1

Софийски Университет “Св. Климент Охридски”

Катедра “Обща и Промишлена Микробиология”

Магистратура

“Микробиология и микробиологичен контрол”

Курс: Приложна микробиология

“Контаминиране и икономика на микробните процеси”

доц. д-р А. Куюмджиева гл. асист. В. Петрова

2013 г., София

2

Контаминиране на микробните процеси

Контаминацията на индустриалните процеси, както и принципите и техниките за

нейното елиминиране зависи от:

а) типа на продуцирания метаболит;

б) специфичните свойства на културата;

в) конструкцията на устройствата, използвани в процеса;

г) средата и нейните компоненти;

д) технологията на процеса.

Контаминацията оказва различен негативен ефект върху специфичните

биотехнологични производства. Например, влиянието на контаминацията върху

биосинтеза на пеницилин е по-сериозно, отколкото при други биосинтетични процеси,

тъй като продукта бързо се инактивира от ензима пеницилаза. Биосинтезата на

стрептомицин се повлиява негативно чрез контаминиране с актинофаги, тъй като

щамът-продуцент е чувствителен към тях. Отклонението от подходящата технология

при конструиране на устройствата за култивиране може да причини сериозни проблеми,

тъй като определянето на мястото и източника на контаминация е много трудно дори

чрез използването на модерни методи за детекция. Среди, съдържащи неразтворими или

трудно стерилизируеми компоненти с високо съдържание на спори често са източник на

контаминация.

Освен това, чувствителността на някой процес към контаминации и техния вреден

ефект се определя от голям брой фактори, такива като рН, аерация, интензитет и

продължителност на процеса. Контаминиращите микроорганизми негативно влияят на

индустриалния микробиологичен процес чрез:

а) разрушаване на клетките на щама продуцент;

б) инактивиране на синтезираните метаболити;

в) продукция на субстанции, повлияващи метаболизма на продуцента;

г) изчерпване на субстрати от хранителната среда, необходими за растеж и биосинтеза

на продукт.

Присъствието на контаминиращи микроорганизми обаче не винаги причинява

намаляване на продукцията на метаболити. При биосинтезата на широк спектър от

антибиотици, продукта инхибира растежа на контаминиращите микроорганизми и

следователно, протектира културата. Терминът "протектирано култивиране" се използва

за процеси, при които нежеланата контаминация се потиска от наличието на

антимикробен агент. Агентът или се добавя към средата в подходяща форма или се

продуцира от самата култура.

Стерилност на микробния процес

Неделима част от микробните технологии е разработване на методи за определяне

чистотата на културата, т.е присъствието на чужди микроорганизми. Терминът

"контаминиране на процеса" и "стерилно култивиране" не са напълно коректни, тъй като

процесът винаги е контаминиран от микроорганизма-продуцент и културата не е

напълно стерилна, защото растежа на желаният микроорганизъм трябва да бъде

3

осигурен. Тестването за присъствие на „чужди“ микроорганизми е императивно по

време на всички фази на процеса т.е: 1) култивирането; 2) изолирането и 3) крайната

преработка на продукта. Микробната контаминация се установява чрез микроскопски

или култивационни методи.

Микроскопското изследване е полезно, тъй като е много бърз и ефективен метод

при масивна контаминация. При по-слабо контаминиране, ефективна детекция може да

се постигне само, когато чуждите микроорганизми се различават съществено по форма

или подвижност от продуктивната култура. В повечето случаи е трудно да се различат

живите от мъртвите клетки, които се намират в повечето естествени материали и са

убити при стерилизацията. В такива случаи е приложим теста за виталност, въпреки че

резултатите от него не са достатъчно точни. Най-добро идентифициране на чуждите

микроорганизми се осъществява чрез култивационния тест.

Лабораторните изследвания за контаминация се основават на следната процедура:

Стерилно в колби се взимат проби от културата, която ще се изследва за

контаминация. 1 ml от нея се използва за инокулиране на 2 тест епруветки, съдържащи 5

ml МПБ. Инкубирането се провежда за 24 до 48 часа при 37°С. След приключване на

култивирането, пробите се изследват микроскопски за оценка на морфологичната

еднородност на културата (форма / размер на клетките).

Макроскопското изследване за контаминиращи микроорганизми включва

сравняване на макроскопските характеристики на растеж на микроорганизмите от

пробите с тези на оригиналната култура в течни и твърди хранителни среди (МПБ,

кръвен агар). Например, оригиналната култура расте в течна хранителна среда,

образувайки седимент, докато контаминираната - расте в целия обем.

В други случаи например, оригиналната култура може да образува пелена, докато

контаминираната - да расте хомогенно или да образува седимент.

Колониите на контаминиращите микроорганизми на кръвен агар могат да се

различат от оригиналните колонии по тяхната форма, размер или цвят, или тяхната

хемолитична активност. Главен недостатък на култивационния тест е това, че методът е

бавен и резултат може да се получи след 24/48 часа или повече, в зависимост от

скоростта на растеж на контаминиращия организъм. Резултатите от теста за

контаминация обаче трябва да се получат по-бързо в случаите, когато се проверява

инокулум за биореактор. Често пъти култивационният тест не може да покаже наличие

на странична микрофлора по следните причини:

а) страничната микрофлора не е попаднала в достатъчна концентрация в пробата за

анализ;

б) културата, която се тества предварително се разрежда при посявката;

в) при дадени условия на култивиране, време, хранителна среда страничната

микрофлора може да не се развие достатъчно, за да бъде отчетена;

г) растежът на страничната микрофлора в тест-средата може да се инхибира, поради

отделяне на метаболити от тест културата (основната култура).

Следователно, стерилността на индустриалния процес се дефинира като

невъзможност да се докаже присъствие на странична микрофлора при дадени условия.

Откриването на контаминиращи микроорганизми може да бъде направено, например,

чрез лазерна флуориметрия или фотон-корелираща спектрометрия, но тази техника е

много скъпа.

4

Чувствителност на микробните процеси на контаминация и протекция срещу нея

Индустриалните микробни процеси могат да се разделят на няколко групи,

съгласно тяхната чувствителност към контаминация и техните изисквания за

асептичност (Табл. 1).

По принцип, процесите могат да бъдат разделени на такива, които не изискват

асептични условия и такива, изискващи култивиране при асептични условия.

Култивирането при асептични условия може да бъде класифицирано допълнително в

зависимост от това дали частично или цялостно се изисква асептичност:

1. Процес тип 1 - естествената контаминация е желана за целия процес или някаква

част от него може да се осъществи при асептични условия.

2. Процес тип 2 – характеризира се с пълна асептичност. При него хранителната

среда обичайно се стерилизира и инокулира със специален посевен материал. Този

тип процес култивиране се реализира при специфични условия:

силно кисели среди (получаване на органични киселини);

повишени температури (термофилни микроорганизми);

на среди, неподходящи за развитие на странични микроорганизми

(алкохоли, разтворители);

при анаеробни условия;

при ниски температури (производство на бира), или

когато максималната скорост на растеж на микроорганизмите е толкова

висока, че пролиферацията на страничната микрофлора не достига лог

фаза.

Други фактори, от които зависи дали процесът трябва да се осъществи при асептични

условия е неговата цел (приложение в селското стопанство или индустрията).

Несептични ферментационни процеси се провеждат все по-рядко, тъй като дори

умерено контаминирани продукти (фуражни дрожди, млечна киселина) причиняват

здравословни проблеми във фермите. Процесите от тип 3 и 4 (Табл. 1), чиито продукти

са важни за фармацевтичната и хранителната индустрии, трябва да се провеждат при

напълно асептични условия.

3. Процесите от тип 3, чиито продукти се използват в други браншове на

индустрията (някои ензими) изискват асептични условия тъй като състава

на средата и неутралното рН са много благоприятни за развитието на

странична микрофлора.

4. Процесите от тип 4 изискват поддържане на стерилни асептични условия,

които включват култивиране на патогенни (по растения, животни) и някои

рекомбинантни микроорганизми, получени чрез генни манипулации.

Строго асептични условия трябва да се поддържат не само по време на

култивирането (да се следи и възможността микроорганизмите да контаминират

околното пространство), но също и по време на стъпалата, следващи след култивирането

– при пречистване и пакетиране до краен продукт.

5

Антимикробните агенти за предпазване на микробните процеси също се използват

отдавна. Например, амониевият хидрофлуорид и пентахлорфенол са използвани като

асептични агенти при получаването на етанол; серния диоксид при винопроизводството;

формалдехид, формиат, салицилова киселина или пикринова киселина при

производство на фуражни дрожди. Агенти, използвани за предпазване от контаминация

на гъбни ферментации включват 2,4-дихлорфеноксиоцетна и борна киселина, амониев

флуорид и натриев пентахлорфенолат. Препоръчваните по-рано антибиотици за тези

цели вече не се използват, поради опасност от плазмиден трансфер на резистентност.

Таблица 1. Класификация на индустриалните микробиологични процеси според

необходимостта от поддържане на асептични условия

Процес Приложение Забележка

1. Нестерилно култивиране,

естествена микрофлора

Пречистване на

води

Използване на най-големи обеми,

непрекъснат аеробен процес, активна

утайка, биореактори до 30 000 м3

Биогаз Анаеробен процес

2. Нестерилно култивиране,

специфични инокулати

Бира Стерилна среда, бързото протичане на

ферментацията, предотвратява сериозна

контаминация, биореактори до 320 м3

Млечна

ферментация

Пастьоризация на млякото, биореактори

до 20 м3

Етанол Високо-обемна анаеробна ферментация

3. Асептично култивиране,

специфични инокулати

Антибиотици Комплексна среда, биореактори до 200 м3

Едноклетъчен

протеин

Непрекъснато култивиране, биореактори

до 500 м3

4. Асептично култивиране

със специфичен асептичен

стрес

Растителни

патогени

Високо-продуктивна продукция на

аспарагиназа и ксантан

Животински

патогени

Производство на токсини и ваксини

Рекомбинантни

клетки

Строга асептичност, поради възможност

за нежелани ефекти

6

Преработка на отпадъци

Интегрална част от всеки индустриално производство е преработката на

отпадъците. Всеки микробиологичен процес използва суровини, които се

трансформират в продукти, като се отделят различно количество отпадни вещества.

Количеството и типа на неизбежните отпадъци, възникващи във всеки процес, зависят

от природата на процеса. Използваният напоследък много модерен термин "безотпадна

технология" е некоректен и подвеждащ: проблемът е използването дори на тези

отпадъци, които не се усвояват от микроорганизмите по начин такъв, че да не се

замърсява околната среда.

Отпадъците от микробната индустрия включват:

1. неизползваеми неорганични или органични компоненти;

2. среди;

3. микроорганизми;

4. твърди частици

5. филтрационни материали;

6. отпадни води от измиване и почистване на биореактори;

7. отпадъци от стъпалата на екстракция - органични разтворители.

С изключение на култивирането на патогенни микроорганизми, отпадъците от

микробната индустрия по правило не съдържат токсични материали. Типична черта на

микробната технология е фактът, че при синтезата на продукти се консумира малка част

от тоталната суровина (5-10%).

Контрол на отпадъците

Индивидуалните технологични стъпала в един процес трябва да се следят

непрекъснато за възможен преразход на материали и консумация на вода. Управлението

и контрола на водите има значение при оценка на нарастването на обема на микробната

продукция: рециркулация на водите се използва навсякъде където е възможно. Висока

концентрация на органика в отпадните материали причинява проблеми при

пречистването, тъй като тяхното присъствие води до висока стойност на БПК1

(биологично потребление на кислород), стойности, които са индикатори за степента на

замърсяване.

Както се вижда от Табл. 2, стойностите на БПК в отпадъците от различни

микробиологични производства варират широко и превишават с няколко порядъка

стойностите на битовите отпадъци. Най-висока БПК стойност се получава от

1 БИОЛОГИЧНО ПОТРЕБЛЕНИЕ НА КИСЛОРОД (БПК): Измерва се количеството кислород, което

се изразходва от микроорганизмите при аеробно биологическо разпадане на веществата, съдържащи се

в отпадни води при стандартни условия за определен интервал от време. Определянето на БПК изисква

приложението на специална апаратура: при манометричните подходи се измерва понижаването на

налягането в апарата, за сметка на използването на кислорода. Изследванията се провеждат в апарат

на Варбург или специално разработен респирометър.

7

микробните клетки - тяхното разпространение в отпадните води трябва строго да се

съблюдава.

Таблица 2. Стойности на БПК за микробиологични индустриални отпадни води

(по Stanbury & Whitaker, 1986)

Методът на БПК измерването оценява количеството кислород, необходим за

окисляване на органичните субстанции във водата от микроорганизмите за определен

период при определена температура (обичайно 5 дни при 20°С). Понижаването на

кислородното съдържание може да се определи и изрази в mg О2/l проба. Тъй като теста

се извършва за 5 дни, по-бързи резултати се получават от ХПК2

тест (химично

потребление на кислород), което се измерва в рамките на няколко часа. Този тест дава

по-високи стойности, тъй като включва и субстанциите, които не могат да се окислят от

микроорганизмите. Отношението БПК/ХПК е 0.2:1 до 0.5:1.

Количествената оценка на отпадъците може да даде отговор на следните въпроси:

а) кои водни източници могат да се комбинират за повторно използване;

б) кои концентрирани отпадъци, съдържащи ценни субстанции могат да се

използват за селското стопанство (фуражи, торове) или като горива;

в) кои токсични субстанции изискват специално съхранение и преработка;

г) какъв може да бъде минималния обем на отпадък при максимална продукция;

д) кои отпадъци могат да се освобождават директно и кои е необходимо да бъдат

подложени на преработка в пречиствателно съоръжение.

2 ХИМИЧНО ПОТРЕБЛЕНИЕ НА КИСЛОРОД (ХПК): Измерва се количеството кислород, което се

изразходва при химичното разпадане на веществата, съдържащи се в отпадни води при стандартни

условия за определен интервал от време. Методиката е основана на окислението на веществата в

присъствието на 0.25 % разтвор на калиев бихромат при кипене на пробите в продължение на 2 часа в 50

% разтвор на сярна киселина.

Отпадни води БПК (mg.l-1

)

Битови отпадни води (за сравнение) 350

Сулфитни разтвори 20 000 - 45 000

Етанол (меласа) 10 000-25 000

Хлебопекарни дрожди 3 000 - 14 000

Антибиотици 5 000 - 30 000

Пеницилин - влажен мицел 40 000 - 70 000

филтрат 2 150- 10 000

Стрептомицин 2 450 - 5 900

Ауреомицин 4 000 - 7 000

Разтворители до 2 000 000

8

Методи за третиране на отпадъци

Отпадъците от микробиологичните производства могат да се третират или

преработват чрез физични, химични и биологични методи.

Отделянето на суспендираните твърди частици преди биологичното третиране

значително намалява БПК. Почти всички индустриални микробиологични процеси

включват сепариране на клетките по време на изолиране на продуктите. Отработената

биомаса може в много случаи да се използва като фураж. Ако биомасата е замърсена с

филтърни материали (части от филтрите) тя механично се дехидратира и получения

отпадък се изгаря или изхвърля на сметища.

Фино суспендирани и колоидни частици се отделят чрез коагулация или

флокулация. Коагулацията обичайно е мигновена, докато за флокулацията3

е

необходимо време и се изисква разбъркване, за да се улесни образуването на агрегати.

Феро-фери или А1-флокули се седиментират в утаители или танкове, за да образуват

утайка, която след това механично се дехидратира.

Повечето органични отпадъци могат да бъдат биологично разградени аеробно или

анаеробно чрез прилагане на разнообразни методи. Широко използвани са биологичните

филтри и тяхната колонна модификация (въртящи се дискове), третиране с активни

утайки и различни модификации. Анаеробните процедури, които се използват за тази

цел включват използването на анаеробни микроорганизми.

Икономика на микробните процеси

Основна характеристика на индустриалните процеси е това, че микроорганизмите

трябва да произвеждат даден продукт ефективно, т.е да се получава висок добив.

Успехът на такива процеси зависи допълнително от голям брой фактори:

1. Капиталните инвестиции в съоръженията за култивиране и допълнителното

оборудване трябва да бъдат колкото е възможно по-ниски. Те обаче трябва да са

конструирани така, че да позволяват провеждането на разнообразни микробиологични

процеси, т.е трябва да бъдат високо адаптивни;

2. Суровините трябва да бъдат възможно най-евтини и трябва да се използват с

висока ефективност. Тестването на нови субстрати трябва да продължи, независимо от

факта, че една технология вече може да работи;

3. Продуктивността на микробиологичния процес трябва да бъде възможно

най-висока;

3 Флотацията: метод, при който се пропуска газ през културалната течност. Той образува малки

мехурчета, върху чиято повърхност се абсорбират клетки. Мехурчетата газ с полепналите по тях

клетки се издигат на повърхността на течността и образуват пяна. В някои случаи, мехурчетата

могат да увлекат и продукти от ферментационния процес (мастни киселини). Образуваната пяна,

съдържаща клетки се отстранява от повърхността на биореактора.

Флокулация: При високо плътностни култури (дрождеви култури), част от клетките могат да

образуват клетъчни агрегати, които потъват в дълбочина към дъното на ферментора. Процесът на

флокулиране можа да бъда ускорен чрез добавянето на флокулиращи агенти като соли, органични

електролити или минерални колоидни разтвори.

9

4. Където е възможно човешкия труд трябва да се заменя чрез автоматизация;

5. Времето за култивиране трябва да се намалява, колкото е възможно, за да може

мощностите да се използват ефективно;

6. Изолирането и пречистването трябва да бъде просто и бързо;

7. Количеството на отделените отпадъци трябва да е възможно най-ниско;

8. Енергията, необходима за загряване и работа на апаратурата трябва да се ползва

пестеливо, с висока ефективност;

9. Мястото в цеховете трябва да се ползва рационално, като винаги да се

предвижда възможност за тяхното разширяване.

На практика съблюдаването на тези правила може да се постигне чрез компромис,

тъй като едновременното изпълнение на всички условия е невъзможно. Основните

параметри, определящи ефективността на един микробиологичен процес са: съоръжения

за култивиране, използвана суровина, подходи за филтриране на въздуха, нагряване и

охлаждане, както и изолирането и пречистването на крайния продукт.

Съоръжения за култивиране

Изискванията за най-ефективна икономика на един процес води логично до усилия

за конструиране на съдове за култивиране с голям обем, тъй като мащабирането прави

процеса по-икономичен.

Съществува емпирично съотношение между цената и размера на съоръжението:

цена1 / цена2 = (размер1 / размер2)n,

където n е фактор на размера.

В бирената индустрия n = 0.6, при получаването на едноклетъчен протеин – 0.7-0.8.

Други фактори, играещи роля при планиране на размера на съдовете са: конструкцията,

охлаждането, аерацията, разбъркването. Когато се проектира охлаждащата система

трябва да се има предвид, че обема на биореактора е право пропорционален на радиуса

на съда на степен 3 (r3), докато повърхността му е пропорционална на r

2. По тази причина

мащабирането на биореактора включва намаляване на отношението повърхност/обем,

което се отразява негативно на ефективността на охлаждането. Ето защо е невъзможно

при много големи биореактори да се извежда топлината чрез външната повърхност на

съда и трябва да се използва допълнителна охлаждаща система (външна охлаждаща

система). Тези допълнителни модификации не са евтини и повлияват разбъркването в

биореактора. Горната граница за размера на биореактора се определя от възможностите

за транспорт от мястото на производството му до мястото на инсталирането му.

Операционният живот на съоръженията за култивиране варира широко в зависимост от

природата на процеса. Най-краткият живот на система за получаване на едноклетъчен

протеин е определена на 10 години, със среден живот 15 години. Животът на

съоръженията за ацетон-бутанолна ферментация е 25 години, докато съоръженията за

производство на бира действат 50-100 години. Действието на съоръженията за

култивиране включва и снабдяването с енергия за производство на пара, сгъстен въздух,

за задвижване на бъркалката и за снабдяване с вода и циркулацията й.

10

Например един процес със средна мощност за производство на антибиотици има

следните изисквания: 45 тона пара, 5000 кW електроенергия, 57000 m3 сгъстен въздух и

200 m3 вода. Продукцията на един тон оцетна киселина изисква 480 m

3 охлаждаща вода,

10 m3

вода, 12 тона пара и 57 кW електроенергия.

Суровини

Цената на отделните суровини, използвани като компоненти на хранителната среда

представлява 38-73% от тоталната цена на продукта. Най-висока цена има въглеродния

източник, чиято цена на световния пазар се променя постоянно. Цената, която се плаща

за суровината е правопропорционална на цената на продукта. Колкото по-висока е

цената на суровината, толкова по-скъп е продукта. Ефектът на различните цени на

суровините върху продукцията на единица продукт (клетки) е показано на Табл. 3.

Таблица 3. Ефект на цената на субстрата върху цената на биомасата (по Abbott &

Clamen, 1973)

Тъй като цената на суровините влияе върху цената на продуктите на

микробиологичната индустрия, те могат да се класифицират в 3 групи (Фиг. 1):

а) продукти с ниска цена: едноклетъчен протеин, органични киселини,

разтворители, полизахариди, алкохоли;

б) продукти със средна цена: антибиотици, алкалоиди, витамини;

в) продукти с висока цена: специфични протеини (инсулин, растежен хормон,

интерферони), продукти на микробната трансформация (стероиди).

Субстрат Цена на субстрата

(в условни единици)

Цена на биомасата

(в условни единици)

Малеат (отпадъчни

продукти)

0 0

Глюкоза 2.0 3.9

n-парафини 4.0 4.0

Метанол 2.0 5.0

Метан 1.0 1.6

Етанол 6.0 8.8

Ацетат 6.0 17.0

11

Фигура 1. Класификация на продуктите от микробиологичните производства

12

Решението да се използват суровини с висока или ниска цена е по-лесно, ако се

вземи предвид следната зависимост:

Филтриране на въздух, нагряване, охлаждане

Стерилизацията чрез нагряване е практически удобна, но скъпа. Изчислено е, че за

стерилизацията на 280 m3 въздух се изисква 132 kJ.min

-1, с кореспондиращо натоварване

на охлаждащата система. Изследвана е възможността за стерилизация на въздух чрез

топлината на компресия. Най-икономични са компресорите при 7,03 кg.сm2.

Когато се използват филтри с фиброзно пакетиране инвестираните цени зависят от

размера на филтрите, особено от тяхното напречно сечение, докато операционните цени

зависят от налягането върху филтъра (за даден размер на филтъра). Някои типове

въздушни филтри изискват голямо инсталационно пространство, други са

по-компактни. Важен фактор е животът на филтъра, в който се отчита и цената за

неговата смяна. За да се удължи живота на филтрите се предвижда и предварително

филтруване за понижаване на замърсяванията в системата (напр. мастни капки от

компресора).

Най-добрият подход за загряване и охлаждане е да се избягват и двете операции

при всички фази на индустриалните микробиологични процеси. Тъй като това е

невъзможно, енергията за загряване и охлаждане трябва да се намали чрез лимитиране

на двете операции до необходимия минимум:

а) стерилизиране на хранителната среда под налягане до 100°С или при 100°С и

нейното охлаждане;

б) стерилизация и охлаждане на устройствата за култивиране и аксесоарите;

в) регулиране на температурата в процеса на култивиране;

г) сушене на крайния продукт.

Цената на охлаждане на културалната течност, особено при бърз растеж на

микроорганизмите не е за пренебрегване, тъй като в случаите, когато се произвежда

13

едноклетъчен протеин тя може да бъде 10-15% от цената на продукта. Годишна

продукция от 100 000 тона едноклетъчен протеин изисква необходимост за отделяне на

топлина, кореспондираща на 46x107

kJ.h-1

. Цената за охлаждане може да се намали чрез

използване на биореактори с нови конструкции, като „еърлифт“ и чрез използване на

термофилни / термотолерантни микроорганизми продуценти.

Изолиране и пречистване на продукт

В литературата не съществуват много данни за цените на изолирането и

пречистването на микробни продукти. Факторите, определящи ценообразуването са:

а) загубите на продукт, дори малки при различните етапи на неговото изолиране

и пречистване;

б) високи енергетични цени и цени на поддържане, свързани с филтриране и

центрофугиране;

в) високи цени на разтворителите и други химикали.

Например загубите при изолиране на лимонена киселина са 8%, при пеницилин G -

4%. Тези стойности са доста оптимистични и отразяват идеалното състояние, което

много трудно се постига в реални условия. Загубите могат да се намалят чрез

понижаване броя на стъпалата за изолиране и пречистване. Когато се избира сепарираща

техника, където е възможно, се предпочита филтриране вместо центрофугиране, тъй

като енергията, необходима за филтруване е по-ниска от тази при центрофугирането.