou-se que após a administração de secoiridóides como 3,4-

DHPEA-EDA e 3,4-DHPEA-EA, aparecem nos líquidos serosais não só os glucoronídeos dos

compostos parentais reduzidos, como os glucoronídeos do HyTy e HVA (Pinto et al., 2010).

3.3.1. Metabolismo

Após a entrada de um xenobiótico no organismo, inicia-se a metabolização do mesmo. A

metabolização tem como função converter uma molécula capaz de atravessar membranas

biológicas, numa que possa ser excretada (pela urina, suor, etc.). Ao longo dos passos

metabólicos, a lipofilicidade das moléculas normalmente reduz-se (o que se traduz também no

aumento de polaridade), e é este fator que determina se ela vai para a excreção renal ou se

prossegue para a metabolização, podendo qualquer um dos passos ativar ou desativar o

xenobiótico – o que poderá limitar a ação de fármacos (se desativado) ou funcionalizar um

pró-fármaco (se ativado).

O metabolismo de xenobióticos é dividido em duas fases distintas: fase I e fase II, onde

cada uma destas comporta diferentes transformações ao xenobiótico.

Após a ingestão do xenobiótico, verifica-se a sua absorção pela corrente sanguínea e entra

no sistema porta-hepático e através da veia porta chega ao fígado. Aí, a sua concentração

pode ser bastante reduzida antes de ser lançada no sistema circulatório, motivo pelo qual,

quando se trata da ingestão de medicamentos, alguns poderão necessitar de ser

administrados por vias alternativas à gastro-intestinal, evitando assim a ação hepática, tal

como administração sublingual, intravenosa, inalação, entre outras. No entanto, o

metabolismo de Fase I e de Fase II não é exclusivo de um determinado órgão, podendo ocorrer

em diferentes locais ou órgãos. Assim, a maioria acontece a nível do fígado mas muitas – como

a hidrólise de ésteres e amidas, a redução e até mesmo a glucoronoconjugação – poderão

ocorrer também a nível da parede intestinal, plasma sanguíneo e outros tecidos.

Relativamente à forma como o metabolismo dos xenobióticos é processado, na fase I,

ocorrem essencialmente três tipos de reações: reações oxidativas, redutoras e hidrolíticas.

Dentro das reações oxidativas poderão ocorrer hidroxilações aromáticas, epoxidação de

alcenos, oxidação de carbonos adjacentes a centros sp2, oxidação de átomos de carbono

alifáticos e alicíclicos, oxidação de sistemas C-N, C-O e C-S, oxidação de álcoois e aldeídos bem

como outras reações oxidativas. Dentro das reações de carácter redutor poderão ocorrer

reduções a grupos carbonilo, de grupos nitro, de grupos azo, de grupos azido, redução de

óxidos de aminas terciárias, desalogenação redutiva e reações carboxilativas. Os ésteres e as

amidas são suscetíveis à ação das estereases, enquanto os grupos nitro, azo e carbonilo são

suscetíveis à ação das reductases.

Enzimas não específicas, tal como as do citocromo P450 no fígado, têm a capacidade de

introduzir grupos funcionais polares em xenobióticos, aumentando a sua polaridade e

tornando os mesmos mais passíveis de sofrerem excreção renal. Outras reações enzimáticas

poderão “desmascarar” grupos funcionais já existentes, resultando assim também no aumento

de polaridade da molécula.

A fase II do metabolismo ocorre principalmente no fígado, mas vários estudos têm

mostrado que o hidroxitirosol sofre extensa O-metilação e glucoronização ao nível do intestino

(Corona et al., 2009; Pinto et al., 2010). Nesta fase ocorre a conjugação dos metabolitos

resultantes do metabolismo de fase I a pequenas moléculas polares endógenas tais como o

ácido glucorónico, sulfato e aminoácidos. Estas alterações nas moléculas podem desativar

ainda mais um xenobiótico por alteração direta das suas propriedades. Nesta fase ocorre,

normalmente, produção de metabolitos hidrofílicos (por redução da sua lipofilicidade, como

referido anteriormente), que são excretados na bílis (se a MM > 300 g.mol-1) ou na urina.

Também pode ocorrer intervenção da glutationa, que captura metabolitos de elevada

eletrofilicidade antes de modificarem macromoléculas importantes a nível biológico como o

ARN, o ADN ou proteínas. As reações de conjugação acontecem principalmente em grupos

hidroxilo, carbonilo, amino, tiol e azoto heterocíclico, em reações de glucoronização,

acetilação, metilação, entre outras (Silverman, 2004; Patrick, 2005).

Uma outra enzima de papel preponderante no metabolismo é a COMT, que intervém na

desativação das catecolaminas. Devido à semelhança estrutural do hidroxitirosol com as

catecolaminas, este vai ser metabolizado pela COMT a álcool homovanílico, pela introdução de

um grupo metilo na posição 3-hidroxi do anel. O hidroxitirosol é também um metabolito do

neurotransmissor dopamina (Figura 12) (Manna et al., 2000).

Figura 12 – Estruturas químicas do hidroxitirosol, seu metabolito álcool homovanílico e dopamina.

Relativamente aos metabolitos de compostos fenólicos do azeite, o hidroxitirosol é

convertido, por via enzimática, em quatro derivados oxidados e/ou metilados, sendo eles o

ácido 3,4-dihidroxifenilacético, o 3,4-dihidroxifenilacetaldeído, bem como o HVA e HVAc –

cujos caminhos metabólicos estão representados na Figura 13 (D’Angelo et al., 2001).

Figura 13 – Caminhos metabólicos possíveis do HyTy - metabolito da oleuropeína - e precursor do HVA (adaptado de

Khymenets et al., 2001; D’Angelo et al., 2001; Tuck et al., 2002).

Os produtos de metabolização dos compostos dependem da estrutura química inicial do

fenol em causa. No caso do hidroxitirosol, a sua glucoronização biocatalizada no fígado, ocorre

nos grupos hidroxilo do anel aromático, onde a posição 4-hidroxi é preferida à 3-hidroxi, sendo

esta regioseletividade comum nos humanos e nos ratos. Relativamente ao tirosol e ao álcool

homovanílico, formam-se dois tipos de glucoronídeos: o O--D-glucoronídeo fenólico e o O--

D-glucoronídeo de álcool alifático, sendo que o glucoronídeo fenólico se forma em maior

quantidade comparativamente ao último (Khymenets et al., 2006).

4. Síntese de O-Glicósidos

A síntese de glicósidos é uma área de franco crescimento nos últimos anos, devido ao

aumento de interesse nas possíveis aplicações em diversas áreas. No entanto, as suas

aplicações começam nos estudos científicos que incorporam oligosacarídeos na produção de

anticorpos, interações com vírus, substratos para glicosidases e glicosiltransferases, bem como

na especificidade de lectina e selectina (proteínas com propriedades de ligação reversível a

açúcares), à semelhança do estudo efetuado por Sébastien Marti de 2004 (Ali, 2003).

Existem essencialmente dois modos de conseguir a formação de ligações glicosídicas: o

método enzimático e o químico.

4.1. Método Enzimático

No primeiro caso, são utilizadas enzimas – tais como as glicosil-transferases – onde os

açúcares mono ou difosfato são dadores glicosil, os seus resíduos são os grupos de saída e os

açúcares ou outras agliconas são os dadores glicosil. Apesar da elevada especificidade na

obtenção de determinadas regio e diasteroseletividades, o elevado custo das enzimas, bem

como as dificuldades inerentes ao método reacional e a geração complicada e dispendiosa de

dadores glicosil limitam a utilização deste método para oligosacáridos complexos (Ali, 2003).

4.2. Método de Síntese Química

No segundo método, a síntese de glicósidos é conseguida através de reações de

glicolisação, onde um dador glicosil protegido, com um grupo de saída (GS) adequado no seu

carbono anomérico é combinado com um aceitador glicosil total ou parcialmente protegido à

excepção de, tipicamente, um grupo hidroxilo livre onde a ligação O-glicósido se irá formar. O

dador (açúcar) irá actuar, tipicamente, como um eletrófilo e o aceitador como um nucleófilo,

onde o grupo de saída do dador glicosil e os grupos protetores serão os fatores determinantes

no rendimento e na seletividade anomérica das reações de glicolisação, dado que uma mistura

anomérica α/ é formada, como representado na Figura 14 (Ali, 2003).

Figura 14 – Tipificação das reações de glicolisação.

4.2.1. Método dos Fosfitos

Este é um outro método desenvolvido por Schmidt e seus colaboradores como

complemento ao método anterior e tem aplicabilidade em deoxiaçúcares, sendo usado no

passo da sililação na síntese de glicósidos do ácido neuramínico (Schmidt et al., 1993 Schmidt,

1998).

A síntese destes glicósidos é feita a partir do oxigénio anomérico desprotegido dos açúcares

pela reação com clorofosfitos e com base de Hünig. Os -glicosil fosfitos do ácido neuramínico

podem ser ativados com quantidades catalíticas de TMSOTf (Ali, 2003), na reação com ROH

para dar os compostos glicosídicos.

Figura 15 – Mecanismo proposto para a glicolisação via fosfitos.

4.2.2. Método Intramolecular

Este método pode, em princípio, superar as questões da ativação e de estereoquímica

quando se tenta manter a orientação adequada dos componentes glicosídicos de modo a estes

poderem ser forçados a se acoplarem intramolecularmente.

É um método recente mas apresenta um elevado potencial na síntese de ligações açúcar-

açúcar de oligosacáridos. Os métodos intramoleculares encontram-se divididos em três

categorias: de substituinte funcional, de espaçador rígido e de grupo de saída.

Figura 16 – Glicolisação intramolecular baseada no substituinte funcional (adaptado de Ali, 2003).

Figura 17 – Mecanismo proposto para a glicolisação intramolecular baseada num espaçador rígido (adaptado de

Müller et al., 1999).

Figura 18 – Glicolisação intramolecular baseada no grupo de saída (adaptado de Scheffler et al., 1997).

Com base na glicolisação por intermédio de um espaçador rígido (Huchel et al., 1998),

Schmidt et al. (Müller et al., 1999) sintetizaram com sucesso dissacáridos com recurso a

resíduos de m-xileno como espaçador, com a estereoseletividade determinada pelo tamanho

do anel (de 14 ou 15 elementos) e pela configuração do resíduo aceitador dentro do anel

macrocíclico.

4.2.3. Método de Fischer-Helferich

O método de Fischer-Helferich baseia-se na substituição direta do oxigénio do carbono

anomérico. É um método análogo ao de Koenigs-Knorr, mas sem a utilização de sais de metais

pesados, recorrendo apenas a uma catálise ácida de modo a permitir a ligação ao oxigénio do

aceitador glicosil.

Figura 19 – Glicolisação de Fischer-Helferich, onde R= alquil, acil; R’= alquil, aril, heteroaril; HA= ácidos de Lewis

(adaptado de Zhu e Schmidt, 2009).

É um método reversível logo a sua aplicabilidade é limitada e inadequada à síntese de

oligosacáridos ou glicósidos complexos. Para uma troca irreversível (assim como no método de

Koenigs-Knorr) do oxigénio do carbono anomérico, é necessária uma pré-ativação do centro

anomérico pela introdução dum bom grupo de saída.

4.2.4. Método de Koenigs-Knorr

Este é o método de glicolisação mais antigo mas é, no entanto, ainda utilizado atualmente.

Neste método os dadores glicosilo são, tipicamente, cloretos ou brometos ativados por sais de

mercúrio ou prata, ou mais recentemente fluoretos (fluoreto de hidrogénio,

dietilaminotrifluoreto de enxofre, sais e metais de fluoreto) (Foster e Westwood, 1973;

Yokoyama, 2000).

Figura 20 – Glicolisação de Knoenigs-Knorr com recurso a sais, onde R= O-alquil, O -acil, alquil, acil; R’= alquil, aril,

heteroaril; Y= sais de metais pesados, ácidos de Lewis ou catalisadores de transferência de fase (adaptado de Kürti e

Czakó, 2005).

Figura 21 – Glicolisação de Knoenigs-Knorr com recurso a fluoretos, onde R= O -alquil, O -acil, alquil, acil (adaptado

de Yokoyama, 2000).

No entanto, o método de Koenigs-Knorr tem algumas desvantagens: a preparação dos

haletos glicosídicos é complexa e estes podem sofrer hidrólise ou eliminação-1,2. Alguns são

também termicamente instáveis e são necessárias quantidades estequiométricas de promotor

de modo a garantir o sucesso da reação (Kürti e Czakó, 2005).

4.2.5. Método do Tricloroacetimideto

Este é um método desenvolvido por R. R. Schmidt e J. Michel, que evita o uso de sais de

metais pesados (por oposição ao método descrito no ponto anterior) e permite a obtenção de

dadores glicosídicos suficientemente estáveis. São ativados com quantidades catalíticas de

ácidos de Lewis, como por exemplo BF3.OEt2, ou um catalisador ácido mais forte como o

TMSOTf (Ali, 2003).

Figura 22 – Glicolisação via tricloroacetimidetos.

O controlo anomérico da ligação O-glicosídica depende da configuração anomérica do

dador glicosídico, sendo que a configuração é obtida com a utilização de K2CO3 como base

(com controlo cinético, o que permite obter o produto de menor energia de ativação e

portanto, mais rapidamente), enquanto a conformação α é obtida com o uso de NaH, Cs2CO3

ou KOH com um catalisador de transferência de fase (por controlo termodinâmico, o que

permite obter um produto mais estável), o que faz deste um método relativamente simples

mas que em condições normais produz resultados bastante promissores.

Na síntese dos imidetos, sob catálise básica e por ação do excesso de carga negativa no

oxigénio após a saída de um protão, verifica-se a adição direta do grupo tricloroacetimideto.

O elevado poder atraídor de eletrões do grupo triclorometilo facilita a formação do ião

oxocarbénio no centro anomérico que, sob catálise ácida (ácido ou ácido de Lewis) leva à saída

do grupo tricloroacetimideto. Como este grupo não demonstra propriedades ácidas ou básicas

nas condições reacionais, torna possível a sua catálise ácida (com recurso a, por exemplo,

BF3.OEt2), e a expressão das suas boas propriedades dador-glicosídicas, com a formação do

aduto O-glicósido entre o dador glicosídico.

Figura 23 – Possível mecanismo de reação da formação do ião oxocarbénio (adaptado de Banait e Jenks, 1991).

Figura 24 – Mecanismo de síntese proposto e previsto para a síntese do glucoronídeo, onde B= base; R= alquil, acil;

R’= alquil, aril, heteroaril (adaptado de Zhu e Schmidt, 2009).

5. Conclusão e observações finais

São vastos os trabalhos e ensaios científicos que apontam para uma relação entre a

ingestão de azeite – e seus constituintes – e uma menor incidência de diversos tipos de

doenças. Nas últimas décadas são notórios diversos indícios que apontam para um benefício

regular desta fonte de gordura quando inserida num regime alimentar saudável.

Esses benefícios na saúde não são atribuíveis a um componente específico mas, alguns

estudos apontam para que uma parte desses benefícios advenha dos compostos polifenólicos.

Estes compostos minoritários do azeite possuem propriedades antioxidantes e da mesma

forma poderão conferir proteção antioxidante após ingestão e absorção pelo organismo. No

entanto, esta atividade biológica é dependente não só da sua absorção pelos órgãos-alvo bem

como da sua metabolização.

O estudo da metabolização e do percurso metabólico é da maior importância pois é através

destes que se poderão inferir conclusões acerca da ingestão destes compostos. Assim é

necessário proceder à sua síntese, quer por via enzimática quer por via de síntese química. A

primeira, apesar de configurar um método rápido e simples para obter os metabolitos,

apresenta elevados custos económicos, enquanto a segunda – apesar de execução mais

extensa – é consideravelmente menos dispendiosa. Assim, esta é a metodologia mais

generalizada e implementada e o que a torna economicamente viável, eficaz e vantajosa.

Seria igualmente interessante complementar os estudos já existentes de biodisponibilidade

e ensaios antioxidantes de metabolitos dos polifenóis do azeite. Um dos mais interessantes e

promissores seria, por exemplo, proceder à síntese dos glucoronídeos do álcool homovanílico

– um composto análogo do neurotransmissor dopamina.

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