ผลของโคลชซนและออรซาลนตอการเปลยนแปลงชดโครโมโซม ในตนออนชดท 2

ของปาลมน ามน Effect of Colchicine and Oryzalin Treatments on Chromosome Duplication in

Secondary Somatic Embryos of Oil Palm

ไซนยะ สะมาลา Sainiya Samala

วทยานพนธนเปนสวนหนงของการศกษาตามหลกสตรปรญญา ปรชญาดษฎบณฑต สาขาวชาพชศาสตร

มหาวทยาลยสงขลานครนทร A Thesis Submitted in Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of

Doctor of Philosophy in Plant Science Prince of Songkla University

2555 ลขสทธของมหาวทยาลยสงขลานครนทร

(1)

ชอวทยานพนธ ผลของโคลชซนและออรซาลนตอการเปลยนแปลงชดโครโมโซม ในตนออนชดท 2 ของปาลมน ามน

ผเขยน นางไซนยะ สะมาลา สาขาวชา พชศาสตร

อาจารยทปรกษาวทยานพนธหลก คณะกรรมการสอบ ………………………………………… .………....……………….ประธานกรรมการ (รองศาสตราจารย ดร.สมปอง เตชะโต) (รองศาสตราจารย ดร.ธระ เอกสมทราเมษฐ) ……………………………………กรรมการ (รองศาสตราจารย ดร.สมปอง เตชะโต) ………………………….………...กรรมการ (รองศาสตราจารย ดร.สนธชย จนทรเปรม)

บณฑตวทยาลย มหาวทยาลยสงขลานครนทร อนมตใหนบวทยานพนธฉบบน เปนสวนหนงของการศกษา ตามหลกสตรปรญญาปรชญาดษฎบณฑต สาขาวชาพชศาสตร

…………………………….…………. (ศาสตราจารย ดร.อมรรตน พงศดารา) คณบดบณฑตวทยาลย

(2)

ชอวทยานพนธ ผลของโคลชซนและออรซาลนตอการเปลยนแปลงชดโครโมโซม ในตนออนชดท 2 ของปาลมน ามน

ผเขยน นางไซนยะ สะมาลา สาขาวชา พชศาสตร ปการศกษา 2554

บทคดยอ

ศกษาผลของโคลชซน และออรซาลน โดยวธการใหสาร ระดบความเขมขน และระยะเวลา

การใหสารทแตกตางกน ตอการเพมชดโครโมโซมปาลมน ามน โดยใชตนออนชดทสอง (secondary somatic embryo: SSE) จมแชหรอเททบดวยสารดงกลาว ทความเขมขน และระยะเวลาตางๆ จากนนน าไปเพาะเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทไมเตมสารควบคมการเจรญเตบโตเปนเวลา 1 เดอน พบวาเปอรเซนตการรอดชวตของ SSE ลดลงตามความเขมขนของโคลชซนหรอออรซาลนทเพมขน โดยการจมแช SSE ในสารละลายโคลชซนเขมขน 0.20 เปอรเซนต เปนเวลา 24 ชวโมง ใหเปอรเซนตรอดชวตประมาณ 50 เปอรเซนต และใหตนเททระพลอยด สวนการจมแช SSE ในสารละลายออรซาลนทกความเขมขนตนกลาชะงกการเจรญเตบโต ส าหรบวธการเททบดวยโคลชซน หรอออรซาลน พบวา SSE ไมพฒนาเปนตนกลาทสมบรณ จากการตรวจสอบลกษณะทางสณฐานวทยาของตนเททระพลอยด พบวามการเจรญเตบโตชา ใบหนา สเขยวเขม ใบใหญขน แตความยาวใบลดลง และใหรากขนาดใหญ แตกตางทางสถตอยางมนยส าคญยงกบชดควบคม สวนลกษณะทางสรรวทยาของตนเททระพลอยด มความสมพนธกบเซลลคม โดยมขนาดของเซลลคมใหญ ความหนาแนนของเซลลคมนอย จ านวนเมดคลอโรพลาสตตอเซลลคมมาก ขนาดเมดคลอโรพลาสตเลก และปรมาณคลอโรฟลลรวมมากกวาชดควบคม และจากการตรวจสอบลกษณะทางเซลลวทยา โดยศกษาจ านวนโครโมโซมจากปลายราก พบวาตนทเจรญมาจากกลม SSE ทแชสารละลายโคลชซน ความเขมขน 0.20 เปอรเซนต เปนเวลา 24 ชวโมง และ 0.10 เปอรเซนต เปนเวลา 12 ชวโมง มจ านวนโครโมโซม 2n=4x=64 สวนชดควบคม มจ านวนโครโมโซม 2n=2x=32 การยนยนระดบพลอยดโดยการศกษาระดบพลอยดของปาลมน ามนดวยเครองโฟลไซโทรมเตอร พบวาการแช SSE ในสารละลายโคลชซนความเขมขน 0.20 เปอรเซนต เปนเวลา 24 ชวโมง ชกน าใหเกดตนเททระพลอยดไดดทสด คดเปน 16.67 เปอรเซนต และใหปรมาณดเอนเอมากกวาชดควบคม 2 เทา คอ 7.45 พโคกรม

(3)

Thesis Title Effect of Colchicine and Oryzalin Treatments on Chromosome Duplication in Secondary Somatic Embryos of Oil Palm

Author Mrs. Sainiya Samala Major Program Plant Science Academic Year 2011

ABSTRACT

This study aimed to observe the effects of different application methods of colchicine or oryzalin at different concentrations and durations of treatment on chromosome doubling in oil palm which were carried out using secondary somatic embryos (SSEs). SSEs which were immersed or overlaid in various concentrations and exposure times of treatments were transferred to culture on MS medium without plant growth regulator for 1 month. The results revealed that survival percentage of SSEs decreased with the increase in either concentration or period of treatment with colchicine or oryzalin. The immersion in colchicine at 0.20% for 24 hr resulted in decrement of survival percentage of SSEs at nearly 50% and defined as tetraploid plant at 16.67%. Growth rate of SSEs treated with all concentrations of oryzalin was inhibited whereas overlay treatment of SSEs with colchicine or oryzalin prevented the development of the embryos into complete plantlets. Morphological observations demonstrated that tetraploid plants showed slow growth of shoots. The leaves were thick, dark green color and significantly increased in leaf width. Root diameter of those plants was also increased. Anatomical and physiological characteristics of tetraploid plants showed to be closely related to guard cell size and density. The size of guard cells was bigger than that of control while their density was far lower. As for the percentage of chloroplasts per guard cell, tetraploid plants had a higher number than that of controlled plants. However, the size of chloroplasts was smaller than that of controlled plants. As for the chlorophyll content, the total chlorophyll content in tetraploid plants increased. Cytological observation of root tip revealed that the chromosome number of tetraploid plants obtained from colchicine treatment at concentration of 0.20% for 24 hr and 0.10% for 12 hr was 2n=4x=64 while controlled plants was 2n=2x=32. Flow cytometry analysis also showed that DNA content of tetraploid plants was 7.45 pg which is two times higher than that of controlled plants.

(4)

สารบญ

หนา สารบญ (6) รายการตาราง (7) รายการภาพประกอบ (10) สญลกษณค ายอและตวยอ (17) บทท 1 บทน า 1 บทน าตนเรอง 1 ตรวจเอกสาร 3 วตถประสงค 22 2 วสด อปกรณ และวธการ 23 วสด 23 อปกรณ 25 วธการ 27 3 ผล 36 4 วจารณ 92 5 สรป 102 เอกสารอางอง 103 ภาคผนวก 117 ประวตผเขยน 120

(6)

รายการตาราง ตารางท หนา

1 ผลของความเขมขน (ปจจย A) และระยะเวลาการทรตสารโคลชซน (ปจจย B) ตอเปอรเซนตการรอดชวตของ SSE หลงจากยายเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโตเปนเวลา 30 วน (n=30)

39

2 ผลของความเขมขน (ปจจย A) และระยะเวลาการทรตสารออรซาลน (ปจจย B) ตอเปอรเซนตการรอดชวตของ SSE หลงจากยายเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโตเปนเวลา 30 วน (n=30)

41

3 ผลของความเขมขน (ปจจย A) และระยะเวลาการเททบดวยอาหารเหลวทเตมโคลชซน (ปจจย B) ตอเปอรเซนตการรอดชวตของ SSE หลงจากยายเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโตเปนเวลา 30 วน (n=30)

42

4 ผลของความเขมขน (ปจจย A) และระยะเวลาการเททบดวยอาหารเหลวทเตมออรซาลน (ปจจย B) ตอเปอรเซนตการรอดชวตของ SSE หลงจากยายเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโตเปนเวลา 30 วน (n=30)

44

5 จ านวนยอด ใบ ราก และโซมาตกเอมบรโอระยะสกแกทพฒนาจาก SSE ทรอดชวตจากการจมแชโคลชซนทความเขมขน และเวลาตางๆ แลวยายไปเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโตเปนเวลา 30 วน

46

6 แสดงจ านวนยอด ใบ ราก และโซมาตกเอมบรโอระยะสกแกของชนสวน SSE ท รอดชวต จากการจมแชออรซาลนทความเขมขน และระยะเวลาตางๆ หลงจากยายไปเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโตเปนเวลา 30 วน

51

7 จ านวนยอด ใบ ราก และโซมาตกเอมบรโอระยะสกแก ทพฒนาจาก SSE ท รอดชวตบนอาหารทเททบดวยโคลชซน ทความเขมขน และระยะเวลาตางๆ แลวยายไปเลยงบนอาหารแขงทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโตเปน เวลา 30 วน

56

(7)

รายการตาราง (ตอ) ตารางท หนา

8 จ านวนยอด ใบ ราก และโซมาตกเอมบรโอระยะสกแก ทพฒนาจาก SSE ท รอดชวต จากการเททบดวยอาหารเหลวเตมออรซาลน ทความเขมขน และระยะเวลาตางๆ แลวยายไปเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโตเปนเวลา 30 วน

60

9 ความกวาง ความยาวของใบ ของตนควบคม และตนทผานการแชโคลชซน ความเขมขน 0.10 เปอรเซนต เปนเวลา 12 ชวโมง และ 0.20 เปอรเซนต เปนเวลา 24 ชวโมง หลงจากยายเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโตเปนเวลา 12 เดอน

64

10 ความกวาง ความยาวของราก ของตนควบคม เปรยบเทยบกบตนจากสงทดลองทผานการแชโคลชซน 0.10 เปอรเซนต เปนเวลา 12 ชวโมง และ 0.20 เปอรเซนต เปนเวลา 24 ชวโมง แลวยายไปเพาะเลยงบนอาหารแขงสตร ARDA เตม NAA 0.5 มลลกรมตอลตร และกรดแอสคอรบค 200 มลลกรมตอลตร เพอชกน ารากเปนเวลา 1 เดอน

68

11 เปอรเซนตการเกดชอดอกในหลอดทดลอง ของตนกลาปาลมน ามน ทผานการจมแชสารโคลชซนความเขมขน และระยะเวลาตางๆ หลงจากยายเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโต เปนเวลา 12 เดอน

71

12 ความกวาง ความยาว และความหนาแนนของเซลลคม ของตนควบคม และตนกลาทผานการแชโคลชซน ความเขมขน 0.10 เปอรเซนต เปนเวลา 12 ชวโมง และ 0.20 เปอรเซนต เปนเวลา 24 ชวโมง หลงจากยายเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโต เปนเวลา 12 เดอน

77

13 ขนาด และจ านวนคลอโรพลาสตตอเซลลคม ของตนควบคม และตนกลาทผานการแชโคลชซน ความเขมขน 0.20 เปอรเซนต เปนเวลา 24 ชวโมง หลงจากยายเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโต เปนเวลา 12 เดอน

81

(8)

รายการตาราง (ตอ) ตารางท หนา

14 ปรมาณคลอโรฟลล เอ บ และคลอโรฟลลรวม จากใบของตนกลาชดควบคม และตนกลาทคาดวาเปนตนเตตราพลอยด ทผานการแชโคลชซน ความเขมขน 0.10 เปอรเซนต เปนเวลา 12 ชวโมง และ 0.20 เปอรเซนต เปนเวลา 24 ชวโมง หลงจากยายเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโต เปนเวลา 12 เดอน

85

15 ผลของสารละลายโคลชซน ทระดบความเขมขน และระยะเวลาตางๆ ทมตอเปอรเซนตการเกดตนเตตราพลอยด จากการศกษาระดบพลอยดดวยโฟลไซโทเมทร (n=30)

89

16 ปรมาณดเอนเอ ของตนกลาชดควบคม และตนเตตราพลอยด ทผานการแชโคลชซนความเขมขน 0.20 เปอรเซนต เปนเวลา 24 ชวโมง กบปรมาณดเอนเอมาตรฐานของขาวญปน หลงจากยายเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโต เปนเวลา 12 เดอน

91

(9)

รายการภาพประกอบ ภาพท หนา

1 EC ทชกน าจากใบออนทยงไมคลของปาลมน ามนตนโตทใหผลผลตด อาย 10 ป ซงวางเลยงบนอาหารแขงสตร MS เตม dicamba เขมขน 0.3 มลลกรมตอลตร กรดแอสคอรบคเขมขน 200 มลลกรมตอลตร น าตาลซโครสเขมขน 0.17 โมลาร หลงจากวางเลยงเปนเวลา 1 เดอน (บาร 5 มลลเมตร)

28

2 กลม SSE ทชกน าจาก HE เพยง 1 ชด ซงประกอบดวย SSE ในระยะทอรปโด

(บาร 7 มลลเมตร)

30

3 วธการทรตกลม SSE ดวยสารละลายโคลชซน หรอออรซาลน 30 4 ดอกตดบนแทน silver paint และผานการเคลอบทองดวยเครอง sputter coater

(บาร 0.5 เซนตเมตร) 32

5 ลกษณะการพฒนาของ SE (ศรช) บนอาหารแขงสตร MS รวมกบกรดแอสคอรบคเขมขน 200 มลลกรมตอลตร เตม dicamba เขมขน 0.3 มลลกรมตอลตร ยายเลยงทกเดอน เปนเวลา 3 เดอน (บาร 5 มลลเมตร)

36

6 ลกษณะของ HE (ศรช) จากการเพาะเลยง EC บนอาหารแขงสตร MS รวมกบกรดแอสคอรบคเขมขน 200 มลลกรมตอลตร เตม dicamba เขมขน 0.1 มลลกรมตอลตร เปนเวลา 1 เดอน (บาร 5 มลลเมตร)

37

7 ลกษณะของ SSE หลงจากเพาะเลยง HE บนอาหารแขงสตร MS เตมกรดแอสคอรบคเขมขน 200 มลลกรมตอลตร รวมกบน าตาลซอรบทอล เขมขน 0.2โมลาร เปนเวลา 3 เดอน (บาร 5 มลลเมตร)

38

8 เปอรเซนตการรอดชวต 50 เปอรเซนต (LD50) ของ SSE ทจมแชดวยโคลชซน ความเขมขน และเวลาตางๆ หลงจากยายเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบ โตเปนเวลา 30 วน

40

9 เปอรเซนตการรอดชวต 50 เปอรเซนต (LD50) ของ SSE ทจมแชดวยออรซา- ลนความเขมขน และเวลาตาง ๆ หลงจากยายเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโตเปนเวลา 30 วน

41

(10)

รายการภาพประกอบ (ตอ) ภาพท หนา

10 เปอรเซนตการรอดชวต 50 เปอรเซนต (LD50) ของ SSE ทเททบดวยอาหาร เหลวเตมโคลชซนความเขมขน และเวลาตาง ๆ แลวยายไปเพาะเลยงบน อาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโตเปนเวลา 30 วน

43

11 เปอรเซนตการรอดชวต 50 เปอรเซนต (LD50) ของ SSE ทเททบดวยอาหารเหลวเตมออรซาลนความเขมขนตางๆ แลวยายเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโตเปนเวลา 30 วน

44

12 พฒนาการของยอด และ MSE จาก SSE ทจมแชดวยโคลชซนความเขมขนตางๆ เฉลยจาก 3ระยะเวลา (12 24 และ 48 ชวโมง)..แลวยายเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโตเปนเวลา 30 วน

45

13 พฒนาการของ SSE ทรอดชวตจากการจมแชดวยสารละลายโคลชซนเปนเวลา 12 ชวโมง แลวยายไปเพาะเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโตเปนเวลา 30 วน (บาร 4 มลลเมตร)

47

14 พฒนาการ SSE ทรอดชวตจากการจมแชดวยสารละลายโคลชซนเปนเวลา 24 ชวโมง แลวยายไปเพาะเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโตเปนเวลา 30 วน (บาร 4 มลลเมตร)

48

15 พฒนาการ SSE ทรอดชวตจากการจมแชดวยสารละลายโคลชซนเปนเวลา 48 ชวโมง แลวยายไปเพาะเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโตเปนเวลา 30 วน (บาร 4 มลลเมตร)

49

16 พฒนาการของยอด และ MSE จาก SSE ทจมแชดวยออรซาลนความเขมขนตางๆ เฉลยจาก 3 ระยะเวลา (12 24 และ 48 ชวโมง)..แลวยายเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโตเปนเวลา 30 วน

50

17 พฒนาการของ SSE ทรอดชวตจากการจมแชดวยออรซาลนเปนเวลา 12 ชวโมง แลวยายไปเพาะเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญ เตบโต เปนเวลา 30 วน (บาร 4 มลลเมตร)

52

18 พฒนาการของ SSE ทรอดชวตจากการจมแชดวยออรซาลนเปนเวลา 24 ชวโมง แลวยายไปเพาะเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญ เตบโต เปนเวลา 30 วน (บาร 4 มลลเมตร)

53

(11)

รายการภาพประกอบ (ตอ) ภาพท หนา

19 พฒนาการของ SSE ทรอดชวตจากการจมแชดวยออรซาลน เปนเวลา 48 ชวโมง แลวยายไปเพาะเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโต เปนเวลา 30 วน (บาร 4 มลลเมตร)

54

20 พฒนาการของยอด จาก SSE ทเททบดวยสารละลายโคลชซนความเขมขนตาง เฉลยจาก 2 ระยะเวลา (1 และ 2 สปดาห).แลวยายเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโตเปนเวลา 30 วน

55

21 พฒนาการของ SSE ทรอดชวตจากการเททบดวยอาหารเหลว เตมโคลชซนเปนเวลา 1 สปดาห แลวยายไปเพาะเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโต เปนเวลา 30 วน (บาร 4 มลลเมตร)

57

22 พฒนาการของ SSE ทรอดชวตจากการเททบดวยอาหารเหลว เตมโคลชซนเปนเวลา 2 สปดาห แลวยายไปเพาะเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโต เปนเวลา 30 วน (บาร 4 มลลเมตร)

58

23 พฒนาการของยอด จาก SSE ทเททบ ดวยสารละลายออรซาลน ความเขมขน ตางๆ เฉลยจาก 2 ระยะเวลา (1 และ 2 สปดาห) แลวยายเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโตเปนเวลา 30 วน

59

24 พฒนาการของ SSE ทรอดชวตจากการเททบดวยอาหารเหลวเตมออรซาลนเปนเวลา 1 สปดาห แลวยายไปเพาะเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโต เปนเวลา 30 วน (บาร 4 มลลเมตร)

61

25 พฒนาการของ SSE ทรอดชวตจากการเททบดวยอาหารเหลวเตมออรซาลนเปนเวลา 2 สปดาห แลวยายไปเพาะเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโต เปนเวลา 30 วน (บาร 4 มลลเมตร)

62

26 การเจรญเตบโตของตนกลาปาลมน ามนตนควบคม (ซาย) และตนทผานการแชโคลชซนความเขมขน 0.10 เปอรเซนต เปนเวลา 12 ชวโมง (กลาง) และความเขมขน 0.20 เปอรเซนต เปนเวลา 24 ชวโมง (ขวา) หลงจากยายไปเพาะเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโต เปนเวลา 12 เดอน (บาร 0.5 เซนตเมตร)

64

(12)

รายการภาพประกอบ (ตอ) ภาพท หนา

27 ความหนาของใบจากตนกลาปาลมน ามนชดควบคม (ก ซาย) และกลอง SEM (ข ซาย) และตนกลาทไดรบโคลชซนเขมขน 0.20 เปอรเซนต เปนเวลา 24 ชวโมง (ก ขวา และ ข ขวา) หลงจากยายเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโต เปนเวลา 12 เดอน (บาร 0.5 เซนตเมตร)

65

28 ใบของตนกลาปาลมน ามน ทไดรบโคลชซน ความเขมขน 0.20 เปอรเซนต เปนเวลา 24 ชวโมง มขนสน าตาล (ศรช ก และ ข) ใบสน และมสเขยวเขม (ค ขวา) เมอเปรยบเทยบกบใบของตนควบคม (ค ซาย) ตนดงกลาวเพาะเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโต เปนเวลา 12 เดอน (บาร 0.5 เซนตเมตร)

65

29 ลกษณะของ SSE ทมลกษณะคลาย ใบ และยอด แตไมสามารถพฒนาเปน ตนกลา หลงจากไดรบสารออรซาลนความเขมขน 0.004 เปอรเซนต เปนเวลา 12 ชวโมง แลวยายไปเพาะเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสาร ควบคมการเจรญเตบโต เปนเวลา 12 เดอน (บาร 0.5 เซนตเมตร)

66

30 ตนกลาทพฒนาจาก SSE ซงผานการเททบดวยโคลชซน ความเขมขน 0.05 เปอรเซนต เปนระยะเวลาตางๆ มการพฒนาคลายดอก (ศรช) หลงจากยายเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโต เปนเวลา 6 เดอน (บาร 0.5 เซนตเมตร)

67

31 ตนกลาทพฒนาจาก SSE ซง ผานการเททบดวยออรซาลน ความเขมขน 0.001 เปอรเซนต เปนระยะเวลาตางๆ

67

32 รากของตนกลาปาลมน ามน หลงจากยายเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศ จากสารควบคมการเจรญเตบโต เปนเวลา 12 เดอน และยายเลยงบนอาหารแขงสตร ARDA ตออก เปนเวลา 1 เดอน (บาร 0.2 เซนตเมตร)

69

33 ลกษณะของชอดอกเพศเมย (ก) และชอดอกเพศผ (ข) จากตนกลาปาลมน ามน ทไดรบโคลชซน ความเขมขน 0.10 เปอรเซนต เปนเวลา 12 ชวโมง แลวยาย ไปเพาะเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโต เปนเวลา 12 เดอน (บาร 0.5 เซนตเมตร)

72

(13)

รายการภาพประกอบ (ตอ) ภาพท หนา

34 ลกษณะชอดอกเพศเมย ของตนกลาปาลมน ามน ทไดรบโคลชซนความเขมขน 0.15 เปอรเซนต เปนเวลา 48 ชวโมง แลวยายไปเพาะเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโต เปนเวลา 12 เดอน (บาร 0.3 เซนตเมตร)

72

35 ลกษณะชอดอกเพศเมย (ก) และชอดอกเพศผ (ข) ของตนกลาปาลมน ามน ทไดรบโคลชซนความเขมขน 0.20 เปอรเซนต เปนเวลา 24 ชวโมง แลวยายไปเพาะเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโต เปนเวลา 12 เดอน (บาร 0.5 เซนตเมตร)

72

36 ลกษณะของชอดอกเพศเมย และเพศผของตนกลาปาลมน ามน (SEM) จากสง ทดลอง ทไดรบโคลชซนความเขมขน และระยะเวลาตางๆ หลงจากยายไป เพาะเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโต เปน เวลา 12 เดอน

73

37 ผลปาลมจากตนปาลมน ามนทออกดอกในหลอดทดลอง ทไดรบโคลชซน ความเขมขน 0.20 เปอรเซนต เปนเวลา 24 ชวโมง บรเวณปลายยอด หลงจากยายเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโต เปนเวลา 12 เดอน และยายเลยงบนอาหารแขงสตร ARDA เตม NAA 0.5 มลลกรมตอลตร และกรดแอสคอรบค 200 มลลกรมตอลตร ตออกเปนเวลา 1 เดอน (บาร 0.5 เซนตเมตร)

74

38 ลกษณะผลปาลมจากตนกลาปาลมน ามน ทไดรบโคลชซน ความเขมขน 0.20 เปอรเซนต เปนเวลา 24 ชวโมง โดยมผลยาวร (ก และ ข) และผลลบ (ค)

75

39 ผลปาลมทพฒนาจากตนกลาปาลมน ามน ทไดรบโคลชซน ความเขมขน 0.20 เปอรเซนต เปนเวลา 24 ชวโมง หลงจากยายเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโตเปนเวลา 12 เดอน และยายเลยงบนอาหารแขงสตร ARDA เตม NAA 0.5 มลลกรมตอลตร และกรดแอสคอรบค 200 มลลกรมตอลตร ตออกเปนเวลา 1 เดอน

75

40 เนอปาลม (mesocarp) ของผลทพฒนาจากตนกลาปาลมน ามน ทไดรบโคลชซน ความเขมขน 0.20 เปอรเซนต เปนเวลา 24 ชวโมง

76

(14)

รายการภาพประกอบ (ตอ) ภาพท หนา

41 ขนาดของเซลลคม (ก) ชดควบคม (ข) ชดทไดรบโคลชซน 0.10 เปอรเซนต เปนเวลา 12 ชวโมง (ค) ชดทไดรบโคลชซน 0.20 เปอรเซนต เปนเวลา 24 ชวโมง หลงจากยายเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโต เปนเวลา 12 เดอน

78

42 ความหนาแนนของเซลลคม (ก) ชดควบคม (ข) ชดทไดรบโคลชซน 0.10 เปอรเซนต เปนเวลา 12 ชวโมง (ค) ชดทไดรบโคลชซน 0.20 เปอรเซนต เปนเวลา 24 ชวโมง หลงจากยายเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโต เปนเวลา 12 เดอน

79

43 ลกษณะความผดปกตแบบตางๆของเซลลคม ของตนกลาปาลมน ามนทไดรบโคลชซน ความเขมขน 0.20 เปอรเซนต เปนเวลา 24 ชวโมง

80

44 คลอโรพลาสตในเซลลคมของตนกลาปาลมน ามน หลงจากยายเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโต เปนเวลา 12 เดอน

82

45 คลอโรพลาสต และลกษณะเซลลคมของตนกลาปาลมน ามน หลงจากยายเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบ โต เปนเวลา 12 เดอน

83

46 ปรมาณคลอโรฟลลเอ คลอโรฟลลบ และคลอโรฟลลรวมของตนกลาปาลมน ามนชดควบคมทไดรบโคลชซนความเขมขน 0.10 เปอรเซนต เปนเวลา 12 ชวโมง และ 0.20 เปอรเซนต เปนเวลา 24 ชวโมง หลงจากยายเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโต เปนเวลา 12 เดอน

85

47 จ านวนโครโมโซมจากปลายราก ของตนกลาปาลมน ามนหลงจากยายเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโต เปนเวลา 12 เดอน (บาร= 0.2 ไมโครเมตร)

87

48 ฮสโตแกรมแสดงระดบพลอยด ของตนกลาปาลมน ามนชนดตางๆ 90

(15)

รายการภาพประกอบ (ตอ)

ภาพท หนา 49 ฮสโตแกรมแสดงปรมาณดเอนเอของ (ก) ตนขาวญปน ซงเปนดเอนเอ

มาตรฐาน (ข) ตนกลาปาลมน ามนชดควบคม ทเปนดพลอยด (2n=2x) และ (ค) ตนเตตราพลอยด ของชดทไดรบโคลชซน ความเขมขน 0.20 เปอรเซนต เปนเวลา 24 ชวโมง (2n = 4x) หลงจากยายเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโต เปนเวลา 12 เดอน

91

(16)

สญลกษณค ายอและตวยอ ARDA = Agricultural Research Development Agency BA = 6-benzyladenine bp = base pair CRD = completely random design 2,4-D = 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid DMRT = Duncan’s multiple range test DNA = Deoxyribonucleic acid EC = Embryogenic callus HE = Haustorium embryo MS = Murashige and Skoog (medium) NAA = - naphthalene acetic acid pDB = p-Dichlorobenzene pg = picogram PI = Propidium iodide PVP = Polyvinyl pyrolidone SE = Somatic embryo SSE = Secondary somatic embryo SEM = Scanning electron microscope

(17)

1

1

บทท 1

บทน า

บทน าตนเรอง

ปาลมน ามน (Elaeis guineensis Jacq.) เปนพชตระกลปาลมทมถนก าเนดอยในทวปอฟรกา จดเปนพชใบเลยงเดยวและเปนพชยนตน (Konan et al., 2006) เปนพชผสมขาม ทมชอดอกตวผและตวเมยอยบนตนเดยวกน แตชวงเวลาการออกดอกไมพรอมกน ปาลมน ามนเปนพช ดพลอยดมจ านวนโครโมโซม 2n = 2x = 32 (Corley, 2003) ปาลมน ามนทปลกเปนการคาคอชนด เทเนอรา (tenera) ซงเปนลกผสมระหวางชนดดรา (dura) และชนดพสเฟอรา (pisifera) น ามนทสกดจากผลปาลมมาจาก 2 แหลง คอ น ามนจากเปลอกผล เรยกวาน ามนปาลม (palm oil) และน ามนจากเมลดในปาลม เรยกวาน ามนเมลดในปาลม (palm kernel oil) น ามนปาลมมองคประกอบทางเคมทเกยวของกบวตามนทส าคญอย 2 ชนด คอ วตามนอ และสารแคโรทนอยด ซงเปนสารตงตนในการสรางวตามนเอ ปาลมน ามนเปนพชน ามนทใหน ามนปรมาณสงมากเมอเปรยบเทยบกบพชน ามนชนดอน ๆ (640-800 กโลกรมน ามนตอพนทปลก 1 ไร) (Konan et al., 2006) การผลตน ามนจากปาลมน ามน มตนทนการผลตต ากวาน ามนพชชนดอนๆ และน ามนปาลมสามารถน าไปใชประโยชนไดอยางหลากหลายทงในดานอปโภคและบรโภค เชน ท าเปนน ามนปรงอาหาร น ามนทอด ผลตนมขน ไอศกรม เนยเทยม เนยขาว ไขมนท าขนมปง สบ เทยนไข ผงซกฟอก ยาส-ฟน ใชในอตสาหกรรมโอลโอเคมคลอยางกวางขวาง และทส าคญทสดในยคน ามนปโตรเลยมแพง ใชเปนวตถดบในการผลตเมทลเอสเตอร น าไปใชเปนเชอเพลงทดแทนน ามนดเซล หรอทนยมเรยกวา ไบโอดเซล

ปาลมน ามนนบวาเปนพชน ามนทยงคงมแนวโนมความตองการเพมขนอยางตอเนอง อยางไรกตาม 60% ของพนทเพาะปลก ยงมปญหาเรองตนทนการผลตสง และใหผลผลตต า เนองจากสายพนธปาลมทใชยงไมดพอและไมเหมาะสมกบพนท พนธปาลมน ามนทเกษตรกรปลกในปจจบนเปนพนธลกผสม ซงเมอน าเมลดพนธไปขยายตอจะเกดความแปรปรวนทางพนธกรรม สงผลใหผลผลตตอตนไมสม าเสมอ (ธระ และคณะ, 2543) ท าใหเกษตรกรไมสามารถเกบเมลดใตตนไปปลกตอได จากปญหาการขาดแคลนปาลมน ามนพนธดทใหผลผลตตอไรสงของประเทศไทย จงไดมการพฒนาหาแนวทางเพอแกปญหาดงกลาวโดยการศกษาครงนจะไดปรบปรงพนธปาลมน ามนดวยเทคนคการเพาะเลยงเนอเยอรวมกบสารเคมกอกลายพนธ คอ โคลชซน

2

(colchicine) และออรซาลน (oryzalin) เพอชกน าใหเกดพอลพลอยดโดยใชชนสวนตนออนชดทสอง (secondary somatic embryo: SSE) เนองจากสามารถชกน าเปนตนพชใหมไดในปรมาณมาก (Te-chato and Hilae, 2007) โดยคาดวาผลทไดจากการศกษาครงน จะเปนแนวทางหนงในการขยายพนธและปรบปรงพนธปาลมน ามนตอไป

3

การตรวจเอกสาร 1. ความรทวไปเกยวกบปาลมน ามน ปาลมน ามนทมความส าคญทางเศรษฐกจในปจจบนแบงไดเปน 3 ชนด ตามความหนากะลาของผลปาลม (นพพร และคณะ, 2546) ดงน คอ 1. ชนดดรา เปนชนดทมกะลาหนาประมาณ 2 - 8 มลลเมตร มชนเปลอกนอก (mesocarp) ทใหน ามน ประมาณ 35 - 60% ของน าหนกผล มจโนไทปทควบคมความหนาของกะลาเปน homozygous dominance (ShSh) ปาลมชนดดราทมกะลาหนามาก ๆ คอ มาโครคายา (macrocarya) กะลาหนาประมาณ 6 - 8 มลลเมตร ดราชนดนพบมากแถบตะวนออกไกล เชน เดลดรา (deli dura) ซงเปนชนดทใหผลผลตคอนขางสง ปจจบนชนดดรา มกใชเปนตนแมส าหรบปรบปรงพนธเพอผลตลกผสมเปนการคา 2. ชนดพสเฟอรา เปนชนดทมกะลาบางมาก หรอบางครงไมมกะลา มจโนไทปทควบคมความหนาของกะลาเปน homozygous recessive (shsh) เมลดในมขนาดเลก ผลเลก ชอดอกตวเมยมกเปนหมน ผลผลตทะลายตอตนต า ไมเหมาะทจะปลกเปนการคา นยมใชปาลมน ามนชนดนเปนตนพอส าหรบผลตพนธลกผสม 3. ชนดเทเนอรา เปนลกผสมระหวางชนดแมดรา และชนดพอพสเฟอรา เปนพนธทมกะลาบางประมาณ 0.5 - 4 มลลเมตร มจโนไทปทควบคมความหนาของกะลาเปน heterozygous (Shsh) มปรมาณของเสนใยหรอ mesocarp 60-90% ของน าหนกผล ผลผลตทะลายสง นยมปลกเปนการคา 2. การเพาะเลยงเนอเยอ และขยายพนธปาลมน ามน ปาลมน ามนสามารถขยายพนธไดวธเดยว คอการเพาะเมลด เนองจากไมสามารถขยายพนธโดยวธไมอาศยเพศทวไป เชน การปกช า ตอนกง และการตดตาได อยางไรกตามในปจจบนมการน าเทคโนโลยชวภาพการเพาะเลยงเนอเยอมาชวยขยายพนธ ท าใหสามารถขยายพนธปาลมน ามนโดยไมอาศยเพศไดผลส าเรจ และไดใชวธนในเชงการคา เพราะใหผลผลตสม าเสมอตรงตามพนธ (นภาพร, 2548)

4

2.1 การเพาะเลยงเนอเยอปาลมน ามน การเพาะเลยงเนอเยอพช คอการน าเอาเซลล เนอเยอ หรออวยวะบางสวนของพช เชน ยอด ล าตน ใบ ราก สวนตางๆ ของดอกหรอผล มาเพาะเลยงบนอาหารสงเคราะห ในสภาพปลอดเชอ การขยายพนธพชดวยวธน สามารถเพมปรมาณตนพชไดเปนจ านวนมากในคราวเดยวกน และใชระยะเวลาสน ปจจบนสามารถเพาะเลยงสวนของคพภะ และใบออน ของปาลมน ามน ซงสามารถสรางยอดใหมไดจ านวนมาก และยงสามารถใชแคลลสเพอการปรบปรงพนธได การขยายพนธปาลมน ามนโดยเทคนคการเพาะเลยงเนอเยอ แบงออกเปน 4 ขนตอนใหญๆ คอ 1) การชกน าแคลลสเรมแรก (primary callus) จากชนสวนพช 2) การชกน าใหเกดแคลลสเจรญเรว (fast growing callus) จากแคลลสเรมแรก 3) การชกน าใหเกดเอมบรโอเจเนซส (embryogenesis) และ 4) การท าใหไดตนกลาทสมบรณ (Lioret, 1981) 2.1.1 การเพาะเลยงคพภะ

การเพาะเลยงคพภะชวยใหเมลดงอกไดเรวขน และเพมปรมาณไดจ านวนมากซงผานกระบวนการชกน าแคลลสโดยใชสารควบคมการเจรญเตบโตพวกออกซน และชกน าเปนพชตนใหมผานกระบวนการโซมาตกเอมบรโอเจเนซส มรายงานผลส าเรจจากการขยายพนธปาลมน ามน ดวยการเพาะเลยงคพภะ เชน Kanchanapoom และ Damyaos (1999) ตดแยกคพภะปาลมน ามนมาเพาะเลยงบนอาหารสตร Y3 (Eeuwens) เตม 2,4-D (2,4-dichorophenoxy-acetic acid) เขมขน 2 มลลกรมตอลตร พบวาชนสวนดงกลาวสามารถชกน าแคลลสไดภายใน 8 สปดาหหลงจากเพาะเลยง และชกน าเอมบรออยด (embryoid) บนอาหารสตร MS เตม 2,4-D เขมขน 0.5 มลลกรมตอลตร แตไมพบการเจรญเปนตนออน อายของคพภะทแตกตางกน สงผลตอเปอรเซนตการสรางแคลลสทแตกตางกนดวย คพภะปาลมน ามนทอาย 193 วนหลงการผสม ใหการสรางแคลลสสงสด 93 เปอรเซนต (Teixeira et al., 1993) Teixeira และคณะ (1995) ท าการทดลองโดยใชเอมบรโอทยงออน และสกแกของปาลมน ามนพนธเทเนอรามาชกน าใหเกดแคลลส พบวาการใชเอมบรโอทยงออนสามารถชกน า primary globular callus (PGC) ไดในอาหารสตร Y3 เตม 2,4-D เขมขน 500 ไมโครโมลาร รวมกบผงถาน 0.3 เปอรเซนต สวนการใชเอมบรโอทสกแกสามารถชกน า friable embryogenic tissue (FET) ไดในอาหารสตร MS เตม 2,4-D เขมขน 475 ไมโครโมลาร หรอ picloram เขมขน 250 ไมโครโมลาร รวมกบผงถาน 0.3 เปอรเซนต

5

Te-chato (1998) ผลตตนกลาปาลมน ามนจ านวนมากจากการเพาะเลยงคพภะปาลมน ามนจากตนแมเทเนอรา โดยผานกระบวนการเอมบรโอเจเนซส บนอาหารแขงสตร MS เตม 2,4-D เขมขน 2.5 มลลกรมตอลตร และน าตาล 3 เปอรเซนต จากนนยายเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทเตมเคซนไฮโดรไลเสท เขมขน 1,000 มลลกรมตอลตร กรดแอสคอรบคเขมขน 200 มลลกรมตอลตร และ 2,4-D หรอ dicamba เขมขน 0.1 - 1.0 มลลกรมตอลตร ภายใตความเขมแสง 2,500 ลกซ 10 ชวโมงตอวน เพาะเลยงเปนเวลา 3-6 เดอน เมอแคลลสพฒนาเปนโซ-มาตกเอมบรโอ หรอตนออนชดแรก (somatic embryo : SE) ยายลงอาหารเหลวสตร MS เตม NAA เขมขน 0.06 มลลกรมตอลตร และ BA เขมขน 0.03 มลลกรมตอลตร จนกระทงพฒนาเปนเอมบรโอระยะสรางจาว (haustorium embryo : HE) จงยายลงอาหารสองชน ชนลางคออาหารสตร MS เตมผงถาน 0.25 เปอรเซนต และชนบนคอ อาหารเหลวสตร ½ MS เตม NAA เขมขน 0.06 มลลกรมตอลตร และ BA เขมขน 0.03 มลลกรมตอลตร เมอไดตนทสมบรณ น าไปจมลงใน NAA เขมขน 4,500 มลลกรมตอลตร เปนเวลา 15 นาท พบวาตนทไดไมมความผดปกตของลกษณะทางสณฐานวทยา เมอตรวจสอบจ านวนโครโมโซมพบวาม 2n=2x=32 เทากบตนแมเดม Rajesh และคณะ (2003) ใช polyamine ในการสงเสรมพฒนาการของเอมบรโอปาลมน ามน พบวา อาหารสตร MS เตม 2,4-D เขมขน 0.01 มลลกรมตอลตร รวมกบ putrescine เขมขน 1 มลลโมลาร สามารถชกน าเอมบรโอเจนคแคลลส (embryogenic callus : EC) 0.70 เปอรเซนต โซมาตกเอมบรโอ 5.60 เปอรเซนต โซมาตกเอมบรโอชดทสอง หรอตนออนชดทสอง (secondary somatic embryo : SSE) 2.97 เปอรเซนต การงอก 5.50 เปอรเซนต การสรางยอด 1.27 เปอรเซนต และการสรางรากสงสดโดยเฉลย 0.37 เปอรเซนต

2.1.2 การเพาะเลยงใบออน

การขยายพนธปาลมน ามนจากใบออนโดย สมปอง และคณะ (2547) รายงานการชกน าแคลลส โดยเพาะเลยงใบออนปาลมน ามนบนอาหารแขงสตร MS เตม NAA หรอ dicamba หรอ 2,4-D ความเขมขนตาง ๆ คอ 1 2.5 5 10 20 30 40 และ 50 มลลกรมตอลตร หลงจากเพาะเลยงเปนเวลา 3 เดอน พบวา dicamba เขมขน 1 มลลกรมตอลตร ใหการสรางแคลลสสงสด 15 เปอรเซนต ในขณะทการเตม 2,4-D เขมขน 1 มลลกรมตอลตร ใหการสรางแคลลส 2.78 เปอรเซนต และ NAA มประสทธภาพในการชกน าแคลลสต าสดเพยง 1.67 เปอรเซนต เทานน และจากการศกษาผลของความเขมขนของ dicamba ตอการชกน าเอมบรโอเจนคแคลลส โดยยายเลยงแคลลสบนอาหารแขงสตร MS เตม dicamba ความเขมขนตาง ๆ คอ 0.1 0.5 และ 1

6

มลลกรมตอลตร รวมกบการเตมหรอไมเตมเคซนไฮโดรไลเสทเขมขน 1,000 มลลกรมตอลตร หลงจากเพาะเลยง 3 เดอน พบวา dicamba เขมขน 0.5 มลลกรมตอลตร รวมกบเคซนไฮโดรไลเสทใหการสรางเอมบรโอเจนคแคลลสสงสด 66.67 เปอรเซนต รองลงมาคอ อาหารเตม dicamba เขมขน 1 มลลกรมตอลตร ใหการสรางเอมบรโอเจนคแคลลส 56.41 เปอรเซนต ตอมาไดศกษาผลของความเขมขนของ dicamba ทความเขมขนต า (0.1 - 1 มลลกรมตอลตร) ในการเพาะเลยงใบออนของปาลมน ามน พบวาสามารถรนระยะเวลาในการเพาะเลยงเหลอเพยง 6 - 9 เดอน โดยการเพาะเลยงใบออนของปาลมน ามนในตนทใหผลผลตทดทมอาย 10 - 20 ป ในสตรอาหาร MS เตม dicamba เขมขน 2.5 มลลกรมตอลตร สามารถชกน าใหเกดเปนแคลลส เมอยายแคลลสดงกลาวมาเพาะเลยงในสตรเดม แตลดความเขมขนของ dicamba ลงเหลอเพยง 1 มลลกรมตอลตร สามารถชกน าใหพฒนาเปนโซมาตกเอมบรโอในระยะสรางจาวไดส าเรจ (อาสลน และสมปอง, 2545)

เพญตมาส และสมปอง (2552) รายงานการชกน าเอมบรโอเจนคแคลลส และโซมาตกเอมบรโอจากแคลลสทชกน าจากใบออนของปาลมน ามนตนโตทใหผลผลตดอาย 10 ป บนอาหารแขงสตร MS เตม dicamba เขมขน 0.3 มลลกรมตอลตร วาสามารถเพมปรมาณเอมบรโอเจนคแคลลส และจ านวนโซมาตกเอมบรโอสงสด 16.88 เอมบรโอตอหลอดทดลอง หลงจากวางเลยงเปนเวลา 1 เดอน แคลลสทเพาะเลยงในอาหารเหลวสตรเดยวกนมลกษณะเกาะกนหลวมๆ สามารถชกน าเอมบรโอเจนคเซลลซสเพนชน โดยใหปรมาตรตะกอนเซลล (packed cell volume : PCV) เปน 2 เทา หลงจากเพาะเลยงเปนเวลา 15 วน ในสวนของสารควบคมการเจรญเตบโต พบวา 2,4-D เขมขน 0.4 มลลกรมตอลตร ในอาหารเหลวสตร MS ใหปรมาตรตะกอนเซลลสงสด 2.25 มลลลตร และมจ านวนโซมาตกเอมบรโอขนาด 2 - 4 มลลเมตร จ านวน 20 เอมบรโอตอฟลาสก สวนการพฒนาของโซมาตกเอมบรโอขนาด 2 - 4 มลลเมตร บนอาหารแขง พบวา อาหารแขงสตร ½ MS เตมน าตาลซอรบทอลเขมขน 0.2 โมลาร สามารถสงเสรมการพฒนาของโซมาตกเอมบรโอระยะสรางจาวสงสด 32 เปอรเซนต 2.2 การขยายพนธปาลมน ามนภายใตสภาวะปลอดเชอ การขยายพนธปาลมน ามนภายใตสภาวะปลอดเชอทสามารถชกน าเปนตนพชใหมปรมาณมาก คอ การขยายพนธพชโดยการใชตนออนชดแรก (SE) และการขยายพนธพชโดยการใชตนออนชดทสอง (SSE)

7

2.2.1 การขยายพนธปาลมน ามนโดยการใชตนออนชดแรก (SE)

การขยายพนธดวย SE เปนการขยายพนธโดยไมอาศยเพศทมความส าคญในพชหลายๆ ชนด โดยเฉพาะอยางยงในพชทขยายพนธดวยวธตามปกตทท าไดยาก (Stasolla and Yeung, 2003) เชน ปาลมน ามน (อาสลน และ สมปอง, 2545) มะพราว (Chan et al., 1998) และอนทผลม (Al-Khayri and Al-Bahrany, 2001) เปนตน ซงระยะของพฒนาการของ SE แบงออกเปน 4 ระยะ คอ ระยะรปกลม ระยะรปหวใจ ระยะทอรปโด และระยะสรางใบเลยง (สมปอง, 2537) อาสลน (2545) รายงานวาการเพาะเลยงใบออนปาลมน ามนจากตนทใหผลผลตแลว 10 ป บนอาหารสตร MS เตมสารควบคมการเจรญเตบโต 3 ชนด คอ NAA dicamba และ 2,4-D ในสภาพมดทอณหภม 26 ± 4 และ 28 ± 0.5 องศาเซลเซยส หลงจากวางเลยง 2-3 เดอน ชนสวนเรมสรางแคลลส โดยแคลลสมลกษณะเปนปมสเหลองออนเกดขนบรเวณรอยตดและผวของชนสวน การเพาะเลยงชนสวนใบบนอาหารสตร MS เตม dicamba เขมขน 1 มลลกรมตอลตร สงเสรมการสรางแคลลสได โดยมการสรางแคลลส 5.55 และ 7.93 เปอรเซนต เมอเพาะเลยงทอณหภม 26 ± 4 และ 28 ± 0.5 องศาเซลเซยส ตามล าดบ ในขณะทการเตม 2,4-D เขมขน 1 มลลกรมตอลตร สราง แคลลสได 2.78 เปอรเซนต เฉพาะท อณหภม 28 ± 0.5 องศาเซลเซยส เทานน ส าหรบการเตม NAA เขมขน 10 มลลกรมตอลตร สรางแคลลสได 1.67 เปอรเซนต ทอณหภม 26 ± 4 องศาเซลเซยส เทานน เมอเปรยบเทยบการสรางแคลลสระหวางตนทมอาย 1 10 และ 20 ป พบวา ตนกลาอาย 1 ป สามารถสรางแคลลสไดเรวกวา (หลงจากเพาะเลยงเปนเวลา 60 วน) โดยสรางแคลลสได 12.5 ± 5.00 เปอรเซนต

Te-chato (2002) ชกน า SE โดยเพาะเลยงแคลลสในอาหารสตร MS เตมน าตาลเขมขน 3 เปอรเซนต กรดแอสคอรบค เขมขน 200 มลลกรมตอลตร และสารควบคมการเจรญเตบโตสองชนด คอ 2,4-D หรอ dicamba ทความเขมขน 0.1-0.5 มลลกรมตอลตร ภายใตการใหแสงความเขม 2,500 ลกซเปนเวลา 14 ชวโมงตอวน พบวาการใช dicamba 0.1 มลลกรมตอลตร สงเสรมแคลลสเรมตนใหพฒนาเปนแคลลสทเจรญเรว 61.11 เปอรเซนต หลงจากวางเลยงเปนเวลา 90 วน ผลดงกลาวท าใหรนระยะเวลาในการชกน าเปนตนไดในเวลา 8-10 เดอน เมอชกน าการงอกของ SE และอนบาลตนกลาลงดนปลกไมพบการผดปกตของตนกลาแตอยางใด น าตาลทเตมลงในอาหารเพาะเลยงเปนแหลงคารบอนทส าคญตอการพฒนา การสก-แก และการงอกของ SE

8

2.2.2 การขยายพนธปาลมน ามนโดยการใชตนออนชดทสอง (SSE)

SSE เปนโซมาตกเอมบรโอใหมทเกดจาก SE เดม สามารถเกดได 2 ทาง คอ เกดจากการแบงตว และพฒนาของเซลลเดยว ๆ คลายกบการพฒนาของคพภะ หรอจากกลมเซลล (Maximova et al., 2002) จดก าเนดของ SSE ปาลมน ามน มาจาก 3 แหลง คอ เซลลบรเวณชนอพเดอรมส พาเรนไคมา และโปรแคมเบยม หรอวาสควลารแคมเบยม (ธนวด, 2551) โดยเซลลบรเวณดงกลาวยอมตดสชดเจน มไซโตพลาสซมเขมขนสง และนวเคลยสขนาดใหญ เซลลบรเวณนมการแบงเซลลอยางรวดเรว พฒนาเปนจดก าเนดยอดและราก เรยกวา SSE ซงสวนใหญพฒนาจากเซลลชนอพเดอรมส มรปรางคลายกระสนทอรปโดเหมอนคพภะทเกดจากการผสมภายในเมลด ในกรณของ SSE ทพฒนาจากโปรแคมเบยม หรอเนอเยอมดทอน า ทออาหาร และชนพาเรนไคมานน เอมบรโอมรปรางกลม มมดทอน าทออาหาร เชอมตอกนเปนวงกลม Hilae และ Te-chato (2005) ศกษาผลของชนดน าตาล และความเขมขนตางๆ เพอชกน าการงอกของ SE พบวา น าตาลบางชนด โดยเฉพาะน าตาลแอลกอฮอลสงเสรมการเกด SSE อาหารสตร MS เตมน าตาลซอรบทอล เขมขน 0.2 โมลาร ชกน าการสราง SSE ได 11.55 เปอรเซนต SSE ทชกน าไดมเปอรเซนตการงอกเปนตนทสมบรณไดสงถง 77.92 เปอรเซนต จากการคนพบดงกลาว SSE จงเปนเครองมอทส าคญตอการปรบปรงพนธปาลมน ามนดวยกระบวนการทางเทคโนโลยชวภาพในอนาคต

จากการศกษาการใช SSE ในการขยายพนธปาลมน ามน พบวา สามารถเพมปรมาณจ านวนพชไดมากกวาการใช SE (Hilae and Te-chato, 2005) ส าหรบพชใบเลยงเดยว และพชใบเลยงคอนๆ เชน มนส าปะหลง (Stamp and Henshaw, 1987) และทานตะวน (Vasic et al., 2001) พบวาการขยายพนธดวยวธดงกลาวสามารถเพมปรมาณพชไดจ านวนมากเชนเดยวกบปาลมน ามน การพฒนาของ SSE จาก SE นนอาศยปจจยทเหมาะสมหลายประการ ทงปจจยทางเคม ชวภาพ และ ทางกายภาพ ปจจยทางดานเคม ไดแก องคประกอบของสตรอาหาร สารควบคมการเจรญเตบโต และสารเสรมอนๆ เชน น าตาลซอรบทอล น ามะพราว ตลอดจน polyamine เปนตน Hilae และ Te-chato (2005) รายงานการใชน าตาลซอรบทอล ความเขมขน 0.2 โมลาร สามารถชกน า SSE ในปาลมน ามนได 22.0 เอมบรโอตอ SE ส าหรบการใชน ามะพราว 10 เปอรเซนตในอาหารสตร MS สามารถชกน าใหเกด SSE ในกลวย (Musa spp. AAB cv. Dwarf Brazilian) ได (Khalil et al., 2002) ส าหรบปจจยทางชวภาพ ไดแก ชนสวนเรมตนทใชในการชกน าการเกด SSE ในพชแตละชนดมความแตกตางกนออกไป เชน กลวย (Musa spp. AAB cv. Dwarf Brazilian) นนพบวา ตาดอกตวผจากกลมตาดอกอาย 1 เดอน ใหการสราง SSE ไดด (Khalil et al.,

9

2002) สวนแอปเปล (Mulus x domestica Bokh cv. ‘Gloster 69’) นนชนสวนใบเลยงทพฒนาจากคพภะใหการสราง SSE ไดด (Daigny et al., 1996) เปนตน ส าหรบปจจยทางกายภาพ ไดแก สภาพแสง อณหภม เปนตน มผลตอการชกน า SSE ในพชหลายๆ ชนด สวนใหญในระยะชกน าใหเกดแคลลส มกวางเลยงในทมด เมอเขาสการชกน าการเกด SSE เพาะเลยงในทมแสง เชน มนส าปะหลง (Groll et al., 2001) แตในพชหลายชนด มการน าชนสวนพชไปวางเลยงในทมด กอนน ามาวางเลยงในทมแสงเพอใหเกดการสราง SSE (Stamp and Henshaw, 1987) 3. การกลายพนธในพช การกลายพนธหมายถงการเปลยนแปลงโครงสรางโมเลกลดเอนเอ ซงมผลท าใหเกดการเปลยนแปลงของยน หรอโครโมโซม ผลจากการเปลยนแปลงดงกลาวอาจจะท าใหพชแสดงลกษณะใหมๆ ซงแตกตางจากลกษณะเดมโดยสามารถถายทอดจากรนทหนงไปยงรนตอไปได (Ram, 2000) สาเหตของการกลายพนธม 2 ประการ (Sigurbjornsson, 1983) คอ 3.1. การกลายพนธทเกดขนเองตามธรรมชาต พบในอตราทต า เชน ยน Y ทควบคมการเกดสเหลองของเมลดขาวโพดมอตราเกดการกลายพนธในธรรมชาตเพยง 2x10-6 เปอรเซนต เปนตน สาเหตการกลายพนธตามธรรมชาต อาจเกดจากรงส สารเคม หรออณหภม ทมอยในธรรมชาต โดยทมนษยไมไดชกน าใหเกดขน

3.2. การชกน าใหเกดการกลายพนธโดยสงกอกลายพนธ สงกอกลายพนธแบงเปน 2 กลม คอ สงกอกลายพนธทางเคม กบสงกอ

กลายพนธทางกายภาพ ส าหรบสงกอกลายพนธทางเคม ไดแก สารเคมทสามารถชกน าใหเกดการกลายพนธ เชน ethylmethane sulphonate (EMS) และ ethylethane sulphonate (EES) รวมถงสารเคมเพมชดโครโมโซม เชน โคลชซน และออรซาลน เปนตน สวนสงกอกลายพนธทางกายภาพ ไดแก รงสซงจ าแนกเปน 2 ประเภท คอรงสทไมเกดจากการแตกตวของประจ (non ionizing radiation) เชน คลนเสยง คลนวทย รงสอลตราไวโอเลต เปนตน และรงสทเกดจากการแตกตวของประจ (ionizing radiation) เชน รงสแกมมาซงมแหลงก าเนดจากโคบอลท 60 และซเซยม 137 เปนตน

10

3.2.1 สงกอกลายพนธทางเคม สารเคมหลายชนดทสามารถชกน าใหเกดการกลายพนธไดในสงมชวต โดยท าใหเกดการเปลยนแปลงโครงสรางของยนมากกวาการเปลยนแปลงโครงสราง หรอจ านวนชดของโครโมโซม สารเคมทมการศกษาและนยมใชอยางกวางขวางในการท าใหเปลยนแปลงทยนม 4 กลม คอ 1) สารเคมทมโครงสรางโมเลกลคลายกบเบสในดเอนเอ 2) กลมทท าปฏกรยาโดยตรงกบเบสในดเอนเอ 3) สารทสามารถเขาแทนทเบส purine ในสายดเอนเอได เชนพวก alkylating agents และ 4) สารทมสมบตในการลดหรอเพมเบสในดเอนเอ เชน ส acridine (กฤษฎา, 2546) ส าหรบสารเคมทนยมใชในการชกน าใหเกดการกลายพนธ เพอใหเกดการเพมชดโครโมโซม หรอพอลพลอยด คอโคลชซน และออรซาลน (Blakeslee and Avery, 1937; Wan et al., 1991; Dhooghe et al., 2011) 3.2.1.1 โคลชซน

โคลชซนเปนสารประกอบอโรมาตกในกลมอลคาลอยด พบ ในพชบางชนด เชน Colchicum autumnale L. มสมบตในการเพมชดของโครโมโซม โดยสารเคมเหลานจะจบกบโมเลกลทบลนของสปนเดล ท าใหโมเลกลไมท าหนาท ไมสามารถรวมตวสรางไม-โครทบล สงผลท าใหเกดการยบย งการสรางสปนเดลไฟเบอร จงไมสามารถแยกโครโมโซมไปทขวเซลลได ท าใหเพมจ านวนโครโมโซมจากดพลอยดเปนพอลพลอยด (Petersen et al., 2003) การใชโคลชซนเพอเพมชดโครโมโซมในการเพาะเลยงเซลลเนอเยอและอวยวะนน อาจเตมลงในอาหารเลยงเซลล และลางออกหลงจากเพาะเลยงไปชวงระยะเวลาหนง มกใชกบเมลดทก าลงงอกหรอสวนของเนอเยอเจรญ ความเขมขนทใชกนทวไปคอ 0.1-0.5 เปอรเซนต แตทนยมและกอใหเกดการกลายพนธทใชประโยชนไดคอ ความเขมขน 0.2 เปอรเซนต สารโคลชซนนมผน ามาใชในการชกน าใหเกดการกลายพนธในพชอยางกวางขวาง เนองจากไมเปนอนตรายตอตนพช แมจะใชในอตราสง เพราะเปนสารทสกดจากพช เคลอนยายไปตามสวนตาง ๆ ของพช โดยยงคงรกษารปเดม และท าหนาทชกน าใหเกดการกลายพนธไดเปนเวลานาน อกทงไมท าใหเกดการเปลยนแปลงโครงสรางของยน (นพพร และคณะ, 2546) เนองจากโคลชซนสลายตวเมอโดนความรอนชน สงผลใหการเพมชดโครโมโซมลดลงหรอหายไป (Zhang et al., 2007) ดงนนจงตองกรองดวยกระดาษกรองมลลพอร ท าใหสะดวกในการชกน าใหเกดการเพมชดโครโมโซมภายใตสภาวะปลอด

11

เชอ อยางไรกตาม ในพชบางชนดโคลชซนสงผลใหพชเปนหมน การเจรญเตบโตผดปกต และเกดการขาดของโครโมโซมได (Luckett, 1989) 3.2.1.2 ออรซาลน ออรซาลนมลกษณะเปนผลกสเหลอง ท าหนาทยบย งการแบงเซลลแบบไมโทซส โดยจะเขาจบกบทบลนทต าแหนงตางกบโคลชซน สงผลใหเกดการเพมจ านวนโครโมโซมไดเชนเดยวกบโคลชซน เปนสารก าจดวชพชพวกไดไนโทรแอนลน นยมใชกบเซลลพช เนองจากราคาถกกวา และใชในปรมาณนอยกวาโคลชซน ใหผลดกบสวนของเนอเยอเจรญ และมกไมกอใหเกดการแตกหกหรอสญหายของโครโมโซม (นตยศร, 2551; Anderson et al., 1991) 3.2.2 สงกอกลายพนธทางกายภาพ สงกอกลายพนธทางกายภาพทนยมใชในการปรบปรงพนธพชไดแก รงสเอกซ รงสแกมมา รงสอลตราไวโอเลต และอนภาคนวตรอน (Sigurbjornsson, 1983) รงสมผลตอสงมชวตทงทางตรงและทางออม โดยมผลตงแตระดบโมเลกลไปจนกระทงถงระดบเซลล เนอเยอ และระบบอวยวะ ผลทางตรงไดแกการทรงสทเกดจากการแตกตวของประจ ท าลายโมเลกลของสารตางๆ ทอยภายในเซลล หรอเปนองคประกอบของเซลล เชน ไขมน โปรตน คารโบไฮเดรต กรดนวคลอก โดยเฉพาะดเอนเอ ซงเปนสารทเกบขอมลและถายทอดลกษณะพนธกรรม สวนผลทางออมคอ รงสจะท าใหน าซงเปนองคประกอบสวนใหญของเซลลสงมชวตถกไอออไนซ ท าใหเกดอนมลอสระขน ซงอนมลอสระทเกดขนอาจรวมตวกบโมเลกลอนๆ ทเปนองคประกอบของเซลลหรออยภายในเซลล ท าใหโครงสรางทางเคมของสารนนเปลยนแปลงไป หรออนมลอสระอาจรวมตวกนใหมกลายเปนสารอนๆ ทเปนอนตรายตอเซลลหรอสารตางๆ ภายในเซลล จากผลของอนมลอสระดงกลาว อาจท าใหกระบวนการเมแทบอลซมภายในเซลลเปลยนแปลงไป ซงอาจมผลตอการเจรญเตบโตของสงมชวต จนกระทงถงตายได (Constantin, 1975)

12

4. การชกน าใหเกดการกลายพนธในพชโดยใชสารโคลชซน และออรซาลน การชกน าตนพอลพลอยดในหลอดทดลองโดยการใชสารโคลชซน และออรซาลนไดมการศกษากนในพชหลายชนด เชน Scuctellaria baicalensis (Gao et al., 2002) ทบทม (Shao et al., 2003) และลาเวนเดอร (Urwin and Horsnell., 2007) พอลพลอยดนบวามความส าคญอยางยงตอววฒนาการของสงมชวต โดยเฉพาะพชมดอกมรายงานวาประมาณ 47 เปอรเซนต เปนพอล-พลอยดซงสาเหตการเกดพอลพลอยด ทเปนไปไดมดงนคอ 1. การเพมชดโครโมโซมของเซลลรางกาย อาจเนองจากการท างานทผดปกตของสายสปนเดล หรอการชกน าใหเกดพอลพลอยดดวยสารเคม ทมสมบตยบย งการสรางสปนเดลในการแบงเซลล แบบไมโทซส เชน โคลชซน และออรซาลน 2. การเพมชดโครโมโซมทเกยวของกบเซลลสบพนธ เปนการผสมระหวางเซลลสบพนธทไมมการลดจ านวนโครโมโซม เนองจากการแบงเซลลแบบไมโอซสทผดปกต ดงนนเซลลสบพนธจงมจ านวนโครโมโซม 2 ชด (จรสศร, 2548) การชกน าตนพอลพลอยดเปนวธการหนงในการปรบปรงพนธพชเพอการพฒนาสายพนธทใหประสทธภาพสง (Adaniya and Shirai, 2001; Zeng et al., 2006) ซงอาจจะท าใหสวนของ ใบ ล าตน ราก และดอกของตนทเปนพอลพลอยดมขนาดใหญกวาตนดพลอยด ดงนนตนพอลพลอยดอาจจะใหผลผลตสงขน ซงการชกน าตนพอลพลอยดในสภาพหลอดทดลองไดมการศกษากนอยางตอเนอง เชนการศกษาในพชสมนไพร Datura stramonium สามารถเพมปรมาณสารอลคาลอยดในใบ ล าตน และราก ไดมากกวาตนดพลอยดสองเทา (Rowson, 1949) ในท านองเดยวกนกบตน Atropa belladonna ทเปนเททระพลอยด มปรมาณสารอลคาลอยด 154 เปอรเซนต ซงมากกวาตนดพลอยด (Jackson and Rowson, 1953) และตน Artemisia annua ทเปนเททระ-พลอยดมปรมาณสาร artemisinin เพมขนเปนหกเทาของตนดพลอยด (Jesus-Gonzalez and Weathers, 2003)

การชกน าตนพอลพลอยด โดยการเพาะเลยงเนอเยอพชในหลอดทดลอง ภายใตสภาวะปลอดเชอเปนทนยม เนองจากใหประสทธภาพสง เหมาะสมในการผลตเพอการคา (Gao et al., 1996) ปจจบนเมลดพชมากกวา 70 เปอรเซนต ไดมการชกน าใหเกดพอลพลอยด โดยเฉพาะในไมผล เนองจากใหผลทมขนาดใหญขน ตนแขงแรง ใหผลผลตสง ตานทานโรค และมเมลดนอยหรอไมมเมลด (Predieri, 2001) เชน องน (Derman, 1954) ทอ (Derman, 1965) สตรอเบอรร (Sebastiampillai and Jones, 1976; James et al., 1987) บลเบอรร (Perry and Lyrene, 1984) กลวย (Hamil et al., 1992; van Duren et al., 1996) แอปเปล (Liu et al., 2001) และสาล (Kadota and

13

Niimi, 2002) โดยพบวา ตนเททระพลอยดใหผลผลตทมขนาดใหญกวาตนดพลอยด นอกจากน ขนาดของใบ ล าตน และราก ของตนเททระพลอยด ยงมขนาดใหญกวาตนควบคม และมผลผลตมวลรวม มากกวาตนควบคม (Dubcovsky and Dvorak, 2007; Leitch and Leicth, 2008; Zhang et al., 2008) อยางไรกตามในไมผลบางชนด เชน ปาลมน ามน (Madon et al., 2005) พบวาตนเททระ-พลอยดใหตนกลาทมขนาดเลกกวาตนดพลอยด 5. ปจจยทมผลตอการใชสารโคลชซน และออรซาลนชกน าใหเกดการเพมชดโครโมโซมในพช

ปจจยส าคญทมผลตอประสทธภาพการชกน าตนเททระพลอยด คอ ชนสวนพช ระดบความเขมขนของสารเคม รวมกบระยะเวลาการจมแชชนสวน และวธการใหสาร (Kermani et al., 2003; Petersen et al., 2003) โดยพชแตละชนดจะตอบสนองตอสารแตกตางกน

5.1 ชนสวนพช

ประสทธภาพของการเกดพอลพลอยดนน ขนกบชนดของชนสวนพช และความสามารถของเนอเยอพชในการล าเลยงสารโคลชซน และออรซาลนเขาสเนอเยอเจรญ (Allum et al., 2007) จากการศกษาพบวา การใชชนสวนพชทแตกตางกน ในการชกน าใหเกดการเพมชดโครโมโซม สงผลใหพชมลกษณะจโนไทปแตกตางกนดวย (de Mello et al., 2000; Chauvin et al., 2005; Stanys et al., 2006; Khosravi et al., 2008) โดยทวไป นยมใชชนสวนเนอเยอเจรญ ในการชกน าใหเกดการเพมชดโครโมโซม เชน ปลายยอด ตาขาง ล าตนใตใบเลยง ขอ ใบเลยง ปลอง เมลด ใบเลยง แคลลส โซมาตกเอมบรโอ คพภะ อบเรณ เปนตน (Dhooghe et al., 2011) ส าหรบการศกษาการชกน าใหเกดตนเททระพลอยดในปาลมน ามนนน Madon และคณะ (2005) ใชเมลดทก าลงงอก

นอกจากน มรายงานการศกษา การเพมจ านวนชดโครโมโซมในพชชนด อนๆ โดยใชชนสวนพชแตกตางกน เชน ชนสวนปลายยอดของสม (Aleza et al., 2009) พทรา (Gu et al., 2005) กลวย (van Duren et al., 1996; Ganga and Chezhiyan, 2002) กหลาบ (Kermani et al., 2003) ชนสวนยอดในกลวย (Hamill et al., 1992) ชนสวนตายอดใน Dioscorea zingiberensis (Zhang et al., 2010a) ชนสวนโปรโตคอรมในกลวยไมแคทลยา (de Mello et al., 2000) แคลลสของสม (Zhang et al., 2007) และ Dioscorea zingiberensis (Heping et al., 2008) นอกจากนมรายงานการใชชนสวนใบในสาล (Sun et al., 2009) ชนสวนขอของมะเขอเทศ (Greplova et al.,

14

2009) ทบทม (Shao et al., 2003) กหลาบ ( Allum et al., 2007; Khosravi et al., 2008) ชนสวนล าตนใตใบเลยง และขอใบเลยงของตนค าเงาะ (de Carvalho et al., 2005) ตนออนของแตงโม (Omran et al., 2008) เซลลซสเพนชนของสม (Dutt et al., 2010) โพรโทพลาสตของสม (Zeng et al., 2006) โซมาตกเอมบรโอขององน (Yang et al., 2006) และ SSE ในพช Spathiphyllum wallisii (Eeckhaut et al., 2004) 5.2 ความเขมขน ระยะเวลา และวธการใหสาร

ความเขมขนของโคลชซน และออรซาลน รวมกบระยะเวลาทจมแชสาร มผลตออตราการเกดพอลพลอยด ซงพชแตละชนดจะตอบสนองแตกตางกน การศกษาโดยใชสารความเขมขนต าอาจจะไมสามารถชกน าใหเกดการเพมชดโครโมโซมได และเมอใชสารความเขมขนสง สงผลใหเนอเยอพชอาจตายได ดงนนระดบความเขมขน และระยะเวลาทเหมาะสม เปนปจจยส าคญทสามารถเพมอตราการชกน าตนพอลพลอยดได Tang และคณะ (2010) รายงานการใชสารโคลชซนวาทความเขมขนต า แตใชเวลาในการจมแชชนสวนแคลลสของ Paulownia tomentosa ในสารละลายนานขน สามารถเพมเปอรเซนตการเกดตนพอลพลอยดใหสงขนได นอกจากนการใชสารทมความเขมขนสง แตใชเวลาในการจมแชชนสวนสนลง สามารถชกน าตนพอลพลอยดไดเชนเดยวกน (Allum et al., 2007) Madon และคณะ (2005) ชกน าการกลายพนธในปาลมน ามนโดยใชสารโคลชซน และออรซาลนความเขมขนตางๆ จมแชเมลดงอกภายนอกสภาพหลอดทดลอง พบวา โคลชซนเขมขน 10.0 ไมโครโมลาร ทเวลา 8 ชวโมง ใหเปอรเซนตการรอดชวตสงทสด 48 เปอรเซนต และโคลชซนเขมขน 12.5 ไมโครโมลาร ทเวลา 6 ชวโมง เกดตนเททระพลอยด สวนออรซาลน เขมขน 90 ไมโครโมลาร ทเวลา 8 ชวโมง ใหเปอรเซนตการรอดชวตสงทสด 72 เปอรเซนต และไมพบตนพอลพลอยด ส าหรบการศกษาการเพมชดโครโมโซม โดยใชสารละลายโคลชซน ภายนอกสภาพหลอดทดลองในพชชนดอนนน Urwin และ Horsnell (2007) จมแชเมลดลาเวนเดอร ในอาหารเหลวรวมกบสารโคลชซน ความเขมขน 12.5 เปอรเซนต เปนระยะเวลา 7 วน พบวาเกดตนเททระพลอยด Omidbaigi และคณะ (2010) น าเมลด ใบเลยงของตนออน และราก ของโหระพา มาแชสารละลายโคลชซน ความเขมขน 0.05 - 0.75 เปอรเซนต เปนระยะเวลา 6 12 24 และ 36 ชวโมง พบวา การหยดสารละลายโคลชซนความเขมขน 0.5 เปอรเซนต บนใบเลยงของตนออนเทานน ทสามารถชกน าใหเกดตนเททระพลอยดได นอกจากนเปอรเซนตการรอดชวตของ

15

ชนสวนพช ลดลงตามความเขมขนของสารละลายโคลชซนทสงขน และระยะเวลาการแชสารทนานขน

มรายงานการเพมชดโครโมโซม โดยใชสารละลายโคลชซน และออรซาลนภายในสภาพหลอดทดลอง ภายใตสภาวะปลอดเชอ เชน Gantait และคณะ (2011) น าปลายยอดของเยอบ-รา แชในสารละลายโคลชซนความเขมขน 0.1 เปอรเซนต ภายใตสภาวะปลอดเชอ เปนระยะเวลา 8 ชวโมง พบวาสามารถชกน าใหเกดตนเททระพลอยดไดดทสด แตมเปอรเซนตการรอดชวตนอยกวาตนควบคม Gu และคณะ (2005) เพาะเลยงปลายยอดพทราบนอาหารแขงสตร MS รวมกบสาร โคลชซนเขมขน 0.05 เปอรเซนต เปนเวลา 48 และ 72 ชวโมง และความเขมขน 0.1 เปอรเซนต เปนเวลา 24 และ 48 ชวโมง สามารถชกน าใหเกดตนเททระพลอยดได 3 เปอรเซนต Stanys และคณะ (2004) ศกษาการชกน าการเกดพอลพลอยดใน Ribes โดยการเพาะเลยงปลายยอด และเอมบรโอรวมกบสารโคลชซนเขมขน 0.25 เปอรเซนต และออรซาลนเขมขน 20 ไมโครโมลาร พบวาสามารถชกน าใหเกดพชพอลพลอยดได Nguyen และคณะ (2003) ชกน าปลายยอด Alocasia ใหเกดตนเททระพลอยด โดยแชในสารโคลชซน และออรซาลนความเขมขนตางๆ พบวาโคลชซนเขมขน 0.01 เปอรเซนต ทเวลา 48 ชวโมง ใหเปอรเซนตการรอดชวตดทสด และมการสรางยอดรวมมากกวาตนควบคม แตไมพบตนเททระพลอยด สวนออรซาลนเขมขน 0.05 เปอรเซนต ทเวลา 24 ชวโมง มเปอรเซนตการรอดชวตสงสด และออรซาลน 0.01 เปอรเซนต ทเวลา 24 ชวโมง เกดตนเททระพลอยดดทสด

Liu และ Gao (2007) น าตายอดของเบญจมาศ จมแชในสารโคลชซน ความเขมขน 0.05 เปอรเซนต เปนระยะเวลา 12 ชวโมง ภายใตสภาวะปลอดเชอ พบวาเกดตนเททระพลอยดไดดทสด Liu และคณะ (2007) จมแชเมลด Platanus acerifolia ในสารละลายโคลชซน ความเขมขน 0.1 - 0.5 เปอรเซนต เปนระยะเวลา 96 ชวโมง พบวาสามารถชกน าใหเกดตนเททระพลอยดได อยางไรกตามตนออนไมสามารถพฒนาเปนตนทสมบรณได Omran และ Mohammad (2008) จมแชเมลดฝาย ในอาหารเหลวสตร MS ทเตมสารโคลชซน เขมขน 0.9 เปอรเซนต เปนระยะเวลา 16 ชวโมง พบวาสามารถชกน าตนเททระพลอยดได แตเปอรเซนตการรอดชวตต าลง Rego และคณะ (2011) น าชนสวนล าตนใตใบเลยงของเสาวรสผลสเหลอง ทไดจากการเพาะเลยงเมลดภายใตสภาวะปลอดเชอมาจมแชในอาหารเหลวทเตมสารละลายโคลชซน และออรซาลน ทความเขมขนตางๆ เปนเวลา 15 วน พบวาการจมแชชนสวนในสารละลายโคลชซนเขมขน 25 ไมโครโมลาร เปนระยะเวลา 15 วน เกดตนเททระพลอยดไดดทสด สวนการจมแชในสารละลายออรซาลนทกความเขมขน (5 - 30 ไมโครโมลาร) ไมสามารถชกน าใหเกดตนเททระพลอยดได Sun และคณะ (2009) ใชชนสวนใบของสาลวางบนกระดาษกรองทหยดสารละลายโคลชซนความเขมขน 4 เปอรเซนต

16

เปนเวลา 24 48 และ 72 ชวโมง หลงจากนน น าไปชกน าใหเกดยอดภายใตสภาวะปลอดเชอ พบวาการวางชนสวนเปนเวลา 48 ชวโมง สามารถชกน าใหเกดตนเททระพลอยดไดดทสด และการวางชนสวนบนสารละลายโคลชซนเปนเวลานานขนสงผลใหเปอรซนตการรอดชวต และเปอรเซนตการเกดตนเททระพลอยดลดลง

Koarapatchaikol (2007) แชแคลลสของกลวยสาในสารละลายออรซาลนเขมขน 1.5 มลลกรมตอลตร เปนเวลา 48 ชวโมง พบวา เกดตนเททระพลอยดมากทสด Heping และคณะ (2008) น าแคลลสของ Dioscorea zingiberensis จมแชในสารละลายโคลชซนความเขมขน 0.3 เปอรเซนต เปนระยะเวลาตาง ๆ คอ 4 8 12 16 20 24 และ 30 ชวโมง พบวา สามารถชกน าตนเททระพลอยดไดทกระยะเวลา แตการจมแชแคลลสเปนระยะเวลา 16 ชวโมง สามารถชกน าใหเกดตนเททระพลอยดไดดทสด Sariano และคณะ (2007) รายงานผลการศกษาการชกน าการเพมจ านวนโครโมโซมในขาวสาล (Triticum aestivum L.) พนธตางๆ โดยใชชนสวนอบเรณและเรณมาเพาะเลยงบนอาหารแขงสตร MS รวมกบสารโคลชซนเขมขน 300 มลลกรมตอลตร เปนเวลา 48 ชวโมง สามารถชกน าพชไดแฮพลอยด (dihaploid)ไดสงถง 75 เปอรเซนต Escandon และคณะ (2005) ศกษาการเพาะเลยงขอของพชสมนไพรกรดน า (Scoparia montevidiensis) บนอาหารแขงสตร MS รวมกบสารโคลชซนทระดบความเขมขน 0.001 0.01 0.05 และ 0.1 เปอรเซนต เปนเวลา 24 และ 48 ชวโมง พบวา ทกความเขมขนสามารถชกน าใหเกดเททระพลอยดได โดยทความเขมขน 0.001 เปอรเซนต ทเวลา 24 ชวโมง สามารถชกน าใหเกดเททระพลอยดมากทสด และทความเขมขน 0.05 เปอรเซนต ชกน าใหเกดมกโซพลอยดมากทสดเชนกน วธการใหสารโคลชซน และออรซาลน ม 2 วธ คอ การหยดสารละลายโดยตรงกบตนพชบรเวณปลายยอด และการน าเมลด หรอชนสวนพชแชสารละลายดงกลาว ซงสามารถศกษาในพชทเจรญเตบโตในแปลงปลก และในหลอดทดลองภายใตสภาวะปลอดเชอ (Rubuluza et al., 2007) การใหสารโคลชซน และออรซาลนแกพชตองพยายามใหสารแทรกซมเขาไปในเนอเยอเจรญ หรอเซลลทก าลงเจรญเตบโตและสมบรณ ระยะเวลาและความยาวนานของการใหสารแกเนอเยอขนอยกบวฎจกรของการแบงเซลลพช หากระยะเวลาทใหสารสนอาจไมแสดงผล ถานานเกนไปอาจแสดงผลมาก คอพชทไดจะมโครโมโซมมากเกนระดบทตองการ

17

6. การตรวจสอบการกลายพนธในพช วธการตรวจสอบการกลายพนธของพช ทไดจากการชกน าใหเกดการกลายพนธ โดยใชสารโคลชซน และออรซาลนนน สามารถตรวจสอบลกษณะทางสณฐานวทยา ลกษณะทางสรรวทยา และการตรวจสอบลกษณะทางเซลลวทยา 6.1 การตรวจสอบลกษณะทางสณฐานวทยา

ความแปรปรวนจากการกลายพนธ สามารถตรวจสอบไดจากลกษณะทางสณฐานวทยา เนองจากสามารถตรวจสอบไดงาย จากการสงเกตลกษณะทเกดขน มการถายทอดทางพนธกรรมผานยนบนโครโมโซม ภายหลงการชกน าใหเกดการกลายพนธ ซงลกษณะทปรากฏ เปนผลมาจากการเปลยนแปลงขอมลทเปนองคประกอบทางจโนไทป และสงแวดลอม สงผลใหแสดงลกษณะนนๆ ออกมา เชน ลกษณะของการเจรญเตบโต ล าตน ใบ ดอก ผล ราก เปนตน Zhang และคณะ (2007) รายงานวา ลกษณะ และขนาดของใบ สามารถประเมนการเกดพอลพลอยดได อยางไรกตาม Zhang และคณะ (2010b) รายงานวาจากการประเมนลกษณะทางสณฐานวทยาของตนทคาดวาเปนตนเททระพลอยด (putative tetraploid) นน หลงจากยนยนผลโดยการศกษาลกษณะทางเซลลวทยา พบวาเพยง 50 เปอรเซนต เทานนทจดเปนตนเททระพลอยด สวนทเหลอเปนตนมกโซพลอยด ส าหรบการประเมนการเกดเททระพลอยดในปาลมน ามนน น Madon และคณะ (2005) พบวาตนเททระพลอยดของปาลมน ามน ทชกน าจากการแชเมลดทงอกในสารละลายโคลชซน มการเจรญเตบโตชา และมใบสเขยวเขม หนากวาตนควบคม นอกจากน มรายงานการประเมนการเกดเททระพลอยด โดยการศกษาลกษณะสณฐานวทยาในพชชนดอน เชน Shao และคณะ (2003) รายงานวาตนเททระพลอยดของทบทมใหขนาดของยอด ใบ และราก ใหญกวาตนดพลอยด Sun และคณะ (2009) รายงานวาตนเททระพลอยดของสาล ใหใบ และยอดสเขยวเขม หนา แตขนาดของใบลดลง ล าตนและขอสนกวาตนดพลอยด Liu และ Gao (2007) รายงานวา ตนเททระพลอยดของเบญจมาศ มการเจรญเตบโตชา ล าตน ใบ และ ราก มขนาดใหญกวาตนดพลอยด นอกจากน Heping และคณะ (2008) รายงานวา ตนเททระพลอยดของ Dioscorea zingiberensis ใหขนาดของใบ และเหงา ใหญกวาตนดพลอยด และ Omidbaigi และคณะ (2010) รายงานวาตนเททระพลอยดของโหระพา มใบสเขยวเขม หนา และรปรางของใบเปลยนแปลงไปแตกตางจากตนควบคม ขนาดของใบ เมลด และละอองเรณ มขนาดใหญกวาตนดพลอยด

18

จากการศกษาลกษณะทางสณฐานวทยาของตนเททระพลอยดในพทรา Gu และคณะ (2005) รายงานวาตนเททระพลอยด ใหตนขนาดใหญ ใบหนา และใหดอกขนาดใหญกวาตนดพลอยด Escandon และคณะ (2005) รายงานวาตนเททระพลอยดของกรดน า ใหล าตน ใบ และดอกขนาดใหญขน Nimura และคณะ (2006) รายงานการเกดพอลพลอยด ในดอกคารเนชนลกผสม (Dianthus caryophyllus L. และ D. japonicus Thunb) สงผลใหขนาดดอกใหญขน ระยะเวลาบานของดอกนานกวากลมควบคม และ Allum และคณะ (2007) รายงานวาตนเททระ-พลอยดของดอกกหลาบ มจ านวนกลบดอกมากกวาตนดพลอยด นอกจากน Tang และคณะ (2010) รายงานวาตนเททระพลอยดของ Paulownia tomentosa เตยลง มขอของล าตนสนลง รปรางของใบเปลยนเปนใบกลม ใหดอกขนาดใหญ กานดอกยาว และรงไขใหญกวาตนดพลอยด และ Gantait และคณะ (2011) รายงานวา ตนเททระพลอยดมการเจรญเตบโตชา ใบมขนาดใหญ และหนา รากมขนาดใหญและสน ดอก และชอดอกมขนาดใหญ กานดอกยาว และระยะเวลาการออกดอกชากวาตนควบคมเปนเวลา 5 วน จากการศกษาตนเททระพลอยดขององน พบวาใหผลขนาดใหญกวาตนควบคม (Notsuka et al., 2000) ส าหรบตนเททระพลอยดของ Chaenomeles japonica นน มเมลดลดลง แตใหน าหนกผลสดเพมขน (Stanys et al..2006) นอกจากน Rego และคณะ (2011) รายงานวา ตนเททระพลอยดของเสาวรสผลสเหลอง ใหใบ ผลขนาดใหญ และใหน าในผลมากกวาตนด-พลอยด การเปลยนแปลงลกษณะทางสณฐานวทยาของพชในตนเททระพลอยดนน กอใหเกดมลคาเพมทางเศรษฐกจ เชน ตนพชททนตอสภาวะแลง ตานทานโรค ใหผลผลตเพมขน และสามารถเกบรกษาหลงการเกบเกยวไดนานขน (Riddle et al., 2006; Xiong et al., 2006) ดงเชนรายงานของ Li และคณะ (2009) รายงานวาตนเตตราพลอยดทมการเปลยนแปลงลกษณะทางสณฐานวทยา โดยขนาดของใบลดลง ใหมวลของใบตอพนทเพมขน เนอเยอ epidermal และ palisade cell หนากวาเดม สงผลใหทนตอสภาวะแลงไดดกวาตนควบคม นอกจากนยงมรายงานวาตนเตตราพลอยดของ Prunus salicina (Pustovoitova et al., 1996) และ Betula papyrifera (Li et al., 1996) ตานทานตอภาวะน าทวมไดดกวาตนควบคม Dewey (1980) รายงานวาตนเตตราพลอยดของ Lolium perenne และ Lolium multiflorum ตานทานโรคไดดกวาตนควบคม ไฟเบอรนมขน และยอยไดงายกวาเดม และ Zhang และคณะ (2010a) รายงานวาตนเตตราพลอยด ใน Dioscorea ตานทานตอสภาวะรอนไดดกวาตนควบคม

19

6.2 การตรวจสอบลกษณะทางสรรวทยา

การตรวจสอบความแปรปรวนของปาลมน ามน ทชกน าใหเกดการกลาย พนธ สามารถคดเลอกไดโดยการศกษาลกษณะทางสรรวทยา เชน ขนาดเซลลคม ปรมาณคลอโรฟลล จ านวนเมดคลอโรพลาสต และปรมาณสารทตยภม เปนตน โดยทวไปแลวลกษณะทางสณฐานวทยาของพช มความสมพนธกบลกษณะทางสรรวทยา ดงนนจงสามารถคดเลอกตนทคาดวาเปนเททระพลอยด โดยการศกษาเบองตนจากลกษณะภายนอก และน ามาตรวจสอบขนาดของเซลลคม และนบจ านวนเมดคลอโรพลาสต ซงเปนวธตรวจสอบทท าไดงาย สะดวก และประหยด (Tal, 1980; Cohen and Yao, 1996) ขนาดของเซลลคมนน สามารถน ามาประเมนตนเทท-ระพลอยดได โดยตนเททระพลอยดใหขนาดเซลลคมใหญกวาตนดพลอยด (Hodgson et al., 2010) มรายงานการศกษาเกยวกบตนเททระพลอยด ใหขนาดเซลลคมใหญกวาตนควบคม และความหนาแนนของเซลลคมนอยกวาตนดพลอยด ในเสาวรสผลสเหลอง (Rego et al., 2011) สาล (Kadota and Nimii, 2002; Sun et al., 2009) Chaemomeles japonica (Stanys et al., 2006) องน (Yang et al., 2006) กลวย (Hamill et al., 1992) พทรา (Gu et al., 2005) หมอน (Chakraborti et al., 1998) หนอไมฝรง (Shiga et al., 2009) โหระพา (Omibaigi et al., 2010) Pennisetum spp. (Campos et al., 2009) Lagerstroemia indica (Zhang et al., 2010b) เยอบรา (Gantait et al., 2011) เบญจมาศ (Liu et al., 2007) Zantedeschia (Cohen and Yao, 1996) Aegilops neglecta (Aryavand et al., 2003) และAlocasia (Thao et al., 2003) ส าหรบปาลมน ามน Madon และคณะ (2005) รายงานวา ขนาดเซลลคมของตนเททระพลอยด และตนดพลอยดไมมความแตกตางกน

นอกจากนยงสามารถตรวจสอบการเกดเททระพลอยด โดยการนบจ านวนเมดคลอโรพลาสต ซงมการยนยนผลวาจ านวนเมดคลอโรพลาสตในตนเททระพลอยด มจ านวนมากกวาตนดพลอยด ในหมอน (Chakraborti et al., 1998) พทรา (Gu et al., 2005) Poplar และ black locus (Edward et al., 2009) Lagerstoemia indica (Zhang et al., 2010b) โหระพา (Omibaigi et al., 2010) และเสาวรสผลสเหลอง (Rego et al., 2011) 6.3 การตรวจสอบจ านวนโครโมโซม การศกษาจ านวนโครโมโซมจากเซลลปลายราก หรอเนอเยอเจรญสวนอน เชน ยอด ดวยวธ Feulgen squash สามารถประเมนการเกดพอลพลอยดไดอยางแมนย า (Dolezel et al., 2007) ส าหรบปาลมน ามน Madon และคณะ (2005) รายงานวาปาลมน ามนเปนพชดพลอยด ม

20

จ านวนโครโมโซม 2n=2x=32 และตนเททระพลอยดมจ านวนโครโมโซม 2n=4x=64 นอกจากน Madon และคณะ (2008) รายงานวา จากการศกษาปลายรากปาลมน ามนตนดพลอยด พบวามจ านวนโครโมโซม 2n=2x=32 เชนเดยวกน ส าหรบการตรวจสอบการเกดเททระพลอยดในพชชนดอน จากการนบจ านวนโครโมโซม Liu และ Gao (2007) รายงานวาตนเททระพลอยดของเบญจมาศ มจ านวนโครโมโซม 2n=4x=36 สวนตนดพลอยด มจ านวนโครโมโซม 2n=2x=18 Rego และคณะ (2011) รายงานการศกษาปลายรากของเสาวรสผลสเหลองตนเททระพลอยด และดพลอยด พบวาตนเททระพลอยดมจ านวนโครโมโซม 2n=4x=36 และตนดพลอยด 2n=2x=18 นอกจากน มหลายการศกษาทรายงานการยนยนผลการเกดตนเททระพลอยดของพชตางๆ จากการนบจ านวนโครโมโซมจากเซลลปลายราก เชน Lagerstoemia indica (Zhang et al., 2010b) Paulownia tomentosa (Tang et al., 2010) โหระพา (Omidbaigi et al., 2010) แพร (Sun et al., 2009) Dioscorea zingiberensis (Heping et al., 2008) กรดน า (Escandon et al., 2005) พทรา (Gu et al., 2005) และ Alocasia (Thao et al., 2003) 6.4 การตวจสอบปรมาณดเอนเอ โดยเทคนคโฟลไซโทเมทร

โฟลไซโทเมทร เปนเครองมอส าหรบวเคราะหปรมาณดเอนเอ โดยอานคานวเคลยสของเซลลพชทตองการศกษาดวยแสงเลเซอร ท าใหสามารถประมาณดเอนเอทเปนองคประกอบในนวเคลยสและขนาดของจโนมพชทตองการศกษาได นอกจากนยงสามารถบงชถงระดบการเปลยนแปลงเพมหรอลดของจ านวนชดโครโมโซม รวมทงสามารถยนยนถงความเสถยรของโครโมโซมพชทเพาะเลยงภายใตสภาวะปลอดเชอเปนเวลานาน การวเคราะหปรมาณดเอนเอ สามารถปฏบตไดอยางรวดเรว และใหผลทแมนย า (Galbraith et al., 1983; Eeckhaut et al., 2005; Dolezel et al., 2007) ปจจบนเทคนคดงกลาวเปนทนยม เนองจากการตรวจสอบการเกดพอลพลอยดโดยการนบจ านวนโครโมโซมนนมขนตอนทยงยาก สารเคมทใชในการศกษามความจ าเพาะตอชนดพช และตองใชความช านาญของผปฏบตการสง (Bohanec, 2003) การศกษาปรมาณดเอนเอโดยใชโฟลไซโทเมทรจากเนอเยอเจรญของพช เชน แคลลส ยอด ใบออน และเอมบรโอ ไดรบความนยมสง วธการคอการแยกเซลลพชใหเปนเซลลเดยว ดวยการสบเนอเยอพชดวยใบมด หรอ การตดวยเมดบท (Roberts, 2007) ในสารละลายบฟเฟอร และยอมนวเคลยสดวยสารละลาย propidium iodide (PI) หรอ 4’, 6-diamino-2-phenylindole (DAPI) หลงจากนนวเคราะหระดบพลอยดดวยเครองโฟลไซโทมเตอร ซงเครองจะวเคราะหขณะทเซลลเคลอนทผานล าแสงเลเซอรเปนเซลลเดยวๆ โดยการตรวจจบนวเคลยส และสามารถนบไดเปนพนเซลล และเครองดงกลาวจะ

21

วเคราะหปรมาณดเอนเอจากนวเคลยส ซงปรมาณดเอนเอมความสมพนธโดยตรงกบระดบพลอยด (Cousin et al., 2009) จงสามารถตรวจสอบระดบพลอยดของพชไดปรมาณมาก ในระยะเวลาอนสน ส าหรบการศกษาปรมาณดเอนเอในปาลมน ามน โดยเทคนคโฟลไซโทเมท-รนน Rival และคณะ (1997) รายงานวา ปรมาณดเอนเอของปาลมน ามนคอ 3.786 0.125 pg Srisawat และคณะ (2005) รายงานวาปรมาณดเอนเอของปาลมน ามนมคาสงกวาของ Rival เลกนอยคอ 3.97 0.31 pg และ Madon และคณะ (2008) รายงานปรมาณดเอนเอของปาลมน ามนมคา 3.76 0.02 pg ส าหรบการศกษาระดบพลอยดของพชนน Madon และคณะ (2005) จมแชเมลดงอกของปาลมน ามนในสารละลายโคลชซนเพอชกน าใหเกดตนเททระพลอยด หลงจากนนน าใบออนมาวเคราะหปรมาณดเอนเอ พบวาระดบพลอยดเพมขนเปนเททระพลอยด คอจาก 2 ชด เปน 4 ชด Gantait และคณะ(2011) รายงานการน ายอดของเยอบราตนเททระพลอยดมาศกษาระดบพลอยด พบวาตนเททระพลอยดมระดบพลอยดสงกวาตนดพลอยดสองเทา Zhang และคณะ (2010a) น าใบของตน Dioscorea zingiberensis ทไดรบการจมแชในสารละลายโคลชซน ตรวจสอบปรมาณดเอนเอ เพอประเมนจ านวนชดโครโมโซม พบวา ปรมาณดเอนเอของตนเททระพลอยดมากกวาตนด-พลอยดสองเทา Tang และคณะ (2010) ใชใบของ Paulownia tomentosa ตรวจสอบระดบพลอยด พบวาตนทใชสารโคลชซนสามารถชกน าใหเกดการเพมชดโครโมโซมเปนตนเททระพลอยด Sun และ คณะ (2009) ตรวจสอบระดบพลอยดของใบสาลทชกน าใหเกดพอลพลอยด โดยเทคนคโฟลไซโทเมทร พบวามระดบพลอยดเปลยนเปน ทรพพลอยด มกโซพลอยด และ เททระพลอยด นอกจากน Barbara และ Elwira (2002) ใชโฟลไซโทเมทรกบ cloudberry พบวาปรมาณดเอนเอจากยอดทพฒนามาจากเมลดเทยมซงเกบไวเปนเวลานานทอณหภม 4 องศาเซลเซยส ในสภาวะปลอดเชอ มจ านวนชดโครโมโซมเทาเดม สวนแคลลสทเกดขนมจ านวนชดโครโมโซมเปลยนเปน 4 ชด และ 8 ชด Gajdosova และคณะ (1995) พบวาปรมาณดเอนเอของตน silver fir จากยอดทยายเลยงเปนเวลานานยงคงมจ านวนชดโครโมโซมคงเดม ไมมการเปลยนแปลง

22

วตถประสงคของการวจย การศกษาผลของโคลชซนและออรซาลนตอการเปลยนแปลงชดโครโมโซม ในตนออนชดท 2 ของปาลมน ามนครงนมวตถประสงคคอ

1. เพอศกษาระดบความเขมขน ระยะเวลา และวธการจมแชชนสวนในสารโคล- ชซน และออรซาลนตออตรารอดชวต และการพฒนาเปนพชตนใหมจาก SSE

2. เพอศกษาระดบความเขมขน ระยะเวลา และวธการจมแชชนสวนในสารโคล-ชซน และออรซาลนตออตราการเกด putative tetraploid จาก SSE

3. เพอศกษาวธการตรวจสอบการเพมชดโครโมโซมจากการใชสารโคลชซน และ ออรซาลนทเหมาะสม รวดเรว และประหยดคาใชจาย เพอใชในการประเมน ตนเททระพลอยด และคดเลอกวธการเพอเพมประสทธภาพในการผลตปาลม น ามนเททระพลอยดตอไป

23

23

บทท 2

วสด อปกรณ และวธการ

วสด และอปกรณ

1. วสด

1.1 วสดพช

ใชเอมบรโอเจนคแคลลส (EC) ทชกน าจากใบออนทยงไมคลของปาลมน ามนตนโตทใหผลผลตดอาย 10 ป จากสถานวจยและฝกภาคสนามเทพา คณะทรพยากรธรรมชาต มหาวทยาลยสงขลานครนทร ดแลแคลลสโดยยายเลยงทกเดอนบนอาหารแขงสตร MS เตม dicamba เขมขน 0.3 มลลกรมตอลตร กรดแอสคอรบคเขมขน 200 มลลกรมตอลตร น าตาลซโครสเขมขน 3 เปอรเซนต หลงจากยายเลยงเอมบรโอเจนคแคลลสเปนเวลา 1 เดอน ชกน าใหเกดตนออนระยะสรางจาว (haustorium embryo: HE) แยกตวเปนอสระออกมาจากแคลลส จากนนยาย HE เดยวๆ ไปเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทเตมน าตาลซอรบทอลเขมขน 0.2 โมลาร เตมกรดแอสคอรบคเขมขน 200 มลลกรมตอลตร เพาะเลยงเปนเวลา 3 เดอน จะได SSE จ านวนมากเพอใชในการศกษาผลของโคลชซน และออรซาลนตอการเพมชดโครโมโซมตอไป

1.2 สตรอาหารทใชเลยง

สตรอาหารทใชในการศกษานเปนสตร MS ดดแปลงใหมความเหมาะสมกบ การชกน าพฒนาการของปาลมน ามน ในแตละระดบดงนคอ 1.2.1 สตรอาหารเพมปรมาณเอมบรโอเจนคแคลลส คอ อาหารแขงสตร

MS เตม dicamba เขมขน 0.3 มลลกรมตอลตร และกรดแอสคอรบค เขมขน 200 มลลกรมตอลตร

1.2.2 สตรอาหารชกน าตนออนระยะสรางจาว คอ อาหารแขงสตร MS เตม dicamba เขมขน 0.1 มลลกรมตอลตร และกรดแอสคอรบคเขมขน 200 มลลกรมตอลตร

24

1.2.3 สตรอาหารชกน าโซมาตกเอมบรโอชดทสอง (SSE) คอ อาหารแขงสตร MS เตมน าตาลซอรบทอลเขมขน 0.2 โมลาร และเตมกรดแอสคอรบค เขมขน 200 มลลกรมตอลตร 1.2.4 สตรอาหารชกน าตนกลา คอ อาหารแขงสตร MS ปราศจากสารควบคม

การเจรญเตบโต 1.2.5 สตรอาหารชกน าราก คอ อาหารแขงสตร ARDA (Agricultural

Research Development Agency) เตม NAA 0.5 มลลกรมตอลตร และกรดแอสคอรบค 200 มลลกรมตอลตร

1.3 วสดสารเคม

1.3.1 สารเคมทใชเปนองคประกอบสตรอาหาร MS และ ARDA (รายละเอยด แสดงในตารางภาคผนวกท 1)

1.3.2 น าตาลซโครส ซอรบทอล 1.3.3 กรดแอสคอรบค 1.3.4 สารควบคมการเจรญเตบโต คอ dicamba และ NAA 1.3.5 สารเคมชกน าใหเกดพอลพลอยด คอ โคลชซน และออรซาลน 1.3.6 สารเคมทใชในการฆาเชอจลนทรย คอ แอลกอฮอล

1.3.7 สารเคมทใชปรบความเปนกรด-ดางของอาหาร คอกรดไฮโดรคลอรก และโซเดยมไฮดรอกไซด 1.3.8 สารเคมทใชศกษาลกษณะสณฐานวทยาของดอก และลกษณะของเซลล

คม คอสารละลายฟอสเฟตบฟเฟอร (Na2HPO4–NaH2PO4) และสาร ละลายกลตารลดไฮด (glutaraldehyde)

1.3.9 สารเคมทใชศกษาปรมาณคลอโรฟลล คอ อะซโตน 1.3.10 สารเคมทใชศกษาโครโมโซมของพช คอ พาราไดคลอโรเบนซน (P-dichlorobenzene : PDB) กรดเกลเชยลอะซตก (glacial acetic acid) กรดไฮโดรคลอรก สยอมโครโมโซมคารบอลฟกซน (carbol fuchsin) และ oil immersion (รายละเอยดแสดงในตารางภาคผนวกท 2)

25

1.3.11 สารเคมทใชในการศกษาปรมาณดเอนเอ ประกอบดวยสารละลาย บฟเฟอร [Tris-HCl, Triton-X, PVP (polyvinyl pyrolidone)] และ ส ยอมดเอนเอ propidium iodide (PI) (รายละเอยดแสดงในตาราง ภาคผนวกท 3)

1.4 วสดเกษตร

1.4.1 กระถางขนาดเสนผานศนยกลาง 4 นว 1.4.2 ปยละลายชาสตร 14-14-14 1.4.3 สารสกดชวภาพก าจดเชอรา แบคทเรย ตราไบซน 1.4.4 แลนเนต

2. อปกรณ

2.1 อปกรณทใชในการเตรยมอาหาร

2.1.1 เครองวดความเปนกรด-ดาง (pH meter) 2.1.2 เครองคนสารละลายพรอมแทงแมเหลก 2.1.3 เครองชงทศนยม 2 และ 4 ต าแหนง 2.1.4 หมอนงความดนไอ 2.1.5 ตอบไมโครเวฟ

2.1.6 เครองแกวทใชในการทดลอง เชน จานเพาะเลยง ฟลาสก บกเกอร ขวดปรบปรมาตร

2.1.7 ตเยนและตแชแขง 2.1.8 เครองกลนน า

2.2 อปกรณทใชในการยายเลยง และวางเลยง

2.2.1 ตยายเลยงเนอเยอพช 2.2.2 เครองเขยาเลยง

26

2.2.3 ชดเครองมอยายเลยงเนอเยอ ไดแก ปากคบ และมดผาตด 2.2.4 ชนส าหรบวางขวดเพาะเลยง ซงควบคมอณหภม 26+2 องศาเซลเซยส

ใหแสง 14 ชวโมงตอวน ความเขมแสง 8.73 ไมโครโมลตอตารางเมตรตอวนาท

2.3 อปกรณทใชในการศกษาลกษณะดอก และลกษณะของเซลลคม

2.3.1 อปกรณในการศกษาจ านวนเซลลคม ไดแก ใบมด ปากคบ แผน สไลด แผนปดสไลด 2.3.2 กลองจลทรรศนใชแสงแบบเชงประกอบ (compound light microscope) ยหอ Olympus รน BH2-RFL-T2

2.3.3 เครองเคลอบอนภาคทอง (sputter-coater) รน Spi module 2.3.4 กลองจลทรรศนอเลคตรอนแบบสองกราด (scanning electron

microscope: SEM) รน Quanta 400, FEI 2.4 อปกรณทใชในการศกษาปรมาณคลอโรฟลล

2.4.1 อปกรณในการศกษาปรมาณคลอโรฟลล ไดแกกรวยกรอง

กระดาษกรองเบอร1 และโกรง 2.4.2 เครองวดการดดกลนแสง (spectrophotometer) รน MAPADA (v-1200/uv-1100/uv-1200)

2.5 อปกรณทใชในการศกษาจ านวนโครโมโซม

2.5.1 อปกรณในการศกษาจ านวนโครโมโซม ไดแก แผนสไลด แผน ปดสไลด เขมเขย ใบมด ดนสอปลายเรยบ

2.5.2 กลองจลทรรศนใชแสงแบบเชงประกอบ (compound light microscope) ยหอ Olympus รน BH2-RFL-T2 2.5.3 กลองถายรปดจตอล ยหอ Sony รน DSC-H10

27

2.6 อปกรณทใชในการศกษาปรมาณดเอนเอ

2.6.1 อปกรณในการศกษาปรมาณดเอนเอ ไดแก ใบมด หลอดทดลอง ขนาดเลก กระดาษกรองขนาด 20 ไมโครเมตร 2.6.2 เครองวดปรมาณดเอนเอ FACScalibur Flow Cytometer รน Becton- Dickinson Japan

วธการ

1. การเพาะเลยงเนอเยอปาลมน ามน

1.1 การชกน า และเพมปรมาณ EC

น าเอมบรโอเจนคแคลลส (EC) (ภาพท 1) ทชกน าไดจากการเพาะเลยงใบออน ทยงไมคลของปาลมน ามนตนโตทใหผลผลตดอาย 10 ป จากสถานวจยและฝกภาคสนามเทพา คณะทรพยากรธรรมชาต มหาวทยาลยสงขลานครนทร มาเพาะเลยงบนอาหารแขงสตร MS เตม dicamba เขมขน 0.3 มลลกรมตอลตร รวมกบกรดแอสคอรบคเขมขน 200 มลลกรมตอลตร น าตาลซโครส 3 เปอรเซนต ปรบความเปนกรด-ดาง เปน 5.7 และเตมวน 0.75 เปอรเซนต อาหารดงกลาวบรรจในหลอดทดลองขนาด 25×150 มลลลตร ปรมาตร 10 มลลลตร นงฆาเชอทความดน 1.07 กโลกรมตอตารางเซนตเมตร เปนเวลา 15 นาท เพาะเลยงทอณหภม 26+2 องศาเซลเซยส ใหแสง 14 ชวโมงตอวน ความเขมแสง 8.73ไมโครโมลตอตารางเมตรตอวนาท บนทกการพฒนาของแคลลสชนดตางๆขนาดของ EC และ HE โดยยายเลยงทกเดอน เปนเวลา 3 เดอน

28

ภาพท 1 EC ทชกน าจากใบออนทยงไมคลของปาลมน ามนตนโตทใหผลผลตด อาย 10 ป ซงวาง เลยงบนอาหารแขงสตร MS เตม dicamba เขมขน 0.3 มลลกรมตอลตร กรดแอสคอรบค

เขมขน 200 มลลกรมตอลตร น าตาลซโครสเขมขน 0.17 โมลาร หลงจากวางเลยงเปนเวลา 1 เดอน (บาร 5 มลลเมตร)

1.2 การชกน า SE

น า EC จากการเพาะเลยงบนอาหารแขงสตร MS เตม dicamba เขมขน 0.3 มลล-

กรมตอลตร รวมกบกรดแอสคอรบคเขมขน 200 มลลกรมตอลตร มาเพาะเลยงบนอาหารแขงสตร MS เตม dicamba เขมขน 0.1 มลลกรมตอลตร รวมกบกรดแอสคอรบคเขมขน 200 มลลกรมตอลตร เตมน าตาลซโครส 3 เปอรเซนต ปรบความเปนกรด-ดาง เปน 5.7 และเตมวน 0.75 เปอรเซนต นงฆาเชอทความดน 1.07 กโลกรมตอตารางเซนตเมตร เปนเวลา 15 นาท วางเลยงทสภาพแวดลอมเดยวกบการชกน า และเพมปรมาณ EC ในขอ 1.1 บนทกอตราการสรางและจ านวนของ HE หลงจากเพาะเลยงเปนเวลา 1 เดอน

1.3 การชกน า SSE

น า HE มาเพาะเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญ-เตบโต เตมน าตาลซอรบทอลเขมขน 0.2 โมลาร และกรดแอสคอรบคเขมขน 200 มลลกรมตอลตร ปรบความเปนกรด-ดาง เปน 5.7 และเตมวน 0.75 เปอรเซนต นงฆาเชอทความดน 1.07 กโลกรมตอตารางเซนตเมตร เปนเวลา 15 นาท วางเลยงทสภาพแวดลอมเดยวกบการชกน า SE ในขอ 1.2

29

บนทกเปอรเซนตการงอกเปนยอดหรอตนทสมบรณ การสราง SSE และจ านวน SSE/HE หลงจากเพาะเลยงเปนเวลา 3 เดอน น า SSE ทชกน าไดจากการเพาะเลยง HE บนอาหารแขงสตร MS เตมน าตาลซอรบทอลเขมขน 0.2 โมลาร มาเปนชนสวนเรมตนในการทดลองดวยสารโคลชซน และ ออรซาลน 2. ศกษาการชกน าใหเกดพอลพลอยดโดยสารโคลชซน และออรซาลน 2.1 ผลของโคลชซน และออรซาลนตอเปอรเซนตการรอดชวต

ใชกลมชนสวน SSE ทชกน าจาก HE เพยง 1 ชด ซงประกอบดวย SSE ในระยะทอรปโด จ านวน 10 - 15 SSE (ภาพท 2) มาเพาะเลยงในอาหารเหลวสตร MS เตมสารละลายโคล-ชซนหรอออรซาลนทระดบความเขมขน และระยะเวลาตาง ๆ ในกรณสารละลายโคลชซน ใชความเขมขน 0 0.05 0.10 0.15 และ 0.20 เปอรเซนต ส าหรบสารละลายออรซาลน ใชความเขมขน 0 0.001 0.002 0.003 และ 0.004 เปอรเซนต โดยแบงการทดลองเปน 2 ชดคอ ชดท 1 จมแชกลม SSE ในสารละลายโคลชซน หรอออรซาลน (ภาพท 3ก) เปนเวลา 12 24 และ 48 ชวโมง หลงจากน นจงย ายชนสวนไปเพาะเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโต สวนการทดลองชดท 2 ใชโคลชซน หรอออรซาลนความเขมขนดงกลาวเททบ (overlay) บนอาหารแขงสตรเดยวกนกบการทดลองชดท 1 (ภาพท 3ข) ซงเพาะเลยงชนสวนพช เปนเวลา 1 และ 2 สปดาห จงยายไปเลยงบนอาหารแขงสตรเดม แตละหนวยการทดลองใชกลม SSE จ านวน 10 กลมตอซ า ท า 3 ซ า บนทกเปอรเซนตการรอดชวต เปรยบเทยบกนในแตละวธการใหสาร ชนด และความเขมขนของโคลชซน หรอออรซาลน หลงจากทรตและยายไปเพาะเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโตเปนเวลา 1 เดอน เพอหาความเขมขนของสารทยบย งการเจรญเตบโต 50 เปอรเซนต โดยใชแผนการทดลองแบบแฟกทอเรยล 2 ปจจย ในแผนแบบสมสมบรณ (completely randomize design : CRD) และเปรยบเทยบความแตกตางคาเฉลยโดยวธ Duncan’s multiple range test (DMRT)

30

ภาพท 2 กลม SSE ระยะทอรปโด ทชกน าจาก HE เพยง 1 ชด (บาร 7 มลลเมตร)

ภาพท 3 วธการทรตกลม SSE ดวยสารละลายโคลชซน หรอออรซาลน

ก การทดลองชดท 1 กลม SSE จมแชในอาหารเหลวสตร MS ทเตมโคลชซน และออร-ซาลน ความเขมขนตางๆ เปนเวลา 12 24 และ 48 ชวโมง จากนนจงยายเลยงบนอาหารแขงสตรเดม (บาร 2 เซนตเมตร)

ข การทดลองชดท 2 กลม SSE ทวางเลยงบนอาหารแขงสตร MS เททบดวยอาหารเหลวสตรเดยวกน ทเตมโคลชซน และออรซาลน ความเขมขนเดยวกนกบการทดลองชดท 1 เปนเวลา 1 และ 2 สปดาห จงยายไปเลยงบนอาหารแขงสตรเดม (บาร 2 เซนตเมตร)

ก

ก

ข

31

2.2 ผลของโคลชซน และออรซาลนตอการเจรญ และพฒนาของตนกลา หลงจากศกษาเปอรเซนตรอดชวตของกลม SSE บนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโตเปนเวลา 30 วน ในขอ 2.1 แลว น ากลม SSE ไปเพาะเลยงบนอาหารใหมสตรเดม และเพาะเลยงตออกเปนเวลา 30 วน เพอชกน าการงอกของ SSE บนทกอตราการเจรญ การเกดยอด ใบ และราก เปรยบเทยบกนในแตละชดการทดลอง โดยใชแผนการทดลองแบบแฟกทอเรยล 2 ปจจย ในแผนแบบสมสมบรณ (CRD) และเปรยบเทยบคาเฉลยโดยใชวธ DMRT 3. การศกษาลกษณะพชดพลอยด และพอลพลอยดในหลอดทดลอง 3.1 การศกษาลกษณะทางสณฐานวทยา

3.1.1 ลกษณะภายนอกของตน ใบ และราก

เมอ SSE พฒนาเปนตนกลา น าตนกลาทยงไมมการสรางรากไปชกน าใหเกดราก โดยยายเลยงบนอาหารแขงสตร ARDA เตม NAA 0.5 มลลกรมตอลตร และกรดแอสคอรบค 200 มลลกรมตอลตร จากนนสมตวอยางจากแตละสงทดลองจ านวน10 ตน ตรวจสอบอตราการเจรญเตบโตเปรยบเทยบกน ส าหรบลกษณะสณฐานวทยาของใบ และรากนน สมเลอกตวอยางใบ 3 ใบ และ 3 ราก น ามาวดความยาว ความหนา และสงเกตสของใบ รปรางของใบ การเกดแขนงของราก จากตนทสมเลอกมาในแตละความเขมขนของโคลชซน และออรซาลน บนทกลกษณะดงกลาวในแตละสงทดลองเปรยบเทยบกนโดยใชแผนการทดลอง CRD เปรยบเทยบคาเฉลยในแตละชดการทดลองโดยใชวธ DMRT

3.1.2 ลกษณะภายนอกของดอก และผล

เมอตนกลาเกดดอกในหลอดทดลอง น าดอกมาศกษาลกษณะภายนอกภายใตกลอง SEM โดยเตรยมตวอยางดอกดงน คอ น าดอกตรงดวยสารละลาย glutaraldehyde (C5H8O2) เขมขน 2.5 เปอรเซนต เปนเวลา 1-2 ชวโมง ลางดวยฟอสเฟตบฟเฟอร 2-3 ครง ดงน าออกจากดอกโดยใชแอลกอฮอลความเขมขนเปนล าดบ (50-100 เปอรเซนต) ชนดละ 15-30 นาท

32

และท าดอกใหแหงจนถงระดบ critical point drying จากนนน าดอกตดบนแทน ใช carbon paint หรอ silver paint เปนตวยด น าดอกเคลอบทองดวยเครอง sputter coater (ภาพท 4) และศกษาดวยกลองจลทรรศนอเลคตรอนแบบสองกราด (SEM) ก าลงขยาย 1200 เทา เมอดอกมการพฒนาเปนผล ศกษาลกษณะของผล โดยน าผลปาลมศกษาภายใตกลองสเตอรโอ และศกษาเนอเยอของผลจากการผาตดตามขวาง และตามยาว ภายใตกลอง SEM เชนเดยวกบการศกษาของดอกขางตน บนทกภาพดวยกลอง SEM เปรยบเทยบกนในแตละสงทดลอง

ภาพท 4 ดอกตดบนแทน silver paint และ ผานการเคลอบทองดวยเครอง sputter coater

(บาร 0.2 เซนตเมตร)

3.2 การศกษาลกษณะทางสรรวทยา

3.2.1 รปราง ขนาด และความหนาแนนของเซลลคม

เมอ SSE พฒนาเปนตนกลา สมตวอยางตนกลาจากการทดลองท 3.1.1 จ านวน 10 ตน แตละตนใชตวอยางใบ 3 ใบ เตรยมตวอยางใบเชนเดยวกบการศกษาลกษณะภายนอกของดอก และผลในการศกษาท 3.1.2 บนทกขนาดของเซลลคม (ความกวางและความยาว) ความหนาแนนของเซลลคมตอพนท 25 มลลเมตร บรเวณทองใบ จากแตละความเขมขนของโคลช-ซน และออรซาลนภายใตกลอง SEM ก าลงขยาย 1200 เทา เปรยบเทยบกนโดยใชแผนการทดลองแบบ CRD เปรยบเทยบคาเฉลยในแตละชดการทดลองโดยใช DMRT

33

3.2.2 จ านวนเมดคลอโรพลาสตในเซลลคม

เมอ SSE พฒนาเปนตนกลา สมตวอยางตนกลาจากการทดลองท 3.1.1 จ านวน 10 ตน แตละตนใชตวอยางใบ 3 ใบ โดยสมลอกผวใบบรเวณทองใบเปนแผนบางๆ น ามาวางบนแผนสไลด หยดน ากลนลงบนชนสวนใบและปดดวยกระจกปดสไลด น ามาศกษาภายใตกลองจลทรรศนใชแสงแบบเชงประกอบ ก าลงขยาย 400 เทา บนทกจ านวน และขนาดเมดคลอโร พลาสต ในแตละความเขมขนของโคลชซน และออรซาลน ททดสอบเปรยบเทยบกนโดยใชแผนการทดลองแบบ CRD เปรยบเทยบคาเฉลยในแตละชดการทดลองโดยใชวธ DMRT

3.2.3 ปรมาณคลอโรฟลล

เมอ SSE พฒนาเปนตนกลา เกบรวบรวมใบตนกลาทคาดวาเปนตน เททระพลอยดจากการศกษาท 3.1.1 จ านวน 10 ตน หนก 0.1 กรมน าหนกสด มาสกดคลอโรฟลลโดยบดดวยสารละลายอะซโตนเขมขน 80 เปอรเซนต ปรมาตร 4 มลลลตร ในโกรงใหละเอยด กรองสารทสกดไดดวยกระดาษกรอง Whatman เบอร 1 น าสวนตะกอนทเหลอมาบดอกครงในสารละลายเดยวกน จากนนผสมสารทกรองไดครงท 1 และ 2 เขาดวยกน ปรบปรมาตรเปน 10 มลลลตร น ามาวดการดดกลนแสงดวยเครองดดกลนแสงทความยาวชวงคลน 645 และ 663 นาโน-เมตร และค านวณปรมาณของคลอโรฟลลเอ คลอโรฟลลบ และคลอโรฟลลรวม โดยดดแปลงจากสตรของ Witham และคณะ (1986) อางโดยราตร (2540) ดงน คอ

chlorophyll a = [12.7 (D663) – 2.69 (D645) ] x V 1000 x W

chlorophyll b = [22.9 (D645) – 4.68 (D663) ] x V 1000 x W

total chlorophyll = [20.2 (D663) + 8.02 (D645) ] x V 1000 x W

D645 = การดดกลนแสงทความยาวคลน 645 นาโนเมตร D663 = การดดกลนแสงทความยาวคลน 663 นาโนเมตร V = ปรมาตรคลอโรฟลลรวม W = น าหนกใบ

34

3.3 การตรวจสอบลกษณะทางเซลลวทยา

3.3.1 ศกษาจ านวนโครโมโซมจากเซลลปลายราก

เกบตวอยางเซลลปลายรากจากตนทคดเลอกภายใตสภาวะปลอดเชอ ซงคาดวาเปนตนเททระพลอยด และตนควบคม ในชวงเวลา 11.00 - 14.00 น. แตละสงทดลอง (ความเขมขนและระยะเวลาการจมแชในโคลชซน) ใชจ านวนตน 5 ตน แตละตนใช 2 ราก และศกษาดวยวธ Feulgen squash ซงดดแปลงจากวธการของ Sharma และ Sharma (1980) ดงนคอ เลอกปลายรากทมลกษณะขาวใสปลายขนเลกนอยตดใหมความยาว 1 เซนตเมตร ใสในสารละลายอมตวพาราไดคลอโรเบนซน เกบทอณหภม 10 องศาเซลเซยส นาน 4 - 5 ชวโมง ลางดวยน ากลน 1-2 ครง หลงจากนนคงสภาพรากในน ายาฟกเซทฟ (fixative) ทประกอบดวยเอธลแอลกอฮอล 95เปอรเซนต กบกรดเกลเชยลอะซตกในอตราสวน 3:1 เกบทอณหภม 10 องศาเซลเซยส นาน 24 ชวโมง ลางรากดวยเอธลแอลกอฮอล 95 เปอรเซนต 1 - 2 ครง จากนนน ารากมาไฮโดรไลซสในกรดเกลอเขมขน 1 นอรมล ทอณหภม 60 องศาเซลเซยส นาน 10 นาท ยอมสดวยคารบอลฟกซนนาน 4 - 5 ชวโมง ตรวจสอบจ านวนโครโมโซมภายใตกลองจลทรรศนใชแสงแบบเชงประกอบ ก าลงขยาย 1000 เทา บนทกภาพโครโมโซมปลายรากระยะเมทาเฟส เปรยบเทยบกนระหวางตนควบคม และตนซงคาดวาเปนตนเททระพลอยด 3.3.2 การศกษาปรมาณดเอนเอโดยโฟลไซโทเมทร น าชนสวนใบจากตนกลาทคาดวาเปนตนเททระพลอยด และตนควบคมจากการทดลองท 3.1.1 มาเปนตวอยางพชทใชศกษา แตละสงทดลอง (ความเขมขนและระยะเวลาการจมแชในโคลชซน) ใชตนกลา 10 ตน แตละตนใช 1 ใบ มาวเคราะหปรมาณดเอนเอเพอยนยนการเกดเททระพลอยดตามวธการของ Uozu และคณะ (1997) ดงนคอ น าใบออนหนกประมาณ 30 มลลกรม ใสลงในจานเพาะเลยงขนาดเลก เตมสารละลายบฟเฟอร ปรมาตร 1000 ไมโครลตร สบชนสวนดวยใบมดโกนใหละเอยด กรองสารละลายดวยผากรองขนาด 20 ไมโครเมตรใสหลอดทดลองขนาดเลก จากนนเตมสารละลาย PI ปรมาตร 50 ไมโครลตร เกบทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 15 นาท จงน าตวอยางทไดมาวเคราะหดวยเครองโฟลไซโทรมเตอร โดยการนบนวเคลยสของปาลมน ามน 4,000 นวเคลยส ตอตวอยาง วเคราะหผลทได และเปรยบเทยบปรมาณดเอนเอของตนทคาดวาเปนตนเททระพลอยด และตนควบคม เพอหาระดบพลอยดดวยเครอง FACS Calibur

35

cytometer โดยใชดเอนเอของขาวญปนสายพนธ Nipponbare [Oryza sativa (cv. ‘Nipponbare’] ซงทราบระดบพลอยดแนนอนแลวเปน DNA มาตรฐาน ค านวณปรมาณดเอนเอดงสมการตอไปน

sample (2C DNA) = G1peak channel of sample X 0.91 pg G1peak channel of Oryza sativa

36

บทท 3

ผล 1. การเพาะเลยงเนอเยอปาลมน ามน

1.1 การชกน า และเพมปรมาณ EC

การเพาะเลยง EC บนอาหารแขงสตร MS เตม dicamba เขมขน 0.3 มลลกรมตอลตร รวมกบกรดแอสคอรบคเขมขน 200 มลลกรมตอลตร น าตาลซโครส 3 เปอรเซนต ปรบความเปนกรด-ดาง เปน 5.7 และเตมวน 0.75 เปอรเซนต โดยยายเลยงทกเดอน เปนเวลา 3 เดอน ใหการเพมขนาดเสนผานศนยกลางของกอนแคลลส 0.2 เซนตเมตร แคลลสมสน าตาลออน และให SE เฉลยสงถง 16.55 เอมบรโอตอหลอดทดลอง (ภาพท 5) ลกษณะของ EC ทเกดขนมโครงสรางกลม ขนาดเลก สเหลอง

ภาพท 5 ลกษณะการพฒนาของ SE (ศรช) บนอาหารแขงสตร MS รวมกบกรดแอสคอรบคเขมขน

200 มลลกรมตอลตร เตม dicamba เขมขน 0.3 มลลกรมตอลตร ยายเลยงทกเดอนเปนเวลา 3 เดอน (บาร 5 มลลเมตร)

SE

37

1.2 การชกน า HE

เมอยาย EC ทม SE รวมอยดวย ไปเพาะเลยงบนอาหารแขงสตร MS เตม dicamba เขมขน 0.1 มลลกรมตอลตร รวมกบกรดแอสคอรบคเขมขน 200 มลลกรมตอลตร เปนเวลา 1 เดอน สงเสรมการสรางเอมบรโอระยะสรางจาว (HE) ได จ านวน HE ทสรางเฉลยสงสด 9 เอมบรโอตอหลอดทดลอง ลกษณะของ HE ทเกดขนมโครงสรางไมแนนอนและมสเขยว (ภาพท 6)

ภาพท 6 ลกษณะของ HE (ศรช) จากการเพาะเลยง EC บนอาหารแขงสตร MS รวมกบกรด แอสคอรบคเขมขน 200 มลลกรมตอลตร เตม dicamba เขมขน 0.1 มลลกรมตอลตร เปน เวลา 1 เดอน (บาร 5 มลลเมตร)

1.3 การชกน า SSE

จากการน า HE มาเพาะเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโต เตมกรดแอสคอรบคเขมขน 200 มลลกรมตอลตร และน าตาลซอรบทอลเขมขน 0.2 โมลาร เปนเวลา 3 เดอน พบวา HE เรมมขนาดใหญขน และสราง SSE จ านวนมาก เฉลย 20 SSE ตอ HE แตยงไมเกด ยอดและราก (ภาพท 7)

HE

38

ภาพท 7 ลกษณะของ SSE หลงจากเพาะเลยง HE บนอาหารแขงสตร MS เตมกรดแอสคอรบค

เขมขน 200 มลลกรมตอลตร รวมกบน าตาลซอรบทอลเขมขน 0.2โมลาร เปนเวลา 3 เดอน (บาร 5 มลลเมตร)

2. ศกษาการชกน าใหเกดพอลพลอยดโดยสารโคลชซน และออรซาลน 2.1 ผลของโคลชซน และออรซาลนตอเปอรเซนตการรอดชวต 2.1.1 วธการการจมแช

ผลของโคลชซน และออรซาลนตอเปอรเซนตรอดชวตของ SSE เมอยาย กลมของ SSE ทพฒนาบน HE ซงผานการจมแชในสารละลายโคลชซน และออรซาลนความเขมขนตางๆ ไปเพาะเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโต เปนเวลา 30 วน พบวาชนสวนทไดรบสารโคลชซน ความเขมขน 0.05 0.10 0.15 และ 0.20 เปอรเซนต ทระยะเวลา 12 ชวโมง ใหเปอรเซนตการรอดชวต 80 68.78 56.22 และ 50.56 เปอรเซนต ตามล าดบ และทระยะเวลา 24 ชวโมง ใหเปอรเซนตการรอดชวต 70.11 57.33 48.66 และ 42 เปอรเซนต ตามล าดบ และเมอใหสารเปนเวลานานขนเปน 48 ชวโมง ใหเปอรเซนตการรอดชวตลดลง 41 26.55 12.11 และ 0 เปอรเซนต ตามล าดบ จากการพจารณาเปอรเซนตการรอดชวตโดยเฉลย พบวาเปอรเซนตการรอดชวตของ SSE ลดลง หลงจากจมแชดวยโคลชซนความเขมขนสงขน และการใหสารเปนระยะเวลานานขน สงผลใหเปอรเซนตการรอดชวตลดลงแตกตางอยางมนยส าคญทางสถต (p ≤

0.01) (ตารางท 1) เมอวเคราะหคา LD50 ในแตละความเขมขน และเวลาตางๆ พบวา คา LD50

HE

SSE

SSE

SSE

SSE

39

ส าหรบการจมแชโคลชซน 12 24 และ 48 ชวโมงคอ 0.185 0.149 และ 0.075 เปอรเซนต ตามล าดบ (ภาพท 8) ตารางท 1 ผลของความเขมขน (ปจจย A) และระยะเวลาการจมแชสารโคลชซน (ปจจย B) ตอ

เปอรเซนตการรอดชวตของ SSE หลงจากยายเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโตเปนเวลา 30 วน (n=30)

โคลชซน (%)

เปอรเซนตการรอดชวต ± SE หลงจากจมแชเปนเวลา เฉลย

F-test (A)

12 ชวโมง 24 ชวโมง 48 ชวโมง 0 100.00±0.00 a 100.00±0.00a 100.00±0.00a 100.00±0.00A

0.05 80.00±2.27b 70.11±1.72c 41.00±1.90f 63.70±4.13B

0.10 68.78±2.45c 57.33±2.38d 26.55±2.25g 50.89±4.33C **

0.15 56.22±2.06d 48.66±1.99e 12.11±1.89h 38.99±4.02D

0.20 50.56±1.95e 42.00±2.03f 0.00±1.61i 30.85±4.06E

เฉลย 71.11±4.27A 63.62±4.57B 35.93±5.62C

F-test (B) **

F-test (AXB) **

C.V. (%) 6.704

**แตกตางอยางมนยส าคญทางสถต (p≤ 0.01) คาเฉลยทก ากบดวยอกษรรวมกนในสดมภเดยวกนไมมความแตกตางทางสถตเมอเปรยบเทยบดวย DMRT

40

ภาพท 8 เปอรเซนตการรอดชวต 50 เปอรเซนต (LD50) ของ SSE ทจมแชดวยโคลชซนความเขมขน และเวลาตางๆ หลง จากยายเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการ เจรญเตบโตเปนเวลา 30 วน ส าหรบการจมแช SSE ในสารออรซาลน ทความเขมขนตางๆ เปนเวลา 12 24 และ 48 ชวโมง หลงจากนนยายชนสวนไปเพาะเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโต เปนเวลา 30 วน พบวาชนสวนทไดรบสารออรซาลน ความเขมขน 0.001 0.002 0.003 และ 0.004 เปอรเซนต ทระยะเวลา 12 ชวโมง ใหเปอรเซนตรอดชวต 84.11 72.74 60.54 และ 44.02 เปอรเซนต ตามล าดบ สวนการใหสารทความเขมขนเดยวกน เปนเวลา 24 ชวโมง ใหเปอรเซนตการรอดชวต 70.00 56.58 45.00 และ 32.34 เปอรเซนต ตามล าดบ และเมอใหสารเปนเวลานานขนเปน 48 ชวโมง ใหเปอรเซนตการรอดชวต 49.03 28.44 13.77 และ 5.11 เปอรเซนต ตามล าดบ จากการพจารณาเปอรเซนตการรอดชวตโดยเฉลย พบวาเปอรเซนตการรอดชวตของ SSE ลดลง หลงจากจมแชดวยออรซาลนความเขมขนสงขน และการใหสารเปนระยะเวลานานขน สงผลใหเปอรเซนตการรอดชวตลดลงแตกตางอยางมนยส าคญทางสถต (p ≤ 0.01) (ตารางท 2) เมอวเคราะหคา LD50 ในแตละความเขมขน และเวลาตางๆ นน พบวาคา LD50 จากการจมแชออรซาลน เปนเวลา 12 24 และ 48 ชวโมงคอ 0.0015 0.0028 และ 0.0037 เปอรเซนต ตามล าดบ (ภาพท 9)

y = -12.267x + 107.91

y = -13.744x + 104.86

y = -22.889x + 104.6

-20

-10

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 0.05 0.1 0.15 0.2

12 ชม 24 ชม 48 ชม เชงเสน (12 ชม) เชงเสน (24 ชม) เชงเสน (48 ชม)

เปอรเซนต

รอดช

วต (%

)

สารโคลชซน (%)

LD50 = 0.075 LD50 = 0.149 LD50 = 0.185

41

ตารางท 2 ผลของความเขมขน (ปจจย A) และระยะเวลาการจมแชสารออรซาลน (ปจจย B) ตอเปอรเซนตการรอดชวตของ SSE หลงจากยายเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโตเปนเวลา 30 วน (n=30)

ออรซาลน (%)

เปอรเซนตการรอดชวต ± SE หลงจากจมแชเปนเวลา เฉลย

F-test 12 ชวโมง 24 ชวโมง 48 ชวโมง (A)

0 100±0.00a 100±0.00a 100±0.00a 100±0.00A 0.001 84.11±2.32b 70.00±2.09c 49.03±2.03f 61.71±3.83B 0.002 72.74±2.13c 56.58±2.85e 28.44±2.21i 52.59±4.33C ** 0.003 60.54±2.48d 45.00±2.20g 13.77±1.93j 39.77±4.43D 0.004 44.02±2.07g 32.34±1.606h 5.11±1.73k 27.16±4.01E เฉลย 72.28±4.50A 60.78±4.90B 39.27±5.85C

F-test (B) ** F-test (AXB) **

C.V. (%) 7.75 **แตกตางอยางมนยส าคญทางสถต (p≤ 0.01) คาเฉลยทก ากบดวยอกษรรวมกนในสดมภเดยวกนไมมความแตกตางทางสถตเมอเปรยบเทยบดวย DMRT

ภาพท 9 เปอรเซนตการรอดชวต 50 เปอรเซนต (LD50) ของ SSE ทจมแชดวยออรซาลนความเขม- ขน และเวลาตางๆ หลงจากยายเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการ เจรญเตบโตเปนเวลา 30 วน

y = -13.553x + 112.94

y = -16.032x + 108.88

y = -22.504x + 106.78 -

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 0.001 0.002 0.003 0.004

12 ชม 24 ชม 48 ชม เชงเสน (12 ชม) เชงเสน (24 ชม) เชงเสน (48 ชม)

LD50 = 0.0028

LD50 = 0.0037

LD50 = 0.0015

เปอรเซนต

รอดช

วต (%

)

สารออรซาลน (%)

42

2.1.2 การเททบดวยอาหารเหลวเตมโคลชซน และออรซาลน ผลของการเททบดวยอาหารเหลวทเตมโคลชซน และออรซาลน ความเขมขนตางๆ บนชนสวน HE ทพฒนาให SSE ซงเพาะเลยงบนอาหารแขงสตร MS เปนเวลา 1 และ 2 สปดาห แลวยายไปเพาะเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโต เปนเวลา 30 วน พบวา ชนสวนทไดรบสารโคลชซนความเขมขน 0.05 0.10 0.15 และ 0.20 เปอรเซนต ทระยะเวลา 1 สปดาห ใหเปอรเซนตการรอดชวต 45.44 31.02 14.00 และ 3.11 เปอรเซนต ตามล าดบ สวนการใหสารทความเขมขนเดยวกนเปนเวลา 2 สปดาห ใหเปอรเซนตการรอดชวต 33.00 20.20 8.11 และ 0 เปอรเซนต ตามล าดบ จากการพจารณาเปอรเซนตการรอดชวตโดยเฉลย พบวาเปอรเซนตการรอดชวตของ SSE ลดลง หลงจากเททบดวยโคลชซนความเขมขนสงขน และการใหสารเปนระยะเวลานานขนสงผลใหเปอรเซนตการรอดชวตลดลงแตกตางอยางมนยส าคญทางสถต (p ≤ 0.01) เชนเดยวกน (ตารางท 3) เมอวเคราะหคา LD50 ของชนสวน SSE ทจมแชโคลชซน เปนเวลา 1 และ 2 สปดาห ใหคา 0.063 และ 0.075 เปอรเซนต ตามล าดบ (ภาพท 10)

ตารางท 3 ผลของความเขมขน (ปจจย A) และระยะเวลาการเททบดวยอาหารเหลวทเตมโคลชซน (ปจจย B) ตอเปอรเซนตการรอดชวตของ SSE หลงจากยายเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโตเปนเวลา 30 วน (n=30)

โคลชซน (%)

เปอรเซนตการรอดชวต ± SE หลงจากเททบอาหารเหลวเตมโคลชซนเปนเวลา เฉลย

F-test (A)

1 สปดาห 2 สปดาห 0 100±0.00a 100±0.00a 100±0.00A

0.05 45.44±0.53b 33.00±1.00c 39.22±2.63B 0.10 31.02±1.23d 20.20±0.51e 25.61±2.48C ** 0.15 14.00±0.24f 8.11±0.39g 11.05±1.80D 0.20 3.11±0.56h 0.00±0.00i 1.55±1.33E เฉลย 38.71±5.91A 32.26±6.07B

F-test (B) ** F-test (AXB) **

C.V. (%) 1.692 **แตกตางอยางมนยส าคญทางสถต (p≤ 0.01) คาเฉลยทก ากบดวยอกษรรวมกนในสดมภเดยวกนไมมความแตกตางทางสถตเมอเปรยบเทยบดวย DMRT

43

ภาพท 10 เปอรเซนตการรอดชวต 50 เปอรเซนต (LD50) ของ SSE ทเททบดวยอาหารเหลวเตม

โคลชซนความเขมขน และเวลาตางๆ แลวยายไปเพาะเลยงบนอาหารแขงสตร MS ท

ปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโตเปนเวลา 30 วน ส าหรบผลของการเททบดวยอาหารเหลวทเตมออรซาลนความเขมขนตางๆ บนชนสวน HE ทม SSE ซงเพาะเลยงบนอาหารแขงสตร MS เปนเวลา 1 และ 2 สปดาห แลวยายชนสวนไปเพาะเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโต เปนเวลา 30 วน พบวาชนสวนทไดรบสารออรซาลนความเขมขน 0.001 0.002 0.003 และ 0.004 เปอรเซนต ทระยะเวลา 1 สปดาห ใหเปอรเซนตการรอดชวต 52.02 39.11 21.00 และ 9.11 เปอรเซนต ตามล าดบ สวนการใหสารทความเขมขนเดยวกน เปนเวลา 2 สปดาห ใหเปอรเซนตการรอดชวต 34.05 18.02 9.44 และ 3 เปอรเซนต ตามล าดบ จากการพจารณาเปอรเซนตการรอดชวตโดยเฉลย พบวาเปอรเซนตการรอดชวตของ SSE ลดลง หลงจากเททบดวยออรซาลนความเขมขนสงขน และการใหสารเปนระยะเวลานานขนสงผลใหเปอรเซนตการรอดชวตลดลงแตกตางอยางมนยส าคญทางสถต (p ≤ 0.01) เชนเดยวกน (ตารางท 4) เมอวเคราะหคา LD50 ในแตละความเขมขน และเวลาตางๆ นน พบวาคา LD50 ส าหรบการเททบดวยออรซาลน เปนเวลา 1 และ 2 สปดาหคอ 0.0012 และ 0.0018 เปอรเซนต ตามล าดบ (ภาพท 11)

y = -22.522x + 106.28

y = -22.489x + 99.693

-20

-10

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 0.05 0.1 0.15 0.2

1 สปดาห

2 สปดาห

เชงเสน (1 สปดาห)

เชงเสน (2 สปดาห) LD50 = 0.075 %

LD50 = 0.063 %

สารโคลชซน (%)

เปอรเซนต

รอดช

วต (%

)

44

ตารางท 4 ผลของความเขมขน (ปจจย A) และระยะเวลาการเททบดวยอาหารเหลวทเตมออรซาลน (ปจจย B) ตอเปอรเซนตการรอดชวตของ SSE หลงจากยายเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโตเปนเวลา 30 วน (n=30)

ออรซาลน (%)

เปอรเซนตการรอดชวต ± SE หลงจากเททบอาหารเหลวเตมออรซาลนเปนเวลา เฉลย

F-test (A)

1 สปดาห 2 สปดาห 0 100.00±0.00a 100.00±0.00a 100±0.00A

0.001 52.02± 1.00b 34.05±1.23d 43.03±3.12B 0.002 39.11±0.31c 18.02±1.00f 28.56±3.40C ** 0.003 21.00±1.00e 9.44±0.75g 15.22±2.53D 0.004 9.11±1.23g 3.00±0.00h 6.05±1.89E เฉลย 44.25±5.70A 32.90±6.03B

F-test (B) ** F-test (AXB) **

C.V. (%) 2.318 **แตกตางอยางมนยส าคญทางสถต (p≤ 0.01) คาเฉลยทก ากบดวยอกษรรวมกนในสดมภเดยวกนไมมความแตกตางทางสถตเมอเปรยบเทยบดวย DMRT

ภาพท 11 เปอรเซนตการรอดชวต 50 เปอรเซนต (LD50) ของ SSE ทเททบดวยอาหารเหลวเตมออ- รซาลนความเขมขนตางๆ แลวยายเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคม การเจรญเตบโตเปนเวลา 30 วน

y = -21.28x + 108.09

y = -21.861x + 98.485 -20

-10

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 0.001 0.002 0.003 0.004

1 สปดาห 2 สปดาห เชงเสน (1 สปดาห) เชงเสน (2 สปดาห)

LD50 = 0.0018 % LD50 = 0.0012 %

เปอรเซนต

รอดช

วต (%

)

สารออรซาลน (%)

45

2.2 ผลของโคลชซน และออรซาลนตอการเจรญ และการพฒนาของตนกลา 2.2.1 โคลชซน การพฒนาเปนตนกลาของชนสวน HE ทม SSE ทจมแชในสารละลาย โคลชซน ทระดบความเขมขน และระยะเวลาตางๆ นน หลงจากเพาะเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโตเปนเวลา 30 วน พบวาโคลชซนความเขมขน 0.10 เปอรเซนต ทเวลา 12 ชวโมง เกดการพฒนาเปนยอด ใบ และรากไดดทสด โดยมจ านวนยอด ใบ และรากเฉลย 4 ยอด 2.34 ใบ และ 2.87 รากตอ SSE ตามล าดบ สวนโคลชซนความเขมขน 0.20 เปอรเซนต ทเวลา 24 ชวโมง เกดโซมาตกเอมบรโอระยะสกแก (mature somatic embryo : MSE) เพมจ านวนมากทสด 14 เอมบรโอตอ SSE (ตารางท 5) จากการพจารณาผลของความเขมขนของโคลชซน และระยะเวลาการใหสารโดยเฉลย ตอการพฒนาเปนยอด และ MSE พบวาการพฒนาเปนยอดลดลงแตกตางอยางมนยส าคญทางสถต (p ≤ 0.01) เมอความเขมขนโคลชซนเพมขน และเกด MSE จ านวนมากขนหลงจากจมแชดวยโคลชซนความเขมขนสงขน โดยโคลชซนความเขมขน 0.20 เปอรเซนต ให MSE เฉลยมากทสด คอ 8.67 เอมบรโอ (ภาพท 12) นอกจากนยอดของตนกลาทผานการจมแชโคลชซน มลกษณะบวม ซด และชนสวนทไดรบสารโคลชซนความเขมขนสง ระยะเวลานาน สงผลใหเนอเยอไหม ตาย และบางชนสวนไมสามารถพฒนาเปนตนกลาได (ภาพท 13-15)

ภาพท 12 พฒนาการของยอด และ MSE จาก SSE ทจมแชดวยโคลชซนความเขมขนตางๆ เฉลย

จาก 3 ระยะเวลา (12 24 และ 48 ชวโมง) แลวยายเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโตเปนเวลา 30 วน

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

1 2 3 4 5

ยอด (ยอด)

MSE (เอมบรโอ)

0 0.05 0.10 0.15 0.20 สารโคลชซน (%)

จ านว

น

46

ตารางท 5 จ านวนยอด ใบ ราก และโซมาตกเอมบรโอระยะสกแกทพฒนาจาก SSE ทรอดชวตจาก การจมแชโคลชซนทความเขมขน และเวลาตางๆ แลวยายไปเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโตเปนเวลา 30 วน

โคลชซน(%)

ระยะเวลา (ชม.)

จ านวนยอด ± SE (ยอด)

จ านวนใบ ± SE (ใบ)

จ านวนราก ± SE (ราก)

จ านวน MSE ± SE (เอมบรโอ)

0.00 0 3 ± 0.00ab 4 ± 0.00a 0b 0e

เฉลย 3 ± 0.00A 4 ± 0.00A 0B 0D 0.05 12 3± 0.00ab 2 ± 0.00b 0b 2 ± 0.00d

24 3 ± 1.00ab 2 ± 0.00b 0b 0e 48 3 ± 0.00ab 2 ± 0.00b 0b 0e

เฉลย 3 ± 0.71A 2 ± 0.71B 0B 0.67 ± 1.00C 0.10 12 4 ± 0.00a 2.34 ± 0.76b 2.67 ± 0.76a 4 ± 1.00c

24 2 ± 1.00b 2 ± 0.00b 0b 0e

48 2 ± 1.00b 2 ± 0.00b 0b 0e เฉลย 2.67 ± 1.11A 2 ± 0.58B 0.89 ± 1.17A 1.33 ± 1.44BC

0.15 12 2 ± 0.00ab 0c 0b 3 ± 1.00cd

24 2 ± 0.00b 0c 0b 2 ± 0.00d

48 2 ± 0.00b 0c 0b 0e เฉลย 2.33 ± 0.71A 0D 0B 1.67 ± 1.19B

0.20 12 3 ± 0.00ab 2 ± 0.00b 0b 12 ± 1.00b

24 0c 0c 0b 14 ± 1.00a

48 0c 0c 0b 0e เฉลย 1 ± 1.22B 0.67 ± 1.00C 0B 8.67 ± 2.57A

F-test ** ** ** ** C.V. (%) 20.83 30.00 18.62 19.49

**แตกตางอยางมนยส าคญทางสถต (p≤ 0.01) คาเฉลยทก ากบดวยอกษรรวมกนในสดมภเดยวกนไมมความแตกตางทางสถตเมอเปรยบเทยบดวย DMRT

47

ภาพท 13 พฒนาการของ SSE ทรอดชวตจากการจมแชดวยสารละลายโคลชซนเปนเวลา 12 ชวโมง แลวยายไปเพาะเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโตเปนเวลา 30 วน (บาร 4 มลลเมตร)

ก. ตนกลาทพฒนาจาก SSE ทไมไดแชโคลชซน (ชนสวนควบคม) ข. ยอด และใบทพฒนาจาก SSE ทแชโคลชซนความเขมขน 0.05 เปอรเซนต ค. ยอด และรากทพฒนาจาก SSE ทแชโคลชซนความเขมขน 0.10 เปอรเซนต ง. ยอด ทพฒนาจาก SSE ทแชโคลชซน ความเขมขน 0.15 เปอรเซนต จ. ยอด และโซมาตกเอมบรโอระยะสกแก ทพฒนาจาก SSE ทแชโคลชซนความ เขมขน 0.20 เปอรเซนต

shoot

mature somatic embryo

roots

shoots

shoot

leave

shoot leave

ก

ข ค

ง จ

shoots

48

ภาพท 14 พฒนาการ SSE ทรอดชวตจากการจมแชดวยสารละลายโคลชซนเปนเวลา 24 ชวโมง แลวยายไปเพาะเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโต เปนเวลา 30 วน (บาร 4 มลลเมตร) ก. ยอด และใบทพฒนาจาก SSE ทแชโคลชซน ความเขมขน 0.05 เปอรเซนต ข. ยอด ทพฒนาจาก SSE ทแชโคลชซน ความเขมขน 0.10 เปอรเซนต ค. ยอด ทพฒนาจาก SSE ทแชโคลชซน ความเขมขน 0.15 เปอรเซนต ง. โซมาตกเอมบรโอระยะสกแก ทพฒนาจาก SSE ทแชโคลชซนความเขมขน 0.20 เปอรเซนต

shoot

shoot

mature somatic embryo

shoot

leave

ก ข

ค ง

49

ภาพท 15 พฒนาการ SSE ทรอดชวตจากการจมแชดวยสารละลายโคลชซนเปนเวลา 48 ชวโมง แลวยายไปเพาะเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโต เปนเวลา 30 วน (บาร 4 มลลเมตร) ก. ยอด ทพฒนาจาก SSE ทแชโคลชซน ความเขมขน 0.05 เปอรเซนต ข. ยอดทพฒนาจาก SSE ทแชโคลชซน ความเขมขน 0.10 เปอรเซนต ค. ยอด ทพฒนาจาก SSE ทแชโคลชซน ความเขมขน 0.15 เปอรเซนต ง. โซมาตกเอมบรโอระยะสกแก ทพฒนาจาก SSE ทแชโคลชซนความเขมขน 0.20 เปอรเซนต

shoot

shoot

shoot

ก ข

ค ง

mature somatic embryo

shoot

shoot

50

2.2.2 ออรซาลน การพฒนาเปนตนกลาของ HE ทม SSE ทผานการจมแชสารละลายออรซา-ลน ทระดบความเขมขน และใหระยะเวลาตางๆ แลวยายไปเพาะเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโตเปนเวลา 30 วน พบวา ออรซาลนทกความเขมขนไมเกดราก สวนออรซาลนความเขมขน 0.001 เปอรเซนต ทเวลา 12 ชวโมง ใหการพฒนาเปนยอดไดดทสด 3 ยอด ตอ SSE และชนสวนทสามารถพฒนา และสรางใบได คอ ออรซาลนความเขมขน 0.001 และ 0.002 เปอรเซนต ทเวลา 12 ชวโมง ให 2 ใบตอตนกลา ส าหรบออรซาลนความเขมขน 0.003 เปอรเซนต ทเวลา 24 ชวโมง เกดโซมาตกเอมบรโอระยะสกแกเพมจ านวนมากทสด 5 เอมบรโอตอ SSE แตไมพฒนาเปนยอด รากและใบ (ตารางท 6) จากการพจารณาผลของความเขมขนของออร-ซาลน และระยะเวลาการใหสารโดยเฉลยตอการพฒนาเปนยอด และ MSE พบวาการพฒนาเปนยอดลดลงแตกตางอยางมนยส าคญทางสถต (p ≤ 0.01) เมอจมแชดวยออรซาลนความเขมขนสงขน และเกด MSE จ านวนเฉลยมากทสดเมอทรตดวยออรซาลนความเขมขน 0.003 เปอรเซนต อยางไรกตามเปอรเซนตการเกด MSE ลดลงแตกตางอยางมนยส าคญทางสถต (p ≤ 0.05) เมอจมแชดวยออร-ซาลนความเขมขนสงขน (ภาพท 16) ชนสวนทผานการแชสารออรซาลนทกความเขมขน มลกษณะบวม ซด การพฒนาเปนยอด และใบลดลงเมอไดรบออรซาลนระดบความเขมขนสงขน และใหเวลานานขน ภาพท (17-19)

ภาพท 16 พฒนาการของยอด และ MSE จาก SSE ทจมแชดวยออรซาลนความเขมขนตางๆ เฉลย

จาก 3 ระยะเวลา (12 24 และ 48 ชวโมง) แลวยายเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโตเปนเวลา 30 วน

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

1 2 3 4 5

ยอด (ยอด)

MSE (เอมบรโอ)

0 0.001 0.002 0.003 0.004 สารออรซาลน (%)

จ านว

น

51

ตารางท 6 แสดงจ านวนยอด ใบ ราก และโซมาตกเอมบรโอระยะสกแกของชนสวน SSE ท รอด ชวตจากการจมแชออรซาลนทความเขมขน และระยะเวลาตางๆ หลงจากยายไปเลยง บนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโตเปนเวลา 30 วน

ออรซาลน (%)

ระยะเวลา (ชม.)

จ านวนยอด (ยอด)

จ านวนใบ (ใบ)

จ านวนราก (ราก)

จ านวน MSE (เอมบรโอ)

0.00 0 3 ± 0.00a 4 ± 00a 0 0c

เฉลย 3 ± 0.00A 4 ± 00A 0 0C

0.001 12 3 ± 1.00a 2 ± 1.00b 0 0c 24 2 ±1.00b 2 ± 0.00b 0 0c 48 2 ± 0.00b 0c 0 0c

เฉลย 2.34 ± 0.84B 1.34 ± 1.06B 0 0C

0.002 12 2 ± 0.00b 2 ± 0.00b 0 0c 24 1 ± 0.00b 0c 0 0c 48 2 ± 0.00b 0c 0 0c

เฉลย 2 ± 0.00B 0.67 ± 1.00C 0 0C

0.003 12 2 ± 0.00b 0c 0 0c 24 0c 0c 0 5 ± 1.00a 48 0c 0c 0 0c

เฉลย 0.67 ± 1.00C 0D 0 1.67 ± 1.60A

0.004 12 0c 0c 0 0c 24 0c 0c 0 3 ± 0.00b 48 0c 0c 0 0c

เฉลย 0D 0D 0 1 ± 1.22B F-test ** ** - * C.V. (%) 20.04 36.07 - 45.09

** , * แตกตางอยางมนยส าคญทางสถต (p≤ 0.01) และแตกตางอยางมนยส าคญทางสถต (p≤ 0.05) คาเฉลยทก ากบดวยอกษรรวมกนในสดมภเดยวกนไมมความแตกตางทางสถตเมอเปรยบเทยบดวย DMRT

52

ภาพท 17 พฒนาการของ SSE ทรอดชวตจากการจมแชดวยออรซาลนเปนเวลา 12 ชวโมง แลว ยายไปเพาะเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโต เปน เวลา 30 วน (บาร 4 มลลเมตร) ก. ตนกลาทพฒนาจาก SSE ทไมไดแชออรซาลน (ชนสวนควบคม)

ข. ยอดทพฒนาจาก SSE ทแชออรซาลน ความเขมขน 0.001 เปอรเซนต ค. ยอดทพฒนาจาก SSE ทแชออรซาลน ความเขมขน 0.002 เปอรเซนต ง. ยอดทพฒนาจาก SSE ทแชออรซาลน ความเขมขน 0.003 เปอรเซนต จ. SSE ทแชออรซาลนความเขมขน 0.004 เปอรเซนต

ก

shoot leave

shoot

ข

shoot

ค

shoot

ง จ

53

ภาพท 18 พฒนาการของ SSE ทรอดชวตจากการจมแชดวยออรซาลนเปนเวลา 24 ชวโมง แลว ยายไปเพาะเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโต เปน เวลา 30 วน (บาร 4 มลลเมตร)

ก. ยอด ทพฒนาจาก SSE ทแชออรซาลน ความเขมขน 0.001 เปอรเซนต ข. ยอด ทพฒนาจาก SSE ทแชออรซาลน ความเขมขน 0.002 เปอรเซนต

ค. โซมาตกเอมบรโอระยะสกแกทพฒนาจาก SSE ทแชออรซาลนความเขมขน 0.003เปอรเซนต

ง. โซมาตกเอมบรโอระยะสกแกทพฒนาจาก SSE ทแชออรซาลนความเขมขน 0.004 เปอรเซนต

shoot

mature somatic embryo

ก ข

ค ง

shoot

mature somatic embryo

54

ภาพท 19 พฒนาการของ SSE ทรอดชวตจากการจมแชดวยออรซาลนเปนเวลา 48 ชวโมง แลว

ยายไปเพาะเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโต เปนเวลา 30 วน (บาร 4 มลลเมตร) ก. ยอด ทพฒนาจาก SSE ทแชออรซาลน ความเขมขน 0.001 เปอรเซนต ข. ยอด ทพฒนาจาก SSE ทแชออรซาลน ความเขมขน 0.002 เปอรเซนต ค. SSE ทแชออรซาลน ความเขมขน 0.003 เปอรเซนต ง. SSE ทแชออรซาลน ความเขมขน 0.004 เปอรเซนต

ค ง

shoot

ก

shoot

ข

shoot

55

2.3 ผลของการเททบดวยอาหารเหลวเตมโคลชซน และออรซาลน ตอการเจรญ และการพฒนาของตนกลา

2.3.1 โคลชซน การพฒนาเปนตนกลาของ SSE ทเททบดวยอาหารเหลวสตร MS ทเตมสารละลายโคลชซน ทระดบความเขมขน และระยะเวลาตางๆ แลวยายไปเพาะเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโต เปนเวลา 30 วน จากการพจารณาผลของความเขมขนของโคลชซน และระยะเวลาการใหสารโดยเฉลยตอการพฒนาเปนยอด พบวาการพฒนาเปนยอดลดลงเมอเททบดวยโคลชซนความเขมขนสงขนแตกตางอยางมนยส าคญทางสถต (p ≤

0.01) โดยเปอรเซนตการเกดยอดเฉลยสงสด 6.5 ยอด หลงจากเททบดวยโคลชซนความเขมขน 0.05 เปอรเซนต (ภาพท 20) และโคลชซนความเขมขน 0.05 เปอรเซนต ทเวลา 2 สปดาห ใหการพฒนาเปนยอดไดดทสด 8 ยอด ตอ SSE แตไมเกดใบ และราก โดยยอดมสเขยวเขม รปรางแบนคลายใบ และทความเขมขน 0.005 เปอรเซนต ทเวลา 1 สปดาห ยอดสามารถพฒนาเปนใบได 2 ใบ ตอตนกลา นอกจากนการใหสารโคลชซนดวยวธการเททบทกระดบความเขมขน ไมสงเสรมการสรางราก และเอมบรโอระยะสกแก (ตารางท 7 และ ภาพท 21-22)

ภาพท 20 พฒนาการของยอด จาก SSE ทเททบดวยสารละลายโคลชซนความเขมขนตางๆ เฉลย

จาก 2 ระยะเวลา (1 และ 2 สปดาห) แลวยายเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโตเปนเวลา 30 วน

0

1

2

3

4

5

6

7

1 2 3 4 5 0 0.05 0.10 0.15 0.20 สารโคลชซน (%)

จ านว

นยอด

(ยอด

)

56

ตารางท 7 จ านวนยอด ใบ ราก และโซมาตกเอมบรโอระยะสกแกทพฒนาจาก SSE ทรอดชวตบนอาหารทเททบดวยโคลชซน ทความเขมขน และระยะเวลาตางๆ แลวยายไปเลยงบนอาหารแขงทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโตเปนเวลา 30 วน

โคลชซน (%)

ระยะเวลา (สปดาห)

จ านวนยอด ± SE (ยอด)

จ านวนใบ ± SE (ใบ)

จ านวนราก (ราก)

จ านวน MSE (เอมบรโอ)

0.00 0 3 ± 0.00c 4 ± 1.00a 0 0

เฉลย 3 ± 0.00B 4 ± 1.00A 0 0

0.05 1 5 ± 1.00b 2 ± 0.00b 0 0

2 8 ± 1.00a 0c 0 0

เฉลย 6.5 ± 1.37A 1 ± 1.05B 0 0

0.10 1 3 ± 0.00c 0c 0 0

2 1 ± 0.00de 0c 0 0

เฉลย 2 ± 1.05C 0C 0 0

0.15 1 2 ± 0.00cd 0c 0 0

2 0e 0c 0 0

เฉลย 1 ± 1.04D 0C 0 0

0.20 1 0e 0c 0 0

2 0e 0c 0 0

เฉลย 0E 0C 0 0

F-test ** ** - -

C.V. (%) 19.27 19.97 - -

**แตกตางอยางมนยส าคญทางสถต (p≤ 0.01) คาเฉลยทก ากบดวยอกษรรวมกนในสดมภเดยวกนไมมความแตกตางทางสถตเมอเปรยบเทยบดวย DMRT

57

ภาพท 21 พฒนาการของ SSE ทรอดชวตจากการเททบดวยอาหารเหลว เตมโคลชซนเปนเวลา 1 สปดาห แลวยายไปเพาะเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญ เตบโต เปนเวลา 30 วน (บาร 4 มลลเมตร) ก. เททบดวยอาหารเหลวทปราศจากโคลชซน (ชดควบคม) ข. เททบดวยอาหารเหลวเตมโคลชซน ความเขมขน 0.05 เปอรเซนต ค. เททบดวยอาหารเหลวเตมโคลชซน ความเขมขน 0.10 เปอรเซนต ง. เททบดวยอาหารเหลวเตมโคลชซน ความเขมขน 0.15 เปอรเซนต จ. เททบดวยอาหารเหลวเตมโคลชซน ความเขมขน 0.20 เปอรเซนต

shoot

ก

ข ค

ง

shoot

จ

shoot

shoot

58

ภาพท 22 พฒนาการของ SSE ทรอดชวตจากการเททบดวยอาหารเหลว เตมโคลชซนเปนเวลา 2 สปดาห แลวยายไปเพาะเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญ เตบโต เปนเวลา 30 วน (บาร 4 มลลเมตร) ก. เททบดวยอาหารเหลวทปราศจากโคลชซน (ชดควบคม) ข. เททบดวยอาหารเหลวเตมโคลชซน ความเขมขน 0.05 เปอรเซนต ค. เททบดวยอาหารเหลวเตมโคลชซน ความเขมขน 0.10 เปอรเซนต ง. เททบดวยอาหารเหลวเตมโคลชซน ความเขมขน 0.15 เปอรเซนต จ. เททบดวยอาหารเหลวเตมโคลชซน ความเขมขน 0.20 เปอรเซนต

shoot

shoot

ก

ข ค

ง จ

shoot shoot

shoot

59

2.3.2 ออรซาลน การพฒนาเปนตนกลาจาก SSE ทเททบดวยอาหารเหลวสตร MS เตมสารละลายออรซาลน ระดบความเขมขน และใหระยะเวลาตางๆ หลงจากเพาะเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโต เปนเวลา 30 วน จากการพจารณาผลของความเขมขนของออรซาลน และระยะเวลาการใหสารโดยเฉลยตอการพฒนาเปนยอด พบวาการพฒนาเปนยอดลดลงเมอเททบดวยออรซาลนความเขมขนสงขน แตกตางอยางมนยส าคญทางสถต (p ≤

0.01) โดยเปอรเซนตการเกดยอดเฉลยสงสด 5.5 ยอด หลงจากเททบดวยออรซาลนความเขมขน 0.001 เปอรเซนต (ภาพท 23) และออรซาลนความเขมขน 0.001 เปอรเซนต เปนเวลา 1 สปดาห ใหการพฒนาเปนยอดไดดทสด คอ 10 ยอด ตอ SSE อยางไรกตามไมพบการสรางใบและราก โดยยอดมรปรางยาว ขนาดเลก คลายใบ สวนออรซาลนความเขมขนเดยวกน ทเวลา 2 สปดาห ใหยอดเพยง 1 ยอด ตอ SSE ยอดสามารถพฒนาเปนใบได 2 ใบ ตอตนกลา มสเขยวเขมขนาดใหญ มลกษณะมวนเขาหาชนสวน SSE นอกจากนยงพบวาออรซาลนทกระดบความเขมขน ไมสงเสรมการสราง ราก และ เอมบรโอระยะสกแก (ตารางท 8 และ ภาพท 24-25)

ภาพท 23 พฒนาการของยอด จาก SSE ทเททบดวยสารละลายออรซาลนความเขมขนตางๆ เฉลย

จาก 2 ระยะเวลา (1 และ 2 สปดาห) แลวยายเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโตเปนเวลา 30 วน

0

1

2

3

4

5

6

0 0 0.001 0.002 0.003 0.004 สารออรซาลน (%)

จ านว

นยอด

(ยอด

)

60

ตารางท 8 จ านวนยอด ใบ ราก และโซมาตกเอมบรโอระยะสกแกทพฒนาจาก SSE ทรอดชวต จากการเททบดวยอาหารเหลวเตมออรซาลน ทความเขมขน และระยะเวลาตางๆ แลว

ยายไปเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโตเปนเวลา 30 วน

ออรซาลน (%)

ระยะเวลา (สปดาห)

จ านวนยอด ± SE (ยอด)

จ านวนใบ ± SE (ใบ)

จ านวนราก (ราก)

จ านวน MSE (เอมบรโอ)

0.00 0 3 ± 0.00b 4 ± 1.00a 0 0

เฉลย 3 ± 00B 4 ± 1.00A 0 0

0.001 1 10 ± 1.00a 2 ± 0.00b 0 0

2 1 ± 0.00d 1 ± 0.00c 0 0

เฉลย 5.5 ± 2.23A 1.5 ± 0.74B 0 0

0.002 1 2 ± 0.00c 0d 0 0

2 0e 0d 0 0

เฉลย 1 ± 0.00C 0C 0 0

0.003 1 0e 0d 0 0

2 0e 0d 0 0

เฉลย 0D 0C 0 0

0.004 1 0e 0d 0 0

2 0e 0d 0 0

เฉลย 0E 0C 0 0

F-test ** ** - - C.V. (%) 14.99 33 - -

**แตกตางอยางมนยส าคญทางสถต (p≤ 0.01) คาเฉลยทก ากบดวยอกษรรวมกนในสดมภเดยวกนไมมความแตกตางทางสถตเมอเปรยบเทยบดวย DMRT

61

ภาพท 24 พฒนาการของ SSE ทรอดชวตจากการเททบดวยอาหารเหลวเตมออรซาลนเปนเวลา 1 สปดาห แลวยายไปเพาะเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการ เจรญเตบโต เปนเวลา 30 วน (บาร 4 มลลเมตร) ก. เททบดวยอาหารทไมเตมออรซาลน (ชดควบคม) ข. เททบดวยอาหารเหลวเตมออรซาลน ความเขมขน 0.001 เปอรเซนต ค. เททบดวยอาหารเหลวเตมออรซาลน ความเขมขน 0.002 เปอรเซนต ง. เททบดวยอาหารเหลวเตมออรซาลน ความเขมขน 0.003 เปอรเซนต จ. เททบดวยอาหารเหลวเตมออรซาลน ความเขมขน 0.004 เปอรเซนต

shoot shoot

ก

ข ค

ง

shoot

จ

62

ภาพท 25 พฒนาการของ SSE ทรอดชวตจากการเททบดวยอาหารเหลวเตมออรซาลนเปนเวลา 2 สปดาห แลวยายไปเพาะเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการ เจรญเตบโต เปนเวลา 30 วน (บาร 4 มลลเมตร) ก. เททบดวยอาหารทไมเตมออรซาลน (ชดควบคม) ข. เททบดวยอาหารเหลวเตมออรซาลน ความเขมขน 0.001 เปอรเซนต ค. เททบดวยอาหารเหลวเตมออรซาลน ความเขมขน 0.002 เปอรเซนต ง. เททบดวยอาหารเหลวเตมออรซาลน ความเขมขน 0.003 เปอรเซนต จ. เททบดวยอาหารเหลวเตมออรซาลน ความเขมขน 0.004 เปอรเซนต

shoot

shoot

ก

ข ค

ง จ

63

3. การศกษาลกษณะพชดพลอยด และพอลพลอยดในหลอดทดลอง 3.1 การศกษาลกษณะทางสณฐานวทยา

3.1.1 ใบ

จากการจมแช SSE ในอาหารเหลวทเตมสารโคลชซน และออร- ซาลนทความเขมขน และระยะเวลาตางๆ จากนนยายไปเพาะเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโต โดยยายเลยงบนอาหารเดมทกเดอน เปนเวลา 12 เดอน จงคดเลอกตนกลาปาลมน ามนทคาดวามลกษณะทางสณฐานตางๆ คงท มาศกษาลกษณะภายนอกของตนกลาเปรยบเทยบกบตนควบคม พบวาตนกลาทผานการแชโคลชซนความเขมขน 0.10 เปอรเซนต เปนเวลา 12 ชวโมง และ 0.20 เปอรเซนต เปนเวลา 24 ชวโมง มการเจรญเตบโตชากวาตนควบคม (ภาพท 26) ใบมสเขยวเขมกวา โดยเฉพาะกลมทแชสารละลายโคลชซน ความเขมขน 0.20 เปอรเซนต เปนเวลา 24 ชวโมง มใบหนาขน (ภาพท 27 ก, ข) ใบมขนสน าตาลซงมองเหนดวยตาเปลาไมชดเจน แตเมอสองดภายใตกลอง SEM จะเหนโครงสรางดงกลาวไดชดเจน (ภาพท 28 ก, ข) ขนาดของใบสน มสเขยวเขมมากทสด (ภาพท 28 ค) จากการเปรยบเทยบขนาดใบของตนควบคม และตนกลาทไดรบโคลชซน ความเขมขน 0.20 เปอรเซนต เปนเวลา 24 ชวโมง พบวามความแตกตางอยางมนยส าคญทางสถต (p ≤ 0.01) คอ ตนควบคมใหความกวาง และความยาวของใบ 0.92 และ 9.27 เซนตเมตร สวนตนกลาทไดรบโคลชซนความเขมขน 0.20 เปอรเซนต เปนเวลา 24 ชวโมง ใหความกวาง และความยาวของใบ 1.52 และ 3.59 เซนตเมตร อยางไรกตามขนาดใบของตนทไดรบโคลชซนความเขมขน 0.10 เปอรเซนต เปนเวลา 12 ชวโมง ไมแตกตางกนทางสถตกบชดควบคม (ตารางท 9) ส าหรบชนสวนทไดรบสารออรซาลน ความเขมขน 0.004 เปอรเซนต เปนเวลา 12 ชวโมง สงผลตอการเปลยนแปลงลกษณะทางสณฐานวทยา คอ SSE มการพฒนาคลายใบ และยอด แตไมสามารถพฒนาเปนตนทสมบรณได เมอน าชนสวนทพฒนาคลายใบออนมาตรวจสอบระดบพลอยดดวยโฟลไซโทเมทร พบวาตนกลาดงกลาวเปนเททระพลอยด (ภาพท 29)

64

ตารางท 9 ความกวาง ความยาวของใบ ของตนควบคม และตนทผานการแชโคลชซน ความ เขมขน 0.10 เปอรเซนต เปนเวลา 12 ชวโมง และ 0.20 เปอรเซนต เปนเวลา 24 ชวโมง

หลงจากยายเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโตเปนเวลา 12 เดอน

โคลชซน เวลา ขนาดของใบ (%) (ชม.) ความกวาง (ซม.) ± SE ความยาว (ซม.) ± SE

0 0 0.92 ± 0.04b 9.27 ± 0.51a 0.10 12 0.86 ± 0.05b 8.36 ± 0.39a 0.20 24 1.52 ± 0.24a 3.59 ± 0.29b

F-test ** ** C.V. (%) 11.53 18.25

**แตกตางอยางมนยส าคญทางสถต (p≤ 0.01) คาเฉลยทก ากบดวยอกษรรวมกนในสดมภเดยวกนไมมความแตกตางทางสถตเมอเปรยบเทยบดวย DMRT

ภาพท 26 การเจรญเตบโตของตนกลาปาลมน ามนตนควบคม (ซาย) ตนทผานการแชโคลชซน ความเขมขน 0.10 เปอรเซนต เปนเวลา 12 ชวโมง (กลาง) และความเขมขน 0.20 เปอรเซนตเปนเวลา 24 ชวโมง (ขวา) หลงจากยายไปเพาะเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโต เปนเวลา 12 เดอน (บาร 0.5 เซนตเมตร)

65

ภาพท 27 ความหนาของใบจากตนกลาปาลมน ามนชดควบคม (ก ซาย) และกลอง SEM (ข ซาย)

และตนกลาทไดรบโคลชซนเขมขน 0.20 เปอรเซนต เปนเวลา 24 ชวโมง (ก ขวา และ ข ขวา) หลงจากยายเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโต เปนเวลา 12 เดอน (บาร 0.5 เซนตเมตร)

ภาพท 28 ใบของตนกลาปาลมน ามนทไดรบโคลชซน ความเขมขน 0.20 เปอรเซนต เปนเวลา 24 ชวโมง มขนสน าตาล (ศรช ก และ ข) ใบสน และมสเขยวเขม (ค ขวา) เมอเปรยบเทยบ กบใบของตนควบคม (ค ซาย) ตนดงกลาวเพาะเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจาก สารควบคมการเจรญเตบโต เปนเวลา 12 เดอน (บาร 0.5 เซนตเมตร)

ก ข

ก ข ค

66

ภาพท 29 ลกษณะของ SSE ทมลกษณะคลาย ใบ และยอด แตไมสามารถพฒนาเปนตนกลา หลงจากไดรบสารออรซาลนความเขมขน 0.004 เปอรเซนต เปนเวลา 12 ชวโมง

แลวยายไปเพาะเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโต เปนเวลา 12 เดอน (บาร 0.5 เซนตเมตร)

ส าหรบการเททบดวยอาหารเหลวทเตมสารโคลชซน และออรซาลนท

ความเขมขน และระยะเวลาตางๆ บน SSE จากนนยายเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโต โดยยายเลยงบนอาหารสตรเดมทกเดอน เปนเวลา 12 เดอน พบวาตนกลาทไดรบโคลชซนความเขมขน 0.05 เปอรเซนต เปนเวลา 1 สปดาห ใหใบเรยว สน ขนาดเลกมาก มการพฒนาเนอเยอ ทมลกษณะคลายดอก (ภาพท 30 ก) เชนเดยวกบตนกลาทไดรบโคลชซนความเขมขน 0.05 เปอรเซนต เปนเวลา 2 สปดาห (ภาพท 30 ข) อยางไรกตามตนกลาชะงกการเจรญเตบโต และตายหลงจากยายเลยงเปนเวลา 6 เดอน ตนกลาทไดรบออรซาลนความเขมขน 0.001 เปอรเซนต เปนเวลา 1 สปดาห ใหตนกลาขนาดเลก มใบหนา ใบมสเขยวเขม แตตนกลาชะงกการเจรญเตบโต และตาย หลงจากยายเลยงเปนเวลา 12 เดอน (ภาพท 31 ก) สวนตนกลาทไดรบออ-รซาลนความเขมขน 0.001 เปอรเซนต เปนเวลา 2 สปดาห มลกษณะคลายชอดอกเพศผ (ภาพท 31 ข) และตนตายหลงจากยายเลยงเปนเวลา 6 เดอน นอกจากนชนสวนทไดรบสารโคลชซน และออ-รซาลนความเขมขนอนๆ ชะงกการเจรญเตบโต และไมพฒนาเปนตนกลา โดยชนสวนทงหมดตายหลงจากยายเลยงเปนเวลา 3 เดอน

67

ภาพท 30 ตนกลาทพฒนาจาก SSE ซงผานการเททบดวยโคลชซน ความเขมขน 0.05 เปอรเซนต เปนระยะเวลาตางๆ มการพฒนาคลายดอก (ศรช) หลงจากยายเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโต เปนเวลา 6 เดอน (บาร 0.5 เซนตเมตร) ก. ไดรบโคลชซน เปนเวลา 1 สปดาห ข. ไดรบโคลชซน เปนเวลา 2 สปดาห

ภาพท 31 ตนกลาทพฒนาจาก SSE ซงผานการเททบดวยออรซาลน ความเขมขน 0.001เปอรเซนต เปนระยะเวลาตางๆ ก. ไดรบออรซาลน เปนเวลา 1 สปดาห แลวยายไปเลยงบนอาหารแขงสตร MS ท

ปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโต เปนเวลา 12 เดอน (บาร 0.5 เซนตเมตร) ข. ไดรบออรซาลน เปนเวลา 2 สปดาห แลวยายไปเลยงบนอาหารแขงสตร MS ท

ปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโต เปนเวลา 6 เดอน (บาร 0.5 เซนตเมตร)

ก ข

ก ข

68

3.1.2 ราก

เมอยายตนกลาทพฒนาจาก SSE ทผานการจมแชโคลชซน ความ เขมขนและระยะเวลาตางๆ อาย 12 เดอน ไปเพาะเลยงบนอาหารชกน าราก ซงเปนอาหารแขงสตร ARDA เตม NAA 0.5 มลลกรมตอลตร และกรดแอสคอรบค 200 มลลกรมตอลตร เปนเวลา 1 เดอน คดเลอกตนทมรากจากแตละชดการทดลองมาศกษาลกษณะ และขนาดของราก พบวารากของตนกลาจากสงทดลองทไดรบโคลชซน 0.20 เปอรเซนต เปนเวลา 24 ชวโมง ใหรากสขาวขน ขนาดใหญ และสนกวาตนควบคม (ภาพท 32 ก ขวา) แตกตางอยางมนยส าคญทางสถต (p ≤ 0.01) กบตนควบคม ใหความกวาง และความยาว 0.12 x 1.30 เซนตเมตร รากตนกลาทไดรบโคลชซน 0.20 เปอรเซนต เปนเวลา 24 ชวโมง ใหขนาด 0.24 x 0.64 เซนตเมตร (ตารางท 10) ส าหรบรากของตนกลาทไดรบโคลชซน 0.10 เปอรเซนต เปนเวลา 12 ชวโมงนน ใหรากทส นกวา และใหญกวาตนควบคมเลกนอย คอ 0.20 x 1.21 เซนตเมตร (ภาพท 32 ข) อยางไรกตามขนาดของรากแตกตางกบตนควบคมอยางมนยส าคญทางสถต (p≤ 0.01) นอกจากนพบรากทมลกษณะอวบ กลม สเหลองออน (ภาพท 32 ค) ในตนกลาทไดรบโคลชซน 0.20 เปอรเซนต เปนเวลา 24 ชวโมงดวย ตารางท 10 ความกวาง ความยาวของราก ของตนควบคม เปรยบเทยบกบตนจากสงทดลองทผาน การแชโคลชซน 0.10 เปอรเซนต เปนเวลา 12 ชวโมง และ 0.20 เปอรเซนต เปนเวลา 24 ชวโมง แลวยายไปเพาะเลยงบนอาหารแขงสตร ARDA เตม NAA 0.5 มลลกรมตอ ลตร และกรดแอสคอรบค 200 มลลกรมตอลตร เพอชกน ารากเปนเวลา 1 เดอน

โคลชซน เวลา ขนาดของราก (%) (ชม.) ความกวาง ± SE (ซม.) ความยาว ± SE (ซม.)

0 0 0.12 ± 0.02c 1.30 ± 0.007a 0.10 12 0.20 ± 0.01b 1.21 ± 0.005b 0.20 24 0.24 ± 0.02a 0.64 ± 0.007c

F-test ** ** C.V. (%) 4.53 5.21

**แตกตางอยางมนยส าคญทางสถต (p≤ 0.01) คาเฉลยทก ากบดวยอกษรรวมกนในสดมภเดยวกนไมมความแตกตางทางสถตเมอเปรยบเทยบดวย DMRT

69

ภาพท 32 รากของตนกลาปาลมน ามน หลงจากยายเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสาร

ควบคมการเจรญเตบโตเปนเวลา 12 เดอน และยายเลยงบนอาหารแขงสตร ARDA ตอ อกเปนเวลา 1 เดอน (บาร 0.2 เซนตเมตร)

ก. รากของตนควบคม (ซาย) และรากของตนกลาจากสงทดลอง ทไดรบโคลชซน ความเขมขน 0.20 เปอรเซนต เปนเวลา 24 ชวโมง (ขวา)

ข. รากของตนกลาทไดรบโคลชซน ความเขมขน 0.10 เปอรเซนต เปนเวลา 12 ชวโมง ค. รากทมลกษณะอวบ กลม ของตนกลาทไดรบโคลชซน ความเขมขน 0.2 เปอรเซนต เปนเวลา 24 ชวโมง

ก

ข ค

70

3.1.2 ดอก และผล หลงจากยายเลยงตนกลาบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโตเปนเวลา 12 เดอน พบวาตนกลาเกดชอดอกในหลอดทดลองจากโคลชซน 3 ความเขมขน คอ โคลชซนความเขมขน 0.10 เปอรเซนต เปนเวลา 12 ชวโมง โคลชซน 0.20 เปอรเซนต เปนเวลา 24 ชวโมง และโคลชซน 0.15 เปอรเซนต เปนเวลา 48 ชวโมง โดยแยกเปนตนทใหชอดอกเพศผ และชอดอกเพศเมย จากการศกษาเปอรเซนตการออกดอกในหลอดทดลอง จากแตละสงทดลองทรอดชวต พบวาโคลชซน 0.15 เปอรเซนต เปนเวลา 48 ชวโมง เกดชอดอกมากทสด 20 เปอรเซนต (ตารางท 11) รองลงมาเปน โคลชซน 0.20 เปอรเซนต เปนเวลา 24 ชวโมง เกดชอดอก 6 เปอรเซนต อยางไรกตาม โคลชซน 0.15 เปอรเซนต เปนเวลา 48 ชวโมง เกดชอดอกในหลอดทดลองเพยง 1 ตน แตใหเปอรเซนตการออกดอกสงทสด เนองจากใหเปอรเซนตการรอดชวตต า จากการศกษาลกษณะภายนอกของชอดอกดวยตาเปลา และกลองจลทรรศนแบบสเตอรโอ พบวาโคลชซนความเขมขน 0.10 เปอรเซนต เปนเวลา 12 ชวโมง ใหชอดอกเพศเมยขนาดใหญ สขาวอมชมพ (ภาพท 33 ก) และชอดอกเพศผ สเขยวออน (ภาพท 33 ข) โคลชซน 0.15 เปอรเซนต เปนเวลา 48 ชวโมง ใหชอดอกเพศเมยสขาว โดยเกดชอดอกจ านวนมาก (ภาพท 34) สวนโคลชซนความเขมขน 0.20 เปอรเซนต เปนเวลา 24 ชวโมง ใหชอดอกเพศเมยสขาวขนาดใหญ (ภาพท 35 ก) และใหชอดอกเพศผสเขยวเขม ปลายชอดอกมสน าตาลเขม (ภาพท 35 ข) จากการศกษาลกษณะชอดอกดวยกลอง SEM พบวาชอดอกเพศเมยของสงทดลองทไดรบโคลชซนทง 3 ความเขมขน (ภาพท 36 ก ข และ ค) มยอดเกสรเพศเมย (stigma) จ านวนมากบรเวณปลายดอก โดย stigma รปรางคอนขางกลม (ภาพท 36 ง) นอกจากนลกษณะของชอดอกเพศผมลกษณะคลายนว (ภาพท 36 จ) โดยมเกสรเพศผ (stamen) รปราง ยาวร (ภาพท 36 ฉ) อยางไรกตาม ตนกลาทเกดชอดอกบรเวณปลายยอด จะตายหลงจากทดอกฝอเปนเวลา 1 เดอน

71

ตารางท 11 เปอรเซนตการเกดชอดอกในหลอดทดลองของตนกลาปาลมน ามน ทผานการจมแช สารโคลชซนความเขมขน และระยะเวลาตางๆ หลงจากยายเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโต เปนเวลา 12 เดอน

โคลชซน ระยะเวลา จ านวนตนท จ านวนตนกลาทเกดชอดอก (ตน) เปอรเซนตการ

จมแช ตรวจสอบ เกดชอดอก

(%) (ชม.) (ตน) ชอดอกเพศผ ชอดอกเพศเมย (%)

0 0 100 0 0 0

0.05 12 50 0 0 0

24 30 0 0 0

48 10 0 0 0

0.10 12 100 2 1 3

24 30 0 0 0

48 3 0 0 0

0.15 12 10 0 0 0

24 10 0 0 0

48 5 0 1 20

0.20 12 10 0 0 0

24 100 2 4 6

48 0 0 0 0

72

ภาพท 33 ลกษณะของชอดอกเพศเมย (ก) และชอดอกเพศผ (ข) จากตนกลาปาลมน ามน ทไดรบ

โคลชซน ความเขมขน 0.10 เปอรเซนต เปนเวลา 12 ชวโมง แลวยายไปเพาะเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโต เปนเวลา 12 เดอน (บาร 0.5 เซนตเมตร)

ภาพท 34 ลกษณะชอดอกเพศเมย ของตนกลาปาลมน ามน ทไดรบโคลชซนความเขมขน 0.15

เปอรเซนต เปนเวลา 48 ชวโมง แลวยายไปเพาะเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโต เปนเวลา 12 เดอน (บาร 0.3 เซนตเมตร)

ภาพท 35 ลกษณะชอดอกเพศเมย (ก) และชอดอกเพศผ (ข) ของตนกลาปาลมน ามน ทไดรบโคล-

ชซน ความเขมขน 0.20 เปอรเซนต เปนเวลา 24 ชวโมง แลวยายไปเพาะเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโต เปนเวลา 12 เดอน (บาร 0.5 เซนตเมตร)

ก ข

ก ข

73

ภาพท 36 ลกษณะของชอดอกเพศเมย และเพศผของตนกลาปาลมน ามน (SEM) จากสงทดลอง ท

ไดรบโคลชซนความเขมขน และระยะเวลาตางๆ หลงจากยายไปเพาะ เลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโต เปนเวลา 12 เดอน ก. ชอดอกเพศเมยของตนกลาจากสงทดลอง ทไดรบโคลชซนความเขมขน 0.10 เปอรเซนต เปนเวลา 12 ชวโมง ข. ชอดอกเพศเมยของตนกลาจากสงทดลอง ทไดรบโคลชซนความเขมขน 0.15 เปอรเซนต เปนเวลา 48 ชวโมง ค. ชอดอกเพศเมยของตนกลาจากสงทดลอง ทไดรบโคลชซนความเขมขน 0.20 เปอรเซนต เปนเวลา 24 ชวโมง ง. ลกษณะของเกสรเพศเมย (stigma) ของชอดอกเพศเมยของตนกลาจากสงทดลอง ท

ไดรบโคลชซน (ศรช) ความเขมขน 0.20 เปอรเซนต เปนเวลา 24 ชวโมง จ. ชอดอกเพศผของตนกลาจากสงทดลอง ทไดรบโคลชซนความเขมขน 0.20 เปอรเซนต เปนเวลา 24 ชวโมง ฉ. ลกษณะเกสรเพศผ (stamen) ของชอดอกเพศผของตนกลาจากสงทดลอง ทไดรบ โคลชซนความเขมขน 0.20 เปอรเซนต เปนเวลา 24 ชวโมง

ง

ก ค

จ

ข

ฉ

74

หลงจากยายเลยงตนกลาทไดรบโคลชซนความเขมขน 0.20 เปอรเซนต เปนเวลา 24 ชวโมง ทมอาย 12 เดอน บนอาหารแขงสตร ARDA เตม NAA 0.5 มลลกรมตอลตร และกรดแอสคอรบค 200 มลลกรมตอลตร เพอชกน าราก เปนเวลา 1 เดอน พบวาเกดราก และชอดอก โดยเกดชอดอกเพศเมยบรเวณปลายยอด และพฒนาเปนผลในระยะเวลาตอมา (ภาพท 37) จากการศกษาการพฒนาของผลปาลมภายใตกลองจลทรรศนแบบสเตอรโอ พบวาผลมลกษณะยาวร บางผลมลกษณะลบ (ภาพท 38 ก-ค) จากการตดตามขวาง (ภาพท 39 ก) และตามยาว (ภาพท 39 ข) ภายใตกลอง SEM พบวาเปนผลทไมมเมลด โดยเปนเนอเยอของ mesocarp ทมระบบเนอเยอทอล าเลยง (vascular tissue system) ประกอบดวยทอล าเลยงน า กบทอล าเลยงอาหาร (ภาพท 40 ก และ 40 ข)

ภาพท 37 ผลปาลมจากตนปาลมน ามนทออกดอกในหลอดทดลอง ทไดรบโคลชซน ความเขมขน 0.20 เปอรเซนต เปนเวลา 24 ชวโมง บรเวณปลายยอด หลงจากยายเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโต เปนเวลา 12 เดอน และยายเลยงบนอาหารแขงสตร ARDA เตม NAA 0.5 มลลกรมตอลตร และกรดแอสคอรบค 200 มลลกรมตอลตร ตออกเปนเวลา 1 เดอน (บาร 0.5 เซนตเมตร)

75

ภาพท 38 ลกษณะผลปาลมจากตนกลาปาลมน ามน ทไดรบโคลชซน ความเขมขน 0.2 เปอรเซนต เปนเวลา 24 ชวโมง โดยมผลยาวร (ก และ ข) และผลลบ (ค)

ภาพท 39 ผลปาลมทพฒนาจากตนกลาปาลมน ามน ทไดรบโคลชซนความเขมขน 0.2 เปอรเซนต เปนเวลา 24 ชวโมง หลงจากยายเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโตเปนเวลา 12 เดอน และยายเลยงบนอาหารแขงสตร ARDA เตม NAA 0.5 มลลกรมตอลตร และกรดแอสคอรบค 200 มลลกรมตอลตร ตออกเปนเวลา 1 เดอน

ก. ผลทตดตามยาว ข. ผลทตดตามขวาง

ก ข

ก ข

ค

76

ภาพท 40 เนอปาลม ( mesocarp) ของผลปาลมทพฒนาจากตนกลาปาลมน ามน ทไดรบโคลชซน ความเขมขน 0.20 เปอรเซนต เปนเวลา 24 ชวโมง ก. ระบบเนอเยอทอล าเลยงของผลทตดตามยาว (ศรช)

ข. ระบบเนอเยอทอล าเลยงของผลทตดตามขวาง คอ ทอล าเลยงน า (xylem) กบ ทอล าเลยงอาหาร (phloem) (ศรช)

3.2 การศกษาลกษณะทางสรรวทยา

3.2.1 รปราง ขนาด และความหนาแนนของเซลลคม

เมอ SSE ทผานการจมแชสารโคลชซน ทระดบความเขมขน และระยะเวลาตางๆ พฒนาเปนตนกลาอาย 12 เดอน คดเลอกตนทคาดวาเปนเททระพลอยด โดยดจากลกษณะทางสณฐานวทยาในขอ 3.1 มาศกษาความหนาแนน และขนาดของเซลลคมดวยกลอง SEM พบวาชดทไดรบโคลชซน ความเขมขน 0.20 เปอรเซนต เปนเวลา 24 ชวโมง (ภาพท 41 ค) ใหความกวางของเซลลคม 19.11 ไมโครเมตร มากกวาชดควบคม (ภาพท 41 ก) ซงมขนาด 9.75 ไมโครเมตร มความแตกตางอยางมนยส าคญทางสถต (p ≤ 0.01) อยางไรกตามความยาวของเซลลคมทงชดการทดลองทไดรบ และไมไดรบโคลชซนใหคาใกลเคยงกน ไมมความแตกตางอยางมนยส าคญทางสถต (p ≤ 0.01) (ตารางท 12) เมอพจารณาความกวางของเซลลคม พบวาชดทไดรบโคลชซน ความเขมขน 0.10 เปอรเซนต เปนเวลา 12 ชวโมง (ภาพท 41 ข) ใหความกวางของเซลลคม 14.39 ไมโครเมตร แตกตางอยางมนยส าคญทางสถต (p ≤ 0.01) กบชดควบคม (ตารางท 12) ส าหรบความหนาแนนของเซลลคม พบวาชดทไดรบโคลชซนทงสองความเขมขน ใหความหนาแนนทนอยกวา

ก ข

xylem

phloem

77

ชดควบคมแตกตางอยางมนยส าคญทางสถต (p ≤ 0.01) (ตารางท 12 และภาพท 42 ก-ค) โดยลกษณะเซลลคมของชดทไดรบโคลชซน 0.20 เปอรเซนต เปนเวลา 24 ชวโมง มลกษณะบดเบยว บวม เสยรปราง และตดกนสองเซลล สวนปากใบเสยหาย ถกท าลาย (ภาพท 43 ก-ฉ) ตารางท 12 ความกวาง ความยาว และความหนาแนนของเซลลคมของตนควบคม และตนกลาท ผานการแชโคลชซน ความเขมขน 0.10 เปอรเซนต เปนเวลา 12 ชวโมง และ 0.20 เปอรเซนต เปนเวลา 24 ชวโมง หลงจากยายเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจาก สารควบคมการเจรญเตบโตเปนเวลา 12 เดอน

โคลชซน เวลา ขนาดของเซลลคม (ไมโครเมตร) ความหนาแนน ± SE (%) (ชม.) ความกวาง ± SE ความยาว ± SE (เซลลคม/25 มม.)

0 0 9.75 ± 0.04b 25.82 ± 0.51 16.00 ± 0.21a 0.10 12 14.39 ± 0.05b 26.61 ± 0.39 13.00 ± 0.15b 0.20 24 19.11± 0.04a 29.23 ± 0.29 7.00 ± 0.21c

F-test ** ns ** C.V. (%) 17.66 18.25 15.80

**แตกตางอยางมนยส าคญทางสถต (p≤ 0.01) และ ns = ไมมความแตกตางทางสถต คาเฉลยทก ากบดวยอกษรรวมกนในสดมภเดยวกนไมมความแตกตางทางสถตเมอเปรยบเทยบดวย DMRT

78

ภาพท 41 ขนาดของเซลลคม (ก) ชดควบคม (ข) ชดทไดรบโคลชซน 0.10 เปอรเซนต เปนเวลา 12 ชวโมง (ค) ชดทไดรบโคลชซน 0.20 เปอรเซนต เปนเวลา 24 ชวโมง หลงจากยาย

เลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโต เปนเวลา 12 เดอน

ก

ข

ค

79

ภาพท 42 ความหนาแนนของเซลลคม (ก) ชดควบคม (ข)ชดทไดรบโคลชซน 0.10 เปอรเซนต เปนเวลา 12 ชวโมง (ค) ชดทไดรบโคลชซน 0.20 เปอรเซนต เปนเวลา 24 ชวโมง หลงจากยายเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโต เปน เวลา 12 เดอน

ก

ค

ข

80

ภาพท 43 ลกษณะความผดปกตแบบตางๆของเซลลคม ของตนกลาปาลมน ามนทไดรบโคลชซน ความเขมขน 0.20 เปอรเซนต เปนเวลา 24 ชวโมง (ก) เซลลคมเสยหาย ท าใหปากใบมรปรางผดปกต (ข) เซลลคมมลกษณะตดกนสองเซลล และปากใบมรปรางผดปกต (ค) เซลลคมเสยหาย บวม เสยรปราง และปากใบมรปรางผดปกต (ง) เซลลคมบวม เสยรปราง (จ-ฉ) เซลลคมบวม เสยรปราง และปากใบปดถาวร

ก ข

ค ง

จ ฉ

81

3.2.2 จ านวนคลอโรพลาสตในเซลลคม

เมอ SSE ทผานการจมแชสารโคลชซน ทระดบความเขมขน และระยะเวลาตางๆ พฒนาเปนตนกลาอาย 12 เดอน จงคดเลอกตนทคาดวาเปนเททระพลอยดจากการศกษา 3.1 มาศกษาจ านวน และขนาดของคลอโรพลาสตในเซลลคมดวยกลองจลทรรศนใชแสงแบบเชงประกอบ พบวาชดทไดรบโคลชซนความเขมขน 0.10 เปอรเซนต เปนเวลา 12 ชวโมง และ 0.20 เปอรเซนต เปนเวลา 24 ชวโมง มความแตกตางกบชดควบคมอยางมนยส าคญทางสถต (p ≤

0.01) โดยมขนาดคลอโรพลาสตในเซลลคมเฉลย 2.00 ไมโครเมตร เลกกวาชดควบคม (4.00 ไมโครเมตร) สองเทา (ตารางท 13 และภาพท 44 ก-ค) ส าหรบจ านวนคลอโรพลาสตตอเซลลคม พบวาชดทไดรบโคลชซน 0.20 เปอรเซนต เปนเวลา 24 ชวโมง มจ านวนคลอโรพลาสตในเซลลคมสงสด คอ 28.00 เมด สงกวาชดควบคมทไมไดรบโคลชซน (14 เมดตอเซลลคม) แตกตางอยางมนยส าคญทางสถต (p ≤ 0.01) นอกจากน การใหสารโคลชซน ความเขมขน และระยะเวลาแตกตางกน สงผลใหลกษณะของคลอโรพลาสต และเซลลคมทแตกตางกนดวย ดงแสดงในภาพท 45 ตารางท 13 ขนาด และจ านวนคลอโรพลาสตตอเซลลคมของตนควบคม และตนกลาทผาน การแชโคลชซน ความเขมขน 0.20 เปอรเซนต เปนเวลา 24 ชวโมง หลงจากยายเลยง บนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโตเปนเวลา 12 เดอน

โคลชซน เวลา ขนาดคลอโรพลาสต ± SE จ านวนคลอโรพลาสต/เซลลคม ± SE (%) (ชม.) (ไมโครเมตร) (เมด)

0 0 4.00 ± 0.00a 14.40 ± 0.52b 0.10 12 2.00 ± 0.00b 13.50 ± 0.50b 0.20 24 2.00 ± 0.00b 28.00 ± 0.97a

F-test ** ** C.V. (%) 0.00 14.18

**แตกตางอยางมนยส าคญทางสถต (p≤ 0.01) คาเฉลยทก ากบดวยอกษรรวมกนในสดมภเดยวกนไมมความแตกตางทางสถตเมอเปรยบเทยบดวย DMRT

82

ภาพท 44 คลอโรพลาสตในเซลลคมของตนกลาปาลมน ามน หลงจากยายเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโตเปนเวลา 12 เดอน ก. ชดควบคม ข. ตนทไดรบโคลชซน ความเขมขน 0.10 เปอรเซนต เปนเวลา 12 ชวโมง ค. ตนทไดรบโคลชซน ความเขมขน 0.20 เปอรเซนต เปนเวลา 24 ชวโมง

ก ข

ค

83

ภาพท 45 คลอโรพลาสต และลกษณะเซลลคมของตนกลาปาลมน ามน หลงจากยายเลยงบน อาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโต เปนเวลา 12 เดอน ก. ตนทไดรบโคลชซน 0.05 เปอรเซนต เปนเวลา 12 ชวโมง เซลลคมบวม ข. ตนทไดรบโคลชซน 0.05 เปอรเซนต เปนเวลา 24 ชวโมง จ านวนคลอโรพลาสตใน เซลลคมลดลง ค. ตนทไดรบโคลชซน 0.05 เปอรเซนต เปนเวลา 48 ชวโมง ขนาดเซลลคมไมเทากน ง. ตนทไดรบโคลชซน 0.10 เปอรเซนต เปนเวลา 24 ชวโมง คลอโรพลาสตภายใน เซลลคมมขนาดเลก และมจ านวนมาก จ. ตนทไดรบโคลชซน 0.15 เปอรเซนต เปนเวลา 48 ชวโมง คลอโรพลาสตภายใน เซลลคมมขนาดเลก สวนใหญใส ไมมสเขยว

ก ข ค

ง จ

84

3.2.3 ปรมาณคลอโรฟลล

เมอ SSE พฒนาเปนตนกลา เกบรวบรวมใบตนกลาทคาดวาเปนตนเททระพลอยด มาสกดคลอโรฟลลโดยบดดวยสารละลายอะซโตนเขมขน 80 เปอรเซนต พบวาปรมาณคลอโรฟลลของตนชดควบคมกบทไดรบโคลชซน มความแตกตางกนโดยตนทไดรบโคลชซนมปรมาณคลอโรฟลลสงกวาตนควบคมเลกนอย ส าหรบคลอโรฟลลเอนนพบวาโคลชซนเขมขน

0.10 เปอรเซนต เปนเวลา 12 ชวโมง และ 0.20 เปอรเซนต เปนเวลา 24 ชวโมง มปรมาณ 3.06 และ 3.15 มลลกรมตอกรมน าหนกสดตามล าดบ สวนชดควบคมมปรมาณ 2.77 มลลกรมตอกรมน าหนกสด เมอวเคราะหทางสถต พบวาไมมความแตกตางอยางมนยส าคญทางสถต เมอพจารณาปรมาณคลอโรฟลลบ พบวาชดทไดรบโคลชซน 0.10 เปอรเซนต เปนเวลา 12 ชวโมง และ 0.20 เปอรเซนต เปนเวลา 24 ชวโมง มปรมาณคลอโรฟลลบ 13.29 และ 16.81 มลลกรมตอกรมน าหนกสด ตามล าดบ มากกวาชดควบคมซงมปรมาณคลอโรฟลลบ 10.77 มลลกรมตอกรมน าหนกสด แตกตางอยางมนยส าคญทางสถต (p ≤ 0.05) ส าหรบปรมาณคลอโรฟลลรวม พบวาชดทไดรบโคลชซน 0.10 เปอรเซนต เปนเวลา 12 ชวโมง และ 0.20 เปอรเซนต เปนเวลา 24 ชวโมง มปรมาณคลอโรฟลลรวม 16.354 และ 19.976 มลลกรมตอกรมน าหนกสด มากกวาชดควบคมซงมปรมาณคลอโรฟลลรวม 13.543 มลลกรมตอกรมน าหนกสด แตกตางอยางมนยส าคญทางสถต (p ≤ 0.01) (ตารางท 14 และ ภาพท 46)

85

ตารางท 14 ปรมาณคลอโรฟลล เอ บ และคลอโรฟลลรวม จากใบของตนกลาชดควบคม และตน กลาทคาดวาเปนตนเททระพลอยด ทผานการแชโคลชซนความเขมขน 0.10 เปอร- เซนต เปนเวลา 12 ชวโมง และ 0.20 เปอรเซนต เปนเวลา 24 ชวโมง หลงจากยาย

เลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโต เปนเวลา 12 เดอน

โคลชซน เวลา ปรมาณคลอโรฟลล (มก./ก. น าหนกสด) (%) (ชม.) คลอโรฟลลเอ ± SE คลอโรฟลลบ ± SE คลอโรฟลลรวม ± SE

0 0 2.77 ± 0.44 10.77 ± 0.14c 13.543 ± 0.29b 0.10 12 3.06 ± 0.32 13.29 ± 0.11b 16.354 ± 0.43ab 0.20 24 3.15 ± 0.80 16.81 ± 0.02a 19.97 ± 0.83a

F-test ns * ** C.V. (%) 4.94 5.80 5.02

ns = ไมมความแตกตางทางสถต * , ** แตกตางอยางมนยส าคญทางสถต (p≤ 0.05) และแตกตางอยางมนยส าคญทางสถต (p≤ 0.01) คาเฉลยทก ากบดวยอกษรรวมกนในสดมภเดยวกนไมมความแตกตางทางสถตเมอเปรยบเทยบดวย DMRT

ภาพท 46 ปรมาณคลอโรฟลลเอ คลอโรฟลลบ และคลอโรฟลลรวมของตนกลาปาลมน ามนชดควบคมทไดรบโคลชซนความเขมขน 0.10 เปอรเซนต เปนเวลา 12 ชวโมง และ 0.20 เปอรเซนต เปนเวลา 24 ชวโมง หลงจากยายเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโต เปนเวลา 12 เดอน

0

5

10

15

20

25

คลอโรฟลลเอ คลอโรฟลลบ คลอโรฟลลรวม

control

0.10%(12ชม)

0.20%(24ชม)

ปรมาณค

ลอโรฟล

ล (มก

./ก.น าหนก

สด)

86

3.3 การตรวจสอบทางเซลลวทยา

3.3.1 ศกษาจ านวนโครโมโซมจากเซลลปลายราก

จากการศกษาจ านวนของโครโมโซมดวยวธ Feulgen squash ของชดควบคมเปรยบเทยบกบชดทไดรบโคลชซน พบวาชดควบคมมจ านวนโครโมโซม 2n=2x=32 (ภาพท 47 ก) สวนจ านวนโครโมโซมของตนทคดเลอกและคาดวาเปนเททระพลอยด ทผานการแชสารละลายโคลชซนความเขมขน 0.10 เปอรเซนต เปนเวลา 12 ชวโมง และ 0.20 เปอรเซนต เปนเวลา 24 ชวโมง มจ านวนโครโมโซมเพมเปนสองเทา (2n=4x=64) คอเปนตนเท-ทระพลอยด (ภาพท 47 ข และ ค) นอกจากนยงพบตนมกโซพลอยด (2n=2x=32 และ 2n=4x=64) ซงมจ านวนโครโมโซมผสมอยระหวางดพลอยด และเททระพลอยด ในตนกลาทผานการแชสารละลายโคลชซน ความเขมขน 0.10 เปอรเซนต เปนเวลา 12 ชวโมง และ 0.15 เปอรเซนต เปนเวลา 48 ชวโมง

87

ภาพท 47 จ านวนโครโมโซมจากปลายราก ของตนกลาปาลมน ามนหลงจากยายเลยงบนอาหาร แขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโต เปนเวลา 12 เดอน (บาร= 0.2 ไมโครเมตร) ก. โครโมโซมปลายรากจากชดควบคม (ตนดพลอยด 2n=2x=32) ข. โครโมโซมปลายรากจากชดทไดรบโคลชซน 0.10 เปอรเซนต เปนเวลา 12 ชวโมง (ตนเททระพลอยด 2n=4x=64)

ค. โครโมโซมปลายรากจากชดทไดรบโคลชซน 0.20 เปอรเซนต เปนเวลา 24 ชวโมง (ตนเททระพลอยด 2n=4x=64)

ก ข

ค

88

3.3.2 การศกษาปรมาณดเอนเอโดยโฟลไซโทเมทร การศกษาระดบพลอยด ของตนกลาปาลมน ามนชดควบคมเปรยบเทยบกบชดทไดรบโคลชซน พบวาชดควบคมมระดบพลอยดเปนดพลอยด (2n = 2x) (ภาพท 48 ก) สวนชดทผานการแชสารละลายโคลชซนความเขมขน 0.10 เปอรเซนต เปนเวลา 12 ชวโมง และ 0.20 เปอรเซนต เปนเวลา 24 ชวโมง เกดเปนตนเททระพลอยด โดยระดบพลอยดเพมขนเปนสองเทา คอ 2n = 4x (ภาพท 48 ข) ทงนชดทไดรบโคลชซน 0.20 เปอรเซนต เปนเวลา 24 ชวโมง เกดเปนตนเททระพลอยดไดมากทสด 16.67เปอรเซนต (ตารางท 15) นอกจากนชดทไดรบโคลชซน ความเขมขน 0.15 เปอรเซนต เปนเวลา 48 ชวโมง ใหตนกลามกโซพลอยด คอ มระดบพลอยดผสมระหวางดพลอยด และเททระพลอยด (ภาพท 48 ค) สอดคลองกบผลทไดจากการศกษาโครโมโซมปลายราก จากการตรวจสอบปรมาณดเอนเอของปาลมน ามน โดยใชดเอนเอของขาวญปน ซงมขอมลระดบพลอยดแนนอนแลวเปนดเอนเอมาตรฐาน ยนยนผลไดวาตนปาลมน ามนทพฒนาจาก SSE ในชดควบคมมระดบพลอยดเปนดพลอยด มปรมาณดเอนเอเทากบ 3.75 พโคกรม เมอเปรยบเทยบขนาดของคเบส คดเปน 1.81 x 109 bp สวนชดทผานการแชสารละลายโคลชซน ความเขมขน 0.10 เปอรเซนต เปนเวลา 12 ชวโมง และ 0.20 เปอรเซนต เปนเวลา 24 ชวโมง ยนยนผลไดวาเปนตนเททระพลอยด มปรมาณดเอนเอเพมเปนสองเทา คอ 7.45 พโคกรม เมอเปรยบเทยบขนาดของคเบส คดเปน 3.59 x 109 bp (ตารางท 16 และภาพท 49)

89

ตารางท 15 ผลของสารละลายโคลชซน ทระดบความเขมขน และระยะเวลาตางๆ ทมตอเปอรเซนต การเกดตนเททระพลอยด จากการศกษาระดบพลอยดดวยโฟลไซโทเมทร (n=30)

ระดบความเขมขน

ระยะเวลา

เปอรเซนตการรอดชวต

ระดบพลอยด เปอรเซนตการเกดเททระพลอยด

(%) (ชม.) (%) มกโซพลอยด 2C-4C

เททระพลอยด 4C

(%)*

0 12 100 0 0 0 24 100 0 0 0 48 100 0 0 0

0.05 12 80 0 0 0 24 70.11 0 0 0 48 41 0 0 0

0.10 12 68.78 1 2 6.67 24 57.33 0 0 0 48 26.55 0 0 0

0.15 12 56.22 0 0 0 24 48.66 0 0 0 48 12.11 5 0 0

0.20 12 50.56 0 0 0 24 42 0 5 16.67 48 0 0 0 0

*เปอรเซนตการเกดเททระพลอยด (เปอรเซนต) = จ านวนตนกลาทเปนเททระพลอยด X 100 จ านวนตนกลาทงหมด (30 ตน)

90

ภาพท 48 ฮสโตแกรมแสดงระดบพลอยด ของตนกลาปาลมน ามนชนดตางๆ ก. ตนควบคม (ตนดพลอยด 2n=2x=32) (n=10) ข. ตนทไดรบโคลชซน 0.20 เปอรเซนต เปนเวลา 24 ชวโมง (ตนเททระพลอยด 2n=4x=64) (n=5)

ค. ตนทไดรบโคลชซน 0.15 เปอรเซนต เปนเวลา 48 ชวโมง (ตนมกโซพลอยด 2n=2x=32 และ 2n=4x=64) (n=5)

100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000

100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000

ก

ข

ค

100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000

no. o

f nuc

lei

fluorescent intensity

91

ภาพท 49 ฮสโตแกรมแสดงปรมาณดเอนเอของ (ก) ตนขาวญปน ซงเปนดเอนเอมาตรฐาน (ข) ตนกลาปาลมน ามนชดควบคม ทเปนดพลอยด (2n=2x) และ (ค) ตนเททระพลอยด ของชดทไดรบโคลชซน ความเขมขน 0.20 เปอรเซนต เปนเวลา 24 ชวโมง (2n = 4x)

หลงจากยายเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโต เปนเวลา 12 เดอน

ตารางท 16 ปรมาณดเอนเอของตนกลาชดควบคม และตนเททระพลอยด ทผานการแชโคลชซน ความเขมขน 0.20 เปอรเซนต เปนเวลา 24 ชวโมง กบปรมาณดเอนเอมาตรฐานของ ขาวญปน หลงจากยายเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการ เจรญเตบโตเปนเวลา 12 เดอน

พช จ านวนตน จ านวนโครโมโซม

ปรมาณดเอนเอ (พโคกรม) ± SE

ขนาดคเบส ± SE

E. guineensis Jacq. cv. ‘Tenera’ (ชดควบคม)

3 32 3.75 ± 0.26b 1.81 ± 0.05b

E. guineensis Jacq. cv. ‘Tenera’ (ไดรบโคลชซน 0.20% เวลา 24 ชม)

3 64 7.45 ± 0.25a 3.59 ± 0.06a

Oryza sativa cv. ‘Nipponbare’ (ตนเปรยบเทยบมาตรฐานภายนอก)

3 24 0.91 0.43

t-test ** ** **แตกตางอยางมนยส าคญทางสถต (p≤ 0.01) คาเฉลยทก ากบดวยอกษรรวมกนในสดมภเดยวกนไมมความแตกตางทางสถตเมอเปรยบเทยบดวย DMRT

100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000

ก

ค ข

fluorescent intensity

no. o

f nuc

lei

92

บทท 4

วจารณ

1. การเพาะเลยงเนอเยอปาลมน ามน การศกษาครงน ใชแคลลสปาลมน ามนทชกน าจากใบออนเปนชนสวนเรมตนในการทดลอง โดยใชแคลลสทไดจากการศกษาของ สมปอง และคณะ (2547) จากหองปฏบตการเทคโนโลยชวภาพของพชปลก คณะทรพยากรธรรมชาต เพาะเลยงแคลลสดงกลาวบนอาหารแขงสตร MS เตม dicamba เขมขน 0.1 มลลกรมตอลตร รวมกบกรดแอสคอรบคเขมขน 200 มลลกรมตอลตร และน าตาลซโครสเขมขน 3 เปอรเซนต เปนเวลา 1 เดอน พบวาสงเสรมใหเอมบรโอเจนคแคลลสทมลกษณะรวนพฒนาเปน SE และ HE ไดด สอดคลองกบการศกษาของ Te-chato (2002) ทชกน า SE โดยเพาะเลยงแคลลสบนอาหารแขงสตร MS เตมน าตาลซโครสเขมขน 3 เปอรเซนต กรดแอสคอรบค เขมขน 200 มลลกรมตอลตร และสารควบคมการเจรญเตบโต คอ dicamba 0.1 มลลกรมตอลตร พบวาสารควบคมการเจรญเตบโตดงกลาว สงเสรมแคลลสเรมตนใหพฒนาเปนเอมบรโอเจนคแคลลสทเจรญเรว การเพาะเลยง SE และ HE บนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโต เตมกรดแอสคอรบคเขมขน 200 มลลกรมตอลตร และน าตาลซอรบทอลเขมขน 0.2 โมลาร เปนเวลา 3 เดอน ในการศกษานชกน า SSE จ านวนมาก สอดคลองกบการศกษาของ Hilae และ Te-chato (2005) ซงรายงานวาการใชน าตาลซอรบทอลความเขมขน 0.2 โมลาร สามารถชกน า SSE ในปาลมน ามนไดจ านวนมาก น าตาลซอรบทอลทเตมลงในอาหารเพาะเลยงเปนแหลงคารบอนทส าคญตอการพฒนาการสก-แก และการงอกของ SE จากการศกษาผลของน าตาล ชนดและความเขมขนตางๆ เพอชกน าการงอกของ SE พบวาน าตาลบางชนด โดยเฉพาะน าตาลแอลกอฮอลสงเสรมการเกด SSE เมอยาย SSE ไปเพาะเลยงในอาหารทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโต 2-3 เดอนสงเสรมการงอกเปนตนทมทงยอด และรากในเปอรเซนตสง ดงนนการพฒนาเปนพชตนใหมของปาลมน ามนผานการสราง SSE จงมประสทธภาพสง แมนย า เนองจากสามารถชกน าการงอกของตนออนไดปรมาณมาก (Te-chato and Hilae, 2007) ดวยเหตผลดงกลาว ในการศกษาครงนจงใชชนสวน SSE ในการชกน าการเพมชดโครโมโซม

93

2. การชกน าใหเกดพอลพลอยดโดยสารโคลชซน และออรซาลน การชกน าใหเ กดการกลายพนธโดยการใชสารเคมในการเพมจ านวนชดโครโมโซมนน พบวาการจมแชชนสวน SSE ในสารโคลชซน และออรซาลนความเขมขน และระยะเวลาตางๆ ใหเปอรเซนตการรอดชวตเฉลยของ SSE ลดลงตามความเขมขน และระยะเวลาการจมแชทนานขน ส าหรบการเททบสารเคมดงกลาวบนชนสวน SSE พบวาใหผลเชนเดยวกบการจมแชชนสวนในสารโคลชซน และออรซาลน สอดคลองกบการศกษาของ Madon และคณะ (2005) ซงรายงานวา เปอรเซนตการรอดชวตของเมลดงอกของปาลมน ามนทจมแชดวยสารโคลชซน และออรซาลน ลดลงตามความเขมขนทสงขน และระยะเวลาการจมแชสารทนานขน เชนเดยวกบงานวจยของ สทธพงษ และธระ (2553) ซงพบวาเมลดงอกทผานการจมแชสารโคลชซนทระดบความเขมขนสง และระยะเวลานาน ใหตนกลาปาลมน ามน มเปอรเซนตการรอดชวตลดลง นอกจากน Ishigaki และคณะ (2009) ทดลองใหโคลชซนความเขมขน 0.0125 0.025 0.05 และ 0.1 เปอรเซนต เปนระยะเวลา 12 และ 48 ชวโมงกบหญารซ (Brachiaria ruziziensis) พบวา ความเขมขนต าใหเปอรเซนตการรอดชวตทสงกวาความเขมขนสง และการจมแชชนสวนในสารโคล-ชซนทระยะเวลาส นกวาใหเปอรเซนตการรอดชวตสงกวาการจมแชทระยะเวลานาน ทงนอาจเนองจากสารโคลชซน และออรซาลนทความเขมขนสง และใหสารเปนเวลานาน เปนพษตอเซลลทเปนองคประกอบของชนสวนพช โดยสารดงกลาวมความสามารถในการแทรกซมเขาไปยงสวนตางๆ ภายในเซลล (Derman, 1940 อางโดย วชตา, 2537) และมผลท าใหความหนด (viscosity) ของไซโตพลาสซมเปลยนแปลงไป การท างานของเซลลจงผดปกต (Cook และ Loudon, 1952 อางโดย วชตา, 2537) การใชโคลชซน หรอออรซาลน ความเขมขนต าเกนไปจากการศกษานไมสามารถชกน าการเพมชดโครโมโซมได อยางไรกตามการใชสารความเขมขนสงอาจสงผลใหเนอเยอพชตาย หรอเจรญผดปกตได ดงนนระดบความเขมขน และระยะเวลาทเหมาะสม เปนปจจยส าคญทสามารถเพมเปอรเซนตการชกน าตนพอลพลอยดได คาทเปนเกณฑในการเลอกใชสารเคมขางตน คอความเขมขน และระยะเวลาการใหสาร ทท าใหชนสวนพชตายไป 50 เปอรเซนต (LD50) (Sigurbjornsson, 1983) โดยคาดงกลาวแตกตางกนขนกบพนธพช ชนสวนพช ชนดของสารกอกลายพนธ และวธการใหสาร เมอพจารณาถงคา LD50 ของวธการการจมแชสารละลายโคลชซนในการศกษานอยในชวง 0.075 ถง 0.185 เปอรเซนต และการจมแชสารออรซาลนอยในชวง 0.0015 ถง 0.0037 เปอรเซนต สวนวธการเททบดวยสารละลายโคลชซนอยในชวง 0.063 ถง 0.075 เปอรเซนต และออรซาลนอยในชวง 0.0012 ถง 0.0018 เปอรเซนต ในขณะท สทธพงษ และธระ

94

(2553) รายงานวาคา LD50 ของการทดลองจมแชโคลชซนกบเมลดงอกของปาลมน ามนภายนอกหลอดทดลองมคาเทากบ 0.227 เปอรเซนต ซงเปนความเขมขนทสงกวาการศกษานทใชชนสวน SSE ภายใตสภาวะปลอดเชอ ทเปนเชนนอาจเนองจากเมลดงอกของปาลมน ามนทน ามาทดลองจมแชโคลชซนนน ใชความเขมขนทสงกวา และระยะเวลาการใหสารนอยกวาการศกษาน จงใหคาทแตกตางกน นอกจากนเมลดงอกนนมกจกรรมของเนอเยอเจรญนอยกวาชนสวน SSE ดงน นกระบวนการเมตาบอลซมในเซลลของ SSE จงถกท าลายไดมากกวาเมลดงอก คา LD50 ของการศกษานจงใหคาทต ากวา โดย Allum และคณะ (2007) รายงานวาความสามารถในการล าเลยงสารกอกลายพนธเขาสเนอเยอพช และลกษณะพนธกรรมของพช (Stanys et al., 2006; Khosravi et al., 2008) เปนปจจยทมผลตอเปอรเซนตการรอดชวต และการเพมชดโครโมโซม

เมอพจารณาเปอรเซนตการเกดเททระพลอยดในการศกษาน พบวาวธการการจมแชสารโคลชซนความเขมขน 0.20 เปอรเซนต เปนเวลา 24 ชวโมง ใหตนเททระพลอยดไดดทสด โดย Kermani และคณะ (2003) รายงานวาปจจยส าคญทมผลตอการชกน าใหเกดการกลายพนธในพชขนกบชนดของสารกอกลายพนธ โดยสารโคลชซน และสารออรซาลนจดเปนสารกอกลายพนธทกอใหเกดการเพมชดโครโมโซมเชนเดยวกน กลไกการท างานของสารกลมนจะเขาจบกบอลฟาทบลนไดเมอร (∞-tubulin dimer) หรอเบตาทบลนไดเมอร (β-tubulin dimer) ทต าแหนงแตกตางกน จงไมมสปนเดลไฟเบอร ดงนนไมสามารถควบคมการแยกของโครโมโซมไปทขวเซลล เปนผลใหไมเกดการแบงเซลล จงหยดทระยะเมตาเฟส เมอโครมาทดแยกออกจากกนจงไมถกดงไปทขว สงผลใหมจ านวนโครโมโซมเพมเปน 2 เทา ถามการแชสารดงกลาวนานขน อาจสงผลใหมจ านวนโครโมโซมเพมเปน 4 เทา โดยออรซาลนมสมบตยบย งการสรางสปนเดลไฟเบอรทความเขมขน 1/1000 ของความเขมขนโคลชซนทใชกน ดงนนออรซาลนจงเปนพษมากกวา ความเขมขนทใชจงต ากวา สอดคลองกบการศกษาของ Dhooghe และคณะ (2011) ซงรายงานวาออรซาลนใหประสทธผลในการเพมจ านวนชดโครโมโซมไดดกวาโคลชซน แตจากการศกษาโดยทวไปนกวจยจ านวนมากนยมใชโคลชซนชกน าใหเกดเททระพลอยด เนองจากใหผลดกวาสารออรซาลน ดงเชนการศกษาของ Madon และคณะ (2005) ซงจมแชเมลดปาลมน ามนภายนอกสภาพหลอดทดลองในสารละลายโคลชซน และออรซาลนความเขมขนตาง ๆ พบวาโคลชซนเขมขน 12.5 ไมโครโมลาร ทเวลา 6 ชวโมง เกดเททระพลอยดไดดทสด สวนสารละลายออรซาลนทกความเขมขนไมพบตนพอลพลอยด และมการศกษาจ านวนมากทรายงานวาการเพมชดโครโมโซมโดยสารโคลชซน ใหผลดกวาออรซาลน ดงเชนในเสาวรสผลสเหลอง (Rego et al., 2011) Ranunculus asiaticus (Dhooghe et al., 2009a) Helleborus (Dhooghe et al., 2009b) ในพชสกลมะเขอเทศ (Greplova et al., 2009) Spathiphyllum (Eeckhaut et al., 2004) Chaenomeles (Stanys et al.,2006) และ

95

Rhododendron (Vainola, 2000) เปนตน นอกจากนความเขมขน และระยะเวลาการใหสาร มผลตอเปอรเซนตการกลายพนธเชนเดยวกน โดยทวไปความเขมขนของโคลชซนทเหมาะตอการเพมชดโครโมโซม อยในชวง 0.05 - 1.0 เปอรเซนต ออรซาลน 0.0001 - 0.00157 เปอรเซนต สวนระยะเวลาการใหสาร อาจใหเปนชวโมง วน หรอสปดาห (Allum et al., 2007) ดงเชนการศกษาของ Tang และคณะ (2010) รายงานการใชสารโคลชซนทความเขมขนต า แตใชเวลาในการจมแชชนสวนในสารละลายนานขน สามารถเพมเปอรเซนตการเกดตนพอลพลอยดในพช Paulownia tomentosa ได นอกจากน Allum และคณะ (2007) รายงานวาการใชสารทมความเขมขนสง แตใชเวลาในการจมแชชนสวนสนลง สามารถชกน าตนพอลพลอยดไดเชนเดยวกน วธการใหสารจดเปนอกปจจยหนงทมผลตอการกลายพนธ ดงเชนรายงานของ Kermani และคณะ (2003) ซงแชชนสวนขอกหลาบ ในอาหารเหลวทเตมออรซาลนเปนระยะเวลาสน แลวยายบนอาหารแขงเพอชกน ายอด พบวาเกดตนพอลพลอยดไดดกวาการแชชนสวนในอาหารเหลวทเตมออรซาลนเปนระยะเวลานาน นอกจากน Adaniya และ Shirai (2001) พบวาชนสวนปลายยอดของพชสกลขงท เททบดวยโคลชซนบนอาหารแขงสตร MS ใหเปอรเซนตการเกดเททระพลอยดมากกวาการจมแชในอาหารเหลวสตรเดยวกน นอกจากนในพชชนดเดยวกนแตชนสวนทแตกตางกนตอบสนองตอสารเคมเพมชดโครโมโซมตางกน บางชนสวนตอบสนองตอการเพมชดโครโมโซม เมอใชโคลชซนในขณะทบางชนสวนตอบสนองตอการเพมชดโครโมโซมเมอใชออรซาลน ดงเชนการศกษาของ Stanys และคณะ (2006) ทพบวาเมอใชยอดรวมของ Chaenomeles japonica จมแชสารโคลชซน ใหเปอรเซนตการเกดเททระพลอยดไดดกวาสารออรซาลน อยางไรกตามเมอใชชนสวนของใบเลยง พบวาสารออรซาลนใหตนเททระพลอยดมากกวาสารโคลชซน ในการศกษานการใชโคลชซนความเขมขนต า ในระยะเวลาสน (ความเขมขน 0.10 เปอรเซนต เปนเวลา 12 ชวโมง) ใหจ านวนตนเททระพลอยดนอย การเพมความเขมขนสงขน (ความเขมขน 0.20 เปอรเซนต) และระยะเวลานานขน (24 ชวโมง) สงผลใหจ านวนตนเททระ-พลอยดเพมขน (ตารางท 15) ทงนอาจเนองจากความเขมขน และระยะเวลาดงกลาวสามารถยบย งการสรางสายสปนเดลไฟเบอรไดมากกวา สงผลใหมการเพมชดโครโมโซมมากกวาดวย สวนความเขมขนสงกวานสงผลเสยหายตอเซลล เนองจากระยะเวลาการสรางสายสปนเดลมาดงใชเวลานาน เมอโครโมโซมเพมเปนจ านวนมากสดทายไมสามารถแบงเซลลได เซลลแตกตาย ดงเชนเซลลคมทสงเกตไดจากการศกษานมลกษณะบวม ไหม ปากใบปด มลกษณะทเสยหายเหมอนเซลลแตก สงผลใหการท างานของเซลลคมไมปกต ท าใหเซลลไมสามารถเจรญเตบโตได เมอพจารณาการพฒนาของยอดรวมจากชนสวนททรตดวยสารโคลชซน และออรซาลน พบวาชนดสารเคมกอกลายพนธ วธการให และความเขมขนของสารดงกลาว มผลตอการ

96

สรางยอดรวม โดยยอดรวมเฉลยของชดทดลองทจมแชดวยสารโคลชซน และออรซาลนทกความเขมขน ใหจ านวนยอดรวมเฉลยนอยกวาชดควบคม (ตารางท 5 และ 6) สอดคลองกบการศกษาของ Rego และคณะ (2011) ซงพบวาการพฒนาเปนยอดรวม จากการเพาะเลยงชนสวนขอของเสาวรสผลสเหลองทไดรบโคลชซนความเขมขน 25 250 และ 1,250 ไมโครโมลาร ลดลงตามความเขมขนของโคลชซนทเพมขน อยางไรกตามชดทดลองทเททบดวยโคลชซน ความเขมขน 0.05 เปอรเซนต ในการศกษานใหเปอรเซนตการเกดยอดรวมเฉลยเพมขน และทความเขมขนสงขนเปอรเซนตการเกดยอดรวมเฉลยลดลง สวนการเททบดวยออรซาลนความเขมขน 0.001 เปอรเซนต ใหเปอรเซนตการเกดยอดรวมเฉลยมากกวาชดควบคม และทความเขมขนสงขนเปอรเซนตการเกดยอดเฉลยลดลง (ตารางท 7 และ 8)

เมอพจารณาการพฒนาโซมาตกเอมบรโอระยะสกแกของจากชนสวนททรตดวย สารโคลชซน และออรซาลน พบวาชนดสารเคมกอกลายพนธ วธการใหสาร และความเขมขนของสารดงกลาว มผลตอการพฒนาโซมาตกเอมบรโอระยะสกแก โดยชดทดลองทจมแชโคลชซนสงเสรมโซมาตกเอมบรโอระยะสกแกเฉลยเพมขนตามความเขมขนทสงขน สอดคลองกบการศกษาของ Petersen และคณะ (2003) ทเพาะเลยงชนสวนใบ และปลายยอดของ Miscanthus sinensis บนอาหารรวมกบสารโคลชซน หรอออรซาลน พบวาสารโคลชซนทความเขมขนสงสงเสรมการสรางแคลลส และใหเปอรเซนตการเกดพชเททระพลอยดสงกวาออรซาลน สวนการจมแชดวยออรซาลนในการศกษาน พบวาออรซาลนความเขมขนต าไมสงเสรมการพฒนาโซมาตกเอมบรโอระยะสกแก โดยออรซาลน 0.003 เปอรเซนต ชกน าใหโซมาตกเอมบรโอเรมเขาสระยะสกแก อยางไรกตามเปอรเซนตการพฒนาโซมาตกเอมบรโอระยะสกแกลดลงตามความเขมขนทสงขน (ตารางท 5 และ 6)

การเททบดวยโคลชซน หรอออรซาลนทกความเขมขน และระยะเวลาในการศก- ษานไมเกดโซมาตกเอมบรโอระยะสกแก (ตารางท 7 และ 8) ทงนอาจเนองจากการใหสารเปนเวลานานเกนไป ท าใหเปนพษตอเซลลพช และสารดงกลาวอาจสงผลตอการยบย งการแบงเซลล เมอพจารณาลกษณะของยอด และโซมาตกเอมบรโอระยะสกแกทพฒนาจาก SSE ทจมแชในโคลช-ซน และออรซาลน พบวามลกษณะบวม ฉ าน า นอกจากนวธการเททบดวยอาหารเหลวทเตมสารดงกลาว สงผลใหยอดมลกษณะบวม ฉ าน ามาก ใบโปรงแสง และไมสามารถพฒนาเปนตน สอดคลองกบการศกษาของ Franck และคณะ (2004) ทพบวายอดของ Prunus avium ทเพาะเลยงในอาหารเหลวเกดอาการบวม ฉ าน า (hyper hydricity) มากกวาการเพาะเลยงบนอาหารแขง ซง Kei-ichiro และคณะ (1998) รายงานวาอาจเปนไปไดวาโคลชซน และออรซาลนสงผลใหเกดลกษณะผดปกตทางสรรวทยาในลกษณะฉ าน า โดยเนอเยอดดน ามากเกนไป เนองจากเซลลเอพเดอรมส

97

ขาดชนควตเคล หรอไขทเคลอบผว (cuticular layer) ท าใหไมมชนทปองกนการเขาออกของน าทมากเกนไป อกทงมพนทในชน mesophyll เพมขน จงสามารถบรรจน าไดเพมขน จงเกดภาวะบวม ฉ าน า นอกจากน Franck และคณะ (2004) ยงรายงานอกวาปรากฏการณดงกลาวอาจเกดเนองจากสารโคลชซน และออรซาลนท าลายเซลลปากใบ สงผลใหการท างานของปากใบไมปกต และจ านวนชน palisade cell ลดลง สงผลใหจ านวนคลอโรพลาสตทอยในชนนลดลง และปรมาณคลอโรฟลลลดลงดวย จงสงผลใหกระบวนการพฒนาเปนตนกลาลดลง 3. ลกษณะพชดพลอยด และพอลพลอยดในหลอดทดลอง

3.1 ลกษณะทางสณฐานวทยา

เมอพจารณาลกษณะทางสณฐานวทยาของตนเททระพลอยดปาลมน ามน พบวามการเจรญเตบโตชา ใบหนา สเขยวเขม ใบใหญขน แตความยาวลดลง และมรากขนาดใหญ (ตารางท 9 และ 10) สอดคลองกบการศกษาของ Madon และคณะ (2005) ซงรายงานวาตนเททระพลอยดของปาลมน ามนทชกน าจากการแชเมลดงอกในสารละลายโคลชซนความเขมขน 12.5 ไมโครโม-ลาร นาน 6 ชวโมง มการเจรญเตบโตชา และมใบหนา สเขยวเขมกวาตนควบคม เชนเดยวกบการศกษาของ สทธพงษ และธระ (2553) ซงรายงานวาตนเททระพลอยดของปาลมน ามนทชกน าจากการแชเมลดงอกในสารละลายโคลชซนความเขมขน 5 ไมโครโมลาร นาน 48 ชวโมง ใหการเจรญเตบโตชากวาตนควบคม นอกจากนมหลายการศกษาทรายงานวาการเพมจ านวนชดโครโมโซมดวยสารโคลชซนสงผลใหการพฒนาเปนยอด และการเจรญเตบโตชาลง (Ganga and Chezhiyan, 2002; Kadota and Niimi, 2002; Stanys et al., 2006; Yang et al., 2006; Omran et al., 2008; Aleza et al., 2009; Sun et al., 2009) Swanson (1957) รายงานในท านองเดยวกนวาโคลชซนสงผลท าใหเปอรเซนตการแบงเซลลของตนเททระพลอยดลดลง โดยเฉพาะวงจรการแบงเซลลทชาเนองมาจากจ านวนชดโครโมโซมทเพมขน จงมการเจรญเตบโตชากวาตนปกต Rauf และคณะ (2006) รายงานวาโคลชซนความเขมขนสงมผลยบย งการเจรญเตบโตของพช เนองจากระยะเวลาการสรางสายสปนเดลมาดงใชเวลานานจงไมสามารถแบงเซลลได อาจท าใหเซลลแตกตาย และชะงกการเจรญเตบโต ในกรณของใบสเขยวเขมนนเปนผลมาจากปรมาณคลอโรฟลลทเพมมากขน ทเปนเชนน Yan และคณะ (2008) รายงานวาอาจเนองจากโคลชซนสงผลตอการเพม BA (benzyladenine) ฮอรโมนดงกลาวมความสมพนธในทางบวกกบการสรางคลอโรฟลล และการเปลยนอทโอพลาสตไปเปนคลอโรพลาสต ดงนนสใบจงมสเขยวเขมขน สงเคราะหแสงไดมากขน ใบจงหนาขน

98

ตนเททระพลอยดทชกน าจากการศกษาน เกดดอกแยกเพศขนาดใหญในหลอดทดลอง ซงมลกษณะแตกตางกน และดอกเพศเมยสามารถพฒนาเปนผลทไมมเมลด สอดคลองกบการศกษาของ Allum และคณะ (2007) ทรายงานวาจากการใชโคลชซนเพมจ านวนชดโครโมโซมในกหลาบนน เกดตนเททระพลอยดทใหดอกทมขนาดใหญกวาตนควบคม ซงผลของการเพมชดโครโมโซมนน มผลโดยตรงกบลกษณะทางสณฐานวทยาของพช สาเหตอาจเนองจากการเปลยนแปลงทางพนธกรรม ซงสามารถถายทอดไปยงรนตอไปได โดยอาจเกดจากการเพมของชดของยน แลวสงผลใหเกดความผดปกตของโครโมโซมทเกดจากมชนสวนบางสวนของโครโมโซมเกนมาจากปกต ซงโดยทวไปจะมความสามารถในการอยรอดมากกวากรณทมชนสวนบางสวนของโครโมโซมหายไป ผลของการเกดการเพมของยน ท าใหลกษณะทางฟโนไทปเปลยนแปลงได (Otto, 2007) นอกจากนการเปลยนแปลงของการควบคมการแสดงออกของยน (gene expression) เนองจากยโนมพชทเพมขน ท าใหเกดการแปรสภาพของเซลล (cell differentiation) ไดหลายชนด โดยยนบางยนถกยบย งไมใหแสดงออก และยนบางยนแสดงออกไดตางเวลากน จงอาจท าใหลกษณะฟโนไทปเปลยนแปลงได (Osborn et al., 2003) หรออาจเกดจากการเปลยนแปลงของยนแบบ epigenetic คอความผดปกตรปแบบหนงของยน ไมมการเปลยนแปลงล าดบเบส แตมการดดแปลงเบสไซโตซนทอยดานปลาย 5' ของกวนน (CpG) โดยมการเตมหมเมธล (-CH3) ทต าแหนง 5' ของเบสไซโตซนบรเวณโปรโมเตอร ท าใหการแสดงออกของยนลดลง (Parisod et al., 2010) การตรวจสอบตนเททระพลอยดจากลกษณะการเปลยนแปลงทางสณฐานวทยานน เปนเพยงหลกการคดเลอกเบองตนเทานน จ าเปนตองยนยนผลดวยการตรวจสอบลกษณะทางสรรวทยา และเซลลวทยา โดย Zhang และคณะ (2010b) รายงานวา จากการยนยนผลการเกด เททระพลอยดของตน Lagerstoemia indica ดวยการศกษาจ านวนโครโมโซม และตรวจสอบปรมาณดเอนเอ พบวาตนทคาดวาเปนเททระพลอยด ทมลกษณะ ล าตนหนา ใบขนาดใหญนนมเพยง 50 เปอรเซนตเทานนทเปนตนเททระพลอยด สวนตนทเหลอเปนมกโซพลอยด ส าหรบปาลมน ามนทไดจากการศกษานคาดวาตนเททระพลอยดทไดมการเจรญเตบโตชา ทางใบสน ตนเตย และมใบสนกวาตนควบคม ในอนาคตหากยายลงดนปลกท าใหสะดวกตอการเกบเกยว และสามารถปลกจ านวนตนตอพนทไดเพมขน จงใหผลผลตตอพนทเพมขนดวย และตนเททระพลอยดมใบเขยวเขมซงใหปรมาณคลอโรฟลลมากกวาตนปกต จงสามารถน าไปผลตเปนอาหารสตวทมธาตอาหารสง นอกจากนอาจจะใหปรมาณน ามนจากผลปาลม เพมขนมากกวาตนดพลอยด สามารถเพมรายไดใหกบเกษตรกร และน าไปผลตเปนพลงงานทดแทนตามนโยบายของรฐบาลตอไป

99

3.2 ลกษณะทางสรรวทยา

จากการศกษาน พบวาตนเททระพลอยดมขนาดของเซลลคมกวางกวาชดควบคม มความหนาแนนของเซลลคมนอยกวาชดควบคม มจ านวนคลอโรพลาสตตอเซลลคมมากกวาชดควบคม แตมขนาดคลอโรพลาสตเลกกวาชดควบคม (ตารางท 12 และ 13) สอดคลองกบการศกษาของ สทธพงษ และธระ (2553) ซงพบวาตนกลาปาลมเททระพลอยด มขนาดเซลลคมใหญกวา จ านวนคลอโรพลาสตมากกวา แตมความหนาแนนเซลลคมต ากวาตนดพลอยดซงเปนชดควบคม อยางไรกตาม Madon และคณะ (2005) รายงานวา ขนาดเซลลคมของตนเททระพลอยด และตนด-พลอยดนนไมแตกตางกน มหลายการศกษาทรายงานวาขนาดของเซลลปากใบทใหญ สามารถประเมนการเกดพอลพลอยดได เชน ในเสาวรสผลสเหลอง (Rego et al., 2011) ยเขง (Ye et al., 2010) สาล (Sun et al., 2009) หนอไมฝรง (Shiga et al., 2009) Pennisetum (Campos et al., 2009) Chaemomeles japonica (Stanys et al., 2006) และองน (Yang et al., 2006) ความหนาแนนของเซลลคมทลดลงสามารถบงชถงการเกดพอลพลอยดในพชหลายชนดเชน เยอบรา (Gantait et al., 2011) โหระพา (Omidbaigi et al., 2010) เบญจมาศ (Liu and Gao., 2007) Aegilops neglecta (Aryavand et al., 2003) Alocasia (Thao et al., 2003) หมอน (Chakraborti et al., 1998) Zantedeschia (Cohen and Yao, 1996) และกลวย (Hamill et al., 1992) นอกจากนยงสามารถตรวจสอบการเกดเททระพลอยดโดยการนบจ านวนคลอโรพลาสต ซงมการยนยนผลวาจ านวนคลอโรพลาสตในตนเททระพลอยดมจ านวนมากกวาในตนดพลอยดสองเทา ในหมอน (Chakraborti et al., 1998) พทรา (Gu et al., 2005) Poplar (Edward et al., 2009) Lagerstoemia indica (Zhang et al., 2010b) โหระพา (Omibaigi et al., 2010) และเสาวรสผลสเหลอง (Rego et al., 2011) เปนตน คาความหนาแนน และขนาดของเซลลคม รวมทงจ านวนคลอโรพลาสตตอเซลลคมทไดจากการศกษาน ใชเปนตวบงชการเกดเททระพลอยดไดอยางแมนย า Hodgson และคณะ (2010) รายงานวาพอลพลอยดมความสมพนธกบขนาดของเซลลคม และขนาดของจโนมในพชดอก จากความสมพนธดงกลาวท าใหการตรวจสอบการเกดพอลพลอยด โดยการศกษาขนาดของเซลลคม ความหนาแนนของเซลลคม และจ านวนคลอโรพลาสตนน เปนวธการตรวจสอบทใหผลแมนย า ไมยงยาก ไมสนเปลองคาใชจาย และใชระยะเวลาสน เมอพจารณาปรมาณคลอโรฟลลจากแผนใบในการศกษาน พบวาตนเททระ-พลอยดใหปรมาณคลอโรฟลลบ และคลอโรฟลลรวมมากกวาตนควบคมอยางมนยส าคญทางสถต (p ≤ 0.01) (ตารางท 14) สอดคลองกบการศกษาของ Beck และคณะ (2003) ทพบวาระดบพลอยด

100

ทเพมขน มความสมพนธกบปรมาณคลอโรฟลล และคลอโรพลาสตทเพมขนใน black wattle เชนเดยวกบการศกษาของ Shao และคณะ (2003) ทพบวาตนเททระพลอยดของทบทมมปรมาณคลอโรฟลลมากกวาตนควบคม ทเปนเชนนอาจเนองจากตนเททระพลอยดใหคลอโรพลาสตตอปากใบมากกวาตนดพลอยด จงใหปรมาณคลอโรฟลลเพมขน ในทางตรงกนขาม Xu และคณะ (2010) พบวาตนเททระพลอยดในพช Juncus effuses ใหปรมาณคลอโรฟลลเอ คลอโรฟลลบ และคลอโรฟลลรวมนอยกวาตนควบคม สาเหตอาจเนองจากการไมรวมกนของระบบ thylakoid membrane ในตนเททระพลอยด อยางไรกตาม Warner และ Edwards (1989) รายงานวาปรมาณคลอโรฟลลในตนเททระพลอยด Atriplex confertifolia ไมแตกตางกบตนดพลอยด

3.3 การตรวจสอบทางเซลลวทยา

การตรวจสอบการเกดพอลพลอยด โดยศกษาจ านวนโครโมโซมของปาลมน ามน จากเซลลปลายรากในการศกษาน พบวาตนควบคมมจ านวนโครโมโซม 32 แทง และตนทเพมชดโครโมโซม เกดตนเททระพลอยด มจ านวนโครโมโซม 64 แทง สวนตนมกโซพลอยด มจ านวนโครโมโซมผสมระหวางดพลอยด และเททระพลอยด คอ 32 และ 64 แทง ท านองเดยวกบการศกษา ของ Madon และคณะ (2005) และ สทธพงษ และธระ (2553) ซงรายงานวาจ านวนโครโมโซมปาลมน ามนตนควบคมทเปนพชดพลอยด มจ านวนโครโมโซม 2n=2x=32 สวนตนเททระพลอยดทชกน าไดจากการทรตดวยสารโคลชซน มจ านวนโครโมโซมมากกวาดพลอยดสองเทา (2n=4x=64) และตนมกโซพลอยด มจ านวนโครโมโซมผสมระหวางดพลอยด และเททระพลอยด (2n=2x=32 และ 2n=4x=64) โดยทวไปการชกน าใหเกดการเพมจ านวนชดโครโมโซมน น พลอยดมการเปลยนแปลงหลายระดบ เชน ทรพลอยด เททระพลอยด และมกโซพลอยด เปนตน มหลายการศกษาทตรวจสอบระดบการเพมจ านวนชดของโครโมโซมหรอระดบพลอยด โดยการนบจ านวนโครโมโซม เชน ใน Lagerstoemia indica (Zhang et al., 2010b) Ranunculus (Dhooghe et al., 2009a) กหลาบ (Khosravi et al., 2008; Allum et al., 2007) Spathiphyllum wallisii (Eeckhault et al., 2004) และ Alocasia (Thao et al., 2003) เปนตน ซงการตรวจสอบจ านวนโครโมโซมปลายรากนน เปนวธทสามารถบงชการเกดพอลพลอยดไดแมนย าทสด (Dolezel et al., 2007) แตมกถกเลอกใชเปนวธสดทาย เนองจากตองใชเทคนค และความช านาญในการตรวจสอบ รวมทงตองตรวจสอบเซลลจ านวนมาก ใชเวลานาน (Bohanec, 2003) การตรวจสอบการเกดพอลพลอยดอกวธทนยม ใหผลรวดเรว และท าไดปรมาณมากในระยะเวลาทจ ากด คอการศกษาปรมาณดเอนเอโดย

101

โฟลไซโทเมทร เชน การประเมนเททระพลอยดในยอดของเยอบรา (Gantait et al., 2011) ใบของตน Dioscorea zingiberensis (Zhang et al., 2010a) ใบของ Paulownia tomentosa (Tang et al., 2010) และใบสาล (Sun et al., 2009) เปนตน การศกษานใชดเอนเอขาวญปน เปนดเอนเอมาตรฐาน พบวาใบออนของปาลมน ามนดพลอยด มปรมาณดเอนเอ 3.75 พโคกรม และใบออนตนเททระพลอยดมปรมาณดเอนเอเพมเปนสองเทา คอ 7.45 พโคกรม สอดคลองกบการศกษาของ Madon และคณะ (2005) ทรายงานวาการตรวจสอบดวยโฟลไซโทเมทร ตนเททระพลอยดใหระดบพลอยดเพมขนเปน 2 เทา ของตนดพลอยด ปรมาณดเอนเอของปาลมน ามน ขนกบชนดของสายพนธ ชนสวนพช และดเอนเอมาตรฐานทใชเปนตวเปรยบเทยบภายนอก ดงเชนรายงานของ Rival และคณะ (1997) ทศกษาปรมาณดเอนเอของปาลมน ามนเทเนอรา พนธลกผสม G6446 โดยใช Petunia hybrida เปนดเอนเอมาตรฐาน พบวา ใบออนมปรมาณดเอนเอ 3.786 พโคกรม และแคลลส 3.212 พโคกรม นอกจากน Srisawat และคณะ (2005) พบวาการศกษาปรมาณดเอนเอของใบออนปาลมน ามนเทเนอรา (T38) โดยใชถวเหลอง มะเขอเทศ และขาวโพด เปนดเอนเอมาตรฐาน มคา 4.18 3.97 และ 4.34 พโคกรม ตามล าดบ และการวดปรมาณดเอนเอจากชนสวนเอมบรโอ ปลายยอด และแคลลสของปาลมน ามน โดยใชถวเหลองเปนดเอนเอมาตรฐาน มคา 4.16 4.15 และ 4.68 พโคกรม ตามล าดบ โดย Loureiro และคณะ (2007) รายงานวา เนองจากใบของปาลมน ามนมสารทตยภม คอ สารประกอบฟโนลคปรมาณมากกวาเอมบรโอ จงสงผลใหกรดแทนนนรบกวนการดดกลนแสงของเครองโฟลไซโทเมทรมากกวา จงใหคาปรมาณดเอนเอทแตกตางกน แมวาปจจบนวธการประเมนการเกดเททระพลอยดนน นยมใชโฟลไซโทเมทร เนองจากสามารถศกษาเนอเยอในปรมาณมาก ระยะเวลาสน (Dolezel et al., 2007) และสามารถตรวจสอบในชนสวนพชทแตกตางกน โดยเฉพาะการประเมนการเกดมกโซพลอยด ซงใหผลชดเจน รวดเรวกวาการตรวจสอบดวยการศกษาจ านวนโครโมโซม ซงตองอาศยเวลา และความช านาญเพอยนยนการเกดมกโซพลอยด (Leus et al., 2009) อยางไรกตามการประเมนดวยวธน มค าใช จ าย สง และตองใช เอนไซมและสย อมด เอนเอทจ า เพาะตอพชแตละชนด ดงน น Vanstechelman และคณะ (2010) รายงานวา วธทเหมาะสมตอการประเมนระดบพลอยดทใหผลแมนย าทสด โดยเฉพาะมกโซพลอยด คอการตรวจสอบรวมกนระหวางการศกษาจ านวนโครโมโซมจากเซลลปลายราก และการใชใบตรวจสอบปรมาณดเอนเอ โดยโฟลไซโทเมทร อยางไรกตาม ในกรณปาลมน ามนในการศกษาน การตรวจสอบลกษณะทางสรรวทยากเพยงพอ สามารถประเมนตนเททระพลอยดไดแมนย า เพราะมความสมพนธใกลชดกนระหวางลกษณะทางสรรวทยา และลกษณะทางเซลลวทยา

103

102

บทท 5

สรป

1. อาหารแขงสตร MS เตม dicamba เขมขน 0.1 มลลกรมตอลตร รวมกบกรดแอสคอรบคเขมขน 200 มลลกรมตอลตร และน าตาลเขมขน 3 เปอรเซนต สงเสรมใหแคลลสพฒนาเปน SE และ HE ได เมอน า SE และ HE ไปเพาะเลยงบนอาหารแขงสตร MS ทปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโต เตมกรดแอสคอรบคเขมขน 200 มลลกรมตอลตร และน าตาลซอรบทอลเขมขน 0.2 โมลาร เปนเวลา 3 เดอน สงเสรมการสราง SSE จ านวนมาก 2. การจมแช SSE ในสารละลายออรซาลน เขมขน 0.001 เปอรเซนต เปนเวลา 12 ชวโมง ใหเปอรเซนตรอดชวตใกลเคยง 50 เปอรเซนต แตไมสามารถชกน าเปนตนได จงไมแนะน าใหใชสารออรซาลนในการชกน าใหเกดเททระพลอยด 3. การจมแชกลม SSE ทพฒนาจาก HE ในสารละลายคอลชซน เขมขน 0.1 เปอรเซนต เปนเวลา 12 ชวโมง และ 0.2 เปอรเซนต เปนเวลา 24 ชวโมง ใหเปอรเซนตรอดชวตใกลเคยง 50 เปอรเซนต และใหตนทมลกษณะทางสณฐานวทยาซงคาดวาจะเปนเททระพลอยด 4. ลกษณะทางสณฐานวทยาของตนเททระพลอยด มการเจรญเตบโตชา ใบหนา สเขยวเขม ใบใหญขน แตความยาวใบลดลง และใหรากขนาดใหญกวาตนควบคม 5. ตนทคาดวาจะเปนเททระพลอยด มขนาดของเซลลคมกวาง ความหนาแนนของเซลลคมนอย จ านวนเมดคลอโรพลาสตตอเซลลคมมาก ขนาดเมดคลอโรพลาสตเลก และปรมาณคลอโรฟลลรวม มากกวาตนควบคม 6. การตรวจสอบลกษณะทางเซลลวทยารวมกนระหวางการศกษาจ านวนโครโมโซมจากเซลลปลายราก และการใชใบตรวจสอบปรมาณดเอนเอ โดยโฟลไซโทเมทร พบวาตนควบคมมจ านวนโครโมโซม 32 แทง (2n=2x=32) และตนทเพมชดโครโมโซม เกดตนเททระพลอยด มจ านวนโครโมโซม 64 แทง (2n=4x=64) สวนตนมกโซพลอยด มจ านวนโครโมโซมผสมระหวางดพลอยด และเททระพลอยด คอ 32 และ 64 แทง (2n=2x=32 และ 2n=4x=64) และการศกษาปรมาณดเอนเอ โดยโฟลไซโทเมทร พบวาใบออนของปาลมน ามนดพลอยด มปรมาณดเอนเอ 3.75 พโคกรม และใบออนตนเททระพลอยดมปรมาณดเอนเอเพมเปนสองเทา คอ 7.45 พโคกรม

103

เอกสารอางอง

กฤษฎา สมพนธารกษ. 2546. การปรบปรงพนธพช : พนฐาน วธการ และแนวคด. กรงเทพฯ : ภาควชาพชไรนา คณะเกษตร มหาวทยาลยเกษตรศาสตร. จรสศร นวลศร. 2548. เอกสารค าสอน วชาการปรบปรงพนธพชสวน. สงขลา : ภาควชาพชศาสตร

คณะทรพยากรธรรมชาต มหาวทยาลยสงขลานครนทร. ธนวด พรหมจนทร. 2551. การชกน าโซมาตกเอมบรโอชดทสอง และการวเคราะหความ

แปรปรวนของตนปาลมน ามนทพฒนาโดยใชเครองหมายอารเอพด. วทยานพนธวทยาศาสตรมหาบณฑต มหาวทยาลยสงขลานครนทร.

ธระ เอกสมทราเมษฐ ชยรตน นลนนท ธระพงศ จนทรนยม ประกจ ทองค า และหะสน กอมะ. 2543. เอกสารประกอบการฝกอบรม การจดการสวนปาลมน ามน. สงขลา: คณะทรพยากรธรรมชาต มหาวทยาลยสงขลานครนทร.

นพพร คลายพงษพนธ เรวต เลศฤทยโยธน รงสฤษด กาวตะ และสนธชย จนทรเปรม. 2546. พชเศรษฐกจ. กรงเทพฯ : ภาควชาพชไรนา คณะเกษตร มหาวทยาลยเกษตรศาสตร.

นภาพร นาคอดม. 2548. การเกดโซมาตกเอมบรโอเจเนซสจากการเพาะเลยงเซลลแขวนลอยปาลมน ามน. วทยานพนธวทยาศาสตรมหาบณฑต มหาวทยาลยสงขลานครนทร.

นตยศร แสงเดอน. 2551. พนธศาสตรพช. กรงเทพฯ : ภาควชาพนธศาสตร คณะวทยาศาสตรมหาวทยาลยเกษตรศาสตร.

เพญตมาส กระมท และสมปอง เตชะโต. 2552. ผลของแหลงคารบอน และความเขมขนของสตร อาหารตอพฒนาการของโซมาตกเอมบรโอจากเอมบรโอเจนคเซลลซสเพนชนของปาลมน ามนบนอาหารแขง. ว. วทยาศาสตรเกษตร 40(3)(พเศษ): 448-451.

วชชตา รงเรอง. 2537. ผลของโคลชซน และรงสแกมมาทมตอการกลายพนธของหนาววพนธ Double Spathe ทเลยงในสภาพปลอดเชอ. วทยานพนธวทยาศาสตรมหาบณฑต มหาวทยาลยเกษตรศาสตร.

ราตร สจารย. 2540. การปรบปรงพนธมงคด (Garcinia mangostana L.) โดยใชโคลชซนในหลอด

ทดลอง. วทยานพนธวทยาศาสตรมหาบณฑต มหาวทยาลยสงขลานครนทร. สทธพงษ พรมมา และธระ เอกสมทราเมษฐ. 2553. การชกน าพอลพลอยดและลกษณะสณฐานของ ตนกลาปาลมน ามน. ว. เกษตรพระจอมเกลา 28: 36-43. สมปอง เตชะโต. 2537. การเพาะเลยงเนอเยอพช หลกการและพชเศรษฐกจทส าคญ. สงขลา : ภาควชาพชศาสตร คณะทรพยากรธรรมชาต มหาวทยาลยสงขลานครนทร.

104

สมปอง เตชะโต อาสลน หเล และอบรอเฮม ยด า. 2547. การชกน าเอมบรโอเจนคแคลลสและพช ตนใหมจากใบออนปาลมน ามนตนโตทใหผลผลตด. ว. สงขลานครนทร วทท. 26:617-628.

อาสลน หเล. 2545. การเพาะเลยงใบออนของตนปาลมน ามนทใหผลผลตดเพอการขยายพนธ. วทยานพนธวทยาศาสตรมหาบณฑต มหาวทยาลยสงขลานครนทร.

อาสลน หเล และสมปอง เตชะโต. 2545. การปรบปรงวธการพฒนาเปนพชตนใหมผานกระบวน การโซมาตกเอมบรโอของปาลมน ามนทไดจากการเพาะเลยงใบออน. การประชมเสนอ ผลงานวจยระดบบณฑตศกษาของประเทศไทย ครงท 3 วนท 18-19 กรกฎาคม 2545 ณ มหาวทยาลยเทคโนโลยสรนาร จงหวดนครราชสมา.

Adaniya, S. and Shirai, D. 2001. In vitro induction of tetraploid ginger (Zingiber officinale Roscoe) and its pollen fertility and germinability. Scientia Horticulturae 88: 277-287.

Aleza, P., Juarez, J., Ollitrault, P. and Navarro, L. 2009. Production of tetraploid plants of non apomictic citrus genotypes. Plant Cell Reports 28: 1837-1846. Allum, J.F., Bringloe, D.H. and Roberts, A.V. 2007. Chromosome doubling in a Rosa rugosa Thunb. hybrid by exposure of in vitro nodes to oryzalin: the effects of node length,

oryzalin concentration and exposure time. Plant Cell Reports 26: 1977-1984. Al-Khayri, J.M. and Al-Bahrany, A.M. 2001. Silver nitrate and 2-isopentyladenine promote

somatic embryogenesis in date palm (Phoenix dactylifera L.). Scientia Horticulturae 89: 291-298.

Anderson, J.A., Moussetdeclas, C., Williams, E.G., Taylor, N.L. 1991. An in vitro chromosome doubling method for clovers (Trifolium spp.). Genome 34: 1-5. Aryavand, A., Ehdaie, B., Tran, B. and Waines, J.G. 2003. Stomatal frequency and size differentiate ploidy levels in Aegilops neglecta. Genetic Resources and Crop Evolution 50: 175-182. Barbara, T. and Elwira, S. 2002. Flow cytometric analysis of DNA content in cloudberry

(Rubus chamaemorus L.) in vitro cultures. Plant Science 164: 129-134. Beck, S.L., Fossey, A. and Mathura, S. 2003. Ploidy determination of black wattle (Acacia

mearnsii) using stomatal chloroplast counts. Southern African Forestry Journal 192: 79- 82.

105

Blakeslee, A.F. and Avery, A.G. 1937. Methods of inducing doubling of chromosomes in plants. Heredity 28: 393-411.

Bohanec, B. 2003. Ploidy determination using flow cytometry. In Doubled Haploid Production in Crop Plants (eds. M. Maluszynski, K..J. Kasha, B.P. Forster and I. Szorejko), pp. 397-403. Dordrecht : Kluwer Press.

Campos, J.M.S., Davide, L.C., Salgado, C.C., Santos, F.C., Costa, P.N., Silva, P.S., Alves, C.C.S., Viccini, L.F. and Pereira, A.V. 2009. In vitro induction of hexaploid plants from triploid hybrids of Pennisetum purpureum and Pennisetum glaucum. Plant Breeding 128: 101-104.

Chakraborti, S.P., Vijayan, K., Roy, B. and Qadri, S. 1998. In vitro induction of tetraploidy in mulberry (Morus alba L.). Plant Cell Reports 17: 799-803. Chan, J.L., Saenz, L., Talavera, C., Hornung, R., Robert, M. and Oropeza, C. 1998. Regeneration

of coconut (Cocos nucifera L.) from plumule explants through somatic embryogenesis. Plant Cell Reports 17: 515-521.

Chauvin, J.E., Label, A. and Kermarrec, M.P. 2005. In vitro chromosome doubling in tulip (Tulipa gesneriana L.). The Journal of Horticultural Science and Biotechnology 80: 693- 698. Cohen, D. and Yao, J.L. 1996. In vitro chromosome doubling of nine Zantedeschia cultivars. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 47: 43-49. Constantin, M.J. 1975. Mutations for chlorophyll deficiency in barley. In: Proceedings 3th Barley

genetics, (ed. H. Gaul), pp. 96-112. Munich : Verlag Karl Thiemig. Corley, R.V. 2003. Oil palm. A major tropical crop. Biotrop Bulletin 19: 5-8. Cousin, A., Heel, K., Cowling, W.A. and Nelson, A.N. 2009. An efficient high-troughput flow cytometric method for estimating DNA ploidy level in plants. Cytometry Part A 75: 1015-1019. Daigny, G., Paul, H., Sangwan, R.S. and Sangwan-Norrell, B.S. 1996. Factors influencing

secondary somatic embryogenesis in Malus domestica Borkh. (cv. ‘Gloster 69’). Plant Cell Reports 16: 153-157.

de Carvalho, J.F.R.P., de Carvalho, C.R. and Otoni, W.C. 2005. In vitro induction of polyploidy in annatto (Bixa orellana). Plant Cell, Tissue and Organ Culture 80: 69-75.

106

de Mello, S.M., Callegari, J. and Zanettini, B. 2000. Induction and identification of polyploids in Cattleya intermedia Lindl. (Orchidaceae) by in vitro techniques. Ciencia Rural 30: 105-111. Derman, H. 1954. Colchiploidy in grapes. Heredity 45: 159-172. Derman, H. 1965. Colchiploidy and histological imbalance in triploid apple and pear. The

American Journal of Botany 52: 353-359. Dewey, D.R. 1980. Some application and misapplication of induced polyploidy to plant breeding.

In Polyploidy: biological relevance (ed. W.H. Lewis) Vol.13, pp. 445-470. NewYork: Plenum Press.

Dhooghe, E., Denis, S., Eeckhaut, T., Reheul, D. and Van Labeke, M.C. 2009a. In vitro induction of tetraploids in ornamental Ranunculus. Euphytica 168: 33-40.

Dhooghe, E., Grunewald, W., Leus, L. and Van Labeke, M.C. 2009b. In vitro polyploidisation of Helleborus species. Euphytica 165: 89-95.

Dhooghe, E., Van L.K., Eeckhaut, T., Leus, L. and Van, H.J. 2011. Mitotic chromosome doubling of plant tissue in vitro. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 104: 359-373. Dolezel, J., Greilhuber, J. and Suda, J. 2007. Flow cytometry with plants: An overview. In Flow

Cytometry with Plant Cells (eds. J. Dolezel, J. Greilhuber and J. Suda), pp. 41-65. Weinheim : Wiley Press.

Dubcovsky, J. and Dvorak, J. 2007. Genome plasticity a key factor in the success of polyploid wheat under domestication. Science 316: 1862-1865. Dutt, M., Vasconcellos, M., Song, K.J., Gmitter, F.G. and Grosser, J.W. 2010. In vitro production

of autotetraploid Ponkan mandarin (Citrus reticulata Blanco) using cell suspension cultures. Euphytica 173: 235-242. Edward, D., Ulrich, K., Naujoks, G. and Schroder, M.B. 2009. Induction of tetraploid poplar and black locust plants using colchicine: chloroplast number as an early marker for selecting polyploids in vitro. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 99: 353-357. Eeckhaut, T., Leus, L. and Van, H. J. 2005. Exploitation of flow cytometry for plant breeding.

Acta Physiologia Plantarum 27: 743-750.

107

Eeckhaut, T., Werbrouck, S., Leus, L., Van Bockstaele, E. and Debergh, P. 2004. Chemically induced polyploidization in Spathiphyllum wallisii Regel through somatic

embryogenesis. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 78: 241-246. Escandon, A.S., Miyajima, I., Alderete, M., Hagiwara, J.C., Facciuto, G., Mata, D. and Sato. S.M.

2005. Wild ornamental germplasm exploration and domestication based on biotechnological approaches. In vitro colchicine treatment to obtain a new cultivar of Scoparia montevidensis. Electronic Journal of Biotechnology 8: 204-211.

Franck, T., Kevers, C., Gaspar, T., Dommes, J., Deby, C., Greimers, R., Serteyn, D. and Deby- Dupont, G. 2004. Hyperhydricity of Prunus avium shoots cultured on gelrite: a controlled stress response. Plant Physiology and Biochemistry 42: 519-527.

Gajdosova, A., Vookova, B., Kormutak, A., Libiakova, G. and Dolezel, J. 1995. Induction protein composition and DNA ploidy level of embryogenic calli of silver fir and its hybrids. Biologia Plantalum 37: 169-176.

Galbraith, D.W., Harkins, K.R., Maddox, J.R., Ayres, N.M., Sharma, D.P. and Firoozabady, E. 1983. Rapid flow cytometric analysis of the cell cycle in intact plant tissue. Science 220: 1049-1051.

Ganga, M. and Chezhiyan, N. 2002. Influence of the antimitotic agents colchicine and oryzalin on in vitro regeneration and chromosome doubling of diploid bananas (Musa spp.). The Journal of Horticultural Science and Biotechnology 77: 572-575. Gantait, S., Mandal, N., Somnath, B. and Prakash, K.D. 2011. Induction and identification of tetreaploids using in vitro colchicine treatment of Gerbera jamesonii Bolus cv. Sciella. Plant Cell, Tissue and Organ Culture doi: 10.1007/s 11240-011-9947-1. Gao, S.L., Zhu, D.N., Cai, Z.H. and Xu ,D.R. 1996. Autotetraploid plants from colchicine treated

bud culture of Salvia miltiorrhiza Bge. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 47: 73-77. Gao, S., Chen, B. and Zhu, D. 2002. In vitro production and identication of autotetraploids of

Scutellaria baicalensis. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 70: 289-293. Greplova, M., Polzerova, H. and Domkarova, J. 2009. Intra- and interspecific crosses of Solanum materials after mitotic polyploidization in vitro. Plant Breeding 128: 651-657.

108

Groll, J., Mycock, D.J., Gray, V.M. and Laminski, S. 2001. Secondary somatic embryogenesis of cassava on picloram supplemented media. Plant Cell, Tissue and Organ culture 65: 201- 210. Gu, X.F., Yang, A.F., Meng, H. and Zhang, J.R. 2005. In vitro induction of tetraploid Zizyphus jujuba Mill. Cv. Zhanhua. Plant Cell Reports 24: 671-676. Hamill, S., Smith, M. and Dodd, W. 1992. In vitro induction of banana autotetraploids by

colchicine treatment of micropropagated diploids. Australian Journal of Botany 40: 887-896.

Heping, H., Shanlin, G., Lanlin, C. and Xiaoke, J. 2008. In vitro induction and identification of autotetraploids of Dioscorea zingiberensis. In Vitro Cellular and Developmental Biology 44: 448-455.

Hilae, A. and Te-chato, S. 2005. Effects of carbon sources and strength of MS medium on germination of somatic embryos of oil palm (Elaeis guineensis Jacq.). Songklanakarin Journal Science Technology 27: 630-635.

Hodgson, J.G., Sharafi, M., Jalili, A., Dı´az, S., Montserrat-Martı´, G., Palmer, C., Cerabolini, B., Pierce, S., Hamzehee, B., Asri, Y., Jamzad, Z., Wilson, P., Raven, J.A., Band, S.R., Basconcelo, S., Bogard, A., Carter, G., Charles, M., Castro-Dı´ez, P., Cornelissen,

J.H.C., Funes, G., Jones, G., Khoshnevis, M., Pe´rez-Harguindeguy, N., Pe´rez-Rontome´, M.C., Shirvany, F.A., Vendramini, F., Yazdani, S., Abbas-Azimi, R., Boustani, S., Dehghan, M., Guerrero-Campo, J., Hynd, A., Kowsary, E., Kazemi-Saeed, F., Siavash, B., Villar-Salvador, P., Craigie, R., Naqinezhad, A., Romo-Dı´ez, A., de Torres Espuny, L. and Simmons, E. 2010. Stomatal vs. genome size in angiosperms: the somatic tail wagging the genomic dog?. Annals of Botany 105: 573-584.

Ishigaki, G., Gondo, T., Suenaga, K. and Akashi, R. 2009. Induction of tetraploid ruzigrass (Brachiaria ruziziensis) plants by colchicine treatment of in vitro multiple-shoot clumps and seedlings. Japanese Society of Grassland Science 55: 164-170.

Jackson, B.P. and Rowson, J.M. 1953. Alkaloid biogenesis in tetraploid Stramonium. Journal of Pharmacy and Pharmacology 5: 778-793.

109

James, D.J., Mackenzie, K.A.D. and Malhotra, S.B. 1987. The induction of hexaploidy in cherry rootstocks using in vitro regeneration techniques. Theoretical and Applied Genetics 73: 589-594.

Jesus-Gonzalez, L.D. and Weathers, P.J. 2003. Tetraploid Artemisia annua hairy roots produce more artemisinin than diploids. Plant Cell Reports 21: 809-813.

Kadota, M. and Niimi, Y. 2002. In vitro induction of tetraploid plants from a diploid Japanese pear cultivar (Pyrus pyrifolia N. cv. Hosui). Plant Cell Reports 21: 282-286.

Kanchanapoom, K. and Domyoas, P. 1999. The origin and development of embryoids in oil palm (Elaeis guineensis Jacq.) embryo culture. ScienceAsia 25: 193-200.

Kei-ichiro, U., Susan, C. and Kalidas, S. 1998. Reduced hyperhydricity and enhanced growth of tissue culture-generated raspberry (Rubus sp.) clonal lines by Pseudomonas sp. isolated from oregano. Process Biochemistry 33: 441-445.

Kermani, M.J., Sarasan, V., Roberts, A.V., Yokoya, K., Wentworth, J. and Sieber, V.K. 2003. Oryzalin-induced chromosome doubling in Rosa and its effect on plant morphology and pollen viability. Theoretical and Applied Genetics 107: 1195-1200. Khalil, S.M., Cheah, K.T., Perez, E.A., Gaskill, D.A. and Hu, J.S. 2002. Regeneration of banana

(Musa spp. AAB CV. Dwarf Brazilian) via secondary somatic embryogenesis. Plant Cell Reports 20: 1128-1134.

Khosravi, P., Kermani, M.J., Nematzadeh, G.A., Bihamta, M.R. and Yokoya, K. 2008. Role of mitotic inhibitors and genotype on chromosome doubling of Rosa. Euphytica 160: 267-

275. Koarapatchaikol, K., 2007. Polyploidy plant production via shoot bud-derived callus of diploid

banana (Musa spp.) by oryzalin. Ph.D. Dissertation in Biology. Prince of Songkla University.

Konan, E. E., Durand, G. T., Kouadio, J.Y., Flori, A. And Rival, A. 2006. A modeling approach of the in vitro conversion of oil palm (Elaeis guineensis) somatic embryo. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 84: 99-112.

Leitch, A.R. and Leitch, I.J. 2008. Genomic plasticity and the diversity of polyploid plants. Science 320: 481-483.

110

Leus, L., Van Laere, K., Dewitte, A. and van Huylenbroeck, J. 2009. Flow cytometry for plant breeding. Acta Horticulturae 836: 221-226.

Li, W.L., Berlyn, G.P. and Ashton, P.S. 1996. Polyploids and their structural and physiological characteristics relative to water deficient in Betula papyrifera (Betulaceae). American Journal of Botany 83: 15-20.

Li, W.D., Biswas, D.K., Xu, H., Xu, C.Q., Wang, X.Z., Liu, J.K. and Jiang, G.M. 2009. Photosyn thetic responses to chromosome doubling in relation to leaf anatomy in Lonicera japonica subjected to water stress. Functional Plant Biology 36: 783-792.

Lioret, C. 1981. Vegetative propagation of oil palm by somatic embryogenesis. In Oil Palm in the Eighties. (eds. E. Pushparajah and P.S. Chew) Vol. I, pp. 163-172. Kuala Lumpur: Incorporated Society of Planters.

Liu, Q.Z., Zhao, H.J., Liu, P., Mong, R.G. and Freddi, H. 2001. Regeneration of tetraploid plants of royal gala apple variety from in vitro leave treated with colchicine. Journal of Fruit Science 18: 7-10.

Liu, Z. and Gao, S. 2007. Micropropagation and induction of autotetraploid plants of Chrysanthemum cinerarifolium (Trev.) Vis. In Vitro Cellular and Developmental Biology 43: 404-408.

Liu, G., Li, Z. and Bao, M. 2007. Colchicine-induced chromosome doubling in Platanus acerifolia and its effect on plant morphology. Euphytica 157: 145-154.

Loureiro, J., Rodriguez, E., Dolezel, J., and Santos, C. 2007. Two new nuclear isolation buffers for plant DNA flow cytometry: A test with 37 species. Annals of Botany 100: 875-888.

Luckett, D. 1989. Colchicine mutagenesis is associated with substantial heritable variation in cotton. Euphytica 42: 177-182.

Madon, M., Clyde, M.M., Hashim, H., Mohd, Y.Y., Mat, H. and Saratha, S. 2005. Polyploidy induction of oil palm through colchicines and oryzaline treatments. Jounal of Oil Palm Research 17: 110-123.

Madon, M., Phoon, L.Q., Clyde, M.M., and Mohd-Din, A. 2008. Application of flow cytometry for estimation of nuclear DNA content in Elaeis . Jounal of Oil Palm Research 20: 447-452.

111

Maximova, S.N., Alemanno, L., Young, A., Ferriere, N., Traore, A. and Guiltinan, M.J. 2002. Efficiency, genotypic variability and cellular origin of primary and secondary somatic embryogenesis of Theobroma cacao L. In Vitro Cellular and Developmental Biology 38: 252-259.

Nguyen, T.T., Kenji, U., Ikuo, M., Yukio, O., and Hiroshi, O. 2003. Induction of tetraploids in ornamental Alocasia through colchicine and oryzalin treatments. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 72: 19-25.

Nimura, M., Kato, J., Horaguchi, H., Mii, M. and Sakai, K. 2006. Induction of fertile amphi- diploids by artificial chromosome-doubling in interspecific hybrid between Dianthus caryophyllus L. and D. japonicus Thunb. Breeding Science 56: 303-310.

Notsuka, K., Tsuru, T. and Shiraishi, M. 2000. Induced polyploidy grapes via in vitro chromosome doubling. Journal of The Japanese Society for Horticultural Science 69: 543-551. Omidbaigi, R., Mirzaee, M., Hassani, M.E. and Moghadam, M.S. 2010. Induction and identification of polyploidy in basil (Ocimum basilicum L.) medicinal plant by colchicine treatment. International Journal of Plant Production 4: 87-98. Omran, A., and Mohamad, B.N. 2008. Polyploidization effect in two diploid cotton (Gossypium herbaceum L. and G. arboretum L.) species by colchicines treatments. African Journal of Biotechnology 7: 102-108. Omran, S.A., Guerra-Sanz, J.M. and Cardenas, J.A.G. 2008. Methodology of tetraploid induction and expression of microsatellite alleles in triploid watermelon. In: Proceedings 4th Eucarpia Meeting on Genetics and Breeding of Cucurbitaceae, (ed. M. Pitrat), pp. 381-

384. Avignon : INRA. Osborn, T.C., Pires, J.C., Birchler, J.A., Auger, D.L., Chen, Z.J., Lee, H.S., Comai, L., Madlung,

A., Doerge, R.W., Colot, V. and Martienssen, R.A. 2003. Understanding mechanisms of novel gene expression in polyploids. Trends in Genetics 19: 141-147.

Otto, S.P. 2007. The evolutionary consequences of polyploidy. Cell 131: 452-462. Parisod, C., Holderegger, R. and Brochmann, C. 2010. Evolutionary consequences of autopoly

ploidy. New Phytologist 186: 5-17.

112

Perry, J.L. and Lyrene, P.M. 1984. In vitro induction of tetraploidy in Vaccinium darrowi, V. elliottii, V. darrowi and V. elliottii with colchicine treatment. Journal of the American Society for Horticultural Science 109: 4-6.

Petersen, K.K., Hagberg, P. and Kristiansek, K. 2003. Colchicine and oryzalin mediated- chromosome doubling in different genotypes of Miscanthus sinensis. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 73: 137-146.

Predieri, S. 2001. Mutation induction and tissue culture in improving fruits. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 64: 185-210.

Pustovoitova, T.N., Eremin, G.V., Rassvetaeva, E.G., Zhdanova, N.E. and Zholkevich, V.N. 1996. Drought resistance, recovery capacity, and phytohormone content in polyploid plum leaves. Russian Journal of Plant Physiology 43: 232-235.

Rajesh, M.K., Radha, E., Karus, A. and Parthasarathy, V.A. 2003. Plant regeneration from embryo-derived callus oil palm the effect of exogenous polyamines. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 75: 41-47.

Ram, J.S. 2000. Plant Cytogenetics. Illinois : CRC Press Inc. Rauf, S., Khan, I.A. and Khan, F.A. 2006. Colchicine-induced tetraploidy and changes in allele

frequencies in colchicine-treated populations of diploids assessed with RAPD markers in Gossypium arboreum L. Journal of Biology 30: 93-100.

Rego, M.M., Rigo, E.R., Bruckner, C.H., Finger, F.L. and Otoni, W.C. 2011. In vitro induction of autotetraploids from diploid yellow passion fruit mediated by colchicine and oryzalin. Plant Cell, Tissue and Organ Culture doi: 10.1007/s11240-011-9995-6.

Riddle, N.C., Kato, A. and Birchler, J.A. 2006. Genetic variation for the response to ploidy change in Zea mays L. Theoretical and Applied Genetics 114: 101-111.

Rival, A., Beule, T., Barre, P., Hamon, S., Duval, Y. and Noirot, M. 1997.Comparative flow cytometric estimation of nuclear DNA oil palm content in Elaeis guineensis Jacq. tissue cultures and seed-derived plants. Plant Cell Reports 16: 884-887.

Roberts, A.V. 2007. The use of bead beating to prepare suspensions of nuclei for flow cytometry from fresh leaves, herbarium leaves, petals and pollen. Cytometry Part A 71: 1039-1044. Rowson, J.M. 1949. Increased alkaloid contents of induced polyploid of Datura. Nature 154: 81-

82.

113

Rubuluza, T., Nikolova, R.V., Smith, M.T. and Hannweg, K. 2007. In vitro induction of tetraploids in Colophospermum mopane by colchicine. South African Journal of Botany 73: 259-261. Sariano, M., Cistué, L., Vallés, M.P. and Castillo, A.M. 2007. Effects of colchicine on anther

and microspore culture of bred wheat (Triticum aestivum L.). Plant Cell, Tissue and Organ Culture 91: 225-234.

Sebastiampillai, A.R. and Jones, J.K. 1976. Improved techniques for the induction and isolation of polyploids in the genus Fragaria. Euphytica 25: 725-735.

Shao, J., Chen, C., and Deng, X. 2003. In vitro induction of tetraploid in pomegranate (Punica granatum). Plant Cell, Tissue and Organ Culture 75: 241-246.

Sharma, A.K. and Sharma, A. 1980. Chromosome Technique-3rd. Butterworth: Inc. Fakenham Press Ltd.

Shiga, I., Uno, Y., Kanechi, M. and Inagaki, N. 2009. Identification of polyploidy of in vitro anther-derived shoots of Asparagus officinalis L. by flow cytometric analysis and

measurement of stomatal length. Journal of The Japanese Society for Horticultural Science 78:103-108. Sigurbjornsson, B. 1983. Induced mutations. In Crop Breeding. (ed. D.R. Wood), pp. 153-176.

Wisconsin : American Society of Agronomy. Srisawat, T., Kanchanapoom, K., Pattanapanyasat, K., Srikul, S. and Chuthammathat, W. 2005.

Flow cytometric analysis of oil palm : a preliminary analysis for cultivars and genomic DNA alteration Songklanakarin Journal Science Technology 27: 645-652.

Stamp, J.A. and Henshaw, G.G. 1987. Somatic embryogenesis from clonal leaf tissue of cassava. Annals of Botany 59: 445-450. Stanys, V., Stanine, G. and Siksnias, T. 2004. In vitro induction of polyploidy in Ribes. Acta Universitatis Latviensis, Biology 676: 235-237. Stanys, V., Weckman, A., Staniene, G. and Duchovskis, P. 2006. In vitro induction of polyploidy

in Japanese quince (Chaenomele japonica). Plant Cell, Tissue and Organ Culture 84: 263-268. Stasolla, C. and Yeung, E.C. 2003. Recent advances in conifer somatic embryogenesis improving somatic embryo quality. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 74 : 15-35.

114

Sun, Q.R., Sun, H.S., Li, L.G. and Bell, R.L. 2009. In vitro colchicine-induced polyploid plantlet production and regeneration from leaf explants of the diploid pear (Pyrus communis L.) cultivar ‘Fertility’. The Journal of Horticultural Science and Biotechnology 84: 548-552.

Swanson, C.P. 1957. Cytology and Cytogenetics. New Jersy: Prentice Hall. Tal, M. 1980. Physiology of polyploids. In Polyploidy: Biological Relevance (ed. W.H. Lewis)

Vol. 13, pp. 61-76. New York : Plenum Press. Tang, Z.Q., Chen, D.L., Song, Z.J., He, Y.C. and Cai, D.T. 2010. In vitro induction and

identification of tetraploid plants of Paulownia tomentosa. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 102: 213-220.

Te-chato, S. 1998. Callus induction from cultured zygotic embryo of oil palm subsequent to plantlet regeneration. Songklanakarin Journal Science Technology 20: 1-6.

Te-chato, S. 2002. Improve callus induction and embryogenic callus formation from cultured young leaves of oil palm seedling. Thai Journal Agricultural Science 35: 407-413.

Te-chato, S. and Hilae, A. 2007. High-frequency plant regeneration through secondary somatic embryogenesis in oil palm (Elaeis guineensis Jacq. var. tenera). Journal of Agricultural Technology 3: 345-357.

Teixeira, J.B., Sondahl, M.R., Nakamura, T. and Kirby, E.G. 1993. Somatic embryogenesis from immature zygotic embryos of oil palm. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 34: 227-233.

Teixeira, J.B., Sondahl, M.R., Nakamura, T. and Kirby, E.G. 1995. Establishment of oil palm cell suspension and plant regeneration. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 40: 105-111.

Thao, N.T.O., Ureshino, K., Miyajima, I., Ozaki, Y. and Okubo, H. 2003. Induction of tetraploids in ornamental Alocasia through colchicine and oryzalin treatments. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 72: 19-25.

Uozu, S., Ikehashi, H., Ohmido, N. and Ohtsubo, H. 1997. Repetitive sequences:cause for variation in genome size and chromosome morphology in the genus Oryza. Plant Molecular and Biology 35: 791-799.

Urwin, N.A.R. and Horsnell, J.M.T. 2007. Generation and characterization of colchicine induced autotetraploid Lavandula angustifolia. Euphytica 156: 257-266.

115

Vainola, A. 2000. Polyploidization and early screening of Rhododendron hybrids. Euphytica 112: 239-244.

van Duren, M., Morpugo, R., Dolezel, J. and Afza, R. 1996. Induction and verification of autotetraploids in diploid banana (Musa acuminate) by in vitro techniques. Euphytica 88: 25-34.

Vanstechelman, I., Eeckhaut, T., Van Huylenbroeck, J. and Van Labeke, M. 2010. Histogenic analysis of chemically induced mixoploids in Spathiphyllum wallisii. Euphytica 174: 61-72.

Vasic, D., Alibert, G. and Skoric, D. 2001.Protocols for efficient repetitive and secondary somatic embryogenesis in Helianthus maximiliani (Schrader). Plant Cell Reports 20: 121-125.

Wan, Y., Duncan, D.R., Rayburn, A.L., Petolino, J.F. and Widholm, J.M. 1991. The use of anti-microtubule herbicides for the production of doubled haploid plants from anther-derived maize callus. Theoretical and Applied Genetics 81: 205-211.

Warner, D.A. and Edwards, G.E.1989. Effects of polyploidy on photosynthetic rates, photosyn- thetic enzymes, contents of DNA, chlorophyll and sizes and numbers of photosynthetic cells in the C4 dicot Atriplex confertifolia. Plant Physiology 91: 1143-1151.

Xiong, Y.C., Li, F.M. and Zhang, T. 2006. Performance of wheat crops with different chromo- some ploidy: root-sourced signals, drought tolerance, and yield performance. Planta 224: 710-718. Xu, L., Najeeb, U., Naeem, M.S., Daud, M.K., Cao, J.S., Gong, H.J., Shen, W.Q. and Zhou, W.J.

2010. Induction of tetraploidy in Juncus effusus by colchicine. Biologia Plantarum 54: 659-663.

Yan, O., Zubo, M.V., Yamburenko, S.Y., Selivankina, F.M., Shakirova, A.M., Avalbaev, N.V., Kudryakova, N.K., Zubkova, K.L., Olga, N.K., Victor, V.K. and Thomas, B. 2008. Cytokinin stimulates chloroplast transcription in detached barley leaves. Plant Physiology 148: 1084-1093.

Yang, X., Cao, Z., An, L., Wang, Y. and Fang, X. 2006. In vitro tetraploid induction via colchicine treatment from diploid somatic embryos in grapevine (Vitis vinifera L.). Euphytica 152: 217-224.

116

Ye, Y.M., Tong, J., Shi, X.P., Yuan, W. and Li, G.R., 2010, Morphological and cytological studies of diploid and colchicine induced tetraploid lines of crape myrtle (Lagerstroemia indica L.). Scientia Horticulturae 124: 95-101.

Zeng, S.H., Chen, C.W., Liu, H., Liu, J.H. and Deng, X.X. 2006. In vitro induction, regeneration and analysis of autotetraploids derived from protoplasts and callus treated with colchicine in Citrus. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 87: 85-93.

Zhang, J., Zhang, M. and Deng, X. 2007. Obtaining autotetraploids in vitro at a high frequency in Citrus sinensis. Plant Cell , Tissue and Organ Culture 89: 211-216.

Zhang, Z., Dai, H., Xiao, M. and Liu, X. 2008. In vitro induction of tetraploids in Phlox subulata L. Euphytica 159: 59-65. Zhang, X.Y., Hu, C.G. and Yao, J.L. 2010a. Tetraploidization of diploid Dioscorea results in

activation of the antioxidant defense system and increased heat tolerance. Journal of Plant Physiology 167: 88-94.

Zhang, Q.Y., Luo, F.X., Liu, L. and Guo, F.C. 2010b. In vitro induction of tetraploids in crape myrtle ( Lagerstroemia indica L.). Plant Cell, Tissue and Organ Culture 101: 41-47.

117

ภาคผนวก

118

ตารางภาคผนวกท 1 องคประกอบธาตอาหารทใชเพาะเลยงปาลมน ามน

องคประกอบ ปรมาณสาร(มลลกรมตอลตร)

สตร MS สตร ARDA ธาตอาหารหลก NH4NO3 1,650.000 1,025.000 KNO3 1,900.000 800.000 KH2PO4 170.000 170.000 CaCl2.2H2O 440.000 MgSO4.7H2O 370.000 ธาตอาหารรอง KI 0.830 0.415 K2SO4 495.000 H3BO3 6.200 6.2000 MnSO4.H2O 16.900 16.900 ZnSO4.7H2O 10.600 9.600 CuSO4.5H2O 0.025 3.138 Na2MoO4.2H2O 0.250 0.250 CoCl2.6H2O 0.025 0.0125 FeSO4.7H2O 27.800 27.800 Na2EDTA 37.300 37.300 สารอนทรย Myo-inositol 100.000 100.000 Nicotinic acid 0.500 0.500 Pyridoxine HCl 0.500 0.500 Thaiamine HCl 0.100 0.550 Glycine 2.000 2.000 Sucrose (กรม) 30.000 30.000 วน(กรม) 7.500 7.500 pH 5.700 5.700

119

ตารางภาคผนวกท 2 สารเคมทใชศกษาจ านวนโครโมโซม สารเคม ปรมาณสาร Paradichlorobenzene 50 มล. acetic acid : alcohol 1 : 3 hydrochloric acid 1 นอรมอล Carbon fuchsin 2 %

ตารางภาคผนวกท 3 สารเคมทใชศกษาปรมาณดเอนเอ โดยโฟลไซโทเมทร สารเคม ปรมาณสาร

สารละลายบฟเฟอร Tris-HCl 50.00 มก/ล. Polyvinylpyrolidone (PVP) 0.05 % Triton-X 0.01 % Sodium sulphite 0.63 % pH 7.50 สยอมดเอนเอ Propidium iodide (PI) 0.10 %

120

ประวตผเขยน

ชอ สกล นางไซนยะ สะมาลา

รหสประจ าตวนกศกษา 5210630017

วฒการศกษา

วฒ ชอสถาบน ปทส าเรจการศกษา วทยาศาสตรบณฑต (พฤกษศาสตร)

มหาวทยาลยสงขลานครนทร 2543

วทยาศาสตรบณฑต (การแพทยแผนไทย)

มหาวทยาลยสโขทยธรรมาธราช 2552

วทยาศาสตรมหาบณฑต(พฤกษศาสตร)

มหาวทยาลยสงขลานครนทร 2549

ทนการศกษา (ทไดรบในระหวางการศกษา)

- ทนสนบสนนโครงการวจยวทยานพนธ สถานวจยความเปนเลศเทคโนโลยชวภาพ

เกษตรและทรพยากรธรรมชาต คณะทรพยากรธรรมชาต มหาวทยาลยสงขลานครนทร - ทนสนบสนนโครงการวจยวทยานพนธบณฑตวทยาลย มหาวทยาลยสงขลานครนทร - ทนสนบสนนโครงการวจยวทยานพนธ สถานวจยพชกรรมปาลมน ามน คณะ ทรพยากรธรรมชาต มหาวทยาลยสงขลานครนทร

การตพมพเผยแพรผลงาน ไซนยะ สะมาลา และสมปอง เตชะโต. 2553. ผลของคอลชซนตอการเจรญและพฒนาของ SSE

ปาลมน ามน. ว.วทยาศาสตรเกษตร. 41(2)(พเศษ): 237-240. ไซนยะ สะมาลา และสมปองเตชะโต. 2555. การเพมชดโครโมโซมของปาลมน ามนโดยใชโคลช-

ซนในหลอดทดลอง. วารสารเกษตร. (28)(1): 51-59. Samala, S. and Te-chato, S. 2010. Effects of Colchicine Treatments on Physiological Characte-

ristics of Secondary Somatic Embryos of Oil Palm in vitro. The 7th Regional IMT-GT Uninet and The 3nd Joint PSU-UNS International Conference on 7-8 October: Songkla.

121

Samala, S. and Te-chato, S. 2011. Morphological characters of putative tetraploid oil palm plantlets from in vitro colchicine treatment. The 37th Congress on Science and Technology of Thailand on 10-12 October: Bangkok.

Samala, S. and Te-chato, S. 2012. Ploidy induction through secondary somatic embryo (SSE) of oil palm by colchicine treatment. Journal of Agricultural Technology 8(1): 337-352.